專利名稱：：甘油的厭氧發(fā)酵的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于細菌在甘油底物上發(fā)酵(即缺少電子受體)生長的適當?shù)呐囵B(yǎng)條件的開發(fā)。所述方法在開發(fā)能夠使甘油轉化成為高價值產(chǎn)品，例如乙醇、氫、甲酸鹽、琥珀酸鹽或1,2-丙二醇的方法和菌株上具有特別的用途。
背景技術：
：在生物柴油的生產(chǎn)中產(chǎn)生大量作為副產(chǎn)物的甘油，并且據(jù)預測，甘油的產(chǎn)量由于全球生物柴油產(chǎn)量的急劇增加將持續(xù)增加。在過去的兩年中甘油的過剩已導致價格下降10倍。因此，粗甘油由于其低成本已成為發(fā)酵工藝的吸引人的碳源。不僅由于甘油充足，與纖維糖(cellulosicsugar)相比，其高還原態(tài)有希望顯著增加化學品的產(chǎn)物產(chǎn)率，而由糖生產(chǎn)所述化學品要受到還原當量的可用性的限制。利用甘油中碳的較高還原態(tài)的優(yōu)勢將會需要使用厭氧發(fā)酵(即，否則所述電子受體將"奪取"(take)所述電子而不是被"積累(deposit)"在所述期望產(chǎn)物中，所述期望產(chǎn)物包括燃料或還原化合物)。然而，甘油在發(fā)酵工藝中用作碳源的潛力可能被工業(yè)微生物，例如大腸桿菌(五"/^n'c/u'aco"，現(xiàn)代微生物學的主力)不能在缺少外源電子受體時發(fā)酵甘油阻礙。發(fā)酵甘油的能力限于非常少的生物，其絕大部分由于致病性、需要嚴格的厭氧條件、缺乏其生理知識和對其進行改進的基因手段，以及高度營養(yǎng)需求而不適于工業(yè)應用。甘油可以被甘油脫氫酶(GldA，由gWA編碼)直接氧化，產(chǎn)生二羥基丙酮(DHA)。然而，作為II型甘油脫氫酶的(glyDH-n)的GldA被認為是隱蔽的或不在野生型大腸桿菌菌株中表達的。激活大腸桿菌中的GIdA需要使g//^、g/;^和g/;xD去活化繼之以產(chǎn)生恢復其代謝甘油能力的突變株的誘變和選擇程序(Jin等，1983;Tanh等1982a，b)。然而，既使在這個突變株中，01(1八并不為￡."http://提供以發(fā)酵方式代謝甘油的能力。在本領域中需要的是將全球過剩的廉價甘油生物轉化為其他原料化學品的方法。如果所述方法基于厭氧發(fā)酵以利用甘油中碳的較高還原態(tài)，該方法可以是尤其有利的。厭氧工藝還將提供成本優(yōu)勢，由于其對應的需氧工藝需要更高的資本投資并顯示更高的操作成本。發(fā)明公開我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些條件下大腸桿菌事實上能夠在缺少電子受體時發(fā)酵甘油。我們的發(fā)現(xiàn)代表一種用于在大腸桿菌和其他腸細菌中發(fā)酵甘油的新范例，并且可以實現(xiàn)微生物平臺的開發(fā)以將低價值的未加工的甘油轉化為高價值的化學品和燃料。甘油發(fā)酵的方法被描述，其中pH、C02濃度、甘油濃度、鉀濃度、磷酸鹽濃度以及羥基丙酮的濃度被控制以使甘油發(fā)酵代謝成期望的化學前體。當pH是近中性或弱酸性時，可以獲得改善的甘油發(fā)酵。在優(yōu)選的實施方案中，所述pH是5.5到7.5，更優(yōu)選的是pH6.0-6.5，在最優(yōu)選的實施方案中所述pH是大約6.3。C02濃度不可避免地與pH相關聯(lián)并且當pH增加時變小，這是由于C02被轉化為碳酸氫根，HCCV。通過將CO2增加到20-30Q/?？梢詼p少將pH增加到7.0以上的負面影響。用pH6.3和10%C02、pH7.5和20%(302可見改善的甘油發(fā)酵。更大濃度的<302也是有益的。由于甘油中碳的高還原態(tài)，維持氧化還原平衡變得非常"精細"，這是因為將甘油并入細胞量導致還原當量的凈產(chǎn)生。H2在幾個反應中起電子給體的作用(例如延胡索還原酶)并因此使氧化還原反應偏移。如果減少H2濃度，這就不會發(fā)生而甘油發(fā)酵就能優(yōu)化地進行。通過增加頂部空間，H2被稀釋，改善了甘油發(fā)酵。用惰性氣體或C02沖洗頂部空間除去過量的H2并進一步增加甘油的發(fā)酵。將氣體吹掃或鼓泡通過所述培養(yǎng)基以除去最多的H2提供了最佳的甘油發(fā)酵條件。