專利名稱：：人胚胎干細(xì)胞方法與podxl表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于鑒定樣品中的未分化胚胎干細(xì)胞并從樣品中分離它們的方法；以及用于去除樣品內(nèi)這種細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及在這種方法中有作用的組分試劑盒(kitofparts)。
背景技術(shù)：
：未分化的人胚胎干細(xì)月包在醫(yī)學(xué)中具有多種用途，例如用于組織再生和修復(fù)，且人們相信其在今后將變得越發(fā)重要。目前，捐獻(xiàn)的器官和組織常常用來*#換患病或受損組織，^f旦對可移4直組織和器官的需求已大大超過了有效供給量。干細(xì)胞尤其是人胚胎干細(xì)胞可定向分化為特定的細(xì)胞類型，提供了可更新性^,換細(xì)胞和組織來源的可能性，用來治療帕金森和阿爾茨海默病、脊髓損傷、中風(fēng)、燒傷、心臟病、津唐尿病、骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕'f生關(guān)節(jié)炎。目前，用來鑒定人胚胎干細(xì)胞的試驗(yàn)包括培育并再次培養(yǎng)所述干細(xì)胞幾個月。這確保了細(xì)胞能夠長期自我更新。通過顯纟敬鏡觀察該培養(yǎng)物，以判斷細(xì)胞看上去健康且保持未分化。利用特殊技術(shù)來確定僅在未分化細(xì)胞上所發(fā)現(xiàn)的表面標(biāo)志物的存在。另一個重要的試驗(yàn)是檢測通常由未分化細(xì)胞生成的稱為Oct-4蛋白的存在。Oct-4是一種轉(zhuǎn)錄因子，即其有助于基因在恰當(dāng)?shù)臅r間開啟或關(guān)閉，是細(xì)月包分化和胚胎發(fā)育過程中的重要部分。檢測人胚胎干細(xì)胞是否為多能性，通過1)允許細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中自發(fā)分化；2)處理細(xì)胞使其分化形成特定細(xì)胞類型；或者3)將該細(xì)胞注射入免疫抑制的小鼠體內(nèi)，4企測稱為畸胎瘤的良性腫瘤的形成。畸胎瘤通常包含多種分化或部分分化的細(xì)胞類型-表明胚胎干細(xì)l包能夠分化為多種細(xì)月包類型。盡管未分4匕人胚胎干細(xì)月包本身可用于細(xì)月包療法中，^f旦人們^人為，相比于人胚胎干細(xì)力包，采用已開始分化或已經(jīng)分4b的細(xì)胞比4交有好處。促進(jìn)未分化人胚胎干細(xì)胞分化為特殊細(xì)胞譜系的方法在本領(lǐng)域中為人熟知。一旦該分化過程已經(jīng)開始或繼續(xù)，則去除或破壞未分化人胚胎干細(xì)胞則比較有益，否則其可能形成不需要的畸胎瘤。因此，可以看出鑒定或分離未分化人胚胎干細(xì)胞非常有利(因?yàn)槠浔旧砜捎糜谥委熤谢蚪?jīng)促進(jìn)可分化為可用于治療中的特定細(xì)胞諳系)。從細(xì)胞混合物中去除或破壞未分化人胚胎干細(xì)胞也非常有利，細(xì)胞混合物中的部分細(xì)胞已經(jīng)開始分化或已分化，因?yàn)檫@些分化細(xì)胞在治療中比較有利。現(xiàn)在仍然需要其他鑒定未分化人胚胎千細(xì)力包的方法。本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)足糖萼蛋白樣蛋白1前體是未分化人胚胎干細(xì)胞的一個標(biāo)志物。本說明書中對之前所發(fā)表文獻(xiàn)的羅列和討論不必認(rèn)為是承認(rèn)該文獻(xiàn)為本領(lǐng)域現(xiàn)狀的一部分或是共有的常識。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一方面提供鑒定樣品中未分化人胚胎干細(xì)胞的方法，樣品可能包含這種細(xì)胞，該方法包括鑒定表達(dá)足糖萼蛋白樣蛋白l前體(PODXL)的才羊品內(nèi)表面上細(xì)月包。該方法可用來評估特殊樣品是否包含未分化人胚胎干細(xì)胞以及如果包含這種細(xì)胞，則評估包含多少這種細(xì)胞。因此，本發(fā)明包，括未分化人胚胎干細(xì)力包的定量。本發(fā)明的第二方面提供從包含這種細(xì)胞的樣品中分離未分化人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括分離樣品內(nèi)表達(dá)其表面上的PODXL的細(xì)胞。本方法用來^是供富集(enriched)的或基本分離的未分化人胚胎千細(xì)胞的組合物。這種組合物可用于多種方法中，例如其本身可用于細(xì)胞療法中，如下文將更詳細(xì)討論的，或者其可用作細(xì)胞來源，其經(jīng)促進(jìn)可分化為用于特定治療的特定細(xì)胞譜系，或者其可用來(體外或體內(nèi))研究可使人胚胎干細(xì)胞分化為其他細(xì)胞的因素。通常，該人胚胎干細(xì)力包的富集組合物所包含細(xì)力包的至少50%為未分化人胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選至少70%或至少90%或至少95%。優(yōu)選的，該組合物中的所有細(xì)胞均為所述未分化人胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明的第三方面提供從包含這種細(xì)胞的樣品中去除未分化人胚胎干細(xì)月包的方法，該方法包括V人才羊品中去除表達(dá)其表面上的PODXL的纟田月包。所去除的細(xì)胞可能形成如本發(fā)明第二方面中人胚胎干細(xì)胞的組合物。此外，已經(jīng)從中去除人胚胎干細(xì)胞的樣品在治療中可能非常有利，如下文將更詳細(xì)討i侖的。10本發(fā)明的第四個方面提供破壞包含這種細(xì)胞的樣品中未分化人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括破壞樣品內(nèi)表達(dá)其表面上的PODXL的細(xì)月包。石皮壞或殺死樣品中的未分化人胚胎干細(xì)胞非常有利，因?yàn)槿缦挛乃懻摰模瑥奈捶只头只?xì)胞混合物中去除未分化人胚胎干細(xì)胞有時非常有利。樣品可以為任何包含或懷疑包含一種或多種未分化人胚胎干細(xì)胞的樣品。恰當(dāng)?shù)臉悠钒ㄈ伺咛セ蛉伺咛ソM織。其他恰當(dāng)樣品包括體外培養(yǎng)的樣品。關(guān)于本發(fā)明的第三和第四方面，特別優(yōu)選樣品中的未分化人胚胎干細(xì)胞經(jīng)促進(jìn)已分化為特定細(xì)胞譜系，因此該樣品可包含未分化和分化細(xì)胞的混合物(因?yàn)槟壳胺只皇且粋€高效的過程)。通常，在這種樣品中，所述未分化人胚胎干細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞總數(shù)的百分之幾。通常，樣品中的分化細(xì)胞可以為(通過分化)起源于人胚胎干細(xì)胞的心月幾細(xì)J包、月夷島、神經(jīng)元祖細(xì)月包或間質(zhì)干細(xì)胞。在臨床應(yīng)用包含分化細(xì)胞的樣品之前，從該樣品中去除(或在其中石皮壞)未分化人胚胎干細(xì)i包將非常有利，因?yàn)樗鑫捶只?xì)刀包可能形成不需要的畸胎瘤。通常，應(yīng)去除或破壞未分化細(xì)胞的至少95%。優(yōu)選的，去除或-皮壞所述全部細(xì)胞。相對于去除，更傾向于石皮壞或殺死才羊品中的未分化細(xì)月包，以將細(xì)胞處理或分離的額外步驟降到最少。此外，人們相信殺死可能是一種更"純粹"形式的細(xì)胞去除。足糖萼蛋白樣蛋白1前體的氨基酸序列在圖9B中給出(SEQIDNO:1),也可在通過EntrezPubMed在NCBI蛋白序列翁:據(jù)庫的登陸號No000592中查到(還可參見Kershaw"a/(1997)乂^o/.C77em.272，15708-15714)。也稱為PCLP1和PODXL。為了方1^更，下文3夸4爾為PODXL。應(yīng)該理解，用在本發(fā)明所述方法中的標(biāo)志物是在未分化人胚胎干細(xì)胞中天然存在的PODXL。因此，PODXL可能具有圖9B中給出的精確序列，還可以是其天然存在的變異體。例如，根據(jù)000592,R是殘基62處T的變異體，而S是殘基196處L的變異體。在本發(fā)明第一、第二和第三方面的特別優(yōu)選實(shí)施例中，使樣品與結(jié)合部分4妄觸，該結(jié)合部分結(jié)合PODXL,通過其結(jié)合于該結(jié)合部分所述人胚胎干細(xì)胞可在樣品中鑒定，或者從樣品中分離或去除。才艮據(jù)000592，PODXL是528殘基糖基化的細(xì)月包表面多肽，其殘基1-22是單肽，而殘基23-528代表成熟蛋白。人們認(rèn)為殘基23-431是蛋白的胞外部分，而殘基432-452是3,膜區(qū)。殘基23-304代表Ser/Thr富集區(qū)。如果結(jié)合PODXL的結(jié)合部分結(jié)合PODXL的月包外區(qū)，例如在Ser/Thr富集區(qū)內(nèi)部或該區(qū)域之外，則是優(yōu)選的。合適的，該結(jié)合部分是抗體，該術(shù)語包括其片,殳或書f生物，或者合成的抗體或合成的抗體片段。結(jié)合PODXL的抗體已經(jīng)為人所知。例如，特異于人足糖萼蛋白的山羊IgG(該多克隆4元血清結(jié)合到月包外i或)可從R&DSystems,Inc購得，目錄號是AF1658。此外，單克隆抗人足糖萼蛋白抗體(小鼠IgG2A)可乂人R&DSystems,Inc購4尋，目錄號是MAB1658。在<壬何情形下，通過目前與單克隆抗體技術(shù)相關(guān)的技術(shù)，可制備針對大多數(shù)抗原的抗體。抗原結(jié)合部分可為抗體的一部分(例如Fab片段)或者合成的抗體片段(例如單鏈Fv片段[ScFv])。針對選定抗原的恰當(dāng)單克隆抗體可通過已知技術(shù)制備，例如那些在"Mo"oc/o"a/y^/6ot//esvj附朋i/a/fec/2m々wW,HZola(CRCPress,1988)和JGRHurrell(CRCPress，1982)中所4皮露的。Neuberger等人討論了嵌合抗體(1988，8,//w^"a"o加/5/c^ec/2wo/ogy5y^2/os7'm柳Part2,792-799)。多克隆抗體在本發(fā)明所述方法中非常有利。優(yōu)選單特異性多克隆抗體。恰當(dāng)?shù)亩嗫寺】贵w可利用本領(lǐng)域中熟知的方法進(jìn)4亍制備?？