專利名稱：：生產(chǎn)尸胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)尸胺的方法。更特別地，本發(fā)明涉及重組微生物的用途，所述重組;f效生物包含生產(chǎn)尸胺所必需的以去調(diào)節(jié)形式存在的DNA分子?，F(xiàn)有技術(shù)運蛋白基因引入賴氨酸生產(chǎn)微生物來生產(chǎn)尸胺的方法。JP2004222569公開了通過培養(yǎng)具有賴氨酸脫羧酶活性和高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型的重組棒桿菌來生產(chǎn)尸胺。發(fā)明簡述在一方面，本發(fā)明提供了通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶和至少一種去調(diào)節(jié)的基因，該基因選自那些在賴氨酸的生物合成途徑中所必需的基因。在另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)聚酰胺的方法，其包括如上所述的用于生產(chǎn)尸胺的步驟，并將尸胺與二羧酸相反應(yīng)。發(fā)明詳述在接下來的說明書中，廣泛地使用了大量術(shù)語。此處提供了定義來促進對發(fā)明的理解。術(shù)語尸胺意味著1，5-二氨基戊烷。啟動子.指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA的DNA序列。通常啟動子定位于基因的5，區(qū)域，鄰近結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子。如果啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，那么轉(zhuǎn)錄效率會響應(yīng)于誘導(dǎo)試劑而提高。相反，如果啟動子是組成型啟動子，轉(zhuǎn)錄效率則不受誘導(dǎo)試劑調(diào)節(jié)。增強子.啟動子元件.增強子可增加特定基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的效率，無論增強子相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的距離或方向。表達.表達是從結(jié)構(gòu)基因生產(chǎn)多肽的過程。該過程涉及將基因轉(zhuǎn)錄成mRNA并將此mRNA翻譯成多肽?？寺≥d體.DNA分子，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、或噬菌體，其具有在宿主細胞中自主復(fù)制的能力，并可用來轉(zhuǎn)化細胞用于基因操作?？寺≡泽w通常含有一個或少數(shù)的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點，外源DNA序列可以確定的形式在不損失栽體的必需生物功能的情況下插入這些位點，以及適合用于鑒定和篩選克隆載體轉(zhuǎn)化過的細胞的標(biāo)志基因。標(biāo)志基因通常包括那些提供四環(huán)素抗性或氨節(jié)青霉素抗性的基因。表達載體.包含克隆的編碼外源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的DNA分子，所述DNA分子提供外源蛋白質(zhì)在重組體宿主中的表達。通常，將克隆基因的表達置于特定調(diào)節(jié)序列例如啟動子和增強子序列的控制下(即，有效連接)。啟動子序列可為組成型的或誘導(dǎo)型的。重組宿主.重組宿主可以是任何原核的或真核的細胞，其含有克隆載體或表達載體。該術(shù)語也意味著包括那些經(jīng)遺傳工程操作的在宿主細胞染色體或基因組中含有克隆基因的原核或真核細胞。合適宿主的例子見Sambrook等人，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)["Sambrook"I。如此處所用的，基本純的蛋白質(zhì)意味著目的純化蛋白是基本上無污染的細胞組分，如通過在聚丙烯酰胺-十二烷基石克酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)之后的單條帶所證實的。術(shù)語"基本上純的"進一步意味著描述某分子通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的一種或多種純度或均一性特征來表征是均一的。例如，基本上純的賴氨酸脫羧酶在某些參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的實驗偏差內(nèi)將顯示恒定的和可重復(fù)的特征，所述參數(shù)如下分子量、色鐠遷移、氨基酸組成、氨基酸序列、封閉的或未封閉的N末端、HPLC洗脫圖譜、生物活性、和其它此類參數(shù)。然而，該術(shù)語并不意味著排除賴氨酸脫羧酶與其它化合物的人工的或合成的混合物。另外，該術(shù)語并不意味著排除分離自重組宿主的賴氨酸脫羧酶融合蛋白。