專利名稱：表征生物活性化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及表征生物活性化合物的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及在 可旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器中可控地?cái)U(kuò)增三維培養(yǎng)物以表征生物活性化合物的方法。
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2006年2月2日提交的題為"用于測(cè)試藥物功效的方法 (Process for Testing Drug Efficacy)"的美國系列號(hào)60A764524的優(yōu)先斗又。
背景技術(shù)：
大多數(shù)生物活性化合物目標(biāo)是組織特異性功能，這些功能基于從分子到 大規(guī)模組織結(jié)構(gòu)的所有水平的生物過程中所存在的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)過程。測(cè) 試這些生物活性化合物的功效和確定作用的機(jī)理需要高保真度(high fidelity) 的細(xì)胞和組織，并且通常在常規(guī)體外培養(yǎng)(用于總效應(yīng)(gross effect))、動(dòng)物、 以及最后在人體臨床試驗(yàn)中進(jìn)行。然而，這些方法中的每一個(gè)都具有由于低 保真度和/或倫理學(xué)引入的限制。此外，研究具體的詳細(xì)機(jī)理或生物活性化合
物作用的物理位點(diǎn)的能力受到這些常規(guī)測(cè)試方法的限制。相似的情況對(duì)于理 解毒性化學(xué)品的毒性機(jī)理和程度或?qū)τ诶斫饣虮碚髟噭?反應(yīng)物)的生物學(xué)活 性來說是成立的。在使用動(dòng)物體進(jìn)行測(cè)試的情況中，生物學(xué)的環(huán)境太復(fù)雜， 不可控制，富含混雜因子，常常不良地代表人體狀況，并且受到倫理的限制。 常規(guī)培養(yǎng)，如二維培養(yǎng)，或需要攪動(dòng)、攪拌、以及混合培養(yǎng)物的其它方式的 那些培養(yǎng)不能夠再現(xiàn)如細(xì)胞在體內(nèi)組織微環(huán)境中相互作用那樣與細(xì)胞進(jìn)行生 物學(xué)活性相互作用。在常規(guī)非旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)中利用固定基質(zhì)，即缺乏自由懸浮的
及進(jìn)行這些研究的實(shí)用性方面引入限制。人體測(cè)試會(huì)引入明顯的嚴(yán)重倫理限 制，連同動(dòng)物測(cè)試中固有的許多倫理限制。
基本功能細(xì)月包(primary functional cell)相互間、與支持纟田月包(support cell)、 以及與機(jī)械支持基質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)系，允許準(zhǔn)確的和天然的細(xì)胞和組織特異性的4亍為(accurate and natural cell and tissue specific behavior)。 特'I"生濁口連才妻復(fù)合物 (junctional complexes)、 Ir泉體形成(gland formation)、纟田月包才及性和支持纟田月包的總 體的正確幾何關(guān)系，以及非細(xì)胞成分介導(dǎo)這些細(xì)胞和組織特異性的行為。而 且，個(gè)體細(xì)胞和組織以依賴于這些及其它特性的方式來發(fā)揮功能。其它的特 性也有助于細(xì)胞間和細(xì)胞中的關(guān)系和專交大的組織結(jié)構(gòu)中細(xì)胞間的三維相互作 用，其包括粘蛋白(mucin)、分泌的激素(來自胰Beta細(xì)胞的胰島素)、細(xì)胞間 可溶的信號(hào)、細(xì)胞膜表面標(biāo)記、膜結(jié)合酶、免疫特征標(biāo)記、附著分子(adherence molecules)、液泡(vacuoles)、儲(chǔ)存的和釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，以及細(xì)胞內(nèi)部特殊機(jī) 構(gòu)(cellular internal specialized machinery)如月幾肉的情況中的月幾球蛋白收縮纖 維，肝細(xì)胞的情況中的糖原和綴合的毒素清除處理。個(gè)體細(xì)胞功能和細(xì)胞與 細(xì)胞相互作用依賴于這些及其它特性。
生物活性化合物的功效和毒性是通過確定生物活性化合物對(duì)細(xì)胞、組織、 和/或這些特性的影響來測(cè)試和測(cè)量的。這些可測(cè)反應(yīng)包括遺傳表達(dá)、核型 (karyotype)、生長率特征、多細(xì)胞和個(gè)體細(xì)胞形態(tài)學(xué)、代謝計(jì)量(metabolic measure)、以及細(xì)胞間關(guān)系。這些及其它反應(yīng)是熟知的，但是困難在于傳統(tǒng)的 培養(yǎng)方法不能夠培養(yǎng)足量的細(xì)胞和組織，使得細(xì)胞和細(xì)胞相互作用基本上模
體內(nèi)細(xì)胞反應(yīng)的準(zhǔn)確反映。因此，不支持細(xì)胞和組織隨延長的時(shí)間大量加速
生長的傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)，不能夠提供準(zhǔn)確的體外模型用于通過測(cè)試它們的影響
來表征生物活性化合物。
在單種培養(yǎng)和共培養(yǎng)中許多哺乳動(dòng)物正常的和腫瘤哺乳動(dòng)物組織的生長
已經(jīng)在分批補(bǔ)料的(batch-fed)和灌流的旋轉(zhuǎn)壁容器中建立起來，Schwarz等， 美國專利No. 4,988,623, (1991)和Schwarz等，美國專利No. 5，026，5卯，(1991), 并在基于常規(guī)平板或搖瓶的培養(yǎng)系統(tǒng)中建立起來。在某些應(yīng)用中，三維結(jié)構(gòu) (例如，組織)在這些培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長已通過固態(tài)基質(zhì)的支持物來促進(jìn)，所述 固態(tài)基質(zhì)的形式為生物相容的聚合體和微載體。在球狀生長(spheroidal growth) 的情況中，獲得三維結(jié)構(gòu)而無基質(zhì)支持物，Goodwin等，In Vitro Cell Dev. Biol., 28A: 47-60(1992), Goodwin等，Proc. Soc. Exp. Biol. Med.， 202:181-192 (1993), Goodwin等，J. Cell Biochem., 51:301-311 (1993), Goodwin等，In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.， 33:366-374 (1997)。然而，在常規(guī)培養(yǎng)條件下,在受控生長誘導(dǎo) 和三維機(jī)體形成(organization)方面，人組織是非常難控制的(refractory)。實(shí)際的微重力，以及在較小程度上，旋轉(zhuǎn)刺激的微重力，允許增強(qiáng)的細(xì)胞生長。
也已進(jìn)行了在培養(yǎng)物中使用靜止電場(chǎng)以增強(qiáng)神經(jīng)生長的嘗試。成功地改 變了胚胎發(fā)育并且成功地實(shí)現(xiàn)了分離的神經(jīng)軸突定向生長。然而，還沒有實(shí)
現(xiàn)導(dǎo)致這些的生長或遺傳活性的加強(qiáng)作用(potentiation)的實(shí)際加速。旨在幫助 培養(yǎng)和定向三維哺乳動(dòng)物神經(jīng)組織的機(jī)械裝置目前可獲得。Fukuda等，美國 專利No. 5,328,843使用在不銹鋼刮削刀片(shaving blade)之間形成的區(qū)來定向 神經(jīng)細(xì)胞或軸突。此外，利用具有(chargedwith)電位的電極來增強(qiáng)軸突反應(yīng)。 Aebischer，美國專利No. 5,030,225描述了 一種充電的可植入管狀膜，用于在 人體內(nèi)再生已分離的(severed)神經(jīng)。Wolf等，美國專利No. 6,485,963利用電 磁力增加細(xì)胞的生長，但是在大多數(shù)情況下細(xì)胞生長或擴(kuò)增發(fā)生得不足夠快 速以用于患者的所需的測(cè)試或治療。
因此，仍然需要從實(shí)質(zhì)上模擬體內(nèi)微環(huán)境的體外培養(yǎng)系統(tǒng)以測(cè)試生物活 性化合物對(duì)細(xì)胞和組織的影響，從而提供高度代表體內(nèi)情況的反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及表征生物活性化合物的方法，其包括將細(xì)胞混合物放入可旋 轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以開始三維培養(yǎng)，其中所述三維培養(yǎng)物包含細(xì)胞和生物成分 (biological component),在三維培養(yǎng)中可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞，同時(shí)通過旋轉(zhuǎn)可旋轉(zhuǎn) 的生物反應(yīng)器來維持細(xì)胞三維幾何形狀和細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持及幾何形狀，將 生物活性化合物引入三維培養(yǎng)中，并且利用測(cè)試來測(cè)試生物成分以表征所述 生物活性化合物。


圖1是可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方案的仰視側(cè)視圖(elevated side view);
圖2是可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)部透視圖3示意性地說明可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)載體流動(dòng)回路(culture carrier flow loop)的優(yōu)選實(shí)施方案；
圖4是非旋轉(zhuǎn)參照幀(non-rotating reference frame)中代表性細(xì)月包的軌跡 (orbital path);
圖5是細(xì)胞每轉(zhuǎn)的偏離幅度(magnitude of deviation)的圖；和
圖6是如在培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)參照幀中觀察的代表性的細(xì)胞軌道(cellpath)。發(fā)明詳述
在最簡(jiǎn)單的情況(term)中，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器包含培養(yǎng)室(culture chamber),其在操作中可以圍繞基本上水平的軸旋轉(zhuǎn)，并且具有內(nèi)部部分和 外部部分。培養(yǎng)室的內(nèi)部部分限定了可能可移除地容納(removably receive)生 物成分混合物的空間。優(yōu)選地，培養(yǎng)室基本上是柱狀的。在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng) 器的優(yōu)選實(shí)施方案中，電傳導(dǎo)線圈回繞在培養(yǎng)室的外部部分，所述外部部分 優(yōu)選地附接于(affixto)培養(yǎng)室，更優(yōu)選地可移除地附接于培養(yǎng)室。TVEMF源 操作地連接于電傳導(dǎo)線圈以使得，在使用中，該TVEMF源將TVEMF傳送 到培養(yǎng)室的內(nèi)部部分并傳送到生物成分混合物以擴(kuò)增其中的生物成分。培養(yǎng) 室具有至少一個(gè)孔(aperture)以使得，在使用時(shí)，可以將生物成分混合物放入 培養(yǎng)室的內(nèi)部部分。該孔也可以優(yōu)選地用于培養(yǎng)基和/或生物活性化合物的交 換，和移除用于測(cè)試的生物成分的樣品，而且優(yōu)選地該孔適于與注射器一起 使用。
在附圖中，圖1是可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器IO優(yōu)選實(shí)施方案的橫截面仰視側(cè)視 圖(elevated side view)。在該優(yōu)選實(shí)施方案中通過基座14支持電動(dòng)機(jī)罩(motor housing) 12。電動(dòng)機(jī)16附接于電動(dòng)機(jī)罩2內(nèi)部并通過第一電線18和第二電 線20連接于其中設(shè)有控制器的控制箱22,由此可以通過旋轉(zhuǎn)控制按鈕24來 增量控制(incrementally control)電動(dòng)機(jī)16的速度。從電動(dòng)機(jī)罩12延伸出的是 電動(dòng)機(jī)軸26?？尚D(zhuǎn)的裝置(mounting) 28可移除地容納可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器支 架(holder) 30,所述支架可移除地容納培養(yǎng)室32,其優(yōu)選為一次性的(disposable) 并且還優(yōu)選基本上柱狀的，其是附接的，優(yōu)選可移除地附接，在可旋轉(zhuǎn)生物 反應(yīng)器支架30內(nèi)，優(yōu)選通過螺旋(screw) 34。培養(yǎng)室32安裝(mounted)，優(yōu)選 可移除地安裝于可旋轉(zhuǎn)的裝置28?？尚D(zhuǎn)的裝置28被電動(dòng)機(jī)軸26容納 (received by the motor shaft 26)。在使用中，當(dāng)開啟控制按鈕24時(shí)，培養(yǎng)室32 旋轉(zhuǎn)。術(shù)語"旋轉(zhuǎn)的，，和類似術(shù)語意指在使用中，培養(yǎng)室的旋轉(zhuǎn)阻止了細(xì)胞、 組織或細(xì)胞團(tuán)(cell mass)與可旋轉(zhuǎn)TVEMF生物反應(yīng)器的內(nèi)部部分的碰撞。培 養(yǎng)室也可以優(yōu)選為灌流的(perftised)。
本發(fā)明的可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器10的培養(yǎng)室可以優(yōu)選為一次性的，意思是 它可以被棄去而在后續(xù)培養(yǎng)中根據(jù)需要使用新的培養(yǎng)室?？尚D(zhuǎn)生物反應(yīng)器 IO也可以優(yōu)選為滅菌的，例如，在每次使用和再使用后為后續(xù)培養(yǎng)而在高壓滅菌器中滅菌。 一次性培養(yǎng)室32能夠在無菌環(huán)境下生產(chǎn)和包裝，由此^[吏其能 夠幾乎和使用其它 一 次性醫(yī)療設(shè)備一樣被醫(yī)療或研究專業(yè)人員使用。
