專利名稱：：大豆異戊烯基轉移酶基因及其使用方法大豆異戊烯基轉移酶基因及其使用方法發(fā)明領域本發(fā)明涉及植物基因操作領域，特別是調控基因活性以影響植物發(fā)育和生長的領域。
背景技術：
：細胞分裂素是一類]^取代的噪呤衍生植物激素，調控細胞分裂及影響多種發(fā)育事件，例如枝條發(fā)育、庫強、根的分支、枝條頂端優(yōu)勢的控制、葉發(fā)育、葉綠體發(fā)育和葉衰老(Mok等，(1994)C>toA:/m>w.C7iem&^y,爿ch'owawe/_Fwwcriow.CRCPress,BocaRaton,FLA,155-166頁；Horgan(1984)爿dvawceof尸/awfMB.編4辱，Pitman,London,UK,53-75頁；和Letham(1994)^wwwa/iev/ewo/尸/a"Z/Vz>w.o/^:163-197)。在玉米中，細胞分裂素(CK)在不利的環(huán)境條件當中對確定種子大小、降低頂部谷仁敗育和增加結實起重要作用(Cheikh等,(1994)尸/a"f尸/2jw.。/.106:45-51;Dietrich等，(1995)戶/a"f尸/zyw'o/所oc/^m33:327-36)。活性細胞分裂素庫(pool)由合成和降解的速度調節(jié)。直到最近，人們都認為根是細胞分裂素生物合成的主要部位，但也有證據表明其它組織，例如枝條分生組織和發(fā)育中的種子，也具有高的細胞分裂素生物合成活性。業(yè)已表明，細胞分裂素在細胞增殖活躍的限定部位合成。在擬南芥04ra6/血，戸/力中存在的幾種A/Pr基因及其差異表達模式可用于此目的。催化酶異戊烯基轉移酶(IPT)指導細胞分裂素的合成，并在控制植物組織中的細胞分裂素水平方面起重要作用。已提出了細胞分裂素生物合成的多個途徑。由于某些tRNA分子在鄰近反密碼子的位點處含有異戊烯基腺苷(iPA)殘基，所以已提出轉運RNA的降解為細胞分裂素的來源(Swaminathan等，(1977)Aoc/^/m's^y16:1355-1360)。修飾是由tRNA異戊烯基轉移酶(tRNAIPT;EC2.5.1.8)催化的，該酶已在諸^!口大腸^干菌(Esc/^n,c/2/aco//)、酉良酒酵母(Sacc/7c^omjKC&scereWw'ae)、p耆酸乳4干菌(丄acto6a"7/i^ac/(3b//H7us)、人(Z/omosa//era)和玉米(Zea等多種生物中被鑒定(Bartz等，(1972)腸c/z歷'e54:31-39;Kline等，(1969)5/oc/zew&^y8:4361-4371;Holtz等，(1975)//op/e-^S^/e,sZ尸/z;w'o/.C&m356:1459-1464;Golovko等，(2000)258:85-93;和Holtz等，(1979)//op;e-5^/^^Z.尸/z;wW.359:89-101)。然而，該途徑并不被認為是細胞分裂素合成的主要途徑(Chen等，(1997)尸—。/尸te101:665-673和McGmw等，(1995)尸/""f//or歸腦，尸/z戸'o/ogy,5/oc/zew/s吵朋dMo/ecw/or所o/ogy.Davies編輯，98-117,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht)。形成細胞分裂素的另一個可能途徑是以二曱基烯丙基二磷酸(DMAPP)、AMP、ATP和ADP作為底物通過腺苷酸異戊烯基轉移酶(IPT;EC2.5.1.27)從頭生物合成iPMP。我們目前關于植物中細胞分裂素生物合成的知識主要是由對根瘤土壤桿菌C4gn^acfen'wwrt^e/ac/era)中可能的類似系統(tǒng)的研究推斷而來。根瘤土壤桿菌(A^we/ac/e""細胞能夠通過在宿主植物組織中誘導瘤形成而感染某些植物種類(VanMontagu等，(1982)C鮮7b;McroWo/7w聽"o/96:237-254;Hansen等，(1999)CwrTopM/cra&o//mww"o/240:21-57)。為實現此目的，根瘤土壤桿菌細胞合成并分泌介導正常宿主植物組織轉化為瘤或愈傷組織的細胞分裂素。含有編碼細胞分裂素生物合成所必需的酶和調節(jié)物的基因的根瘤土壤桿菌瘤誘導質粒促進該過程。生物化學和遺傳學研究揭示，瘤誘導質粒的基因4編碼異戊烯基轉移酶(IPT)，該酶將AMP和DMAPP轉變?yōu)榧毎至阉氐幕钚孕问揭划愇煜┗佘?5'-—磷酸(iPMP)(Akiyoshi等，(1984)/VocA^/.JcW.tAS^81:5994-5998)。已表明土壤桿菌ipt基因在多種轉基因植物中的過量表達在宿主植物中引起細胞分裂素水平提高，并引發(fā)典型的細胞分裂素應答(Hansen等，(1999)CWr7b/M/cra&o//mww"o/240:21-57)。因此，已推定植物細胞使用與根瘤土壤桿菌細胞類似的機器進行細胞分裂素生物合成。最近已在擬南芥和矮牽牛中鑒定出擬南芥IPT同源物(Takei等，(2001)/所o/.C/^m.276:26405-26410和Kakimoto，(2001)P/aWCW/尸/z;w'o/.42:677-685)。擬南芥IPT同源物在植物中的過量表達提高了細胞分裂素水平，并在植物體內(/wp/朋to)和組織培養(yǎng)條件下引發(fā)典型的細胞分裂素應答(Kakimoto，(2001)P/"WCW//Vzp/o/.42:677-685)。擬南芥ipt基因是9個不同基因的小型多基因家族的成員，其中2個編碼tRNA異戊烯基轉移酶，7個編碼具有細胞分裂素生物合成功能的基因產物。重組AtlPT4蛋白的生物化學分析表明，與細菌的酶相反，擬南芥的酶利用ATP而不是AMP作為底物。使用活化標記策略，在矮牽牛(尸&w"/a/^6W&)中鑒定出另一個植物/尸r基因(幼o)(Zubko等，(2002)7TzeP/""fJowma/29:797-808)。鑒于細胞分裂素對包括根結構、枝條和葉的發(fā)育以及結實在內的多種植物發(fā)育過程的影響，在高等植物細胞中操作細胞分裂素水平并由此強烈影響植物生長和生產率的能力提供了重要的商業(yè)價值(Mok等,(1994)C>YoA:/m>w.CTzem/W^,爿crio"awt/CRCPress,BocaRaton，FL,155-166頁)。發(fā)明概述本發(fā)明的組合物和方法包含并使用參與調控植物發(fā)育、形態(tài)和生理的異戊烯基轉移酶(IPT)多肽和多核苷酸。組合物還包含具有本發(fā)明的IPT序列的表達盒、植物、植物細胞和種子。相對于未經本發(fā)明修飾的植物、植物細胞或種子，本發(fā)明的植物、植物細胞和種子可表現出表型改變，例如被調控的(提高的或降低的)細胞分裂素水平；被調控的花發(fā)育；被調控的根發(fā)育；改變的莖根比；增加的種子大小或增加的種子重量；增加的植物產量或植物生長勢；維持或改善的脅迫耐受性(例如，增加或維持的植物大小、減至最低的種子或莢果敗育、增加或維持的結實)；降低的枝條生長；延遲衰老或增強的營養(yǎng)生長。提供降低或去除植物中的IPT多肽活性的方法，該方法包括將選定的多核苷酸導入植物中。在具體的方法中，提供的多核苷酸降低植物中的細胞分裂素水平和/或調控植物的根發(fā)育。還提供提高植物中的IPT多肽水平的方法，該方法包括將選定的多核苷酸導入植物中。在具體的方法中，IPT多核苷酸的表達提高植物中的細胞分裂素水平；維持或改善植物的脅迫耐受性；維持或增加植物大??；將種子敗育減至最低；增加或維持結實；增加枝條生長；增加種子大小或種子重量；增加植物產量或植物生長勢；調控花發(fā)育；延遲衰老或增加葉生長。附圖簡述圖1提供了ZmlPT2(SEQIDNO:8)、GmIPTl(SEQIDNO:2)、GmlPT2(SEQIDNO:4)和GmlPT3(SEQIDNO:7)的氨基酸序列比對。星號表示在多個IPT蛋白中保守的氨基酸，得到的IPT共有序列在比對之下說明。tRNAIPT的基序特征見GmlPT3。圖2提供了GmIPTl、GmlPT2、GmlPT3、ZmlPT2和擬南芥IPT1-IPT9的同一性百分率數值和相似性百分率數值。圖3是顯示多種大豆組織中的GmIPTl(圖A)和GmlPT2(圖B)的相對表達水平的RNA印跡。圖4是植物IPT序列的系統(tǒng)樹。GmIPT1和GmlPT2與其它植物IPT蛋白聚類，而GmlPT3與為tRNAIPT的AtlPT2聚類。序列表簡述SEQIDNO:1和2提供了GmIPTl的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:3和4提供了GmlPT2的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:5提供了初始鑒定的GmlPT2EST的完整插入片段序列。SEQIDNO:6和7提供了GmlPT3的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:8提供了ZmlPT2氨基酸序列。SEQIDNO:9為共有IPT序列。SEQIDNO:10-13為用于BAC篩選的引物序列。SEQIDNO:14-16為用于表達譜分析的標簽。發(fā)明詳述現在，下文將參考附圖更全面地描述本發(fā)明，其中給出了本發(fā)明的一部分而不是全部的實施方案。實際上，本發(fā)明可以許多不同形式具體化，不應被理解為限于本文所記載的實施方案；相反，提供這些實施方案是為了使本文公開內容滿足適用的法律規(guī)定。在全文中同樣的數字是指同樣的元素。此處所列的本發(fā)明的多種修改和其它實施方案將提示本發(fā)明所屬領域的技術人員由前述說明和相關附圖所示教導獲益。因此，應該理解，本發(fā)明不受所公開的具體實施方案限制，修改與其它實施方案擬包含在隨附權利要求的范圍內。盡管本文使用了特定術語，但僅以通用的和描述性的含義使用它們，而不是為了進行限定。組合物本發(fā)明的組合物包括參與調控植物發(fā)育、形態(tài)和生理的異戊烯基轉移酶(IPT)多肽和多核苦酸。具體地說，本發(fā)明提供包含編碼SEQIDNO:2、4和7所示的氨基酸序列的核苷酸序列的分離多核苷酸。還提供具有由本文所述多核苷酸(例如在SEQIDNO:1、3和6中所示的那些多核苷酸)編碼的氨基酸序列的分離多肽。本發(fā)明的異戊烯基轉移酶多肽與異戊烯基轉移酶蛋白家族成員共享序列同一性。已在多種細菌以及擬南芥和矮牽牛中鑒定出IPT家族中的多肽。參見例如Kakimoto,(2001)尸/"WCe〃42:677-658;Takei等，(2001)777eJow謹/。/B油g/ca/C/z函'勿276:26405-26410和Zubko等，(2002)77zeP/a"fJowr"a/29:797-808。IPT家族成員的特征在于具有共有序列GxTxxGK[ST]xxxxx[VLI]xxxxxxx[VLI][VLI]xxDxxQx{57，60}[VLI][VLI]xGG[ST](SEQIDNO:9)(其中x表示任意氨基酸殘基，[]表示在[]中顯示的任一個氨基酸，x(m，n)表示編號m-n的氨基酸殘基)。參見Kakimoto等，(2001)尸/a"fCe〃尸/^w'o/.42.'677-85和Kakimoto等，(2003)/P/"Wias.116:233-9，這兩個文獻均通過引用結合到本文中。IPT家族成員還可以具有ATP/GTP結合位點。圖l提供了玉米IPT2蛋白和本發(fā)明的大豆(G7少c/"emox)細胞分裂素生物合成酶的氨基酸比對。星號表示在多種細胞分裂素生物合成酶中發(fā)現的共有序列。除了此共有序列之外，還在GmlPT3中鑒定出tRNA結合位點，這4是示該基因編碼tRNAIPT酶。異戊烯基轉移酶參與細胞分裂素生物合成，因此本發(fā)明的IPT多肽具有"細胞分裂素合成活性"。所述"細胞分裂素合成活性"是指產生細胞分裂素、其衍生物或細胞分裂素合成途徑中的任何中間體的預期酶活性。因此，細胞分裂素合成活性包括但不限于DMAPP:AMP異戊烯基轉移酶活性(將AMP(腺苷-5'-—磷酸)和DMAPP轉變?yōu)閕PMP(異戊烯基腺苷-5'-—磷酸))、DMAPP:ADP異戊烯基轉移酶活性(將ADP(腺苷-5'-二磷酸)和DMAPP轉變?yōu)閕PDP(異戊烯基腺苷-5'-二磷酸))、DMAPP:ATP異戊烯基轉移酶活性(將ATP(腺苷-5'-三磷酸)和DMAPP轉變?yōu)閕PTP(異戊烯基腺苷-5'-三磷酸))，以及DMAPP:tRNA異戊烯基轉移酶活性(修飾胞質、葉綠體和/或線粒體tRNA,以得到異戊烯基)。細胞分裂素合成活性還可以包括含有次級側鏈前體的底物，只是DMAPP除外。側鏈供體的實例包括碎類來源的化合物。例如，底物可以是羥曱基丁烯基二磷酸(HMBPP),它應允許進行反式玉米素核苷一磷酸(ZMP)的合成。參見例如Astot等，(2000)尸97:14778-14783和Takei等，(2003)JT/a"fA仏116(3):265國9。細胞分裂素合成活性還包括參與ZMP形成的中間體的合成。測定各種細胞分裂素及其中間體產生的方法例如可參見Takei等(2001)77^/o訓a/o/S/o/og/ca/C/2纖勿276:26405-26410，Zubo等，(2002)T7ze尸/朋fJo訓a/29.797-808;Kakimoto等，(2001)P/a"fCe〃尸/z拜'。.42:677-658和Sun等，(2003)Ha"f尸/^w'o/ogy131:167-176,各文獻均通過引用結合到本文中。"細胞分裂素合成活性"還包括以細胞分裂素濃度增加為特征的任何植物或植物細胞表型變化。這些細胞分裂素特異性作用在本文另外一處有討論，包括但不限于增強枝條形成、降低頂端優(yōu)勢、延遲衰老、延遲開花、增強葉生長、提高植物中的細胞分裂素水平、增強脅迫下的耐受性、將莢果和/或種子敗育降至最低、在脅迫條件下增加或維持結實以及降低根生長。測量或檢測這些表型的測定法是已知的。參見例如Miyawaki等，(2004)T7ze尸/a"f/om/77<3/37:128-138，Takei等，(2001)77zeJow謂/o/Wo/og/ca/C7z謹勿276:26405-26410，Zubo等，(2002)772e尸teJow濯/29:797-808;Kakimoto等，(2001)P/a"fCe〃42:677-658和Sun等，(2003)尸/a"尸/^/o/ogv131:167-176，各文獻均通過引用結合到本文中。本文討論了由于植物中的細胞分裂素合成活性增加而產生的其它表型。本發(fā)明的組合物包括參與細胞分裂素生物合成的IPT序列。具體地說，本發(fā)明提供包含編碼SEQIDNO:2、4和7所示氨基酸序列的核苷酸序列的分離多核苷酸。還提供具有由本文所述多核苷酸(例如在SEQIDNO:1、3和6中所示的那些多核苷酸)及其片段和變體編碼的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明包括分離的或基本純化的多核苷酸或蛋白質組合物。"分離"或"純化，，的多核苷酸或蛋白質或其生物活性部分，基本上或實質上不含通常與在其天然環(huán)境中存在的多核苷酸或蛋白質伴隨或相互作用的組分。因此，當通過重組技術生產時，分離或純化的多核苷酸或蛋白質基本上不含其它細胞材料或培養(yǎng)基，或者當化學合成時基本上不含化學前體或其它化學品。"分離"的多核苷酸最好不含在該多核苷酸所來源的生物的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的序列(即位于該多核苷酸的5'和3'末端的序列)(最好為蛋白編碼序列)。例如，在不同的實施方案中，分離的多核苷酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的以下核苷酸序列其在該多核苷酸所來源的細胞的基因組DNA中天然側接該多核苦酸?；旧喜缓毎牧系牡鞍踪|包括具有大約少于30%、20%、10%、5%或1%(以干重計)污染蛋白的蛋白制品。當本發(fā)明的蛋白或其生物活性部分為重組產生時，培養(yǎng)基中最好提供大約少于30%、20%、10%、5%或1%(以干重計)的化學前體或非目標蛋白化學品。本發(fā)明也包括所公開的多核苷酸和由此編碼的蛋白的片段和變體。所述"片段，，是指部分多核苷酸或部分氨基酸序列及由此編碼的蛋白。多核苷酸片段可編碼保留天然蛋白的生物活性并因此具有細胞分裂素合成活性的蛋白片段?；蛘撸米麟s交探針的多核苷酸片段通常不編碼保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列片段的范圍可為至少約20個核苦酸、約50個核苦酸、約100個核苷酸，直到編碼本發(fā)明蛋白的全長多核苷酸。編碼本發(fā)明的IPT蛋白的生物活性部分的IPT多核苷酸片段編碼至少15、25、30、50、100、150、200、225、250、275、300、310、315或320個連續(xù)氨基酸，或直到本發(fā)明的全長IPT蛋白中存在的氨基酸總數(例如SEQIDNO:2和4的340個氨基酸；SEQIDNO:7的480個氨基酸)。用作雜交探針或PCR引物的IPT多核苷酸片段通常不需要編碼IPT蛋白的生物活性部分。因此，IPT多核苦酸片段可以編碼IPT蛋白的生物活性部分，或者其可以為使用以下公開的方法可用作雜交探針或PCR引物的片段。IPT蛋白的生物活性部分可如下制備分離本發(fā)明的其中一個IPT多核苷酸的一部分，表達IPT蛋白的編碼部分(例如通過體外重組表達)，并評價IPT蛋白編碼部分的活性。為IPT核苷酸序列片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、卯0、950或965個連續(xù)核苷酸，或者直到本文所公開的全長IPT多核苷酸中存在的核苷酸數(例如對于SEQIDNO:l、3和6分別為1023、1409和1592個核苷酸)。"變體"是指基本上相似的序列。對于多核苷酸而言，變體是在天然多核苷酸中的一個或多個位點包含一個或多個核苷酸的缺失和/或添加的變體，和/或在天然多核苷酸中的一個或多個位點包含一個或多個核苷酸的取代的變體。本文所用的"天然"多核苷酸或多肽分別含有天然的核苷酸序列或氨基酸序列。對于多核苷酸而言，保守變體包括那些由于遺傳密碼簡并性而編碼本發(fā)明的其中一個IPT多肽的氨基酸序列的序列。諸如這些的天然變體可使用眾所周知的分子生物學技術進行鑒定，例如采用下文概述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術。變異多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如通過例如^f吏用定點誘變產生的但仍編碼本發(fā)明的IPT蛋白的那些多核苷酸。一般來說，通過本文另外一處描述的序列比對程序和參數測定，本發(fā)明的特定多核苷酸的變體與特定多核苷酸具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75°/。、80%、85%、90%、91%、92。/。、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。本發(fā)明的特定多核苷酸(即參比多核苷酸)的變體還可以通過比較變異多核苷酸編碼的多肽與參比多核苷酸編碼的多肽之間的序列同一性百分率來評價。因此，例如，公開了編碼與SEQIDNO:2、4或7的多肽具有給定序列同一性百分率的多肽的分離多核苷酸?？衫帽疚牧硗庖惶幟枋龅男蛄斜葘Τ绦蚝蛥祦碛嬎闳我鈨蓚€多肽之間的序列同一性百分率。對于任意給定的本發(fā)明多核苷酸對，在通過比較它們編碼的兩個多肽所共享的序列同一性百分率來評價它們時，兩個編碼多肽之間的序列同一性百分率至少約為40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、900/。、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97。/。、98%、99%以上的序列同一性。"變體"蛋白是指通過在天然蛋白中的一個或多個位點缺失或添加一個或多個氨基酸和/或在天然蛋白中的一個或多個位點具有一個或多個氨基酸取代而從天然蛋白衍生而來的蛋白。本發(fā)明包含的某些變體蛋白是有生物活性的，也就是說它們仍具有所需的天然蛋白生物活性，即如本文所述的細胞分裂素合成活性。這些變體可由例如遺傳多態(tài)性或人工操作獲得。通過本文另外一處所述的序列比對程序和參數測定，本發(fā)明的天然IPT蛋白的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序列具有至少約40%、45。/。、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、980/0、99%以上的序列同一性。本發(fā)明蛋白的生物活性變體與該蛋白的差異可少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個、例如6-10個氛基酸殘基，少至5個氨基酸殘基，少至4個、3個、2個乃至1個氨基酸殘基。本發(fā)明的蛋白可通過包括氨基酸取代、缺失、截短和插入在內的多種方法改變。用于這些操作的方法一般是本領域已知的。例如，IPT蛋白的氨基酸序列變體和片段可通過DNA突變來制備。用于誘變和多核苷酸改變的方法在本領域眾所周知。參見例如Kunkel(1985)淑/.爿cW.5W.園82:488-492;Kunkel等，(1987)MeAoA五"狎o/.154:367-382;美國專利第4,873,192號;Walker和Gaastra編輯，(1983)rec/zm々wesMo/ecw/oT(MacMillanPublishingCompany,NewYork),及其中引用的參考文獻。關于不影響目標蛋白生物活性的適宜氨基酸取代的指導可參見Dayhoff等，(1978)A/asSe^e"ceawd5Vn/"we(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的才莫型，該文獻通過引用結合到本文中。保守取代可能最佳，例如一個氨基酸被另一個具有類似特性的氨基酸替換。因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸既包括天然序列，也包括突變形式。同樣，本發(fā)明的蛋白包括天然蛋白及其變體和修飾形式。這些變體仍具有所需的IPT活性。顯然，在編碼變體的DNA中產生的突變一定不能使序列處于讀框之外，且最好不能形成可產生二級mRNA結構的互補區(qū)。預期本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不會產生蛋白特征的徹底改變。不過，在難以提前預測取代、缺失或插入的確切作用時，本領域技術人員會認識到，可通過常規(guī)篩選測定來評價這些作用。也就是說，可通過測定細胞分裂素合成活性評價該活性。參見例如Takei等，(2001)77zeJowma/o/5z.o/og/ca/C/zem&^y276:26405-26410;Zubo等，(2002)77ze尸/a"fJowr"a/29:797-808;Kakimoto等，(2001)戶/""fCW/尸/^Wo.42:677-658;Sun等，(2003)P/a"f尸/z;w,o/ogy131:167-176和Miyawaki等，(2004)7TzeP/a"fJowtw/37:128-138，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。變異的多核苷酸和蛋白還包含來源于諸如DNA改組的突變和重組方法的序列和蛋白。采用該方法，可對一個或多個不同的IPT編碼序列進行操作，以得到具有需要特性的新IPT多肽。以此方式可從相關序列多核苷酸群產生重組多核苷酸文庫，所述多核苷酸群含有的序列區(qū)具有顯著的序列同一性，并可在體外或體內同源重組。例如，使用該方法，編碼目標結構域的序列基序可在本發(fā)明的IPT基因和其它已知的IPT基因之間改組，以獲得編碼具有改進的目標特性(例如就酶而言增加的Km)的蛋白的新基因。這種DNA改組的策略在本領域是已知的。參見例如Stemmer(1994)尸rac.Ato/.爿cadL/iSJ91:10747-10751;Stemmer(1994)A^we370:389-391;Cmmeri等，(1997)A^w^5/ofec/7.15:436-438;Moore等，(1997)/Mo/.B/o/.272:336-347;Zhang等，(7卯7」尸rac.iV加/.Jcad94:4504-4509;Crameri等，(1998)A^wre391:288-291;PCT公布WO97/20078;和美國專利第5,605,793和5,837,458號。所述"啟動子"是指DNA的調節(jié)區(qū)，通常包括能夠指導RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的合適轉錄起始位點啟動RNA合成的TATA盒。啟動子可另外包含其它識別序列，它們通常位于TATA盒的上游或5',稱為上游啟動子元件，其影響轉錄起始速率。本發(fā)明的啟動子序列調節(jié)(即抑制或活化)轉錄。本發(fā)明的多核苷酸可用于從其它生物、特別是其它植物、更特別地是其它單子葉植物分離出相應序列。