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少一種去調(diào)節(jié)的選自下列的基因(i)包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡，定二羧酸琥珀酰酶(succinylase)、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)酪醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶，如果天冬氨酸激酶作為基因(i)而去調(diào)節(jié)，則必須有除天冬氨酸激酶之外的另一種基因(i)被去調(diào)節(jié)。本發(fā)明的方法描述了如此處所述的和/或以導(dǎo)致尸胺產(chǎn)生的方式培養(yǎng)的重組孩t生物，其優(yōu)選地包括載體或基因(例如，野生型和/或突變型基因)。術(shù)語"重組"微生物包括已經(jīng)遺傳改變、修飾或工程化(例如遺傳工程化的)的微生物(例如，細菌、酵母細胞、真菌細胞等等)，以便其展示與其所來源的天然存在的微生物相比改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，當(dāng)遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時)。術(shù)語"去調(diào)節(jié)的"包括基因產(chǎn)物的表達(例如，賴氨酸脫羧酶)處于低于或高于在微生物操作前或在未經(jīng)操作的相當(dāng)?shù)暮⑹飞镏兴磉_水平的表達水平。在一個實施方案中，微生物可經(jīng)遺傳操作(例如，遺傳工程化的)來表達比微生物操作前所表達的水平或未經(jīng)操作的相當(dāng)微生物中的表達水平更低或更高水平的基因產(chǎn)物。遺傳操作可包括但不限于，改變或修飾調(diào)節(jié)序列或與特定基因的表達相關(guān)的位點(例如，通過除去強啟動子，誘導(dǎo)型啟動子或多重啟動子)、修飾特定基因的染色體位置、改變與特定基因例如核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子鄰近的核^列、減少特定基因的拷貝數(shù)量、修飾涉及特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活因子等等)、或本領(lǐng)域中慣用的去調(diào)節(jié)特定基因表達的其它常規(guī)方法(包括但不限于使用翻譯核酸分子、或其它方法來敲除或阻斷靶蛋白的表達)。術(shù)語"去調(diào)節(jié)基因活性"例如去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶，還意味著將基因活性例如賴氨酸脫羧酶活性引入微生物，所述微生物中各自基因活性例如脫羧酶活性在此前并未發(fā)現(xiàn)過，例如優(yōu)選通過遺傳工程的方法將一個或多個拷貝的異源基因例如賴氨酸脫羧酶基因《1入微生物。賴氨酸脫羧酶催化L-賴氨酸脫羧化為尸胺。該酶被分類為E.C.4.1.1.18。分離自大腸桿菌(Escherichiacoli)的具有賴氨酸脫羧酶活性的酶是cadA基因產(chǎn)物(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,Entryb4131)和ldcC基因產(chǎn)物(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,EntryJW0181)。SEQIDNO:l公開了大腸桿菌cadA的氨基酸序列，SEQIDNO:2公開了大腸桿菌ldcC的氨基酸序列。編碼大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因的DNA分子可通過利用具有反向翻譯自氨基酸序列SEQIDNO:l或2的多核苷酸的探針篩選cDNA或基因組文庫來獲得。備選地，大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因可通過利用相互引發(fā)長寡核苷酸來合成DNA分子而獲得。見例如，Ausubel等人，(eds.)，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,8.2.8至8.2.13頁(19卯)'，A細bel".另夕卜，見Wosnick等人.，Gene60:115(1987);和Ausubel等人(eds.)，SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,第3版，8-8至8-9頁(JohnWiley&Sons,Inc.1995)。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的確定技術(shù)提供了合成長度為至少2千堿基的DNA分子的可能。Adang等人，PlantMolec.Biol.21:1131(1993);Bambot等人，PCRMethodsandApplications2:266(1993);Dillon等人，"UseofthePolymeraseChainReactionfortheRapidConstructionofSyntheticGenes,"inMETHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.15:PCRPROTOCOLS:CURRENTMETHODSANDAPPLICATIONS,White(ed.)，263-268頁，(HumanaPress,Inc.1993);Holowachuk等人，PCRMethodsAppl.4:299(1995)?？