贵w片段例如Fab和Fab2片段還可應(yīng)用作為一般的基因工程抗體和抗體片l史。在抗體識別中涉及抗體的重《連可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL),該事實(shí)最初是通過早期的蛋白酶消化試驗(yàn)而認(rèn)識到的，并通過嚙齒類抗體的"人源化"而得到進(jìn)一步確認(rèn)。嚙齒動物源抗體的可變區(qū)可融合于人源抗體的恒定區(qū)，使得所得到的抗體保留嚙齒動物源抗體的抗原特異性(MorrisonW"/(1984)尸rac.A^"81，6851-6855)。該抗原特異性由可變區(qū)賦予，且依賴于恒定區(qū)，這一點(diǎn)是從涉及抗體片段的細(xì)菌表達(dá)的實(shí)驗(yàn)而得知的，所述抗體片段均包含一個或多個可變區(qū)。這些分子包4舌Fab才羊分子(Better""/(1998)5Wewce240，1041);Fv分子(Skerraetal(1988)5W潔e240,1038);單鏈Fv(ScFv)分子，其中Vh和VL的伴侶結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽而連4妄(Bird"a/(1998)242，423;Huston"c/(1988)胸/.JcadSc/.6^485,5879)并且包含獨(dú)立V區(qū)的單鏈抗體(dAbs)(Ward"a/(1989)A^w"341，544)。對保留其特異結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段合成中所涉及才支術(shù)的綜述可在Winter&Milstein(1991)A^fwre349，293-299中查到。13通過"ScFv分子"表示其中Vh和VL的伴侶結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽連4妄的分子。Fab、Fv、ScFv和dAb抗體片,殳均可在co//中表達(dá)并乂人其中分泌出來，^v而易于生成大量所述片l殳。全抗體和F(ab，)2片l殳為"二^介"。通過"二fT表示所述抗體和F(ab，)2片段具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。相反，F(xiàn)ab、Fv、ScFv和dAb片段為單價(jià)，僅具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合PODXL的合成抗體還可利用噬菌體顯示技術(shù)制備，如本^頁i或中為人熟^口的。特別優(yōu)選用于本發(fā)明所述方法和試劑盒中的抗PODXL抗體在下文i舉細(xì)4苗述。通常，在鑒定未分化人胚胎干細(xì)胞的方法中，結(jié)合部分進(jìn)行可檢測性標(biāo)記或者可以檢測。例如，結(jié)合部分用放射性原子或有色分子或熒光分子或易于以<壬4可其他方式^:測的分子進(jìn)4于標(biāo)記。結(jié)合部分可直4妄用可才企測性標(biāo)記物進(jìn)4亍標(biāo)記或間4妻標(biāo)記。例如，結(jié)合部分可以是可通過另一種抗體(其本身可加以標(biāo)記)進(jìn)4于;險(xiǎn)測的未標(biāo)記抗體。可替代的，第二抗體可已結(jié)合于生物素，帶標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合于生物素可用來間接標(biāo)記第一抗體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明包4舌鑒定才羊品中未分化人胚胎干細(xì)胞的方法，樣品可能包含這種細(xì)胞，該方法包括使樣品與結(jié)合部分(例如抗體)接觸，而該結(jié)合部分結(jié)合所述細(xì)胞表面上的PODXL，使得結(jié)合部分(例如抗體)結(jié)合細(xì)胞表面上的PODXL并確定哪些細(xì)胞具有在該位置結(jié)合的結(jié)合部分(例如抗體)。通常，在分離未分化人胚胎干細(xì)胞的方法中，將結(jié)合部分固定于固體載體上，因此可通過親和性結(jié)合而分離人胚胎干細(xì)胞。方便的，固體載體包括任何恰當(dāng)?shù)幕|(zhì)例如瓊脂糖、丙烯酰胺、Sepharose(商標(biāo))和Sephadex(商標(biāo))。該固體載體還可以為固態(tài)基底如凝:量滴定^反等。方便的，將結(jié)合部分進(jìn)行磁性標(biāo)記(直接或間接)，使得發(fā)生結(jié)合后，一旦提供合適的磁場即可將人胚胎干細(xì)胞與樣品的其余部分分開。用于f茲性細(xì)胞分選的孩O朱常常命名為MACS月交體超順^茲微珠。以這種方式標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞可通過^茲性激活的細(xì)胞分選(MACS)進(jìn)行分選。恰當(dāng)?shù)?，結(jié)合部分用熒光分子標(biāo)記(直接或間接)，并利用熒光活化的細(xì)胞分選儀(FACS)分離人胚胎干細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明包括從包含這種細(xì)胞的樣品中分離未分化人胚胎千細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟使樣品接觸可結(jié)合所述細(xì)胞表面上PODXL的結(jié)合部分(例如抗體)，4吏結(jié)合部分(例如抗體)結(jié)合于細(xì)胞表面上的PODXL，將結(jié)合的部分-細(xì)胞復(fù)合物與樣品的剩余部分分開，且可選的，將所述細(xì)胞從結(jié)合部分釋放。在本發(fā)明第四方面的特別優(yōu)選實(shí)施例中，通過結(jié)合于可結(jié)合PODXL的結(jié)合部分而破壞所述未分化人胚胎干細(xì)胞。方便的，結(jié)合部分是抗體?？贵w本身可導(dǎo)致殺傷未分化人胚胎干細(xì)胞。例如，抗體結(jié)合細(xì)胞表面上的PODXL可引起細(xì)胞通透性增加(如對染料如石爽化丙啶/臺盼藍(lán)的明顯高通透性)和細(xì)胞皺縮?？商娲模贵w(或其他結(jié)合部分)可進(jìn)一步連4妻于細(xì)月包毒性部分，當(dāng)所連4妄的抗體結(jié)合于細(xì)月包時，該細(xì)力包毒性部分可^皮壞所述細(xì)月包。可連接于抗體或其他結(jié)合部分的恰當(dāng)細(xì)胞毒性部分包括放射性原子、細(xì)胞毒性藥物、細(xì)胞毒性蛋白以及將前藥轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性藥物的酶系統(tǒng)。這些部分在本々頁i或中均為人熟知。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明包括破壞包含這種細(xì)胞的樣品中未分化人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟使樣品接觸對所述細(xì)胞有毒的結(jié)合部分(例如抗體)，使結(jié)合部分(例如抗體)結(jié)合所述細(xì)力包表面上的PODXL，并4吏該結(jié)合部分殺傷所述細(xì)力包。該結(jié)合部分可以是本身對所述細(xì)胞有細(xì)胞毒性的抗體，或者包括另一種乂于細(xì)力包有毒的部分。從上文應(yīng)該理解，本發(fā)明還包括結(jié)合PODXL的部分用于鑒定含這種細(xì)胞的樣品中的未分化人胚胎干細(xì)胞；結(jié)合PODXL的部分用于/人含這種細(xì)胞的樣品中分離未分化人胚胎干細(xì)胞；結(jié)合PODXL的部分用于從含這種細(xì)胞的樣品中去除未分化人胚胎干細(xì)胞；結(jié)合PODXL的部分用于破壞含這種細(xì)胞的樣品中的未分化人胚胎干細(xì)胞.優(yōu)選的，該結(jié)合部分是抗體。本發(fā)明還提供進(jìn)一步包含可檢測標(biāo)記物的結(jié)合PODXL的部分。本發(fā)明還l是供進(jìn)一步包含細(xì)胞毒性部分的結(jié)合PODXL的部分。優(yōu)選的，該結(jié)合部分是抗體。本發(fā)明的另外一方面提供包含結(jié)合PODXL的部分的組分試劑盒(kitofparts)以及另外的4企測另一種人胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的試劑。優(yōu)選的，所述另一種人胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物是Oct4、SSEA-4、Tra-l-60、Tra-1-81和GCTM2中的4壬4可一種。更fiL選的，所述另一種人胚胎干纟田月包才示i己凈勿進(jìn)一步包4舌mAb5、mAb8、mAb14、mAb63、mAb84、mAb85、mAb95、mAb375、mAb432和mAb529中的任何一種。通常，試劑盒包4舌抗PODXL的抗體以及抗Oct4、SSEA-4、Tra-l-60、Tra-1-81和GCTM-2中一種或多種的抗體。通常，試劑盒還可包括用于免疫化學(xué)的試劑；固定與支持物的抗體；用于標(biāo)記抗體的方法；用于將^:體連4妄于細(xì)力包毒性部分的方法。應(yīng)該理解，對于本發(fā)明的所有實(shí)施方式，優(yōu)選抗體是選擇性的。因此，優(yōu)選抗PODXL的抗體選擇性結(jié)合PODXL,即以比其他人類蛋白更大的親和力結(jié)合PODXL。通常，抗PODXL抗體基本上不結(jié)合其他蛋白。下文將4交詳細(xì)闡述其他在本發(fā)明的實(shí)施中非常有利的抗PODXL抗體。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明第二方面分離的未分化人胚胎干細(xì)胞(或富集這種細(xì)胞的組合物)。本發(fā)明還包括表達(dá)其表面上的PODXL的分離的未分化人胚胎干細(xì)胞。通常，所述分離的人胚胎干細(xì)力包或富集人胚胎干細(xì)力包的纟且合物作為藥物纟且合物而沖是供。因此，本發(fā)明4是供通過實(shí)施本發(fā)明第二方面的方法生成人胚胎干細(xì)胞的藥物組合物并通過例如恰當(dāng)?shù)臒o菌無致熱原的試劑將其制備入藥物組合物的方法所述分離或富集的未分化人胚胎干細(xì)月包可用來治療需要細(xì)月包療法的患者。通常在執(zhí)業(yè)醫(yī)師的監(jiān)督下將有效量的細(xì)胞給予患者。