圖2是可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器10的側(cè)部透視圖。圖2圖示了保留控制按鈕 54并由基座44支持的電動(dòng)機(jī)罩42。從電動(dòng)機(jī)罩42延伸的是電動(dòng)機(jī)軸56。 可旋轉(zhuǎn)的裝置58可移除地容納可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器支架60,所述支架可移除 地容納培養(yǎng)室。電傳導(dǎo)線圈59回繞在培養(yǎng)室的外部部分。電傳導(dǎo)線圈59可 以優(yōu)選地由任何導(dǎo)電的電傳導(dǎo)材料制成，其包括但不限于下列傳導(dǎo)性材料； 銀、金、銅、鋁、鐵、鉛、鈦、鈾、磁鐵性金屬、和鋅、或它們的組合。電 傳導(dǎo)線圏59也可以優(yōu)選地包含鹽水(saltwater)。電傳導(dǎo)線圏59也可以優(yōu)選為 螺線管。此外，電傳導(dǎo)線圈59可以優(yōu)選地被包含在電絕緣體中，所述電絕緣 體包括，但不限于橡膠、塑料、硅樹脂(silicone)、玻璃和陶瓷。電傳導(dǎo)線圈 59可以回繞在培養(yǎng)室的外部部分，并由此培養(yǎng)室支持了電傳導(dǎo)線圈59的形 狀，其優(yōu)選地具有基本上卵形的(oval)橫截面，更優(yōu)選基本上橢圓形的橫截面， 和最優(yōu)選基本上圓形的橫截面。將與優(yōu)選為一次性的培養(yǎng)室整合的電傳導(dǎo)線 圏59連同一次性培養(yǎng)室安裝入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器10,并且操作地連接到 TVEMF源64。當(dāng)棄去一次性培養(yǎng)室時(shí)，將電傳導(dǎo)線圏59與其一起棄去。
在一端(at a first end)將第一傳導(dǎo)電線62和第二傳導(dǎo)電線66 (二者都與電 傳導(dǎo)線圈59整合)操作地連接于具有源旋鈕65的TVEMF源64,在使用中， 可開啟源旋鈕65以產(chǎn)生TVEMF。在另 一端(at a second end)將電線62、 66連 接于至少一個(gè)環(huán)以促進(jìn)電傳導(dǎo)線圈59的旋轉(zhuǎn)。當(dāng)開啟控制按鈕54時(shí)，培養(yǎng) 室和電傳導(dǎo)線圈59同時(shí)旋轉(zhuǎn)。此外，電傳導(dǎo)線圈59仍然附接于，并圍繞著 培養(yǎng)室，以使得在使用中，其將TVEMF供給培養(yǎng)室中的細(xì)胞。
可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室可以優(yōu)選地備有培養(yǎng)基流動(dòng)回路100用于支 持呼吸氣體交換進(jìn)來，營養(yǎng)物供應(yīng)進(jìn)來，和從三維培養(yǎng)物除去代謝廢物。在 圖3中說明了培養(yǎng)基流動(dòng)回路100的優(yōu)選實(shí)施方案，其具有培養(yǎng)室119，充 氧器(oxygenator)121,促進(jìn)培養(yǎng)基定向流動(dòng)的裝置，優(yōu)選通過使用主泵115, 以及用于選擇性輸入培養(yǎng)基所需物的供應(yīng)多支管117，所述培養(yǎng)基所需物例 如但不限于營養(yǎng)物106、緩沖劑105、新鮮培養(yǎng)基107、細(xì)胞因子109、生長 因子111及激素113。在此優(yōu)選實(shí)施方案中，主泵115從供應(yīng)多支管117提供 新鮮培養(yǎng)基到充氧器121中，其中將培養(yǎng)基充氧并經(jīng)過培養(yǎng)室119。優(yōu)選地 通過主泵115從培養(yǎng)室119中將用過的培養(yǎng)基中的廢物移除，并將其運(yùn)送至廢物區(qū)(waste) 118中，未移除至廢物區(qū)118的培養(yǎng)基的剩余體積返回供應(yīng)多 支管117，其中可以優(yōu)選地接收培養(yǎng)基所需物的新鮮進(jìn)料，然后通過泵115， 經(jīng)由充氧器121到培養(yǎng)室119再循環(huán)。
在此培養(yǎng)基流動(dòng)回路100的優(yōu)選實(shí)施方案中，響應(yīng)化學(xué)傳感器(未顯示) 進(jìn)行調(diào)節(jié)以維持培養(yǎng)室119內(nèi)部的恒定條件?？刂贫趸?jí)毫Σ⒁胨釅A 來校正pH。將氧氣、氮?dú)夂投趸既苡跉怏w交換系統(tǒng)(未顯示)以支持細(xì)胞 呼吸。培養(yǎng)基流動(dòng)回路100從循環(huán)氣體容量(circulating gas capacitance)中添加 氧氣去除二氧化碳。盡管圖3是可用于本發(fā)明的培養(yǎng)基流動(dòng)回路的一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方案，但本發(fā)明并不意欲受到如此局限。將培養(yǎng)基所需物如，但不限于 氧氣、營養(yǎng)物、緩沖劑、新鮮培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、生長因子和激素輸入可旋 轉(zhuǎn)的TVEMF生物反應(yīng)器也可以手動(dòng)、自動(dòng)或通過其它控制手段(如可為廢物 和二氧化碳的控制及去除)來進(jìn)行。
由于在可旋轉(zhuǎn)的TVEMF生物反應(yīng)器中可以進(jìn)行各種變化，如本發(fā)明中 所包括的(contemplated),而不背離本發(fā)明的范圍，因此意欲將本文包含的所 有情形均理解為說明性的，而不是限制性的。
發(fā)明詳述
以下定義意欲有助于描述和理解本發(fā)明的上下文中定義的術(shù)語。這些定 義不是意欲將這些術(shù)語限制于小于本申請(qǐng)中所描述的。此外，包括與TVEMF 相關(guān)的幾個(gè)定義，在這點(diǎn)上所有定義應(yīng)視為互為補(bǔ)充，而不理解為互相沖突。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"TVEMF"指"時(shí)間變化電^茲力(time varying electromagnetic force)"。如上面所討論的，本發(fā)明的TVEMF在S波中，更優(yōu) 選為差示方波(differential square wave),并且最l尤選為方波(2艮隨Fourier曲 線)。TVEMF優(yōu)選地選自下列之一:(1)力幅度(force amplitude)小于100高斯 并且轉(zhuǎn)換速率(slewrate)大于每秒1000高斯的TVEMF。(2)具有頻率小于100 Hz的相當(dāng)?shù)偷牧Ψ葍蓸O方波的TVEMF。 (3)具有相當(dāng)?shù)偷牧Ψ确讲?小于100。/。工作循環(huán)(duty cycle)的TVEMF。 (4)轉(zhuǎn)換速率大于每秒1000高斯 持續(xù)脈沖小于l ms的TVEMF。(5)具有轉(zhuǎn)換速率兩極S函數(shù)樣脈沖及工作循 環(huán)小于1%的TVEMF。 (6)具有力幅度小于100高斯峰對(duì)峰(peak-to-peak)和 轉(zhuǎn)換速率兩極S函數(shù)樣脈沖且其中工作循環(huán)小于1%的TVEMF。 (7)利用螺 線管線圈以在三維培養(yǎng)中產(chǎn)生均一力強(qiáng)度而施加的TVEMF。 (8)以及利用通量集中器(flux concentrator)來提供三維培養(yǎng)中聚焦的f茲通量及石茲通量空間梯 度而施加的TVEMF。震蕩電磁力強(qiáng)度的頻率范圍是可以選擇的參數(shù)，用于在 三維培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的期望刺激。然而，這些參數(shù)并不意味對(duì)本發(fā)明的 TVEMF進(jìn)行限制，因?yàn)榛诒景l(fā)明的其它方面這些參數(shù)可以變化?？蓽y(cè)量 TVEMF,例如通過標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備如EN131細(xì)胞傳感器高斯計(jì)來測(cè)量TVEMF。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"電傳導(dǎo)線圈，，指任何導(dǎo)電的電傳導(dǎo)材料， 其包括，但不限于下列傳導(dǎo)性材料；銀、金、銅、鉆、鐵、鉛、鈦、鈾、鐵 磁金屬、和鋅，或它們的組合。電傳導(dǎo)線圈也可以優(yōu)選包含鹽水。電傳導(dǎo)線 圏也可以優(yōu)選為螺線管。此外，電傳導(dǎo)線圏可以優(yōu)選地包含在電絕緣體中， 所述電絕緣體包括但不限于橡膠、塑料、硅樹脂、玻璃和陶瓷。電傳導(dǎo)線圈 可以回繞在可旋轉(zhuǎn)的TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室的外部部分，因此，優(yōu)選 地該培養(yǎng)室支持了電傳導(dǎo)線圈的形狀，其優(yōu)選具有基本上卵形的橫截面，更 優(yōu)選基本上橢圓形的橫截面，最優(yōu)選基本上圓形的橫截面。培養(yǎng)室支持了電 傳導(dǎo)線圈的形狀，優(yōu)選地因?yàn)榕囵B(yǎng)室的形狀和電傳導(dǎo)線圈的形狀基本上相似。 "回繞的(wrapped around)"是指電傳導(dǎo)線圈環(huán)繞培養(yǎng)室使得優(yōu)選地，在操作 中，將基本上均一的TVEMF傳送至培養(yǎng)室的內(nèi)部部分和其中的細(xì)胞。"環(huán)繞 (encompass)"是指電傳導(dǎo)線圈圍繞(surround)培養(yǎng)室，并且在使用中，將優(yōu)選 基本上均一的TVEMF傳送到培養(yǎng)室的內(nèi)部部分。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"生物成分"指在本發(fā)明方法的可控?cái)U(kuò)增 步驟的過程中可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的三維培養(yǎng)物的部分。可以在培養(yǎng)過程中 或者通過其它手段在培養(yǎng)完成后，或?qū)τ谔厥獾姆治黾夹g(shù)(如電鏡技術(shù))甚至在 殺死培養(yǎng)物后來優(yōu)選地測(cè)試生物成分。測(cè)試生物成分以表征生物活性化合物。 生物成分可以優(yōu)選為任何形態(tài)的細(xì)胞，例如激活的T-細(xì)胞，以及細(xì)胞的任何 部分包括膜，細(xì)胞壁(在植物的情況中)，和/或包括線粒體的內(nèi)部細(xì)胞器。待 測(cè)試的生物成分也可以優(yōu)選地包括分泌的物質(zhì)，例如粘蛋白、膠原和基質(zhì)、 分泌的激素(來自胰Beta細(xì)胞的胰島素)、分泌的細(xì)胞間結(jié)構(gòu)成分、引入的結(jié) 構(gòu)基質(zhì)、附著基質(zhì)、生長基質(zhì)、細(xì)胞間可溶信號(hào)、細(xì)胞膜表面標(biāo)記、膜結(jié)合 酶、免疫特征標(biāo)記、附著分子、液泡、儲(chǔ)存的和釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，以及細(xì)胞 內(nèi)部特殊機(jī)構(gòu)如肌肉的情況中的肌球蛋白收縮纖維、糖原、培養(yǎng)基、受測(cè)試 的化合物、受測(cè)試的可疑毒素、受測(cè)試的試劑、真菌以及在肝細(xì)胞的情況中 的綴合的復(fù)合物。生物成分也可以優(yōu)選為在擴(kuò)增期間在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的三維培養(yǎng)物所包含的病毒。這些病毒可以包括，但不限于HIV、 BirdFlu、 SIV、肝炎病毒(Hepatitis)、 HPV、皰疹病毒，其可以包含病毒DNA，或在逆 轉(zhuǎn)錄病毒的情況中為病毒RNA及顆粒。生物成分也可以優(yōu)選為細(xì)菌細(xì)胞。生 物成分也可以優(yōu)選為任何其它核酸酶、DNA、 RNA、蛋白、人工生物活性顆 粒如毫微粒(nanoparticle)和/或基因，但不限于此。生物成分可以優(yōu)選地包含 在細(xì)胞混合物中，或添加到三維培養(yǎng)物，或在添加細(xì)胞混合物前》文入可旋轉(zhuǎn) 生物反應(yīng)器中。生物成分是測(cè)試的焦點(diǎn)以表征生物活性化合物。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"生物活性化合物"指任何生物學(xué)物質(zhì)， 合成的或非合成的，其由本發(fā)明的方法表征。生物活性化合物可以優(yōu)選為任 何形式，其包括但不限于粉末、液體、蒸汽和氣體。生物活性化合物也能優(yōu) 選為但不限于蛋白、細(xì)胞、化學(xué)品、氣體、金屬、生長因子、輻射、毫微粒、 病毒、細(xì)菌和/或水、和/或它們的任意組合。生物活性化合物也可以優(yōu)選為對(duì) 三維培養(yǎng)物的任意部分有毒的任何材料，其包含細(xì)胞和生物成分。如在本申 請(qǐng)中使用的，術(shù)語毒素指任何材料或物理過程，其疑似或已知負(fù)面地影響細(xì) 胞或組織功能或使其偏離正常功能。毒素可以優(yōu)選為重金屬，也可以優(yōu)選為 熱、輻射、或甚至于電暴露(electrical exposure)。此外，生物活性化合物業(yè)可 以優(yōu)選為對(duì)包含細(xì)胞和生物成分的三維培養(yǎng)物具有影響的試劑。在本申請(qǐng)中 所使用的，術(shù)語"試劑，，指任何材料或物理過程，其用于導(dǎo)致以下方面的變 化細(xì)胞或組織功能、體系結(jié)構(gòu)(architecture)、結(jié)構(gòu)(structure)、生長、壽命、 遺傳組成(genetic composition)、生長特征、分泌的物質(zhì)、分化狀態(tài)、分化譜 系素因(differentiation lineage predisposition)、或表面標(biāo)i己表達(dá)、^i射狀態(tài)、內(nèi) 部細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，膜結(jié)構(gòu)、或致腫瘤性。除優(yōu)選的生物活性化合物(如運(yùn)輸?shù)郊?xì) 胞并導(dǎo)致葡萄糖內(nèi)部運(yùn)輸?shù)囊葝u素)之外，生物活性化合物可以優(yōu)選地指試劑 步驟(reagent step)如電穿孔、化學(xué)致孔(chemopomtion)、及毫微粒相互作用。 穿孔(poration)方法對(duì)于制備用于單克隆抗體生產(chǎn)的雜交瘤特別有用。不受理 論的限制，但是通過旋轉(zhuǎn)壁培養(yǎng)(rotating wall culture)得到的良好分布的三維 培養(yǎng)內(nèi)容物對(duì)于使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間在雜合體形成中的遺傳交換最大