缮a(chǎn)與母酶相比含有保守氨基酸改變的大腸桿菌賴氨酸脫羧酶的變體。即，可獲得含有SEQIDNO:l或2的一個或多個氨基酸替換的變體，其中用烷基氨基酸替換賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的烷基氨基酸，用芳香族氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的芳香族氨基酸，用含硫氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的含硫氨基酸，用羥基氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的含羥基氨基酸，用酸性氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的酸性氨基酸，用堿性氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的堿性氨基酸。在共同的氨基酸中，例如"保守氨基酸替換"可列舉為下列組之一中的氨基酸間的替換(l)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸，(3)半胱氨酸和甲硫氨酸，(4)絲氨酸和蘇氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(7)賴氨酸、精氨酸和組氨酸。大腸桿菌賴氨酸脫羧酶中的保守氨基酸改變可通過用核苷酸替換SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所述的核苷酸來引入。此類"保守氨基酸"變體可通過例如寡核苷酸定向誘變、接頭掃描誘變、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的誘變等等得到。Ausubd等人，前述，8.0.3-8.5.9頁；Ausubel等人(eds.)，SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,第三版，8-10至8-22頁(JohnWiley&Sons,Inc.1995)。通常還可見，McPherson(ed.)，DIRECTEDMUTAGENESIS:APRACTICALAPPROACH,IRLPress(1991)。此類變體將L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的能力可利用標(biāo)準(zhǔn)的酶活性測定法例如此處所述的測定法來測定。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的賴氨酸脫羧酶是來自大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶及其等同基因，其與相應(yīng)的"原始"基因產(chǎn)物有高達80%、優(yōu)選地卯。/。和最優(yōu)選的95%和98%的序列同一性(基于氨基酸序列)，并仍具有賴氨酸脫羧酶的生物學(xué)活性。這些等同基因可容易地由本領(lǐng)域已知的方法通過引入核苷酸替換、缺失或插入來構(gòu)建。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案是大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶(SEQIDNO:l和NO:2)，通過應(yīng)用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutmicum)的密碼子選擇將其回譯成DNA。這些賴氨酸脫羧酶多核苷酸序列對于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物特別是谷氨酸棒桿菌中賴氨酸脫羧酶的表達是有用的。除了去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因外，根據(jù)本發(fā)明的微生物必須具有至少一種選自組(i)的去調(diào)節(jié)的基因。組(i)是在賴氨酸的生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一組基因，并由下列基因組成天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氬吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶。根據(jù)本發(fā)明的方法至少一種組(i)的基因必須被去調(diào)節(jié)。優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的微生物中多于一種組(i)的基因，例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種基因被去調(diào)節(jié)。組(i)的基因和基因產(chǎn)物是本領(lǐng)域中公知的。EP1108790公開了高絲氨酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶基因中的突變，其對于重組棒桿菌在賴氨酸生產(chǎn)中的生產(chǎn)能力具有有益影響。