本發(fā)明還提供包含未分化細(xì)胞的組合物(其已通過促進(jìn)未分化人胚胎干細(xì)胞分化而制備)，但其通過本發(fā)明第三或第四方面所述方法耗盡了未分化人胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明還提供包含從未分化人胚17胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞的組合物，該組合物基本不包含表達(dá)其表面上的PODXL的未分化人胚胎干細(xì)胞。這些組合物通常作為藥物組合物而l是供。因此，本發(fā)明包4舌通過如上文所述提供包含分化細(xì)胞(但耗盡了未分化人胚胎干細(xì)胞)的組合物并將其制備入藥物組合物而制備藥物組合物的方法。包含分化細(xì)胞但耗盡了未分化人胚胎干細(xì)胞(且優(yōu)選沒有這種細(xì)胞)的組合物對于治療需要細(xì)胞療法的患者非常有利。通常在執(zhí)業(yè)醫(yī)師的監(jiān)督下將有效量的組合物給予患者。利用該細(xì)力包或組合物進(jìn)4亍治療的合適疾病包4舌帕金森和阿爾茨海默病、脊髓損傷、中風(fēng)、燒傷、心臟病、骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。已經(jīng)確定了mAb84的Vh和VL鏈的氨基酸序列(且編碼其的多核苷酸序列)，如圖11和12中所示。因此，本發(fā)明的另外一方面提供抗PODXL的抗體，包含氨基酸序列i)至iii)或氨基酸序列iv)至vi)或優(yōu)選包含氨基酸序列i)至vi)DS細(xì)SVNYMY卿ff>NO:2)i0OTSMAS(,B>NO:3)鄉(xiāng)QQ，SYFYT(S1QIDNO:4》的IfTWMN,ID藍(lán)5)v)BIRLKSNNYATHyABSVKG(SEQIDNO:6)WERA卿麗0:7)或其變異體，其中所述序列i)至Vi)的一個或多個中的一個或兩個或三個氨基酸用另一種氨基酸取^。優(yōu)選的，抗體包含已給出的特殊氨基酸序列。通常，如果所給出的氨基酸序列存在變異，則該變異是所述序列i)至Vi)中一個或兩個或三個或四個中一個或兩個氨基酸的取^。通常，變異體在所述序列i)至vi)中一個或兩個中具有一個或兩個氨基酸取^。方i"更的，在所述序列i)至vi)中一個或兩個中存在一個氨基酸取代。在任何情形下，抗體均保留結(jié)合PODXL的能力。優(yōu)選的，抗體選才奪性結(jié)合PODXL的胞夕卜區(qū)域，所述與PODXL的選擇性結(jié)合由這些氨基酸序列的存在而賦予。伊G選的，^L體具有至少一個結(jié)合下列CDR的輕鏈可變區(qū)CDR1:SASSSVKYM1f(SBQIDNO:2)ODE2:DTS>ttAS,fl>NO:3》OTE3:QQ鄉(xiāng)SYPYT卿H>M>:4)專交優(yōu)選的，抗體具有至少一個包含圖ii中所示出氨基酸序列(SEQIDNO:8)的45鏈可變區(qū)。優(yōu)選的，抗體具有至少一個結(jié)合下列CDR的重鏈可變區(qū)CDRl:MYWMN(SEQID:N0:5)ODR2:E10XSHNYMHY細(xì)VK:G卿IB微6)CDR3:BRA(犯QBDNO:7)專交優(yōu)選的，抗體具有至少一個包含圖12中所示出氨基酸序列(SEQIDNO:IO)的重鏈可變區(qū)。更加優(yōu)選的，抗體具有如上文所確定defined的至少一種輕鏈可變區(qū)以及力o上文所確定defined的至少一種重鏈可變區(qū)。最優(yōu)選的，抗體具有至少一個包含如圖11中所示出氨基酸序列(SEQIDNO:8)的輕《連可變區(qū)和至少一個包含如圖12中所示出氨基f復(fù)序列(SEQIDNO:IO)的重鏈可變區(qū)。然而，應(yīng)該理解上文所列出mAb84的輕《連和重鏈CDRsl-3與除圖11和12中所示之外的才匡架區(qū)結(jié)合也可能特別有利。因此，在一種實(shí)施方式中，上文所列出mAb84的具有CDRsl-3的輕《連或重鏈可具有替代性框架區(qū)。恰當(dāng)?shù)目蚣軈^(qū)在本領(lǐng)域中為人熟知，且可在例如M.Lefranc&G.Lefranc(2001)"TheImmunoglobulinFactsBook"，AcademicPress,結(jié)合于此供參考。抗體可進(jìn)行可檢測性標(biāo)記或者其可利用如上文所述細(xì)胞毒性部分進(jìn)行標(biāo)記。抗體可用于本發(fā)明第一、第二、第三或第四方面所述方法中的任何一種，且其可用于組分試劑盒中。應(yīng)該理解，CDR序列可用于生成如上文所討i侖的合成抗體和抗體片段。本發(fā)明的另一方面4是供編碼上文所4是及抗體或包含這種抗體Vl或VH鏈其中之一(或二者均包含)的分子的多核苷酸。編碼mAb84輕鏈和重鏈的多核普酸分別在圖11(SEQIDNO:9)和圖12(SEQIDNO:ll)中示出。本發(fā)明包4舌包含表達(dá)抗體所需的一種或多種多核苷酸的宿主細(xì)胞。通常，該宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞。中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)月包特別適于4元體生成?，F(xiàn)在，將參照下列圖形和實(shí)施例而進(jìn)行描述，其中恩丄柳」A與末^y么^E^C^9應(yīng)系^"合的就式^9應(yīng);^^f。HES-3細(xì)胞的單細(xì)胞懸液用抗hESC上細(xì)胞表面抗原制備的不同mAb克隆或抗Tra-1-60的mAb進(jìn)4亍染色。結(jié)合于細(xì)月包的抗體則用輒合FITC的抗小鼠抗體進(jìn)行檢測。陰影直方圖表示利用隱性對照進(jìn)行染色，空白直方圖則表示利用第一抗體進(jìn)行染色。激2^/^A瘦鈿應(yīng)化夢為、浙/i"A與/^E^C^虔丄鈿應(yīng)表面拔j的潛合。在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)的HES-3克隆用抗hESC上細(xì)胞表面抗原制備的不同mAb克隆進(jìn)行免疫染色。隨后克隆用輒合FITC(mAb5、14、63和95)或PE(mAb84和mAb85)的抗小鼠才企測抗體進(jìn)行染色。陰性染色利用同種型對照SSEA-1進(jìn)行觀察(數(shù)據(jù)未示出)。圖像以40倍》丈大進(jìn)行拍才聶，比例條表示200jum。激義對以不/^7的A^^C錄合附JA;^拔Ocf的附J6染悉的好ES-3進(jìn)^f"雙悉滅^C勿應(yīng)為、^f。hESC的單細(xì)胞懸液依次用不同的hESC結(jié)合mAb克隆染色，隨后用抗Oct-4的mAb染色。結(jié)合于細(xì)胞的抗體同時用抗小鼠IgG特異性抗體(軛合FITC)和抗小鼠IgM抗體(軛合PE)進(jìn)行4企測。定位該plot的標(biāo)志物以表示左下象限中恰當(dāng)?shù)腇ITC或PE軛合的同種型對照中>95%的熒光。激4附^W對^E"51(7和五C細(xì)應(yīng)的^9應(yīng)毒性^t應(yīng)。細(xì)月包懸液(2x105)與5jugmAb84或mAb85(同種型只于照)在4。C一起孵育45min。其后，收集細(xì)胞用于在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行PI排除分析。散點(diǎn)圖中的門區(qū)表示存活細(xì)胞群。激5.^M微^"^^f與附^W—趟/承f的/^ESC和五C細(xì)應(yīng)。細(xì)月包懸'液(2x105)在24孑14反中與5jugmAb84或mAb85(同種型只于21照)在4。C一起孵育45min,并在顯微鏡下進(jìn)行分析。圖像以100倍放大進(jìn)行拍攝，比例條表示100jum。激6.附」W^f^S^A五SC殺務(wù)64和丑j時/^^^^^f^:的在在。HES-3細(xì)月包與5jugmAb84(A)或mAb85禪，同種型對照)在4。C一起孵育。加入mAb后15、30和45min收集細(xì)J包，并通過PI排除或臺盼藍(lán)排除試-驗(yàn)分析存活性。(C)mAb84劑量對hESC的殺傷歲丈應(yīng)。HES-3細(xì)月包與5mgmAb84(血)或mAb85(翻)在4。C一起孵育。45min后，收集細(xì)胞，并通過PI排除試驗(yàn)分析存活性。(D):HES-3細(xì)胞與純化或未純化(培養(yǎng)液上清)(■)mAb84在37。C一起孵育45min,隨后收集細(xì)胞用于在流式細(xì)胞儀上通過PI排除試驗(yàn)進(jìn)行分析。與mAb85—起孵育作為同種型對照《0。慰7.時河對/MJW^V^^^E^C殺仿的影詢。HES-3細(xì)胞與純化mAb84或mAb84的培養(yǎng)液上清在4。C和37°C—起粹育45min。隨后收集細(xì)胞用于在流式細(xì)胞儀上通過PI排除試驗(yàn)進(jìn)行分析。與mAb85—起將育作為同種型只于照。戽&A五5^,潛維'勝與wJ6W殺i^炎羋之河的^殺。未分化和分化HES-3細(xì)月包的單細(xì)胞懸液為(A):用抗Tra-1-60的mAb染色。結(jié)合于細(xì)胞的抗體用軛合FITC的抗小鼠抗體進(jìn)行檢測。陰影直方圖表示利用隱性對照進(jìn)行染色，空白直方圖則表示利用抗Tra-1-60的mAb進(jìn)4亍染色。(B):與5jugmAb84在4。C一起孵育45min。其后，收集細(xì)胞用于在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行PI排除分析。散點(diǎn)圖中的門區(qū)表示存活細(xì)胞群。激9.尸(9Z)JVX為附J6^/在A五SC丄的乾^f;jo(A)對利用mAb84免疫沉淀的草巴抗原進(jìn)4亍蛋白印跡分析。利用PhyTip柱乂人包含mAb84的hESC裂解物中親和純4b的革巴:沆原在SDS-PAGE上分離，進(jìn)4亍蛋白印跡并用mAb84(泳道1)、抗人PODXL的mAb(泳道2)和抗人PODXL的pAb(泳道3)才全測。(B)利用LC-MS/MS鑒定PODXL。從蛋白數(shù)據(jù)庫搜索獲得的人PODXL(SEQIDNO:l)氨基酸序列以及從MS分析中對應(yīng)于PODXL的6個胰蛋白酶肽(下劃線及并H體)。激/汰^"耆戎尸ODAX拔體;^化:f附^A^/對的^9應(yīng)毒#。HES-3細(xì)月包與5ygmAb84、mAb-PODXL、pAb-PODXL或mAb85(同種型對照)在4。C一起孵育45min。