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改進的頭孢菌素生產(chǎn)的制作方法

文檔序號:594895閱讀:993來源:國知局

專利名稱::改進的頭孢菌素生產(chǎn)的制作方法改進的頭孢菌素生產(chǎn)本發(fā)明涉及在微生物中對頭孢菌素的發(fā)酵生產(chǎn)。有絲真菌尸em'd仏'wmc/zowgemw2是/5-內(nèi)酰胺抗生素(例如青霉素G)的天然生產(chǎn)者。過去數(shù)十年中,青霉素G的生產(chǎn)能力被經(jīng)典菌株改進方法大大提高,產(chǎn)生了強大的工業(yè)生產(chǎn)菌株。近來,通過代謝途徑工程改造,將用于頭孢菌素生產(chǎn)的若干途徑成功整合進了青霉素生產(chǎn)菌株,特別是尸em'cz'〃/wmcAo^ogewwm。在EP-A-0532341中,已用編碼擴展酶的iSV,ep/cw7C^yc/avw//gerwjc^/E"基因)(寸尸e"zW〃/wwc力A3Ay0ge"ww進《亍了轉(zhuǎn)"f七,這使得在存在前體己二酸的情況下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株時,所述菌株能生產(chǎn)己二酰-7-ADCA(己二酰-7-氨基-3-甲基-3-頭孢(cephem)-4-羧酸)。在EP-A-0540210中,除了&re/tom>;c&yc^vw/z'gen^ce/E基因之外,還用羥化酶基因?qū)κ琫m'd仏wmc/jo^oge肌m進行了轉(zhuǎn)化,該基因的表達產(chǎn)物將己二酰-7-ADCA的3-甲基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為3-羥甲基,產(chǎn)生己二酰-7-氨基去乙酰頭孢烷酸(己二酰-7-ADAC);在EP-A-0540210的另一實施例中,用乙酰轉(zhuǎn)移酶基因?qū)σ呀?jīng)過編碼擴展酶和羥化酶的基因轉(zhuǎn)化的尸em'a7/^mc/zo^ge做m再進一步轉(zhuǎn)化,該乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達產(chǎn)物將3-羥甲基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為3-乙酰氧甲基側(cè)鏈,產(chǎn)生己二酰-7-ACA。在WO2004/106347中,用編碼擴展酶、羥化酶和O-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)em'"7//MmcAo^oge"薩進行了轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-頭孢烷酸。選用尸em'cz'〃/wmc/o^^e"Mm的工業(yè)菌株是因為它們能生產(chǎn)和向培養(yǎng)基中分泌大量的多種/3-內(nèi)酰胺化合物,特別是青霉素G和青霉素V。很多證據(jù)表明,0-內(nèi)酰胺分泌是主動的過程,其可能通過轉(zhuǎn)運蛋白進行。在此類發(fā)酵工藝的靠后階段,在工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)了極高的^-內(nèi)酰胺效價。WO01/32904公開了涉及青霉素G分泌的若干種ABC轉(zhuǎn)運蛋白多肽。增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性導(dǎo)致/3-內(nèi)酰胺化合物的分泌增強。前文所討論的在天然非頭孢菌素重組生產(chǎn)宿主(例如尸^&7//"附菌株)中對頭孢菌素分子進行的生產(chǎn)仍有若干問題。例如,想要的化合物的分泌水平仍相對較低,其應(yīng)當被提高,以在技術(shù)和經(jīng)濟上都更有吸引力。由于青霉素轉(zhuǎn)運蛋白,即ABC轉(zhuǎn)運蛋白多肽對于頭孢菌素化合物具有低的親和性,因此在尸.cAo^oge"wm中生產(chǎn)的頭孢菌素的生產(chǎn)率(productionrate)受到限制。在WO01/32904中建議,這可能通過使用編碼WO01/32904中公開的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸,從天然頭孢菌素生產(chǎn)者(例如^crewom'wmcA^soge做m)中克隆一種或多禾中同源ABC轉(zhuǎn)運蛋白多肽來克服。有絲真菌爿cre附om'w附c/z3^oge"w附是頭孢菌素(例如頭包菌素C)的天然生產(chǎn)者。近來已在該真菌的特定菌株爿c"mom'wmc/z^50ge"w肌C10中鑒定出了CefT基因,該基因編碼可能的流出泵(effluxpump)蛋白,同時還顯著增加頭孢菌素C生產(chǎn)(Ulldnetal.(2002)Mol.Genet.Genomics,267,673-683;LirasandMartin(2006)InternationalMicrobiology2,9-19)。