WO0063388公開了天冬氨酸激酶基因中的突變，其對重組棒桿菌在賴氨酸生產(chǎn)上的生產(chǎn)能力具有有益影響。引用EP1108790和WO0063388作為與上述這些基因突變有關(guān)的參考。下列的表中提及了各個基因的每一種基因/基因產(chǎn)物可能的去調(diào)節(jié)方式。在表的"去調(diào)節(jié)"列中所引用的文獻和文件在此引用作為與基因去調(diào)節(jié)有關(guān)的參考。表中所提到的方式是各自基因去調(diào)節(jié)的優(yōu)選實施方案。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氬吡咬二羧酸還原酶、四氫吡咬二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶的基因去調(diào)節(jié)的優(yōu)選方式是"向上"突變，其增加基因活性，例如通過利用強表達信號的基因擴增和/或增強酶活性的點突變。高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶的基因的優(yōu)選去調(diào)節(jié)方式是"向下"突變，其降低基因活性，例如通過基因缺失或基因破壞、利用弱表達信號和/或破壞或降低酶活性的點突變。如果天冬氨酸激酶作為基因(i)組的成員而被去調(diào)節(jié)，則除天冬氨酸激酶外的至少第二種基因(i)成員也必須被去調(diào)節(jié)。觀察到根據(jù)本發(fā)明的方法在微生物中生產(chǎn)的大部分尸胺是乙?；?。為了阻斷由乙酰輔酶A依賴型二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致的乙?；磻?yīng)，且為了增加尸胺的產(chǎn)量，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是去調(diào)節(jié)生產(chǎn)微生物的二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶，特別地降低其活性(例如通過基因的缺失或破壞)。為表達根據(jù)本發(fā)明的去調(diào)節(jié)基因，必須將編碼酶的DNA序列有效連接至在表達載體中控制轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)節(jié)序列上，然后將其引入原核或真核宿主細胞。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，例如啟動子和增強子，表達載體可包括翻譯調(diào)節(jié)序列和適合用于篩選帶有表達載體的細胞的標(biāo)志基因。用于在原核宿主中表達的啟動子可以是可抑制型的、組成型的、或誘導(dǎo)型的。合適的啟動子對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，且包括那些能夠識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子、i噬菌體的Pr和PL啟動子,大腸桿菌的trp、recA、熱激、lacUV5、tac、lpp國lacXpr、phoA、gal、trc和lacZ啟動子，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的cc-淀粉酶和cj28-特異性啟動子，芽孢桿菌屬的噬菌體的啟動子，鏈霉菌屬啟動子，k噬菌體的int啟動子，pBR322的P-內(nèi)酰胺酶基因的bla啟動子，和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子。Glick，J.Ind.Microbiol.1:277(1987);Watson等人，MOLECULARBIOLOGYOFTHEGENE,第4版，BenjaminCummins(1987);Ausubel等人，同上，和Sambrook等人，同上中對原核啟動子進行了綜述。大腸桿菌賴氨酸脫羧酶表達的優(yōu)選啟動子是谷氨酸棒桿菌的sodA啟動子。在原核宿主中表達蛋白質(zhì)的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。見，例如，Williams等人""ExpressionofforeignproteinsinE.coliusingplasmidvectorsandpurificationofspecificpolyclonalantibodies,"inDNACLONING2:EXPRESSIONSYSTEMS,第2版，Glover等人(eds,)，15-58頁(OxfordUniversityPress1995)。還可見，Ward等人，"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies,"inMONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,137-185頁(Wiley-Liss，Inc.1995);以及Georgiou，"ExpressionofProteinsinBacteria,"inPROTEINENGINEERING:PRINCIPLESANDPRACTICE,Cleland等人(eds.)，101-127頁(JohnWiley&Sons,Inc.1996)?？