專利名稱：：展示蛋白質(zhì)a作為向腦部遞送的抗體和免疫復(fù)合物的結(jié)合劑的絲狀噬菌體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于向腦部遞送抗體和免疫復(fù)合物的絲狀噬菌體展示載體及其在診斷和治療中的用途。相關(guān)技術(shù)描述維雜展示組合噬菌體展示肽文庫提供了研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的有效方法。該技術(shù)依賴于非常大的隨機肽樣本的產(chǎn)生，所述隨機肽與它們相應(yīng)的遺傳藍圖相關(guān)(Scott等，1990;Dower,1992;Lane等，1993;Cortese等，1994;Cortese等，1995;Cortese等，1996)。通常通過構(gòu)建在絲狀噬菌體，諸如M13,fd和fl的外表面上表達的嵌合蛋白實現(xiàn)隨機肽的呈遞現(xiàn)。該呈遞使所有組成部分可以經(jīng)受結(jié)合測定和專門的篩選方案(稱為淘選(biopanning)(Parmley等，1988))，從而導(dǎo)致對具有所需結(jié)合特性的肽的親和分離和鑒定。以這種方式，已經(jīng)對與受體(Koivunen等，1995;Wrighton等，1996;Sparks等，1994;Rasqualini等，1996)、酶(Matthews等，1993;Schmitz等,1996)或抗體(Scott等,1990;Cwirla等，1990;Felici等,1991;Luzzago等，1993;Hoess等，1993;Bonnycastle等，1996)相結(jié)合的肽進行了有效的選擇。絲狀噬菌體是非裂解、雄性特異性噬菌體，其感染攜帶F-附加體的大腸桿菌(Esc/2en'c/2/aco/z')細胞(綜述參見Model等，1988)。絲狀噬菌體顆粒以900nm長和10nm厚的細管狀結(jié)構(gòu)存在，其含有環(huán)形單鏈DNA基因組(+鏈)。噬菌體的生命周期需要所述噬菌體與細菌F-菌毛的結(jié)合，以及隨后所述單鏈DNA基因組進入宿主。由宿主復(fù)制系統(tǒng)識別所述環(huán)形單鏈DNA，并且在噬菌體的復(fù)制起始點(-)結(jié)構(gòu)處開始合成互補的第二條DNA鏈。該雙鏈DNA復(fù)制形式是合成單鏈DNA環(huán)形噬菌體基因組的模板，其起始于復(fù)制起始點(+)結(jié)構(gòu)處。最終將這些包裝到病毒體中，并且在不引起對宿主的裂解或明顯損害的條件下，將噬菌體顆粒從細菌中擠壓出來。肽展示系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)了兩種噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白pIII(P3)蛋白和pVIII蛋白。pIII蛋白以5個拷貝/噬菌體而存在，并且專門存在于病毒體的一個尖端(Goldsm他等，1977)。pIII蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域形成結(jié)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對感染過程是必需的(Gray等，1981)。這使得噬菌體能夠吸附到F-菌毛尖端以及'隨后所述單鏈噬菌體DNA滲透和易位到細菌宿主細胞內(nèi)(Holliger等，1997)。pIII蛋白可以耐受大范圍的修飾，且因此被用于在其N-末端表達肽。在不顯著影響pIII蛋白功能的條件下，外源肽長達65個氨基酸殘基(Bluthner等，1996;Kay等，1993)，并且在有些情況中，甚至與全長蛋白質(zhì)一樣大(McCafferty等，1990;McCafferty等，1992)。圍繞著單鏈噬菌體DNA的圓柱狀蛋白包膜由2700個拷貝的主外殼蛋白、pVin、a-螺旋狀亞基組成，其中所述a-螺旋狀亞基由50個氨基酸殘基組成。PVIII蛋白自身以螺旋狀模式排列，其蛋白的a-螺旋以銳角朝向病毒體的長軸(Marvin等，1994)。該蛋白的一級結(jié)構(gòu)包含3個分離的結(jié)構(gòu)域(l)N-末端部分，富含酸性氨基酸并暴露于外界環(huán)境；(2)中央疏水結(jié)構(gòu)域，其負責(zé)(i)噬菌體顆粒中的亞基亞基相互作用和(ii)宿主細胞中的跨膜功能；和(3)含有堿性氨基酸并聚集在C-末端的第三結(jié)構(gòu)域，其包埋在噬菌體的內(nèi)部并與噬菌體-DNA相締合。pVIII合成為含有23個氨基酸的前導(dǎo)肽的前外殼蛋白，其在跨越細菌內(nèi)膜易位時分裂，從而產(chǎn)生成熟的50個-殘基的跨膜蛋白(Sugimoto等，1977)。pVIII作為展示支架的用途受到這樣的事實的阻礙，所述事實是pVIII可以耐受在其N-末端添加不長于6個殘基的肽(Greenwood等，1991;Iannolo等，1995)。更大的插入物干擾噬菌體的裝配。然而，在這樣的系統(tǒng)中引入更大的肽是可能的，所述系統(tǒng)中通過將含有肽、pVIII蛋白的重組體與野生型pVIII在體內(nèi)混合而產(chǎn)生嵌合噬菌體(Felici等，1991;Greenwood等，1991;Willis等，1993)。這允許在噬菌體顆粒裝配的過程中將嵌合pvni蛋白以低密度(數(shù)十到數(shù)百個拷貝/顆粒)結(jié)合到由野生型外殼蛋白所點綴的噬菌體表面上。使用了兩種能夠生成嵌合噬菌體的系統(tǒng)由Smith命名的"8+8型"和"88型"系統(tǒng)(Sm池，1993)。"8+8型"系統(tǒng)基于使得兩個pVIII基因分別位于兩個不同遺傳單位中(Fdici等，1991;Greenwood等，1991;Willis等，1993)。重組pVIII基因位于噬菌粒上，所述噬菌粒是除其自身的復(fù)制起點外，還含有復(fù)制的噬菌體起點和包裝信號的質(zhì)粒。通過用輔助噬菌體超感染攜帶噬菌粒的細菌而提供野生型pVIII蛋白。另外，輔助噬菌體提供將噬菌粒和輔助基因組包裝到病毒體中的噬菌體復(fù)制和裝配系統(tǒng)。因此，所述細菌分泌兩種類型的顆粒輔助噬菌體和噬菌粒，這兩者均與重組體和野生型pVIII蛋白的混合物相結(jié)合。"88型"受益于在一個且相同的感染性噬菌體基因組中含有兩個pvin基因。因此，這避免了對輔助噬菌體和超感染的需要。此外，僅產(chǎn)生一種類型的嵌合噬菌體。噬菌體基因組編碼IO種蛋白質(zhì)(pI-pX)，所有這些蛋白質(zhì)對于產(chǎn)生感染性后代是必要的(Felici等，1991)。這些蛋白質(zhì)的基因被安排在由兩個非編碼區(qū)域分隔開的兩個緊密包裝的轉(zhuǎn)錄單位中(VanWezenbeek等，1980)。一個非編碼區(qū)域，稱為"基因間區(qū)域"(定義為位于pIV和pII基因之間)，含有DNA復(fù)制的(+)和(0起點和噬菌體的包裝信號，從而能夠起始殼體形成。該基因間區(qū)域的一些部分是不必要的(Kim等，1981;Dotto等，1984)。而且，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域能夠耐受在一些位點插入外源DNA(Messing，1983;Moses等，1980;Zacher等，1980)。噬菌體的第二個非編碼區(qū)域位于pVIII和pin基因之間，并且如Pluckthun所舉例說明，也被用于結(jié)合外源重組基因(Krebber等，1995)。l辦沐膨浙扇虎'由表位組成的小合成肽通常是需要肽的化學(xué)合成的較差的抗原，且需要與大載體偶聯(lián)，但是即使那樣它們可以誘導(dǎo)低親和性免疫反應(yīng)。在本發(fā)明人的實驗室中，利用僅展示EFRH肽的絲狀噬菌體作為抗原，開發(fā)了用于產(chǎn)生抗-A(3P抗體的免疫程序(Frenkel等，2000和2001)。近年來，絲狀噬菌體己經(jīng)廣泛應(yīng)用于在它們的表面上"展示"所有大組成成分，所述肽是通過在編碼噬菌體外殼蛋白的基因5'末端克隆隨機寡核苷酸產(chǎn)生的(Scott和Smith,1990;Scott,1992)。如近期報告地，絲狀噬菌體是用于多種生物制劑中外源肽的表達和呈遞的優(yōu)秀載體(Greenwood等，1993;Medynski,1994)。絲狀噬菌體的施用誘導(dǎo)針對噬菌體作用系統(tǒng)的強免疫反應(yīng)(Willis等，1993;Meola等，1995)。以上討論的噬菌體外殼蛋白pill和pVIII是經(jīng)常用于噬菌體展示的蛋白質(zhì)。由于其線性結(jié)構(gòu)，絲狀噬菌體對不同類型的膜具有高度滲透性(Scott等.，1990)，并且跟隨嗅束，通過邊緣系統(tǒng)到達海馬區(qū)域，從而靶向受影響的位點。用氯仿處理絲狀噬菌體將線性結(jié)構(gòu)改變?yōu)榄h(huán)形結(jié)構(gòu)，其阻止噬菌體向腦部的遞送。微工私應(yīng)用抗體工程方法，從而在維持其生物活性的同時，最小化mAb的大小(135-900kDa)(Winter等，1994)。這些技術(shù)和將PCR技術(shù)應(yīng)用于創(chuàng)建大抗體基因全部組成成分使得抗體噬菌體展示成為用于分離和表征單鏈Fv(scFv)抗體的多功能工具(Hoogenboom等，1998)。scFV能夠展示在噬菌體表面上，從而進行進一步的處理，或者可以作為可溶性scFV(25kd)片段釋放。本發(fā)明人的實驗室加工了scFV，其表現(xiàn)出與親本IgM分子相似的抗聚集特性(Frenkel等，2000a)。為了scFV的構(gòu)建，克隆了來自抗-A卩PIgM508雜交瘤的抗體基因(Frenkel等，2000a)。分泌的抗體在阻止其對培養(yǎng)的PC12細胞的毒性作用中顯示出針對ApP分子的特異性活性。位點定向的單鏈Fv抗體是通過細胞內(nèi)或細胞外方法將治療性抗體靶向到腦中的第一步。歪顏丄金黃色葡萄球菌(5te/7/^/ococcwm^ew)的蛋白質(zhì)A是細胞壁成分，其特征在于其與免疫球蛋白，特別是IgG種類的Fc部分的親和性(Goding,1978)。它與人、小鼠、豬、豚鼠和兔的IgG抗體結(jié)合。在小鼠中，蛋白質(zhì)A以高親和性與IgG2a和IgG2b抗體結(jié)合，但是較差地結(jié)合于IgGl和IgG3抗體(Goudswaard等1978)。蛋白質(zhì)A是42kDa的蛋白質(zhì)，其具有四個富含天冬氨酸和谷氨酸但缺乏半胱氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域B)由3個反平行a-螺旋組成，當該蛋白質(zhì)與Fc復(fù)合時，其中第三個a-螺旋破裂(Graille等，2000)。鄉(xiāng)成絲斑形成疾病的特征在于腦中淀粉狀蛋白斑沉積物的存在以及神經(jīng)元的變性。淀粉狀蛋白沉積物通過聚集為不溶性團塊的肽形成。所述肽的性質(zhì)在不同疾病中不同，但是在大部分情形中，該聚集物具有(3折疊結(jié)構(gòu)并被剛果紅染料染色。除阿爾茨海默病(AD)夕卜，其他以淀粉狀蛋白沉積物為特征的疾病是例如SAA淀粉樣變性病、遺傳性冰島綜合癥、多骨髓瘤和朊病毒疾病，所述阿爾茨海默病包括早發(fā)性阿爾茨海默病，遲發(fā)性阿爾茨海默病和癥狀發(fā)生前的阿爾茨海默病。動物中最常見的朊病毒疾病是綿羊和山羊的癢病和牛的牛海綿狀腦病(BSE)(Wilesmith和Wells,1991)。在人類中鑒定了4種朊病毒疾病(i)庫魯病，(ii)克羅伊茨費爾特-雅各布病(CJD)，(iii)格-施-沙病(GSS)，和(iv)致死性家族失眠癥(FFI)(Gajdusek，1977;和Tritschler等，1992)。朊病毒疾病包括正常細胞朊病毒蛋白(PrPC)向相應(yīng)的癢病同種型(PrPSc)的轉(zhuǎn)化。分光鏡測量證明了PrPC向癢病同種型(PrPSc)的轉(zhuǎn)化包括主要的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，這暗示朊病毒疾病，像其他產(chǎn)生淀粉樣蛋白的疾病一樣，是蛋白質(zhì)構(gòu)象的病癥。從PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)換伴隨著a-螺旋二級結(jié)構(gòu)的減少(從42%到30%)和卩折疊含量的顯著增多(從3%到43%)(Caughey等，1991;和Pan等，1993)。該重排作用與異常的生理化學(xué)特性相關(guān)，所述生理化學(xué)特性包括在非變性去污劑中的不溶性和對蛋白質(zhì)水解的部分抗性。早先的研究顯示了與人PrP的殘基106-126(PrP106-126)同源的合成肽表現(xiàn)出一些PrPSc的病原和生理化學(xué)特性(Selvaggini等，1993;Tagliavini等，1993;和Forloni等，1993)。該肽顯示出顯著的構(gòu)象多態(tài)性，從而在多種環(huán)境中獲得不同的二級結(jié)構(gòu)(DeGioia等，1994)。它俾向于在緩沖溶液中采用卩折疊構(gòu)象，并聚集為淀粉狀蛋白原纖維，所述淀粉狀蛋白原纖維部分抵抗用蛋白酶的消化?？贵w3F4和其肽表位(PrP104-113)的復(fù)合物的X射線晶體學(xué)研究提供了該可變區(qū)域的結(jié)構(gòu)圖像，該區(qū)域被認為是發(fā)展朊病毒疾病所必需的構(gòu)象重排成分(Kanyo等，1999)。阿爾茨海默病(AD)是導(dǎo)致老年性癡呆的進行性疾病。廣泛地說，該疾病分成兩類發(fā)生在晚年(典型的65歲以上)的遲發(fā)性和在高齡期前，例如在35-60歲之間充分發(fā)展的早發(fā)性。在這兩種疾病類型中，病理學(xué)相似，但是在更早年齡開始的情形中的異常性傾向于更嚴重和廣泛。該疾病特征在于腦中的兩種類型的損傷，即老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。通過腦組織剖面的顯微鏡分析可見，老年斑是與位于中心的細胞外淀粉狀蛋白沉積物交叉的達到150mm的混亂嗜中性粒細胞的區(qū)域。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是tau蛋白的細胞內(nèi)沉積物，所述tau蛋白由成對彼此扭轉(zhuǎn)的兩條細絲組成。老年斑的主要要素是稱為淀粉狀蛋白P(Ap)或(3-淀粉狀肽((3AP或卩A)的肽。淀粉狀蛋白卩肽是稱為淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的前體蛋白的39-43氨基酸的內(nèi)部片段。已經(jīng)把若干APP中的突變與阿爾茨海默病的存在聯(lián)系起來了(Goate等，(1991)，纈氨酸到異亮氨酸；ChartierHarlan等，(1991),纈氨酸717到甘氨酸；Murrell等，(1991),纈氨酸717到苯丙氨酸；Mullan等，(1992)，雙突變，即將賴氨酸595-甲硫氨酸596改變?yōu)樘於０?95-亮氨酸596)。認為所述突變通過增多或改變的從APP向(3-淀粉狀蛋白的加工，具體地從APP向增加量的長形(3-淀粉狀蛋白(即，AJ31-42和Api-43)的加工，而引起阿爾茨海默病。認為其他基因，諸如早老蛋白基因，PS1和PS2中的突變間接影響APP的加工，以產(chǎn)生增加量的長形P-淀粉狀蛋白(見Hardy，TINS20，154,1997)。這些觀察說明卩-淀粉狀蛋白，且特別是其長形，是阿爾茨海默病中的成因性元素。關(guān)于淀粉狀蛋白纖維的公開文獻說明了圓柱形(3折疊是符合一些X-射線和電子顯微鏡數(shù)據(jù)的唯一結(jié)構(gòu)，且阿爾茨海默Ap片段和變體的纖維可能由兩個或三個同中心的圓柱形卩折疊構(gòu)成(Perutz等,2002)。完整的A卩肽含有42個殘基，即正好是集結(jié)成圓柱形殼的正確數(shù)量；該發(fā)現(xiàn)以及在缺乏脯氨酸條件下由A(3肽構(gòu)成的(3折疊中的許多可能的強靜電相互作用解釋了在阿爾茨海默病患者中發(fā)現(xiàn)的AP肽形成細胞外淀粉狀蛋白斑的傾向。如果該解釋是正確的，則淀粉狀蛋白由具有中心充水腔的細管(納米管)組成。體外淀粉狀蛋白斑生長的可逆性提示了斑和溶液中卩A的穩(wěn)定狀態(tài)平衡(Maggio和Mantyh,1996)。為形成(3折疊原纖維，(3A聚合對肽-肽相互作用的依賴，以及其他蛋白質(zhì)對該反應(yīng)的刺激作用，提示了可以對淀粉狀蛋白形成進行調(diào)節(jié)。已經(jīng)進行了許多嘗試，以發(fā)現(xiàn)能夠干擾淀粉狀蛋白形成的物質(zhì)。研究最多的化合物中有抗體，由P-斷裂(P-breaker)氨基酸如脯氨酸所組成的肽，帶電基團向識別基序的添加和N-甲基化氨基酸作為結(jié)構(gòu)單元的用途(由Gazit綜述,2002)。己經(jīng)提出了用于預(yù)防或治療患者中以淀粉狀蛋白聚集為特征的疾病的方法，其包括使得針對淀粉狀蛋白沉積物的肽成分的抗體接觸到聚集的或可溶的淀粉狀蛋白。見Schenk的W099/27944和Solomon的美國專利5,688,651，將每一篇的全部內(nèi)容引入本文作為參考。通過主動或被動的接種疫苗可以導(dǎo)致抗體接觸到可溶的或聚集的淀粉狀蛋白。在主動接種疫苗中，施用肽，所述肽可以是完整的淀粉狀肽或其一部分，從而在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，該抗體應(yīng)該與可溶的和/或聚集的淀粉狀蛋白相結(jié)合。被動接種疫苗包括直接施用對淀粉狀肽特異的抗體。這些程序通過減小淀粉狀蛋白斑或減緩所述斑的沉積率優(yōu)選地用于治療阿爾茨海默病。報告了Elan公司(ElanCorporation)和Wyeth-Ayerst實驗室已經(jīng)進行了疫苗的臨床試驗，從而測試所述過程。被測試的化合物是AN-1792。報告了該產(chǎn)品是(3-淀粉狀蛋白42形式。本文中任何文獻的引用不意欲承認該文獻是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或被認為是本申請任何權(quán)利要求的可專利性的材料。對任何文獻的內(nèi)容或日期的任何敘述都基于提交時申請人可獲得的信息，且不構(gòu)成對所述敘述正確性的承認。發(fā)明概述本發(fā)明提供噬菌體展示載體，所述噬菌體展示載體包含下列各項絲狀噬菌體，和通過抗體的Fc部分與蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物，其中在所絲狀噬菌體表面上展示了作為非天然絲狀噬菌體分子的蛋白質(zhì)A或其能夠與抗體Fc部分結(jié)合的片段或變體。本發(fā)明還提供藥物組合物，其含有本發(fā)明的噬菌體展示載體，以用作治療劑或診斷劑。本發(fā)明迸一步提供用于治療/抑制或用于診斷腦疾病，病癥或疾病狀況的方法，該方法通過向需要的受試者鼻內(nèi)施用本發(fā)明的噬菌體展示載體實現(xiàn)。附圖簡述圖1A顯示引物ProtA-fwd(SEQIDNO:l)和ProtA匿rev(SEQIDNO:2)，其用于蛋白質(zhì)A變體的PCR合成。圖IB顯示蛋白質(zhì)A變體的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖1C顯示蛋白質(zhì)A變體的氨基酸開放閱讀框(SEQIDNO:4)。圖2是顯示噬菌體-蛋白質(zhì)A結(jié)合IgGl型抗體(196,10D5,6C6和2H3)的圖。它還結(jié)合IgG2a(3D6)，并弱結(jié)合IgG2b(12B4)。圖3是顯示與針對A(31-16的抗體結(jié)合的噬菌體-ProtA—旦當它們與Api-16結(jié)合便不與蛋白質(zhì)A分離的圖。圖4是顯示與mAbl96結(jié)合的噬菌體-ProtAl的滴定的圖。圖5A和5B是顯示用兩種單獨濃度的抗體2H3滴定噬菌體的圖。圖6是顯示ELISA結(jié)果的圖，以檢查PEG沉淀后噬菌體蛋白質(zhì)A與抗體196的解離。處理是1，與5嗎196結(jié)合并PEG沉淀的噬菌體-蛋白質(zhì)A;2，同l，但無PEG沉淀；3，僅是PEG沉淀的抗體196;4，如3中的，但無PEG沉淀；4，無抗體且無PEG沉淀的噬菌體-蛋白質(zhì)A自身。圖7A和7B是顯示噬菌體-prtA-抗胰島素與胰島素的結(jié)合(圖7A)和用山羊抗小鼠抗體檢測到的噬菌體-prtA-胰島素-抗胰島素免疫復(fù)合物的結(jié)合(圖7B)的圖。圖8是比較用噬菌體復(fù)合物處理的小鼠和對照未處理小鼠中的可溶及不可溶Apl-42和不可溶A(31-40的水平的圖。圖9A和9B是顯示與未處理對照小鼠相比，用噬菌體-196復(fù)合物處理的PDAPP小鼠中不可溶或可溶A(31-42的水平的圖。圖IOA和IOB是顯示在復(fù)合物處理的小鼠和非轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笾蠭L1(3和IL10的細胞因子水平的圖。發(fā)明詳述絲狀噬菌體具有線性結(jié)構(gòu)，其能夠使它們在鼻內(nèi)施用時透入腦中。由于能夠?qū)⑺鼈兗庸こ稍谄渫鈿さ鞍咨洗嬖诮M合的(assorted)蛋白質(zhì)或肽，所以它們能夠用于遞送抗體或分子(以與其特異性抗體的免疫復(fù)合物形式)進入哺乳動物受試者的腦中。P3是組裝噬菌體外殼頂端之一的結(jié)構(gòu)蛋白，噬菌體通過所述外殼侵襲細菌大腸桿菌。本發(fā)明的一個方面涉及噬菌體展示載體，所述噬菌體展示載體包括絲狀噬菌體，在其表面上展示了作為非天然絲狀噬菌體分子的蛋白質(zhì)A或其能夠與抗體Fc部分結(jié)合的片段或變體，且述噬菌體展示載體還包括通過其Fc部分與蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物。在優(yōu)選的實施方案中，所述絲狀噬菌體還不通過連接體或直接與藥物綴合，且所述抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物也不固定在固體載體上。在另一個優(yōu)選的實施方案中，與在所述絲狀噬菌體上展示的蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體對不作為靶點在細胞表面上呈遞的分子特異，且該抗體不固定在固體載體上。在本發(fā)明人的實驗室中，使用了絲狀噬菌體M13,fl和fd，其在結(jié)構(gòu)和遺傳水平上都得到了充分的理解(Greenwood等，1991)。該實驗室最先顯示了絲狀噬菌體在保持載體惰性特性和攜帶外源分子能力的同時，表現(xiàn)出對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲透特性(Frenkel和Solomon,2002)。絲狀噬菌體是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的病毒，其含有環(huán)形單鏈DNA基因組。它們在多產(chǎn)的感染過程中，不殺死它們的宿主。感染包含F(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌的噬菌體總體稱為Ff噬菌體。它們不感染哺乳動物細胞。絲狀噬菌體是大約1-2微米長和直徑6nm的柔軟的桿，其具有圍繞DNA核心的蛋白質(zhì)亞基的螺旋殼。兩種主要的外殼蛋白，即蛋白質(zhì)pIII和主外殼蛋白pVin，區(qū)別在于所展示的蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。pIII以4-5個拷貝呈遞，而發(fā)現(xiàn)pVIII以3000個拷貝呈遞。大約50個-殘基的主外殼蛋白pVIII亞基主要是(x-螺旋，且該a-螺旋的軸與病毒體的軸形成小角度?？梢砸匀糠挚紤]蛋白質(zhì)殼外表面，其由所述亞基的N-末端區(qū)域占據(jù)，富含與周圍溶劑相互作用并給予所述病毒體低等電位點的酸性殘基；殼的內(nèi)部，其包括極性側(cè)鏈的19個-殘基的片段，其中蛋白質(zhì)亞基主要彼此間相互作用；和內(nèi)表面，其由所述亞基的C-末端區(qū)域占據(jù)，富含與DNA核心相互作用的堿性殘基。實際上全部蛋白質(zhì)側(cè)鏈相互作用是外殼蛋白陣列的不同亞基之間，而非在亞基內(nèi)的事實使其成為用于研究大分子集合體中的a-螺旋亞基之間的相互作用的有效的模型系統(tǒng)。