當甘油原料濃度高時可以獲得改善的甘油發(fā)酵，例如所述甘油原料濃度比5或10g/L大，或甚至更大(25g/L、50g/L、75g/L、100g/L)。在優(yōu)選的實施方案中，甘油濃度大于100g/L。可以用低鉀和低磷酸鹽濃度來獲得改善的甘油發(fā)酵。鉀濃度優(yōu)選地小于10mM、更優(yōu)選地小于5或2mM、且最優(yōu)選地小于0.6mM。磷酸鹽濃度優(yōu)選小于50mM，更優(yōu)選地小于25或10mM。更優(yōu)選的是小于5mM并且最優(yōu)選地小于1.3mM。較低的磷酸鹽和鉀有利甘油脫氫酶-二羥基丙酮激酶的作用以及1,2-PDO途徑，后者使得氧化還原平衡條件成為可能。用HA補充培養(yǎng)基(至少IO、20、或30mM),進一步改善培養(yǎng)條件。當用HA補充時不需要胰蛋白胨補充物。在一實施方案中，發(fā)酵甘油通過在37。CpH6.3具有0.6mM鉀和1.3mM的磷酸鹽、10g/L甘油培養(yǎng)co/z',同時用C02、Ar或N2吹掃而得以優(yōu)化。在其他的實施方案中，本發(fā)明可以用于具體的應用，例如用甘油做碳源合成期望終產(chǎn)物，所述期望終產(chǎn)物例如琥珀酸鹽、乙醇、甲酸鹽或氫以及l(fā),2-PDO。附圖的簡要說明圖1:在由2g/L胰蛋白胨補充的基本培養(yǎng)基(MM)中由大腸桿菌MG1655發(fā)酵甘油。細胞生長(▲)甘油消耗(園)，以及乙醇(參)、琥珀酸鹽(令)和甲酸鹽加乙酸鹽(*)的積累。圖2:Na+，K+,P043-以及甘油濃度的效果。將Na+(34mM)、K+(128mM)以及P043—(98mM)按所示加至所述介質(zhì)。除非另外注明，實驗都是在pH7.5，37°C,10g/L甘油、2g/L胰蛋白胨下進行，并用氬氣沖洗頂部空間。示出甘油發(fā)酵(線)和細胞生長(棒)條形顏色表示pH6.3(灰色)或7.5(白色)。圖3:用于在具有II型glyDH的大腸桿菌和其他腸細菌中甘油發(fā)酵的新范例。所提出用于在大腸桿菌中將甘油轉化為糖酵解中間產(chǎn)物DHAP的途徑由GldA酶和DHAK構成。圖4:發(fā)酵甘油期間乙醇(線)-H2(實心棒)以及乙醇(線)-甲酸(空心棒)的共同生產(chǎn)。(1)MG1655:pH6.3，氬氣；(II)A/^cj5:pH7.5，氬氣。HycB是FHL系統(tǒng)的必需組分。圖5:由甘油生產(chǎn)琥珀酸(1)MG1655:pH6.3，氬氣；(H)MG1655:pH6.3，10%CO2，(HI)MG1655:pH7.5，20%CO2;以及(IV)AWa夂丄M(pZSKLcf):pH7.5，20%CO2。質(zhì)粒pZSKLcf表達C/re柳&7DHA激酶亞單位DhaKL。本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明提供用細菌發(fā)酵甘油以生產(chǎn)有用的化合物的新方法。"隱蔽"基因是一種不表達或基因表達條件未知的基因。"歧化"是氧化和還原。如本文所使用的，術語"阻斷"和"阻斷株"指其中天然基因或啟動子被突變、刪除、間斷或下調(diào)以這樣的方式減少由此編碼的酶的活性的細胞株。通過敲除或移除整個基因DNA序列基因被完全地(100%)減去。使用移碼突變、早期終止密碼子、重要殘基的點突變等等，通過完全阻止活性蛋白的轉錄和/或翻譯，可以完全使基因產(chǎn)物去活化(100%)"異化"是生物體將物質(zhì)轉化為分泌化合物的代謝過程。術語"外源性的"表示所述蛋白和核酸是由生物體或系統(tǒng)之外引入的非天然分子，而不關心的物種來源。例如，可以將外源性多肽應用于細胞培養(yǎng)基；從轉染到細胞中的重組DNA可以表達外源性RNA;或者天然基因可以處于外源調(diào)控序列的控制之下。通過"發(fā)酵"表示完全不存在外部電子受體(無氧、無硝酸鹽等等)時碳源的代謝或異化。通過"功能性1,2-丙二醇途徑"表示細菌通過一種或更多種不同路徑功能性表達制造1，2-PDO所需要的基因(并由此表達酶)。舉例來說，需要功能性mg^(甲基乙二醛合成酶:MGS)、"a￡、應/zZ以及，歷基因(醛酮還原酶AKR)、gW」(甘油脫氫酶，GldA)中的每一個。一個重要的特征是給定生物體可能具有某種特定的途徑的基因/酶但所述途徑是隱蔽的。