衫枚喾N技術(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔等等將表達載體引入細菌宿主細胞。見，例如，Ausubel等人(eds.)，SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,第3版，1-1至1-24頁(JohnWiley&Sons,Inc.1995)。本發(fā)明的重要方面涉及培育或培養(yǎng)此處所述的重組微生物，以便生產(chǎn)目的化合物尸胺。術(shù)語"培養(yǎng)"包括維持和/或生長本發(fā)明的活的微生物(例如，維持和/或生長培養(yǎng)物或菌林)。在一個實施方案中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在另一實施方案中，在固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選的實施方案中，在包含必需用于或有益于微生物的維持和/或生長的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基(例如，無菌的液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。可用的碳源包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油；脂肪酸，例如軟脂酸、硬脂酸和亞油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有機酸，例如乙酸。在優(yōu)選的實施方案中，將葡萄糖、果糖或蔗糖用作碳源。這些物質(zhì)可分別或作為混合物使用?？捎玫臍庠窗挠袡C化合物，例如蛋白胨，酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素、或者無機化合物，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或作為混合物使用?？捎米髁自吹挠辛姿?、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或含有鈉的相應(yīng)的鹽。培養(yǎng)基必須進一步含有生長羧必需的金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸亞鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外還可使用必要的生長促進物質(zhì)例如氨基酸和維生素?？上蚺囵B(yǎng)基中進一步添加合適的前體?？蓪⑺龅奈癸曃镔|(zhì)作為單批加入培養(yǎng)物，或在培養(yǎng)過程中進行合適地喂飼。優(yōu)選地，在控制的pH下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語"控制的pH"包括可完成目的精細化學(xué)品例如尸胺生產(chǎn)的任何pH。在一個實施方案中，在大約7的pH下培養(yǎng)^:生物。在另一實施方案中，在6.0至8.5的pH下培養(yǎng)微生物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來維持目的pH。例如，將堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸用來合適地控制培養(yǎng)物的pH。另外優(yōu)選地，在控制的通氣下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語"控制的通氣，，包括充足通氣(例如，氧氣)來導(dǎo)致目的精細化學(xué)品例如尸胺的生產(chǎn)。在一個實施方案中，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的氧氣水平例如通過調(diào)節(jié)溶解在培養(yǎng)基中的氧氣的量來控制通氣。優(yōu)選地，培養(yǎng)物的通氣通過攪拌培養(yǎng)物來控制。攪拌可通過推進器或類似的機械攪拌裝置、通過旋轉(zhuǎn)或振蕩培養(yǎng)容器(例如，發(fā)酵罐)或通過各種泵送裝置來提供。攪拌還可通過進一步通過將無菌空氣或氧氣通過培養(yǎng)基(例如，通過發(fā)酵混合物)來控制。另外優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物是在無過量泡沫的情況下培養(yǎng)的(例如，通過添加消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯)。此外，本發(fā)明的微生物可在控制的溫度下培養(yǎng)。術(shù)語"控制的溫度"包括任何致使目的精細化學(xué)品例如尸胺產(chǎn)生的溫度。在一個實施方案中，控制的溫度包括15。C至95。C之間的溫度。在另一實施方案中，控制的溫度包括15。C至70。C之間的溫度。優(yōu)選的溫度是20。C至55。C之間，更優(yōu)選地在30。C至45。C之間或30。C至50。C之間。可在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，且優(yōu)選地連續(xù)或間歇地通過常規(guī)培養(yǎng)方法例如靜止培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)(例如，旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)等等)、通氣旋動培養(yǎng)、或發(fā)酵來培養(yǎng)微生物。