盡管其具有大約16.3MD的質(zhì)量，絲狀噬菌體的獨特結(jié)構(gòu)使其能夠滲透進入腦，并可以有助于其干擾卩A原纖維化的能力，原因在于噬菌體結(jié)構(gòu)類似于淀粉狀蛋白原纖維自身。絲狀噬菌體可以是任何絲狀噬菌體，諸如M13、fl或fd。盡管在下文的實施例中使用了M13,預(yù)計任何其它絲狀噬菌體以相似的方式表現(xiàn)和起作用，其原因在于它們具有相似的結(jié)構(gòu)，且它們的基因組具有大于95%的基因組同一性。在按照本發(fā)明所述的噬菌體展示載體中，蛋白質(zhì)A、或其片段或變體展示在所述絲狀噬菌體的表面上。該噬菌體展示包括表達蛋白質(zhì)A或其片段或變體的cDNA克隆，所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體作為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白。因此，遺傳性修飾絲狀噬菌體基因組，從而在其表面上展示非天然多肽或肽。展示外源蛋白質(zhì)或肽作為與噬菌體外殼蛋白的融合的絲狀噬菌體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？梢允褂迷S多噬菌體和外殼蛋白，其包括但不限于M13蛋白HI，M13蛋白Vin，M13蛋白VI，M13蛋白VI，M13蛋白IX和fd小外殼蛋白pIII(Saggio等，1995;Uppala和Koivunen,2000)?？梢允褂靡淮笈d體(見Kay等，1996;Berdichevsky等,1999;和Benhar,2001)。在優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)A或其片段或變體通過其與絲狀噬菌體的小外殼蛋白(蛋白質(zhì)in)的融合而展示。將外源編碼序列插入到噬菌體基因中的方法是眾所周知的(見，例如Sambrook等,1989;和Brent等，2003)。金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)A是在本領(lǐng)域中用于結(jié)合抗體Fc部分的眾所周知且充分使用的蛋白質(zhì)。含有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)片段在本領(lǐng)域中也是充分公認的。還存在很多關(guān)于具有與抗體(免疫球蛋白)Fc部分改進的結(jié)合(或與來自不同Ig種類和亞類的Fc的區(qū)別性結(jié)合)的蛋白質(zhì)A變體的知識。優(yōu)選地，與蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體屬于IgG種類。蛋白質(zhì)A變體的最優(yōu)選實施方案是具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的變體。14蛋白質(zhì)A或其能夠結(jié)合抗體FC部分的片段或變體展示在絲狀噬菌體的表面上，以結(jié)合抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物，從而向腦遞送。本發(fā)明提供用于抑制或治療腦疾病、病癥或疾病狀況的方法，該方法是通過將所述噬菌體遞送載體引入到腦中而實現(xiàn)的。另外，本發(fā)明還提供用于診斷腦疾病、病癥或疾病狀況的方法，該方法是通過將可以被檢測到的，即標記的噬菌體展示載體引入到腦中而進行的。所述方法包括向需要其的受試者引入/施用有效量的本發(fā)明的噬菌體展示載體。為了本說明書和附加權(quán)利要求的目的，術(shù)語"患者"、"受試者"和"接受者"可互換地使用。它們包括作為預(yù)防或治療處理，或診斷的對象的人和其他哺乳動物。為了本說明書和附加權(quán)利要求的目的，術(shù)語"P淀粉狀肽"與"P-淀粉狀肽"、"淀粉狀(3肽"、"卩AP"、"卩A"禾B"A(3"同義。全部這些術(shù)語指源自淀粉狀蛋白前體蛋白的斑-形成肽。在優(yōu)選的實施方案中，與展示在噬菌體表面上的蛋白質(zhì)A(或其片段或變體)結(jié)合的抗體特異于(特異性結(jié)合于)淀粉狀P肽。淀粉狀P肽優(yōu)選地是A(31-42或A(31-40。用于本文時，"PrP蛋白"、"PrP"、"朊病毒"指在適當條件下能夠誘導(dǎo)引起斑-形成疾病的聚集物形成的多肽。例如，在所述條件下，將正常細胞朊病毒蛋白(PrPC)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的癢病同種型(PrPSc)，所述癢病同種型引起斑-形成疾病，諸如但不僅限于牛海綿狀腦病(BSE)、或瘋牛病、貓的貓科海綿狀腦病、庫魯病、克羅伊茨費爾特-雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)、和致死性家族失眠癥(FFI)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體對病原性PrPS同種型特異。術(shù)語"治療"意欲意指基本抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病、病癥或疾病狀況的進程，基本改善疾病、病癥或疾病狀況的臨床癥狀或基本預(yù)防疾病、病癥或疾病狀況臨床癥狀的出現(xiàn)。本發(fā)明的噬菌體遞送載體和方法針對腦疾病、病癥或疾病狀況。優(yōu)選地，所述腦疾病、病癥或疾病狀況是"斑-形成疾病"。術(shù)語"斑形成疾病"指以在疾病，諸如但不僅限于，早發(fā)性阿爾茨海默病(AD)、遲發(fā)性阿爾茨海默病、產(chǎn)生癥狀前的阿爾茨海默病，SAA淀粉樣變性病、遺傳性冰島綜合癥、衰老、多骨髓瘤和已知感染人和動物的朊病毒疾病中通過聚集蛋白(斑形成肽)引起的斑的形成為特征的疾病，所述聚集蛋白諸如但不限于J3-淀粉狀蛋白、血清淀粉狀蛋白質(zhì)A、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、IgGK輕鏈或朊病毒蛋白；所述已知感染人的朊病毒疾病諸如例如，庫魯病、克羅伊茨費爾特-雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)和致死性家族失眠癥(FFI)，和所述感染動物的朊病毒疾病諸如例如癢病和牛海綿狀腦病(BSE)。因為上文所述的大多數(shù)與斑-形成疾病相關(guān)的淀粉狀蛋白斑(也稱為淀粉狀蛋白沉積物)位于腦內(nèi)，所以任何提議的治療形式必須證明穿越血腦屏障(BBB)的能力，以及溶解淀粉狀蛋白斑的能力。通常，能夠穿透BBB的平均分子大小是大約2kDa。逐漸增多量的證據(jù)顯示在AD臨床過程的早期患有嗅覺缺陷和中樞嗅覺途徑中的退化改變。而且，AD中涉及的解剖模式提出嗅覺途徑可能是AD發(fā)育的最初階段。嗅覺受體神經(jīng)元是位于鼻腔上皮內(nèi)層中的雙極性細胞。它們的軸突穿過篩板，并投射到腦嗅球中嗅覺途徑的第一突觸。來自鼻上皮的嗅神經(jīng)元的軸突形成1000條無髓鞘纖維的束。這種構(gòu)型使得它們成為高通路，通過該高通路病毒或其他被傳輸?shù)奈镔|(zhì)可以穿越血腦屏障(BBB)獲得對CNS的靠近。如前所示，鼻內(nèi)施藥(Mathison等，1998;Chou等,1997;Draghia等，1995)允許病毒和大分子直接進入腦脊髓液(CSF)或CNS。文獻中報告了嗅覺受體神經(jīng)元作為向腦遞送腺病毒載體的位點的用途。據(jù)稱，該方法導(dǎo)致受體基因在無明顯毒性的條件下在腦中表達12天(Draghia等，1995)?？贵w或免疫復(fù)合物的直接腦遞送通過使用嗅神經(jīng)元作為向腦的轉(zhuǎn)運而克服了穿越BBB。在嗅上皮中，初級嗅神經(jīng)元的樹突與鼻內(nèi)腔接觸，且通過軸突，這些神經(jīng)元還與腦嗅球相連接。接觸到嗅上皮的噬菌體能夠被吸收到初級嗅神經(jīng)元中，并轉(zhuǎn)運到嗅球，且甚至進一步進入腦的其他區(qū)域。按照本發(fā)明治療/抑制或診斷的腦疾病、病癥或疾病狀況還包括腦腫瘤和腦炎癥(braininflammatory)疾病、病癥或疾病狀況。腦炎癥導(dǎo)致在完整海馬結(jié)構(gòu)中新神經(jīng)元的基底連續(xù)結(jié)構(gòu)中和在對腦損傷響應(yīng)增加的神經(jīng)發(fā)生中的神經(jīng)發(fā)生的抑制。神經(jīng)發(fā)生的損害依賴于小膠質(zhì)細胞的活化程度，而與周圍組織中是否存在損害無關(guān)。腦炎癥在除AD外的其他慢性神經(jīng)變性病癥的發(fā)病機理中可能起重要作用，其包括APP病理作用，所述其它慢性神經(jīng)變性病癥如帕金森氏病、雷維小體癡呆、AIDS癡呆復(fù)征、外傷性腦損傷、青光眼等。外傷性腦損傷(TBI)包括卩-淀粉狀蛋白沉積和癡呆的早期發(fā)作。盡管有該描述，但是幾乎不知道這些變化發(fā)生的機制。在TBI中生成p-淀粉狀肽的一個假設(shè)來源是(3-淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的異常蛋白水解分裂，己經(jīng)顯示出所述(3-淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)在外傷損傷的軸突中損害的軸漿運輸位點處累積。實際上，最近在TBI的豬模型中發(fā)現(xiàn)伴隨腫脹軸突的PA免疫反應(yīng)性(Smith等，1999)，這提示外傷損傷的軸突中APP的積累可能是TBI中|3-淀粉狀肽形成的來源。神經(jīng)變性疾病和病癥的非限制性實例包括阿爾茨海默病(AD)、帕金森氏病、雷維小體癡呆、AIDS癡呆復(fù)征、中風(fēng)、和封閉性腦損傷和外傷性腦損傷，諸如槍傷、出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)、腦缺血、由神經(jīng)損害試劑如毒素、毒藥、化學(xué)(生物戰(zhàn))試劑引起的損害或由外科手術(shù)諸如腫瘤切除引起的損害。在優(yōu)選的實施方案中，與噬菌體展示的蛋白質(zhì)A(或其片段或變體)結(jié)合的抗體是特異于靶分子的單克隆抗體，所述靶分子與腦疾病、病癥或疾病狀況相關(guān)，諸如淀粉狀!3肽和PrPSc。所述抗體還可以是針對腦中炎性細胞因子諸如TNFa、IL6等的抗體，從而抑制/治療由中風(fēng)、腦損傷或其他神經(jīng)變性疾病或病癥引起的腦炎癥。在用于診斷作為腦疾病、病癥或疾病狀況的腦腫瘤的情形中，抗體特異于腦腫瘤所特有的靶細胞，并且它的存在是對特殊腦腫瘤的診斷。備選地，展示蛋白質(zhì)A(或其片段或變體)的噬菌體遞送載體可以用于將免疫復(fù)合物遞送進入腦中，其中所述蛋白質(zhì)A(或其片段或變體)通過抗體的Fc部分與抗原-抗體免疫復(fù)合物相結(jié)合。免疫復(fù)合物中與抗體結(jié)合的抗原是能夠治療腦疾病、病癥或疾病狀況的分子。與抗體結(jié)合的抗原的非限制性實例包括胰島素、能夠降低神經(jīng)元損傷和細胞死亡的促紅細胞生成素(EPO)、干擾素和其他抗炎細胞因子諸如IL10和不穿越血腦屏障的神經(jīng)元保護分子。按照本發(fā)明用于診斷腦疾病、病癥或疾病狀況的方法包括向需要其的受試者鼻內(nèi)施用本發(fā)明的噬菌體展示載體。當具有它的抗體成分的噬菌體展示載體和與腦疾病、病癥或疾病狀況相關(guān)的靶分子結(jié)合時，那么檢測到腦疾病、病癥或疾病狀況的存在。可以可檢測地標記與在絲狀噬菌體表面上展示的蛋白質(zhì)A(或其能夠與抗體FC部分結(jié)合的片段或變體)結(jié)合的抗體。標記的抗體優(yōu)選地是放射性標記的，從而用在針對腦腫瘤的治療中或診斷性放射成像中。用于標記的放射性核素的非限制性實例包括mIn，1251，'"I和"mTc。所述放射性標記的抗體，其優(yōu)選地是放射性碘標記的抗體，通過用于放射性標記肽和蛋白質(zhì)的標準方法制備，并且然后再與在絲狀噬菌體表面上展示的蛋白質(zhì)A(或其片段或變體)相結(jié)合。其他合適的可檢測標記包括造影劑諸如釓(Gd)，它是增強的動力學(xué)MRI的優(yōu)選試劑，以及包括重元素(例如，Pt,Au，和T1)的有機或無機化合物。