化是理想的。這可以改進(jìn)產(chǎn)生期望抗體的理想雜合體的成功產(chǎn)率。生物活性 化合物的一些額外的優(yōu)選實(shí)例包括，但不僅限于胰島素、白介素、生長因子、 分化調(diào)節(jié)物、趨化劑、抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，可以通過測(cè)試生物活性化合物 對(duì)生物成分的影響來對(duì)其進(jìn)行表征。如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"細(xì)胞，，指任何形式的細(xì)胞，例如，個(gè)體
細(xì)胞、組織、細(xì)胞聚集物、雜合細(xì)胞、預(yù)附接于細(xì)胞附屬物基質(zhì)(cell attachment substrate)的細(xì)胞，所述細(xì)胞附屬物基質(zhì)例如微載體珠連接、組織樣結(jié)構(gòu)、或 完整的組織切除(intact tissue resection)。本發(fā)明的細(xì)胞也可以優(yōu)選為真核細(xì) 胞，更優(yōu)選為原核細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人， 更優(yōu)選成人干細(xì)胞，最優(yōu)選為外周血成人干細(xì)胞，甚至更優(yōu)選間充質(zhì)細(xì)胞 (mesenchymal cell)?？捎糜诒景l(fā)明方法的其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選包括，但不 僅限于心、肝、造血的(hematopoietic)、皮膚、肌肉、腸、胰、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 軟骨、結(jié)締組織(connective)肺(pulmonary)、脾、骨和腎。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器"意指包含電動(dòng)機(jī)， 其連接于具有內(nèi)部部分和外部部分的培養(yǎng)室，并且可以以一定速度旋轉(zhuǎn)。優(yōu) 選地，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器是基本上柱狀的?？尚D(zhuǎn)生物反應(yīng)器也可以優(yōu)選地 具有回繞培養(yǎng)室的外部部分的電傳導(dǎo)線圈。此外，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器也可以 具有附接于它的培養(yǎng)基流動(dòng)回路以有助于促進(jìn)培養(yǎng)基流動(dòng)至并經(jīng)過其中的三 維培養(yǎng)物?？梢酝ㄟ^灌注使培養(yǎng)基流經(jīng)培養(yǎng)室。TVEMF源可以優(yōu)選操作地連 接于電傳導(dǎo)線圈。在使用中，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器可以旋轉(zhuǎn)并且，不受理論限 制，該旋轉(zhuǎn)應(yīng)是受控的以促進(jìn)(foster)、支持和維持三維培養(yǎng)，例如在本發(fā)明 的說明書所描述的。在具有電傳導(dǎo)線圏的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以通過TVEMF 源產(chǎn)生TVEMF，以及適當(dāng)?shù)母咚顾?，可以?jīng)由電傳導(dǎo)線圈將其優(yōu)選地運(yùn)送 到培養(yǎng)室的內(nèi)部部分。可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的容積(volume)優(yōu)選為約15 ml到約 2L。可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的實(shí)例(而不意味著限制)參見例如本文圖l和2。
可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室在內(nèi)部部分具有可旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)室壁以使得， 在操作中，室壁設(shè)置為相對(duì)于培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)，并且因此，相對(duì)于三維培養(yǎng)物運(yùn) 動(dòng)，從而培養(yǎng)基中基本上沒有流體應(yīng)力剪切(fluid stress sheer)。培養(yǎng)室也具有 至少一個(gè)孔用于添加和/或去除培養(yǎng)基、細(xì)胞和/或生物成分或其部分，并且也 用于引入生物活性化合物?？尚D(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室為基本上水平布置的。 培養(yǎng)室也優(yōu)選為基本上柱狀的，具有兩個(gè)端部，并且能圍繞基本上水平的軸 旋轉(zhuǎn)。培養(yǎng)室優(yōu)選為部分透明的以使得可根據(jù)需要評(píng)估其中的生物成分、培 養(yǎng)基和/或三維培養(yǎng)物。此外，培養(yǎng)室也可以優(yōu)選地裝有顯微鏡以評(píng)估生物成 分、三維培養(yǎng)物和/或細(xì)胞。不受理論限制，旋轉(zhuǎn)可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞 提供細(xì)胞隨時(shí)間的可控?cái)U(kuò)增，而在同時(shí)，促進(jìn)、支持并維持復(fù)雜的三維幾何形狀，細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持以及細(xì)胞的幾何形狀。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"細(xì)胞混合物，，及類似術(shù)語，指細(xì)胞混合 物，優(yōu)選地連同其它物質(zhì)，其包括，但不限于培養(yǎng)基(具有和不具有添加劑)、 血漿、緩沖劑及防腐劑。細(xì)胞混合物也可以包含生物成分。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"三維培養(yǎng)物"指通過使用本發(fā)明的方法， 在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室中可控地?cái)U(kuò)增的細(xì)胞和生物成分。三維培養(yǎng)物 中的細(xì)胞具有三維幾何形狀、在培養(yǎng)室中促進(jìn)、支持和維持的幾何形狀和細(xì) 胞對(duì)細(xì)胞的支持。三維培養(yǎng)物中的細(xì)胞具有與體內(nèi)細(xì)胞基本上相同的三維幾 何形狀、及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持和幾何形狀。三維組織、非壞死細(xì)胞團(tuán)和/或組
織樣結(jié)構(gòu)也可以從細(xì)胞中產(chǎn)生(develop)并且在三維培養(yǎng)物中維持和進(jìn)一步擴(kuò) 增，并在同時(shí)模擬體內(nèi)的微環(huán)境。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的可以將三維培養(yǎng)擴(kuò)增(數(shù)目 增長)、維持或退化(degenerate)。換句話說，根據(jù)生物活性化合物的影響和/ 或表征生物活性化合物所需的優(yōu)選的微環(huán)境，將使三維培養(yǎng)物可控地?cái)U(kuò)增， 其優(yōu)選地意指將三維培養(yǎng)物或其部分?jǐn)U增、維持或退化。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"操作地連接，，及類似術(shù)語，意欲指可以 將TVEMF源連接于，優(yōu)選地可移除地連接于培養(yǎng)室，其方式為在操作中 TVEMF源將TVEMF賦予可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室的內(nèi)部部分和其中包含 的三維培養(yǎng)物。將TVEMF源操作地連接，如果在使用中，TVEMF源能將 TVEMF (優(yōu)選基本上均一的TVEMF)賦予培養(yǎng)室的內(nèi)部部分。
在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"暴露"及類似術(shù)語，指將TVEMF供給可 旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室的內(nèi)部部分中包含的三維培養(yǎng)物的方法。在操作中， 將TVEMF源開啟并設(shè)置在優(yōu)選的高斯范圍和優(yōu)選的波形，以使得相同的 TVEMF經(jīng)由TVEMF源傳導(dǎo)到電傳導(dǎo)線圈，所述電傳導(dǎo)線圈回繞可旋轉(zhuǎn)生物 反應(yīng)器的培養(yǎng)室的外部部分。然后將TVEMF運(yùn)送到培養(yǎng)室中包含細(xì)胞的三 維培養(yǎng)物，由此將細(xì)胞暴露于TVEMF,優(yōu)選基本上均一的TVEMF。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"培養(yǎng)基"及類似術(shù)語，指液體，其包含 但不限于生長培養(yǎng)基和營養(yǎng)物，其意指細(xì)胞隨時(shí)間的養(yǎng)料(sustenance)。培 養(yǎng)基可以富含如下的任何物質(zhì)，但不限于此生長培養(yǎng)基、緩沖劑、生長因 子、激素及細(xì)胞因子。將培養(yǎng)基供應(yīng)到細(xì)胞混合物中，用于在可旋轉(zhuǎn)生物反 應(yīng)器的培養(yǎng)室中懸浮，并支持?jǐn)U增?？梢詢?yōu)選地在將培養(yǎng)基加入可旋轉(zhuǎn)生物 反應(yīng)器的培養(yǎng)室之前將培養(yǎng)基與細(xì)胞混合物混合，或可以更優(yōu)選地在加入細(xì)胞混合物之前將培養(yǎng)基加入培養(yǎng)室，由此將培養(yǎng)基和細(xì)胞在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng) 器中混合。可以優(yōu)選在擴(kuò)增期間根據(jù)需要將培養(yǎng)基富集和/或更新。在擴(kuò)增期 間根據(jù)需要，可以優(yōu)選地將培養(yǎng)基中所含廢物以及培養(yǎng)基本身從培養(yǎng)室的三 維培養(yǎng)物中去除。培養(yǎng)基中所含廢物可以是，但不限于代謝廢物、死細(xì)胞 及其它有毒的碎片。可以優(yōu)選地使培養(yǎng)基富含氧并且優(yōu)選地具有攜帶氧、二 氧化碳和氮的能力。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"放置，，和類似術(shù)語，指在將細(xì)胞添加至 可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器之前將細(xì)胞混合物和培養(yǎng)基混合的方法。術(shù)語"放置，，也 可以優(yōu)選地指將細(xì)胞混合物添加至已經(jīng)存在于可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的培養(yǎng) 基?？梢詢?yōu)選地將細(xì)胞連同細(xì)胞附著基質(zhì)(如微載體珠)放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 中。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"可控地?cái)U(kuò)增，"及類似術(shù)語，指在可旋轉(zhuǎn) 生物反應(yīng)器中通過旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)室，使細(xì)胞數(shù)增加、維持、或減少的方法。在優(yōu)
選實(shí)施方案中，可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞還包括將三維培養(yǎng)物暴露于TVEMF。優(yōu)選地， 將細(xì)胞擴(kuò)增而無分化。如果細(xì)胞數(shù)的增加是優(yōu)選的，那么每體積細(xì)胞數(shù)的增 加顯然不是由于單純的流體體積減少而造成的，例如，將培養(yǎng)基的體積從70 ml降至10 ml從而增加了每毫升細(xì)胞數(shù)。通過優(yōu)選在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中擴(kuò) 增(數(shù)目增力。)細(xì)胞來可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞提供了具有與其擴(kuò)增前的細(xì)胞基本上相 同的三維幾何形狀，優(yōu)選地與細(xì)胞在天然設(shè)置(setting)中或它們天然存在的組 織，體內(nèi)微環(huán)境中所顯示的基本上相同的幾何形狀及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的相互作用。 同樣優(yōu)選地，可控地?cái)U(kuò)增可以指維持三維培養(yǎng)物，其中，例如，優(yōu)選的生物 活性化合物的效果是阻止細(xì)胞數(shù)增加。更優(yōu)選地，還可以維持三維培養(yǎng)物來 表征生物活性化合物?？煽氐?cái)U(kuò)增旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的三維培養(yǎng)物中的細(xì)胞還 可以優(yōu)選地指退化培養(yǎng)，其中，例如，優(yōu)選的生物活性化合物的效果是使三 維培養(yǎng)物退化。更優(yōu)選地，可以有意地使三維培養(yǎng)物退化來表征優(yōu)選的生物 學(xué)化合物。擴(kuò)增的其它方面還可以提供本發(fā)明細(xì)胞的特殊特征。