在某些實(shí)-驗(yàn)中，hESC進(jìn)一步與羊抗鼠(GAM)抗體發(fā)生超高交聯(lián)。其后，收集細(xì)胞用于在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行PI排除分析。散點(diǎn)圖中的門區(qū)表示存活細(xì)胞群(A)。結(jié)果也以表^^各形式示出(B)。Ki鏈的^j^^f(/f^^核茅^/^y義未加下劃線的氨基酸對應(yīng)于沖匡架區(qū)。力口下劃線的氨基酸則只寸應(yīng)于互#卜決定區(qū)(CDRs)。氨基酸序列是SEQIDNO:8，核普酸序列是SEQIDNO:9。^//鏈的^^^^^/f^^核夯^^,i/義未加下劃線的氨基酸對應(yīng)于框架區(qū)。力口下劃線的氨基酸則對應(yīng)于互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。氨基酸序列是SEQIDNO:IO，核苦酸序列是SEQIDNO:ll。具體實(shí)施例方式實(shí)施例i:抗;ut萼蛋白樣蛋白的單克隆抗體結(jié)合并殺傷未分化>^胎干細(xì)胞引言人胚胎干細(xì)胞(hESC)起源于胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是多潛能干細(xì)胞，具有以未分化狀態(tài)在體外無限增殖的能力。在恰當(dāng)條件下，hESC還可在體外和體內(nèi)分化為代表所有三種胚層(中胚層、內(nèi)胚層和外胚層)的細(xì)胞類型。形態(tài)上，該細(xì)胞具有較高的核/質(zhì)比，且作為不同的克隆而生長。它們還表達(dá)高水平的堿性磷酸酶、端粒酶和轉(zhuǎn)錄因子Oct-4和Nanog[l-4]。hESC常^見通過細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行表征，包括特殊期胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4、肺瘤排斥抗原(Tra)-l-60和Tra-l-81。然而，這些表面抗原并非hESC特有的，之前曾在人胚胎性癌(EC)細(xì)胞中表征過[5，6]。此外，針對這些抗原的單克隆抗體(mAb)均抗人EC細(xì)胞和小鼠胚胎而制備。迄今為止，僅Son和同事描述過利用hESC作為免疫原生成抗細(xì)月包表面標(biāo)志物的mAb[7]。生成特異于hESC表面4示志物的mAb很重要，因?yàn)槠淠苡脕龛b定表達(dá)限于未分化hESC的新抗原。闡明這些不同的細(xì)胞表面抗原在發(fā)育和多潛能性中的作用/機(jī)制將有助于理解干細(xì)胞調(diào)節(jié)。具有hESC表面特異性mAb的另一個好處將是能夠在治療前將其結(jié)合入細(xì)胞分離過程中。hESC分化為特殊i普系的細(xì)胞后，將殘存未分化hESC從細(xì)胞群中消除非常關(guān)鍵，因?yàn)檫@些細(xì)胞可能在移植后f1起體內(nèi)畸胎瘤的形成[8,9]。在本研究中，用活hESC免疫BALB/C小鼠后生成了一《且共10個mAb。這些mAb對未分化hESC細(xì)胞系表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)性，然而，在hESC起源的擬胚體、小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞、人EC細(xì)胞和其他人細(xì)胞系中，反應(yīng)性減弱或消失。有趣的是，所述克隆的其中之一mAb84，其可與足糖萼蛋白樣蛋白1(PODXL)發(fā)生反應(yīng)，不僅結(jié)合且能在15-30分鐘的孵育期內(nèi)以濃度依賴及補(bǔ)體不依賴性方式殺傷未分化hESC。細(xì)胞毒性限于未分化表型，而hESC分化引起該mAb殺傷效率的下降。由于對未分化hESC的選擇性，mAb84可用來在移植分化的細(xì)胞類型之前去除或殺傷殘余hESC。據(jù)我們所知，這是首份關(guān)于特異性針對未分化hESC的細(xì)胞毒性mAb的報(bào)道。材料&方法人胚月臺干細(xì)月包系HES-2(46，X，X)、HES畫3(46，X,X)和HES誦4(46，X，Y),人ESCellInternational獲4尋。細(xì)月包于37°C/5%C02在明膠涂布器官培養(yǎng)皿內(nèi)的絲裂霉素-C滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞(~7xio4細(xì)胞/cm2)上(共同培養(yǎng))或者在補(bǔ)充了來自永生化小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基E-MEF(無祠養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基)的基質(zhì)"交涂布器官培養(yǎng)亞上培養(yǎng)[l]。用于培養(yǎng)HES細(xì)胞的培養(yǎng)基是HES培養(yǎng)基或KNOCKOUT(KO)培養(yǎng)基。HES培養(yǎng)基包含80%高#唐DMEM和20%FBS(Hyclone)、10ml月夷島素-轉(zhuǎn)4失蛋白-石西溶液/L培養(yǎng)基、25U/ml青霉素、25jug/ml鏈霉素、2mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)和O.lmM2-巰基乙醇；而KO培養(yǎng)基包含85%KO-DMEM和15。/。KO血清^齊^物、lmML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA以及0.1mM2-巰基乙醇和4ng/ml石咸性成纖維生長因子(Invitrogen)。對于共同培養(yǎng)，hESC克隆通過機(jī)械剝離利用手拉玻璃毛細(xì)管而傳代[2];對于無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，hESC按照之前描述的酶處理而傳代[2]。小鼠胚月臺干細(xì)月包系(mESC)、CS-1和E14分別為DrChyuan-ShengLin(CollegeofPhysiciansandSurgeons,ColumbiaUniversity[3])和DrBingLim(GenomeInstituteofSingapore[4]惠贈，并按之前所述進(jìn)行培養(yǎng)[5]。人胚胎性癌(EC)細(xì)胞系2102Ep為ProfPeterAndrews(UniversityofSheffield)惠贈，并4要之前所述進(jìn)4亍i告養(yǎng)[6]。人EC禾口癌細(xì)月包系NTERA-2cL.Dl(CRL-1973)、NCCIT(CRL-2073)和Hela(CCL-2)從美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所購買并按25照ATCCi兌明書進(jìn)4亍培養(yǎng)。人胚腎細(xì)月包系293-HEK(GibcoBRL,LifeTechnologies)按照所提供的方案進(jìn)行培養(yǎng)。為了乂人HES-3細(xì)胞i秀導(dǎo)形成擬胚體(EB)(即在體外從HES-3細(xì)胞誘導(dǎo)hESC分化)，以團(tuán)塊形式收集hESC,并在非黏附性懸浮培養(yǎng)亞(Corning)中以聚集體(即作為擬胚體)形式于EB培養(yǎng)基(80%KO-DMEM、20%FCS、25U/ml青霉素、25jug/ml《連霉素、2mML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA和O.lmM2-巰基乙醇)中培養(yǎng)8天。隨后，利用胰蛋白酶分離EB并鋪種于明膠化培養(yǎng)亞內(nèi)，在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)14天[16]。卓^謦我沐的蘭成兩只6周大的雌性Balb/C小鼠接受連續(xù)5周的腹膜腔內(nèi)接種，每次均4妄種懸浮于PBS+或MPL+TDM佐劑(Sigma)中的5x106HES-3細(xì)胞/小鼠。利用ClonaCellTM-HY雜交瘤克隆試劑盒(StemCellTechnologiesInc)4吏小鼠脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。簡單而言，利用試劑盒提供的聚乙二醇(PEG)和介質(zhì)B使脾細(xì)胞的單細(xì)月包懸液(1x108細(xì)月包)與2x107SP2/0細(xì)月包發(fā)生融合。37。C過夜孵育后，利用甲基纖維素基介質(zhì)D鋪種雜交瘤。鋪種10-14天后分離雜交瘤的單克隆并在含介質(zhì)E的96孔^反隨后在24孔組織i咅養(yǎng)板中培養(yǎng)。收集來自每一個雜交瘤的培養(yǎng)液上清，并通過流式細(xì)胞儀評估對hESC的反應(yīng)性。利用ClonaCellTM-InstantCHEKIsotypingKit(StemCellTechnologies)進(jìn)4亍抗體的分型。諒式勿y^為^^f利用流式細(xì)月包4義通過免疫熒光評估與不同細(xì)月包群上表面標(biāo)志物的抗體反應(yīng)性。利用胰蛋白酶以單細(xì)胞懸液的形式收集細(xì)胞，按2x105/10|u1體積的密度重懸于1%BSA/PBS中，并與每一種mAb克隆(150ju1i咅養(yǎng)'液上清或5iug純化的mAb/200ju11%BSA/PBS)或針對SSEA國4(neat，DevelopmentalStudiesHybridomasBank)、Tra誦l-60、Tra-1國81(2.5jag/200ju11%BSA/PBS,Chemicon,MAB4360/4381)、人足糖萼蛋白(PODXL,R&Dsystems,MAB1658)和抗人足凈唐萼蛋白的多克隆4元體(pAb)(5jug/200ju11%BSA/PBS:R&Dsystems)—起孵育45min。隨后用冷1%BSA/PBS洗滌細(xì)月包，且進(jìn)一步用1:500稀釋的羊抗鼠FITC軛合抗體(DAKO)孵育15分鐘。脬育后，再次洗滌細(xì)l包并重懸于1。/。BSA/PBS和1.25jug/ml石典4匕丙卩定(PI)中，用于在FACScan(BectonDickinsonFACSCalibur)上進(jìn)行分析。除非另有指明，所有的孵育均在4。C進(jìn)行。細(xì)胞用恰當(dāng)?shù)耐N型對照染色作為陰性對照。