按照本發(fā)明所述的藥物制劑包括本發(fā)明的噬菌體展示載體作為活性成分。所述藥物制劑還可以是來自不同絲狀噬菌體的噬菌體展示載體的混合物?？梢詫凑毡景l(fā)明所述的制劑自身，或處于與合適的載體或賦形劑混合的藥物組合物中，施用給生物體。用于本文時，"藥物組合物"指一種或多種本文所述的活性成分和其他化學(xué)成分諸如生理適合的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的是促進化合物向生物體的施用。術(shù)語"活性成分"指對生物作用負責(zé)的制劑。在藥物組合物用于診斷應(yīng)用的情形中，術(shù)語"活性成分"意指靶向與腦疾病、病癥或疾病狀況相關(guān)分子的抗體。在下文中，可以互換地使用的短語"生理用載體"和"藥用載體"指這樣的載體或稀釋劑，其不對生物體引起顯著剌激且不消除被施用的化合物的生物活性和性質(zhì)。術(shù)語"賦形劑"指向藥物組合物添加的惰性物質(zhì)，從而進一步促進活性成分的施用。賦形劑的非限制性實例包括碳酸^、磷酸轉(zhuǎn)、不同的糖和多種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。在"雷明頓制藥科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences)"馬克出版公司(MackPublishingCo.)，伊斯頓(Easton),PA，最新版本中可以找到用于藥物配制和施用的技術(shù)，將其引入本文作為參考。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域中熟知的過程制備，例如通過常規(guī)混合、溶解、?；⑻且峦柚苽?、研末、乳化、包封、陷入或凍干過程。由此，可以以常規(guī)方式配制按照本發(fā)明使用的藥物組合物，所述常規(guī)方式利用一種或多種藥用載體，包括賦形劑和助劑，其促進將所述活性成分加工到能被藥用的制劑中。為了通過鼻吸入施藥，按照本發(fā)明使用的活性成分便利地以氣霧噴霧劑的形式遞送，其從使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的壓縮包裝或噴霧器中噴出。鼻噴霧，其不需要如吸入噴霧中的壓縮包裝或噴霧器，可以備選地用于鼻內(nèi)施藥。在壓縮氣霧劑的情形中，通過提供用于定量遞送的閥可以確定劑量單位?？梢耘渲圃诜峙淦髦惺褂玫睦缑髂z膠囊或藥筒，其包含所述化合物和合適粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。適合于在本發(fā)明的情形中使用的藥物組合物包括這樣的組合物，其中包含有效獲得預(yù)期目的的量的活性成分。更特別地，治療有效量意指有效預(yù)防、減輕或改善疾病、病癥或疾病狀況癥狀或延長受治療受試者生存的活性成分的量。治療或診斷有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，特別是根據(jù)本文所提供的詳細公開?？梢詥为氄{(diào)節(jié)劑量的量和時間間隔，從而提供噬菌體展示載體的腦水平，其足以治療或診斷具體的腦疾病、病癥或疾病狀況(最小有效濃度，MEC)。MEC針對每種制劑而不同，但是由體外數(shù)據(jù)估算。達到MEC必需的劑量應(yīng)該取決于個體的特征。利用MEC值還能夠確定劑量時間間隔。應(yīng)該利用這樣的方案施用制劑，所述方案維持腦水平在10-90%，優(yōu)選地在30-90%之間和最優(yōu)選地50-90%的時間高于MEC。依賴于待治療疾病狀況的嚴重性和反應(yīng)，給藥可以是單次或多次施藥，其治療過程持續(xù)數(shù)天到數(shù)周或直到達到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減小。當然，待施用組合物的量應(yīng)該取決于接受治療或診斷的受試者，痛苦的嚴重性，處方醫(yī)師的判斷，等。如果需要，本發(fā)明的組合物可以存在于包裝或分配器設(shè)備中，諸如FDA批準的試劑盒，其可以包含一種或多種含有活性成分的單位劑型D包裝可以，例如，包括金屬或塑料薄片，諸如泡狀包裝。包裝或分配器裝置可以附加施用說明書。包裝或分配器還可以適應(yīng)于伴隨著容器的注釋，所述容器處于控制醫(yī)藥品制造、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的形式，所述注釋反映所述機構(gòu)對組合物形式或人或獸醫(yī)施藥的批準。該注釋，例如，可以是由美國食品和藥品管理局對處方藥物批準的標簽或批準的產(chǎn)品插入頁。如同上文進一步詳述地，還可以制備包含配制在相容的藥物載體中的本發(fā)明的制劑的組合物，將其置于適當?shù)娜萜髦?，并標記用于治療指定的疾病狀況?，F(xiàn)已一般性地描述了本發(fā)明，將通過參考下列實施例更容易地對其進行理解，所述實施例是通過舉例說明的方式提供的，且不意欲限制本發(fā)明。實施例在該研究中，構(gòu)建了在P3上展示蛋白質(zhì)A變體的絲狀噬菌體。先前的工作使用了這一基本觀點，然而，是以不同的方式Li等(1998)使用了展示蛋白質(zhì)A的B結(jié)構(gòu)域的噬菌體，所述蛋白質(zhì)A的B結(jié)構(gòu)域與scFv分子融合。Djojonegoro等(1994)僅使用了在M13噬菌體上展示的蛋白質(zhì)A的B結(jié)構(gòu)域，且Sampath等(1997)使用了B結(jié)構(gòu)域來證明絲狀噬菌體能夠用作克隆工具。全部這些先前的研究使用了噬菌體展示技術(shù)，從而能夠通過蛋白質(zhì)AIgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人IgG的結(jié)合，對在噬菌體上展示的蛋白質(zhì)A的改進形式進行容易的選擇。下文所述的本研究的實驗表明，展示蛋白質(zhì)A變體的噬菌體結(jié)合小鼠抗體，主要是IgGl型和它們的配體。通過鼻內(nèi)應(yīng)用將這些復(fù)合物施用于hAPPtg小鼠。它們進入小鼠的腦部，并發(fā)揮下文討論的作用。材料和方法斧成歪，爿變沐所使用的蛋白質(zhì)A的部分包含四個重復(fù)結(jié)構(gòu)域，包括結(jié)構(gòu)域B。合成了兩種引物，即具有ATG密碼子和NcoI限制性位點的正向引物，和不具終止密碼子并具有NotI限制性位點的反向引物(圖1A)。利用下列方案進行了PCR:在lxQiagenTaq聚合酶緩沖液中組合2昭金黃色葡萄球菌基因組DNA和20jaM的各種引物。向100^1反應(yīng)體積加入dNTPs(0.2mM),和2.5單位的聚合酶。PCR條件是在94t:起始變性3分鐘，隨后以進行30個周期在94。C變性30秒，在55。C退火1分鐘和在72匸聚合l分鐘。用NcoI和NotI消化，凝膠純化PCR產(chǎn)物，并將其克隆到預(yù)先用NcoI和NotI線性化的載體pCANTAB5E中。將蛋白質(zhì)A基因的這一部分克隆到該載體中產(chǎn)生蛋白質(zhì)A與絲狀噬菌體(M13)的基因3的翻譯融合。利用輔助噬菌體產(chǎn)生了展示蛋白質(zhì)A-P3融合的噬菌體，其稱為噬菌體protA。通過ELISA測量噬菌體蛋白質(zhì)A與不同IgG抗體的結(jié)合:在0.1M磷酸鈉，pH8.5中混合IO"個展示蛋白質(zhì)A的噬菌體和10昭(15nmols)抗體。在37t:輕輕搖動該混合物30分鐘，然后一式四份地將5(Hd等分試樣添加到ELISA孔中，所述孔預(yù)先由兔抗噬菌體抗體包被，并用3%的牛奶封閉。山羊抗-小鼠-HRP綴合的抗體用作第二抗體。用OPD和過氧化物進行HRP反應(yīng)。將結(jié)果描述為在492nm處的OD。通過下列步驟檢驗了抗原結(jié)合后噬菌體-蛋白質(zhì)A-抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性在0.1M磷酸鈉，pH8.5中混合1011個展示蛋白質(zhì)A的噬菌體和10嗎(15nmols)抗體。在37t:輕輕搖動該混合物30分鐘，并且然后將與抗體的摩爾比為50:1的抗原(0.32nmols生物素酰化的Api-16)加入到噬菌體-蛋白質(zhì)A和抗體的混合物中，再持續(xù)30分鐘。一式四份地將5(Hil等分試樣添加到ELISA孔中，所述孔預(yù)先由兔抗噬菌體抗體包被，并用3%的牛奶封閉。使用抗生物素蛋白-HRP綴合物檢測與ELISA平板結(jié)合的復(fù)合物。只有仍然與抗原結(jié)合的噬菌體-抗體復(fù)合物將與抗生物素蛋白-HRP綴合物反應(yīng)。這些實驗中使用的稀釋了1:1000的血清取自具有針對ERFH表位的滴度的小鼠。為了滴定與不同量的抗體結(jié)合所需要的噬菌體的數(shù)量，將表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)A的最佳結(jié)合能力的抗體196以3種不同濃度(50,100和250ng/孑L)用來包被ELISA平板，隨后用3%的牛奶對孔進行封閉。加入不同濃度(10Vml-10Wml)的噬菌體-蛋白質(zhì)A，并通過兔抗-噬菌體抗體和山羊抗-兔-HRP抗體檢測所結(jié)合的噬菌體?？贵w-抗原復(fù)合物與噬菌體-蛋白質(zhì)A的結(jié)合滴定如下將109/ml-1012/ml的噬菌體與兩種獨立濃度的抗體2H3，即lOng或50ng，和1:2摩爾比的抗體抗原(對每個抗體分子有兩個抗原分子)混合。將混合物在37t:輕輕搖動30分鐘，然后添加到ELISA孔中，所述孔預(yù)先用兔抗噬菌體抗體包被，并由在PBS中3。/。的牛奶包被。用抗生物素蛋白-HRP綴合物檢測結(jié)合的噬菌體，所述抗生物素蛋白-HRP綴合物僅能與生物素酰化的抗原結(jié)合。還檢測了噬菌體-蛋白質(zhì)A抗體復(fù)合物的PEG沉淀是否引起它們的解離在4。C，用20嗎/ml抗生物素蛋白包被ELISA孔過夜，并再用l昭/ml生物素?；腁J31-16肽在室溫下包被ELISA孔30分鐘。用在PBS中的3。/o的牛奶封閉該？L在1ml0.1MNa2HP04中將1012噬菌體與l嗎或5嗎抗體196相混合，并且在37。C輕輕搖動1小時。利用PEG-NaCl沉淀該混合物的一半，隨后如前重新混懸在500^10.1MNa2HP04中，并且在不沉淀的條件下使用另一半。在37i:，將兩種混合物都應(yīng)用于前述ELISA平板(50pl混合物/L)1小時。用小鼠抗-噬菌體和山羊抗-小鼠-HRP綴合物進行結(jié)合的噬菌體的檢測。還檢驗了噬菌體-蛋白質(zhì)A與抗-胰島素IgG生成復(fù)合物的情況。在37°C，將噬菌體-蛋白質(zhì)A(1012/ml)與不同濃度的抗-胰島素抗體混合，并在37'C輕輕搖動30分鐘。在應(yīng)用到ELISA平板前，PEG沉淀該復(fù)合物，所述ELISA平板在4'C用0.25mg/ml胰島素包被過夜。用小鼠抗-噬菌體和山羊抗-小鼠抗體，或只用山羊抗小鼠抗體，檢測所結(jié)合的噬菌體。該第二檢測方法用于證明抗胰島素抗體確實與噬菌體蛋白質(zhì)A—起存在于復(fù)合物中。沐片做向年齡為9個月的PDAPP小鼠供給噬菌體-protA復(fù)合物(與Ab196或與抗-胰島素Ab加胰島素)，每2周一次(4次治療)，并在隨后的6個月內(nèi)每月一次，總共為10次治療。通過鼻內(nèi)施用供給復(fù)合物，將20微升分為2個鼻孔施用。治療結(jié)束時，對小鼠進行安樂死和處死。在液氮中冷凍來自每只小鼠左腦半球。將每個半球勻漿，并分為可溶和不可溶級分。隨后，用胍-HCl溶解不可溶級分。在進行分析之前保持兩種級分冷凍。利用對AP1-42特異的捕獲抗體和檢測抗體，通過夾心式ELISA進行卩淀粉狀蛋白l-42檢測。用IL1(3或IL10的特異性試劑盒進行細胞因子水平的確定(R&D系統(tǒng)(R&Dsystems))。結(jié)果和討論利用圖1A中描述的引物合成了蛋白質(zhì)A變體。對PCR產(chǎn)物進行測序，從而證實其完整性，并將其克隆到pCANTAB5E中。產(chǎn)生表達與噬菌體PIII融合的蛋白質(zhì)A變體的噬菌體，并用在ELISA中。展示蛋力^U變沐游敏葳沐主要與/gC7/貧沐翁合由ELISA檢驗protA噬菌體與IgG型抗體的結(jié)合。