CefT基因的核苷酸序列已被保藏于NationalCenterforBiotechnologyInformation的核苷酸數(shù)據(jù)庫,編號(位置)為AJ487683。NCBS可通過互聯(lián)網(wǎng)進入(www.ncbi.nlm.nih.gov),CefT基因核苷酸序列可從http:〃www.ncbi.nkn.nih.gov/entrez/viewer,fcgidb=nucleotide&val=21214008獲得。從CefT編碼的蛋白的氨基酸序列推斷出這是跨膜蛋白,因為其具有12個跨膜片斷(TMS),并且含有具有主要易化子(facilitator)超家族的Drug:H反向轉(zhuǎn)運蛋白12TMS組特性的基元A、B、C、D2和G。CefT蛋白賦予對一些毒性有機酸(包括異戊酸和苯乙酸)的抗性,這可從下述事實推斷出這些酸對其中CefT被失活的Jcwmom'wm菌株有毒性。同源CefT基因的過量表達導(dǎo)致在Jcrewom'wmc/zo^oge"ww中頭孢菌素C的生產(chǎn)提高。而當使用CefT基因的截短形式時卻并非如此。但是,對CefT基因的靶向失活不會影響到Jcremom'wwc/o^ogemw2中的頭包菌素C生產(chǎn),這暗示,有冗余的系統(tǒng)參與v4cremom'wnc/zo^oge"wn中的頭孢菌素輸出。來自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>的CefT蛋白不屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族。對來自Jcremom'wwC10的CefT蛋白氨基酸序列(UMnetal(2002))與WO01/32904中公開的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列中的任何序列進行的比較揭示,CefT蛋白與ABC轉(zhuǎn)運蛋白不具有任何同源性(即,<25%)。術(shù)語"CefT基因"涉及編碼CefT蛋白(即,參與將頭孢菌素化合物從頭孢菌素生產(chǎn)微生物中轉(zhuǎn)運到頭孢菌素生產(chǎn)微生物外的蛋白)的基因。來自菌株Jc^mom'wmdzowge"wmCIO的此類CefT基因的一個例子可在UMnetal(2002)中找到,其中還公開了CefT基因編碼的CefT蛋白的氨基酸序列。術(shù)語"異源CefT基因"表示CefT基因可從任何合適的宿主微生物獲得,并且被用于轉(zhuǎn)化頭孢菌素生產(chǎn)微生物,前提是從中獲得CefT基因的合適的宿主微生物與用所述CefT基因轉(zhuǎn)化的頭孢菌素生產(chǎn)微生物并非同一物種。術(shù)語"同源CefT基因"表示CefT基因從任何合適的宿主微生物獲得,并被用于轉(zhuǎn)化頭孢菌素生產(chǎn)微生物,前提是從中獲得CefT基因的合適的宿主微生物與用所述CefT基因轉(zhuǎn)化的頭孢菌素生產(chǎn)微生物是同一物種。用來自同樣的菌株Jco^om'wmc/zo^oge做mCIO的同源CefT基因?qū)赉輈owom'wmc/2^y0gem^mCIO進行的轉(zhuǎn)化已被Ulldnetal.(2002)描述過。"同源性"指第一基因、蛋白或酶與第二基因、蛋白或酶序列的同一性。在本說明書中,同源性的程度被表示為與參照基因、蛋白或酶的同一性百分比。對這些同源性的測定可通過技術(shù)人員已知的方法來進行,例如,使用參照蛋白的蛋白序列作為"查詢序列",以針對公眾數(shù)據(jù)庫進行檢索,以鑒定出其它家族成員或相關(guān)序列。此類檢索可使用BLAST程序(版本2.2),使用各程序的缺省參數(shù)來進行。見,例如http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在第一個方面,本發(fā)明提供了頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其特征在于,其已經(jīng)經(jīng)過了異源Ce/T基因的轉(zhuǎn)化,并且,由此,經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物較之未經(jīng)異源CefT基因轉(zhuǎn)化的微生物而言具有提高的頭孢菌素生產(chǎn)能力。提高的頭孢菌素生產(chǎn)能力在本文中被定義為經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物的頭孢菌素生產(chǎn)能力與未用異源CefT基因轉(zhuǎn)化的微生物的頭孢菌素生產(chǎn)能力之比為至少1.2,更優(yōu)選地,至少1.4,更優(yōu)選地,至少1.6,更優(yōu)選地,至少1.8,更優(yōu)選地,至少2.0,更優(yōu)選地,至少2.1,更優(yōu)選地,至少2.3,更優(yōu)選地,至少2.5,更優(yōu)選地,至少3.0,更優(yōu)選地,至少5.0,更優(yōu)選地,至少10。