為了共表達(dá)研究，用第一抗體孵育hESC，并如上所述用1%BSA/PBS洗滌。其后，將細(xì)月包固定、透4匕(CaltagLaboratories)并用抗Oct-4的小鼠mAb(SantaCruzsc-5279)以1:20的稀釋度進(jìn)4亍孵育。隨后用1%BSA/PBS洗滌細(xì)胞，并在暗處用1:500稀釋的FITC軛合的羊抗鼠IgG(K鏈特異性)抗體(Sigma)和PE輒合的兔抗鼠IgM抗體(OpenBiosystems)孵育。孵育后，再次洗滌細(xì)月包并重懸于1%BSA/PBS中進(jìn)行分析。除第一抗體外，所有的孵育均在室溫下進(jìn)行，各15min。細(xì)胞用恰當(dāng)?shù)耐N型對照染色作為陰性對照。名瘦細(xì)/S化學(xué)3尋細(xì)月包在4%多聚甲醛中室溫固定45min，并用每一種mAb的培養(yǎng)液上清室溫孵育lh。用輒合異石克氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)(1:500稀釋；DAKO)的羊抗鼠抗體顯示抗體的定位。細(xì)應(yīng)毒'/4試驗(yàn)細(xì)胞上mAb84的細(xì)胞毒性利用PI排除試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行評估。如上所述，1%BSA/PBS中的單細(xì)胞懸液(2x10Vl0jul體禾口、)與mAb84(150ju1i備養(yǎng)液上;青或5jug纟屯^f匕的mAb/200ju11%BSA/PBS)、抗人PODXL的mAb或抗人PODXL的pAb(5|ug/200iul1%BSA/PBS，R&Dsystems)于4。C一起孵育45min。其后，洗滌細(xì)胞并重懸于1。/oBSA/PBS和1.25jug/ml石典化丙啶(PI)中，用于通過FACS進(jìn)行分析。為了劑量研究，將HES-3細(xì)胞與0.1、0.5、1、5和15jug純化的mAb84/200ju11%BSA/PBS—起孵育。為了時間進(jìn)程研究，將HES-3細(xì)胞與5jug純化的mAb84/200ju11%BSA/PBS一起孵育，并在加入mAb后15、30和45min后收集細(xì)月包進(jìn)4亍分牙斤。為了超高交耳關(guān)實(shí)-驗(yàn)，洗滌第一mAb孵育后的HES-3細(xì)月包并用羊抗鼠第二抗體(5jug/200ji11%BSA/PBS，DAKO)孵育45min。細(xì)月包用同種型對照mAb85孵育作為陰性對照。除非另有指明，所有的孵育均在4匸進(jìn)行。為了—瞼證利用PI排除試—驗(yàn)得到的結(jié)果，還利用臺盼藍(lán)排除法確定每一個樣品的生存能力。為了鑒定mAb84的革巴抗原，將hESC的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物在6cmPetri皿(Falcon)中i咅養(yǎng)至融合、用PBS+洗滌并通過在20/0Triton/PBS+中刮除而裂解。通過離心而4吏細(xì)月包裂解物澄清并立即用于免疫^^定(IP)?？乖腎P利用自動化MEA系統(tǒng)(PhynexusInc)而實(shí)施。簡單而言，通過直接捕獲于ProteinAPhyTip柱(5p1樹脂床，Phynexus,Inc)上而/人雜交瘤i咅養(yǎng)液上清中分離mAb84(~100|ug)。用洗滌纟爰沖液I(10mMNaH2PO4/140mMNaClpH7.4)洗去上清中的未結(jié)合蛋白后，使來自約5x106細(xì)胞的澄清細(xì)胞裂解物通過由捕獲的mAb84功能化的柱子。將柱子進(jìn)一步用洗滌緩沖液II(140mMNaClpH7.4)洗滌，并在低pH下將結(jié)合的蛋白用洗脫緩沖液(200mMNaH2PO4/140mMNaClpH2.5)乂人柱子上洗脫下來并立即28用1mMTris-ClpH9.0中和。將洗脫物4呆存于4。C用于進(jìn)一步的分析。SDS-PAGE和蛋白印跡分斗斤SDS-PAGE和蛋白印跡分析基本上分別4安照Laemmli[7]和Towbin[8]的方法實(shí)施。筒單而言，在還原性條件下通過SDS-PAGE(NuPAGE4-12%gradientgel，Invitrogen)分離來自IP的;先脫4勿，隨后進(jìn)行蛋白印跡或凝膠的銀染色。對于蛋白印跡，將分離的蛋白通過100V電泳2h轉(zhuǎn)移至PVDF月莫(Millipore)上。隨后將月莫用mAb84培養(yǎng)液上清(用1%BSA/PBS/0.1%Tween-201:1稀釋)、抗人PODXL的小鼠mAb或抗人PODXL的羊pAb(200ng/ml，R&Dsystems)隨后用HRP輒合的羊抗鼠或兔抗羊抗體(1:10000稀釋，分別為DAKO和Pierce)進(jìn)4亍免疫印跡。HRP專厄合的第二抗體的結(jié)合通過ECL4企觀'J(AmershamBiosciences)顯影。4艮染色利用SilverQuest4艮染色試劑盒(Invitrogen)4安照生產(chǎn)商的步驟而實(shí)施，并手工切割對應(yīng)于蛋白印跡上條帶的蛋白條帶。l漆縱還j、處差化和蛋冷術(shù)席將切割下來的凝膠在洗滌液(2.5mM碳酸氫銨/50%含水乙腈)中4。C浸泡過夜，隨后更換洗滌緩沖液再于37。C孵育20min。隨后將凝月交干燥并還原和烷基化。簡單而言，將20ju110mMDTT/100mM石友酸氫4妄加至每一個凝力交斑點(diǎn)并于56。C孵育lh。其后，加入20jul55mM石典乙酰胺LAA/100mM碳酸氬銨并于暗處室溫孵育45min。隨后洗滌凝月交斑點(diǎn)并分別在100mM碳酸氫銨和100%乙腈中洗滌兩次。為了蛋白水解，每一個凝膠斑點(diǎn)內(nèi)的蛋白用改良胰蛋白酶(0.02jug/jul,溶于25mM石灰酸氫銨中，Promega)于37。C才展蕩消化過夜。胰蛋白酶消化后，向樣品中加入1%曱酸和2%曱醇至終體積9/al，用于LCMS/MS分析。將已消化的樣品利用納米級流速(Nano-flow)高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(LCPackings)分離。將每份9ju1的樣品以25ju1/min注射并;農(nóng)縮至處于0.1%曱&臾/7&中的Trapcartridge(|uPrecolumn,300jumx5mm，C18PepMap勵，LCPackings)上。洗滌5min后，將液流調(diào)為流線型至含10cmC18反相填塞材料(ColumnEngineering)分離4i(內(nèi)《圣75|um的PicotipEmitter,NewObjective),流速減為100nl/mim。在60min內(nèi)梯度乂人0發(fā)展為60%乙腈/0.1%曱酸。利用柱子遠(yuǎn)端的液體連^妻引入2300v的電壓，以在柱子尖端形成噴霧，尖端則指向四極-飛行時間(Qq-tof)混合串聯(lián)質(zhì)譜儀(QSTAR-XL，AppliedBiosystems)的進(jìn)氣孑L。以InformationDependentAcquisition(IDA)才莫式運(yùn)4亍質(zhì)"i普4義，以4甫獲并自動斷裂帶雙電荷和三電荷的聚集離子(massion)。分離最^/[言號8個/sec的選定聚集離子，并用氮?dú)鈱⑵鋽嗔?。所采用的碰撞能量與肽的質(zhì)量成比例，在分才斤過禾呈中利用Analyst-QS庫欠4牛(AppliedBiosystems)進(jìn)4亍計(jì)算。通過利用MASCOT(MatrixScience)4叟索引擎乂于照UniProt(EBI)蛋白數(shù)據(jù)庫搜索MS艇S譜圖文件而鑒定蛋白。結(jié)果為了制備一組抗未分化hESC上細(xì)胞表面標(biāo)志物的mAb，在無佐劑的PBS或在MPL+TDM佐劑中，用存活HES-3細(xì)月包免疫Balb/C小鼠。共從融合物中分離114個雜交瘤。首次利用流式細(xì)胞儀篩選其對HES-3細(xì)胞的反應(yīng)性后，發(fā)現(xiàn)一組共10個抗體可結(jié)合hESC表面標(biāo)志物(圖1)。此外，mAb與HES-3克隆的結(jié)合通過免疫細(xì)胞化學(xué)而確定(圖2)。通過分型，發(fā)現(xiàn)其中9個mAb是IgM，而剩余的一個則為IgM2a(mAb8)。用其他hESC細(xì)胞系HES-2和HES-4篩選，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性不仫f又限于免疫原HES-3(表1)。此外，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)-秀導(dǎo)形成擬胚體(EB)后，抗體結(jié)合減弱，表明在分化過禾呈中抗原表達(dá)下調(diào)。對這IO種克隆進(jìn)行第二次篩選，以確定mAb與其他細(xì)胞系的交叉反應(yīng)性，所述其他細(xì)胞系即小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞(E-MEF)、小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)、人胚胎性癌細(xì)胞(EC)和混雜人細(xì)胞系(HEK-293、HeLa)(表I)。結(jié)果觀察到mAb與小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞無反應(yīng)性，而hESC在免疫接種前在小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)。另外，mAb的反應(yīng)性(即靶抗原表達(dá))限于hESC細(xì)胞系，在所4企測的2種mESC細(xì)胞系則未才企測到反應(yīng)性(除了CS-1上的mAb14)。當(dāng)我們比專交Tra-l-60、Tra-1-81和SSEA-4與我們的mAb組在人EC細(xì)月包上的反應(yīng)性時，如所預(yù)期的，在所沖企測的EC細(xì)月包系上，所有三種抗體(Tra-1-60/81和SSEA-4)均觀察到強(qiáng)反應(yīng)性。相反，我們的mAb組中大多數(shù)與三種EC細(xì)月包系中至少2種無反應(yīng)性或l又有孩i弱反應(yīng)性。有趣的是，mAb84、95、375、432和529與NTERA、2102Ep或NCCIT無反應(yīng)性或4又有纟效弱反應(yīng)性。該結(jié)果表明在hESC與EC之間甚至不同的EC細(xì)胞系之間抗體譜/表達(dá)存在差異。