通過"功能性II型甘油脫氫酶-二羥基丙酮激酶途徑"表示所述細菌具有在缺少外部電子受體時通過將甘油轉化為DHA到DHAP而由甘油制造DHA磷酸鹽(DHAP)需要的酶。舉例來說，所述細菌必須具有活性的GldA(gWA)和DHA激酶(DHAK:^w/0:M)。通過"功能性FoFiATP合成酶途徑"表示細菌具有將ATP的合成與質(zhì)子泵耦合所需要的所有的酶。例如，所述細菌必須具有起作用的a^操縱子，包括W/7尸和a&D。通過"功能性甲酸鹽-氫裂合酶(FHL)途徑"表示所述細菌具有將甲酸鹽歧化為C02和氫所需的所有酶。舉例來說，活性的甲酸脫氫酶(例如FDH-F:/t/;F)以及氫化酶3(c操縱子)。通過"功能性l，3-丙二醇途徑"表示制造l,3-PDO所需的基因或酶。舉例來說，在缺乏功能性1，3-丙二醇途徑的細胞中甘油脫水酶(GD)和或l,3-PDO還原酶(1，3-PDOR)是去活化的或缺乏的。"甘油"在NCBIPubChem#753禾卩CASReg#56-81-5中描述，通過引用包括在本文中。通過"過度表達"表示基因(或蛋白)被修飾以具有比野生型增加的活性。這可以通過向所述細胞添加更多的基因拷貝、通過使所述基因突變以刪除抑制序列、通過去掉抑制劑或通過改變所述蛋白來增加活性等等來達成。如在本文中所使用的"重組體"涉及、來自于或包含基因工程改造的材料。"降低的活性"或"去活化"在本文中被定義為與合適的對照物種相比，在蛋白活性上至少75%減低。優(yōu)選地，獲得至少80、85、90或95%的活性降低，在最優(yōu)選的實施方案中，所述活性被消除(100%)。蛋白可以通過抑制劑、通過突變或通過抑制表達或翻譯等等而去活化。通過"無效突變"或"無效突變化"表示所述蛋白活性被完全去活化。在一個實施例中，插入不具有感興趣基因的對照質(zhì)粒。在另一個實施例中，所述感興趣的基因通過重組完全去除。此外，感興趣的基因可以通過去活化、突變或截斷以消除活性而去除。術語"琥珀酸鹽(succinate)"和"琥珀酸(succinicacid)"以及"甲酸鹽(formate)"和"甲酸(formicacid)"在本文中被可互換地使用。本文中的化學品可以在NationalLibraryofMedicinePubChem數(shù)據(jù)庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中找至ij，所述數(shù)據(jù)庫通過引用包括在本文中。細菌的代謝途徑可以在Lehninger的PrinciplesofBiochemistry2nded(生物化學原理，第二版，1993年)以及其他的生物化學教科書中找到，上述的PrinciplesofBiochemistry2nded通過引用包括在本文中。表l:基因和酶<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例l:材料和方法
技術領域：
：本發(fā)明由始至終，采用下列專用名稱，基因阻斷突變被稱為針對基因l的單阻斷為△ge"e7或針對雙阻斷的Age"eJAge"e2。野生型大腸桿菌(五.co/Z)K12菌株MC4100(ATCC35695)、W3110(ATCC27325),野生型大腸桿菌(￡.co//)B(ATCC11303)，以及腸細菌陰溝腸桿菌陰溝桿菌亞屬(￡"&ra6a"erc/oacaew^yp.c/oacae)NCDC279-56(ATCC13047)、鄉(xiāng)間布丘氏菌(5w衍awxe〃aagmyfe)(ATCC33994)、普利茅斯沙雷氏菌(5Wr油'a;(yw^/n'ca)(ATCC15928)以及理氏勒米諾氏菌aew'"we〃an'c/wraW)(ATCC33998)由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。單突變重組株A;to、A^/7^E、Ac;^L4、△，5、4/hi4、Ayx厶Ag/;丄厶g/;^D、AmgM、A戸五、Ayg/Z、Ayq/B、A/wcO、A,F、△a/p￡>、Apj^F和A&C5由大腸桿菌基因組計劃(威斯康辛大學麥迪遜分校，www.genome.wisc.edu)獲得或采用由Datsenko和Wanner(2000)描述的方法構建。K12株MG1655(F-/amkfo-//vG-(/&-50r;^-l)被用作產(chǎn)生基因阻斷突變的野生型。