在圖2中，呈現(xiàn)了IO"個噬菌體顆粒與15nmol不同抗體的結(jié)合。敏蘑體/^M-潛合游拔體在與gY/:7游貧嚴翁合^不A厥述麼朦沐^分庸絲檢驗抗體，從而確定它們在與其抗原結(jié)合后是否從所述噬菌體中解離出來。使用了來自(3-淀粉狀肽N末端的氨基酸殘基1-16的生物素?；淖鳛榭乖?，。圖2中總結(jié)了該實驗的結(jié)果。對于該實驗，在0.1M磷酸鈉，pH8.5中混合10"個展示蛋白質(zhì)A的噬菌體和10嗎(15nmols)抗體。在37。C輕輕搖動該混合物30分鐘，并且然后將與抗體的摩爾比為50:1的抗原(0.32nmols生物素?；腁(31-16)加入到噬菌體-蛋白質(zhì)A和抗體的混合物中，再持續(xù)30分鐘。將該復(fù)合物添加到ELISA孔中，所述孔預(yù)先由兔抗噬菌體抗體包被，并由3°/。的牛奶封閉。使用綴合的抗生物素蛋白-HRP檢測與ELISA平板結(jié)合的復(fù)合物。只有在結(jié)合抗原后仍然連接的噬菌體-抗體復(fù)合物將與抗生物素蛋白-HRP綴合物反應(yīng)。這些實驗中使用的血清取自具有針對ERFH表位滴度的小鼠。圖3證明了當?shù)鞍踪|(zhì)A-結(jié)合的抗體與它們識別的抗原結(jié)合時，它們不與蛋白質(zhì)A分開。從平板-結(jié)合的噬菌體-protA中分離的抗體-抗原復(fù)合物將被洗掉，并且將不與抗生物素蛋白-HRP反應(yīng)。如圖2中所示，12B4與噬菌體-proA弱結(jié)合。它在此不反應(yīng)，因為它不結(jié)合肽1-16，并將其用作另一個陰性對照。當用PBS緩沖液，pH6.0洗滌ELISA平板時，結(jié)合結(jié)果不變。較低的pH沒有導(dǎo)致抗體-抗原復(fù)合物從噬菌體-ProtA中的解離。縱歪頗爿與』"6麟合滴定了結(jié)合不同量抗體所需的噬菌體的數(shù)量，以證實結(jié)合是特異性的。在該實驗中，將表現(xiàn)出對蛋白質(zhì)A的最佳結(jié)合能力的抗體196以3種不同濃度用來包被ELISA平板，隨后用3%的牛奶封閉孔。加入不同濃度的噬菌體-蛋白質(zhì)A，且由兔抗-噬菌體抗體檢測結(jié)合的噬菌體(圖4)。由圖4，明顯地，噬菌體-蛋白質(zhì)A與抗體196的結(jié)合是特異性的；其作為噬菌體數(shù)量和抗體濃度的函數(shù)得到增強。在該實驗設(shè)置中，沒有觀察到飽和結(jié)合。為了估算展示蛋白質(zhì)A的噬菌體的數(shù)量，用提高的噬菌體濃度包被ELISA孔，并與抗-噬菌體抗體反應(yīng)(未顯示)。通過比較該分析和圖4中呈現(xiàn)的在先分析之間在492nm處的0D，能夠確定大約30%-36%的噬菌體展示蛋白質(zhì)A。為了確定結(jié)合特定量的噬菌體所需要的抗體的量(其應(yīng)該也指示應(yīng)該被結(jié)合的抗原的量)，進行了另一個實驗，其中將提高數(shù)量的噬菌體與2種獨立濃度的抗體(2H3)，及l(fā):2的抗體抗原摩爾比(對于每個抗體分子有2個抗原分子)相混合(圖5A)。將混合物添加到ELISA孔中，所述孔預(yù)先由兔抗噬菌體抗體包被，并由在PBS中3。/。的牛奶包被。用抗生物素蛋白-HRP綴合物檢測所結(jié)合的噬菌體，所述抗生物素蛋白-HRP綴合物僅能與生物素?；目乖Y(jié)合。因為對與每種抗體濃度觀察到的值在不同噬菌體濃度之間區(qū)別不大，所以也能夠?qū)⒔Y(jié)果總結(jié)為"平均值的平均值"，且如圖5B中所示繪圖。這些結(jié)果證明抗體濃度，而非噬菌體濃度，是該實驗設(shè)置中的限制因素在109/ml噬菌體-蛋白質(zhì)A(每個ELISA孔中使用5xl07個噬菌體/50pl)時，存在充足的蛋白質(zhì)A分子結(jié)合50ng，這是大約70pmo1，且它們不足以飽和5xl(f個噬菌體-蛋白質(zhì)A分子。尸五G-7V"C7縱賄導(dǎo)默鵬微離貧微庸還檢驗了噬菌體-蛋白質(zhì)A-抗體復(fù)合物的PEG沉淀是否導(dǎo)致它們的解離。用抗生物素蛋白和1嗎/ml生物素酰化1-16肽包被ELISA孔。用在PBS中的3。/。的牛奶封閉孑L。在0.1MNa2HPO4中混合1012個噬菌體與l嗎或5pg抗體196，并且在37。C輕輕搖動1小時。利用PEG-NaCl沉淀該混合物的一半，隨后以與先前相同的緩沖液和相同體積對其進行重新混懸，并且在不沉淀的條件下使用另一半。在37。C，將兩種混合物都應(yīng)用于前述ELISA平板(50pl混合物/孔M小時。用小鼠抗-噬菌體和山羊抗-小鼠-HRP綴合物進行結(jié)合的噬菌體的檢測。圖6顯示PEG沉淀導(dǎo)致大約20%的噬菌體蛋白質(zhì)A-抗體復(fù)合物解離。敏蘑體歪離爿翁合恭貭島微糊虡絲戯體絲將噬菌體蛋白質(zhì)A和抗-胰島素IgG混合，并將該復(fù)合物用到ELISA平板上，所述板由0.25mg/ml的胰島素包被。在應(yīng)用到ELISA平板前，PEG沉淀該復(fù)合物。用小鼠抗-噬菌體和山羊抗-小鼠抗體(圖7A)或僅用山羊抗-小鼠(圖7B)檢測結(jié)合的噬菌體。該第二檢測方法用于證明抗胰島素抗體確實與噬菌體蛋白質(zhì)A—起存在于復(fù)合物中。將噬菌體-蛋白質(zhì)A(10力ml)與不同濃度的抗-胰島素抗體相混合，且在37'C輕輕搖動30分鐘。在應(yīng)用到ELISA平板前，PEG沉淀該復(fù)合物。用小鼠抗-噬菌體，以及隨后通過山羊抗-小鼠抗體檢測所結(jié)合的噬菌體。圖7A中顯示了相似測定的結(jié)果，但圖7B中顯示了僅用山羊抗-小鼠抗體的檢測。總之，產(chǎn)生了展示蛋白質(zhì)A變體的絲狀噬菌體，所述蛋白質(zhì)A變體能夠結(jié)合IgG型抗體。與強烈結(jié)合小鼠IgG2a和IgG2b的金黃色葡萄球菌25的天然蛋白質(zhì)A相反，該重組蛋白質(zhì)A結(jié)合小鼠IgGl分子，IgGl分子為最豐富的類型并且更好。這些噬菌體能夠在體外用于純化抗體，或例如，能夠在體內(nèi)用來向腦遞送某些抗體。沐艦究維蘿伴-^WU96.如在材料和方法部分所解釋地，將噬菌體-protA-196復(fù)合物應(yīng)用到PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠中。檢驗了可溶和不可溶級分(用胍-HCl溶解的聚集的肽和膜)中P-淀粉狀肽1-42的水平，和不可溶級分中A(31-40的水平。與轉(zhuǎn)基因未處理對照相比，在處理的小鼠中觀察到在可溶和不可溶級分中A(31-42的量減少大約20%。然而，該結(jié)果不是顯著的(圖8)。在A(31-40中，在與對照未處理小鼠相比，在用噬菌體復(fù)合物處理的小鼠間沒有觀察到差別。^^^Lp"-i^^"逸^L,應(yīng)^:用噬菌體-抗體-胰島素復(fù)合物處理PDAPP小鼠。在圖9A中，與Tg未處理小鼠或用噬菌體-196復(fù)合物處理的小鼠相比，在用該復(fù)合物處理的小鼠中觀察到不可溶AP1-42水平更顯著的差別，即大約60%的減少。僅用噬菌體處理的小鼠具有平均23%的A(3l-42水平減少。與對照相比，在處理的小鼠中可溶Api-42水平的減少甚至更加顯著且達到80%(圖9B)。檢驗了IL1(3，即促炎細胞因子，和ILIO，即抗炎細胞因子的水平。轉(zhuǎn)基因未處理小鼠中ILip水平比非轉(zhuǎn)基因小鼠中ILip水平高大約36%(圖IOA)，這意味著疾病引起以較高IL1(3濃度顯示的炎癥。然而，所述復(fù)合物處理的小鼠含有與非轉(zhuǎn)基因小鼠中的IL1(3水平相似的水平，這提示處理的小鼠沒有發(fā)展腦炎癥。在抗炎細胞因子，IL10的濃度中觀察到相同的現(xiàn)象(圖IOB)。于此，再一次，與含有平均少18嘰的IL10的轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾?，在非轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因處理的小鼠中IL10的水平相似。接受噬菌體-protA-196的PDAPP小鼠的細胞因子水平在處理的小鼠和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g沒有顯示出差別(數(shù)據(jù)未顯示)。在先研究提示胰島素通過鼻內(nèi)胰島素施藥途徑對記憶功能的急性改善效應(yīng)，己知所述鼻內(nèi)胰島素施藥途徑提供物質(zhì)進入腦脊髓液室的直接通路(Strachan,2005)。先前的結(jié)果表明了邊緣和海馬區(qū)域中胰島素受體的普遍性，以及用系統(tǒng)胰島素對記憶的改善。將胰島素與噬菌體混合，從而證明了將增多數(shù)量的噬菌體引入到腦中，這導(dǎo)致淀粉狀蛋白負擔(dān)的有效降低。該效果伴隨著腦中細胞因子分布的改善。這種累積作用可能是通過胰島素作為AD保護治療，而獲取噬菌體的抗聚集性質(zhì)加更好的滲透性的有效方法?，F(xiàn)己完整地描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解在不偏離本發(fā)明的精神和范圍且不需要過度實驗的條件下，可以在寬范圍的等價參數(shù)、濃度和條件范圍內(nèi)實現(xiàn)相同的目的。雖然己經(jīng)結(jié)合其具體實施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解能夠進一步對其進行改變。該申請意欲包括本發(fā)明的任意變化、用途或修改，其通常按照本發(fā)明的原則并包括本發(fā)明的這樣的背離，即所述背離來自本發(fā)明所屬領(lǐng)域中已知或習(xí)慣的實踐，和可以適用于如在后附的權(quán)利要求的范圍中闡述的上述基本特征。將本文引用的全部參考文獻，包括雜志文章或摘要、公布的或相應(yīng)的美國或外國專利申請、授權(quán)的美國或外國專利、或任何其他參考文獻，完整引入本文作為參考，包括引用的參考文獻中描述的全部數(shù)據(jù)、表格、附圖和正文。另外，也將本文引用的參考文獻中引用的參考文獻的完整內(nèi)容完整引入，作為參考。對已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、己知方法或常規(guī)方法的參考不以任何方式承認在相關(guān)技術(shù)中公開、教導(dǎo)或提示了本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨?。前述具體實施方案的描述應(yīng)該如此完整的揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，以至于其他人通過應(yīng)用本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的知識(包括本文引用的參考文獻的內(nèi)容)，在無過度實驗，不偏離本發(fā)明一般概念的條件下，方便地修改和/或使所述具體實施方案適應(yīng)于不同應(yīng)用。因此，基于本文所述的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所述適應(yīng)和修改意欲處于與公開的實施方案等價的含義和范圍內(nèi)。應(yīng)該理解本文中的措辭或術(shù)語是為了描述而非限制的目的，以致本說明書的術(shù)語或措辭應(yīng)該由技術(shù)人員依據(jù)本文所述的教導(dǎo)和指導(dǎo)，并結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識進行解釋。參考文獻Adzamil等，放射學(xué)研究(Inves.Radiol.)26(2):143-8，1991Benhar等，單鏈抗體的噬菌體展示(Phagedisplayofsingle-chainantibodies).