在優(yōu)選的實施方案中，在搖瓶中培養(yǎng)微生物。在更加優(yōu)選的實施方案中，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物(例如，發(fā)酵方法)。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括但不限于，分批、補料分批和連續(xù)的發(fā)酵方法。術(shù)語"分批方法，，或"分批發(fā)酵"指的是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基、營養(yǎng)物質(zhì)、補充添加劑的組分等在發(fā)酵之初加入，在發(fā)酵過程中并不進行改變，然而可以對諸如pH和氧氣濃度的此類因素進行控制來防止過度的培養(yǎng)基酸化和/或微生物死亡。術(shù)語"補料分批方法"或"補料分批"發(fā)酵指的是分批發(fā)酵，只是隨著發(fā)酵的進行加入一種或多種底物或補充物的(例如增量或連續(xù)加入)。術(shù)語"連續(xù)方法"或"連續(xù)發(fā)酵"指的是一種系統(tǒng)，其中向發(fā)酵罐中連續(xù)加入確定的發(fā)酵培養(yǎng)基，并同時移除等量已用的或"條件，，培養(yǎng)基，優(yōu)選地用于回收目的尸胺。多種此類方法已被開發(fā)且在本領(lǐng)域中是公知的。本發(fā)明的方法可進一步包括回收尸胺的步驟。術(shù)語"回收"尸胺包括從培養(yǎng)基中提取、收獲、分離或純化化合物?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的任何常規(guī)分離或純化方法來完成化合物的回收，所迷方法包括但不限于用常規(guī)的樹脂(例如，陰離子或陽離子交換樹脂、非離子吸附樹脂等等)處理、用常規(guī)的吸附劑(例如，活性碳、硅酸、硅膠、纖維素、礬土等等)處理、改變pH、溶劑萃取(例如，用常規(guī)的溶劑例如醇、乙酸乙酯、己烷等等)、蒸餾、透析、過濾、濃縮、結(jié)晶、重結(jié)晶、pH調(diào)節(jié)、凍干法等等。例如可通過首先除去微生物從培養(yǎng)基中回收尸胺。然后將除去生物量的發(fā)酵液通過或穿過陽離子交換樹脂來去除不想要的陽離子，然后通過或穿過陰離子交換樹脂上來除去不想要的無機陰離子和具有比尸胺更強酸度的有機酸。在另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)聚酰胺(例如nylon⑧)的方法，其包括如上所述的用于生產(chǎn)尸胺的步驟。將尸胺以已知的方式與二、三或多羧酸反應(yīng)來獲得聚酰胺。優(yōu)選地將尸胺與含有4至10個碳的二羧酸例如琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸等等相反應(yīng)。二羧酸優(yōu)選地是游離酸。實施例1.賴氨酸脫羧酶基因的克隆使用PCR引物WKJ12/WKJ13和WKJ35/WKJ34和大腸桿菌的染色體DNA作才莫板來分別擴增含有cadA和ldcC基因的DNA片段。純化擴增的DNA片段、用限制酶消化，Asp718扁el用于cadA而XhoI/Spel用于IdcC，并將其連接于用相同的限制酶消化的pClik5aMCS載體，從而分別得到的pClik5aMCScadA和pClik5aMCSldcC。為增加ldcC基因的表達，將谷氨酸棒桿菌sodA啟動子(Psod)在該基因的起始密碼子之前替換。利用PCR引物從每個染色體DNA中擴增含有sodA啟動子和ldcC基因編碼區(qū)的DNA片段，其中WKJ31/OLD47用于Psod,而WKJ33/WKJ34用于WcC，將所述DNA片段用作以WKJ31/WKJ34作引物的融合PCR的模板。純化融合的PCR片段、用Xhol和Spel消化片段、并將其插入pClik5aMCS載體的Xhol和Spel剪切位點之間來構(gòu)建pClik5aMCSPsod-ldcC。所用的寡核苷酸引物WKJ12caagctccttcgagctggcaWKJ13gggt33cgt33acc3g3g33WKJ31gagagagactcgagtagctgccaattattccgggWKJ33acgaaaggattttttacccatgaacatcattgccattatgWKJ34ctctctctcactagtgctcaatcacatattgcccaWKJ35gagagagactcgagccggaagcgatggcggcatcOLD47gggtaaaaaatcctttcgtag2.構(gòu)建尸胺生產(chǎn)菌抹為構(gòu)建尸胺生產(chǎn)菌林，將賴氨酸生產(chǎn)菌LU11271用具有賴氨酸脫羧酶基因的重組質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化，所述LU11271是通過將點突變T311I引入天冬氨酸激酶基因、復(fù)制二氨基庚二酸脫氫酶基因和破壞磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因而衍生于谷氨酸棒桿菌野生型菌林ATCC13032。3.