頭孢菌素生產(chǎn)微生物優(yōu)選是天然能生產(chǎn)i8-內(nèi)酰胺化合物(例如青霉素和頭孢菌素)的微生物,其可選自尸em'cz7/z'wm、A;ergz'〃^、^^ptomycw和^cremo"/wm構(gòu)成的組。在該組中,若干種微生物天然具有生產(chǎn)頭孢菌素的能力,例如5Vw;tom;;c"和Jcrewem'wm,或者天然具有生產(chǎn)青霉素的能力,例如尸em'c遊wm和J5;^g/〃w。其它微生物,例如前文公開的尸em'd/^m,可通過遺傳工程獲得生產(chǎn)頭孢菌素的能力,例如,對尸6"^7//"^cAo^oge""w進行遺傳改造,在用編碼擴展酶的基因?qū)ζ溥M行轉(zhuǎn)化之后,其能生產(chǎn)7-ADCA的N-乙?;苌?,或者進一步用羥化酶、用羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶、或用羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶和O-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶對其進行轉(zhuǎn)化后,其能分別生產(chǎn)7-ADAC、7-ACA和7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙?;苌铩?yōu)選地,異源Ce/T基因可源自任何合適的頭孢菌素生產(chǎn)微生物,但是其1尤選源自Jcrewowz'wm,更優(yōu)選源自爿cre附om'wwc/z/3^oge"twz,最優(yōu)選源自Ull紐etal(2002)公開的爿cremo"z'wmc/o^oge"wwC10。就本發(fā)明的目的而言,還可以使用合適的異源Ce/T基因的同源物,例如,如下的CefT基因,其編碼與Ull&netal(2002)公開的來自爿c"wom'wwc/zo^oge"M/wC10的CefT蛋白相比基于蛋白基礎(chǔ)具有超過30%同源性,優(yōu)選超過40%同源性,優(yōu)選超過50%同源性,優(yōu)選超過60%同源性,優(yōu)選超過70%同源性,優(yōu)選超過80%同源性,優(yōu)選超過90%同源性的CefT蛋白。本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式是Pem'd//^m菌株,優(yōu)選地,Pem'cz7/,MmWo^oge"wm,其已通過遺傳工程改造獲得了生產(chǎn)N-取代的7-ADCA衍生物的能力,這是用編碼擴展酶的基因(例如EP-A-0532341中公開的)對其進行轉(zhuǎn)化的結(jié)果,并且,除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地,來自白勺CefT基因,更"[尤選i也,來自爿cre附om'wwc/z^ysogewwm白勺CefT基因,最優(yōu)選的是來自A^mwz/wmc/zo^oge肌mC10的Ce汀基因,其編碼具有U114netal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方式是尸em'a'〃/wm菌株,優(yōu)選地,尸6"/"7//"附cAowge"wm,其已通過遺傳工程改造獲得了生產(chǎn)N-乙?;?-ADAC衍生物的能力,這是用編碼擴展酶和羥化酶的基因(EP-A-0540210中公開的)對其進行轉(zhuǎn)化的結(jié)果,并且,除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地,來自Jcr綴om'wm的CefT基因,更優(yōu)選地,來自爿c廠emom'wmc/zo^oge"wm的CefT基因,最j尤選的是來自」crewom'w/wc/o^oge"wmC10的CefT基因,其編碼具有UMnetal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方式是尸e"/c"/Z簡菌株,優(yōu)選地,Pem.c朋謹c/z,oge"畫,其已通過遺傳工程改造獲得了生產(chǎn)N-乙酰化的7-ACA衍生物的能力,這是用編碼擴展酶和羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因(EP-A-0540210中公開的)對其進行轉(zhuǎn)化的結(jié)果,并且,除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地,來自Aremow'wm的Ce汀基因,更優(yōu)選地,來自Jc"mo"z'wmc/o^oge肌m的CefT基因,最優(yōu)選的是來自Jcremom'wmc/o^oge肌mC10的CefT基因,其編碼具有UMnetal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一優(yōu)選白勺實方但方式是尸em.c/〃&m菌牛朱,^f尤選i也,尸ewz'cz'〃z'wmc/z^3^oge"wm,其已通過遺傳工程改造獲得了生產(chǎn)N-乙?;?