以此方式，可使用諸如PCR、雜交等方法，基于其與本文所列出序列的序列同源性對這些序列進行鑒定。本發(fā)明包括基于其與本文所列出的完整IPT序列或其變體和片段的序列同一性而分離出來的序列。這些序列包括為所公開序列的直系同源物的序列。"直系同源物"是指來源于共同祖先基因的基因，作為物種形成的結果而存在于不同物種中。當存在于不同物種中的基因的核苷酸序列和/或其編碼的蛋白序列共享至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性時，這些基因被認為是直系同源物。直系同源物的功能在種間通常是高度保守的。因此，本發(fā)明包括編碼IPT蛋白交的分離多核苷酸。在PCR方法中，可設計寡核香酸引物用于PCR反應，以由從任何目標植物提取的cDNA或基因組DNA擴增相應的DNA序列。設計PCR引物和PCR克隆的方法一般是本領域已知的，公開于Sambrook等，(1989)Mo/ecw/arC7om'"gv爿丄"6orato/^Mawwa/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。另參見Innis等纟扁壽尋，(1990)PC7iVotoco/s..爿Gw/fifetoA/^/zo(isa"d^pp/Zcaf/ows(AcademicPress,NewYork);I皿is和Gelfand編輯，(1995)戶Ci5^她g7'es(AcademicPress,NewYork);以及Innis和Gelfand編輯,(1999)尸CTA^AocfeTWawwa/(AcademicPress,NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用配對引物、嵌套引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。在雜交技術中，使用全部或部分的已知多核苷酸作為與存在于所選生物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組或cDNA文庫)中的其它相應多核苷酸選擇性雜交的探針。雜交探針可以為基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可用諸如32P的可才企測基團或任何其它可^r測標記物標記。因此，例如，可通過標記基于本發(fā)明的IPT多核苷酸的合成寡核苷酸來制備雜交探針。制備雜交探針以及構建cDNA和基因組文庫的方法是本領域公知的，公開于Sambrook等,(1989)Mo/ecw/arC7ow/"g:」丄a60rato7Mawwa/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。例如，本文^^開的完整IPT多核香酸或其一個或多個部分可以用作能夠與相應IPT多核苷酸特異性雜交的探針。為了在多種條件下實現特異性雜交，這些探針包括在IPT多核苷酸序列中的獨特序列，其優(yōu)選長度為至少約10個核苷酸，最優(yōu)選長度為至少約20個核苷酸。這些探針可用于通過PCR擴增選定植物的相應IPT多核苷酸。該技術可用于從需要的植物中分離另外的編碼序列，或作為診斷測定來確定植物中編碼序列的存在情況。雜交技術包括平板DNA文庫(或者為噬菌斑或者為菌落；參見例如Sambrook等，(1989)Mo/ecw/arC7om'"g:」Z/a6orato^yA/awwa/(第2片反,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork))的雜交篩選。這些序列的雜交可以在嚴格條件下進行。所述"嚴格條件"或"嚴格雜交條件"是指探針與其靶標序列的雜交程度在檢測上高于與其它序列的雜交程度的條件(例如至少為背景的2倍)。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境下將有差異。通過控制雜交嚴格性和/或洗滌條件，可鑒定出與探針100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可調整嚴格條件，以允許在序列中存在某些錯配，以便檢測較低程度的相似性(異源探測)。一般來說，探針長度少于約1000個核苷酸，最好長度少于約500個核苷酸。典型地，嚴格條件是指這樣的條件其中鹽濃度小于約1.5MNa離子，典型地為約0.01-1.0MNa鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3，溫度對短探針(例如10-50個核苷酸)為至少約30°C,而對長纟罙針(例如大于50個核苷酸)為至少約6CTC。嚴格條件還可以通過加入諸如曱酰胺的去穩(wěn)定劑來實現。示例性的低嚴格條件包括用含30-35%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基碌u酸鈉)的緩沖液于37。C雜交，并用IX~2XSSC(20XSSC-3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)于50-55。C洗滌。示例性的中等嚴格條件包括用40-45%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS于37。C雜交，并用0.5X1XSSC于55-60。C洗滌。示例性的高嚴格條件包括用50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS于37。C雜交，并用0.1XSSC于60-65。C洗滌。任選地，洗滌緩沖液可包含約0.1%至約1%SDS。雜交持續(xù)時間一般短于約24小時，通常為約4小時至約12小時。洗滌持續(xù)時間至少為足以達到平衡的時間長度。特異性通常隨雜交后洗滌而變，關鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對DNA-DNA雜合體而言，Tm可運用Meinkoth和Wahl(1984)Aoc/jem.138:267-284的等式Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%曱酰胺)-500/L來估算；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，°/。GC為DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，°/0曱酰胺為雜交溶液中的甲酰胺百分比，L為雜合體的堿基對長度。Tm是指50%互補靶標序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH下)。每有1%錯配，Tm就降低約rC;因此，可調整Tm、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。例如，如果要尋找290%同一性的序列，則可將Tm降低10。C。通常，在確定的離子強度和pH下，選擇比特定序列與其互補序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5。C的嚴格條件。但是，非常嚴格的條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低1。C、2'C、3。C或4'C的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低6。C、7°C、8°C、9"C或10。C的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可使用在比熱解鏈溫度(Tm)低11°C、12°C、13°C、14°C、15。C或20。C的雜交和/或洗滌。一般技術人員會理解，使用該等式、雜交和洗滌組成及所需Tm,固有地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴格性變化。如果所需錯配程度使Tm低于45°C(水溶液)或32°C(曱酰胺溶液)，則最好增加SSC濃度，以便可使用較高的溫度。核酸雜交的廣泛指引參見Tijssen(1993)丄a6orato/17rec/z"/《w^s/"5/oc/zem&^yA/b/ecw/ar~/^nVfe加'oww欣iVwc/e/c爿"V/尸ra6as，第I邢,第2章，(Elsevier,NewYork)和Ausubel等編輯,(1995)Cwre"f/Votoco/sMo/ecw/ar第2章,(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)。參見Sambrook等,(1989)Mo/ecw/arC7ow'"g:爿Z^orato/^Ma"wa/(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。以下術語用于描述兩個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關系(a)"參比序列"，(b)"比較窗"，(c)"序列同一性"，和(d)"序列同一性百分率"。(a)本文所用的"參比序列"是用作序列比較基礎的確定序列。參比序列可以是特定序列的一部分或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的區(qū)段，或者完整的cDNA或基因序列。(b)本文所用的"比較窗"是指多核苷酸序列的連續(xù)和特定區(qū)段，其中比較窗中的多核苷酸序列與參比序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以對兩個多核苷酸進行最優(yōu)比對。通常，比較窗長度為至少20個連續(xù)核苷酸，任選地可為30個、40個、50個、100個或更長。本領域技術人員應理解，為避免由于在多核苷酸序列中含有空位而與參比序列具有高相似性，通常引入空位罰分，并由匹配凄t中扣除。用于比較的序列比對方法在本領域眾所周知。因此，可使用數學算法完成任兩個序列之間的序列同一性百分率測定。這些數學算法的非限制性實例為Myers和Miller,(1988)C4j5/OS4:11-17的算法；Smith等，(1981)Asfv.Ma仇2:482的局部比對算法；Needleman和Wunsch,(1970)/Mo/.48:443-453的全局比對算法Pearson和Lipman,(1988)iVoc.A^/.Jc^/.85:2444-2448的局部檢索比對算法Karlin和Altschul，(1990)A^/.Jcad5W.OS^872264的算法，由Karlin和Altschul,(1993)iVoc.A^/.Jcadt/SJ90:5873-5877修改。這些數學算法的計算機實現可用于序列比較，以確定序列同一性。這些實現包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可從Intelligenetics,MountainView,California獲得)；ALIGN程序(版本2.0)及GCGWisconsinGenetics軟件包第10版中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可/人AccelrysInc.，9685ScrantonRoad,SanDiego，California,USA獲得)。使用這些程序的比對可使用默認參數進行。CLUSTAL程序充分描述于Higgins等(1988)73:237-244(1988);Higgins等，(1989)5:151-153;Corpet等，(1988)iVwc/ez.c爿"Ai仏16:10881-卯；Huang等，(1992)8:155-65和Pearson等，(1994)Me仇Mo/.歷o/.24:307-331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller,(1988)的算法。當用ALIGN程序比較氨基^列時，可使用PAM120加權殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。Altschul等，(1990)7Mo/.215:403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul，(19卯)的算法。BLAST核苷酸檢索可用BLASTN程序進行，記分=100，字長=12,以獲得與編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可用BLASTX程序進行，記分=50，字長=3，以獲得與本發(fā)明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有空位比對，可如Altschul等，(1997)MWe/c爿c/^s25:3389所述使用GappedBLAST(在BLAST2.0中)?；蛘撸墒褂肞SI-BLAST(在BLAST2.0中)進行迭代檢索來檢測分子間遠緣關系。參見上述Altschul等，(1997)。當使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST時，可使用各自程序的默認參數(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通過檢查人工進行比對。除非另有說明，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用第10版GAP并使用以下參數獲得的值核普酸序列的°/。同一性和％相似性使用空位加權50、長度加權3和nwsgapdna.cmp打分矩陣氨基酸序列的％同一性和％相似性使用空位加權8、長度加權2和BLOSUM62打分矩陣。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)/Mo/.說o/.48:443-453的算法來尋找使匹配數最大并使空位數最小的兩個全序列的比對。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并建立具有最大匹配堿基數和最少空位數的比對。它允許在匹配堿基單元中提供空位S1入罰分和空位延伸罰分。GAP必須使匹配空位引入罰分數對其插入的每個空位有利。如果選擇的空位延伸罰分大于O,則GAP必須還使空位長度乘以空位延伸罰分對插入的每個空位有利。在GCGWisconsinGenetics軟件包第IO版中，默認的空位引入罰分值和空位延伸罰分值對蛋白序列分別為8和2。對于核苷酸序列，默認的空位引入罰分為50，而默認的空位延伸罰分為3?？瘴灰牒涂瘴谎由炝P分可以選自0-200的整數表示。因此，例如空位引入和空位延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65以上。GAP代表了最好的序列比對家族的一員。該家族可能有很多成員，但其它成員都不具有更好的質量。GAP表現出四個方面的序列比對優(yōu)勢質量、比值、同一性和相似性。質量是為了比對序列而最大化的量度。比值是質量除以更短區(qū)段的堿基數。同一性百分率是實際匹配的符號的百分率。相似性百分率是相似符號的百分率。與空位相對的符號被忽略。當某對符號的打分矩陣值大于等于相似性閾值0.50時，記錄相似性。在第10版GCGWisconsinGenetics軟件包中所用的打分矩陣為BLOSUM62(參見Henikoff和Henikoff(1989)尸rac.Ato/.^cad5W.89:10915)。(c)本文使用的在兩個多核苷酸或多肽序列背景下的"序列同一性，，或"同一性"是指在特定比較窗內比對獲得最大對應時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分率用于指蛋白時，則認為不一致的殘基位置通常差異在于保守氨基酸取代，在保守氨基酸取代中，氨基酸殘基被另一個具有類似特性(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基取代，從而不改變分子的功能特性。當序列差異在于保守取代時，可上調序列同一性百分率，以校正取代的保守性質。因這些保守取代而不同的序列被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。進行這種調整的方法是本領域技術人員眾所周知的。典型地，它包括將保守取代記錄為部分而不是完全錯配，從而提高了序列同一性百分率。因此，例如，在相同氨基酸被給予記分1而非保守取代被給予記分0的情況下，保守取代^皮給予介于0和1之間的記分。保守取代的記分可通過例如用PC/GENE程序(Intelligenetics，MountainView,California)執(zhí)行來計算。(d)本文所用的"序列同一性百分率"是指通過在比較窗內比較兩個最優(yōu)比對序列而確定的值，其中比較窗中的多核苷酸序列部分與參比序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以優(yōu)化兩個序列的比對。如下計算百分率測定兩個序列中存在相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數，獲得匹配位置數，用該匹配位置數除以比較窗中的總位置數，并將結果乘以100，獲得序列同一性百分率。本發(fā)明還提供具有改變的水平和/或活性的本發(fā)明IPT多肽的植物。在某些實施方案中，本發(fā)明的植物將本發(fā)明的IPT序列穩(wěn)定整合入其基因組中。在其它實施方案中，提供在編碼本發(fā)明的IPT多肽的基因組基因座進行了遺傳修飾的植物。所述"天然基因組基因座"是指天然存在的基因組序列。可對基因組基因座進行修飾，以降低或去除IPT多肽的活性。本文所用術語"遺傳修飾的"是指植物或植物部分的遺傳信息通過引入一個或多個外源多核苷酸而被改變，外源多核苷酸的插入導致植物表型變化。所述"表型變化"是指一種或多種細胞功能的可檢測變化。例如，在編碼IPT多肽的基因組基因座具有遺傳修飾的植物可顯示出降低或去除的IPT多肽的表達或活性。產生這種遺傳修飾的基因組基因座的多種方法，以及由本發(fā)明的IPT序列的水平/活性的調控而產生的多種表型，本文另外一處有描述。本文所用術語植物包括所提到的完整植物、植物部分或器官(例如葉、莖、根)、植物細胞及其種子和后代。本文所用的植物細胞包括但不限于從種子獲得的或存在于種子中的細胞、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子以及植物原生質體和植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢，以及在植物和植物部分中完整的植物細胞，所述植物部分例如為胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、谷仁(kemel)、穗、穗軸、外殼、柄、根、根尖、花藥、谷粒(grain)等。本文所用的"谷粒"是指為了非生長或增殖物種的目的由商業(yè)種植者生產的成熟種子。再生植物的子代、變體和突變體也包括在本發(fā)明范圍內，前提是這些部分含有引入的核^列。方法I.提供序列本發(fā)明的序列可被導入到諸如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物或最好植物細胞的宿主細胞中和并在其中表達。預期本領域技術人員熟知多種可用于將本發(fā)明的多肽或核苷酸序列導入宿主細胞中的系統(tǒng)。因此，將不試圖對各種已知用于在原核生物或真核生物中提供蛋白的方法進行詳細描述。所述"宿主細胞"是指含有本發(fā)明的異源核酸序列的細胞。宿主細胞可以是諸如大腸桿菌的原核細胞，或諸如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞的真核細胞。宿主細胞也可以是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞。在某些實施方案中，單子葉植物宿主細胞為玉米宿主細胞。術語"多核苷酸"的應用并不限定本發(fā)明為含DNA的多核苷酸。本領域一般技術人員會認識到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸與脫氧核糖核苦酸的組合。這些脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸包括天然分子和合成類似物這二者。本發(fā)明的多核苷酸還包含所有序列形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾、莖環(huán)結構等。本發(fā)明的IPT多核苷酸可在用于在目標植物中表達的表達盒中提供。該表達盒包括與本發(fā)明的IPT多核苷酸有效連接的5'和3'調節(jié)序列。"有效連接的"是指兩個或更多個元件的功能性連接。例如，目標多核苷酸與調節(jié)序列(即啟動子)之間的有效連接是一種功能性連接，可以使目標多核苦酸表達。有效連接的元件可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。當用于指兩個蛋白編碼區(qū)的連接時，所述有效連接的是指編碼區(qū)處于相同讀框中。表達盒可另外包含至少一個要共轉化到生物中的其它基因。或者，其它基因可在多個表達盒上提供。表達盒可提供多個限制性位點和/或重組位點，用以插入IPT多核苷酸，使其處在調節(jié)區(qū)的轉錄調節(jié)之下。表達盒可另外含有選擇標記基因。在某些實施方案中，表達盒按5'-3'的轉錄方向包括在植物中起作用的轉錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、本發(fā)明的IPT多核苷酸及轉錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。調節(jié)區(qū)(即啟動子、轉錄調節(jié)區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或本發(fā)明的IPT多核苷酸對宿主細胞或彼此之間可以是天然的/類似的?；蛘?，調節(jié)區(qū)和/或本發(fā)明的IPT多核苷酸對宿主細胞或彼此之間可以是異源的。本文用于指示序列的"異源的"是指來源于外來物種的序列，或者，如果來自相同物種，則通過有意的人為干涉而在組成和/或基因組基因座方面由其天然形式發(fā)生顯著改變。例如，與異源多核苷酸有效連接的啟動子來自不同于多核苷酸來源物種的物種，或者，如果來自相同/類似物種，則其中一個或二者由其初始形式和/或基因組基因座發(fā)生顯著改變，或者啟動子不是有效連接的多核苷酸的天然啟動子。本文所用的嵌合基因包含編碼序列和轉錄起始區(qū)，其中編碼序列與轉錄起始區(qū)有效連接，而轉錄起始區(qū)對于編碼序列來說是異源的。盡管異源啟動子可用于表達IPT序列，但還可使用天然啟動子序列或其它IPT啟動子。這些構建體可改變才直物或才直物細胞中的IPT序列表達水平。因此，可改變植物或植物細胞的表型。終止區(qū)對轉錄起始區(qū)可以是天然的，對有效連接的目標IPT多核苦酸可以是天然的，對植物宿主可以是天然的，或者可以得自其它來源(例如針對啟動子是外源的或異源的)、目標IPT多核苷酸、植物宿主或其任何組合。便利的終止區(qū)可從根瘤土壤桿菌的Ti質粒獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。另參見Guerineau等，(1991)Mo/.262:141-144;Proudfoot(1991)CW/64:671-674;Sanfacon等，(1991)Gew&sDev.5:141-149;Mogen等，(19%)尸/a"fCe〃2:1261-1272;Munroe等，(1990)91:151-158;Ballas等，(1989)AWe/c爿c/(isL17:7891-7903和Joshi等，(1987)iVwc/e/c紐15:9627-9639。在合適情況下，為了在轉化植物中增加表達，可優(yōu)化多核苷酸。也就是說，可用植物優(yōu)選的密碼子來合成多核苷酸，以提高表達。參見例如Campbell和Gowri(1990)尸/a"f尸/^z'o/.92:1-11關于宿主優(yōu)選的密碼子選擇的論述。這些方法可從合成植物優(yōu)選基因的領域獲得。參見例如美國專利第5,380,831和5，436，391號，以及Murray等，(1989)iW/c/e/cA^sias.17:477-498，所述文獻通過引用結合到本文中。已知在細胞宿主中增強基因表達的其它序列修飾。這些修飾包括除去編碼假多聚腺苷酸化信號的序列、外顯子-內含子剪接位點信號、轉座子樣重復序列以及其它這類可能對基因表達不利的已充分表征的序列。通過參比在宿主細胞中表達的已知基因進行計算，可將序列的G-C含量調整至給定細胞宿主的平均水平。在有可能時，對序列進行修飾，以避免預測的發(fā)夾二級mRNA結構。表達盒可另外含有5'前導序列。這類前導序列可用于增強翻譯。