優(yōu)選地，細(xì)胞和/或組織經(jīng)過擴(kuò)增，只要是測(cè)試生物成分以表征生物活性 化合物所必需的。三維培養(yǎng)物可以優(yōu)選地在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中經(jīng)過至少160 天的擴(kuò)增。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"旋轉(zhuǎn)"及類似術(shù)語，指可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng) 器的培養(yǎng)室的旋轉(zhuǎn)，其優(yōu)選為基本上柱形的并且圍繞基本上水平的平面旋轉(zhuǎn)。優(yōu)選地，旋轉(zhuǎn)的速率為約1轉(zhuǎn)每分鐘(RPM)到約120 RPM，更優(yōu)選從約2 RPM 到約30RPM。可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器可以優(yōu)選地自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，或手動(dòng)旋轉(zhuǎn)。此外， 旋轉(zhuǎn)的速率可以優(yōu)選地進(jìn)行手動(dòng)調(diào)節(jié)、啟動(dòng)或停止，或更優(yōu)選地利用傳感器 自動(dòng)調(diào)節(jié)、啟動(dòng)或停止。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"引入生物活性化合物"指在可控?cái)U(kuò)增步 驟之前、之間和/或之后將生物活性化合物加入培養(yǎng)室的方法?？梢詢?yōu)選地在 本發(fā)明的方法的過程中和多個(gè)步驟之前和/或之后根據(jù)需要添加生物活性化 合物。根據(jù)所進(jìn)行的優(yōu)選的測(cè)試，可以以不同的濃度并且在遍及本發(fā)明的方 法的多個(gè)時(shí)間添加生物活性化合物。也可以將生物活性化合物固有地包含在 三維培養(yǎng)物中。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"測(cè)試"指通過分析生物活性化合物對(duì)生 物學(xué)成份的效果或無效果來表征生物活性化合物的方法。根據(jù)待測(cè)試的生物 成分，測(cè)試將變化。例如，如果預(yù)期生物活性化合物影響生物學(xué)成份的DNA 或RNA,則可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)試對(duì)DNA的影響或通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)試對(duì)RNA的影響，從而來表征該生物活性化合物。其它測(cè)試 及測(cè)試方法包括但不限于如下儀器和技術(shù)，其包括質(zhì)譜分析、流式細(xì)胞術(shù)、 免疫熒光、色譜、單克隆和雙克隆抗體、生存力測(cè)試、毒性測(cè)試、物種測(cè)試、 生物鑒定(bioassay)、稀釋和有效濃度測(cè)試、劑量響應(yīng)測(cè)試、有害廢物測(cè)試、 致死濃度測(cè)試、篩選測(cè)試(screeningtest)、靜態(tài)更新(static renewal)測(cè)試、細(xì)月包 數(shù)和組織生長測(cè)試以及放射性標(biāo)記。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了通過測(cè)試生物活 性化合物對(duì)致腫瘤性和遺傳異常的影響來表征生物活性化合物的方法。可以
括，但不限于與遺傳表達(dá)有關(guān)的測(cè)試、核型、生長速率特征(growth rate characteristics),多細(xì)胞和單細(xì)胞形態(tài)學(xué)、代謝計(jì)量以及細(xì)胞間關(guān)系。測(cè)試優(yōu) 選地針對(duì)測(cè)試結(jié)合復(fù)合物、腺體形成、細(xì)胞極性、及細(xì)胞間幾何形狀關(guān)系(細(xì) 胞對(duì)細(xì)胞幾何形狀)以及無細(xì)胞成分。本發(fā)明提供了方法，其包括如下步驟 可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞以使細(xì)胞的三維幾何形狀保持如其在天然設(shè)置中，由此提供
微環(huán)境中對(duì)生物成分的影響來表征生物活性化合物。可以測(cè)試生物成分以表 征生物活性化合物的作用機(jī)理、生物學(xué)效應(yīng)、功效(efficacy)、運(yùn)送、效用(unility)
和/或毒性。如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"表征，，指通過進(jìn)行生物成分的測(cè)試來確 定優(yōu)選的生物活性化合物對(duì)生物成分具有的影響的方法。可以優(yōu)選地測(cè)試生 物活性化合物的功效和毒性來進(jìn)行測(cè)試?？梢詼y(cè)試生物成分以表征生物活性 化合物的作用機(jī)理、生物學(xué)效果、功效、運(yùn)送、效用和/或毒性。
如在本申請(qǐng)中所-使用的，術(shù)語"細(xì)胞對(duì)細(xì)胞幾何形狀"指細(xì)胞的幾何形 狀，包括細(xì)胞相對(duì)于另一個(gè)細(xì)胞的間距、之間的距離及物理關(guān)系。例如，在 本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)利用細(xì)胞、擴(kuò)增細(xì)胞，包括那些組織、細(xì)胞聚集 物及組織樣結(jié)構(gòu)的那些細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞保持彼此的關(guān)系如在體內(nèi)微環(huán)境中。與
例如二維擴(kuò)增室中相比，擴(kuò)增的細(xì)胞在細(xì)胞間天然間距范圍(bound)內(nèi)，而在
二維擴(kuò)增室中所述間距不能隨時(shí)間和擴(kuò)增而保持。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"細(xì)胞對(duì)細(xì)胞支持"指細(xì)胞提供給相鄰細(xì) 胞的支持。例如，組織、細(xì)胞聚集物、組織樣結(jié)構(gòu)，及細(xì)胞維持與其它細(xì)胞 的相互作用如化學(xué)的、激素的、神經(jīng)的(其中實(shí)用的/適當(dāng)?shù)?。此外，細(xì)胞互 相提供結(jié)構(gòu)上的支持。細(xì)胞沒必要物理接觸以提供細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持。在本 發(fā)明中，將這些相互作用維持在正常的功能參數(shù)內(nèi)，意味著它們不會(huì)例如開
始向其它細(xì)胞釋放有毒的(toxic)或破壞的信號(hào)(除非在天然的細(xì)胞及組織環(huán)境 中要完成這些)。
如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語"三維幾何形狀，，指在三維狀態(tài)中細(xì)胞的 幾何形狀(與它們天然狀態(tài)相同或非常相似)，相對(duì)于二維幾何形狀例如培養(yǎng)皿 (Petri dish)中生長的細(xì)胞中存在的，其中細(xì)胞變得扁平和/或一皮拉伸。不受理 論的限制，但是細(xì)胞的三維幾何形狀被維持、支持和保持以使細(xì)胞能在可旋 轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的三維培養(yǎng)物中發(fā)展成三維細(xì)胞聚集物、組織和/或組織樣結(jié) 構(gòu)，而同時(shí)維持三維幾何形狀，及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持和幾何形狀。通過旋轉(zhuǎn) 培養(yǎng)室中的三維培養(yǎng)物，其中的細(xì)胞可以維持三維幾何形狀，細(xì)胞對(duì)細(xì)胞幾 何形狀和支持，而與在攪動(dòng)環(huán)境如搖動(dòng)、使用氣泡(bubble)、及攪拌中生長的
并維持體內(nèi)微環(huán)境的細(xì)胞中存在的三維維度。
對(duì)于涉及維持本發(fā)明的細(xì)胞的"細(xì)胞對(duì)細(xì)胞支持"、"細(xì)胞對(duì)細(xì)胞幾何形 狀，，和"三維幾何形狀，，的上述三個(gè)定義的每一個(gè)，術(shù)語"基本上(essentially) 相同，，和"基本上(substantially)相同，，意指在擴(kuò)增中提供的天然的幾何形狀 和支持，從而使細(xì)胞不會(huì)以這樣的方式而改變，例如對(duì)三維培養(yǎng)物是功能障礙的、有毒的或有害的。而且(rather)，本發(fā)明的細(xì)胞，在擴(kuò)增期間和擴(kuò)增后， 模擬體內(nèi)情況。
在操作中，將細(xì)胞混合物放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室。在一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方案中，培養(yǎng)室在一段時(shí)間內(nèi)旋轉(zhuǎn)，而同時(shí)通過TVEMF源在培養(yǎng)室中 產(chǎn)生TVEMF。"而同時(shí)"是表示運(yùn)送TVEMF的開始可以在培養(yǎng)室的旋轉(zhuǎn)開 始前，與其同時(shí)或在其后。在更復(fù)雜的可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中，可以周期性的 更新和去除為細(xì)胞提供養(yǎng)料的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基富含了培養(yǎng)基所需物，其 優(yōu)選包括但不限于生長培養(yǎng)基、緩沖劑、營養(yǎng)物、激素、細(xì)胞因子及生長因 子?？梢栽诒榧皵U(kuò)增過程的任意時(shí)間測(cè)試可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的三維培養(yǎng)物所 包含的生物成分。而且，可以在生物反應(yīng)器中三維培養(yǎng)開始之前、過程中或 之后的任意時(shí)間將要表征的生物活性化合物引入三維培養(yǎng)物。通過測(cè)試生物 成分，可以表征生物活性化合物。
在使用中，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器提供了穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán)境，其中可以通過 同時(shí)最小化流體剪切應(yīng)力、為細(xì)胞提供三維自由度和基質(zhì)空間定向、和在擴(kuò) 增期間在特殊的空間區(qū)域增加細(xì)胞的定位(localization)將細(xì)胞引入、懸浮、集 合(assemble)、生長和維持，使精致的三維結(jié)構(gòu)完整性的保持或產(chǎn)生得到改進(jìn)。
在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了這三個(gè)標(biāo) 準(zhǔn)(在下文中稱為"上面三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，，)，而同時(shí)將細(xì)胞暴露于TVEMF。本發(fā)明 的特別感興趣的是培養(yǎng)室的大小、細(xì)胞的沉降速率、旋轉(zhuǎn)速率、外部重力場(chǎng)、 TVEMF 、以及生物活性化合物和生物成分的相互作用。
退化過程。例如，通過確定致瘤細(xì)胞和組織的大小和數(shù)目是否有任何降低并 且確定作用機(jī)理可能涉及測(cè)試相關(guān)的生物成分，從而表征生物活性化合物， 如化療劑。響應(yīng)化療劑的任何成功的腫瘤減小將表征該化療劑的功效。在這 種情況下，可以分析運(yùn)送生物活性化合物進(jìn)入腫瘤的穿入或圍繞細(xì)胞的情況 以及可以通過其它操作或藥物增強(qiáng)這種運(yùn)送的方法。鑒定培養(yǎng)組織構(gòu)建體中， 在內(nèi)部細(xì)胞亞體積，或者在細(xì)胞表面上的藥物分布對(duì)于精確理解有效藥物運(yùn) 送(毒性化合物分析，或試劑作用)是關(guān)鍵的。然后通過常規(guī)組織和細(xì)胞超微結(jié) 構(gòu)、分子的、免疫的和物理的分析，分析培養(yǎng)的模型腫瘤對(duì)潛在治療的反應(yīng)(化 療、放射方案、微顆粒功能，或它們的組合)。在此優(yōu)選實(shí)施方案中，生物活 性化合物由免疫活性元件(element)組成，所述免疫活性元件如包含化合物的抗體或甚至活免疫細(xì)胞(其可以如通過采用的免疫療法-殺傷性T-細(xì)胞活化修 飾的它們自身)。同樣地，生物活性化合物可以優(yōu)選地包含活的細(xì)胞成分，其
試，因此它們可以自由地與靶組織(在此情況下為肺瘤)相互作用。
在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的操作中提及的穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán)境是培養(yǎng)基中的條 件，特別是指流體速度梯度，在引入細(xì)胞之前，其在引入細(xì)胞后支持幾乎均 勻的細(xì)胞懸液由此在添加細(xì)胞混合物之后開始三維培養(yǎng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 最初將培養(yǎng)基穩(wěn)定化至幾乎呈固體圍繞軸水平旋轉(zhuǎn)，在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的
相似旋轉(zhuǎn)的室壁的邊緣內(nèi)。在這種條件下培養(yǎng)室室壁以與培養(yǎng)室內(nèi)容物相同 的角速率移動(dòng)，因?yàn)閱?dòng)瞬時(shí)，以及相關(guān)的瞬時(shí)流體速率梯度凈皮耗散
(dissipate)。將培養(yǎng)室室壁設(shè)置為相對(duì)于培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)，以最初地將旋轉(zhuǎn)引入培 養(yǎng)室內(nèi)容物。在這個(gè)瞬時(shí)期間，其也在培養(yǎng)室旋轉(zhuǎn)降j氐(spindown)期間出現(xiàn)， 存在顯著的流體速度梯度和相關(guān)流體剪切應(yīng)力。在培養(yǎng)室與內(nèi)容物達(dá)到穩(wěn)態(tài) 后，這些梯度顯著降低并且其中流體應(yīng)力剪切區(qū)域?yàn)樽钚≈怠⒓?xì)胞引入并 穿過處于穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán)境中的培養(yǎng)基從而開始并維持三維培養(yǎng)。三維培養(yǎng) 物在重力、離心力和科里奧利力(coriolusforce)的影響下移動(dòng)，而三維培養(yǎng)物