在MG1655和W3110(ATCC27325)兩者中構建菌株Ag/必、ZW/wAX似以及A/鼎尸。多基因阻斷是通過使用Pl噬菌體轉導組合單突變體而實現(xiàn)的。在除去卡那霉素盒后，將每種突變加至菌種，一次加一種。質(zhì)粒pZSKLM(表達大腸桿菌DHA激酶亞單位DhaKLM)以及pZSKLcf(表達弗氏擰檬酸桿菌(C"rak"er,e朋必)DHA激酶亞單位DhaKL)是由瑞士伯爾尼大學的B.Emi博士惠贈的(Bachler等，2005)。表達酶DHAK和GldA的質(zhì)粒pZSKLM—gldA按如下構建。PCR擴增gW^基因的完整開讀框架以及其核糖體結合位點。所述PstI以及MluI位點通過引物引入到PCR產(chǎn)物的兩端以促進質(zhì)粒pSZKLM中說"《ZM操縱子下游的gW」基因的克隆。用PstI和MM消化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物兩者，接合、轉化到DH5a中并針對陽性克隆屏蔽。成功構建所述質(zhì)粒是經(jīng)PCR并通過所編碼的酶活證實。質(zhì)粒被轉移到大腸桿菌菌株中并在由適當?shù)目股匮a充的LuriaBertani(LB)上篩選。采用標準的重組DNA方法克隆、分離質(zhì)粒、噬菌體P1轉導、電穿孔和聚合酶鏈式反應(PCR)(Sambrook等，1989)。所述菌株被保持在-80。C的32.5。/。的甘油儲備液中。采用含有1.5。/。瓊脂的LB介質(zhì)制備平板。按下列濃度包括抗生素和引物100pg/ml氨節(jié)青霉素，30嗎/ml的氯霉素，50嗎/ml的卡那霉素以及12.5嗎/ml四環(huán)素，0.001-0.1mMIPTG以及100ng/mL無水四環(huán)素。除非另外注明，采用由Neidhardt等(1974)設計的基本培養(yǎng)基(MM)，用0.03-0.2%胰蛋白胨、5pM亞硒酸鹽(selenyte)以及用1.32mMNa2HP04代替K2HP04。MOPS(3-(N陽嗎啉代)丙磺酸)本身僅包括于在試管中進行實驗中(見以下)或其中未采用胰蛋白胨補充的實驗中。當指出時，所述介質(zhì)由一定濃度的下列化合物補充磷酸二氫鈉和磷酸氫鈉以及磷酸二氫鉀和磷酸氫鉀、磷酸二氫銨和磷酸氫銨、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、L-氨基酸、核苷酸和維生素。除非另外注明，所有化學品都由Sigma-AldrichCo.(StLouis,MS)獲得。所有實驗都是在厭氧條件下進行的，并且除非另外注明，于37。C下進行。試管中的實驗是在密封的厭氧管(Hungatetm管美國新澤西州bellcoGlassInc)中進行的，所述厭氧管用介質(zhì)完全填充或用氬氣持續(xù)吹掃(初始pH7.2)。所述發(fā)酵系統(tǒng)以及其在厭氧條件下的操作連同接種物制備技術在別處已有描述(Dharmadi等,2006)。在使用前，將所述儲備培養(yǎng)物(貯藏為-80。C的甘油儲備液)在LB平板上劃線并在具有C02產(chǎn)生裝置的oxoidtm厭氧罐(英國罕布什爾貝辛斯托克的OxoiD⑧Ltd.)中在37T下溫育過夜。采用單個菌落接種完全充滿介質(zhì)(由10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物、以及5g/L甘油補充的MM)的17.5mL的Hungatetm管。所述試管在37°C下溫育直到達到~0.4的OD55。。此活躍生長的預培養(yǎng)物的適當體積被離心，洗滌所述小團并用于接種各發(fā)酵罐中的350mL介質(zhì)，在550nm處的目標起始光密度為0.05。用具有六個500ml工作體積的容器，并獨立控制溫度、pH以及攪拌速度(200rpm)的SixForstm多重發(fā)酵系統(tǒng)進行發(fā)酵。所述系統(tǒng)裝備完全并用制造商的IRISNT軟件計算機控制。各容器安有用0°C冷卻的甲醇-水供應操作的冷凝管以防止揮發(fā)。厭氧條件通過用超高純氬(得克薩斯州休斯頓的MATHESONTRI-GAS氣Inc.)以O.OlLPM沖洗頂部空間維持。采用氧氣阱(伊利諾伊州迪爾菲爾德的ALLTECHASSOCIATES,Inc.)來消除氣流中的痕量氧氣。