翻譯前導序列是本領域已知的，包括小RNA病毒前導序列，例如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5'非編碼區(qū))(Elroy-Stein等，(1989)iVoc.淑/.爿cad,86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導序列，例如TEV前導序列(煙草蝕紋病毒)(Gallie等，(1995)165(2):233-238)，MDMV前導序列(玉米矮縮花葉病毒)(Wra/ogy154:9-20)，及人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)(Macejak等，(1991)Atow^353:90-94);苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMVRNA4)(Jobling等，(1987)Atowe325:622-625);煙草花葉病毒前導序歹'J(TMV)(Gallie等，(1989)載于Mo/ecw/arB/o/ogyo//A^，Cech編輯，(Liss,NewYork)，237-256頁)；及玉米褪綠斑駁病毒前導序列(MCMV)(Lommel等，(1991)Wro/ogy81:382-385)。另參見Della-Ci叩pa等，(1987)P/a"f尸/^Zo/.84:965-968。還可使用已知增強翻譯的其它方法。在制備表達盒時，可操作多種DNA片段，從而提供方向正確并在適宜時讀框適合的DNA序列。為此，可^f吏用適配體或連^r物來連接DNA片段，或者可包含其它操作，以提供便利的限制性位點、除去冗余DNA、除去限制性位點等。為此目的，可包含體外誘變、引物修復、限制、退火、再取代(例如轉換和顛換)。表達盒還可以包括用于選擇轉化細胞的選擇標記基因。選擇標記基因用于轉化細胞或組織的選擇。標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉移酶(HPT)的那些，以及賦予對除草劑化合物(例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D))抗性的基因。其它選擇標記包括表型標記，例如(3-半乳糖苷酶和熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)(Su等，(2004)所o&c/wo/85:610-9和Fetter等，(2004)P/a"fCe〃/6..215-28)、青色熒光蛋白(CYP)(Bolte等，(2004)/Ce〃5W露e117:943-54和Kato等，(2002)戶/a"fP/^w'o/129:913-42)和黃色焚光蛋白(來源于Evrogen的PhiYFP,參見Bolte等，(2004)/Ce〃Sc/e"ce117:943-54)。關于其它選擇標記，通常參見Yarranton(1992)CwmC^'".3:506-511;Christopherson等，(1992)尸rac.Ato/.爿c"d5W."5"」89:6314-6318;Yao等，(1992)Ce〃71:63-72;Reznikoff(1992)Mo/.M/cra6/o/.6:2419-2422;Barkley等，(1980)載于7TzeQpera"，177-220頁；Hu等，(1987)CW/48:555-566;Brown等，(1987)Ce〃49:603-612;Figge等，(1988)Ce〃52:713-722;Deuschle等，(1989)尸rac.A^/.爿cad爿c/.L/5L486:5400-5404;F畫t等，(1989)尸rac.編.加d5W.腦86:2549-2553;Deuschle等，(1990)5We"ce248:480-483;Gossen(1993)博士論文，海德堡大學；Reines等，(1993)尸rac.A^/.5W.t/5L490:1917-1921;Labow等，(1990)Mo/.Ce〃.所o/.10:3343-3356;Zambretti等，(1992)尸rac.A^/.^cad5W.89:3952-3956;Baim等，(1991)尸rac.A/a//.^a^.5W.tZ&i88:5072-5076;Wyborski等，(1991)A^c/e/c^c/A19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7bp/c>sMo/.Sfrwc.所o/.10:143-162;Degenkolb等，(1991)爿油,w/cra6.々e她C7ze,^zer35:1591-1595;Kleinschnidt等，(1988)祝oc/zem&fry27:1094-1104;Bonin(1993)博士論文，海德堡大學；Gossen等，(1992)A^/.^c"dOSL489:5547-5551;Oliva等，(1992)爿油Vw.cra6.C/zemo^er.36:913-919;Hlavka等,(1985)i/朋必ooA:o/Ex/eW膨"to/尸/zamaco/ogy,第78巻(Springer-Verlag,Berlin);Gill等，(1988)A^we334:721-724。這些公開內容通過引用結合到本文中。以上列出的選擇標記基因沒有限制性。在本發(fā)明中可使用任何選擇標記基因。在本發(fā)明實踐中可使用多種啟動子，包括目標多核苷酸序列的天然啟動子?？苫谒杞Y果選擇啟動子。可將核酸與組成型啟動子、誘導型啟動子、組織優(yōu)選啟動子或其它啟動子組合，用于在植物中表達。這樣的組成型啟動子包括例如在WO99/43838和美國專利第6,072,050號中^^開的Rsyn7啟動子的核心啟動子和其它組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell等，(1985)Atowe313:810-812);水稻肌動蛋白(McElroy等，(1990)尸/a"fCe〃2:163-171);泛素(Christensen等，(1989)尸teMo/.扁.12:619-632和Christensen等，(1992)尸teMo/.所o/.18:675-689);pEMU(Last等，(1991)7Tzeor^^/.81:581-588);MAS(Velten等，(1984)￡MB(9/3:2723畫2730);ALS啟動子(美國專利第5,659,026號)等。其它組成型啟動子包括例如美國專利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5，466，785、5,399,680、5,268,463、5，608，142和6，177，611號。可使用組織優(yōu)選啟動子將增強的IPT表達定向于特定植物組織。組織優(yōu)選啟動子包括Yamamoto等，(1997)P/a"fJ12(2):255-265;Kawamata等，(1997)尸/a"fCW/尸/^w'o/,38(7):792畫803;Hansen等，(1997)Mo/.(7ew254(3):337-343;Russell等，(1997)7謹ge"/cM6(2):157國168;Rinehart等，(1996)P/a"f尸/y^。/.112(3):1331-1341;VanCamp等，(1996)P/a"f112(2):525-535;Canevascini等，(1996)尸/a"f尸/^w'o/.112(2):513陽524;Yamamoto等，(1994)戶/a"fCe〃尸/^w'o/.35(5):773-778;Lam(1994)/ewto尸roW.Ce〃20:181-196;Orozco等，(1993)尸taMo/編.23(6):1129-1138;Matsuoka等，(1993)尸racA^/.^c。d5W.t/5^90(20):9586-9590和Guevara-Garcia等，(1993)P/a"〃.4(3):495-505。如有需要，可修飾這樣的啟動子，以減弱表達。另參見美國專利申請第2003/0074698號，該申請通過引用結合到本文中。葉優(yōu)選啟動子是本領域已知的。參見例如Yamamoto等，(1997)尸/a"f/12(2):255-265;Kwon等，(1994)P/a"f尸/7少w'o/.105:357-67;Yamamoto等，(1994)P/a"fCe〃尸/^/o/'35(5):773-778;Gotor等，(1993)戶/""fJ3:509-18;Orozco等，(1993)P/a"fMo/.歷o/.23(6):1129-1138;Baszczynski等，(1988)iVwc/.爿c^/&s.16:4732;Mitra等，(1994)尸/a"fA/o/ecw/or26:35-93;Kayaya等，(1995)Gewena/Gewe"c^248:668-674和Matsuoka等，(1993)iVoc.Ato/.^cadSc/.90(20):9586-9590。還4吏用衰老調節(jié)型啟動子，例如SAM22(Crowell等，(1992)尸teMo/.編.7&459-466)。另參見美國專利第5,589,052號，該專利通過引用結合到本文中。根優(yōu)選啟動子是已知的，可選自眾多可由文獻獲得的啟動子，或從多種相適物種中從頭分離。參見例如Hire等，(1992)P/aWMo/.說o/.20(2):207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(199l)P/a"/CW/3(10):1051-1061(扁豆GRP1.8基因的根特異性控制元件)；Sanger等，(1990)尸/a"fM/.B/o/.14(3):433-443(根瘤土壤桿菌甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao等，(1991)尸/a"fCe〃3(1):11-22(編碼胞質谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，可在大豆根和根瘤中表達)。另參見Bogusz等，(1990)尸/aWCe〃2(7):633-641，其中描述了從固氮非豆科植物榆科山黃麻(尸araw/ow/aa"(ieraow7)和相關的非固氮非豆一牛才直物山黃麻(7Vematomew加a)的血紅蛋白基因分離的兩個根特異性啟動子。這些基因的啟動子與p-葡糖醛酸糖苷酶報告基因連接，并導入到非豆科植物煙草(Wco"awato^cwm)和豆科植物百&M艮(丄o^scorm.cw/art/力這二者中，在這兩種情況下根特異性啟動子活性都得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對發(fā)根土壤桿菌C4grokifcfeWwmWz/zoge"as)中高表達的rolC和rolD才艮i秀導基因的啟動子的分析(參見尸/a"f5We"ce(Limerick)79(1):69-76)。他們推斷增強子和組織優(yōu)選的DNA決定子在這些啟動子中是解離的。Teeri等，(1989)用與lacZ融合的基因表明，編碼章魚堿合酶的土壤桿菌(ylgra6acten'ww)T-DNA基因在根尖表皮中尤其有活性，TR2'基因在完整植物中是根特異性的，并被葉組織中的傷口刺激，與殺蟲基因或殺幼蟲基因一起使用是特別需要的特征組合(參見五M5(9J8(2):343-350)。與"pf//(新霉素磷酸轉移酶II基因)融合的TR1'基因表現出類似的特征。其它的根優(yōu)選啟動子包括VffiNOD-GRP3基因啟動子(Kuster等，(1995)P/a"fMo/.Ao/.29(4):759-772);ro舊啟動子(Capana等，(1994)尸taMo/.脂.國專利公布2005/0097633)。另參見美國專利第5,837,876、5,750,386、5，633，363、5,459,252、5,401,836、5,110，732和5,023,179號。"種子優(yōu)選"啟動子是指那些在種子發(fā)育過程中有活性的啟動子，可以包括在種子原始體或相關母系組織中的表達。這樣的種子優(yōu)選啟動子包括但不限于Ciml(細胞分裂素誘導的信使)；cZ19Bl(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-l-磷酸合酶)(參見WO00/11177和美國專利第6,225,529號，所述文獻通過引用結合到本文中)。y-玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。球蛋白-1(Glob-l)是代表性的胚特異性啟動子。對于雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于菜豆(3-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、P-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。對于單子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、y-玉米醇溶蛋白、糯質基因(waxy)、超甜基因1(shrunken1)、超甜基因2(shrunken2)、球蛋白1等。另參見WO00/12733,其中公開了來自ewZ/和ew^基因的種子優(yōu)選啟動子；所述文獻通過引用結合到本文中。在Sato等，(1996)ZVoc.A^/.爿cad93:8117-8122;Nakase等，(1997)尸/a"f/12:235-46和Postma-Haarsma等，(1999)P/a"fMo/.編.39:257-71中公開了其它胚特異性啟動子。在Albani等，(1984)￡M5(93:1405-15;Albani等，(1999)77zeor^p/.98:1253-62;Albani等，(1993)戶/a"f/4:343畫55;Mena等，(1998)7Tze尸/a"fJow"a/116:53-62和Wu等，(1998)Ha加CW/P/y^/o/ogy39:885-889中公開了其它胚乳特異性啟動子。在諸如發(fā)育的花序組織的分生組織區(qū)域中有活性的啟動子以及在開花時或者大約在開花時或者在早期谷仁發(fā)育時驅動表達的啟動子同樣令人關注。這可以包括例如玉米Zag啟動子，包括Zagl和Zag2(參見Schmidt等，(1993)77ze尸/a"fCe〃5:729國37;GenBankX80206;Theissen等，(1995)Ge"e156:155-166和美國專利申請10/817,483);玉米Zap啟動子(也稱為ZmMADS;美國專利申請10/387,937;WO03/078590);玉米ckxl-2啟動子(美國專利申請2002-0152500Al;WO02/0078438);玉米eepl啟動子(美國專利申請10/817,483);玉米end2啟動子(美國專利6,528,704和美國專利申請10/310,191);玉米lecl啟動子(美國專利申請09/718,754);玉米F3.7啟動子(Baszczynski等，Maydica42:189-201(1997));玉米tbl啟動子(Hubbarda等，Genetics162:1927-1935(2002)和Wang等，(1999)Atowre398:236-239);玉米eep2啟動子(美國專利申請10/817,483);玉米石克氧還蛋白H啟動子(美國臨時專利申請60/514,123);玉米Zm40啟動子(美國專利6,403,862和WO01/2178);玉米mLIP15啟動子(美國專利6,479,734);玉米ESR啟動子(美國專利申請10/786,679);玉米PCNA2啟動子(美國專利申請10/388,359);玉米細胞分裂素氧化酶啟動子(美國專利申請11/094,917);在Weigal等，(1992)Ce〃69:843-859中公開的啟動子；登錄號AJ131822;登錄號Z71981;登錄號AF049870;和在McAvoy等，(2003)Jcto//oW.(T5KS^625:379-385中7>開的枝條優(yōu)選啟動子。在Ito等，(1994)尸/a"fMo/.說o/.24:863-878;Regad等，(1995)Mo.248:703-711;Shaul等，(1996)iVoc.A^/.」cad5W.93:4868-4872;Ito等，(1997)尸teJ11:983-992和Trehin等，(1997)尸teMo/.脂.35:667-672中公開了其它值得關注的分裂細胞或分生組織優(yōu)選啟動子，所有這些文獻均通過引用結合到本文中?；ㄐ騼?yōu)選啟動子包括查耳酮合酶啟動子(VanderMeer等，(1990)尸/fl"fMo/.所o/.15:95-109)、LAT52(Twell等，(1989)Mo/.217:240-245)、花粉特異性基因(Albani等，(1990)尸/""fMo/說W.15:605)、Zml3(Buerrero等，(1993)Mo/.224:161-168)、玉米花粉特異性基因(Hamilton等，(1992)尸/a"fMo/.Ao/.18:211-218)、向曰葵花粉表達的基因(Baltz等，(1992)T7zeP/a"fJow77a/2:713-72l)以及甘藍型油菜(及""pw"花粉特異性基因(Amoldo等，(1992)CW/.5/oc/zem，摘要Y101204))。脅迫誘導型啟動子包括鹽/水脅迫誘導型啟動子，例如P5CS(Zang等，(1997)P/a"f5We"cw129:81-89);冷誘導型啟動子，例如corl5a(Hajela等，(1990)P/a"f尸—。/93:1246-1252)、corl5b(Wlihelm等，(1993)P/"WMo/5/o/23:1073-1077)、wscl20(Ouellet等，(1998)F五BS423-324-328)、ci7(Kirch等，(1997)尸/a"fMo/所o/.33:897-909)、ci21A(Schneider等，(1997)尸/a"fP/^w'o/.113:335-45);干燥誘導型啟動子，例如Trg-31(Chaudhary等，(1996)尸/a"fMo/.說o/.30:1247-57);滲透誘導型啟動子，例如RaM7(Vilardell等，(1991)尸/a"fMo/.所o/.17:985-93)和滲透蛋白(Raghothama等，(1993)尸/a"fMo/所o/23:1117-28);以及熱誘導型啟動子，例如熱休克蛋白(Barros等，(1992)尸/a"^Mo/.19:665-75;Marrs等，(1993)Dev.14:27-4l)和smHSP(Waters等，(1996)J￡x/eWme"to/Boto"y47:325-338)。其它脅迫誘導型啟動子包括rip2(美國專利第5，332，808號和美國專利公布號2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki等，(1993)Mo/.236:331-340)。在本發(fā)明的方法中也可以使用脅迫不敏感啟動子。該類啟動子以及代表性實例將在本文另外一處進一步描述。在本發(fā)明的方法中也可以使用氮響應型啟動子。這類啟動子包括但不限于22kDa玉米醇溶蛋白啟動子(Spena等，(1982)五MSOJ1:1589-1594和Muller等，(1995)/P/a"f尸/yw'o/145:606-613);19kDa玉米醇溶蛋白啟動子(Pedersen等，(1982)CW/29:1019-1025);14kDa玉米醇溶蛋白啟動子(Pedersen等，(1986)/C&m.261:6279-6284)、b-32啟動子(Lohmer等，(1991)￡M5(9/10:617-624)和亞硝酸鹽還原酶(NiR)啟動子(Rastogi等，(1997)Mo/所o/.34(3):465-76和Sander等，(1995)尸/a"fMo/27(1):165畫77)。關于氮誘導型啟動子中存在的共有序列的綜述，參見例如Muller等，(1997)77ze/VawfJ0wm3/12:281-291。的基因表達?；诖四康?，啟動子可以是化學誘導型啟動子，在此情況下使用化學物質誘導基因表達，或者是化學阻抑型啟動子，在此情況下通過使用化學物質抑制基因表達?；瘜W誘導型啟動子是本領域已知的，包括但不限于可被笨璜酰胺除草劑安全劑激活的玉米In2-2啟動子、可被用作前應急除草劑的疏水親電化合物激活的玉米GST啟動子，及可被水楊酸激活的煙草PR-la啟動子。其它值得關注的化學調節(jié)啟動子包括類固醇響應型啟動子(參見例如Schena等，(l"l)/Voc.Ato/.爿cadt/51488:10421-10425和MeNellis等，(1998)P/a"f丄14(2):247-257中的糖皮質激素誘導型啟動子)以及四環(huán)素誘導和四環(huán)素抑制啟動子(參見例如Gatz等，(1991)Mo/.227:229-237和美國專利第5,814,618和5,789,156號)，所述文獻通過引用結合到本文中。動子，例如ZmCkxl-2啟動子(美國專利6，921，815和待審查的美國專利申請11/074,144)。這種構建體應當擴大發(fā)育階#殳和/或目標組織中存在的細胞分裂素生物合成。在待審查的美國專利申請11/094,917和11/273,537中描述了其它細胞分裂素誘導型啟動子，這些文獻全部通過引用結合到本文中。其它誘導型啟動子包括熱休克啟動子，例如Gmhspl7.5-E(大豆)(Czarnecka等，(1989)Mo/Ce〃所o/.9(8):3457-3463);APX1基因啟動子(擬南芥)(Storozhenko等，(1998)P/a"f尸/^w'o/.118(3):1005畫1014);//a/wp77.7(向曰葵(//^//""^2"15aw7ww力)(Almoguera等，(2002)尸/a"fP/7>w'o/.129(1):333-341);和玉米Hsp70(Rochester等，(1986)五MBOJ5:451-8)。本發(fā)明的方法包括將多肽或多核苷酸導入到植物中。"導入"是指向植物提供多核苷酸或多肽，提供方式可使序列進入植物細胞內部。本發(fā)明的方法不依賴于向植物中導入序列的具體方法，只要多核苷酸或多肽可以進入植物的至少一個細胞內部。將多核苷酸或多肽導入植物中的方法是本領域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉化法、瞬時轉化法和病毒介導的方法。"穩(wěn)定轉化"是指導入到植物中的目標核苷酸構建體整合到植物基因組中，并能由其子代遺傳下去。"瞬時轉化"是指序列導入到植物中，并僅在植物中短暫表達或存在。轉化程序及向植物中導入多肽或多核苷酸序列的程序可依作為轉化耙標的植物或植物細胞的類型(即，是單子葉還是雙子葉)而變化。向植物細胞導入多肽和多核苷酸的合適方法包括微注射(Crossway等，(1986)Ao&c/z"/^^4:320-334)、電穿孔(Riggs等，(1986)ZVoc.Ato/.^c"dOSL483:5602-5606)、土壤桿菌介導的轉化(美國專利第5,563,055號和美國專利第5,981,840號)、定向基因轉移(Paszkowski等，(1984)J3:2717-2722)及彈道顆粒加速法(參見例如美國專利第4,945,050號；美國專利第5，879，918號；美國專利第5,886,244和5,932,782號；Tomes等，(1995)載于戶/a"fCe//,Hwwe,Cw/fwm'Fwwda膨幽/Mw/zo成Gamborg和Phillips編輯，(Springer-Verlag,Berlin);McCabe等，(1988)5/ofec/z"o/ogy6:923-926);Lecl轉化(WO00/28058)。另參見Weissinger等，(1988)iev.22:421-477;Sanford等,(1987)戶aW/cw/她5b/ewcerec/zwo/ogy5:27-37(洋蔥)；Christou等,(1988)Pte尸—。/.87:671-674(大豆)McCabe等，(1988)5/o/Tec/z"o/ogy6:923-926(大豆)；Finer和McMuUen(1991)/"。CW/Z)ev.編.27P:175畫182(大豆)；Singh等,(1998)772eor^;;/.96:319-324(大豆)；Datta等，(1990)所ofec/z"o/ogy8:736-740(水稻)；Hoque等，(2005)P/a"fCe〃Hwwe&Oga"Cw/&m82(l):45-55(水稻)；Sreekala等，(2005)戶/a"fCe〃7epo池24(2):86曙94(水稻)；Klein等，(1988)Ato/.Jcad5W,t/5^85:4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)脂ec/z"o/，6:559-563(玉米);美國專利第5,240,855、5,322,783和5,324,646號；Klein等，(1988)尸/a"f尸/^Wo/.91:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)所o&c/z"o/ogy8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等，(1984)A^we(London)311:763-764;美國專利第5,736,369號(谷物);Bytebier等,(1987)扁.