此外，當(dāng)篩選對其他人類細(xì)月包系的抗性時，mAb克隆中的7個(包4舌mAb84、95、14和85)不結(jié)合HEK-293或HeLa細(xì)月包。然而，對于mAb5和mAb63，與這兩種細(xì)胞系的反應(yīng)性相比hESC有所增加，暗示隨著細(xì)胞終末分化出現(xiàn)抗原表達(dá)上調(diào)。為了進(jìn)一步表征mAb組，我們比較了hESC多潛能標(biāo)志物Oct-4與該組中IgMmAb所4f"^j"抗原的共表達(dá)情況。圖3示出了HES-3細(xì)胞系的2色流式細(xì)胞分析。從散點(diǎn)圖，超過95%的mAb陽性HES-3細(xì)胞對Oct-4卩曰性，表明靶抗原表達(dá)與Oct-4表達(dá)之間的強(qiáng)相關(guān)性。細(xì)應(yīng)毒遂我沐附^,的衷在在對抗體組的篩選過程中，發(fā)現(xiàn)相比于與其^也IgMmAb(例如mAb85)—起孵育的細(xì)月包，與mAb84—起孵育的HES-3細(xì)月包在生存能力方面有顯著增強(qiáng)(圖4,柱1)。才艮據(jù)PI排除試-瞼，相比于mAb85,在與mAb84—起孵育(4°C，45min)后<又7%細(xì)月包4呆持存活。與mAb84—起卵孚育后，在2種其他hESC細(xì)胞系、HES-2和HES-4以及EC細(xì)月包系NCCIT(圖4，4主2-4)上也乂見察到了mAb84對hESC的細(xì)胞毒性效應(yīng)，分別存活8%、40%和9%。相反，另一種EC細(xì)胞系2102Ep在孵育后保持94%存活(圖4,柱5)。當(dāng)在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞時，很明顯，相比與mAb84—起孵育的NTERA和2102Ep細(xì)月包或者與mAb85—起孵育的NCCIT細(xì)月包，與mAb84—起孵育的HES-3和NCCIT細(xì)胞表現(xiàn)出顯著凝集(圖5)。才艮據(jù)這些結(jié)合和細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)，可理解為mAb84的細(xì)胞毒性效應(yīng)依賴于該mAb與細(xì)月包系的結(jié)合(表I)。mAb只于不結(jié)合該mAb的細(xì)胞未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性效應(yīng)。在時間進(jìn)禾呈研究中，HES-3細(xì)月包與5mgmAb84或mAb85—起孵育，且每隔15分鐘收集一次細(xì)胞，用于通過PI排除和臺盼藍(lán)排除試-驗(yàn)進(jìn)4亍分析(圖6A和B)。在PI^卜除試-驗(yàn)中，mAb84對HES-3細(xì)月包的細(xì)月包毒性歲文應(yīng)快至在與該mAb—起孵育15min后即可7見察到，生存能力降到33%。這些結(jié)果通過臺盼藍(lán)排除試驗(yàn)得以確認(rèn)。有趣的是，才艮據(jù)該試-驗(yàn)，生存能力的下降發(fā)生在孵育后15-30min之間，然而，孵育45min后的最鄉(xiāng)冬生存能力也相當(dāng)于~20%。當(dāng)mAb84的濃度在0.1-15jug的范圍內(nèi)逐步增加時，發(fā)現(xiàn)mAb84對HES-3細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)呈劑量依賴性(圖6C)。大約ljug(lpmol)的純化mAb84即能夠?qū)е耯ESC生存能力降到30%以下(即生存能力下降70%)。直至該階段，細(xì)胞毒性試驗(yàn)一直在4。C進(jìn)行，以將抗原-抗體復(fù)合物內(nèi)化入細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)降到最低。為了研究溫度對細(xì)胞毒性的影響，將hESC與純化和未純化(培養(yǎng)液上清)mAb84在4。C和37°C一起孵育(圖6D)。通過PI排除試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溫度未影響mAb對hESC的細(xì)胞毒性(用未純化mAb84可殺傷75%以上的hESC細(xì)胞)。此外，圖7表明在37。C時mAb84也對hESC具有細(xì)月包毒性。從散點(diǎn)圖可^見察到對于純化的mAb84和mAb84i咅養(yǎng)液上清，4。C和37°C時mAb84介導(dǎo)的HES-3細(xì)力包殺傷不存在差異。此外，在通過蛋白A純化后，mAb84對hESC具有同等細(xì)胞毒性(4。C孵育后，純化和未純化mAb84均，見察到77%以上的殺傷)。該結(jié)果表明mAb84誘導(dǎo)的對hESC的毒性不是補(bǔ)體介導(dǎo)的，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中存在或不存在胎牛血清時，細(xì)胞殺傷效率是同等的。之前我們已經(jīng)7見察到mAb84與hESC的結(jié)合在8天大的擬胚體內(nèi)下調(diào)(表1)。為了確定mAb84的細(xì)胞毒性是否特異于未分化表型，通過去除培養(yǎng)基中的FGF2或通過EB形成而誘導(dǎo)hESC分化(圖8A)。才艮據(jù)多潛能標(biāo)志物Tra-l-60的表達(dá)評估分化。4敬消FGF2后12天，觀察到hESC的部分分化，相比未分化hESC培養(yǎng)物(〉95%Tm-l-60+ve),細(xì)月包群中^f叉49%仍然表達(dá)Tra-l-60。通過EB途徑的分化得到〉99。/。Tra-l-60+ve細(xì)月包。當(dāng)來自3種條件的細(xì)月包與mAb84一起孵育時，細(xì)力包殺傷效率幾乎相當(dāng)于Tra-l-60+ve細(xì)胞的百分比(圖8B)。對于未分化hESC，4又~1%的細(xì)月包在與mAb84—起孵育后保持存活。對于FGF2々幾餓的培養(yǎng)物和EB培養(yǎng)物，該百分比分另'J增力口至69%和99%。乂,/z五SCJ:m^M4拔^乾4^的蔞定和-驗(yàn)證為了鑒定hESC上與mAb84細(xì)胞毒性效應(yīng)有關(guān)的靶抗原，實(shí)施了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。使細(xì)胞總裂解物通過包含蛋白A樹脂和mAb84的PhyTip柱。通過親和相互作用而捕獲的蛋白在蛋白凝膠上分離并用mAb84檢測。根據(jù)分子重量標(biāo)志物，^r測到〈190kDa的抗原條帶(圖9A,泳道1)。由第二抗體在~25kDa處才全測到的4交j氐條帶已鑒定為還原后的mAb84輕鏈。分離銀染色凝膠上的相應(yīng)條帶并通過質(zhì)鐠法進(jìn)行鑒定。對所獲得的肽進(jìn)行蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，將該蛋白條帶鑒定為足糖萼蛋白樣蛋白1前體(PCLP1或PODXL;登陸號000592)。PODXL和相應(yīng)肽匹配的氨基酸序列在圖9B中示出。為了馬全證該抗原靶標(biāo)是PODXL,重復(fù)進(jìn)行與mAb84的免疫沉淀，并用抗PODXL的市售抗體4會測來自柱子的洗脫物(圖9A;永道2和3)。從蛋白印跡的3個泳道中均檢測到了同等分子量的條帶，從而確認(rèn)了PODXL的身份。利用RT-PCR，發(fā)現(xiàn)在hESC內(nèi)有兩種PODXL的變異體(變異體1和2的登陸號分別為NP—001018121和000592)發(fā)生轉(zhuǎn)錄(凝:據(jù)未示出)。鑒定了mAb84的抗原靶標(biāo)，我們繼續(xù)研究抗PODXL的市售抗體是否對hESC表現(xiàn)出類似的細(xì)胞毒性效應(yīng)。從圖10A和B,很明顯，雖然3種來源的抗體(mAb和pAb)均特異于人PODXL,僅mAb84觀察到了細(xì)胞毒性，而兩種商品化來源的抗PODXL抗體則未觀察到。之前已經(jīng)報(bào)道了結(jié)合于細(xì)胞上抗原(例如細(xì)胞上的CD19、20和22)的第一抗體的超高交聯(lián)可誘導(dǎo)凋亡[19,20]。由于mAb84是IgM(五聚體)而mAb-PODXL和pAb-PODXL均為IgG(二<介)，我們研究了mAb-PODXL或pAb-PODXL與羊抗鼠(GAM)抗體的超高交聯(lián)是否類似mAb84介導(dǎo)的hESC殺傷。將hESC與第一抗體隨后與GAM抗體一起孵育，未能誘導(dǎo)與mAb84類似的細(xì)胞毒性效應(yīng)(圖IOB)。討論鑒定細(xì)胞表面抗原對于hESC研究非常重要，因?yàn)閔ESC是一種在分化過程中監(jiān)測多潛能性和特殊細(xì)胞種群發(fā)育的非常有價(jià)值的工具。此外，因?yàn)槠錇榉?曼入性，因此特異于細(xì)月包表面抗原的抗常規(guī)用來表征多潛能hESC的幾種這樣的細(xì)胞表面抗原是SSEA-3、SSEA-4、Tra-l-60和Tra-l-81。遺憾的是，這些抗原也存在于人EC細(xì)胞上，DraperWa/.[21]近期的研究發(fā)現(xiàn)分化過程中hESC內(nèi)這些抗原表達(dá)的變化非常類似于人EC細(xì)J包。因此，為了更好的理解hESC內(nèi)自我更新和多潛能性的調(diào)節(jié)，需要鑒定在hESC上獨(dú)特表達(dá)的新型細(xì)胞表面抗原，其將能夠區(qū)分hESC與人EC細(xì)胞。在本文描述的研究中，活hESC用于免疫小鼠，首次篩選雜交瘤中結(jié)合hESC表面標(biāo)志物的mAb后，鑒定出了一組共10個mAb。與SSEA-4和Tra-1-60/81(其與hESC和人EC細(xì)月包均強(qiáng)烈反應(yīng))不同的是，我冇]的4元體中有5種(mAb84、95、375、432、529)僅與hESC發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，而對人EC細(xì)胞則為陰性或有孩支弱反應(yīng)。此夕卜，抗體結(jié)合與Oct-4表達(dá)相關(guān)，且當(dāng)hESC分化形成EB時結(jié)合下調(diào)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持存在某些獨(dú)特存在于未分化hESC上的抗原。