-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸衍生物的能力,這是用編碼擴展酶、羥化酶和O-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因(WO2004/106347中公開的)對其進行轉(zhuǎn)化的結(jié)果,并且,除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地,來自^remow^m的CefT基因,更優(yōu)選地,來自Jc"mom'wmcA^soge""w的CefT基因,最優(yōu)選的是來自爿crewom'wmc/z/">wogewwmC10白勺CefT基因,其纟扁石馬具有Ull&netal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉(zhuǎn)化。在第二個方面,本發(fā)明提供了用于構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的頭孢菌素生產(chǎn)微生物的方法,所述方法包括下述步驟:從合適的宿主微生物分離異源Ce/T基因,用分離的CefT基因轉(zhuǎn)化頭孢菌素生產(chǎn)微生物,前提是所述宿主微生物與頭孢菌素生產(chǎn)微生物并非同一物種。在一種優(yōu)選的實施方式中,本發(fā)明提供了用分離的CefT基因構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的頭孢菌素生產(chǎn)微生物的方^去,所述方^去包f舌下述步l聚從JcT6wom'wm,優(yōu)選從爿crewow'wmsogew訓(xùn),最優(yōu)選從UMnetal(2002灘述的爿cre腳m'臓sogew謂C10分離異源Ce/T基因,對經(jīng)過編碼擴展酶的基因以及任選地編碼羥化酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和O-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因中的一種或多種轉(zhuǎn)化過的頭孢菌素生產(chǎn)微生物(優(yōu)選地Pem'a7/z'ww,更優(yōu)選地,Pem'cz7/山mc/o^oge"wm)進行轉(zhuǎn)化,由此提供具有生產(chǎn)前文所述的7-ADCA、7-ADAC、7-ACA和N-乙?;?-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的能力的尸em'c/〃z'wm菌株。在第三個方面,本發(fā)明提供了生產(chǎn)頭孢菌素的工藝,所述工藝包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來培養(yǎng)本發(fā)明的相應(yīng)的頭孢菌素生產(chǎn)微生物。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式是生產(chǎn)7-ADCA、7-ACA、7-ADCA禾H7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙酰化衍生物的工藝。本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式是使用EP-A-0532341、EP-A-0540210和WO2004/106347公開的發(fā)酵工藝來生產(chǎn)7-ADCA、7-ACA、7-ADCA或7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的己二酰衍生物的工藝。實施例一般材料和方法按照Sambrook,J."a/.(1989),Molecularcloning:alaboratorymanual,2ndEd"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork所述按照標準流程來進行。使用校正聚合酶Turbo-Pfu-Polymerase或Herculase(Stratagene,荷蘭)按照廠商方案來擴增DNA,同時使用Taq聚合酶來驗證構(gòu)建的菌株和質(zhì)粒。限制性酶來自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。對于常規(guī)克隆而言,使用五sc/zen'c/n'aco/!'菌株ToplO和DH10B(Invitrogen)。對構(gòu)建的質(zhì)粒的驗證通過限制性分析和隨后的測序(SeqlabGmbH,Goettingen,德國)來進行。有絲真菌Pem'cz.〃/wmc力o^oge"wmWisconsin54-1255(ATCC28089)被用作為遺傳修飾和生產(chǎn)菌株構(gòu)建的宿主。實施例1構(gòu)建Ce/T表達盒用于在尸em'cz7/^wc/;r^oge肌w中的轉(zhuǎn)化^c/^n'c/^cc^DH5a被用作為宿主菌株,用于高頻率轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA擴增(Sambrook,1989)和質(zhì)粒構(gòu)建,其中使用Invitrogen的MultisiteGatewayThree-FragmentVectorConstructionKit禾口不同的載體。