搖瓶培養(yǎng)中的尸胺生產(chǎn)對重組菌林進行搖瓶實驗來測試尸胺生產(chǎn)。使用與W02005059139中所述的賴氨酸生產(chǎn)相同的培養(yǎng)基和條件。對對照宿主菌林和具有pClik5aMCS的重組菌林進行平行測試。將菌林在CM瓊脂上在30°C下預(yù)培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)的細胞收獲入含有1.5ml的0"。/。NaCl的微型管，并在旋渦后通過610nm的吸光度來測定細胞濃度。為進行主培養(yǎng)，將懸浮細胞接種入10ml的生產(chǎn)培養(yǎng)基中達到1.5的初始OD值，所述培養(yǎng)基盛裝在含有0.5g的CaC03的高壓滅菌的100ml錐形瓶中。主培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)搖床(InforsAJ118,Bottmingen，瑞士)上，以200轉(zhuǎn)/分在30。C下進行48-78小時。尸胺和賴氨酸的濃度利用HPLC(Agilent1100系列LC系統(tǒng))來測定。在培養(yǎng)了含有賴氨酸脫羧酶基因的所有重組菌林的發(fā)酵液中，積累了大量的尸胺。相反，觀察到賴氨酸生產(chǎn)能力的顯著下降?？紤]到賴氨酸向尸胺的完全轉(zhuǎn)化，必須產(chǎn)生與賴氨酸相同數(shù)量的尸胺分子。然而，所積累的尸胺的量卻少于宿主菌抹所生產(chǎn)的賴氨酸的量，另一方面，相當(dāng)大量的副產(chǎn)物乙?；钒殡S地積累，導(dǎo)致了糖產(chǎn)量的降低。除了HPLC分析，還通過質(zhì)鐠方法鑒定了尸胺和乙酰基尸胺。4.乙?；沸纬擅傅蔫b定為鑒定乙?；沸纬擅?，進行了蛋白質(zhì)純化。收獲了培養(yǎng)在CM液體中的谷氨酸棒桿菌菌林ATCC13032或一些衍生物、將其洗滌并懸浮在0.5倍體積的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，所述緩沖液由50mMTris-HCl(pH7.8)，0.02%Brij35，蛋白抑制劑混合物(Complete,Roche)和20%甘油組成。利用賴L流器(M-110EH，MicrofluidicsCo.)裂解細胞懸浮物后利用微量過濾器(MF42，Satorius)進行過濾。通過使用QSepharose(Q瓊月旨糖)(AmershamBioscience,50x300mm，在10mMTris(pH7.5)緩沖液中的0.0-0.5MNaCl的線性梯度，10ml/min的流速)、PhenylSepharose(苯基瓊月旨糖)(AmershamBioscience,50x300mm,在10mMTris(pH7.5)緩沖液中的1.5-0.0M乙酸銨的線性梯度，10ml/min的流速)、S叩erdex(AmershamBioscience,26x600mm,10mMTris(pH7.5)緩沖液，4ml/min的流速)、Mono-Q(AmershamBioscience,5x50mm,在10mMTris(pH7.5)緩沖液中的0.0-0.5M-NaCl的線性梯度，1ml/min的流速)和Superose(AmershamBioscience,15x300mm，10mMTris(pH7,5)緩沖液，0,3ml/min的流速)一系列柱子來純化濾液中的酶。整個純化步驟中，對級分中的乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶活性和酶反應(yīng)混合物中的乙?；返拇嬖谶M行監(jiān)測。在下列條件下通過監(jiān)測1ml的總體積中由于產(chǎn)生TNB(硫代硝基苯甲酸)而導(dǎo)致的412nm處吸收的增加來測定酶活性10mMTris-HCl(pH7.8)，0.1mMDTNB(5，5，-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸))，0.25mM乙酰輔酶A，5mM尸胺，酶溶液。利用TNB的13.6mM"xcm"的摩爾消光系數(shù)來計算比活性。將來自Superose柱子的含有酶活性的級分上樣于SDS-PAGE凝膠。從考馬斯染色凝膠切下后，用改良的胰蛋白酶(Roche，Mannheim)如Hermann等人所述(Electrophoresis(2001)，22，1712-1723)消化蛋白點。在nano-HPLC分離肽(LCPackings,RP18柱，長度15cm,i.d.75pm)之后，在LCQadvantage(ThermoElectron)上利用MASCOT軟件(Davidetal.(l999)Electrophoresis,:20，3551-3567)進行了質(zhì)語鑒定。結(jié)果，鑒定出作為潛在的乙?；沸纬擅傅囊阴＾D(zhuǎn)移酶(Genebank檢索號NP—600742)。5.質(zhì)粒構(gòu)建和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的破壞為了進行所鑒定的編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因的染色體破壞，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，其允許通過兩次連續(xù)的同源重組事件的無標(biāo)記操作。