而且，當(dāng)篩查整個組mAb對HlhESC細(xì)胞系的抗性時(數(shù)據(jù)未示出)，我們發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)譜類似于HES-2、3和4的反應(yīng)譜，表明該mAb結(jié)合在不同hESC細(xì)月包系之間4呆守的4元原。獨(dú)特的，mAb84不4又結(jié)合hESC，且在15-30min孵育期內(nèi)即對細(xì)胞會有細(xì)胞毒性。與其他細(xì)胞毒性mAb(其需要活化補(bǔ)體或超高交聯(lián)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20,22])不同的是，mAb84介導(dǎo)的hESC殺傷不依賴于這兩種機(jī)制。通過IP和MS分析，我們鑒定足糖萼蛋白樣蛋白1(PODXL)為mAb84在hESC上的耙抗原。PODXL是屬于CD34唾液粘蛋白家族的高度糖基化I型《爭膜蛋白，該家族包4舌CD34和Endoglycan[23,24]。PODXL最初描述為腎小球足細(xì)胞上的大唾液蛋白[25],后來發(fā)現(xiàn)其在血管內(nèi)皮細(xì)胞和早期造血祖細(xì)胞上表達(dá)[26,27]。最近，研究顯示PODXL在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中是腫瘤侵襲力的指示劑[28-30]。人PODXL定位35于染色體7q32-q33上，編碼528個氨基酸的成熟蛋白[31]。然而，由于PODXL的胞外區(qū)利用唾液酸化O連接的糖類而廣泛糖基化以及5個可能的N-連接糖基化，因此PODXL的恰當(dāng)分子量是160-162kDa[32]。功能方面，已經(jīng)報(bào)道PODXL依賴于其在其中表達(dá)的細(xì)胞類型而具有極為不同的作用。在足細(xì)胞內(nèi)，PODXL作為抗黏附分子而保持在利用電荷排斥的足細(xì)胞足突之間開放的過濾位點(diǎn)[33]。然而，在高內(nèi)皮樣i靜脈內(nèi)，PODXL作為黏附分子結(jié)合L-選擇素且介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的圈合與滾動[23]。在hESC中，PODXL在轉(zhuǎn)錄水平鑒定為在未分化hESC中高表達(dá)的基因之一[34，35]。通過EST頻度分析，PODXL的表達(dá)水平在第7-8天的EB中下調(diào)幾乎2.5倍，在神經(jīng)外胚層樣細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)分別下調(diào)約7和12倍[34]。該結(jié)果得到hESC和第8天EB的免疫組化的支持，染色在后者中顯著減弱[36]。在一個獨(dú)立研究中，Wei""/.比4交了hESC與mESC的轉(zhuǎn)錄譜，且觀察到相比于hESC,利用MPSS未能在mESC細(xì)胞系E-14中檢測到PODXL的表達(dá)[37]?？傊?，這些關(guān)于PODXL在ESC中表達(dá)的報(bào)道與我們利用流式細(xì)胞儀得到的mAb84觀察結(jié)果相一致，其中相比于未分化hESC，結(jié)合反應(yīng)性在第8天的EB中有所下降，而在mESC中反應(yīng)性缺失。同時，在FGF2饑餓的hESC和第22天的EB中mAb84介導(dǎo)的殺傷性下降或缺失可歸因于由于分化引起的PODXL表達(dá)下調(diào)。然而，盡管已有這些關(guān)于PODXL在未分化hESC中表達(dá)的報(bào)道，其功能尚未闡明。與mAb84結(jié)合PODXL后殺傷hESC的機(jī)制也4艮吸引人。在Zhang"a/.[38]的凈艮道中，4十對細(xì)月包表面受體Porimin(i秀導(dǎo)細(xì)月包月莫損傷的前力長亡受體)的IgMmAb，可通過稱為"長亡的過程而i秀導(dǎo)Jurkat纟田月包內(nèi)的細(xì)月包死亡[39]。Porimin例如PODXL是粘蛋白家力矣的成員，因?yàn)槠湓诘鞍装鈪^(qū)上具有多個O-和N-連接的糖基化位點(diǎn)[40]。Jurkat細(xì)月包與抗Porimin—起孵育引起懸液中的快速細(xì)胞聚集，且在孵育僅20分鐘后即引起75%以上的細(xì)胞的膜通透性增加。細(xì)胞殺傷也不依賴于補(bǔ)體和溫度。區(qū)別于凋亡的是，與mAb—起孵育后未觀察到DNA斷裂或凋亡小體。通過電子顯孩i鏡掃描，發(fā)現(xiàn)抗Porimin所處理細(xì)胞的膜孔隙、空泡和表面鈹縮增加。將該結(jié)果與我們的凄t據(jù)進(jìn)行比H令人吃驚的是mAb84與抗Porimin共有多個類似的細(xì)胞殺傷標(biāo)志物。此外，我們研究組的初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)mAb84處理的細(xì)胞未表現(xiàn)出caspases水平上升(凋亡的特征)。因此，我們-假設(shè)但不限于理i侖mAb84介導(dǎo)的hESC殺傷是由于與月長亡類似的才幾制。將hESC用作分化為體內(nèi)任何細(xì)胞類型的初始材料來源，對于再生醫(yī)學(xué)具有顯著的優(yōu)勢。然而，分化后最大的關(guān)心之一是在移柏:前消除殘留的未分化hESC，因?yàn)檫@些細(xì)胞具有致瘤性。前期工作表明少至2個ESC植入棵鼠體內(nèi)可引起畸胎瘤的形成，而移植體外分化的ES細(xì)胞也未能緩解疾病[41，42]。此外，CookeW"/.報(bào)道移才直入hESC的位置影響所形成畸胎瘤的結(jié)局。在肝移才直物中，表達(dá)多潛能標(biāo)志物SSEA-3的未成熟細(xì)胞的較大腫瘤占優(yōu)勢，而在皮下植入物中則以分化組織的較小腫瘤占優(yōu)勢[9]。已經(jīng)開發(fā)了幾種不同的策略以克服該問題。在兩個獨(dú)立的研究中，ChungWa/.[8]和FukudaWa/.[43]證實(shí)攜帶soxl-GFP才艮告子基因的重組小鼠ESC細(xì)胞系可用來通過熒光活化細(xì)胞分選(FACS)從ESC中純化soxlVGFP+的分^匕神經(jīng)前體細(xì)胞。移才直純4匕出來的細(xì)月包未引起畸胎瘤形成，而移植soxlVGFP+細(xì)胞則引起了畸胎瘤形成。在hESC中，Hewitt"a/.設(shè)計(jì)了在hTert啟動子控制下表達(dá)a1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)的細(xì)胞系[44]。未分化hESC將表達(dá)GalT,其隨后催化并在細(xì)胞表面上提呈cc-gal表位。該表位的存在將使細(xì)胞易感于人血清內(nèi)的循環(huán)抗體，引起體外細(xì)胞死亡。雖然這些策略取得了成功，但它們均需要生成攜帶可選擇性基因的重組ESC細(xì)胞系。相反，我后迅速清除。目前，體內(nèi)研究正在進(jìn)行中，以證實(shí)mAb處理后由hESC引起的腫瘤形成消失或耗盡。此外，我們還建議將我們組內(nèi)的幾種其他hESC特異性mAb與mAb84聯(lián)合應(yīng)用，以確保徹底去除在m,總之，本發(fā)明是首份關(guān)于選擇性結(jié)合并殺傷未分化hESC的細(xì)月包毒性mAb的凈艮道。可以在細(xì)胞移才直前應(yīng)用mAb84，以消除殘存hESC,從而增加移植的成功率和安全性。參考文獻(xiàn)1.ThomsonJA^Itsfcovitz-邁dorJ,ShqiiroSSetaiEmbryonicstemcdllinesderivedftomhumanblastocysts.Sci咖el卿;282:ll45-1147.2.ReubiaoffBE,P鄉(xiāng)MF,'FongCYetal.:fe^biyoidcst咖cdlUn切fi:啤hom姐blastocysts:soma(io碰erentiatiocLinvitro.Nal3iotecibnol-,2000;18:3效<404.3'..Chamb敏IColbyD,RobatsoaM祐al.Functionalexpr坊咖ac)o血g:ofltoio&'apluripotetiGy.sustainingfectorinembryonicst咖cells.Cell2003;113:643-655,4,MitsiriKjTokuzawaY，ItoltHetal.HiehomeoprotdnN咖gisrequired&r:ma^aianceofpluripotaicyin咖鵬epibkstandES鄰Us,Cell2003;"3:631-642.5.■■KannagiR>CochranNA^IsMgaMFetal.Steg&"Spec迅cembryonicantigens(SSEA-3and-4)areepitopesofauniquegciboseriesgan^Uosideisolatedftomh咖anteratocarciao咖cells,EMBOJ,1983;2:2355-2361.6.AndrewsPW,BantingG，Damj咖vIetal.Threemonoclonalantibodiesdefiningdistinctdifferentiationantigensassociated鄰ithdifferent,hi^hmolecularwei扭tpolypeptideson(hesurfaceofhumanembryonal咖cino邊acells,Hybridoma1984;3:347-361.7.SonYS,Park取KangYKetal.HeatShock70-kDaProtein8Isofoim1isex|iressedonthesiafaceofhumanembryoniostemcellsand.downregulated邵ondifferaitiati(瓜StemCells加05;23:1502-1513,8.ChungS,ShinBS,Hedl加dEetal.GeneticselectionofsoxlGFP-eqaressingneuralprecursorsremovesresidualtumorigenicpluripotentstemcellsandattenuatestumorfotmationaftertransplantation.J^Neurochem,2006;97:1467-1480,9.CookeMJ，StojkovicM,PrzjborskiSA,Gro她ofteratomasderivedfiomhumanpluripot節(jié)tstemcellsiinfl卿cedbythegraftsite.StemCellsDev.2006;15:254-259.!0.ChooA3PadmanabhanJT，ChinAetal.immorializedfeed鄉(xiāng)forthesoale~upoflmman咖kyonicstoncellsinfeeder抑dfeeder-fi:eeconditions.J.Biotedhnol.