載體pDONRTMP4-P1R被用于克隆pcbC基因上游920bp的啟動子區(qū)域。使用引物attB4-F-IPNS通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)添加attB4F位點,使用引物attBl-R-IPNS添加attBlR位點。使用BP克隆酶,將擴增出的PCR產(chǎn)物克隆進pDONRP4-P1R,產(chǎn)生pDONRP4-P1R-IPNS啟動子。用載體pDONR201門(gateway)載體來克隆爿cr簡麵'簡s,"畫的CVT基因(acCefT)。使用引物attBlF-AcCefT通過PCR添加attBlF位點,使用attB2R-AcCefT-minus-Stop添力口attB2R位點。使用BP克隆酶,將擴增出的AcCEfT基因克隆進pDONR201,產(chǎn)生pDONR201-AcCefT。除去AcCefT的終止密碼子,從而在基因的羧基末端位點與His標簽或GFP標簽融合。為向penDE基因下游551bp的終止子區(qū)域添加attB2F位點以便用于在pDONRP2R-P3中克隆,使用attB2F-His8x-Tat引物。終止子區(qū)域與引物attB3R-Tat—起被克隆,添加具有終止密碼子的HIS標簽,產(chǎn)生載體pDONRP2-P3R-HIS-Tat。為獲得與GFP的羧基末端融合,使用引物attB2R-GFP禾nattB3R-Tat來產(chǎn)生載體pDONRP2-P3R-GFP-Tat。在MultisiteGatewayThree-FragmentVectorConstructionKit的LR反應(yīng)中,將這些pDONRTM載體組合于pDESTTMR4-R3中,制造出分別具有PcbC啟動子、AcCefT基因、His或GFP標簽和PenDE基因終止子的目標載體。表l:用于0^,&7@克隆的引物。粗體顯示的核苷酸代表Gateway⑤系統(tǒng)的att重組位點,斜體代表保持了HIS標簽、GFP標簽和AcCefT基因之間的框的核苷酸,下劃線的核苷酸代表HIS標簽的8個氨基酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2用實施例1中設(shè)計的Cg/T表達盒轉(zhuǎn)化尸em'cz'〃/wmc/zn^oge做mATCC28089Ce伍/Cg/F/CmcH(構(gòu)建被描述于WO2004106347中)為進行對尸em'c/肌wmc/io^oge肌mATCC28089Ce/E/C^/F/Cmc//的轉(zhuǎn)化實驗,使用生產(chǎn)大約0.3g/L己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的菌株。制造并分離原生質(zhì)體,通過具有pcbC啟動子、Ce/T基因和penDE終止子的pDESTTMP4-R3載體的共轉(zhuǎn)化來進行轉(zhuǎn)化(Alvarez,1987),在用乙酰胺作為唯一氮源的平板上用AMDS基因作為選擇標記。使用Trizol(Iiwitrogen)來分離轉(zhuǎn)化子的總RNA,使用AcCefT特異性引物(AcCefTFl;5,-TCGATTCGTACCAGCACCAGGC-3,)禾口attB2-HIS標簽引物(5,-TGGTGATGGTGATGGTGGACCACTT-3,),用RT-PCR珠(Amersham)來測定陽性轉(zhuǎn)化子,獲得384bp的PCR片段。實施例3培養(yǎng)尸em'd〃/MmcArvwgg做mATCC28089Ce伍/Cg/F/Cmc//Cg/T并測量己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的分泌將5個CefT轉(zhuǎn)化子的菌絲體接種進50mL搖瓶中的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中,所述培養(yǎng)基含有(g/L):葡萄糖(5);乳糖(80);尿素(4.5);(NH4)2S04(1.1);Na2SO"2.9);KH2P04(5.2);K2HP04(4.8)和10mL/L微量元素溶液A,其中含有檸檬酸(150);FeS04.7H20(15);MgS04.7H20(150);H3B03(0.0075);CuS04.5H20(0.24);CoS04.7H20(0.375);ZnS04.7H20(5);MnS04.H20(2.28);CaCl2.2H20(0.99);3g/L己二酸;在滅菌前的pH為6.5。在25。C,280rpm下生長7天后,沉淀出細胞,使用NMR分析上清液來測量頭孢菌素的形成。結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)清楚顯示了CefT基因在尸.dz^wge"wm基因組中整合對于頭孢菌素生產(chǎn)的積極影響。