為了保持無菌，分別采用0.2卞m和0.45卞m的HEPA濾器(加利福尼亞州Bellerica的Millipore)安裝入口和出口線路。在550nm測量光密度并用作細胞濃度的估計(1O.D.=0.34gDW/L)。離心后，上清液在-20。C儲存以用于HPLC分析。為了定量甘油、乳酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽以及乙醇的濃度，使用裝配有HPX-87H有機酸柱(加利福尼亞州Hercules的Bio-Rad)的ShmadzuProminenceSIL20頂系統(tǒng)(馬里蘭州哥倫比亞的ShimadzuScientificInstrumentsInc.)用離子排除HPLC分析樣品。使用先前描述的方法(Dharmadi和Gonzalez,2005)確定最優(yōu)化的峰分離操作條件(流動相30mMH2S04、柱溫42°C)。使用氣相色譜在選定的樣品中測量氫產(chǎn)生。還可以將氫計算為(乙醇+乙酸鹽)和甲酸鹽的摩爾量之差。如以下所述經(jīng)NMR(核磁共振)實驗確定l，2-PDO的濃度并使用四甲基硅垸(TMS)作為標準物。發(fā)酵產(chǎn)物的身份通過ID1H(質(zhì)子)NMR實驗確認。60nlD2O和1pi的600mMNMR內(nèi)標TSP(3-(三甲基甲硅垸基)丙酸-D4，鈉鹽)被加至540pl樣品中。所得的溶液然后被轉移到5mm-NMR管中并在25°C于裝配有PENTATM探頭的Varian500MHzlNOVATM譜儀上進行1D質(zhì)子NMR譜。使用以下參數(shù)掃描寬度8,000Hz;捕獲時間2.8秒；捕獲256次；脈沖寬度6.3ps;脈沖重復延遲1.2s以及預飽和2秒。所得譜使用FELIX2001(馬里蘭州伯林頓的AccelrysSoftwareInc.)軟件分析。峰通過其化學位移和J-耦合值鑒定，其在其中樣品用代謝標準物(2mM終濃度)示蹤的獨立實驗中獲得。所述樣品進一步的表征是通過2D1H-1HCOSY(相關光譜，CorrelationSpectroscopy)NMR實現(xiàn)的。具有Watergate溶劑壓制的雙量子濾波COSY譜是通過wgdqfcosy脈沖序列獲得的，所述的wgdqfcosy脈沖序列是脈沖序列BioPacktm套件(Varian氣Inc.)的部分。使用以下參數(shù)掃描寬度6,000Hz;捕獲時間0.5秒；tl維上600個復數(shù)點；32個瞬態(tài)；脈沖寬度5.5ps;弛豫延遲1秒。通過在大腸桿菌中發(fā)酵50%11-13<:-標記的甘油來評定甘油并入產(chǎn)蛋白的生物質(zhì)。3天后(72小時)，收獲所述試管并離心所述發(fā)酵肉湯。細胞小團用9g/L的NaCl溶液洗滌并再次離心。所得的細胞小團使用REACTI-THERMTM水解系統(tǒng)(伊利諾伊州Rockford的PiERCE)ffl6N持續(xù)煮沸的HC1在110°C水解24小時。采用CentriVaptm系統(tǒng)(密蘇里州堪薩斯的LabconcoCorp.)使所述溶液在75°C真空下快速蒸發(fā)2小時以除去HC1。所述干燥樣品在lmlD20中復原(馬薩諸塞州Cambridge的CambridgeIsotopeLaboratories),冰凍至-80。C，然后在4.5LFreeZonetm凍干系統(tǒng)(labconco⑧Corp)中凍干24小時。然后將所述樣品在600^D20中復原并過濾以除去細胞顆粒。將1M1TSP標準物加至所述樣品，并將內(nèi)含物轉移到NMR管中。為了確定。C富集，所述樣品采用在碳5()上具有并發(fā)90°脈沖和不具有并發(fā)90。脈沖一維質(zhì)子自旋回波分析。在碳上的90。脈沖重新調(diào)焦在13<:碳原子上，由此壓制由于質(zhì)子-碳自旋耦合的13(:衛(wèi)星峰的產(chǎn)生。此現(xiàn)象對于12<:原子不發(fā)生。對于這些實驗，我們在500MHzVarianInnovaspectrometer使用了商業(yè)上可獲得的脈沖序列；wxcfl/。采用以下參數(shù)掃描寬度8,000Hz;捕獲時間2.7秒；瞬態(tài)256個，在25°Cpwxl0和卯°。根據(jù)化學位移和所述譜的精細結構鑒定單獨的氨基酸。為了進行酶分析，來自0.7的OD55Q的厭氧培養(yǎng)物的細胞用離心收獲(2分鐘，10,000xg)，用9g/升NaCl洗滌，并以細胞小團在-20。