在J.Colligen(Ed)，當前免疫學(xué)方案(CurrentProteocolsinImmunology)，巻10.19B,美國JohnWiley&Sons公司(2001)中Berdichevsky等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)，228:151-62(1999)Bluthner等，"由具有基因片段噬菌體展示文庫的PM/Scl自體抗體識別的表位定位"("MappingofepitopesrecognizedbyPM/Sclautoantibodieswithgene-fragmentphagedisplaylibraries"),免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)198:187-198(1996)Bonnycastle等，"用由絲狀噬菌體展示一組受限制的肽文庫探測抗體反應(yīng)'性基石出"("Probingthebasisofantibodyreactivitywithapanelofconstrainedpeptidelibrariesdisplayedbyfilamentousphage).分子生物學(xué)雜志(JMolBiol.),24;258(5):747-62(1996)Brent等，當前分子生物學(xué)中的方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWiley&Sons公司(2003)Caughey等，"由紅外光譜獲得的癢病相關(guān)蛋白PrP27-30在水中的二級結(jié)構(gòu)分析"("Secondarystructureanalysisofthescrapie-associatedproteinPrP27-30inwaterbyinfraredspectroscopy")，生物化學(xué)(Biochemistry)30:7672-7680(1991)ChartierHarlan等，自然(Nature)53:844(1991)Chou等，生物制藥學(xué)和藥物處理(BiopharmDrugDispos.)18(4):335-46(1997)Cortese等，"利用在噬菌體上展示的肽文庫進行的表位遞送"("Epitopediscoveryusingpeptidelibrariesdisplayedonphage",生物技術(shù)趨勢(TrendsBiotechnol)12:262-267(1994)Cortese等，"利用展示在噬菌體上的隨機文庫識別生物活性肽"("Identificationofbiologicallyactivepeptidesusingrandomlibrariesdisplayedonphage"),當前生物技術(shù)觀點(CurrOpinBiotechnol)6:73-80(1995)Cortese等，"通過隨機肽文庫的噬菌體展示選擇生物活性肽"("Sdectionofbiologicallyactivepeptidesbyphagedisplayofrandompeptidelibraries).當前生物技術(shù)觀點(CurrOpinBiotechnol)7:616-621(1996)Cwirla等，"噬菌體上的肽用于識別配體的肽的大文庫"("Peptidesonphage:avastlibraryofpeptidesforidentifyingligands")，美國國家禾斗學(xué)院學(xué)報(ProcNatlAcadSciUSA)87:6378-6382(19卯)DeGioia等，"與朊病毒蛋白的殘基106-126同源的淀粉狀蛋白生成和毒害神經(jīng)的肽的構(gòu)象多態(tài)性"("Conformationalpolymorphismoftheamyloidogenicandneurotoxicpeptidehomologoustoresidues106-126oftheprionprotein"),生物化學(xué)雜志(JBiolChem)269:7859-7862(1994)DjojonegoroBM，BenedikMJ，WillsonRC,"金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體表面展示"("Bacteri叩hagesurfacedisplayofanimmunoglobulin-bindingdomainofStaphylococcusaureusproteinA")生物技術(shù)(Biotechnology)12(2):169-72(1994).Dotto等，"噬菌體flDNA復(fù)制的功能起點其信號和結(jié)構(gòu)域"("ThefunctionaloriginofbacteriophageflDNAreplication:ItsSignalanddomains")，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)172:507-521(1984)DowerWJ,"噬菌體能力"("Phagepower")，現(xiàn)代生物學(xué)(CurrBiol)2:251-253(1992)Draghia等，基因治療(GeneTherapy)2:418-423(1995)Fdici等，"從在多價暴露載體上表達寡肽大文庫中選擇抗體配體"("Selectionofantibodyligandsfromalargelibraryofoligopeptidesexpressedonamultivalentexpositionvector")，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)222:301-310(1991)Frenkd等，"阿爾茨海默卩-淀粉狀肽的N-末端EFRH序列代表其抗-聚集抗體的表位"("N-terminalEFRHsequenceofAlzheimer's(3-amyloidpeptiderepresentstheepitopeofitsanti-aggregatingantibodies"),神經(jīng)免疫學(xué)雜志(JNeuroimmunology)88:85-90(1998)Frenkd,D.,Solomon,B.和Benhar，I."由位點定向的單鏈抗體調(diào)節(jié)阿爾茨海默卩-淀粉狀蛋白神經(jīng)毒性"("ModulationofAlzheimer's卩-amyloidneurotoxicitybysite-directedsingle-chainantibody")神經(jīng)免疫學(xué)雜志(JNeuroimmunol)，106:23-31(2000a).Frenkel,D.,Katz，O.和Solomon,B."通過EFRH噬菌體的施用使阿爾茨海默卩-淀粉狀蛋白斑免疫"("ImmunizationagainstAlzheimer's卩-amyloidplaquesviaEFRHphageadministration")PNAS97(21):11455-11459(2000b).Frenkel,D.,Kariv,N.和Solomon,B."針對阿爾茨海默病疫苗的自體抗體的產(chǎn)生"("GenerationofautoantibodiestowardsAlzheimer'sdiseasevaccination")疫苗(Vaccine)19,2615-2619(2001).Frenkel和Solomon,PNAS,99:5675-5679(2002)Gajdusek，科學(xué)(Science)197:943-960(1991)GazitE.，"通過利用肽片段和類似物進行的淀粉狀蛋白原纖維形成過程的機制研究對設(shè)計原纖維抑制劑的暗示"("Mechanisticstudiesoftheprocessofamyloidfibrilsformationbytheuseofpeptidefragmentsandanalogues:implicationsforthedesignoffibrillizationinhibitors")9H戈醫(yī)學(xué)和化學(xué)(CurrMedChem,)9(19):1725-35(2002)GodingJW.,"葡萄球菌蛋白質(zhì)A作為免疫試劑的用途"("UseofstaphylococcalproteinAasanimmunologicalreagent")免疫學(xué)方法雜志(JImmunolMethods.)20:241-53(1978)Goldsmith等，"噬菌體fd的吸附蛋白病毒中的分離、分子性質(zhì)和位置"("Adsorptionproteinofbacteriophagefd:Isolation,molecularproperties,andlocationinvirus")，生物化學(xué)(Biochemistry)16:2686-2694(1977)Goate等，自然(Nature)349:704(1991)GoudswaardJ,vanderDonkJA，NoordzijA，vanDamRH，VaermanJP."不同哺乳動物免疫球蛋白的蛋白質(zhì)A的反應(yīng)性"("ProteinAreactivityofvariousmammalianimmunoglobulins")掃描免疫學(xué)雜志(JScanImmunol.)8(1):21-8(1978)GrailleM，SturaEA,CorperAL,SuttonBJ，TaussigMJ，CharbonnierJB，SilvermanGJ."與人IgM抗體的Fab片段復(fù)合的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)用識別B細胞受體和超抗原活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)"("CrystalstructureofaStaphylococcusaureusproteinAdomaincomplexedwiththeFabfragmentofahumanIgMantibody:structuralbasisforrecognitionofB-cellreceptorsandsuperantigenactivity")美國國家禾斗學(xué)院學(xué)報(ProcNatlAcadSciUSA).97(10):5399-404(2000)Gray等"絲狀fd病毒的吸附復(fù)合物"("Adsorptioncomplexoffilamentousfdvirus"),分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)146:621-627(1981)Greenwood等，"絲狀噬菌體上外源肽的多樣展示"("Multipledisplayofforeignpeptidesonafilamentousbacteriophage"),分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)220:821-827(1991)Hardy,TINS,20:154(1997)Hoess等，"識別與碳水化合物-特異性單克隆抗體B3結(jié)合的肽"("Identificationofapeptidewhichbindstothecarbohydrate-specificmonoclonalantibodyB3")，基因(Gene)128:43-49(1993)Holliger等，"來自噬菌體fd的小外殼蛋白g3p的膜滲透結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)提示了絲狀噬菌體的保守感染途徑"("Aconservedinfectionpathwayforfilamentousbacteriophagesissuggestedbythestructureofthemembranepenetrationdomainoftheminorcoatproteing3pfromphagefd")，結(jié)t勾(Structure)5:265-275(1997)Hoogenboom,H.R.,deBruine,A.P.,Hufton，S.E.，Hoet,R.M.Arends，J.W.和Roovers，R.C."