加06;122:13(M41.■11,ChooAB，Padm咖bhanJ>ChinACetal.Expansionofpluripotenthumanembryonicst鵬cellsonhumanfeeders..Biotechnol.Bioeng.2004;88:321-331.12,YiaY,timYK;Salto-Tell抵Metal.AFP(+),ESOderivedcellsengraftanddifferentiateintoh鄰atocyt切invivo.StemCdls2002;20:338-346.13*Doetschm姐T,GreggRG，MaedaNal.TaigettedcoireclionofamutantHPRTgeneinmouseembryonicstemcells.Nature1987;330:576-578,14:OhSKFong^WJ,TeoYetal.Hi扭densityculturesofembryonicstemcells.Biotechnol,Bio加g.2005;91:523-533.15.AndrewsFW，BronsonD3L，BenhamFetal.Acomparativestudyofei-tcelllinesderivedfi:omhumantesticularteratocarcinoma^.Int丄Cancerl卿鄰2砂2肌16..HeinsN,LindahlAKadssonUetal.Clonalderivationandcharacterizationofh咖姐embryonicstemcelllines*J.Biotedmol,2006;122:511-520.17,LaemmliUKCleavageofstructuralp加teins'tiuringtheassemblyoftheheadofbacteriopliageT4.Nature1970;227:咖-685.■18.TcwbiiiH,StaehelinT,GordonJ.Electrophoretictransferofproteins'frompolyacrylamidegelstodtrocelMosesheets:procedureandsomeapplications.卩^(;^汰11厶0348<11;.8丄1979;76:43504354.19.ChacrachiN，VazquezA>GalanaudPe*aLBcellantigeareceptor-mediatedapoptosis.ImportanceofaccessorymoleculesCD19andCD22,ando《surfaceIgMcross-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)合PODXL的部分在從包含未分化人胚胎干細(xì)胞的樣品中去除所述未分化人胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用。19.結(jié)合PODXL的基團(tuán)在破壞包含未分化人胚胎干細(xì)胞的樣品中的所述未分化人胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用。20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合部分是抗體。21.—種結(jié)合PODXL的部分，進(jìn)一步包含可檢測的標(biāo)記。22.—種結(jié)合PODXL的部分，進(jìn)一步包含細(xì)胞毒性部分。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的部分是抗體。24.—種多組分試劑盒，包含結(jié)合PODXL的部分以及才企測另一種人胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的另外試劑。25.4艮據(jù)權(quán)利要求24所述的多組分試劑盒，其中所述另一種人胚月臺干細(xì)月包標(biāo)記物是Oct4、SSEA-4、Tra畫l畫60、Tra-1國81和GCTM-2中的4壬4可一種。26.才艮據(jù)4又利要求25所述的多組分試劑盒，其中所述另一種人胚月臺干細(xì)月包標(biāo)i己物進(jìn)一步包4舌mAb5、mAb8、mAb14、mAb63、mAb84、mAb85、mAb95、mAb375、mAb432和mAb529中的^f壬何一種。27.—種通過^又利要求2所述方法分離的未分化人胚胎干細(xì)胞。28.—種分離的表達(dá)其表面上的PODXL的未分化人胚胎干細(xì)胞。29.—種包含分化細(xì)胞的組合物，但其已經(jīng)耗盡了通過權(quán)利要求7所述方法得到的未分化人胚胎干細(xì)胞。30.—種包含從未分化人胚胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞的組合物，所述組合物基本不包含表達(dá)其表面上的PODXL的未分化人胚胎干細(xì)胞。31.—種治療需要細(xì)月包療法的患者的方法，所述方法包括纟會予所述患者根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的細(xì)胞或者根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的組合物。32.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的細(xì)胞或者根據(jù)權(quán)利要求29或30所述組合物在制造治療需要細(xì)胞療法的患者的藥劑中的應(yīng)用。33.—種制備未分化人胚胎干細(xì)力包的藥物組合物的方法，所述方法包括實(shí)施權(quán)利要求2所述的方法或提供權(quán)利要求28所述的細(xì)月包，以及^l尋如此分離的細(xì)月包并入藥物組合物中。34.—種制備包含分化細(xì)胞但已經(jīng)耗盡了未分化人胚胎干細(xì)胞的藥物組合物的方法，所述方法包括實(shí)施纟又利要求7所述的方法或提供權(quán)利要求29所述的組合物，以及將所述細(xì)胞的組合物并入藥物《且合物中。35.—種抗-PODXL的抗體，包含氨基酸序列i)至iii)或氨基酸序列iv)至vi)或優(yōu)選包含氨基酸序列i)至vi):S雄SYNYMY(SEQIDNO:2)i0DTSNLAS(SBQS>NO:3)蹄QQ，SWYT(,IDNO:4》的NYmm(犯QIDNO:5)ERA(SBQ1DN0:7)或其變異體，其中所述序列i)至Vi)的一個或多個中的一個或兩個或三個氨基酸被另一種氨基酸取代。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的抗體，具有至少一個并入下列CDR的車圣《連可變區(qū)Omi:SASISSVNYMY《SEQ10恥:2)OD勝鵬NLAS卿ID脆3》37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的抗體，具有至少一個包含圖11中所列出的氨基酸序列(SEQIDNO:8)的輕《連可變區(qū)。38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的抗體，具有至少一個并入下列CDR的重鏈可變區(qū)CDB1:NYWMN(SEQNO:5)ODE2:EIIOLKSNHYMHY細(xì)YKG(SEQ1B微6)CDB3:BRA(犯QIDNO:7)或其變異體，其中所述序列i)至vi)的一個或多個中的一個或兩個或三個氨基酸^皮另一種氨基酸耳又^。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的抗體，具有至少一個包含圖12中所列出的氨基酸序列(SEQIDNO:IO)的重鏈可變區(qū)。40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的抗體，具有至少一個根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的輕鏈可變區(qū)以及至少一個4艮據(jù)4又利要求38或39所述的重鏈可變區(qū)。41.一種選擇性地結(jié)合PODXL表位的抗體，其中所述表位已由具有至少一個才艮據(jù)斥又利要求37所述的輕《連可變區(qū)和至少一個才艮據(jù)一又利要求39所述的重鏈可變區(qū)的抗體結(jié)合。42.—種編碼才艮據(jù)片又利要求35至41中任何一項(xiàng)所述的抗體的多核苷酸，或一種包含本文中的Vh或VL鏈的分子。43.—種包含才艮據(jù)片又利要求42所述多核苷酸的宿主細(xì)月包。44.根據(jù)權(quán)利要求9或14中任何一項(xiàng)所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求20或23所述的應(yīng)用，其中所述抗體是片又利要求35至41中4壬一項(xiàng)所述的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及一種鑒定樣品中未分化人胚胎干細(xì)胞的方法，樣品可能包含這種細(xì)胞，該方法包括鑒定樣品內(nèi)表達(dá)其表面上的足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種從包含未分化人胚胎干細(xì)胞樣品中分離這種細(xì)胞的方法，該方法包括分離樣品內(nèi)表達(dá)其表面上的PODXL的細(xì)胞。通常，所述方法利用結(jié)合PODXL的抗體。利用所述方法分離的未分化人胚胎干細(xì)胞在細(xì)胞療法中可以是非常有利的。此外，特別的，本發(fā)明還提供從人胚胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞的組合物，但該組合物已經(jīng)耗盡了未分化人胚胎干細(xì)胞，該組合物在細(xì)胞療法中非常有利。文檔編號C12N5/0735GK101454441SQ200780008235公開日2009年6月10日申請日期2007年3月6日優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日發(fā)明者徐文華申請人:新加坡科技研究局