至培養(yǎng)基。術(shù)語"元件，，意指包括在三維培養(yǎng)的培養(yǎng)基中存在的任何物質(zhì)， 其包括但不限于病毒、毫微粒、廢物、死細(xì)胞、細(xì)胞及其中的任何其它物 體。培養(yǎng)基相對(duì)于培養(yǎng)室的顯著運(yùn)動(dòng)、顯著的流體剪切應(yīng)力及其它流體運(yùn)動(dòng)， 是由于這些細(xì)胞、顆粒、和/或培養(yǎng)基中元件的存在而引起的。
還優(yōu)選的是，為了方便或有利起見，可將這些元件中的一些與培養(yǎng)室壁 旋轉(zhuǎn)固定，而其它元件是自由的以在培養(yǎng)室中液體隔室中移動(dòng)。這些"固定 的，，元件可為物體(如基底(substrate))，否則(otherwise)其太重以至于不能《又通 過旋轉(zhuǎn)的流體而懸??；元件，其在培養(yǎng)室內(nèi)部被甚至低沉積誘導(dǎo)的殘余流體 剪切所破壞，受到不可避免的壁沖擊(wall impact)的不良影響，所述壁沖擊是 自由懸浮的元件所經(jīng)歷的，為了更近地觀察，或僅僅為了操作者的方便(如過 后放置特殊元件。值得注意的是這些"固定的"元件的引入代表了培養(yǎng)方法
一個(gè)實(shí)例為在旋轉(zhuǎn)著的培養(yǎng)室內(nèi)"懸掛(hang)"心瓣膜狀的基底，因?yàn)橐敫?多細(xì)胞用于附著在該基底上，以構(gòu)造改進(jìn)的心臟瓣膜。在大多數(shù)情況下，裝入(prime with)穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞以優(yōu)選低于0.5 厘米每秒的低速率沉降。因此，可以在三維培養(yǎng)的早期，從寬范圍的旋轉(zhuǎn)速
率(優(yōu)選從約1至約120 RPM，更優(yōu)選從約2至約30 RPM)和培養(yǎng)室直徑(優(yōu) 選約0.5至約36英寸)中選擇。優(yōu)選地，最低的旋轉(zhuǎn)速率是有利的，因?yàn)樗?處理三維培養(yǎng)物時(shí)使設(shè)備磨損及相關(guān)的其它補(bǔ)給(logistics)最小化。
不受理論的限制，相對(duì)于外部重力矢量(gravity vector)圍繞基本上水平的 軸以一種角速度旋轉(zhuǎn)使三維培養(yǎng)物中懸浮的細(xì)胞軌道優(yōu)化。在操作中，細(xì)胞 擴(kuò)增以形成大量的細(xì)胞聚集物、三維組織、非壞死細(xì)胞團(tuán)和/或組織樣結(jié)構(gòu)， 其大小隨著三維培養(yǎng)的進(jìn)展而增加。細(xì)胞間相互作用，如三維幾何形狀及細(xì) 胞對(duì)細(xì)胞的幾何形狀和支持基本上模擬了細(xì)胞天然設(shè)置中所存在的，體內(nèi)微 環(huán)境。優(yōu)選地通過可見地、手工地或自動(dòng)地確定三維培養(yǎng)中三維細(xì)胞團(tuán)直徑 的增加來評(píng)估三維培養(yǎng)的進(jìn)展。三維培養(yǎng)中的細(xì)胞聚集物、組織、非壞死細(xì) 胞團(tuán)或組織樣結(jié)構(gòu)的大小和/或數(shù)目的增加或減少，可能需要對(duì)旋轉(zhuǎn)速度的適 當(dāng)調(diào)節(jié)，以優(yōu)化具體的途徑。培養(yǎng)室的旋轉(zhuǎn)最佳地控制了碰撞頻率，碰撞強(qiáng) 度和細(xì)胞相對(duì)于其它細(xì)胞的定位，還有可旋轉(zhuǎn)TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室 的限制性邊界。為控制旋轉(zhuǎn)，如果觀察到細(xì)胞向下端(downward dise)向內(nèi)部 過分變形而向上端向外部過分變形，則可以優(yōu)選地增加轉(zhuǎn)每分鐘("RPM")。 如果觀察到細(xì)胞過分地離心到外壁，則可以優(yōu)選地降低RPM。不受理論的限 制，在達(dá)到操作極限時(shí)，就高細(xì)胞沉降速率或高重力強(qiáng)度而言，操作者可能 無法滿足這兩個(gè)條件，并可能被迫接受如相對(duì)上面三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量的性能方面 的降低。
即使在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的操作范圍內(nèi)，由于在三維培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的 元件和/或細(xì)胞的重力誘導(dǎo)偏移，細(xì)胞沉降速率和外部重力場(chǎng)定出了(place)可 獲得的流體剪切應(yīng)力的下限。計(jì)算和測(cè)量使這個(gè)最小流體剪切應(yīng)力非常接近 于由細(xì)胞的和/或成分的外部重力場(chǎng)強(qiáng)度的終極沉降速率(穿過培養(yǎng)基)所得到 的。離心力和科里奧利力(centrifugal and coriolis)誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)[經(jīng)典角運(yùn)動(dòng)學(xué)提 供下列方程式，其將科里奧利力與物體的質(zhì)量(m)，其在旋轉(zhuǎn)框架中的速度(Vr) 和參考的旋轉(zhuǎn)框的角速度(co)相關(guān)F科里奧利二-2m(coxVr)]連同由于細(xì)胞和培 養(yǎng)基相互作用引起的次級(jí)效應(yīng)，在細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)起作用以進(jìn)一步降低流體剪切 應(yīng)力水平。
不受理論的限制，但是當(dāng)外部重力場(chǎng)降低時(shí)，可以獲得更密的和更大的三維結(jié)構(gòu)。為了獲得最小流體剪切應(yīng)力水平，優(yōu)選的是將培養(yǎng)室以與培養(yǎng)基 基本上相同的速率旋轉(zhuǎn)。不受理論的限制，但是這樣使誘導(dǎo)于三維培養(yǎng)物上 的流體速度梯度最小化。為了將細(xì)胞大小(及相關(guān)的沉降比率)維持在擴(kuò)增速率
能夠滿足上面三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的范圍內(nèi)，控制組織形成的速率(rate)和大小是有利的。 然而，優(yōu)選地，為了具體的研究目的如研究剪切應(yīng)力對(duì)三維細(xì)胞聚集物的影 響，可以有意地引入和控制速度梯度和所得的流體剪切應(yīng)力。此外，擴(kuò)增過 程的瞬時(shí)破壞是允許的和容忍的，除其它原因外，用于在最初系統(tǒng)裝入 (priming)、樣品獲得、系統(tǒng)維持和三維培養(yǎng)終止期間的補(bǔ)給(logistical)目的。
將細(xì)胞圍繞基本上垂直于重力的軸旋轉(zhuǎn)可以產(chǎn)生多種沉降速率，本發(fā)明 的所有沉降速率仍然是空間上定位于特定區(qū)域一段延長的時(shí)間，從數(shù)秒(當(dāng)沉 降特征大時(shí))到數(shù)小時(shí)(當(dāng)沉降差異小時(shí))。不受理論的限制，但是這樣允許這 些細(xì)胞有充足時(shí)間根據(jù)需要進(jìn)行相互作用以形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)并在三維培養(yǎng)物 中彼此關(guān)聯(lián)。細(xì)胞可以優(yōu)選根據(jù)需要在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中擴(kuò)增。細(xì)胞可以 優(yōu)選在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中繼續(xù)擴(kuò)增至少160天。
培養(yǎng)室的尺寸也影響本發(fā)明三維培養(yǎng)中的細(xì)胞的途徑。優(yōu)選選擇培養(yǎng)室 的直徑使其具有適當(dāng)?shù)捏w積，優(yōu)選為用于預(yù)期三維培養(yǎng)的約15ml到約2L而 且其允許足夠的細(xì)胞接種密度。不受理論的限制，但是由于離心力引起的向 外的細(xì)胞偏移在較高培養(yǎng)室半徑(radii)時(shí)被放大并用于快速沉降細(xì)胞。因此， 優(yōu)選限制培養(yǎng)室的最大半徑，作為最終三維培養(yǎng)階段中期望的組織的沉降性 質(zhì)的函數(shù)(當(dāng)具有高沉降速率的最大的細(xì)胞聚集物已經(jīng)形成時(shí))。
結(jié)合由重力、離心和科里奧利效應(yīng)得到的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，已通過分析計(jì)算了 三維培養(yǎng)中細(xì)胞的路徑。這些控制方程(governing叫uation)的計(jì)算機(jī)模擬允許
操作人員建立其過程的模型并選擇可接受的(或優(yōu)化的)參數(shù)用于特殊計(jì)劃的 三維培養(yǎng)。圖4顯示了從外部(非旋轉(zhuǎn))參考框觀察到的細(xì)胞軌道的典型形狀。 圖5是細(xì)胞從作為RPM的函數(shù)(以0.5 cm每秒的終端速度的典型細(xì)胞沉降) 標(biāo)繪的理想環(huán)形流線的半徑(radial)偏移圖。該圖(圖5)顯示了如由重力沉降所 誘導(dǎo)的正弦變化的半徑細(xì)胞偏移的降低幅度。圖5還顯示了隨RPM增加，由 于離心而導(dǎo)致的半徑細(xì)胞偏移(每轉(zhuǎn))增力口。這些相反的約束條件謹(jǐn)慎地影響選 擇最佳的RPM,以優(yōu)選將細(xì)胞與室壁的沖擊，或在室壁的累積最小化。由于 外部重力場(chǎng)強(qiáng)度增加或細(xì)胞沉降速率增加，就可用的RPM選^^而言，產(chǎn)生了 限定性增加的曲線家族。優(yōu)選地利用這個(gè)曲線家族，或優(yōu)選地解出這些控制軌道方程的計(jì)算機(jī)模型，來選擇最佳的RPM和培養(yǎng)室的尺寸用于在給定的外 部動(dòng)力場(chǎng)強(qiáng)度中擴(kuò)增給定沉降速率的細(xì)胞。不受理論的限制，但是隨著三維 培養(yǎng)物的擴(kuò)增，組織、細(xì)胞聚集物及組織樣結(jié)構(gòu)在大小和沉降速率方面增加， 因此，可以優(yōu)選地調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)速率從而將其優(yōu)化。
在三維培養(yǎng)中，可以看出培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)參考框的細(xì)胞軌道(圖4)在旋轉(zhuǎn)重 力矢量(圖6)的影響下以近乎圓形的途徑運(yùn)動(dòng)。不受理論的限制，但是由旋轉(zhuǎn)
的(力。速的)參考框產(chǎn)生的兩種偽力(pseudo force),即科里奧利力和離心力，導(dǎo) 致了另外的近乎圓形途徑的變形。更高的重力水平和更高的細(xì)胞沉降速率產(chǎn) 生了更大的半徑圓形圖徑，其對(duì)應(yīng)于從如在非旋轉(zhuǎn)參考框中所見的理想圓形 軌道的更大軌道偏移。認(rèn)為在旋轉(zhuǎn)的參考框中，不受理論的限制，不同沉降 速率的細(xì)胞將長時(shí)間保持空間定位上彼此接近，與如果重力矢量未旋轉(zhuǎn)相比 具有大大降低的凈累積間隔(net cumulative separation);細(xì)胞在沉降，但是在 小的圓周中(如在旋轉(zhuǎn)參考框中所觀察到的)。因此，在操作中可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng) 器為不同沉降性質(zhì)的細(xì)胞提供充足的時(shí)間以機(jī)械地并通過可溶性化學(xué)信號(hào)相 互作用從而模擬如體內(nèi)存在的基本上相同的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持和幾何形狀。 在操作中，本發(fā)明提供優(yōu)選約0 cm/秒多至10 cm/秒的沉降速率。
此外，在操作中本發(fā)明的培養(yǎng)室具有至少一個(gè)孔優(yōu)選用于輸入新鮮培養(yǎng) 基、細(xì)胞混合物、生物成分和生物活性化合物，還有去除一定體積含有代謝 廢物和生物成分樣品的使用過的培養(yǎng)基，但不限于此，優(yōu)選地，培養(yǎng)基的交 換還可以經(jīng)由培養(yǎng)基回路進(jìn)行，其中新鮮的或重復(fù)利用的培養(yǎng)基可以在培養(yǎng) 室內(nèi)移動(dòng)，優(yōu)選以足夠支持代謝氣體交換、營養(yǎng)物運(yùn)送和代謝廢物去除的速 率在培養(yǎng)室內(nèi)移動(dòng)。這樣可以使其它(otherwise)靜止的三維培養(yǎng)物輕微地降 解。因此，優(yōu)選的是引入用于支持優(yōu)選的成分的機(jī)制，所述優(yōu)選的成分包括， 但不限于呼吸氣體更換、營養(yǎng)物運(yùn)送、生長因子向三維培養(yǎng)的培養(yǎng)基的運(yùn)送， 還有用于去除代謝廢物的機(jī)制，以提供能夠支持顯著代謝負(fù)荷數(shù)小時(shí)到數(shù)月 時(shí)間的長期三維培養(yǎng)。
本發(fā)明優(yōu)選地將三維培養(yǎng)物(并因而將生物成分和細(xì)胞)暴露于TVEMF, 所述TVEMF不僅提供了細(xì)胞的加速擴(kuò)增，其維持它們的三維幾何形狀和細(xì) 胞對(duì)細(xì)胞支持及幾何形狀，而且另外在擴(kuò)增過程中可以影響細(xì)胞的 一 些性質(zhì)， 例如上調(diào)促進(jìn)生長的基因，或下調(diào)抑制生長的基因。通過TVEMF源產(chǎn)生了 電磁場(chǎng)。在操作中，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的電傳導(dǎo)線圈優(yōu)選可與培養(yǎng)室一起旋轉(zhuǎn)，意思是繞與培養(yǎng)室相同的軸在相同的方向旋轉(zhuǎn) 而且，電傳導(dǎo)線圏可以
優(yōu)選地相對(duì)于可旋轉(zhuǎn)的灌注的TVEMF-生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室固定。電傳導(dǎo)線 圏可以優(yōu)選地與培養(yǎng)室的外部部分整合，意思是將可旋轉(zhuǎn)TVEMF生物反應(yīng) 器的培養(yǎng)室的電傳導(dǎo)線圈附接于并回繞培養(yǎng)室的外部部分。TVEMF源操作地 連接于可旋轉(zhuǎn)TVEMF生物反應(yīng)器。本發(fā)明的方法以此前未獲得的方式提供 了上面三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)并優(yōu)化了三維培養(yǎng)，而同時(shí)促進(jìn)并支持了擴(kuò)增，使得在充分 的時(shí)間量中測(cè)試到充分的擴(kuò)增(在數(shù)目每體積(number per volume)、關(guān)于組織 的直徑(diameter in reference to tissue), 或濃度方面增力口)。