抗體噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用"("Antibodyphagedisplaytechnologyanditsapplications")免疫學(xué)技術(shù)(Immunotechnology)4:1-20(1998).Horiuchi和Caughey,"正常朊病毒蛋白通過局部化結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合于癢病形式啟動了它向蛋白酶-抵抗狀態(tài)的轉(zhuǎn)化"("Specificbindingofnormal朊病毒proteintothescrapieformviaalocalizeddomaininitiatesitsconversiontotheprotease-resistantstate"),EMBO雜志(EMBOJ)18:3193-3203(1999)Iannolo等，"改變絲狀噬菌體的衣殼主衣殼蛋白的尺寸限制"("Modifyingfilamentousphagecapsid:limitsinthesizeofthemajorcapsidprotein"),分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，5月12日;248(4):835-44(1995)Kay等，"展示作為具有與選擇的靶標的親和性的新型序列來源的38-氨基酸肽的M13噬菌體文庫"("AnM13phagelibrarydisplaying38-amino-acidpeptidesasasourceofnovelsequenceswithaffinitytoselectedtargets"),基因(Gene)128:59-65(1993)Kay等，"肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示"(PhageDisplayofPeptidesandProteins),實驗室手冊(ALaboratoryManual),學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)(1996)Kanyo等，"抗體結(jié)合定義參與PrPC-->PrPSc構(gòu)象變化的表位的結(jié)構(gòu)"("AntibodybindingdefinesastructureforanepitopethatparticipatesinthePrPC—>PrPScconformationalchange")，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol.)293:855-863(1999)Kim等，"M13互補鏈起點的可行性刪除"("ViabledeletionsoftheM13complementarystrandorigin"),美國國家科學(xué)院學(xué)報(ProcNatlAcadSciUSA)78:6784-6788(1981)Koivunen等，"展示具有不同環(huán)尺寸的環(huán)形肽的噬菌體文庫RGD-指導(dǎo)的整聯(lián)蛋白的配體特異性"("Phagelibrariesdisplayingcyclicpeptideswithdifferentringsizes:ligandspecificitiesoftheRGD-directedintegrins"),生物技術(shù)(Biotechnology)13:265-270(1995)Krebber等，"通過選擇性-感染的噬菌體共選擇同源-抗原對"("Co-selectionofcognate-antigenpairsbyselectively-infectivephages"),FEBS書信(FEBSLett)377:227-231(1995)LiY，CockburnW，WhitelamGC，"雙功能蛋白質(zhì)A::scFv融合的絲狀噬菌體展示"(FilamentousbacteriophagedisplayofabiftinctionalproteinA::scFvfusion)分子生物技術(shù)(MolBiotechnol).1998年6月；9(3):18793.Luzzago等，"由噬菌體展示的肽，a模擬不連續(xù)表位。利用受限制的肽的噬菌體文庫對人H鐵蛋白的表位定位"("Mimickingofdiscontinuousepitopesbyphagedisplayedpeptides,a.EpitopemappingofhumanHferritinusingaphagelibraryofconstrainedpeptides"),基因(Gene)128:51-57(1993)MaggioJE,MantyhPW,"腦淀粉狀蛋白-a物理化學(xué)前景"("Brainamyloid隱aphysicochemicalperspective")腦病理學(xué)(BrainPathol.)6(2):147-62(1996)Marvin等，"天然和突變種類的絲狀噬菌體Ff(fd，fl，M13),fl和Ke的分子模型禾卩結(jié)構(gòu)比較"("MolecularmodelandstructuralcomparisonsofnativeandmutantclassfilamentousbacteriophagesFf(fd,fl,Ml3),flandKe"，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)235:260-286(1994)Mathison等，藥物耙標雜志(J.DrugTarget),5(6):415-441(1998)Matthews等，"底物噬菌體由單價噬菌體展示選擇蛋白酶底物"("Substratephage:selectionofproteasesubstratesbymonovalentphagedisplay")，科學(xué)(Science)，260:1113-1116(1993)McCafferty等，"噬菌體酶噬菌體表面上功能堿性磷酸酶的表達和親合層析"("Phageenzymes:expressionandaffinitychromatographyoffunctionalalkalinephosphataseonthesurfaceofbacteriophage")，蛋白質(zhì)工程(ProteinEng)4:955-961(1992)McCafferty等，"噬菌體抗體展示抗體可變結(jié)構(gòu)域的絲狀噬菌體"("Phageantibodies:filamentousphagedisplayingantibodyvariabledomains")自然(Nature),348(6301):552-4(1990)Medynski,D."噬菌體展示全部裝飾并作好功能準備"("Phagedisplay:alldressedupandreadytorole")生物技術(shù)(BiolTechnol)12，1134-1136(1994).Meola，A.,Delmastro，P.，Monaci,P.等，"從模擬表位衍生疫苗展示在絲狀噬菌體上的人B病毒表面抗原模擬表位的免疫學(xué)性質(zhì)"("Derivationofvaccinesfrommimotopes:ImmunologicalpropertiesofhumanBvirussurfaceantigenmimotopesdisplayedonfilamentousphage")免疫學(xué)雜志(JImmuno)154:3162-3172(1995).MessingJ，"用于克隆的新M13載體"("NewMl3vectorsforcloning")，酶學(xué)方法(MethodsEnzymol)101:20-78(1983)Model等，"絲狀噬菌體"("FilamentousBacteri叩hage"),在噬菌體(TheBacteriophages)，CalendarR(版本)中，Plenum出版社(PlenumPress)，紐約和倫敦，巻2,第375頁(1988)中Mo腦iR等,當前分子治療學(xué)觀點(CurrOpinMolTher.)，3(2)-.159-69(2謝)Moses等，"噬菌體fl基因組的重建基因Vin在基因間空間中的表達"("Restructuringthebacteriophageflgenome:ExpressionofgeneVIIIintheintergenicspace")，病毒學(xué)(Virology)104:267-278(1980)Mullan等，自然遺傳學(xué)(NatureGenet.)1:345(1992)M畫ll等,科學(xué)(Science)254:97(1991)Pan等，"ot-螺旋向P-折疊的轉(zhuǎn)化在癢病朊病毒蛋白形成中起重要作用"("Conversionofalpha-helicesintobeta-sheetsfeaturesintheformationofthescrapieprionproteins")，美國國家科學(xué)院學(xué)報(ProcNatlAcadSciUSA)90:10962-10966(1993)Parmley等，"抗體-可選擇的絲狀fd噬菌體載體靶基因的親合純化"("Antibody-selectablefilamentousfdphagevectors:affinitypurificationoftargetgenes"),基因(Gene)73:305-318(1988)Peretz，"朊病毒蛋白N末端的構(gòu)象轉(zhuǎn)換在癢病同種型形成中起重要作用"("AconformationaltransitionattheNterminusoftheprionproteinfeaturesinformationofthescrapieisoform"),分子生物學(xué)雜;志(JMolBiol)273:614-622(1997)Rasqualini等，"利用噬菌體展示肽文庫的體內(nèi)器官靶向"("Organtargetinginvivousingphagedisplaypeptidelibraries")，自然(Nature)380:364-366(1996)Saggio等，基因(Gene),152:35-39(1995)Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecularcloning:Alaboratorymanual)，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港(ColdSpringHarbor),紐約(1989)SampathA，AbrolS，ChaudharyVK.,"用于指導(dǎo)PCR-擴增的用于絲狀噬菌體表面展示的片段的克隆和不依賴連接的克隆的通用載體"("Versatilevectorsfordirectcloningandligation-independentcloningofPCR-amplifiedfragmentsforsurfacedisplayonfilamentousbacteriophages")基因(Gene).190(1):5畫10(1997)Schmitz等，"如由噬菌體展示評估的磷酸酪氨酸激酶Blk，Lyn，c-Src和Syk的催化特異性"("CatalyticspecificityofphosphotyrosinekinasesBlk,Lyn,c-SrcandSykas.assessedbyphagedisplay"),分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)260:664-677(1996)Scott等，"利用表位文庫搜索肽配體"("Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary")，科學(xué)(Science)249:386-390(1990)Scott,J.K."利用表位文庫發(fā)現(xiàn)肽配體"("Discoveringpeptideligandsusingepitopelibraries")生物化學(xué)科學(xué)趨勢(TrendsInBiochemSci),241-245(1992)Sdvaggin等，"與朊病毒蛋白的殘基106-126同源的蛋白酶-抗性的、淀粉狀蛋白生成和神經(jīng)毒性的肽的分子特征"("Molecularcharacteristicsofaprotease-resistant,amyloidogenicandneurotoxicpeptidehomologoustoresidues106-126oftheprionprotein"),生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(BiochemBiophysResCommun)194:1380-1386(1993)Silen和Agard,"a-細胞溶解蛋白酶的前-區(qū)域不需要物理連接來在體內(nèi)活化蛋白酶結(jié)構(gòu)域"("Thealpha-lyticproteasepro-regiondoesnotrequireaphysicallinkagetoactivatetheproteasedomainInvivo")，自然(Nature)341:462-464(1989)SmithGP"表面展示和肽文庫"("Surfacedisplayandpeptidelibraries"),基因(Gene)128:1-2(1993)SmithDH.