利用一套PCR引物(WKJ203/WKJ205用于上游而WKJ206/WKJ204用于下游)從谷氨酸棒桿菌染色體DNA擴增了含有基因的上游和下游區(qū)域的DNA片段，將所述片段用作模板利用PCR引物WKJ203/WKJ204進行融合PCR來制備除去了基因中間區(qū)域的融合片段。純化了融合PCR的產(chǎn)物，用XhoI和SpeI進行消化，并將其插入用相同的限制酶消化的pClikintsacB栽體，這使得序列在谷氨酸棒桿菌的基因組基因座處得以整合(Becker等人(2005)，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,71(12)，p.8587畫8596)。然后將質(zhì)粒用于破壞乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的天然編碼區(qū)域。所用的菌林是LU11271LdcC，其中l(wèi)dcC基因被整合入染色體的bioD基因座上，且其同時產(chǎn)生尸胺和乙?；贰纱芜B續(xù)的重組事件(在上游和下游區(qū)域各有一次)是破壞基因中間序列所必需的。所破壞的突變體通過利用引物WKJ203/WKJ204的PCR和DNA雜交分析來確認(rèn)。所用的寡核苷酸引物WKJ203gctcctcgaggcattgtatactgcgaccactWKJ204cggt3ct3gtgt3gtg3gcc33g3c3tggWKJ205cgattccgtgattaagaagcgcttcaaccagaacatcgacWKJ206gtcgatgttctggttgaagcgcttcttaatcacggaatcg6.對乙?；沸纬珊褪飞a(chǎn)能力的影響為分析乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的破壞對乙?；沸纬珊褪飞a(chǎn)能力的影響，對破壞的突變體進行了搖瓶實驗。使用了與尸胺生產(chǎn)相同的培養(yǎng)基和條件(同上)。破壞的突變體沒有顯示處乙?；返姆e累。這表明只有所鑒定的乙酰轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)乙?；返男纬?。因此，通過破壞所述基因致使乙?；沸纬傻南岣吡耸飞a(chǎn)能力。乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因序列和多肽序列如下所述:乙酰轉(zhuǎn)移酶基因序列:GATGTGGAAACCGCCAGCGATGCCAACTGTTTAA蛋白質(zhì)序列:LYNRLGFVPLGY工PSDDDGTPELAMWKPPAMPTV權(quán)利要求1.通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少一種去調(diào)節(jié)的選自組(i)的基因，組(i)由下列組成天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶，條件是如果天冬氨酸激酶作為基因(i)被去調(diào)節(jié)，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二種基因(i)必須被去調(diào)節(jié)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物屬于棒桿菌屬。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶對所述微生物是異源的。5，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重組微生物具有來自埃希氏菌屬的賴氨酸脫羧酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述賴氨酸脫羧酶具有SEQIDNO:l或2的多肽序列，或與SEQIDNO:l或2有至少80D/Q同一性的具有賴氨酸脫羧酶活性的多肽序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物(MO)的二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶活性被去調(diào)節(jié)。8.生產(chǎn)聚酰胺的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1生產(chǎn)尸胺，并將尸胺與二羧酸反應(yīng)。全文摘要通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少一種去調(diào)節(jié)的選自組(i)的基因，組(i)由下列組成天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶，條件是如果天冬氨酸激酶作為基因(i)被去調(diào)節(jié)，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二種基因(i)必須被去調(diào)節(jié)。文檔編號C12P13/00GK101389765SQ200780006903公開日2009年3月18日申請日期2007年3月23日優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日發(fā)明者A·赫羅爾德,C·克洛普羅格,H·施羅德,O·策爾德爾,W·K·曾申請人:巴斯夫歐洲公司