除通過操作可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器而產(chǎn)生的性質(zhì)上獨(dú)特的(qualitatively unique)細(xì)胞之外，不受理論的限制，由于實(shí)現(xiàn)了基本上均勻的均質(zhì)懸浮，可 以獲得關(guān)于利用全部培養(yǎng)室體積用于細(xì)胞和組織培養(yǎng)方面增加的效率。因此， 有利地，可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器在操作中以較少的人力資源在相同的可旋轉(zhuǎn)生物 反應(yīng)器中提供了數(shù)目增加的細(xì)胞。許多細(xì)胞類型可用于本方法。本發(fā)明和使 用本發(fā)明的方法為如下應(yīng)用提供了增強(qiáng)基本的細(xì)胞和組織生物學(xué)研究以及 需要體內(nèi)細(xì)胞行為的準(zhǔn)確體外模型的臨床應(yīng)用，因?yàn)槿缟厦婧驼麄€(gè)本申請(qǐng)中 所示，本發(fā)明的擴(kuò)增的細(xì)胞和組織具有與天然存在的、未擴(kuò)增的細(xì)胞與組織 基本上相同的三維幾何形狀和細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持以及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的幾何形 狀。在非常接近地模擬體內(nèi)情況的環(huán)境中測(cè)試生物活性化合物是有用的。
可以測(cè)試生物活性化合物的毒性和功效以表征生物活性化合物。為了測(cè) 試生物活性化合物，準(zhǔn)確的體外組織模型的形成是非常需要的?？尚D(zhuǎn)生物 反應(yīng)器能夠提供獨(dú)特的且有用的體外條件，其包括基本上靜止的三維培養(yǎng)物， 其中細(xì)胞可以以接近地表現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境情況的方式響應(yīng)生物活性化合物。
不同類型的藥物具有明顯不同的作用機(jī)理，但是在本發(fā)明專注的藥物研 發(fā)過程享有一般的特性。例如，在抗病毒藥物的情況中，病毒顆粒的完整生 命周期提供了干預(yù)的機(jī)會(huì)。病毒生命周期至少包括病毒顆粒的初始轉(zhuǎn)運(yùn)和在 靶細(xì)胞附近定位、細(xì)胞膜透過、遺傳整合、病毒亞顆粒生產(chǎn)、病毒顆粒組裝 以及病毒釋放。在病毒生命周期中這些具體的步驟是生物活性化合物如抗病 毒藥物所針對(duì)的和測(cè)試其功效的步驟。因此，這些測(cè)試需要接近地模擬體內(nèi) 微環(huán)境的高保真度細(xì)胞和多細(xì)胞組織水平行為，所述體內(nèi)微環(huán)境是由可旋轉(zhuǎn) 生物反應(yīng)器中的擴(kuò)增所提供的，如在本發(fā)明中所提供的。可以優(yōu)選地通過本 發(fā)明的方法測(cè)試的病毒的關(guān)鍵實(shí)例包括HIV、禽流感、肝炎、皰疹病毒，并包括傳統(tǒng)的基于DNA的以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA (逆轉(zhuǎn)錄酶依賴的)感染性病
毒顆粒?？梢砸勒疹愃频某绦蛞詢?yōu)選地測(cè)試生物活性化合物(優(yōu)選抗菌劑)對(duì)于 細(xì)菌感染的效果，就毒素暴露而言可以測(cè)試其中毒綜合征，并且提供矯正干 預(yù)的方法(例如重金屬暴露)。
可以優(yōu)選地測(cè)試其它生物活性化合物以確定它們對(duì)正常細(xì)胞和組織功能 和形態(tài)學(xué)的影響，包括生物活性化合物是否可以調(diào)節(jié)這些正常組織和細(xì)胞功 能以潛在地恢復(fù)正常細(xì)胞和組織的功能或抑制疾病狀態(tài)。不受理論的限制， 在疾病狀態(tài)正常細(xì)胞和組織的功能是過表達(dá)或低表達(dá)，常常是由于調(diào)控和反
饋機(jī)制的問題而引起的。例如，在成年型糖尿病(Adult Onset Diabetes)的情況 中，由于變薄(rarified)的細(xì)胞膜胰島素受體、無效的受體或被阻滯的受體(抗 體)，細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)(接納葡萄糖)不足。被測(cè)試以治療成年型糖尿病的 藥物的定常流(steady flow)針對(duì)于使這些細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)常態(tài)。本發(fā)明提 供基本上模擬體內(nèi)情況的體外模型用于測(cè)試生物活性化合物的效果，并因此 將其表征，在所述體外模型中細(xì)胞具有與體內(nèi)微環(huán)境基本上相同的三維幾何 形狀以及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持和幾何形狀，并且其維持了模擬體內(nèi)情況的細(xì)胞 和組織功能。
優(yōu)選地，在測(cè)試生物活性化合物功效的同時(shí)，也可以通過本發(fā)明的方法 測(cè)試對(duì)靶細(xì)胞和/或組織以及對(duì)其它非相關(guān)組織的毒性，其也可暴露于藥物并 且其也可以在體外培養(yǎng)至增強(qiáng)的保真度。優(yōu)選地，在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的三 維培養(yǎng)中可以類似地培養(yǎng)功能異常的組織和細(xì)胞，以評(píng)估針對(duì)病原靶物的潛 在生物活性化合物功效，所述病原耙物如，但不限于惡性轉(zhuǎn)化的(癌性)組織。 可以針對(duì)惡性組織測(cè)試的一些優(yōu)選的生物活性化合物包括，但不僅限于化療 的、；故療的、抗4爭(zhēng)移的、腫瘤月永管系統(tǒng)剝奪的(tumor vasculature deprival)以及 毫微粒劑。而且，優(yōu)選地可以通過本發(fā)明的方法測(cè)試雜交細(xì)胞系。
值得注意的是對(duì)于毫微粒(術(shù)語"毫微粒"表示人造的生物活性顆粒)的治 療模態(tài)未來大有希望(用于癌癥以及非轉(zhuǎn)化的病狀校正)，并且這些模態(tài)的開發(fā) 將依賴于準(zhǔn)確的組織培養(yǎng)體外模型(疾病的正常的兩者)。優(yōu)選地，因此，針對(duì) 測(cè)試毫微粒功能的生物活性化合物包括，但不限于下列功能歸巢(homing)、 靶物鑒定(target identification)、粘著、導(dǎo)納(admittance),直接顆粒干預(yù)(direct particle intervention)、 二級(jí)顆粒功能如藥物釋放、顆粒生命期/周期、分解 (breakdown)以及清除(clearance)可以通過在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的本發(fā)明的擴(kuò)增方法來測(cè)試。優(yōu)選地，可以類似地測(cè)試由改變的病毒組成以實(shí)現(xiàn)治療目 標(biāo)的雜合體。
本發(fā)明還提供了優(yōu)選地測(cè)試藥理學(xué)調(diào)節(jié)、改變或校正沿定向途徑的干細(xì) 胞更新及分化發(fā)育的機(jī)制的方法，以更新干細(xì)胞(或祖細(xì)胞)匯集物以及從干細(xì) 胞產(chǎn)生預(yù)期的組織(或定型的祖譜系)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下 方法，在體外準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增干細(xì)胞，而同時(shí)維持與體內(nèi)存在的基本上相同的三 維幾何形狀，細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持及幾何形狀。在這樣的優(yōu)選實(shí)施方案中，可 以測(cè)試具有干細(xì)胞的三維培養(yǎng)物對(duì)可溶的和直接接觸控制機(jī)制的反應(yīng)，還可
以優(yōu)選地測(cè)試非定向的臨床用途如移植物移入質(zhì)量評(píng)估(engraftment quality assessment)。為說明本發(fā)明的廣泛的實(shí)用性， 一些其它的優(yōu)選實(shí)施方案包括 測(cè)試?yán)蛐阅芤约皩?duì)腎小管和基質(zhì)復(fù)合物的腎毒性；對(duì)可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中 擴(kuò)展的平滑肌(smoothmuscle)進(jìn)行血壓控制處理的反應(yīng)；以及在自身免疫模型 上測(cè)試生物活性化合物。
本發(fā)明很好地適合于實(shí)現(xiàn)本文提及的目標(biāo)并獲得本文提及的結(jié)果和優(yōu) 勢(shì)，以及它們中固有的那些。在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，意欲將本文 包含的所有內(nèi)容理解為說明性而非限制性的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見 的是，可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍情況下在本發(fā)明中進(jìn)行各種改變， 因此本發(fā)明不受包含在附圖和說明書中的內(nèi)容的限制，而僅如所附的權(quán)利要 求所示。
操作方法
在操作中，優(yōu)選地具有從15 ml到約2L的培養(yǎng)室的可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基全部填充，對(duì)于要擴(kuò)增的人細(xì)胞而言優(yōu)選地補(bǔ)充以白蛋白(5%) 和優(yōu)選的G-CSF,其空間(room)僅用于如下物質(zhì)的任何預(yù)期的額外體積培 養(yǎng)基、細(xì)胞、生物活性化合物和/或預(yù)期三維培養(yǎng)的培養(yǎng)基其它優(yōu)選的成分。 優(yōu)選地，受控的環(huán)境孵育器完全圍繞可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器并且優(yōu)選設(shè)置成約5% 002和約21%氧氣，并且溫度優(yōu)選為約26。C到約4rC,更優(yōu)選約37。C士2。C。 優(yōu)選地可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器也可以具有整合的溫度計(jì)、加熱器和氣體控制(包括 C02、 02和/或氮?dú)獾目刂?。
最初，在培養(yǎng)基中創(chuàng)建穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán)境。旋轉(zhuǎn)可以優(yōu)選地以約10RPM 開始。IORPM是產(chǎn)生微載體珠軌道的優(yōu)選速率，在所述軌道中珠子不會(huì)因重力誘導(dǎo)的沉降或旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的離心而略微累積于室壁。以這種方式，可旋轉(zhuǎn)生 物反應(yīng)器在三維培養(yǎng)中產(chǎn)生最小流體速度梯度和流體剪切應(yīng)力。
如果要使用細(xì)胞附屬物基質(zhì)，優(yōu)選將細(xì)胞附屬物基質(zhì)同時(shí)地或順序地與
細(xì)胞一起引入培養(yǎng)室以給予適當(dāng)?shù)拿芏龋瑑?yōu)選5mg細(xì)胞附屬物基質(zhì)每毫升培 養(yǎng)基，并且優(yōu)選地用于支抗依賴性細(xì)胞(anchorage dependent cell)的附屬物基 質(zhì)為微載體珠。優(yōu)選將細(xì)胞混合物通過培養(yǎng)室中的孔注射到穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán) 境中以開始三維培養(yǎng)，優(yōu)選在短時(shí)間內(nèi)，優(yōu)選2分鐘進(jìn)行，以使在通過運(yùn)送 系統(tǒng)時(shí)的細(xì)胞損傷最小化。優(yōu)選地，細(xì)胞混合物和/或細(xì)胞附屬物基質(zhì)，如果 使用，經(jīng)由注射器來運(yùn)送。
在細(xì)胞注射結(jié)束后，培養(yǎng)室快速回到最初的圍繞基本上水平的軸的旋轉(zhuǎn)， 優(yōu)選在少于一(l)分鐘內(nèi)，優(yōu)選地10 RPM，由此使流體剪切應(yīng)力回到細(xì)胞能 獲得的最小水平。在最初的加載和附著階段過程中，允許細(xì)胞平衡一小段時(shí) 間，優(yōu)選2小時(shí)到4小時(shí)，更優(yōu)選地足夠使暫態(tài)流(transient flow)減弱(dampen out)的時(shí)間。
將本發(fā)明中待測(cè)試的生物活性化合物在擴(kuò)增細(xì)胞之前、過程中和/或之后
形式(例如氣體、液體或固體)，還有通過它將生物活性化合物S1入培養(yǎng)室的孔。 此外，濃度還依賴于待最終進(jìn)行的優(yōu)選測(cè)試以及生物活性化合物的期望結(jié)果。 在三維培養(yǎng)物的擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)，預(yù)期的是，依賴于生物活性化合物的效果， 裝配的細(xì)胞的大小和沉降速率增加，并且可以增加系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)速率(增量增加優(yōu) 選約1到2 RPM)以降低由重力誘導(dǎo)的從現(xiàn)在增加的直徑組織片(diameter tissue pieces)的理想環(huán)形流線的軌道變形。#4居生物活性化合物的效果，裝配 的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)可以增加或減小其大小。無論哪種方式，可能需要調(diào)節(jié)三維
選的，然而，它們是可能的。然而可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器為任何沖擊，如果完全 的話(ifatall)，提供了充分低能量(lowenergetic)的沖擊，以使得它不會(huì)破壞靜 止的三維培養(yǎng)物。
在擴(kuò)增期間，可以評(píng)價(jià)和調(diào)節(jié)培養(yǎng)室中三維培養(yǎng)物的旋轉(zhuǎn)速度以使三維 培養(yǎng)物中的細(xì)胞維持基本上在水平軸上或附近。保證增加旋轉(zhuǎn)速度以防止過