等，"在豬的擴散性腦損傷后淀粉狀蛋白和Tau的累積和神經(jīng)細絲內(nèi)含物的形成"("AccumulationofAmyloidandTauandtheFormationofNeurofilamentInclusionsFollowingDiffliseBrainInjuryinthePig")神經(jīng)病理學(xué)和實驗神經(jīng)學(xué)雜志(J.Neuropathol.Exp.Neurol.),58(9):982-992(1999)Sparks等，"來自噬菌體展示的隨機肽文庫的SrcSH3配體的識別和表征"("IdentificationandcharacterizationofSrcSH3ligandsfromphage-displayedrandompeptidelibraries")，生物化學(xué)雜志(JBiolChem)269:23853-23856(1994)StrachanM.W.J.，"人中的胰島素和認知功能實驗數(shù)據(jù)和治療考慮因素"("Insulinandcognitivefunctioninhumans:experimentaldataandtherapeuticconsiderations")生物寸七學(xué)學(xué)會會報(BiochemicalSocietyTransactions).33:1037-1040(2005)Sugimoto等，"關(guān)于噬菌體fdDNA的研究。IV.關(guān)于主外殼蛋白基因的信使RNA的序歹ij"("StudiesonbacteriophagefdDNA.IV.Thes叫uenceofmessengerRNAforthemajorcoatproteingene")，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)111:487-507(1977)Tagliavini等，"與朊病毒蛋白殘基106-147同源的合成肽離體形成淀粉狀蛋白樣原纖維"("Syntheticpeptideshomologoustoprionproteinresidues106-147formamyloid-likefibirlsinvitro")，美國國家科學(xué)院學(xué)報(ProcNatlAcadSciUSA)90:9678-9682(1993)Uppala禾口Koivunen,化學(xué)高通量篩選(Chem.HighThroughputScreen),3:373-392(2000)VanWezenbeek等，"絲狀噬菌體M13DNA基因組的核苷酸序列與噬菌體fd的比較"("NucleotidesequenceofthefilamentousbacteriophageMl3DNAgenome:comparisonwithphagefd"),基因(Gene)11:129-148(1980)Wilesmith禾QWells，當前微生物學(xué)和免疫學(xué)主題(CurrTopMicrobiolImmunol)172:21-38(1991)Willis等，"絲狀噬菌體上多重展示中的外源肽的免疫學(xué)性質(zhì)"("Immunologicalpropertiesofforeignpeptidesinmultipledisplayonafilamentousbacteriophage"),基因(Gene)128:79-83(1993)Winter,G.,Griffiths,A.D.,Hawkins,R.E.禾QHoogenboom,H.R."通過噬菌體展示技術(shù)制造抗體"("Makingantibodybyphagedisplaytechnology")免疫學(xué)年度綜述(AnnuRevImmunol)12:433-455(1994).Wrighton等，"作為蛋白質(zhì)激素促紅細胞生成素有效模擬物的小肽"("Smallpeptidesaspotentmimeticsoftheproteinhormoneerythropoietin"),科學(xué)(Science)273:458-463(1996)Zacher等，"新絲狀噬菌體克隆載體fd-tet"("Anewfilamentousphagecloningvector:fd-tet"),基因(Gene)9:127-140(1980)權(quán)利要求1.噬菌體展示載體，其包括下列各項絲狀噬菌體，和通過其Fc部分與蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物，其中在所述絲狀噬菌體表面上展示了作為非-天然絲狀噬菌體分子的所述蛋白質(zhì)A或其能夠與抗體Fc部分結(jié)合的片段或變體，所述噬菌體展示載體符合下列條件所述絲狀噬菌體還不(notalso)通過連接體與藥物綴合或直接與藥物綴合，且所述抗體或免疫復(fù)合物也不(notalso)固定在固體載體上。2.權(quán)利要求1的噬菌體展示載體，其中所述絲狀噬菌體選自由M13、fl和fd噬菌體，及其任意混合物組成的組。3.權(quán)利要求1的噬菌體展示載體，其中所述絲狀噬菌體是M13。4.權(quán)利要求1的噬菌體展示載體，其中所述抗體屬于IgG種類。5.權(quán)利要求1的噬菌體展示載體，其中與所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體是單克隆抗體。6.權(quán)利要求5的噬菌體展示載體，其中所述單克隆抗體是針對淀粉狀|3肽A(31-42或A|31-40產(chǎn)生的或?qū)Φ矸蹱頟肽A(31-42或A|31-40特異的單克隆抗體。7.權(quán)利要求5的噬菌體展示載體，其中所述單克隆抗體對與腦疾病、病癥或疾病狀況相關(guān)的靶分子特異。8.權(quán)利要求7的噬菌體展示載體，其中所述腦疾病、病癥或疾病狀況是斑-形成疾病或病癥。9.權(quán)利要求7的噬菌體展示載體，其中所述單克隆抗體是標記的。10.權(quán)利要求1的噬菌體展示載體，其中與所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的所述免疫復(fù)合物是胰島素和抗-胰島素抗體的免疫復(fù)合物。11.權(quán)利要求1的噬菌體展示載體，其中在所述絲狀噬菌體表面上展示的所述非-天然絲狀噬菌體分子由與抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)A、或其能夠結(jié)合抗體Fc部分的片段或變體組成。12.噬菌體展示載體，其包括下列各項絲狀噬菌體，和通過其Fc部分與所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體，其中在所述絲狀噬菌體表面上展示了作為非-天然絲狀噬菌體分子的蛋白質(zhì)A或其能夠結(jié)合抗體Fc部分的片段或變體，其中所述抗體對不在細胞表面上作為耙標呈遞的分子特異，且符合這樣的條件所述抗體還不固定在固體載體上。13.權(quán)利要求12的噬菌體展示載體，其中所述絲狀噬菌體選自由M13、fl和fd噬菌體，及其任意混合物組成的組。14.權(quán)利要求12的噬菌體展示載體，其中所述絲狀噬菌體是M13。15.權(quán)利要求12的噬菌體展示載體，其中所述抗體屬于IgG種類。16.權(quán)利要求12的噬菌體展示載體，其中與所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體是單克隆抗體。17.權(quán)利要求16的噬菌體展示載體，其中所述單克隆抗體是針對淀粉狀(3B太A(31-42或A卩1-40產(chǎn)生的或?qū)Φ矸蹱頟肽A(31-42或A卩1-40特異的單克隆抗體。18.權(quán)利要求16的噬菌體展示載體，其中所述單克隆抗體對與腦疾病、病癥或疾病狀況相關(guān)的靶分子特異。19.權(quán)利要求18的噬菌體展示載體，其中所述腦疾病、病癥或疾病狀況是斑-形成疾病或病癥。20.藥物組合物，其包括權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的噬菌體展示載體和藥用載體、賦形劑、稀釋劑或助劑。21.用于治療或抑制腦疾病、病癥或疾病狀況的方法，其包括向需要其的受試者鼻內(nèi)施用有效量的權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的噬菌體展示載體，從而抑制或治療所述腦疾病、病癥或疾病狀況。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述腦疾病、病癥或疾病狀況是斑-形成疾病或病癥。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述斑-形成疾病或病癥是阿爾茨海默病。24.權(quán)利要求23的方法，其中與在所述噬菌體展示載體上展示的所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體是對淀粉狀卩肽特異的抗體。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體對淀粉狀P肽1-42或1-40特異。26.權(quán)利要求22的方法，其中所述斑-形成疾病或病癥是朊病毒疾病。27.權(quán)利要求21的方法，其中所述腦疾病、病癥或疾病狀況是腦腫瘤。28.權(quán)利要求21的方法，其中所述腦疾病、病癥或疾病狀況是腦炎癥(braininflammatory)疾病、病癥或疾病狀況。29.權(quán)利要求21的方法，其中所述受試者是哺乳動物。30.權(quán)利要求21的方法，其中所述受試者是人。31.權(quán)利要求21的方法，其中與所述蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的所述免疫復(fù)合物是胰島素和抗-胰島素抗體的免疫復(fù)合物。32.用于診斷腦疾病、病癥或疾病狀況的方法，其包括向需要其的受試者鼻內(nèi)施用權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的噬菌體展示載體；和檢測所述噬菌體展示載體，從而診斷腦疾病、病癥或疾病狀況的存在，所述噬菌體展示載體的抗體成分與腦疾病、病癥或疾病狀況相關(guān)的靶分子^口口o33.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體是可檢測地標記的。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體是用放射性核素可檢測地標記的。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體是用造影劑可檢測地標記的。全文摘要本發(fā)明涉及噬菌體展示載體，其由下列各項組成絲狀噬菌體和通過其Fc部分與蛋白質(zhì)A或其片段或變體結(jié)合的抗體或抗原-抗體免疫復(fù)合物，其中在所述絲狀噬菌體表面上展示了作為非-絲狀噬菌體分子的蛋白質(zhì)A或其能夠結(jié)合抗體Fc部分的片段或變體。將所述噬菌體展示載體配制到藥物組合物中，且能夠用于治療/抑制或診斷腦疾病、病癥或疾病狀況。文檔編號C12N15/10GK101410134SQ200780010364公開日2009年4月15日申請日期2007年2月15日優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日發(fā)明者貝卡·所羅門,雷切爾·科恩柯畢克申請人:臺拉維夫大學(xué)拉莫特