C儲存。細胞被重新懸浮于0.2ml各自的緩沖液中并通過渦旋與氯仿混合(Tao等，2001年)。通過測定在含有50mMTris，HCl(pH7.6)、2mMMgCl2、500^MNAD+、10mM甘油以及10-100^細胞粗提取物的混合物在25°C，340nm處吸光度的變化來檢驗甘油脫氫酶。對于所有制備物確立對HA的甘油脫氫酶活性、甲基乙二醛還原酶活性、酵-酮還原酶活性以及所述反應的線性(蛋白濃度和時間)。結果表示為微摩爾，分鐘人毫克細胞蛋白—、并且是對至少三個細胞制備物的平均。細胞生長的比速率(一、甘油消耗以及產(chǎn)物合成通過將總細胞、甘油或產(chǎn)物濃度對細胞濃度的積分(ICC)作圖，并將這些圖擬合為多項式函數(shù)。實施例2:甘油發(fā)酵和介質(zhì)組成的影響盡管人們認為大腸桿菌中甘油代謝限于呼吸條件下，我們發(fā)現(xiàn)此生物體可以在缺乏電子受體時代謝甘油。圖1顯示典型的野生型菌株MG1655在由2g/L胰蛋白胨補充的介質(zhì)中的典型發(fā)酵曲線(其余細節(jié)在臨時申請60/788,512和60/867,581以及Gonzalez等，2007年中提供)。在固定相培養(yǎng)物中剩下大約1-2g/L的甘油未發(fā)酵。使用不同的NMR技術鑒定了乙醇、1,2-丙二醇(1,2-PDO)以及琥珀酸、醋酸以及甲酸作為發(fā)酵產(chǎn)物。下一步我們探索鑒定各種參數(shù)對于甘油發(fā)酵的影響效果。根據(jù)典型方法，進行鉀、磷酸鹽、鈉、甘油、HA、pH和C02對細胞生長滴定。在先前的大腸桿菌中甘油代謝的研究中使用的典型介質(zhì)含有高水平的磷酸鹽、鉀以及鈉，其主要目的是將培養(yǎng)物的pH控制在從7-7.5。此介質(zhì)最初由Tanaka等報道(1967)并隨后在大腸桿菌中甘油的代謝研究中被大部分研究者使用。我們發(fā)現(xiàn)用這樣水平的磷酸鹽、鉀和鈉(即34mMNaH2P04及64mMK2HP04)補充我們的介質(zhì)嚴重削弱甘油發(fā)酵(圖2)——此影響在堿性pH下尤其有害。鉀和磷酸鹽是造成此消極作用的原因，但鈉鹽不是(圖2)。在我們實驗中分析甘油消耗模式顯示在介質(zhì)中留有顯著量的甘油未被代謝(一般是10-30mM)，暗示存在限制厭氧發(fā)酵甘油的閾濃度。有趣的是，先前甘油代謝的研究也是在一般從20到30mM變化的甘油濃度下進行的。我們現(xiàn)在知道當采用含有高水平的磷酸鹽和鉀、2g/L的甘油的介質(zhì)，并在pH7.5和37。C進行發(fā)酵時，甘油發(fā)酵和細胞生長被徹底削弱(圖2)。綜上所述，我們的結果明確證實先前嘗試用大腸桿菌厭氧發(fā)酵甘油的企圖不成功是因為所述實驗都是在消極影響甘油發(fā)酵的條件下進行的。這些條件包括使用中性到堿性的pH(7-7.5)、高濃度的鉀和磷酸鹽，相對低的甘油濃度、37。C以及密閉容器。后者是我們顯示由于積累氫以及在氧化還原平衡上導致的結果而削弱甘油發(fā)酵的條件。實施例3:甘油發(fā)酵的途徑和機理腸道細菌中甘油的厭氧發(fā)酵長久以來被認為是具有活性1,3-PDO途徑的物種的特權。然而，我們已經(jīng)證實，只要存在功能1，2-PD0途徑和glyDH-II-DHAK途徑，大腸桿菌可以以不依賴1,3-PDO方式，以發(fā)酵的方式代謝甘油?；谖覀兊陌l(fā)現(xiàn)，所述發(fā)現(xiàn)在Dharmadi等(2006)、Gonzalez等2007以及臨時申請60/867,581和60/788,512中更詳細地描述(每一件都通過引用并入本文)，我們提出了用于在腸道細菌中甘油發(fā)酵的新范例，其中(i)所述的l，2-PDO途徑提供消耗在合成細胞總量期間產(chǎn)生的還原當量，因此實現(xiàn)氧化還原平衡條件的手段以及(ii)通過氧化還原平衡途徑合成乙醇，通過經(jīng)底物水平的磷?；a(chǎn)生ATP而實現(xiàn)能量要求(圖3)。還發(fā)現(xiàn)所述甲酸氫裂合酶以及FoF廣ATP酶系統(tǒng)的活性可能是通過輔助維持胞內(nèi)pH和C02供應而促進甘油的發(fā)酵代謝。我們顯示將甘油轉化為糖酵解中間產(chǎn)物的途徑主要由兩種酶構成(圖3):甘油脫氫酶(glyDH)以及DHA激酶(DHAK)，前者是先前未知的生理角色。