度的壁沖擊，其對(duì)于精密結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步三維增長是有害的。例如，如果在三 維培養(yǎng)中的細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)周期向下端過度地向內(nèi)和向下落下，而在旋轉(zhuǎn)周期向上端過度地向外和不充分地向上，則增加旋轉(zhuǎn)優(yōu)選的。最佳地，建議^f吏用者 優(yōu)選地選擇旋轉(zhuǎn)速率，其促進(jìn)最小的壁碰撞頻率和強(qiáng)度，以維持三維幾何形 狀以及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持和細(xì)胞的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的幾何形狀。本發(fā)明優(yōu)選的速
度是從約2到約30 RPM，并且更優(yōu)選約10到約30 RPM。
可以優(yōu)選地通過優(yōu)選透明的培養(yǎng)室用視覺評(píng)估和手動(dòng)調(diào)節(jié)三維培養(yǎng)。三 維培養(yǎng)的評(píng)估和調(diào)節(jié)也可以通過傳感器(例如，激光)而自動(dòng)化，所述傳感器監(jiān) 測(cè)培養(yǎng)室中細(xì)胞的定位。指示很多細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的傳感器讀數(shù)將自動(dòng)引發(fā)機(jī)制以 相應(yīng)地調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)速度。
在初始加載細(xì)胞混合物和優(yōu)選的附著階段之后(如果使用細(xì)胞附屬物基 質(zhì))(2到4小時(shí))，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將TVEMF源開啟并調(diào)節(jié)以 使TVEMF輸出在培養(yǎng)室的三維培養(yǎng)物中產(chǎn)生預(yù)期的電》茲場(chǎng)。也可將TVEMF 在初始加載和附著階段過程中優(yōu)選地應(yīng)用于三維培養(yǎng)。優(yōu)選的是將TVEMF 在擴(kuò)增時(shí)間期間供應(yīng)給三維培養(yǎng)物直至其終止。
電傳導(dǎo)線圈的大小，和它回繞可旋轉(zhuǎn)TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室次數(shù) 的數(shù)目是這樣的，將TVEMF供應(yīng)給電傳導(dǎo)線圈時(shí)，在可旋轉(zhuǎn)TVEMF生物 反應(yīng)器的培養(yǎng)室中的三維培養(yǎng)物內(nèi)產(chǎn)生TVEMF。 TVEMF優(yōu)選地選自下列之 一(1)力幅度小于100高斯并且轉(zhuǎn)換速率大于1000高斯每秒的TVEMF。 (2) 具有頻率小于100 Hz的低的力幅度兩極方波的TVEMF。 (3)具有低的力幅 度方波及小于100%工作循環(huán)的TVEMF。 (4)轉(zhuǎn)換速率大于1000高斯每秒持 續(xù)脈沖小于1 ms的TVEMF。(5)具有轉(zhuǎn)換速率兩極S函數(shù)樣脈沖及工作循環(huán) 小于1%的TVEMF。 (6)具有力幅度小于100高斯峰對(duì)峰和轉(zhuǎn)換速率兩極S 函數(shù)樣脈沖且其中工作循環(huán)小于1%的TVEMF。 (7)利用螺線管線圈以在整 個(gè)細(xì)胞混合物中產(chǎn)生均一力強(qiáng)度而施加的TVEMF。 (8)以及利用通量集中器 來提供細(xì)胞混合物中聚焦的磁通量及磁通量空間梯度而施加的TVEMF。震蕩 電磁力強(qiáng)度的頻率范圍是可以選擇的參數(shù)，用于在三維培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的 期望刺激。然而，這些參數(shù)并不意味對(duì)本發(fā)明的TVEMF進(jìn)行限制，因?yàn)榛?于本發(fā)明的其它方面這些參數(shù)可以變化?？蓽y(cè)量TVEMF,例如通過標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備 如EN131細(xì)胞傳感器高斯計(jì)來測(cè)量TVEMF。
快速細(xì)胞擴(kuò)增和增加總的代謝要求可以使間歇地添加使三維培養(yǎng)物中的 培養(yǎng)基豐富的優(yōu)選成分成為必需，所述成分包括，但不限于營養(yǎng)物、新鮮生 長培養(yǎng)基、生長因子、激素和細(xì)胞因子。該添加根據(jù)需要優(yōu)選地增加以維持葡萄糖和其它營養(yǎng)物水平。可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的快速細(xì)胞和組織擴(kuò)增期間， 可根據(jù)需要優(yōu)選地去除包含廢物的培養(yǎng)基。也可以將生物成分的樣品從三維 培養(yǎng)物中移除以進(jìn)行測(cè)試并且可將培養(yǎng)室旋轉(zhuǎn)暫時(shí)停止以允許實(shí)際操作?？?br> 以優(yōu)選地允許三維培養(yǎng)進(jìn)行超出可能選擇極佳的細(xì)胞軌道的點(diǎn)；而處于重力
引入了約束條件的點(diǎn)，所述約束條件對(duì)于低剪切應(yīng)力的三維培養(yǎng)而言使性能 稍微下降。此外，在擴(kuò)增后，細(xì)胞可以用于治療目的，其包括組織的再生、 研究和疾病的治療。
下列實(shí)施例是本發(fā)明的優(yōu)選的例證，但它們并不意欲對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1-成體干細(xì)胞及生物活性化合物擴(kuò)增 制備
可以優(yōu)選地通過如下來制備圖1和2的優(yōu)選實(shí)施方案中所說明的可旋轉(zhuǎn) 生物反應(yīng)器的75 ml培養(yǎng)室用洗滌劑和殺菌消毒劑溶液(Roccal II)以推薦的 用于消毒及清潔的濃度進(jìn)行洗滌，隨后以高質(zhì)量去離子水進(jìn)行大量沖洗并浸 泡?？梢酝ㄟ^高壓滅菌使可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器滅菌然后以培養(yǎng)基沖洗一次。如 果使用了可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的一次性培養(yǎng)室，則優(yōu)選一次性培養(yǎng)室是已經(jīng)滅 菌的并且只需要將其從任何包裝中移除并組裝于電動(dòng)機(jī)上。對(duì)于具有電傳導(dǎo) 線圈的優(yōu)選實(shí)施方案，電傳導(dǎo)線圈連接于可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的TVEMF源。
外周血干細(xì)胞的擴(kuò)增
可以優(yōu)選地以培養(yǎng)基填充可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器，所述培養(yǎng)基由如下組成 Isocove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM) (GIBCO， Grand Island N.Y.),補(bǔ)充以 5%人白蛋白、100 ng/ml重組人G-CSF (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)，及 100 ng/ml重組人干細(xì)胞因子(SCF) (Amgen)。此外，可將溶于DMSO中的銅 螯合劑D-青霉胺(D-Penicillamine) [D(-)-2-氨基-3-巰基-3-曱基丁炔酸 (D(-)-2-Amino-3-mercapto-3-methylbutonoic acid)] (Sigma-Aldrich)4尤選以 10 ppm的量引入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基。可以優(yōu)選地將來自外周血的成 體干細(xì)胞(0034+/0038-)以0.75 x 106細(xì)胞/ml的濃度置于可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 的培養(yǎng)室。優(yōu)選地，在將細(xì)胞混合物放入培養(yǎng)室之前將培養(yǎng)室平衡。如果使 用培養(yǎng)基流動(dòng)回路，如圖3中的優(yōu)選實(shí)施方案中所示，則培養(yǎng)基的平衡也是 優(yōu)選的以創(chuàng)建穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán)境。穩(wěn)定化的培養(yǎng)環(huán)境為細(xì)胞混合物的添加提 供了基本上低的剪切應(yīng)力水平。應(yīng)將電動(dòng)機(jī)開啟，優(yōu)選地開至約30 RPM的速率。如果培養(yǎng)室和其中培 養(yǎng)基已經(jīng)平衡，旋轉(zhuǎn)速度應(yīng)緩慢回到優(yōu)選的旋轉(zhuǎn)速率?？梢詢?yōu)選地每天評(píng)估 可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)，并進(jìn)行調(diào)節(jié)使旋轉(zhuǎn)維持在一定速度以防止壁沖擊
并將三維培養(yǎng)的細(xì)胞基本上保持在培養(yǎng)室中部。還可以將TVEMF源優(yōu)選地 開至優(yōu)選的高斯和振蕩范圍，優(yōu)選從約lmA到約1000mA,應(yīng)該優(yōu)選地允許 擴(kuò)增進(jìn)行七天然后終止，在那時(shí)測(cè)試細(xì)胞。 樣品和結(jié)果
在上述條件下在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中應(yīng)該優(yōu)選地?cái)U(kuò)增外周血干細(xì)胞的至 少兩個(gè)樣品。應(yīng)該將樣品1擴(kuò)增七天然后在顯微鏡下評(píng)估生存力。期望細(xì)胞 在第 一樣品中將保持健康和繁殖。應(yīng)該優(yōu)選將生物活性化合物在三維培養(yǎng)開 始時(shí)引入樣品2。生物活性化合物可優(yōu)選為3 ppm銅綠假單胞菌(Pseudomonas aemginosa)細(xì)菌。除細(xì)菌外，樣品1和2之間的擴(kuò)增條件應(yīng)該優(yōu)選為相同的。 七天后，應(yīng)該終止試驗(yàn)培養(yǎng)并在顯微鏡下評(píng)估細(xì)胞的生存力。期望顯微鏡檢 查揭示來自樣品2的含有細(xì)菌的生物活性化合物的細(xì)胞將死去，而在樣品1 中的細(xì)胞將保持存活和健康。這樣的結(jié)果預(yù)示如果允許該優(yōu)選的細(xì)菌進(jìn)入外 周血流則該細(xì)菌很可能是有毒的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何已知的已接受 的方法來確定細(xì)胞的生存力。
實(shí)例2-大鼠腎細(xì)胞和生物活性化合物的擴(kuò)增 制備
應(yīng)該如上面實(shí)例1制備可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器。 大鼠腎細(xì)胞的擴(kuò)增
可以優(yōu)選/人由無痛致死的(euthenized) Sprague Dawley 大鼠(Harlan Sprague-Dawley， Cleveland Ohio)收獲的腎皮質(zhì)分離大鼠腎細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，可 以優(yōu)選用剪刀將大鼠腎皮質(zhì)切出，在腎細(xì)胞緩沖液137mmolNaCl、 5.4mmo1 KC1、 2.8 mmol CaCl2、 1.2 mmol MgCl2、 10 mmol HEPES-Tris, pH 7.4中細(xì)細(xì) 絞碎。可以優(yōu)選將絞碎的組織放置在0.1% IV型膠原酶和0.1%胰蛋白酶溶于 生理鹽水的10 ml溶液中。可以優(yōu)選將含有組織的溶液在37。C振蕩水浴中溫 育45分鐘并加以間歇滴定?？梢詢?yōu)選將細(xì)胞放入離心機(jī)并輕微離心(800 rpm 5 分鐘)，吸出上清，將細(xì)胞重懸于含0.1%牛血清的5ml腎細(xì)胞緩沖液，并通 過細(xì)(70 mm)篩?？梢詢?yōu)選將過篩的級(jí)分層疊于5%牛血清白蛋白的不連續(xù)梯度并輕微離心(800 rpm 5分鐘)。應(yīng)該再次棄去上清留下大鼠腎細(xì)胞的細(xì)胞沉 淀。此時(shí)，可優(yōu)選將細(xì)胞冷凍(優(yōu)選在-80。C，更優(yōu)選在液氮中)根據(jù)需要用于 將來使用。
可以優(yōu)選將大鼠腎細(xì)胞沉淀以大約1 x 106細(xì)胞/ml的濃度重懸于 DMEM/F-12培養(yǎng)基(環(huán)丙沙星和兩性霉素B處理的)中。優(yōu)選在可旋轉(zhuǎn)生物反 應(yīng)器的培養(yǎng)室中擴(kuò)增細(xì)胞的至少兩個(gè)樣品(l x 1()S細(xì)胞/ml)。應(yīng)將可旋轉(zhuǎn)生物 反應(yīng)器置于5% C02 95% 02培養(yǎng)箱中，或者具有對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)的整合的氣體 和溫度計(jì)量器。應(yīng)該優(yōu)選將大鼠腎細(xì)胞擴(kuò)增7天。
樣品和結(jié)果
應(yīng)將大鼠腎細(xì)胞的樣品1在無任何添加劑包括任何生物活性化合物下擴(kuò) 增。應(yīng)該優(yōu)選在三維培養(yǎng)開始時(shí)將生物活性化合物10ppm的鄰苯二曱酸二異 辛酯增塑劑(diisooctylphthalateplasticizer)引入樣品2。優(yōu)選在7天后，通過本 領(lǐng)域已知方法如通過顯微鏡測(cè)定，樣品1和2都應(yīng)具有經(jīng)評(píng)估的細(xì)胞的生存 力。期望樣品1中的細(xì)胞將擴(kuò)增至和放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的至少七倍一樣 多。另一方面，期望樣品2中的大部分細(xì)胞將死亡。這些結(jié)果預(yù)示如果允許 鄰苯二曱酸二異辛酯導(dǎo)入體內(nèi)并在腎細(xì)胞中累積則它是有毒的。除生物活性 化合物以外，所有其它條件在樣品1和2之間優(yōu)選是相同的。此外，培養(yǎng)條 件和可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)應(yīng)該優(yōu)選與實(shí)施例1中相同。然而，在本實(shí)施 例2中優(yōu)選不將三維培養(yǎng)物暴露于TVEMF。
實(shí)施例3-大鼠腎細(xì)胞的擴(kuò)增和生物活性化合物 制備