表2:Pem'cz7/z.wmcAo^oge肌mATCC28089(^/27(^/F/Cwc//的CefT基因轉(zhuǎn)化子的搖瓶培養(yǎng)物中己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.一種頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其特征在于,其經(jīng)過異源CefT基因的轉(zhuǎn)化,并且,由此,用所述異源CefT基因轉(zhuǎn)化過的所述微生物的頭孢菌素生產(chǎn)能力與未用所述異源CefT基因轉(zhuǎn)化過的微生物的頭孢菌素生產(chǎn)能力的比例為至少1.2。2.根據(jù)權(quán)利要求1的頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其特征在于,所述異源C"e/T基因源自^cre附o"z'wm,"f尤選i也,源自v4cremowfw附c/1/7soge"wm,最優(yōu)選地,源自Jc"mom'wmc/o^ogem/mCIO,或是所述CeyT基因的同源物,所述同源物編碼與來自爿cremom'wnc/o^ge肌mC10的CefT蛋白相比基于蛋白基礎(chǔ)具有超過30%同源性的Ce汀蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其中,所述微生物天然能生產(chǎn)頭孢菌素,或者通過遺傳工程改造獲得了生產(chǎn)所述頭孢菌素的能力。4.根據(jù)權(quán)利要求3的頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其中,所述微生物可選自尸em'a7/z.wm、^y/erg7'〃ws、5V;-eptom;/c&s"禾口JcremomYwz豐勾成的纟且。5.根據(jù)權(quán)利要求4的頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其中,尸訓(xùn)'"7//"附菌株,優(yōu)選地,Pem'c""wmc/o^ge做m,在用編碼擴展酶的基因轉(zhuǎn)化以及任選地編碼羥化酶、羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶或者羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶和O-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因進一步轉(zhuǎn)化后獲得了生產(chǎn)頭孢菌素的能力,所述Penicillimn分別能生產(chǎn)7-ADCA、7-ADAC、7-ACA和7-氨基-3-氨基甲酰-氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙?;苌铩?.用于構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的微生物的方法,所述方法包括下述步驟a.從合適的宿主分離CeZr基因;以及b.用步驟a中分離的所述CefT基因轉(zhuǎn)化所述頭孢菌素生產(chǎn)微生物,前提是所述宿主和所述頭孢菌素生產(chǎn)微生物并非同一生物。7.—種生產(chǎn)頭孢菌素的工藝,所述工藝包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的頭孢菌素生產(chǎn)微生物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的工藝,其中,所述頭孢菌素選自7-ADCA、7-ACA、7-ACCA和7-氨基-3-氨基甲酰-氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙酰化衍生物構(gòu)成的組。全文摘要本發(fā)明涉及頭孢菌素生產(chǎn)微生物,其特征在于,其經(jīng)過異源CefT基因的轉(zhuǎn)化,并且,由此,用異源CefT基因轉(zhuǎn)化過的微生物的頭孢菌素生產(chǎn)能力與未用異源CefT基因轉(zhuǎn)化過的微生物的頭孢菌素生產(chǎn)能力的比例為至少1.2。此外,本發(fā)明提供了生產(chǎn)頭孢菌素生產(chǎn)微生物的方法以及使用頭孢菌素生產(chǎn)微生物來發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素的工藝。文檔編號C12R1/645GK101389635SQ200780006569公開日2009年3月18日申請日期2007年2月23日優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日發(fā)明者耶羅恩·赫爾本·尼蘭德,阿諾德·雅各布·馬蒂歐·德里森,馬爾科·亞歷山大·范德勃戈,馬庫斯·漢斯,魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司
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