Table2.發(fā)酵甘油期間細胞的生長u<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實驗在0.2%的胰蛋白胨和10g/L甘油的存在下進行。NG:未觀察到生長;ND:未檢測到；SD:標準偏差。在指數(shù)生長期間計算的最大比生長速率(h—^。Yx/S:按消耗單位甘油的細胞總量增加計算的生長產(chǎn)率(mg細胞/g甘油)。按所描述的通過NMR鑒定1,2-PDO的合成我們所發(fā)現(xiàn)的菌株MG1655可以發(fā)酵甘油的現(xiàn)象是大腸桿菌物種的通性，因為其他的測試菌株(W3110,MC4100和Eco//B)也可以發(fā)酵甘油(表2)。由于兩種其他glyDHs，即glyDH-III和glyDH-IV，已經(jīng)在腸桿菌族(^fera6"Wm'"ce"e)的成員中得以確認，我們對其在厭氧發(fā)酵甘油中的參與進行了研究。只有菌株陰溝腸桿菌(五"/era6arfwdoacae)NCDC279-56，類似大腸桿菌擁有glyDH-II(2)，可以發(fā)酵甘油(表2)。我們對酵母釀酒酵母(SacctoramycMcwev/w'ae)的初步結果似乎表明相似的途徑可以支持在此生物體中發(fā)酵甘油。以上的途徑提供了可以解釋所觀察到的pH和鉀、磷酸鹽和甘油濃度對于甘油發(fā)酵的影響(見實施例2、臨時申請60/867,581以及Gonzalez等，2007)的框架。舉例來說，高水平的磷酸鹽促進DHA和HA兩者(兩種在前述途徑中的關鍵中間體)的分解并消極影響GldA的活性及其由HA的可誘導性。此外，MG合成酶，一種負責1,2-PDO合成的關鍵酶在高磷酸鹽濃度下被抑制。高濃度的鉀增加了MG(—種在1,2-PDO合成中的關鍵中間體)的毒性。GldA對于甘油的低親和性[Km為3-40mM]解釋了為了發(fā)酵代謝要求高濃度的甘油以及我們觀察到的在介質(zhì)中留有10-30mM的甘油未被發(fā)酵。pH對于甘油發(fā)酵的影響也可以與其對于前述途徑(見實施例2、臨時申請60/867,581以及Gonzalez等，2007)的影響有關。GldA呈現(xiàn)強的pH依賴性，在強堿性pH氧化活性較高以及在中性到堿性條件下的還原活性。酸性條件不僅降低了glyDH的活性，還降低了合成1,2-PDO所需的MG還原活性。另一方面，堿性條件增加了MG(—種在1,2-PDO合成中的關鍵中間體)的毒性。顯然，所述細胞內(nèi)pH需要謹慎控制以避免關鍵酶的低活性和MG的毒性。舉例來說，盡管細胞外6.3的pH明顯防止了MG的毒性，細胞仍然需要一個系統(tǒng)來防止pH降到允許glyDH和MGR/AKR活性的水平以下。已知所述的FHL系統(tǒng)通過將甲酸轉化為C02和H可以防止細胞質(zhì)酸性化，這可以解釋為何在酸性條件下對于甘油發(fā)酵需要FHL。然而，F(xiàn)HL活性可以產(chǎn)生過量的氫，如果其積累將會消極影響甘油發(fā)酵。在堿性條件下，可能需要所述FoFpATP酶以防止細胞質(zhì)堿性化，由此避免MG毒性。實施例4:在工業(yè)介質(zhì)中改進甘油發(fā)酵的生產(chǎn)效率和可行性為了證實應用我們的發(fā)現(xiàn)對于改進甘油發(fā)酵的推論，我們將發(fā)現(xiàn)的主體途徑(GldA-DHAK)在野生型菌株MG1655中過度表達并觀察到在細胞生長和甘油發(fā)酵兩者中多于2倍的增加。GldA-DHAK途徑的放大是通過用質(zhì)粒pZSWfl《丄M^/必轉化MG1655而實現(xiàn)的。進一步的生產(chǎn)效率的提升可能需要糖酵解酶(例如磷酸丙糖異構酶)與所述GldA-DHAK途徑的協(xié)同過度表達。此外，其他基于工藝的改進包括進一步優(yōu)化培養(yǎng)介質(zhì)、培養(yǎng)系統(tǒng)以及執(zhí)行的操作模式。甘油發(fā)酵在工業(yè)水平上的應用將需要使用在生物柴油生產(chǎn)期間得到的甘油。當MG1655在純甘油和由FWmuP恥/化學公司所經(jīng)營的生物柴油廠獲得的兩個甘油樣品上培養(yǎng)時，我們觀察到相似的細胞生長和甘油發(fā)酵48小時培養(yǎng)后，所述細胞發(fā)酵4(純)，3.9(提純)和3.8(粗)g/L的甘油并達到1.2(純),0,96(提純)，and0.98(粗)的光密度。