應(yīng)該如上面實(shí)施例1制備可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器。 大鼠腎細(xì)胞的擴(kuò)增、樣品和結(jié)果
在實(shí)施例3中，應(yīng)重復(fù)實(shí)施例2，只是在樣品2中優(yōu)選用10 ppm順鉑取 代鄰苯二甲酸二異辛酯增塑劑。測(cè)試優(yōu)選在與實(shí)施例2相同的條件下重復(fù)10 次。在幾乎所有情況下，期望樣品1中的細(xì)胞保持存活。期望樣品2中的細(xì) 胞，在具有10ppm順鉑的大多數(shù)情況下，大鼠腎細(xì)胞將保持健康和存活。因 此，這些結(jié)果預(yù)示，向大鼠腎細(xì)胞中添加10ppm順鉑并在可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 中擴(kuò)增它們不產(chǎn)生不良效應(yīng)，這最終顯示事實(shí)上順鉑可以證明有助于預(yù)防腎 衰竭。在將順鉑用于人之前，應(yīng)該進(jìn)行其它的有關(guān)通過使用順鉑來預(yù)防腎衰竭的研究。
實(shí)施例4-外周血干細(xì)胞的擴(kuò)增和生物活性化合物 制備
應(yīng)該如上面實(shí)施例1制備可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器。 外周血干細(xì)胞的擴(kuò)增
可以優(yōu)選地以培養(yǎng)基填充可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器，所述培養(yǎng)基由如下組成 Isocove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM) (GIBCO， Grand Island N.Y)，補(bǔ)充以 5%人白蛋白、100 ng/ml重組人G畫CSF(Amgen Inc., Thousand Oaks, CA),及 100 ng/ml重組人干細(xì)胞因子(SCF) (Amgen)。此外，可將溶于DMSO中的銅 螯合劑D-青霉胺[D(-)-2-氨基-3-巰基-3-曱基丁炔酸](Sigma-Aldrich)優(yōu)選地以 10 ppm的量引入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基?？梢詢?yōu)選地將來自外周血的 成體干細(xì)胞(CD34+ZCD38-)以0.75 x 106細(xì)胞/ml的濃度置于可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng) 器的培養(yǎng)室。
應(yīng)該優(yōu)選通過本方法制備外周血干細(xì)胞的兩個(gè)樣品。樣品1應(yīng)該優(yōu)選來 自無已知肝損傷的個(gè)體。樣品2應(yīng)該優(yōu)選來自有已知肝損傷的個(gè)體。應(yīng)該如 上制備樣品并在實(shí)施例1中提及的條件下并以相同的濃度將所述樣品放入兩 個(gè)不同的可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中。應(yīng)該將生物活性化合物20 ppm對(duì)乙酰氨基酚 (acetaminophen)在三維培養(yǎng)開始時(shí)加入樣品2。樣品1和2都應(yīng)該優(yōu)選如實(shí)例 1 一樣在擴(kuò)增過程期間暴露于約1 mA到約1000 mA的TVEMF。
結(jié)果
優(yōu)選地，應(yīng)該在14天末尾評(píng)估每個(gè)樣品的生存力并計(jì)算細(xì)胞的數(shù)目，例 如在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行。期望樣品1中的細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增至放入可旋 轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的數(shù)目的至少十倍。還期望樣品2中的細(xì)胞既不死亡也不生長， 而是保持不變。這些結(jié)果預(yù)示在20ppm對(duì)乙酰氨基酚存在下再生肝組織的潛 在問題。應(yīng)該進(jìn)行更多的測(cè)試以確定將肝細(xì)胞暴露于對(duì)乙酰氨基酚的效果。
因此期望，快速而顯著的細(xì)胞擴(kuò)增是通過在本發(fā)明的可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 中擴(kuò)增而實(shí)現(xiàn)的，如本文所描述。還期望快速而顯著的擴(kuò)增伴有與體內(nèi)微環(huán) 境基本上相似的三維數(shù)(three-dimensionality)以及細(xì)胞對(duì)細(xì)胞相互作用。
不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可在本發(fā)明中進(jìn)行各種變化，因 此，本發(fā)明不限于包含在附圖和說明書(包括實(shí)施例)中的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1. 表征生物活性化合物的方法，其包括·將細(xì)胞混合物放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以開始三維培養(yǎng)，其中三維培養(yǎng)物包含細(xì)胞和生物成分；·通過旋轉(zhuǎn)可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器來可控地在三維培養(yǎng)中擴(kuò)增細(xì)胞，同時(shí)保持細(xì)胞的三維幾何形狀和細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的支持和幾何形狀；·向三維培養(yǎng)中引入生物活性化合物；和·利用表征所述藥物化合物的測(cè)試來測(cè)試生物成分。
2. 權(quán)利要求l中的方法，其中生物成分選自下組的一種或多種細(xì)月包、 細(xì)胞部分、分泌物質(zhì)(粘蛋白、膠原、基質(zhì))、分泌的激素、分泌的細(xì)胞間結(jié)構(gòu) 成分、引入的結(jié)構(gòu)基質(zhì)、粘著基質(zhì)、生長基質(zhì)、毫微粒、細(xì)胞間可溶信號(hào)、 細(xì)胞膜表面標(biāo)記、膜結(jié)合酶、免疫特征標(biāo)記、粘著分子、液泡、儲(chǔ)存的和釋 放的神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)部特化機(jī)構(gòu)、糖原、培養(yǎng)基、受測(cè)試的化合物、受測(cè) 試的可疑毒素、受測(cè)試的試劑、真菌、綴合的復(fù)合物、組織、酶、DNA、 RNA、 病毒、蛋白、人工生物活性粒子和基因。
3. 權(quán)利要求2中的方法，其中可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器包括旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)室壁， 且其中三維培養(yǎng)物的部分相對(duì)于旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)室壁是固定的。
4. 權(quán)利要求l中的方法，其中可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟進(jìn)一步包括將細(xì)胞 暴露于時(shí)間變化電磁力。
5. 權(quán)利要求l中的方法，其中將細(xì)胞擴(kuò)增至放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的數(shù) 目的至少七倍。
6. 權(quán)利要求l中的方法，其中細(xì)胞選自下組的一種或多種真核細(xì)胞、 原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、功能異常細(xì)胞、含毫微粒的細(xì) 胞、雜合細(xì)胞、含改變的病毒的細(xì)胞雜合體。
7. 權(quán)利要求2中的方法，其中細(xì)胞選自下組的一種或多種真核細(xì)胞、 原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、功能異常細(xì)胞、含毫微粒的細(xì) 胞、雜合細(xì)胞、含改變的病毒的細(xì)胞雜合體。
8. 權(quán)利要求4中的方法，其中細(xì)胞選自下組的一種或多種真核細(xì)胞、 原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、功能異常細(xì)胞、含毫微粒的細(xì) 胞、雜合細(xì)胞、含改變的病毒的細(xì)胞雜合體。
9. 權(quán)利要求6中的方法，其中動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物成體干細(xì)胞。
10. 權(quán)利要求7中的方法，其中動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物成體干細(xì)胞。
11. 權(quán)利要求8中的方法，其中動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物成體干細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求1中的方法，其中測(cè)試用于下組的至少一種移植質(zhì)量、 毒性、功效、病理學(xué)、致腫瘤性、遺傳表達(dá)、核型、生長率特性、多細(xì)胞形 態(tài)學(xué)、個(gè)體細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞間關(guān)系、代謝計(jì)量、病毒生命周期的部分、利 尿性能、腎毒性、血壓控制以及毫微粒功能。
13. 權(quán)利要求1中的方法，其中生物活性化合物是選自下組的一種或多 種形式粉末、液體、蒸汽和氣體。
14. 權(quán)利要求l中的方法，其中生物活性化合物是選自下組的至少一種 蛋白、至少一種細(xì)胞、毒素、試劑、化學(xué)品、氣體、金屬、金屬復(fù)合材料、 輻射、至少一種毫微粒、至少一種病毒、蛋白質(zhì)、抗菌劑、電穿孔、化學(xué)穿 孔、免疫細(xì)胞的活化的衍生物和水。
15. 權(quán)利要求9中的方法，其中測(cè)試用于表征選自下組的至少一種機(jī)理 藥理學(xué)調(diào)節(jié)干細(xì)胞更新、改變干細(xì)胞更新、校正干細(xì)胞更新、藥理學(xué)調(diào)節(jié)干 細(xì)胞分化、改變干細(xì)胞分化和校正干細(xì)胞分化。
16. 權(quán)利要求10中的方法，其中測(cè)試用于表征選自下組的至少一種機(jī)理 藥理學(xué)調(diào)節(jié)千細(xì)胞更新、改變干細(xì)胞更新、校正干細(xì)胞更新、藥理學(xué)調(diào)節(jié)干 細(xì)胞分化、改變干細(xì)胞分化和校正干細(xì)胞分化。
17. 權(quán)利要求ll中的方法，其中測(cè)試用于表征選自下組的至少一種機(jī)理 藥理學(xué)調(diào)節(jié)干細(xì)胞更新、改變干細(xì)胞更新、校正干細(xì)胞更新、藥理學(xué)調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化、改變干細(xì)胞分化和校正干細(xì)胞分化。
18. 權(quán)利要求1中的方法，其中可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以約1轉(zhuǎn)每分鐘至約 120轉(zhuǎn)每分鐘的速率旋轉(zhuǎn)。
19. 權(quán)利要求1中的方法，其中可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以約2轉(zhuǎn)每分鐘到約 30轉(zhuǎn)每分鐘的速率旋轉(zhuǎn)。
20. 權(quán)利要求1中的方法，其中可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以約IO轉(zhuǎn)每分鐘到約 30轉(zhuǎn)每分鐘的速率旋轉(zhuǎn)。
21. 權(quán)利要求1中的方法，其中在可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟前引入生物活 性化合物。
22. 權(quán)利要求1中的方法，其中在可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟過程中引入生物活性化合物。
23. 權(quán)利要求1中的方法，其中在將細(xì)胞混合物放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 之前測(cè)試生物成分。
24. 權(quán)利要求1中的方法，其中在可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟過程中測(cè)試生 物成分。
25. 權(quán)利要求1中的方法，其中在可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟之后測(cè)試生物 成分。
26. 權(quán)利要求1中的方法，其中在可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟過程中和之后 測(cè)i式生物成分。
27. 權(quán)利要求1中的方法，其中在可控地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的步驟之前、過程中 和之后測(cè)i式生物成分。
28. 權(quán)利要求1中的方法，其進(jìn)一步包括使用生物成分用于哺乳動(dòng)物組 織移植物植入。
全文摘要
表征生物活性化合物的方法，通過將細(xì)胞混合物放入可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器，以開始包含生物成分和至少一個(gè)細(xì)胞的三維培養(yǎng)，可控地?cái)U(kuò)增可旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞并且測(cè)試生物成分以確定生物活性化合物的特性。本發(fā)明也可以優(yōu)選地包含將細(xì)胞暴露于時(shí)間變化電磁力中。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101415816SQ200780012037
公開日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2007年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月2日
發(fā)明者唐尼·拉德, 戴維·沃爾夫 申請(qǐng)人:雷格內(nèi)泰克公司