^cad5W.84:5345-5349(百合科)；DeWet等，(1985)載于77^五x/en'we"to/M薩》w/加'owo/Ovw/eT^was，Chapman等編輯,(Longman,NewYork),197-209頁(花粉)；Kaeppler等，(1990)/7a"fCe〃i^po他9:415-418和Kaeppler等，(1992)T7^or84:560-566(頸須介導的轉化)；D'Halluin等，(1992)P/a"fCe〃4:1495-1505(電穿孔)Li等，(1993)尸/a"/Ce〃i印OT^12:250-255以及Christou和Ford(1995)爿w2a/s。/5oto"y75:407-413(水稻)；Osjoda等，(1996)A^we說ofec/wo/ogy14:745-750(玉米通過根瘤土壤桿菌轉化)；所有這些文獻均通過引用結合到本文中。在具體的實施方案中，可使用多種瞬時轉化方法將本發(fā)明的IPT序列提供給植物。這樣的瞬時轉化方法包括但不限于將IPT蛋白或其變體和片段直接導入植物中，或者將IPT轉錄物導入植物中。這樣的方法包括例如微注射或顆粒轟擊。參見例如Crossway等，(1986)Mo/202:179-185;Nomura等，(1986)尸/a"f5W.44:53-58;Hepler等，(1994)尸rac.A/a"爿cad91:2176-2180和Hush等，(1994)7TeJowma/o/Ce〃5We"ce107:775-784，所有文獻都通過引用結合到本文中?；蛘撸琁PT多核苷酸可使用本領域已知的技術瞬時轉化到植物中。這些技術包括病毒載體系統(tǒng)和以排除后續(xù)DNA釋放的方式沉淀多核苷酸。因此，可由與顆粒結合的DNA進行轉錄，但其被釋放以整合到基因組中的頻率被極大降低。這些方法包括使用包被聚乙烯亞胺(PEI;Sigma#P3143)的顆粒。在其它實施方案中，可通過使植物與病毒或病毒核酸接觸而將本發(fā)明的多核苦酸導入植物中。通常，這樣的方法包括將本發(fā)明的核苷酸構建體摻入病毒DNA或RNA分子中。應當認識到，本發(fā)明的IPT多核苷酸最初可作為病毒多聚蛋白的一部分而合成，該部分之后可在體內或體外通過蛋白水解加工，產生所需的重組蛋白。另外，要認識到的是，本發(fā)明所用啟動子還包括用于通過病毒RNA聚合酶轉錄的啟動子。涉及病毒DNA或RNA分子的、用于將多核苷酸導入植物中并在其中表達編碼蛋白的方法是本領域已知的。參見例如美國專利第5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931號和Porta等,(1996)Mo/ecw/arS/o&c/"o/ogy5:209-221;所述文獻通過引用結合到本文中。向植物基因組中的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本領域已知的。在一個實施方案中，使用位點特異重組系統(tǒng)實現多核苷酸在所需基因組位置的插入。參見例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853,以及US6,187,994、6,552,248、6，624，297、6,331,661、6,262,341、6,541,231、6,664,108、6,300,545、6,528,700和6,911,575,所有文獻都通過引用結合到本文中。簡而言之，本發(fā)明的多核苷酸可包含在轉移表達盒中，側接兩個不引起重組的重組位點。將轉移表達盒導入到靶位點已穩(wěn)定摻入其基因組中的植物中，所述靶位點側接兩個對應于轉移表達盒的位點的不引起重組的重組位點。提供合適的重組酶，使轉移表達盒整合在耙位點。因此，目標多核香酸被整合在植物基因組中的特定染色體位置。已轉化的細胞可按照傳統(tǒng)方法培育成植林。參見例如McCormick等，(1986)P/a對Ce〃/印o池5:81-84。然后，可培育這些植林，用相同轉化的植株或不同植抹授粉，并鑒定表達所需表型特征的所獲子代?？缮L兩代或更多代，以確保所需表型特征的表達被穩(wěn)定保持并遺傳，然后收獲種子，以確保實現所需表型特征的表達。以此方式，本發(fā)明提供已將本發(fā)明的多核苷酸(例如本發(fā)明的表達盒)穩(wěn)定摻入其基因組中的轉化種子(也稱為"轉基因種子")。譜系育種從兩個基因型的雜交開始，例如目標原種系和另一個具有一種或多種與目標原種系互補的所需特征(即穩(wěn)定摻入本發(fā)明的多核普酸，具有本發(fā)明多肽的活性和/或水平受調節(jié)等)的近交系。如果兩個原始親本不提供所有需要特征，則在繁殖種群中可包括其它來源。在譜系方法中，使優(yōu)良植林自交，并在連續(xù)子代中選擇。在隨后的子代中，雜合狀態(tài)被由自花授粉和選擇產生的純系代替。典型地，在譜系育種方法中，進行5個或更多個連續(xù)子代的自交和選擇Fl—F2;F2—F3;F3~>F4;F4—F5……。在足量近交后，連續(xù)的子代將用于增加發(fā)育近交系的種子。在具體的實施方案中，近交系在其約95%以上的基因座包含純合性等位基因?；亟怀擞糜诋a生回交轉化之外，還可用于與譜系育種組合，以改變目標原種系和使用改變的原種系產生的雜交系?；亟豢捎糜趯碜砸粋€系(供體親本)的一個或多個特定所需性狀轉移到稱為輪回親本的近交系中，該近交系具備整體上良好的農學特征，但卻沒有所需的一種或多種性狀。不過，該程序可用于使子代傾向輪回親本的基因型，的許多組分。例如，產生諸如商品化雜交系的Fl。該商品化雜交系可與其親本系之一回交，產生BC1或BC2。子代進行自交并選擇，以使新發(fā)育的近交系具有輪回親本的多種特征，但具有非輪回親本的幾個所需特征。該方法平衡了新雜交系和育種中所用的輪回親本的價值和強度。因此，本發(fā)明的一個實施方案是使目標玉米近交系回交轉化的方法，該方法包括以下步驟使目標玉米近交系植物與含有賦予所需性狀(即調控細胞分裂素水平(提高或降低)或由調控的細胞分裂素水平產生的任何植物表型(這些植物表型在本文另外一處有討論))的突變基因或轉基因的供體植抹回交，選擇含賦予所需性狀的突變基因或轉基因的Fl子代植林，將選定的Fl子代植抹與目標玉米近交系植林回交。該方法還可以包括以下步驟獲得目標玉米近交系的分子標記譜，并用該分子標記譜選擇具有所需性狀和目標近交系分子標記譜的子代植抹。按同樣的方式，該方法通過增加以下的最后一步可用于生產Fl雜交種子使具有所需性狀轉化的目標玉米近交系與不同的玉米植抹雜交，以產生含有可賦予所需性狀的突變基因或轉基因的Fl雜交玉米種子。輪回選擇是在植物育種程序中用于改良植物種群的方法。該方法需要使個體植株彼此雜交授粉，以形成子代。培育子代，并通過眾多選擇方法篩選優(yōu)良子代，包括個體植抹、半同胞子代、全同胞子代、自交子代及頂交子代。選定的子代彼此雜交授粉，以形成另一群子代。種植該種群，并再次選擇優(yōu)良植林，彼此進行雜交授粉。輪回選擇是一個循環(huán)過程，因此可根據需要重復多次。輪回選擇的目的是改良種群的性狀。然后，可將改良的種群用作育種材料的來源，以獲得用于雜交系或用作合成栽培變種的親本的近交系。合成栽培變種是通過幾個選定近交系的雜交所形成的后代?；旌线x擇在與分子標記增強選擇聯合使用時是一種有用的技術。在混合選擇中，根據表型和/或基因型選擇來自個體的種子。然后，將這些選定的種子混合在一起，用于培育下一代?；旌线x擇需要成批培育植物種群，讓植抹自花授粉，成批收獲種子，然后使用成批收獲的種子的樣本種植出下一代。直接授粉可代替自花授粉用作育種程序的一部分。突變育種是可用于將新性狀引入原種系的眾多方法中的一種。對于植物育種者，自發(fā)產生或人工誘導的突變可為變異性的有用來源。人工誘變的目標是提高所需特征的突變速率。通過多種不同方法可提高突變速率，包括溫度、長期種子儲存、組織培養(yǎng)條件、輻射(例如X射線、y射線(例如鈷60或銫137))、中子(原子反應堆中鈾235的核裂變產物)、卩輻射(從放射性同位素如磷32或碳14發(fā)射)或紫外線照射(優(yōu)選地從2500nm至2900nm)),或化學誘變劑(例如堿基類似物(5-溴尿嘧啶)、相關化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生素(鏈黑菌素)、烷化劑(硫芥子氣、氮芥、環(huán)氧化物、乙烯胺、硫酸鹽、磺酸鹽、砜、內酯)、疊氮化物、羥胺、亞硝酸或吖啶。一旦通過誘變觀測到所需性狀，則可以通過傳統(tǒng)育種技術如回交將該性狀摻入已有的種質中。突變育種的纟田節(jié)可參見"PrincipalsofCultivarDevelopment,"Fehr，1993MacmillanPublishingCompany,其公開內容通過引用結合到本文中。另夕卜，在其它系中產生的突變可用于產生含這些突變的原種系的回交轉化。本發(fā)明可用于轉化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目標植物物種的實例包括但不限于玉米(Zeawa^);蕓薹(丑ra肌'casp.)(例如甘蘭型油菜(及"qpw"、白菜型油菜(及rapa)、芥菜型油菜(AJ^cea)),尤其是那些可用作種子油來源的蕓薹；苜蓿(5brg/2"mWco/or,iSorg/zwwvw/gare)、黍(i"列i口珠禾夏(尸e""&efwmg/awc)、稷(尸"m,cw/"ace,)、粟(iSetoWa/to/z'ca)、龍爪稷(jE7e,'"ecorac"w《)、向曰蔡(/7e/細^zz^a朋w—、紅花(G3W/zamRSW"cton'—、'J、麥(7V/ric"maest/vwm)、大豆(G7少"'"emao:)、》因草(iWco&a"atoZ)"cww)、馬鈴薯(5"o/a"wmrt^eroswm)、花生(^4rac/2^/^/ogaea)、才帛花(Gos^少//wmZfi^fl(imse，Go邵p/wm/^>虛訓)、甘薯(^owoea6ato加)、木薯(Mam7zof&scw/ewto)、咖啡(Co,a卿.)、椰子(Cocos菠蘿(j"a"osco附osw力、斥計橘杉于(C7^^sspp.)、可可(77zeo6ramacacao)、茶(Came〃/acos7ca)、番石對留(尸s/(i/wwgway,ava)、芒果(A/a"g7y^rafz'"d/ca)、橄才覽(CVeaewra/aea)、番木瓜(Cca/a/a戸)、腰果(/lwacaWwwocc/de她/e)、澳洲堅果(Macac/a附/az'"fegn》//a)、杏仁(尸n/"wsow少g(ia/—、糖甜菜(&tow/gan;s)、甘蔗(Sacc/wrwm燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬u菜包4舌番蒜(Z^co/e^/co"escw/e"^w)、葛苣(例^口丄acfwc"s加'va)、扁豆(P/zoseo/wsvw/gan'"、菜豆(尸/zoseo/ws//附ms7J)、婉豆(丄a^yn^5pp.)和黃瓜(Cwcwm&)屬成員，例如黃瓜(C.sa"Vw"、口合密瓜(C.c朋to/w/e"W"和甜瓜(Cwe/o)。觀賞植物包括杜鵑花(i^c^^fe"dro"spp.)、八仙花(Macro//2少〃aZzjK/ra"gea)、芙蓉(/7/Z^ciASmsasawe,'力、玫瑰(/o^s;/.)、郁金香(rw/z)(3S/7;.)、水仙花(iVarc/^w"/p.)、矮牽?；?尸e抽/fl/z;/6r油)、荷蘭石竹(D/a"f/2wsca，//^〃—、一品紅(五w//2orZ/a/w/c/^r由力和菊花?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的針葉樹包括例如松樹，例如火炬松CP/m^toeda)、沼'澤^"(/V"附e〃/o"7)、美國黃+^CP/"ws/o"^/erosa)、黑+>(尸/"1cowtoWa)和輻射^"CP/"usrai/(3to);花》真+〉CP"M(iotowgame"z/ew7);力口州4失杉(rsMgaca"atfe"w》；美國西力口云杉(尸/ceag/awca);纟工杉(Se《wo/"sewperv/rem1);冷沖多,i"列^口4艮批^46/esaw"Zn7/力和月交批^4W&s6a/sawea);和雪，例如美國西部側柏(77zw乂a//z'cato)和黃扁柏(C/zawaec^paWs"oo汰afem/"。在具體的實施方案中，本發(fā)明的#_物為栽培4^物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓薹、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、黍、煙草等)。在其它實施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在其它的實施方案中，玉米植物是最佳的。其它目標植物包括提供目標種子的谷類植物、油料種子植物和豆科植物。目標種子包括谷物種子，例如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥等。油料種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓薹、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。典型地，使用中間體宿主細胞來實施本發(fā)明，以增加克隆載體的拷貝數。隨著拷貝數增加，可分離大量含目標核酸的載體，用于導入到所需植物細胞中。在一個實施方案中，使用在細菌中不引起多肽表達的植物啟動子。最常用的原核生物以各種大腸桿菌菌林為代表；但也可使用其它微生物菌抹。在本文中被確定為包含轉錄起始啟動子、任選地具有操縱子連同核糖體結合序列的常用原核生物控制序列包括諸如以下的常用啟動子(3內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(tǒng)(Chang等,(1977)198:1056)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，(1980)A^c/ez'c」dA8:4057)和入衍生的PL啟動子以及N-基因核糖體結合位點(Shimatake等，(1981)A^w"292:128)。在轉染大腸桿菌的DNA載體中包含選擇標記也是有用的。這些標記的實例包括確定對氨卡青霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性的基因。選擇允許導入合適宿主細胞中的載體。細菌載體通常為質?；蚴删w來源。合適的細菌細胞用噬菌體載體顆粒感染或用棵噬菌體載體DNA轉染。如果使用質粒載體，則用質粒載體DNA轉染細菌細胞。表達本發(fā)明蛋白的表達系統(tǒng)可使用芽孢桿菌(5oc/〃ww.)和沙門氏菌屬CSa/wo"e〃a)獲得(Palva等，(1983)22:229-235);Mosbach等，(1983)A^fwe302:543-545)。本領域技術人員已知多種真核表達系統(tǒng)，例如酵母、昆蟲細胞系、植物和哺乳動物細胞。如下文簡要解釋，本發(fā)明的多核苷酸可在這些真核系統(tǒng)中表達。在某些實施方案中，如下文論述的轉化/轉染植物細胞用作產生本發(fā)明蛋白的表達系統(tǒng)。在酵母中合成異源多核苷酸是眾所周知的(Sherman等，(1982)Mw/zo<isGe"e/to,ColdSpringHarborLaboratory)。兩個廣泛用于生產真核蛋白的酵母是釀酒酵母(5"acc/z"rawj;cMce"v/w'"e)和巴斯德畢赤酵母(尸z'c/n'aposton》。用于在釀酒酵母和畢赤酵母中表達的載體、菌抹和方案是本領域已知的，可由供應商(例如Invitrogen)處獲得。合適的載體通常具有表達控制序列，例如啟動子，包括3-磷酸甘油酸激酶或乙醇氧化酶，及復制起點、終止序列等，視需要而定。本發(fā)明的蛋白一經表達就可通過裂解細胞并應用所列出的標準蛋白分離技術從酵母中分離出來。純化過程的監(jiān)測可通過使用蛋白質印跡技術或放射性免疫測定或其它標準免疫測定技術來實現。本發(fā)明的序列還可以連接到各種表達載體中，用于轉染例如哺乳動物、昆蟲或植物來源的細胞培養(yǎng)物。用于生產所述肽的示例性細胞培養(yǎng)物為哺乳動物細胞。本領域已開發(fā)了眾多能夠表達完整蛋白的合適宿主細胞系，包括HEK293、BHK21和CHO細胞系。這些細胞的表達載體可包含表達控制序列，例如復制起點、啟動子(例如CMV啟動子、HSVfA:啟動子或pgA:(磷酸甘油酸激酶)啟動子)、增強子(Queen等，(1986)/ww2""o/.89:49)和必需的加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點(例如SV40大T抗原polyA添加位點)及轉錄終止子序列。用于生產本發(fā)明蛋白的其它動物細胞可得自例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心。適于在昆蟲細胞中表達本發(fā)明蛋白的載體通常來源于SF9桿狀病毒。合適的昆蟲細胞系包括蚊幼蟲、蠶、粘蟲、蛾和果蠅(Dmso;/w7a)細胞系，例如Schneider細月包系(參見Schneider(1987)/EwZj^o/.她—o/.27:353-365)。同酵母一樣，當使用高等動物或植物宿主細胞時，典型地將聚腺苷酸化序列或轉錄終止子序列摻入載體中。終止子序列的實例是來自牛生長激素基因的聚腺苷酸化序列。還可以包括用于轉錄物的精確剪接的序列。剪接序列的實例是SV40的VP1內含子(Sprague等，(1983)/F/ro/.45:773-781)。另夕卜，還可以將在宿主細胞中控制復制的基因序列摻入到載體中，例如在牛乳頭狀瘤病毒型載體中發(fā)現的那些載體(Saveria-Campo(1985)C/ow'"g,第II巻，a尸rac〃ca/J//raac/z,D.M.Glover編輯，IRLPress,Arlington,Virginia,213-238頁)。動物和低等真核(例如酵母)宿主細胞是轉染感受態(tài)的，或通過各種方法使其成為轉染感受態(tài)的。有數種眾所周知的方法將DNA導入動物細胞中。這些方法包括磷酸鈣沉淀、受體細胞與含DNA的細菌原生質體融合、用含DNA的脂質體處理受體細胞、DEAE糊精、電穿孔、粒子槍和直接向細胞中微注射DNA。轉染細胞通過本領域眾所周知的方法培養(yǎng)(Kuchler(1997)Afe^zodsCe〃Cw/ft#*eawe/Kz>o/ogv,Dowden,HutchinsonandRoss,Inc.)。II.調控異戊烯基轉移酶多肽的濃度和/或活性提供在植物中調控本發(fā)明多肽的濃度和/或活性的方法。一般而言，IPT多肽的濃度和/或活性相對于不含導入序列的天然對照植物、植物部分或細胞增加或降低至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或卯°/。以上。濃度和/或活性的調控可發(fā)生在發(fā)育的一個或多個階段。在具體的實施方案中，在諸如玉米的單子葉植物中調控本發(fā)明的多肽。IPT多肽的表達水平可通過例如測定植物中的IPT多肽水平直接檢測，或者例如通過測定植物中的細胞分裂素合成活性間接檢測。測定細胞分裂素合成活性的方法在本文另外一處描述。在具體的實施方案中，將本發(fā)明的多肽或多核苷酸導入到植物細胞中。隨后，使用本領域技術人員已知的方法，例如但不限于蛋白質印跡分析、DNA測序、PCR分析或表型分析，選擇導入了本發(fā)明序列的植物細胞。通過前述實施方案而被改變或修飾的植物或植物部分在植林形成條件下生長一段時間，該段時間足以調控本發(fā)明多肽在植物中的濃度和/或活性。植抹形成條件在本領域中眾所周知，并在本文另外一處簡要論述。還要認識到的是,可通過使用不能在轉化植物中指導蛋白或RNA表達的多核苷酸調控多肽的水平和/或活性。例如，本發(fā)明的多核苷酸可用于設計多核苷酸構建體，該構建體可用于改變或突變生物中的基因組核苷酸序列的方法。這樣的多核苦酸構建體包括但不限于RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復載體、混合雙螺旋寡核苷酸、自身互補的RNA:DNA寡核苷酸和引起重組的寡核苷酸酶。這些核香酸構建體和使用方法是本領域已知的。參見美國專利第5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984號；所有這些專利都通過引用結合到本文中。另參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等，(1999)Prac.A^/.」ca<i.t/5L496:8774-8778，所述文獻通過引用結合到本文中。因此，要認識到，本發(fā)明的方法不依賴于將整個多核苷酸摻入基因組中，只要植物或其細胞由于多核苷酸導入細胞中而發(fā)生改變即可。在本發(fā)明的一個實施方案中，基因組可在多核苷酸導入細胞中之后而被改變。例如，多核苷酸或其任何部分均可摻入植物基因組中?；蚪M的改變包括但不限于基因組中的核苷酸的添加、缺失和取代。代，但公認這種添加、缺失或取代包含至少1個核苷酸。還要認識到，可對IPT序列的水平和/或活性進行調控，以僅在某些發(fā)育階段使序列產生作用，并在不再需要表達的其它階段關閉該作用。通過使用誘導型或組織優(yōu)選啟動子可獲得IPT表達控制。或者，可使用位點特異性重組酶、轉座子或重組系統(tǒng)使基因反向或缺失，這也會打開或關閉IPT序列的表達。"受試的植物或植物細胞"是指其中相對于目標基因已實現基因改變如轉化的植物或植物細胞，或者為由如此改變的植物或細胞遺傳并含有該改變的植物或植物細胞。"對照"或"對照植物"或"對照植物細胞，，提供測定受試植物或植物細胞的表型變化的參考點。對照植物或植物細胞可包含例如(a)野生型植物或細胞，即其與起始材料具有相同基因型，用于基因改變，產生受試植物或細胞；(b)與起始材料具有相同基因型但已用無效構建體(即對目標性狀沒有已知影響的構建體，例如含標記基因的構建體)轉化的植物或植物細胞；(c)在受試植物或植物細胞的后代中為非轉化的分離子的植物或植物細胞；(d)與受試植物或植物細胞遺傳相同但未接觸會誘導目標基因表達的條件或刺激的植物或植物細胞，或(e)在不表達目標基因的條件下的受試植物或植物細胞本身。在本例中，例如，細胞分裂素水平的改變，包括細胞分裂素絕對量、細胞分裂素比例、細胞分裂素活性或細胞分裂素分布的變化，或植物或植物細胞表型的變化，例如開花時間、結實、分支、衰老、脅迫耐受性或根群，可通過將受試植物或植物細胞與對照植物或植物細胞相比較來測定。在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體可與其它目標多核苷酸序列組合使用("堆積，，)，以便產生具有目標表型的植物。本發(fā)明的多核苷酸可用任何基因或基因組合堆積，產生的組合可以包括任何一個或多個目標多核苷酸的多個拷貝。所需組合可影響一種或多種性狀；也就是說，可產生用于調控影響細胞分裂素活性的基因表達的某些組合。例如，細胞分裂素合成的上調可與細胞分裂素降解的下調組合?？稍O計其它組合，以產生具有多種所需性狀(例如先前描述的那些性狀)的植物。A.增加異戊烯基轉移酶多肽的活性和/或濃度提供增加本發(fā)明的IPT多肽的活性和/或濃度的方法?？赏ㄟ^向植物提供IPT多肽實現本發(fā)明的IPT多肽濃度和/或活性的增加。如本文另外一處所論述，本領域已知許多向植物提供多肽的方法，包括但不限于將多肽直接導入植物中，和將編碼具有細胞分裂素合成活性的多肽的多核苷酸構建體導入植物中(瞬時地或穩(wěn)定地)。還要認識到，本發(fā)明的方法可使用不能在轉化植物中指導蛋白或RNA表達的多核苷酸。因此，IPT多肽的水平和/或活性可通過改變編碼IPT多肽的基因或其啟動子而增加。參見例如Kmiec,美國專利5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868。因此，提供了在ITP基因中攜帶突變的誘變植物，其中突變增加IPT基因的表達，或增加所編碼IPT多肽的細胞分裂素合成活性。如本文另外一處所述，測定蛋白濃度增加或細胞分裂素合成活性增加的方法是已知的。B.降低異戊烯基轉移酶多肽的活性和/或濃度提供通過用表達盒轉化宿主細胞降低或去除IPT多肽的活性和/或濃度的方法，所述表達盒表達抑制IPT多肽表達的多核苷酸。該多核普酸可通過阻止IPT多肽信使RNA的翻譯而直接抑制IPT多肽表達，或通過編碼抑制編碼IPT多肽的IPT多肽基因的轉錄或翻譯的分子間接抑制IPT多肽表達。在植物中抑制或去除基因表達的方法在本領域眾所周知，任何這樣的方法均可在本發(fā)明中用于抑制IPT多肽的表達。根據本發(fā)明，如果IPT多肽的水平在統(tǒng)計上低于在未進行遺傳修飾或誘變以抑制該IPT多肽表達的植物中的相同IPT多肽的水平，則IPT多肽的表達被抑制。在本發(fā)明的具體實施方案中，在本發(fā)明的修飾植物中的IPT多肽的蛋白水平低于在不是突變體或還未被遺傳修飾以抑制該IPT多肽表達的植物中相同IPT多肽的蛋白水平的95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20。/。、10%或5%。IPT多肽的表達水平例如可通過測定細胞或植物中表達的IPT多肽水平直接測定，或者例如通過檢測細胞或植物中的細胞分裂素合成活性間接測定。測定IPT多肽的細胞分裂素合成活性的方法在本文另外一處描述。在本發(fā)明的其它實施方案中，通過用表達盒轉化植物細胞來降低或去除一種或多種IPT多肽的活性，所述表達盒包含編碼抑制一種或多種IPT多肽活性的多肽的多核苷酸。根據本發(fā)明，如果IPT多肽的細胞分裂素合成活性在統(tǒng)計上低于在未進行遺傳修飾以抑制該IPT多肽的細胞分裂素合成活性的植物中相同IPT多肽的細胞分裂素合成活性，則IPT多肽的細胞分裂素合成活性^皮抑制。在本發(fā)明的具體實施方案中，根據本發(fā)明，在本發(fā)明的修飾植物中的IPT多肽的細胞分裂素合成活性低于在還未進行遺傳修飾以抑制該IPT多肽表達的植物中相同IPT多肽的細胞分裂素合成活性的95°/。、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。根據本發(fā)明，當通過本文另外一處描述的檢測方法不可檢出IPT多肽的細胞分裂素合成活性時，該活性被"去除"。測定IPT多肽的細胞分裂素合成活性的方法在本文另外一處描述。在其它實施方案中，可通過石皮壞編碼IPT多肽的基因降低或去除IPT多肽的活性。本發(fā)明包含在IPT基因中攜帶突變的誘變植物，其中突變P爭低IPT基因的表達，或抑制編碼的IPT多肽的細胞分裂素合成活性。因此，可使用多種方法降低或去除IPT多肽的活性?？墒褂靡环N以上的方法降低一種IPT多肽的活性。另外，可使用組合方法降低或去除兩種或更多種不同IPT多肽的活性。降低或去除IPT多肽表達的方法的非限制性實例在下文給出。1.基于多核苷酸的方法在本發(fā)明的某些實施方案中，用能夠表達抑制IPT序列表達的多核香酸的表達盒轉化植物細胞。本文所用術語"表達"是指基因產物的生物合成，包括所述基因產物的轉錄和/或翻譯。例如，對本發(fā)明目的而言，能夠表達抑制至少1個IPT序列表達的多核苷酸的表達盒是能夠產生抑制至少一種IPT多肽的轉錄和/或翻譯的RNA分子的表達盒。從DNA分子"表達"或"產生"蛋白或多肽是指編碼序列的轉錄和翻譯產生蛋白或多肽，而從RNA分子"表達"或"產生"蛋白或多肽是指RNA編碼序列的翻譯產生蛋白或多肽。抑制IPT序列表達的多核苷酸的實例在下文給出。i.有義抑制/共抑制在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過有義抑制或共抑制獲得對IPT多肽表達的抑制。對于共抑制，表達盒設計用于以"有義"方向表達對應于編碼IPT多肽的全部或部分信使RNA的RNA分子。RNA分子的過量表達可導致天然基因表達降低。因此，對用共抑制表達盒轉化的多個植物系進行篩選，以鑒定那些表現出最大的IPT多肽表達抑制的植物系。用于共抑制的多核苷酸可對應于編碼IPT多肽的全部或部分序列，IPT多肽轉錄物的全部或部分5'和/或3'非翻譯區(qū)，或者編碼IPT多肽的轉錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)這二者的全部或部分。在某些實施方案中，在多核苷酸包含IPT多肽的全部或部分編碼區(qū)時，表達盒被設計為除去多核苷酸的起始密碼子，使得蛋白產物將不被轉錄。共抑制可用于抑制植物基因表達，以產生由這些基因編碼的蛋白的蛋白水平不可檢測的植物。參見例如Broin等，(2002)戶/a"fCe〃14:1417-1432。共抑制還可以用于抑制同一植林中多種蛋白的表達。參見例如美國專利第5,942,657號。在Flavell等，(1994)/Voc.A^/.」cad5W.L^491:3490-3496;Jorgensen等，(1996)尸/a"fM/.5/。/.31:957-973;Johansen和Carrington(2001)P/a"f尸/z^/。/.126:930-938;Broin等，(2002)戶/""fCe〃14:1417-1432;Stoutjesdijk等，(2002)尸/a"f尸/z;w'o/.129:1723-1731;Yu等，(2003)尸/z;;toc/ze柳S^y63:753-763;和美國專利第5,034,323、5,283,184和5,942,657號中描述了用共抑制抑制植物中的內源基因表達的方法；所述各文獻均通過引用結合到本文中。可通過在表達盒的有義序列的3'位和聚腺苷酸化信號的5'位包含poly-dT區(qū)來提高共抑制的效率。參見美國專利公布號20020048814,該專利通過引用結合到本文中。典型地，該核苷酸序列與內源基因轉錄物的序列具有顯著的序列同一性，優(yōu)選地為大于約65%序列同一性，更優(yōu)選地為大于約85%序列同一性，最優(yōu)選地為大于約95%序列同一性。參見美國專利第5,283,184和5，034，323號，所述專利通過引用結合到本文中。ii.反義抑制在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過反義抑制獲得對IPT多肽表達的抑制。對于反義抑制，表達盒被設計成表達與編碼IPT多肽的全部或部分信使RNA互補的RNA分子。反義RNA分子的過量表達可導致天然基因的表達降低。因此，篩選用反義抑制表達盒轉化的多個植物系，以鑒定表現出最大的IPT多肽表達抑制的那些植物系。用于反義抑制的多核苷酸可對應于編碼IPT多肽的序列的全部或部分互補序列，IPT多肽轉錄物5'和/或3'非翻譯區(qū)的全部或部分互補序列，或者編碼IPT多肽的轉錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)這二者的互補序列的全部或部分。另外，反義多核苦酸可以與靶序列完全互補(即與靶序列的互補序列有100%同一性)或部分互補(即與靶序列的互補序列的同一性小于100%)。反義抑制可用于抑制同一植林中多種蛋白的表達。參見例如美國專利第5，942，657號。此外，部分反義核苷酸可用于破壞靶基因的表達。一般而言，可使用至少50個核苦酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300個、400個、450個、500個、550個以上的核苷酸的序列。在例如Liu等，(2002)尸/a"f尸/2"/0/.129:1732-1743和美國專利第5,759,829和5,942,657號中描述了用反義抑制來抑制植物中的內源基因表達的方法，所述各文獻均通過引用結合到本文中。可通過在表達盒中的反義序列的3'位和聚腺苷酸化信號的5'位包含poly-dT區(qū)來提高反義抑制的效率。參見美國專利公布號20020048814,該專利通過引用結合到本文中。iii.雙鏈RNA干擾在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾，獲得對IPT多肽表達的抑制。對于dsRNA干擾，在同一細胞中表達部分互補的反義RNA分子，產生對相應內源信使RNA表達的抑制。可通過設計含有義序列和反義序列的表達盒實現有義和反義分子的表達。或者，可對有義和反義序列使用獨立的表達盒。然后，篩選用一個或多個dsRNA干擾表達盒轉化的多種植物系，以鑒定表現出最大IPT多肽表達抑制的植物系。在Waterhouse等，(1998)Ato/.爿cac/.5W.t/5^95:13959-13964;Liu等，(2002)P/a"f尸/y;w'o/.129:1732-1743和WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035中描述了用dsRNA干擾來抑制內源植物基因表達的方法；所述各文獻均通過引用結合到本文中。iv.發(fā)夾RNA干擾和含有內含子的發(fā)夾RNA干擾在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾或含有內含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾，獲得對一種或多種IPT多肽表達的抑制。這些方法高效抑制內源基因的表達。參見Waterhouse和Helliwell(2003)4:29-38,該文獻通過引用結合到本文中。對于hpRNA干擾，表達盒被設計成表達與自身雜交而形成發(fā)夾結構的RNA分子，所述發(fā)夾結構含有單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對莖。堿基配對莖區(qū)含有對應于全部或部分內源信使RNA的有義序列以及與該有義序列完全或部分互補的反義序列，所述內源信使RNA編碼基因的表達被抑制。因此，分子的堿基配對莖區(qū)通常決定RNA干擾的特異性。hpRNA分子高效抑制內源基因的表達，其誘導的RNA干擾可由植物后代遺傳下去。參見例如Chuang和Meyerowitz(2000)Ato/.^cad5W.L/iSJ97:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)戶/mrf129:1723-1731;和Waterhouse和Helliwell(2003)Ato.4:29-38。在例如Chuang和Meyerowitz(2000)尸rac.A^/.爿cad97:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)戶/a"f尸/7"〖0/.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)iVW.iev.4:29-38;Pandolfini等,5MCB/o&c/zwo/ogy3:7和美國專利公布號2003/0175965中描述了使用hpRNA干擾來抑制基因表達或使基因表達沉默的方法；所述各文獻均通過引用結合到本文中。在Panstruga等，(2003)Mo/.歷o/.30:135-140中描述了hpRNA構建體在體內使基因表達沉默的效率的瞬時測定，該文獻通過引用結合到本文中。或者，堿基配對莖區(qū)可對應于控制要抑制的基因表達的啟動子序列區(qū)部分?？赏ㄟ^使用hpRNA構建體實現轉錄基因沉默(TGS)，其中發(fā)夾的反向重復序列與驅動待沉默基因表達的啟動子區(qū)共享序列同一性。參見例如2004年12月16日申請的美國專利申請11/014,071。將hpRNA加工為可與同源啟動子區(qū)相互作用的短RNA的過程可觸發(fā)降解或曱基化，從而導致沉默(Aufsatz等，(2002)尸A^S99(增刊4):16499-16506;Mette等，(2000)J19(19):5194-5201)。對于ihpRNA，干擾分子具有與hpRNA相同的通用結構，但RNA分子另外含有能夠在表達ihpRNA的細胞中被剪接的內含子。使用內含子可使發(fā)夾RNA分子中剪接后環(huán)的大小減至最小，這提高了干擾效率。參見例如Smith等，(2000)A^w"407:319-320。事實上，Smith等使用ihpRNA介導的干擾表現出100%的內源基因表達抑制。在例如Smith等，(2000)Atowe407:319-320;Wesley等，(2001)/27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)Cwr.6^'".P/a"f所o/.5:146-150;Waterhouse和Helliwell(2003)iVW.Aev.4:29-38;Helliwell和Waterhouse(2003)M"/zoA30:289-295和美國專利公布號20030180945中描述了用ihpRNA干擾來抑制內源植物基因表達的方法，所述各文獻均通過引用結合到本文中。不對應于內源RNA。在該實施方案中，有義序列和反義序列位于環(huán)序列側翼，所述環(huán)序列含有的核苷酸序列對應于靶基因的全部或部分內源信使RNA。因此，是環(huán)區(qū)決定RNA干擾的特異性。參見例如WO02/00904，該文獻通過引用結合到本文中。v.擴增子介導的干擾擴增子表達盒含有植物病毒來源的序列，該序列含有全部或部分靶基因，但通常不含天然病毒的所有基因。表達盒的轉錄產物中存在的病毒序列可使轉錄產物指導其自身復制。由擴增子產生的轉錄物相對于靶序列(即IPT多肽的信使RNA)可為有義的或反義的。在例如Angell和Baulcombe(1997)五M5(9>/16:3675-3684;Angell和Baulcombe(1999)P/a"fJ20:357-362和美國專利第6,646,805號中描述了用擴增子抑制內源植物基因表達的方法，所述各文獻均通過？1用結合到本文中。vi.核酶在某些實施方案中，由本發(fā)明的表達盒表達的多核苷酸是催化性RNA,或者具有對IPT多肽的信使RNA具有特異性的核酶活性。因此，多核苷酸可使內源信使RNA降解，導致IPT多肽的表達降低。該方法描述于例如美國專利第4,987,071號，該專利通過引用結合到本文中。vii.小干擾RNA或微RNA在本發(fā)明的某些實施方案中，可通過量表達編碼微RNA(miRNA)的基因的RNA干擾，獲得對一種或多種IPT多肽表達的抑制。miRNA是由約22個核糖核苷酸組成的調節(jié)因子。miRNA高效抑制內源基因的表達。參見例如Javier等，(2003)425:257-263,該文獻通過引用結合到本文中。對于miRNA干擾，表達盒被設計成表達模擬內源miRNA基因的RNA分子。miRNA基因編碼的RNA形成含22個核苷酸的序列的發(fā)夾結構，該序列與另一內源基因(耙序列)互補。為抑制IPT多肽表達，22個核苷酸的序列選自IPT多肽轉錄物序列，并以有義方向含有編碼所述IPT多肽序列的22個核普酸，以及與有義序列互補的相應反義序列的21個核苷酸。miRNA分子高效抑制內源基因的表達，它們誘導的RNA干擾被植物后代遺傳下去。2.基于多肽的基因表達抑制在一個實施方案中，多核苷酸編碼的鋅指蛋白與編碼IPT多肽的基因結合，導致基因表達降低。在具體的實施方案中，鋅指蛋白與IPT多肽基因的調節(jié)區(qū)結合。在其它實施方案中，鋅指蛋白與編碼IPT多肽的信使RNA結合，并阻止其翻譯。選擇鋅指蛋白靶向位點的方法描述于例如美國專利第6,453,242號，使用鋅指蛋白抑制植物中的基因表達的方法描述于例如美國專利公布號20030037355;所述各文獻均通過引用結合到本文中。3.基于多肽的蛋白活性抑制在本發(fā)明的某些實施方案中，多核苷酸編碼與至少一種IPT多肽結合的抗體，并降低IPT多肽的細胞分裂素合成活性。在另一個實施方案中，抗體的結合通過細胞質控機制導致抗體-IPT多肽復合物的轉換增加?？贵w在植物細胞中的表達以及通過在植物細胞中表達抗體并使抗體與蛋白結合而抑制分子途徑在本領域眾所周知。參見例如Conrad和Sonnewald(2003)AW匿B/她c/z.21:35-36，該文獻通過引用結合到本文中。4.基因破壞在本發(fā)明的某些實施方案中，通過破壞編碼IPT多肽的基因降低或去除IPT多肽的活性?？赏ㄟ^任何本領域已知方法^皮壞編碼IPT多肽的基因。例如，在一個實施方案中，通過轉座子標記破壞基因。在另一個實施方案中，如下破壞基因使用隨機或定向誘變，誘使植物發(fā)生突變，從中選出IPT活性降低的植物。i.轉座子標記在本發(fā)明的一個實施方案中，使用轉座子標記降低或去除一種或多種IPT多肽的細胞分裂素合成活性。轉座子標記包括將轉座子插入到內源IPT基因中，以降低或去除IPT多肽表達。"IPT基因，，是指編碼本發(fā)明的IPT多肽的基因。在該實施方案中，通過將轉座子插入編碼IPT多肽的基因的調節(jié)區(qū)或編碼區(qū)中降低或去除一種或多種IPT多肽的表達。可使用位于IPT多肽基因的外顯子、內含子、5'或3'非翻譯序列、啟動子或任何其它調節(jié)序列中的轉座子降低或去除編碼IPT多肽的表達和/或活性。用于植物中特定基因的轉座子標記的方法在本領域眾所周知。參見例如Maes等，(1999)7>e"<is戶/a"fSc/.4:90曙96;Dharmapuri和Sonti(1999)F五MSM/cra&o/.179:53-59;Meissner等，(2000)P/a"f/22:265-274;Phogat等，(2000)5,as"25:57-63;Walbot(2000)Cwm6>//".尸/^^說o/.2:103誦107;Gai等，(2000)M/c/e/c^c/^s7仏28:94-96;Fitzmaurice等,(1999)G，"cs153:1919-1928)。另外，在Bensen等，(1995)P/a"fCW/7:75-84;Mena等，(1996)5We"ce274:1537-1540;和美國專利第5,962,764號中描述了在選定基因中選擇Mu插入的TUSC方法，所述各文獻均通過引用結合到本文中。ii.活性降低的突變植物其它降低或去除植物中內源基因表達的方法在本領域也是已知的，并可類似地應用于本發(fā)明。這些方法包括其它形式的誘變，例如在反向遺傳學方面(采用PCR)使用曱磺酸乙酯誘導的誘變、缺失誘變和快中子缺失誘變，以鑒定內源基因已缺失的植物系。有關這些方法的實例參見Ohshima等，(1998)Wra/og);243:472-481;Okubara等，(1994)137:867-874;和Quesada等，(2000)154:421-436;所述各文獻均通過引用結合到本文中。另外，使用變性HPLC或選定PCR產物的選擇性內切核酸酶消化，篩選化學誘導突變的快速自動化方法TILLING(定向誘導基因組局部突變)也可應用于本發(fā)明。參見McCallum等，(2000)A^.所o&c/z"o/.18:455-457，該文獻通過引用結合到本文中。影響基因表達或干擾編碼蛋白功能(IPT活性)的突變在本領域眾所周知。在基因外顯子中的插入突變通常產生無效突變體。保守殘基突變對抑制編碼蛋白的細胞分裂素合成活性特別有效。已描述了植物IPT多肽中適于以去除IPT活性為目標的誘變的保守殘基。參見例如圖1。這類突變體可根據眾所周知的方法分離，不同IPT基因座中的突變可通過遺傳雜交堆積。參見例如Gruis等，(2002)尸/朋fCe〃14:2863-2882。在本發(fā)明的另一個實施方案中，由于基因反向和重復基因座的重組，顯性突變體可用于觸發(fā)RNA沉默。參見例如Kusaba等，(2003)尸/a"/Ce//15:1455-1467。本發(fā)明包含降低或去除一種或多種IPT多肽活性的其它方法。其本領域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復載體、混合雙鏈寡核苷酸、自身互補的RNA:DNA寡核苷酸和引起重組的寡核苷酸酶。這些載體和使用方法是本領域已知的。參見例如美國專利第5,565,350、5，731，181、5，756,325、5,760，012、5,795,972和5,871,984號，所述各專利均通過引用結合到本文中。另參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等，(1999)iVW/.Jcadt/5L496:8774-8778;所述各文獻均通過引用結合到本文中。III.調控細胞分裂素水平和/或活性本文所用的"細胞分裂素"是指一類在細胞周期中起核心作用并影響眾多發(fā)育程序的植物特異性激素或該類中的成員。細胞分裂素包括N^取代的噤呤衍生物。代表性的細胞分裂素包括異戊烯基腺噪呤(N、(A、異戊烯基)腺嘌呤(以下簡稱iP)、玉米素(6-(4-羥基-3曱基丁-反式_2_烯基氨基)嘌呤)(以下簡稱Z)和二氫玉米素(DZ)。游離堿基及其核苷(iPR、ZR和DZR)被認為是活性化合物。其它細胞分裂素是已知的。參見例如美國專利第5,211,738號和Keiber等，(2002)C"oA:/w>w,7TzeJraWo/^sAmericanSocietyofPlantBiologists,這兩個文獻均通過引用結合到本文中。"調控細胞分裂素水平"包括與對照植物相比時植物中的細胞分裂素水平和/或活性的任何統(tǒng)計學顯著性降低或提高。例如，在與對照植物或植物部分相比時，調控水平和/或活性可包括總細胞分裂素含量大約提高或降低0.1%、0.5%、1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75°/。、80%、85%、90°/。、95%以上?；蛘?，在與對照植物或植物部分相比時，細胞分裂素的調控水平和/和活性可包括植物或植物部分中的細胞分裂素水平/或活性整體大約提高或降低0.2倍、0.5倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍以上。還要認識到，調控細胞分裂素水平/活性不一定是細胞分裂素水平和/或活性的整體提高/降低，而是還包括細胞分裂素的組織分布的變化。而且，調控細胞分裂素水平/活性不一定是細胞分裂素的整體提高/降低，而是還包括多種細胞分裂素衍生物的比例變化。例如，在與對照植物相比時，多種細胞分裂素衍生物(例如異戊烯基腺嘌呤型、玉米素型或二氫玉米素型細胞分裂素等)的比例可被改變，由此調控植物或植物部分的細胞分裂素的水平/活性。測定細胞分裂素水平和/或活性的調控的方法是本領域已知的。例如，用于細胞分裂素提取、免疫純化、HPLC分離和通過ELISA法定量的代表性方法可參見例如Faiss等，(1997)尸/a"^J":401-415。另參見Werner等，(2001)尸A^S198:10487-10492)和Dewitte等，(1999)P/a"f尸/^w'o/.119:111-121。這些參考文獻中的每一個均通過引用結合到本文中。如本文另外一處所論述，細胞分裂素水平和/或活性的調控還可以通過監(jiān)測特定植物表型而進一步檢測。這類表型在本文另外一處描述。在具體的方法中，通過提高植物中的IPT多肽的水平或活性來提高植物中的細胞分裂素的水平和/或活性。提高植物中的IPT多肽的水平和/或活性的方法將在本文另外一處描述。簡要來說，這些方法包括向植物提供本發(fā)明的IPT多肽，從而提高IPT多肽的水平和/或活性。在其它實施方案中，可如下提供編碼IPT多肽的IPT核苷酸序列將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列的多核苷酸導入植物中，表達IPT序列，并由此在與對照植物相比時提高植物或植物部分中的細胞分裂素的水平和/或活性。在某些實施方案中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。在其它方法中，通過降低植物中的一種或多種IPT多肽的水平和/或活性來降低植物中的細胞分裂素的水平和/或活性。這類方法的細節(jié)公開于本文另外一處。在一種這樣的方法中，將IPT核苷酸序列導入植物中，IPT核苷酸序列的表達降低IPT多肽的活性，從而在與對照植物或植物部分相比時降低植物或植物部分中的細胞分裂素水平和/或活性。在其它實施方案中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。如上所述，技術人員知曉用于在植物中調控細胞分裂素的水平/活性的適宜啟動子。該實施方案的示例性啟動子已在本文另外一處公開。因此，本發(fā)明還提供與對照植物中的細胞分裂素水平/活性相比時具有細胞分裂素水平/活性受調控的植物。在一個實施方案中，本發(fā)明植物的本發(fā)明IPT多肽的水平/活性提高，因此細胞分裂素水平/活性提高。在其它實施方案中，本發(fā)明植物的本發(fā)明IPT多肽的水平降低或去除，從而使細胞分裂素水平/活性降低。在某些實施方案中，這些植物將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定摻入其基因組中，所述IPT核苷酸序列與在植物細胞中驅動表達的啟動子有效連接。IV.調控根發(fā)育提供在植物中調控根發(fā)育的方法。所述"調控根發(fā)育"是指與對照植物相比時植物根發(fā)育的任何變化。根發(fā)育的這些變化包括但不限于初生根生長速度、根鮮重、側根和不定根形成程度、維管系統(tǒng)、分生組織發(fā)育或徑向擴展的變化。提供在植物中調控根發(fā)育的方法。所述方法包括調控植物中的IPT多肽的水平和/或活性。在一種方法中，將本發(fā)明的IPT序列提供給植物。在另一種方法中，如下提供IPT核苷酸序列將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列(其可以為所提供的全長IPT序列的片段)的多核苷酸導入植物中，表達所述IPT序列，由此改變根發(fā)育。在其它的方法中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。在其它方法中，通過降低植物中的IPT多肽的水平或活性來調控根發(fā)育。這類方法可包括將IPT核苷酸序列導入植物中，并降低IPT多肽的活性。在某些方法中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。細胞分裂素合成活性的降低可導致至少一個或多個下述根發(fā)育變化包括但不限于與對照植物相比，根分生組織更大、根生長增加、徑向擴展增強、維管系統(tǒng)增加、根分支增加、不定根更多和/或根鮮重增加。本文所用"根生長"包括在單子葉植物和雙子葉植物中，在根發(fā)育的不同階段組成根系的不同部分生長的所有方面。應理解的是，根生長的增強可起因于其一個或多個部分(包括初生根、側根、不定根等)生長的增強。檢測根系的這些發(fā)育變化的方法是本領域已知的。參見例如美國專利申請第2003/0074698號和Werner等，(2001)/W^S18:10487-10492,這兩個文獻均通過引用結合到本文中。如上所論述，技術人員應知曉用于植物中調控根發(fā)育的適宜啟動子。該實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子和根優(yōu)選啟動子。示例性的根優(yōu)選啟動子已在本文另外一處公開。通過降低IPT多肽的活性和/或水平刺激根生長和增加根群，還可用于改善植物的耐倒伏性。術語"抗倒伏性"或"耐倒伏性"是指植物將其自身固定在土壤中的能力。對具有直立或半直立生長習性的植物而言，該術語也指在不利環(huán)境條件下保持垂直位置的能力。該性狀涉及根系的大小、深度和形態(tài)。另外，在合適的發(fā)育階段，通過降低IPT多肽的水平和/或活性刺激根生長并增加根群，還可用于促進外植體的體外繁殖。增加根生物量和/或改變根結構還可用于改進植物利用氮的效率。這種改進的效率可導致例如在可獲得的氮為現有水平時植物生物量和/或種子產量增加，或在可獲得的氮受限時維持植物生物量和/或種子產量。因而產生農藝和/或環(huán)境利益。此外，由于IPT多肽的水平和/或活性降低而產生更高的根生物量物產生的化合物產量。在根培養(yǎng)物中產生的令人感興趣的化合物的一個實例是紫草素，其產量可通過所述方法有利地提高。因此，本發(fā)明還提供在與對照植物的根發(fā)育相比時具有根發(fā)育受調控的植物。在某些實施方案中，本發(fā)明植物的本發(fā)明IPT多肽的水平/活性降低，根生長和/或根生物量增加。在某些實施方案中，這些植物將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定摻入其基因組中，所述IPT核苷酸序列與在植物細胞中驅動表達的啟動子有效連接。V.調控枝條和葉發(fā)育還提供在植物中調控營養(yǎng)組織生長的方法。在一個實施方案中，調控植物中的枝條和葉的發(fā)育。所述"調控枝條和/或葉發(fā)育"是指在與對照植物或植物部分相比時植物枝條和/或葉發(fā)育的任何變化。枝條和/或葉發(fā)育的這些變化包括但不限于根分生組織發(fā)育、葉片數目、葉片大小、葉和莖的維管系統(tǒng)、節(jié)間長度和葉衰老的變化。本文所用"葉發(fā)育"和"枝條發(fā)育"包括在單子葉植物和雙子葉植物這二者中于其發(fā)育的不同階段分別組成葉系和枝條系的不同部分的生長的所有方面。檢測枝條和葉系的這些發(fā)育變化的方法是本領域已知的。參見例如Werner等，(2001)iWAS98:10487-10492和美國專利申請?zhí)?003/0074698，所述各文獻均通過引用結合到本文中。調控植物中的枝條和/或葉發(fā)育的方法包括調控本發(fā)明的IPT多肽的活性和/或水平。在一個實施方案中，提供本發(fā)明的IPT序列。在其它實施方案中，可如下提供IPT核苷酸序列將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列的多核苷酸導入植物中，表達IPT序列，由此改變枝條和/或葉發(fā)育。在其它實施方案中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。在具體的實施方案中，通過降低植物中的IPT多肽的水平和/或活性調控枝條或葉的發(fā)育。IPT活性的降低可使枝條和/或葉發(fā)育產生一種或多種變化，包括但不限于在與對照植物相比時頂端分生組織更小、葉片數目減少、葉片表面積減少、維管組織減少、節(jié)間縮短和生長矮化以及葉衰老加速。如上所述，技術人員知曉用于調控植物的枝條和葉發(fā)育的適宜啟動子。該實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、枝條優(yōu)選啟動子、枝條分生組織優(yōu)選啟動子、衰老活化型啟動子、脅迫誘導型啟動子、才艮優(yōu)選啟動子、氮誘導型啟動子和葉優(yōu)選啟動子。示例性啟動子已在本文另外一處公開。降低植物中的細胞分裂素合成活性通常導致節(jié)間縮短和生長矮化。因此，本發(fā)明的方法可用于產生矮小植抹。另外，如上所論述，調控植物中的細胞分裂素合成活性調控根和枝條這二者的生長。因此，本發(fā)明還提供改變根莖比的方法。還可以通過增加植物中的IPT多肽的水平和/或活性調控枝條或葉發(fā)育。IPT活性的增加可導致枝條和/或葉發(fā)育的一種或多種變化，包括但不限于在與對照植物相比時葉片數目增加、葉片表面積增加、維管組織增加、枝條形成增加、節(jié)間變長、生長改善、植物產量和生長勢改進以及葉衰老延遲。在一個實施方案中，提高了植物對洪澇的耐受性。洪澇是一種影響植物生長和產量的嚴重環(huán)境脅迫。洪澇引起早衰，早衰造成葉萎黃、壞死、落葉、生長停止及產量降低。細胞分裂素可調節(jié)衰老，并且本發(fā)明通過增加植物中的IPT多肽的水平/活性，改善了植物對包括洪澇突害在內的各種環(huán)境脅迫的耐受性。衰老的延遲還可以有利地擴大農作物的成熟適應性、改善盆栽植物的保存期以及延長切花的插瓶期。在其它的實施方案中，提供在愈傷組織中調控枝條再生的方法。在該方法中，提高IPT多肽的水平和/或活性將提高植物中的細胞分裂素水平。因此，需要降低培養(yǎng)基中的外源生長調節(jié)劑(即細胞分裂素)濃度或無外源細胞分裂素來增強愈傷組織中的枝條再生。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提高IPT序列的水平和/或活性可用于克服某些物種的不良抽莖潛力，該不良抽莖潛力限制了用于那些物種的轉基因技術的成功和速度。而且，可對在經濟上需要盡可能多地產生枝條的作物進行多枝條誘導。因此，提供增加轉化的再生速度的方法。在具體的實施方案中，IPT序列將處于誘導型啟動子(例如熱激啟動子、化學誘導型啟動子)控制之下。其它誘導型啟動子是本領域已知的，并在本文另外一處討論。從外植體建立愈傷組織的方法是已知的。例如，根、莖、芽和無菌發(fā)芽幼苗僅僅是可用于誘導愈傷組織形成的少數幾個組織來源。一般而言，使用幼小且活躍生長的組織(即幼葉、根、分生組織或其它組織)，但并不是必需的。愈傷組織的形成由培養(yǎng)基中存在的生長調節(jié)物質(植物生長素和細胞分裂素)控制。誘導愈傷組織形成所需要的植物調節(jié)物的具體濃度在物種之間有所變化，甚至可取決于外植體來源。在某些情況下，建議在測試過程中使用不同的生長物質(例如2,4-D或NAA)或其組合，因為某些物種可能對特定生長調節(jié)物不響應。另夕卜，培養(yǎng)條件(即光、溫度等)也可以影響愈傷組織的建立。愈傷組織培養(yǎng)物一經建立就可用于啟動枝條再生。參見例如Gurel等，(2001)7WA:J組25:25-33;Dodds等，(1995)ExperimentsinPlantTissueCulture,CambridgeUniversityPress;Gamborg(1995)尸/awfCW/，T7^weOgawC"http://w，G.Phillips編輯；和美國專利申請?zhí)?0030180952，所有文獻都通過引用結合到本文中。還要認識到，可通過提高幼苗的生長速度或提高生長勢來增加種子大小和/或重量。另外，如本文另外一處所論述，調控植物對脅迫的耐受性連同調控根、枝條和葉的發(fā)育可提高植物產量和生長勢。本文所用術語"生長勢"是指植物和/或某些植物部分的相對健康狀況、產量和生長速率，可由各種發(fā)育特征來反映，這些發(fā)育特征包括但不限于葉綠素濃度、光合速率、總生物量、根生物量、谷粒品質和/或谷粒產量。特別是在玉米中，生長勢還可以由穗生長速率、穗大小和/或穗絲突出的擴展性來反映。生長勢可涉及植物在早期發(fā)育當中的快速生長能力和萌發(fā)后發(fā)育良好的根系和發(fā)育良好的光合器官的成功建立。生長勢可在類似環(huán)境條件下參照不同基因型進行測定，或在不同環(huán)境條件下參照相同或不同基因型進行測定。因此，本發(fā)明還提供在與對照植物相比時具有枝條和/或葉發(fā)育受調控的植物。在某些實施方案中，本發(fā)明植物的本發(fā)明IPT多肽的水平/活性提高。在其它實施方案中，本發(fā)明植物的本發(fā)明IPT多肽的水平/活性降低。VI.調控生殖組織發(fā)育花和莢果的敗育在大豆中經常發(fā)生，一般被認為限制產量(Abernethy等，(1997)C朋《/P/a"f57:713-716;Dybing等，(1986)尸/a"f尸/7;w'o/81:1069-1074)。業(yè)已表明，細胞分裂素在花和莢果發(fā)育中起重要作用。向總狀花序外部施用卡基腺噤呤(一種細胞分裂素)降低花和/或莢果的敗育(Dyer等，(1988)載于Pharis和Rood編輯，尸/amgravi^/zsw6加wc&s.NewYork:Springer-Verlag,457-467;Peterson等,(1990)5oto"/ca/151:322-330;Mosjidis等，(1993)爿""a/so/5oto"y71:193-199;Reese等，(1995)J五;c/^/Boto"y46(289):957-964),非常大量的證據支持細胞分裂素在調節(jié)大豆的開花和結實中的作用(Huff和Dybing(1980)J五x;^/31:51-762;Ghiasi等，(1987)尸/a"f81:1069-1074;Peterson等，(1990)Botom.ca/Gaze"e151:322-330;Wiebold(1990)爿，"82:85-88;Mosjidis等，(1993),出處同上；Reese等，(1995),出處同上；Nagel等，(2001)爿""a/so/Boto"_y88:27-31)。響應于細胞分裂素處理而增加的莢果數和種子產量支持以下假設使用適宜啟動子增加發(fā)育中的花和莢果中的細胞分裂素濃度會導致大豆植物的總種子產量增加。提供調控生殖組織發(fā)育的方法。在一個實施方案中，提供在植物中調控花發(fā)育的方法。所述"調控花發(fā)育"是指與對照植物或植物部分相比植物生殖組織結構的任何改變。"調控花發(fā)育"還包括在與對發(fā)育延遲或加速)。宏觀改變可包括生殖器官大小、形狀、數目或位置、形成這些結構的發(fā)育時間段或在環(huán)境脅迫時維持或繼續(xù)進行開花過程的能力的變化。樣"見改變可包括組成生殖器官的細胞類型或形狀的變化。調控植物中花發(fā)育的方法包括調控(提高或降低)植物中的IPT多肽的水平和/或活性。在一種方法中，提供本發(fā)明的IPT序列。可如下提供IPT核苷酸序列將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列的多核苷酸導入植物中，表達IPT序列，從而改變花發(fā)育。在某些實施方案中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。如上所論述，技術人員知曉用于調控植物中的花發(fā)育的適宜啟動子。該實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、誘導型啟動子、括在本文另外一處列出的那些啟動子。在具體方法中，通過提高本發(fā)明的IPT序列的水平和/或活性調控花發(fā)育。這類方法可包括向植物中導入IPT核苷酸序列并提高IPT多肽的活性。在某些方法中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。IPT序列的水平和/或活性的提高可使花發(fā)育產生一種或多種變化，包括但不限于在與對照植物相比時開花加速、花的數目增加以及結實提高。另外，IPT序列的水平或活性的提高可導致防止花衰老和改變每個谷仁中的胚數目。參見Young等，(2004)P/a/^J38:910-22。檢測花發(fā)育的這些發(fā)育變化的方法是本領域已知的。參見例如Mouradov等，(2002)77ze尸/a"fCe〃Sl11-S130,該文獻通過引用結合到本文中。在其它方法中，通過降低本發(fā)明的IPT序列的水平和/或活性調控花發(fā)育。IPT序列的水平和/或活性的降低可導致谷仁敗育和產生不育雌花序。誘導開花延遲或抑制開花可用于提高紫花苜蓿等伺料作物的產量。因此，本發(fā)明還提供在與對照植物的花發(fā)育相比時具有花發(fā)育受調控的植物。組成包括本發(fā)明的IPT多肽水平/活性降低且花發(fā)育改變的植物。組成還包括本發(fā)明的IPT多肽水平/活性提高的植物，其中該植物在脅迫時維持或繼續(xù)進行開花過程。VII.調控植物的脅迫耐受性提供使用本發(fā)明的IPT序列改變植物對非生物性脅迫的耐受性的方法。幼苗生長或早期生長勢的增強經常與脅迫耐受性增加有關。例如，幼苗(包括幼苗萌芽時的根系)的快速發(fā)育對尤其是在諸如干旱的不利條件下的存活至關重要。可用于該方法的啟動子在本文另外一處描述，包括低水平組成型、誘導型或根優(yōu)選啟動子，例如來源于ZmlPT4和ZmlPT5調節(jié)序列的根優(yōu)選啟動子。因此，在本發(fā)明的一個方法中，在與對照植物相比時，通過降低萌芽幼苗中的IPT活性水平，提高或維持植物對脅迫的耐受性。在其它方法中，如下提供IPT核苷酸序列將含有本發(fā)明的IPT核苷酸序列的多核苷酸導入植物中，表達IPT序列，從而增加植物對脅迫的耐受性。在其它實施方案中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。還提供在非生物性脅迫事件當中增加或維持結實的方法。在脅迫(例如干旱、鹽、重金屬、溫度等)期當中，胚發(fā)育經常敗育。在玉米中，中斷的胚發(fā)育導致穗上的癟玉米粒(Cheikh和Jones(1994)P/a"f尸—o/.106:45-51;Dietrich等，(1995)尸/耐尸—'o/A.oc/z謡33:327-336)。在大豆中，在種子成熟前的莢果敗育可降低種子產量，并在最佳和脅迫條件當中均被觀察到。阻止這種種子損失將維持產量。因此，提供增加植物脅迫耐受性的方法(例如在開花和種子發(fā)育過程中)。增加本發(fā)明的IPT序列表達也可以調控脅迫期當中的花發(fā)育，并因此提供維持或改善植物在脅迫下的開花過程的方法。該方法包括提高本發(fā)明的IPT序列的水平和/或活性。在一種方法中，將IPT核苷酸序列導入植物中，并提高IPT多肽的水平和/或活性，從而維持或改善植物在脅迫條件下的耐受性。在其它方法中，導入到植物中的IPT核苷酸構建體被穩(wěn)定摻入植物基因組中。參見例如WO00/63401。在種子發(fā)育的延遲期當中，不利環(huán)境可導致顯著的產量不穩(wěn)定。在該階段當中，種子經歷了超結構、生物化學和對環(huán)境干擾的敏感性的劇烈變化，但在干重積蓄上基本未表現出變化。在延遲期當中發(fā)生的兩個重要事件是胚乳細胞和淀粉體(其為淀粉沉淀的部位)的產生和分裂。業(yè)已表明，在延遲期(玉米中的授粉后天數(DAP)為約10-12天)當中，細胞分裂素濃度的急劇增加恰好處于胚乳細胞分裂和淀粉體形成達到最大速度之前，表明該激素在這些過程和所謂的發(fā)育種子'庫強，中起核心作用。已表明細胞分裂素在不利的環(huán)境條件當中在確定種子大小、降低種子敗育和增加結實方面起重要作用。例如，溫度升高影響種子形成。溫度升高可抑制細胞分裂素積蓄、降^f氐胚乳細胞分裂和淀粉體數目，并因此增加谷仁敗育。在諸如玉米的作物品種中，谷仁庫容量主要隨在前6-12DAP期間建立的胚乳細胞和淀粉粒數目變化。最終形成的胚乳細胞和淀粉體數目與最終谷仁重量高度相關。(Capitanio等，(1983);Reddy和Daynard，(1983);Jones等，(1985)(1996);Engelen隱Eigles等，(2000))。已表明激素、尤其是細胞分裂素刺激細胞分裂、質體形成和其它對建立谷仁庫容量重要的過程(Davies，(1987))。例如可在大豆中用驅動土壤桿菌IPT基因表達的GmlPT2啟動子操作細胞分裂素水平。同樣，可使用胚乳和/或花梗優(yōu)選啟動子提高GmlPT2表達的水平和/或延長GmlPT2表達的持續(xù)時間，這會導致細胞分裂素水平提高，進而會增加花/莢果保持力，增加庫強和產量。因此提供提高發(fā)育花序中的IPT多肽活性和/或水平的方法，從而提高細胞分裂素的水平，并使發(fā)育種子在不利環(huán)境中實現其在體積、莢果和/或種子敗育減至最低以及緩沖結實方面的全部遺傳潛能。所述方法還使植物在不利環(huán)境中維持和/或改善開花過程。在該實施方案中，可使用多種啟動子指導能夠提高IPT多肽的水平和/或活性的序列的表達，所述啟動子包括但不限于組成型啟動子、種子優(yōu)選啟動子、發(fā)育種子啟動子、分生組織優(yōu)選啟動子、脅迫誘導型啟動子和花序優(yōu)選啟動子(例如發(fā)育雌花序啟動子)。在一種方法中，動子。所述"脅迫不敏感，，是指與啟動子有效連接的序列的表達水平在脅迫條件下不發(fā)生改變或僅有很小變化。所述"延遲期"啟動子是指在種子發(fā)育的延遲期中有活性的啟動子。此發(fā)育期的描述見本文其它部分。所述"發(fā)育種子優(yōu)選的"是指在發(fā)育種子中使IPT表達增強的啟動子。這些對脅迫不敏感并在發(fā)育延遲期當中在發(fā)育種子組織中表達的啟動子是本領域已知的，包括Zag2.7(Theissen等，(1995)(7e"e156:155-166,Genbank登錄號X80206)和「Zm4W卩美國專利第6,403,862號和WO01/2178)。表達構建體還可以含有編碼肽信號序列的核苷酸序列，以便在線粒體或葉綠體中實現細胞分裂素的水平和/或活性的改變。參見例如Neupert(1997)」朋wa/7ev.所oc/zem.66:863-917;Glaser等，(1998)P/朋fMo/ecw/w38:311-338;Duby等，(2001)7Tze尸/a"f/27(6):539-549。測定非生物性脅迫當中的結實增加的方法是本領域已知的。例如，可在多種脅迫條件下監(jiān)測IPT活性增加的植物，并與對照植物相比較。例如，細胞分裂素合成活性增加的植物在開花和結實過程中可承受多種程度的脅迫。在相同條件下，細胞分裂素合成活性增加的遺傳修飾植物比對照植物具有數目更多的發(fā)育莢果和/或種子。因此，本發(fā)明還提供在非生物性脅迫(干旱、鹽、重金屬、極端溫度等)期當中具有產量增加或產量維持和/或開花過程增加或維持的植物。在某些實施方案中，在非生物性脅迫當中具有產量增加或維持的植物具有本發(fā)明IPT多肽的水平/活性增加。在某些實施方案中，植苷酸序列。在某些實施方案中，這些植物將含有本發(fā)明IPT核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定摻入其基因組中，所述IPT核普酸序列與在植物細胞中驅動表達的啟動子有效連接。VIII.抗體產生和使用可針對天然形式和重組形式的本發(fā)明蛋白(包括其變體和片段)產生抗體。技術人員已知多種制備抗體的方法?？墒褂酶鞣N分析方法產生本發(fā)明蛋白的親水性譜。這些方法可用于指導技術人員選擇本發(fā)明的肽，以便用于產生或選擇在免疫原性條件下與本發(fā)明蛋白特異性反應的抗體。參見例如J.Janin，(1979)A^wre，277:491-492;Wolfenden等，(1981)所oc/^m&^y208:49-855;Kyte和Doolite,(1982)/Mo/所o/.157:105-132;Rose等，(1985)229:834-838?？贵w可用于篩選諸如正?；虍惓５鞍椎奶囟ū磉_產物的表達文庫，或其改變的水平，此改變的水平可用于^r測或診斷與相應抗原的存在相關的多種病害。例如，指示高水平的本發(fā)明IPT蛋白的測定可用于檢測細胞分裂素水平升高的植物或特定植物部分。通常，該程序中的抗體用可使抗原/抗體結合的存在情況易于檢測的部分進行標記。以下提供的論述為可用技術的一般性概述；但是，技術人員會認識到，基于以下方法的多種改變是已知的?？墒褂枚喾N免疫原產生與本發(fā)明蛋白特異性反應的抗體。由本發(fā)明的分離重組、合成或天然多核苷酸編碼的多肽是用于產生單克隆或多克隆抗體的優(yōu)選抗原。本發(fā)明的多肽在:f皮注射到能夠產生抗體的動物體內之前，任選地被變性，并任選地被還原。可產生單克隆或多克隆抗體，隨后用于免疫測定，以測定本發(fā)明蛋白的存在情況和量。產生多克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的。簡要來說，將抗原、優(yōu)選為純化蛋白、與合適載體(例如GST、匙孔蜮血藍蛋白等)偶聯的蛋白或摻入諸如重組痘病毒的免疫載體(參見美國專利第4，722，848號)中的蛋白與佐劑相混合，再用該混合物免疫動物。通過采集測試血液并檢測對目標蛋白的反應效價監(jiān)測動物對免疫原制品的免疫應答。當獲得針對免疫原的合適的較高抗體效價時，采集動物的血樣，并制備抗血清。特異性單克隆和多克隆抗體通常具有的抗體結合位點對其關聯單價抗原的親和常數至少為106-107升/摩爾，通常為至少108、109、1010直到10"升/摩爾。需要時，對抗血清進行進一步的分級分離，以富集與蛋白反應的抗體(參見例如Coligan，(1991)Cwre"fPratoco/s/w羅"o/ogy,Wiley/Greene,NY;以及Harlow和Lane,(1989)j油Z)o<i/e■s.爿丄a60rato/7Mawwa/，ColdSpringHarborPress,NY)。可通過例如用片段和如上所述的載體蛋白的綴合物免疫動物，產生針對本發(fā)明蛋白的預測片段的抗體，包括其結合片段和單鏈重組形式。典型地，目標免疫原是至少約5個氨基酸的蛋白，更典型地，蛋白質的長度為IO個氨基酸，通常長度為15-20個氨基酸，并可以更長。肽通常與載體蛋白偶聯(例如作為融合蛋白)，或在免疫載體中重組表達。在肽上與抗體結合的抗原決定簇典型地長3-10個氬基酸。用分泌所需抗體的雜種細胞來制備單克隆抗體。篩選與作為抗原來源的蛋白結合的單克隆抗體。用于制備這些單克隆抗體的技術描述參見例々口5as/cawdC7/"/ca/7m/wwwo/ogy，第4版，Stites等編4專，LangeMedicalPublications,LosAltos，CA,及其中引用的參考文獻；Harlow和Lane,出處同上；Goding,Mo"oc/o"a/^""6oW&sv尸n'"")/as尸rac"ce,第2版，AcademicPress,NewYork,NY(1986);以及Kohler和Milstein，Atowre256:495-497(1975)。簡單概述，通過給動物注射含有本發(fā)明蛋白的抗原來實施該方法，然后處死動物，取其脾臟采集脾細胞，再與骨髓瘤細胞融合，得到能夠在體外增殖的雜種細胞，即"雜交瘤"。然后篩選雜交瘤群體，以分離出單個克隆，每個克隆都分泌針對該抗原的單一抗體種類。以此方式獲得的單一抗體種類是由動物響應于在抗原性物質上識別的特異性位點產生的無限增殖化并克隆的單一B細胞的產物。其它合適的技術包括選擇噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫(參見例如Huse等，(1989)ScZe"ce246:1275-1281;和Ward等，(1989)淑群341:544-546;和Vaughan等，(1996)胸匿所ofec/zwo/ogy,14:309-314)。此外可產生重組免疫球蛋白。參見Cabilly,美國專利第4,816,567號；和Queen等，(1989),iVW/力cac.5W.86:10029-10033。針對本發(fā)明多肽的抗體還用于親和層析，以分離本發(fā)明的蛋白。例如用可連接固體支持體(例如顆粒，如瓊脂糖、SEPHADEX等)的抗體裝柱，其中使細胞裂解物通過該柱子，洗滌，并用濃度漸增的溫和變性劑處理，從而釋放純化的蛋白。本發(fā)明的蛋白和抗體經常通過共價或非共價連接提供可檢測信號的物質來標記。各種各樣的標記和綴合技術是已知的，在科技文獻和專利文獻中都有廣泛報道。合適的標記物包括放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學發(fā)光部分、磁性顆粒等。蛋白免疫測定本發(fā)明蛋白的檢測方法并不是本發(fā)明的關鍵方面。在某些實施例中，蛋白使用多種眾所周知的免疫結合測定中的任一種進行;險測和/或定量(參見例如美國專利4，366，241、4，376，110、4,517,288和4，837，168)。關于免疫檢測的一般綜述另參見MethodsinCellBiology,第37巻爿油'6ocfesCW/Asai編輯，AcademicPress,Inc.NewYork(1993);5os/cawe/C//"/ca//mmwwo/ogv第7版，Stites和Terr纟扁專辱，(1991)。另外，本發(fā)明的免疫測定可以若干配置中的任一種進行，例如綜述于/w聽woaswa乂Maggio編輯，CRCPress,BocaRaton,Florida(1980);Tij叫PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,丄a6orato^77"ec/zw—5/oc/2e脂S^yam/Mo/ecw/ar5/o/ogy，ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam(1985);Harlow和Lane,出處同上；/wmw朋awayJ尸ra"/c"/Gw地Chan編輯,AcademicPress,Orlando,FL(1987);尸n."c^7/es尸rac/z.ceo/TwAwwwoowa^^w,Price和Newman編輯，StocktonPress,NY(1991);和/Vow-Zsotop/c/m,wooss，，Ngo編輯，PlenumPress,NY(1988)的那些配置。免疫結合測定(或免疫測定)通常使用特異性結合并通常固定分析物(在本案中指本發(fā)明的蛋白)的"捕獲物質"。捕獲物質是與分析物特異性結合的部分。在某些實施方案中，捕獲物質是與本發(fā)明蛋白特異性結合的抗體?？贵w可通過如本文所述的^J支術人員已知的眾多方法中的任一種產生。成的結合復合物的標記物。該標記物自身可以是含有抗體/分析物復合物的部分之一。因此，標記物可以是本發(fā)明的標記蛋白或與本發(fā)明蛋白特異性反應的標記抗體?；蛘撸瑯擞浳锟梢詾榈谌齻€部分，例如與抗體/蛋白復合物特異性結合的另一種抗體。在整個測定中，在每次試劑混合后可能需要溫育和/或洗滌步驟。溫育步驟的時間可變化，大約5秒鐘至幾小時，通常為約5分鐘至約24小時。然而，溫育時間取決于測定形式、分析物、溶液體積、濃度等。通常，測定在環(huán)境溫度下進行，但其可在一定溫度范圍如10°C-40匸內進4亍。盡管本發(fā)明的免疫測定的細節(jié)可因所用的具體形式而異，但^全測生物樣品中的本發(fā)明蛋白的方法一般包括使生物樣品與在免疫反應條件下和本發(fā)明蛋白特異性反應的抗體相接觸的步驟。在免疫反應條件下使抗體與蛋白結合，并直接或間接檢測結合抗體的存在情況。A.非竟爭性測定形式檢測本發(fā)明蛋白的免疫測定包括竟爭性形式和非竟爭性方式。非竟爭性免疫測定是直接檢測捕獲的分析物(即本發(fā)明的蛋白)的量的測定。在一個實施例一"夾心"測定中，捕獲物質(例如在免疫反應條件下與本發(fā)明的蛋白特異性反應的抗體)可直接與固定其的固體基質結合。這些被固定的抗體然后捕獲檢測樣品中存在的蛋白。這樣，由此固定的蛋白結合標記物，例如帶有標記的二抗。或者，二抗可以沒有標記物，但其又可被對獲得二抗的物種的抗體特異性的標記三抗結合。二抗可用可4全測部分(例如生物素)修飾，該可4企測部分可^皮第三種標記分子(例如酶標記的鏈霉抗生物素蛋白)特異性結合。B.竟爭性測定形式在竟爭性測定中，通過^r測加入的(夕卜源)分析物(例如本發(fā)明的蛋白)被樣品中存在的分析物從捕獲物質(例如在免疫反應條件下與蛋白特異性反應的抗體)取代(或竟爭下去的)的量，間接測定樣品中存在的分析物的量。在一種竟爭性測定中，向樣品中加入已知量的分析物，然后使樣品與特異性結合本發(fā)明蛋白的捕獲物質接觸。與捕獲物質結合的蛋白量與樣品中存在的分析物濃度成反比。在一個實施方案中，將抗體固定在固體基質上?？赏ㄟ^檢測蛋白/抗體復合物中存在的蛋白的量，或者通過檢測余下的未復合蛋白的量，測定與抗體結合的蛋白量。蛋白的量可通過提供標記蛋白來檢測。半抗原抑制測定是另一種竟爭性測定。在該測定中，將已知分析物如本發(fā)明蛋白固定在固體基質上。向樣品中加入已知量的、在免疫反應條件下與蛋白特異性反應的抗體，然后使樣品與固定化蛋白接觸。在此情況下，與固定化蛋白結合的抗體量與樣品中存在的蛋白量成反比。再者，固定化抗體的量可通過檢測抗體的固定化部分或溶液中殘留的抗體部分來測定。如上所述，在抗體被標記的情況下可直接檢測，或者通過隨后加入與抗體特異性結合的標記部分間接檢測。c.產生用于免疫測定的合并抗血清用免疫測定檢測與針對確定抗原產生的抗體特異性結合或特異性免疫反應的蛋白。免疫測定使用針對本發(fā)明多肽(即抗原多肽)產生的多克隆抗血清。選擇的該抗血清對其它蛋白具有低交叉反應性，并通過用不同底物特異性的蛋白(例如不同的酶)和/或具有相同底物特異性但不同形式的蛋白免疫吸附抗血清)。為了產生用于免疫測定的抗血清，如本文所述分離本發(fā)明的多肽。例如，在哺乳動物或其它真核細胞系中產生重組蛋白。使用諸如弗氏佐劑的標準佐劑和標準小鼠免疫方案(參見Harlow和Lane,出處同上)用蛋白免疫小鼠近交品系?；蛘?，來源于本文公開序列并與載體蛋白綴合的合成多肽用作免疫原。收集多克隆血清，并用免疫測定(例多肽進行滴定。選擇效價為104以上的多克隆抗血清，并使用竟爭性結合免疫測定，例如在Harlow和Lane，出處同上，第570-573頁中所述的方法，檢測其對不同形式或底物特異性的多肽的交叉反應性。優(yōu)選地，在該測定中使用兩種或更多種不同形式的多肽。這些不同類型的多肽用作竟爭物，以鑒定被待測定多肽特異性結合的抗體。竟爭性多肽可作為重組蛋白產生，并使用本文所述的標準分子生物學和蛋白質化學技術分離。使用竟爭結合形式的免疫測定進行交叉反應性測定。例如，將免疫原性多肽固定在固體支持體上。加入測定的蛋白與抗血清竟爭結合固定化抗原。將上述蛋白與抗血清竟爭結合固定化蛋白的能力同免疫原性多肽相比較。使用標準方法計算上述蛋白的交叉反應性百分率。選擇并合并那些對不同類型多肽的交叉反應性小于10%的抗血清。然后，通過用不同類型的多肽進行免疫吸附，從合并的抗血清中除去交叉反應性抗體。然后，在如本文所述的竟爭性結合免疫測定中，使用已進行了免疫吸附并合并的抗血清，以比較第二"靶"多肽和免疫原性多肽。為了進行此比較，兩種多肽各自以寬濃度范圍進行測定，并使用標準技術測定抑制50%的抗血清與固定化蛋白結合所需要的每種多肽的量。如果所需靶多肽的量少于所需免疫原性多肽量的兩倍，則認為靶多肽與針對免疫原性蛋白產生的抗體特異性結合。對于特異性的最終測定，用免疫原性多肽充分地免疫吸附合并的抗血清，直到無法檢測到與用于免疫吸附的多肽結合。然后，測試被充分免疫吸附的抗血清與測試多肽的反應性。如果未觀察到反應性，則測試多肽與免疫原性蛋白引發(fā)的抗血清特異性結合。D.其它測定形式在某些實施方案中，使用蛋白質印跡(免疫印跡)分析;險測和定量樣品中本發(fā)明蛋白的存在情況。該技術通常包括通過基于分子量的凝膠電泳分離樣品蛋白，將分離的蛋白轉移到合適的固體支持體(例如硝酸纖維素濾膜、尼龍濾膜或衍生化尼龍濾膜)上，并將樣品與特異性結合本發(fā)明蛋白的抗體一起溫育?？贵w與固體支持體上的蛋白特異性結合。這些抗體可直接標記，或者隨后可使用特異性結合這些抗體的標記抗體(例如標記的綿羊抗小鼠抗體)^r測。E.蛋白質的定量可通過本領域技術人員眾所周知的眾多方法中的任一種，對本發(fā)明的蛋白進行^r測和定量。這些方法包括生化分析方法，例如電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析等；和各種免疫學方法，例如液相或凝膠沉淀素反應、免疫擴散(單向或雙向)、免疫電泳、放射性免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫熒光測定等。F.非特異性結合的減少技術人員應理解，在免疫測定和分析物純化當中，通常需要降低非特異性結合。在測定涉及抗原、抗體或其它固定在固體基質上的捕獲物質的情況下，需要將與基質非特異性結合的量減至最低。降低這種非特異結合的方法是本領域技術人員眾所周知的。典型地，該方法包括用蛋白質組合物包被基質。具體地說，廣泛使用諸如牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉和明膠等蛋白組合物。G.免疫測定標記標記試劑可以為例如單克隆抗體、多克隆抗體、結合蛋白或復合物，或諸如親和基質、碳水化合物或脂質的多聚體。適用于本發(fā)明的可檢測標記包括任何可通過光語、放射性同位素、光化學、生物化學、免疫化學、電、光或化學方法檢測的組分?？赏ㄟ^任何已知方法進行檢測，例如免疫印跡、蛋白質分析、凝膠遷移率變動分析、熒光原位雜交分析(FISH)、放射性或生物發(fā)光標志物的示蹤、核磁共振、電子順磁共振、停流光譜、柱層析、毛細管電泳或基于大小和/或電荷變化示蹤分子的其它方法。測定中所用的具體標記物或檢測基團不是本發(fā)明的關鍵方面。檢測基團可以是具有可檢測的物理或化學性質的任何物質，包括磁珠、熒光染料、放射性標記、酶和比色標記物，或有色玻璃或塑料珠，如上文對核酸標記的論述。按照本領域眾所周知的方法，標記物可直接或間接地與測定中的期望組分偶聯。如上所述，可使用各種各樣的標記，標記的選擇取決于所需靈敏度、化合物綴合的簡易性、穩(wěn)定性需求、可用儀器及處理規(guī)定。標記的檢測方法是本領域技術人員眾所周知的。非放射性標記物通常通過間接方式連接。一般來說，配體分子(例如生物素)與分子共價結合。然后，配體與抗配體(例如鏈酶抗生物素蛋白)分子結合，抗配體分子或者是固有可檢測的，或者與諸如可檢測酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物等信號系統(tǒng)共價結合?？墒褂帽姸嗯潴w和抗配體。所述分子還可以與產生信號的化合物直接綴合，例如通過與酶或熒光團綴合。作為標記的目標酶主要為水解酶，尤其是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，尤其是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光化合物包括螢光素和2,3-二氬二氮雜萘二酮，例如魯米諾。關于可使用的多種標記或信號產生系統(tǒng)的綜述，參見美國專利第4,391,904號，該專利通過引用結合到本文中。某些測定形式不需要使用標記組分。例如，可使用凝集測定檢測耙抗體的存在情況。在此情況下，包被抗原的顆粒被含靶抗體的樣品凝集。在該形式中，不需要標記任何組分，靶抗體的存在情況通過簡單的肉眼觀察來檢測。用于調控酶活性或表達的化合物的測定本發(fā)明的催化活性多肽可與化合物接觸，以便測定所述化合物是否結合和/或調控該多肽的酶活性。所用的多肽具有本發(fā)明的天然全長酶比活的至少20%、30%、40%、50%、60°/。、70%或80%。通常，多肽的存在范圍足以測定化合物的作用，典型地為約lnM-10|aM。同樣，待測化合物的存在濃度為約lnM-10|LiM。技術人員應理解，要控制諸如酶濃度、配體濃度(即底物、產物、抑制物、激活物)、pH、離子強度和溫度等因素，以便獲得有用的動力學數據，并確定結合或調控多肽活性的化合物是否存在。測定酶動力學的方法在本領域眾所周^口。參見例i口Segel，(1976)5/oc/zem/ca/G3/cw/a"ora，第2版，JohnWileyandSons,NewYork。提供以下實施例是為了舉例說明，而不是為了限制。實施例實施例1:GmIPTl和GmlPT2的克隆和基因表征在下文中我們描述了來自大豆(G(yd"ewox)的命名為GmIPTl和GmlPT2的兩種IPT多肽的鑒定和表^正。材料與方法:使用已知的擬南芥和玉米IPT編碼序列，通過大豆EST數據庫的計算積4企索，初步鑒定推定代表大豆中的IPT基因的序列?；谂c參比序列的蛋白質水平同源性并考慮候選序列所起源的文庫選擇兩個候選EST:pk0031和pk086?；诤蜻xEST序列，產生引物100066、100067、100068和100069(分別為SEQIDNO:10-13)。引物對100066/100067和100068/100069用于篩選有專利權的大豆BAC文庫。用引物對100066/100067進一步篩選所鑒定的超級庫(Super-pool),選定兩個BAC克隆C05和124。在每種情況下，都使用以下循環(huán)參數進行遞降PCR(touchdownPCR)(GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBiosystems):94°C3分鐘(1個循環(huán))；94°C1分鐘、55°C1分鐘和72°C1分30秒(35個循環(huán))；72°C7分鐘；并于4。C終止。針對其非常低的平均錯誤率(每500bp擴增片段低于0.5%)，使用尸/wWfra//o"toWTMDNA聚合酶(Stratagene)。從BAC克隆分離出大豆插入片段DNA，并用EcoRI或Pstl消化，用于使用pk0031EST克隆作為探針進行DNA印跡4企驗。將EcoRI消化的C05亞克隆到pBluescript(StratageneInc.,LaJolla,CA)中。在LB培養(yǎng)基中長出白色菌落，使用斑點印跡法將其轉移至膜上。變性后，用pk0031EST克隆對該膜進行探測。對陽性克隆進行了鑒定和測序。圖1提供了ZmlPT2、GmIPTl、GmlPT2和GmlPT3細胞分裂素生物合成酶的氨基酸比對。星號表示在許多細胞分裂素生物合成酶中保守的氨基酸。如圖l所示，GmlPT基因的導出蛋白質序列包^睛確的共有序歹'JGxTxxGK[ST]xxxxx[VLI]xxxxxxx[VLI][VLI]xxDxxQx{57，60}[VLI][VLI]xGG[ST](SEQIDNO:9)(其中x表示任何氨基酸殘基，[]表示在[]中顯示的任一個氨基酸，而x(m,n)表示編號m-n的氨基酸殘基)，該共有序列被Takei等人(Takei等，(2001)/說o/.CT^m.276:26405-26410)用于分離擬南芥^基因。圖2顯示了通過GAP獲得的GmIPTl、GmlPT2和GmlPT3彼此相對以及相對于ZmlPT2和擬南芥IPTl-9的序列同一性百分率和序列相似性值。發(fā)現與其它植物IPT蛋白的同一性不超過52%。實施例2:GmIPT基因的表達為了研究GmIPT基因在多種植物組織中的表達水平，使用如在SEQIDNO:14-16中所示的17聚體標簽進行MPSSTM分析(Solexa，Inc.:Hayward,CA)。一般而言，發(fā)現表達在大多數器官中非常低，但在諸如花(GmIPTl和GmlPT2)和種子(GmlPT3)等生殖組織中較高。每個基因的組織類型、文庫命中結果數和平均ppm見表l。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>GmIPTl和GmlPT2的RNA印跡證實了這些發(fā)現。使用RNA印跡用從不同大豆組織(花、不同發(fā)育期的莢果、葉、莖和根)提取的RNA樣品進一步研究GmIPTl和GmlPT2的表達模式。GmIPTl(AY550884)在莖中表達，在根中的表達程度較低，而GmlPT2在根中高水平表達，在小莢果和莖中的表達程度較低。在莢果發(fā)育過程中，發(fā)現GmlPT2在小莢果中以較高水平表達，基因表達水平隨著莢果尺寸和成熟度增加而降低。這表明GmlPT2在莢果發(fā)育的早期起更重要的作用。下面對GmlPT3表達進行了RNA分析。DNA和RNA提取:根據Dellaporta等，(1983)/7a"fMo/歷o/1:19-21，從植物樣品提取基因組DNA，并儲存在-20。C。根據Verwoerd等，(1989)M/c/efc」"W17:2362,使用熱苯酚抽提法制備總RNA，并儲存于-80。C。4吏用/A^^yAf/w'/Votoco//^iA^C7ea"w;(QIAgen)純化樣品，并用50|alDEPC水洗脫。使用260nm和280nm的光密度(OD)評價RNA制備物的純度，并測出RNA和DNA濃度。DNA印跡、RNA印跡和雜交:對于DNA印跡，將經消化的基因組或BAC克隆DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳(電壓110V),遷移后用l:10000(體積/體積)溴化乙錠溶液的TAE緩沖液染色，如下所示進行轉移。對于RNA印跡，將溴化乙錠加到變性RNA樣品中，并在80V，在1.5。/o變性瓊脂糖凝膠上電泳(Brugi6re等，(2003)尸/a"f尸/z;w'o/.132:1228-1240)。使用Turbo-blotter(Schleicher&Schuell)，按照生產商指引進行轉印。轉移后，將尼龍膜(Nytranplus,Schleicher&Schuell)與Stratalinker(Stratagene)交聯，然后在80。C烘烤30分鐘。使用隨機引發(fā)(ie^)Wme//iaw<iow/V7>we￡"6e〃/"gS少s/e附，AmershamBiosciences),用[a-32P]-dCTP標記探針，并用gw/cA:S;/"Co/wmra(Roche)進行純化。使用ExpressHyb雜交溶液(BDBiosciences)在65°C進行16小時的雜交，并如文獻所述(Brugi6re等，(2003)尸/a^尸/^w'o/.132:1228-1240)在嚴格條件(0.1xSSC，0.1%SDS)下洗滌膜。使用磷成像儀(MD860,MolecularDynamic)，通過成像軟件(/m，Q畫f,MolecularDynamics)定量相對轉錄物豐度。BAC亞克隆:消化BAC克隆，并亞克隆到pBluescriptSK+中。該質粒在/acZ基因及其啟動子之間包含多克隆位點。/"cZ基因由于編碼p-半乳糖苷酶而經常用作報告基因，p-半乳糖苷酶在X-gal酶水解時產生深藍色沉淀。含有其中在多克隆位點中插入BAC片段并因此不能合成該酶的質粒的細菌將顯現為白色。這使得可以通過PCR或DNA印跡對選擇的含BAC亞克隆的菌落進行進一步的篩選。實施例4:在脅迫期間維持或增加結實將本發(fā)明的IPT序列的過量表達定向于被子植物(例如玉米、大豆、水稻或小麥)的發(fā)育雌性花序將提高細胞分裂素水平，并可在不利環(huán)境中使發(fā)育中的種子在大小、將種子和/或莢果敗育減至最低和緩沖結實方面實現其全部遺傳潛力。業(yè)已表明，在玉米的種子發(fā)育當中發(fā)生的非生物性脅迫使細胞分裂素水平降低。在脅迫條件下，很可能細胞分裂素生物合成活性被降低，而細胞分裂素降解增加(Brugi6re等,(2003)P/a"f尸/z;^0/.132(3):1228-40)。因此，在一種非限制性方法中，為維持延遲期中的細胞分裂素水平，可將IPT基因連接至控制元件，所述控制元件l)對脅迫不敏感；2)結構基因表達主要定向于發(fā)育種子；和3)在種子發(fā)育的延遲期當中優(yōu)先驅動結構基因的表達。還可以使用在開花期時或者大約在開花期時將表達靶向相關母本組織的啟動子。或者，可使用組成型啟動子。實施例5:玉米轉化例如，用質粒轟擊來自溫室供體植物的未成熟玉米胚，所述質粒含有與Zag2.1啟動子(Schmidt等，(1993)尸/a"fCe〃5:729-737)有效連接的序列，例如GmlPt2,并含有賦予對除草劑雙丙氨膦抗性的選擇標記基因BAR(Wohlleben等，(1988)70:25-37)?；蛘?，選擇標記基因可在獨立的質粒上提供。如下進行轉化。培養(yǎng)基配方如下。除掉穗的外殼，用加有0.5%Micro去垢劑的30%Clorox漂白液表面消毒20分鐘，然后用無菌水沖洗兩次。切下未成熟胚，并將胚軸側朝下(子葉盤側朝上)放置在560Y培養(yǎng)基上達4小時，每個平板放25個胚，然后在2.5cm靶區(qū)內對齊，準備轟擊。制備含與Zag2.1啟動子有效連接的IPT序列的質粒載體。如下使用CaCl2沉淀法將該質粒DNA與含BAR選擇標記的質粒DNA沉淀在1.1pm(平均直徑)鴒沉淀上100pl制備的鵠顆粒的水溶液；10pl(1|ig)DNA的TrisEDTA緩沖液(l|ig總DNA);100|il2.5MCaCl2;和10^10.1M亞4青胺。在多管渦旋器上保持的同時將每種試劑依次加入鴒顆粒懸浮液中。對最終混合物短暫超聲處理，并使其在恒定渦旋下溫育10分鐘。在沉淀期后，將管短暫離心，除去液體，用500ml100%乙醇洗滌，并離心30秒。再次除去液體，向最終鎢顆粒沉淀加入105|il100°/0乙醇。對于粒子槍轟擊，對鎢/DNA顆粒短暫超聲處理，將10pl點樣在每個巨載體中心，并使其在轟擊前風干約2分鐘。樣品平板在粒子槍弁HE34-1或弁HE34-2中以水平#4轟擊。所有樣品都接受650PSI的單次轟擊，由每管制備的顆粒/DNA獲取總共10等份試樣。在轟擊后，將胚在560Y培養(yǎng)基上保持2天，然后轉移至含3mg/L雙丙氨膦的560R選擇培養(yǎng)基，每2周進行一次繼代培養(yǎng)。約10周選擇后，將選出的抗性愈傷組織克隆轉移至288J培養(yǎng)基，以啟動植林再生。在體細胞胚成熟后(2-4周)，將發(fā)育良好的體細胞胚轉移至萌發(fā)培養(yǎng)基，并轉移到光照培養(yǎng)室。約7-10天后，將發(fā)育的小植林轉移至在管中的272V無激素培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10天，直到小植抹長勢良好。然后，將植抹轉移到鋪有盆栽土的平板(相當于2.5"花盆)襯墊中，放在培養(yǎng)室內生長1周，然后放在溫室內再生長l-2周，接著轉移到經典的600花盆(1.6加侖)中，并生長至成熟。監(jiān)測植抹，并在非生物性脅迫事件當中對結實的維持或增加進行評分。另外，監(jiān)測處于脅迫下的轉化子的細胞分裂素水平(如在實施例5c中所述)和谷粒生長的維持。轟擊培養(yǎng)基(560Y)含有4.0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12，4-D和2.88g/1L-脯氨酸(用KOH調整至pH5.8后用D-IH20定容)；2.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)(用D-IH20定容后加入)和8.5mg/1硝酸銀(在培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后加入)。選擇培養(yǎng)基(560R)含有4.0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(用KOH調整至pH5.8后用D-IH20定容)；3.0g/l脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)(用D-IH20定容后加入)；以及0.85mg/l硝酸銀和3.0mg/l雙丙氨膦(二者均在培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后力口入)。植林再生培養(yǎng)基(288J)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺素、0.10g/1鹽酸吡噴醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)(Murashige和Skoog(1962)P/aW.15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖和1.0ml/1的0.1mM脫落酸(調整至pH5.6后用精制的D-IH20定容)；3.0g/l脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)(用D-IH20定容后加入)；和1.0mg/1吲，，呆乙酸和3.0mg/1雙丙氨膦(在培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60°C后加入)。無激素培養(yǎng)基(272V)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS維生素母液(O.IOOg/1煙酸、0.02g/1鹽酸碌u胺素、0.10g/1鹽酸吡。多醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(調整至pH5.6后用精制的D-IH20定容)；以及6g/1細菌瓊脂(用精制的D-IH20定容后加入)，滅菌并冷卻至60°C。實施例6:大豆胚轉化如下用含與泛素啟動子有效連接的IPT序列的質粒轟擊大豆胚。為了誘導體細胞胚，將由大豆栽培種A2872的經表面消毒的未成熟種子切開的長3-5mm子葉，于26'C在光照下或黑暗中在合適的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10周，然后切下產生次生胚的體細胞胚，放入合適的液體培養(yǎng)基中。在重復選擇早期作為球形期胚繁殖的體細胞胚叢后，如下所述維持懸浮液。大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物可保持在35ml液體培養(yǎng)基中，所處條件為150rpm旋轉搖床、26°C、按照16:8小時晝/夜時間表用日光燈照明。用約35mg組織接種液體培養(yǎng)基，每2周進行一次繼代培養(yǎng)。然后可通過粒子槍轟擊法轉化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(Klein等，(1987)iVaft^(London)327:70-73,美國專利第4,945,050號)?？墒褂肈uPontBiolisticPDS1000/HE儀器(氦改進型(heliumretrofit))進行這些轉化?？捎糜诖龠M大豆轉化的選擇標記基因是由花椰菜花葉病毒的35S啟動子(Odell等，(1985)A^wre313:810-812)、質粒pJR225的潮霉素磷酸轉移酶基因(得自大腸桿菌(五.co//);Gritz等，(1983)25:179-188)和來自根瘤土壤桿菌Ti質粒的T-DNA的胭脂堿合酶基因的3'區(qū)組成而分離出來。然后，可將該片段插入到攜帶標記基因的載體的獨特限制位點中。向50pl60mg/ml的1金顆粒懸浮液中(依順序)力口入5|ilDNA(1ng/|il)、20pi亞精胺(O.lM)和50|ilCaCl2(2.5M)。然后，將顆粒制備物攪拌3分鐘，用微量離心機(microfUge)離心10秒，取出上清液。然后，將包被DNA的顆粒用40070%乙醇洗滌1次，并重懸浮在40pl無水乙醇中。可將DNA/顆粒懸浮液超聲處理3次，每次l秒。然后，將5微升包被DNA的金顆粒加到各個巨載體盤上。將約300-400mg兩周齡的懸浮培養(yǎng)物置于空的60x15mm培養(yǎng)皿中，殘余液體用移液管從組織中除去。對每個轉化實驗，通常轟擊5-10個平板的組織。膜破裂壓力設置為1100psi，小室抽空至28英寸汞柱真空度。將組織置于距保護屏約3.5英寸處，轟擊3次。轟擊后，可將組織分成兩半，放回液體中，并如上所述培養(yǎng)。在轟擊后5-7天，可將液體培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，并在轟擊后11-12天更換為含50mg/ml潮霉素的新鮮培養(yǎng)基。該選擇培養(yǎng)基可每周更新一次。轟擊后7-8周，可觀察到由未轉化的壞死胚發(fā)生叢生長出綠色的轉化組織。取出離體綠色組織，并接種到各個燒瓶中，以產生新的、無性繁殖的、轉化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。每個新系都可以作為獨立的轉化事件進行處理，然后可將這些懸浮液繼代培養(yǎng)，并維持為未成熟胚叢，或通過各個體細胞胚的成熟和萌芽而再生為完整植抹。實施例7:向日葵分生組織轉化分生組織(另參見歐洲專利號EP0486233，該專利通過引用結合到本文中，和Malone國Schoneberg等，(1994)尸/a^Sc/e"ce103:199-207)。用一臺麥穗脫粒機使成熟的向日葵種子(7^//<3"^21awwwsL.)脫殼。用每50ml溶液加入2滴吐溫20的20%Clorox漂白溶液將種子表面消毒30分鐘。用無菌蒸餾水沖洗種子兩次。通過》務改的Schrammeijer等人(Schrammeijer等，(1990)尸/a"fCW/9:55-60)所述程序制備裂開的胚軸外植體。在表面消毒程序后將種子浸入蒸餾水中達60分鐘，然后折斷每粒種子的子葉，在胚軸平面得到干凈斷面。切下根尖后，將外植體在原葉之間縱向對分。將兩半切面向上放置在GBA培養(yǎng)基上，GBA培養(yǎng)基由Murashige和Skoog礦物元素(Murashige等，(1962)尸/^z'o/.尸/a"f.15:473-497)、Shepard氏維生素添力口劑(Shepard(1980)載于rec/wz々腦(7ewe"c/wpravem抓o/Cra戸(UniversityofMinnesotaPress,St.Paul,Minnesota),40mg/1硫酸腺噪呤、30g/l蔗糖、0.5mg/16-千基-氨基噪呤(BAP)、0.25mg/1。引咮-3-乙酸(IAA)、0.1mg/1赤霉酸(GA3),pH5.6和8g/l植物瓊脂組成。在土壤桿菌處理前，對外植體進行微彈轟擊(Bidney等，(1992)尸/"WMo/.所o/.18:301-313)。將30-40個外植體以環(huán)狀放置在60x20mm平板中心進行該處理。將約4.7mg的1.8mm鴒微彈重懸浮在25ml無菌TE緩沖液(10mMTrisHC1，1mMEDTA,pH8.0)中，每次轟擊使用1.5ml等份試樣。每塊平板在PDS1000⑧顆粒加速器中經置于樣品之上2cm的150mmnytex屏轟擊2次。在所有轉化實驗中都使用卸曱根瘤土壤桿菌菌株EHA105。按照Holsters等，(1978)tWo/.Ge".163:181-187所述的凍融法，將含有包含與泛素啟動子有效連接的IPT基因的表達盒的二元質粒載體導入土壤桿菌菌抹EHA105中。該質粒還包含卡那霉素選擇標記基因(即w;^/7)。用于植物轉化實驗的細菌在液體YEP培養(yǎng)基(IOgm/1酵母提取物、10g/1細菌蛋白胨和5g/1NaCl,pH7.0)中過夜培養(yǎng)(28。C和100RPM連續(xù)攪拌)，所述液體YEP培養(yǎng)基含有維持細菌菌林和二元質粒所需的合適抗生素。懸浮液在OD,達到約0.4-0.8時使用。沉淀土壤桿菌細胞，并用含有12.5mMMESpH5.7、1g/1NH4C1和0.3g/1MgS04的接種培養(yǎng)基重懸浮至最終OD6oo為0.5。將轟擊過的新鮮外植體置于土壤桿菌懸液中，混勻，連續(xù)靜置30分鐘，然后將外植體轉移到GBA培養(yǎng)基中，將其切面向下，于26。C18小時白晝共栽培。共栽培3天后，將外植體轉移到補加250mg/1頭孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(不含生長調節(jié)劑且蔗糖水平降低至1%的GBA培養(yǎng)基)中。將外植體選擇培養(yǎng)2-5周，然后轉移到不含卡那霉素的新鮮374B培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)育1-2周。將具有分化的、耐抗生素的、尚未產生適于切割的枝條的生長區(qū)的外植體轉移到含250mg/1頭孢p塞將的GBA培養(yǎng)基中，用以進行第二次3天的植物激素處理。通過ELISA測定來自綠色的、抗卡那霉素的枝條的葉樣品的NPTII存在情況，并通過測定細胞分裂素合成活性，測定該樣品的轉基因表達的存在情況。這樣的檢測在本文另外一處描述。將NPTII陽性枝條移植到Pionee^雜交6440體外生長向日葵實生砧。讓表面消毒后的種子在48-0培養(yǎng)基(半濃Murashige和Skoog鹽、0.5%蔗糖、0.3。/。脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)，pH5.6)中萌發(fā)，并在針對外植體培養(yǎng)所描述的條件下生長。去掉幼苗上部，在下胚軸上制作1cm垂直切片，然后將轉化的枝條插入切口。整個區(qū)域用石蠟膜(parafilm)包裹，以保護枝條。可在1周體外培養(yǎng)后將移植的植抹轉移到土壤中。將在土壤中的移植體保持在高濕度條件下，然后對溫室環(huán)境緩慢馴化。在溫室中成熟的To植抹(親本代)的轉化部分通過NPTIIELISA和/或葉提取物的細胞分裂素合成活性分析來鑒定，而從NPTII陽性To植株收獲的轉基因種子通過對小部分干種子子葉進行細胞分裂素合成活性分析來鑒定。實施例8:水稻轉化本領域技術人員可用的一種將DNA轉化入高等植物細胞中的方法是使用包被目標核酸構建體的金屬顆粒的高速粒子轟擊(參見Klein等，胸廳(1987)(London)327:70-73,并參見美國專利第4,945,050號)。對于這些互補試驗4吏用BiolisticPDS-1000/He(BioRADLaboratories,Hercules,CA)。來自吸水鏈霉菌(5^e/to^ycas/^yosco;/ci^)的細菌潮霉素B磷酸轉移酶(HptII)基因賦予對該抗生素的抗性，可以用作水稻轉化的選擇標記。在載體中，Hpt1I基因可用花椰菜花葉病毒的35S啟動子以及來自根瘤土壤桿菌的章魚堿合酶基因的終止和聚腺苷酸化信號工程化。例如參見在1997年12月18日公布的WO97/47731中關于載體pML18的描述，該文獻的公開內容通過引用結合到本文中。來源于萌發(fā)水稻種子的子葉盤的胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物用作轉化試驗的來源材料。該材料通過使無菌水稻種子在愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MS鹽、Nitsch和Nitsch維生素、1.0mg/12，4-D和10|tiMAgN03)上于27-28。C在黑暗中發(fā)芽而產生。將由胚子葉盤增殖的胚發(fā)生愈傷組織轉移至CM培養(yǎng)基(N6鹽、Nitsch和Nitsch維生素、1mg/12,4-D,Chu等，(1985)<SW.A'm'ca18:659-668)。通過以2周間隔常規(guī)繼代培養(yǎng)將愈傷組織培養(yǎng)物保持在CM上，并在誘導的10周內用于轉化。通過以每個0.5-1.0mm、約1mm間隔繼代培養(yǎng)制備用于轉化的愈傷組織，其排列在直徑約4cm的環(huán)形區(qū)域內，處于放置在CM培養(yǎng)基上的Whatman#541圓形濾紙的中心。將裝有愈傷組織的平板在黑暗中于27-28。C溫育3-5天。在轟擊前，將帶有愈傷組織的濾紙轉移至補加0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM,在黑暗中放置3小時。然后，使培養(yǎng)皿蓋在無菌整流罩中微開20-45分鐘，以使組織上的水分消散。將每個基因組DNA片段與pML18(含有用于水稻轉化的選擇標記)共沉淀到金顆粒表面上。為實現此目標，將總共10jigDNA以2:1的性狀:選擇標記DNA比例加入以60mg/ml濃度重懸浮的50|ul等份金顆粒中。然后，在將管渦旋3分鐘的同時，將氯化鈣(50pi的2.5M溶液)和亞精胺(20)al的0.1M溶液)力。入金-DNA懸浮液中。將金顆粒用微量離心機(microflige)離心1秒，并除去上清液。用1ml無水乙醇洗滌金顆粒兩次，然后重懸浮在50nl無水乙醇中，并超聲處理(水浴超聲器)l秒，以M金顆粒。將金懸浮液于-70。C溫育5分鐘，如果需要分散顆粒則超聲處理(水浴超聲器)。然后，將6inl包被DNA的金顆粒加到聚酯薄膜(mylar)巨載體盤上，讓乙醇揮發(fā)掉。在風干期結束時，將裝有組織的培養(yǎng)皿置于PDS-1000/He的小室中。然后，抽空小室中的空氣至28-29英寸汞柱的真空度。使用破裂膜以氦氣沖擊波加速巨載體，該破裂膜在沖擊管中的He壓力達到1080-1100psi時破裂。將組織置于距停止屏約8cm處，轟擊愈傷組織2次。以此方式用包被DNA的金顆粒轟擊2-4個組織平板。在轟擊后，將愈傷組織轉移至未補加山梨醇或甘露醇的CM培養(yǎng)基。在轟擊后3-5天，將愈傷組織轉移至SM培養(yǎng)基(含有50mg/1潮霉素的CM培養(yǎng)基)。為實現此目標，將愈傷組織由平板轉移至無菌的50ml圓錐形管，并稱重。使用2.5ml頂層瓊脂/100mg愈傷組織加入40。C融化的頂層瓊脂。通過經由10ml移液管重復分配將愈傷組織塊打碎成直徑小于2mm的小塊。將3ml等分的愈傷組織懸浮液鋪在新鮮SM培養(yǎng)基上，將平板在黑暗中于27-28。C培養(yǎng)4周。4周后，鑒定轉基因愈傷組織事件，并轉移至新鮮SM平板，在黑暗中于27-28'C再生長2周。將生長中的愈傷組織轉移至RM1培養(yǎng)基(MS鹽、Nitsch和Nitsch維生素、2%蔗糖、3%山梨醇、0.4。/。脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)+50ppm潮霉素B)，在黑暗中于25。C放置2周。2周后，將愈傷組織轉移至RM2培養(yǎng)基(MS鹽、Nitsch和Nitsch維生素、3%蔗糖、0.4%脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)+50ppm潮霉素B)，并置于白色冷光源(約40(aEm、")下，條件為12小時光周期、25。C和濕度30-40%。在光照2-4周后，愈傷組織開始組織化，形成枝條。由周圍的愈傷組織/培養(yǎng)基中取出枝條，并輕緩轉移至在phytatray(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)中的RM3培養(yǎng)基(l/2xMS鹽、Nitsch和Nitsch維生素、1%蔗糖+5(^111潮霉素B),使用如在先前步驟中所述的相同條件繼續(xù)培養(yǎng)。在2-3周后已出現足夠的根和枝條生長時，將植抹由RM3轉移至裝有Metromix350的4"花盆。實施例9:調控根發(fā)育對土壤桿菌介導的、采用設計用于以合適的啟動子實現轉錄后基因沉默(PTGS)的質粒的大豆轉化而言，可使用Zhao的方法(美國專利第5,981,840號，和PCT專利公布WO98/32326，所述文獻的內容通過引用結合到本文中)。簡單而言，分離未成熟胚，使其與能夠轉移DNA構建體的土壤桿菌懸浮液接觸。所述構建體可包含與由本發(fā)明的任一個GmIPT多核香酸的編碼序列形成的發(fā)夾結構有效連接的CRWAQ81根優(yōu)選啟動子::ADH內含子啟動子。其它有用的構建體可包含靶向本發(fā)明的任一個GmIPT多核苷酸的啟動子的發(fā)夾構建體。(Aufsatz等，(2002)/WAS99(4):16499-16506;Mette等，(2000)￡MB(9/19(19):5194-5201)。將該構建體轉移至至少一個未成熟胚的至少一個細胞中(步驟l:感染步驟)。在該步驟中，將未成熟的胚浸入土i裏桿菌懸浮液中，以便開始接種。胚與土壤桿菌共培養(yǎng)一段時間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)；這可在固體培養(yǎng)基上進行。在此共栽培階段之后，設想了任選的"休眠，，步驟。在該休眠步驟中，在至少一種已知抑制土壤桿菌生長的抗生素存在下溫育胚，而不加入植物轉化子的選擇劑(步驟3:休眠步驟)。接著，將接種的胚在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；生長，回收轉化的愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。然后，將愈傷組織再生為植林(步驟5:再生步驟)。監(jiān)測植林，并對根發(fā)育的調控進行評分。根發(fā)育的調控包括監(jiān)測一個或多個根部分的根生長增強情況，所述根部分包括初生根、側根、不定根等。檢測根系的這些發(fā)育改變的方法是本領域已知的。參見例如美國專利申請第2003/0074698號和Werner等，(2001)18:10487-10492，這兩個文獻均通過引用結合到本文中。實施例10:調控植物衰老如Zhao等,(1998)M2&eCor/ora"owA^n^s7e"er72:34-37所概述，將含有與組成型啟動子、根優(yōu)選啟動子或衰老活化啟動子(例如SAG12(Gan等，(1995)5We"ce270:5244,Genbank登錄號U37336))有效連接的GmIPTl或GmlPT2多核苷酸的DNA構建體導入玉米植抹中，所述文獻通過引用結合到本文中。例如，獲得含與SAG12啟動子有效連接的IPT序列的玉米植林。作為對照，還使用以上概述的轉化方法將非細胞分裂素相關構建體導入玉米植林中。研究IPT多肽水平升高的轉基因玉米植林的表型。例如，可監(jiān)測植抹生長勢的提高情況、貯藏期、插瓶期以及抗感染耐受性改善情況。還可以監(jiān)測植林在多種環(huán)境脅迫下的衰老延遲，所述環(huán)境脅迫包括例如洪澇，洪澇通常導致葉萎黃、壞死、落葉、生長停止及產量降低。實施例11:IPT變體A.不改變編碼的#^酸序列的GmIPTl、GmlPT2或GmlPT3的變體核苷酸序列在SEQIDNO:1、3和6中所示的GmIPT核苷酸序列用于產生變體核苷酸序列，在與相應的起始未改變的ORF核苷酸序列相比較時，所述變體核苷酸序列具有的可讀框核苷酸序列具有約70%、75%、80%、85%、90%或95%核苷酸序列同一性。這些功能性變體使用標準密碼子表產生。盡管變體的核苦酸序列被改變，但由可讀框編碼的氨基酸序列沒有被改變。B.GmIPTl、GmlPT2和GmlPT3的變體^J^醋列產生GmIPTl、GmlPT2和GmlPT3的變體氨基酸序列。在該實施例中，改變一個或多個氨基酸。具體地說，檢查SEQIDNO:2、4或7中所示的可讀框，以確定合適的氨基酸改變。通過參考與多個物種的直系同源物和其它基因家族成員的蛋白質比對，對要改變的氨基酸進行選擇。參見圖l和/或圖4。選定的氨基酸被認為并未處于高選擇壓力下(非高度保守的)，而是容易被具有相似化學特征(即類似的功能性側鏈)的氨基酸取代。可按照本文另外一處概述的測定證實功能性。使用該方法產生與SEQIDNO:2、4和7中的每一個大約具有70%、75°/。、80%、85%、90%或95%核酸序列同一性的變體。C.GmIPTl和GmlPT2的其它變體M酸序列在本實施例中，產生相對于參比蛋白質序列具有80%、85%、90%和95%同一性的人工蛋白質序列。此后一項工作需要由圖1中所示的比對鑒定保守區(qū)和可變區(qū)，然后明智地使用氨基酸取代表。這部分將在下文更詳細;也"i侖述。很大程度上基于IPT蛋白或其它IPT多肽中的保守區(qū)決定要改變的氨基酸序列。參見圖1。基于序列比對，可確定可能要改變的IPT多肽的多個區(qū)。一般認為可在保守區(qū)進行保守取代，而不改變功能。另外，技術人員應理解，本發(fā)明的IPT序列的功能變體可在保守區(qū)中具有少數非保守的氨基酸改變。然后，建立以80-85%、85-90%、90-95%和95-100%同一性的區(qū)間不同于原始序列的人工蛋白質序列。舉例來說，以這些區(qū)間的中點為目標，自由度加上或減去例如1。/。。氨基酸取代可通過定制Perl腳本實現。取代表在下表2中提供。首先鑒定蛋白中不應被改變的任何保守氨基酸，并被"標明為"與取代隔離。起始曱硫氨酸毫無疑問將被自動加入該列表，然后進行改變。H、C和P不改變。首先對異亮氨酸進行改變，從N末端掃描到C末端，然后是亮氨酸，并沿著列表向下類推，直到達到合適的耙點。可實施中間數取代，以便不引起反向改變。列表被標序為1-17，所以根據需要以許多異亮氨酸改變開始，然后是亮氨酸，并以此類推，直到曱硫氨酸。顯然，以此方式許多氨基酸不需要被改變。L、I和V涉及兩個可選擇的最佳取代的50:50取代。變體氨基酸序列被記錄為輸出。用Perl腳本計算同一性百分率。使用該方法，產生與SEQIDNO:2或4的起始未改變的ORF核苷酸序列具有約82%、87%、92%和97%氨基酸同一性的GmIPTl和GmlPT2的變體。表2.取代表<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>實施例12:由大豆或其它植物物種擴增另外的異戊烯基轉移酶aPT)基因可使用例如下述的簡并引物通過PCR或RT-PCR法鑒定植物物種的其它IPT基因。簡并引物可針對存在于大豆、玉米、水稻或擬南芥的可用IPT蛋白中的保守氨基酸基序設計。這些基序可由蛋白序列的比對鑒定。以下列出了這些基序和相應的簡并核苷酸引物的序列的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>本說明書中提及的所有出版物和專利申請都代表了本發(fā)明所屬領域技術人員的水平。所有出版物和專利申請都通過引用結合到本文中，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請被具體地和單獨地指出通過引用結合到本文中一樣。盡管為了清楚理解的目的而通過闡述和實施例相當詳細地描述了本發(fā)明，但是，顯然，可在隨附權利要求的范圍內對本發(fā)明實施某些變更和修改。權利要求1.一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO2、4或7。2.—種分離的多肽，其具有細胞分裂素合成活性并且包含選自以下的氛基酸序列(a)與SEQIDNO:2、4或7具有至少85%序列同一性的^J^酸序列；和(b)由與SEQIDNO:1、3或6所表示的多核苷酸的互補序列在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，其中所述嚴格條件包含于37。C在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中雜交，于60。C至65。C在0.1XSSC中洗滌。3.—種分離的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQIDNO:1、3或6。4.一種分離的多核苷酸，其包含選自以下的核苷酸序列(a)編碼氨基酸序列SEQIDNO:2、4或7的核苷酸序列；(b)與SEQIDNO:1、3或6具有至少85%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有細胞分裂素合成活性的多肽；(c)包含SEQIDNO:1、3或6中的至少50個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有細胞分裂素合成活性的多肽；和(d)與SEQIDNO:1、3或6中的至少100個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列。5.—種轉基因植物，包含與在植物中驅動表達的啟動子有效連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有權利要求4的核苷酸序列，其中所述植物中的細胞分裂素水平相對于對照植物受到調控。6.權利要求5的植物，其中所述細胞分裂素水平提高。7.權利要求5的植物，其中所述細胞分裂素水平降低。8.權利要求5的植物，其中所述多核苷酸與組織優(yōu)選啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子有效連接。9.權利要求8的植物，其中所述組織優(yōu)選啟動子是根優(yōu)選啟動子、葉優(yōu)選啟動子，枝條優(yōu)選啟動子或花序優(yōu)選啟動子。10.權利要求5的植物，其中所述細胞分裂素水平調控影響花的11.權利要求5的植物，其中所述細胞分裂素水平調控影響根的12.權利要求5的植物，其中所述植物的莖根比發(fā)生改變。13.權利要求5的植物，其中種子大小或種子重量增加。14.權利要求5的植物，其中所述植物的生長勢或生物量增加。15.權利要求5的植物，其中所述植物的脅迫耐受性增加。16.權利要求5的植物，其中所述啟動子是脅迫不敏感的，并且在開花期時或者大約在開花期時，在發(fā)育種子的組織或相關母本組織中表達。17.權利要求5的植物的轉化種子。18.權利要求5的植物，其中所述植物是玉米、小麥、水稻、大麥、高粱、黑麥、大豆、蕓薹或向曰葵。19.一種在天然基因組的基因座進行了遺傳修飾的植物，所述基因組的基因座包含權利要求4的多核苦酸，其中所述植物的細胞分裂素水平受到調控。20.—種在植物中調控細胞分裂素水平的方法，該方法包括用與啟動子有效連接的權利要求4的多核苷酸轉化所述植物。21.權利要求20的方法，其中細胞分裂素水平的所述調控影響根生長或莖根比。22.權利要求20的方法，其中細胞分裂素水平的所述調控影響花的發(fā)育。23.權利要求20的方法，其中細胞分裂素水平的所述調控增加種子大小或種子重量。24.權利要求20的方法，其中細胞分裂素水平的所述調控增加植物脅迫耐受性。25.權利要求20的方法，其中細胞分裂素水平的所述調控影響生長勢或生物量。26.權利要求20的方法，其中所述有效連接的啟動子是組織優(yōu)選啟動子或誘導型啟動子，或者既是組織優(yōu)選的又是誘導型的。27.權利要求20的方法，其中所述啟動子是脅迫不敏感的，并且在開花期時或者大約在開花期時，在發(fā)育種子的組織或相關母本組織中表達。28.權利要求20的方法，其中衰老被延遲。29.權利要求20的方法，其中植物種子的庫強受到調控。30.權利要求20的方法，其中在胚、胚乳及其近側組織中的一個或多個中，細胞分裂素水平提高。31.—種調控愈傷組織中枝條再生的速率或發(fā)生率的方法，該方法包括在所述愈傷組織中表達與異源啟動子有效連接的權利要求4的多核香酸。32.權利要求31的方法，其中所述啟動子是誘導型的。全文摘要提供了調控植物發(fā)育的方法和組合物。提供了編碼異戊烯基轉移酶(IPT)多肽的多核苷酸序列，以及該編碼多肽的氨基酸序列。這些序列可用于多種方法，包括調控根發(fā)育、調控花發(fā)育、調控葉和/或枝條發(fā)育、調控衰老、調控種子大小和/或重量，以及調控植物對非生物性脅迫的耐受性。還提供了轉化植物、植物細胞、組織和種子。文檔編號C12N15/82GK101415821SQ200780012065公開日2009年4月22日申請日期2007年1月31日優(yōu)先權日2006年2月1日發(fā)明者N·布魯日耶申請人:先鋒高級育種國際公司