將具有成本有效的工業(yè)補充物胰蛋白胨補充的代替是商業(yè)成功的另一個重要因素。然而，我們已經(jīng)證實用玉米漿(cornsteepliquor)(—種在工業(yè)發(fā)酵中使用的廉價補充物)補充介質(zhì)與觀察到的用胰蛋白胨補充(Dharmadi等，2006)在相似水平支持甘油發(fā)酵。我們還獲得了能夠在無補充的基本培養(yǎng)基中生長的MG1655突變體(OD55()0.36以及發(fā)酵甘油8.1g/L)。這些突變體是通過在含有減少量的HA或胰蛋白胨的介質(zhì)中多輪篩選可以發(fā)酵甘油的菌株而產(chǎn)生的(臨時申請60/867,581)。實施例5:來自甘油的產(chǎn)物我們還做了使用甘油作為碳源以及以上所描述的介質(zhì)形成產(chǎn)物的例證性證實。舉例來說我們在圖4展示了乙醇的生產(chǎn)。我們的結果表明微小的基因和環(huán)境調(diào)整使得大腸桿菌成為將甘油轉化為乙醇以及H2-C02(pH6.3)或乙醇和甲酸鹽(pH7.5并阻斷所述FHL系統(tǒng))的優(yōu)良生物催化劑。與此不同，經(jīng)糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇不會提供H2或甲酸鹽的共產(chǎn)生，因此代表更不經(jīng)濟的過程。乙醇-H2以及乙醇-甲酸鹽產(chǎn)率的進一步改進可以由消除琥珀酸和乙酸途徑(/W力和/^fl突變，Gonzalez等，2007以及臨時申請60/867,581)造成。改進生產(chǎn)率并使用工業(yè)介質(zhì)上面在上面的實施例4中描述。另一個實施例是琥珀酸，其由糖的產(chǎn)生受限于被還原當量的可用性。幸運的是，通過氧化還原-平衡途徑，其從甘油的合成是可行的。然而，在我們用MG1655的實驗中觀察到非常低的琥珀酸產(chǎn)量，這是甘油通過PEP依賴的GldA-DHAK途徑而異化(即低PEP可用性)的結果。通過用弗氏檸檬酸桿菌(C/^""必)的ATP依賴的DHAK取代大腸桿菌PEP依賴的DHAK，并且使用適當?shù)膒H和CCV濃度，采用以上描述的介質(zhì)，我們實現(xiàn)了琥珀酸產(chǎn)率近10倍的增加(圖4)。琥珀酸產(chǎn)率的進一步改進可以由消除乙醇和乙酸途徑(flW五和聲a突變Gonzalez等，2007以及臨時申請60/867,581)造成。改進生產(chǎn)率并使用工業(yè)介質(zhì)如同在上面的實施例4中被描述的那樣，除了弗氏檸檬酸桿菌的ATP依賴的DHAK而不是天然的DHAK將被過度表達。為了使琥珀酸途徑在能量上更有利，我們正在消除大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，由基因ppc編碼)以及過度表達來自大腸桿菌(pcfc4)、琥珀酸放線桿菌(^cri"c^ac77/^wcd"oge"")(pcfc4)或如在酶數(shù)據(jù)庫BRENDA(Schomburg等，2004)所描述的其他的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的過度表達。通過琥珀酸途徑(不像產(chǎn)生ATP的PEPC和PEPCK)的高能量產(chǎn)生將導致更高的生產(chǎn)效率和產(chǎn)率。其合成受益于甘油中碳的高度還原態(tài)的另一產(chǎn)物是1，2-PDO。GldA-DHAK途徑的放大不僅導致增加的生產(chǎn)效率還導致1，2-PDO合成近20倍的增加MG1655僅產(chǎn)生0.026mM的1，2-PDO，而重組的菌株MG1655(pZScZ/2a/a:M^/aL4)積累0.51mM的該產(chǎn)物。這些結果可能是由于GldA參與了1,2-PDO的合成(Gonzalez等，2007)。我們現(xiàn)在正探索幾種用于由甘油產(chǎn)生高水平的1,2-PDO的策略，如下所述(l)用弗氏檸檬酸桿菌的ATP依賴的DHAK(Wfl/^亞單位)代替大腸桿菌的天然的PEP依賴的DHAK(W"/:ZM)以及其與天然的甘油脫氫酶(g/c^)—起過度表達。P)過度表達甲基乙二醛合成酶、甘油脫氫酶和甲基乙二醛還原酶，所有都涉及將DHAP轉化為l，2-PDO(Gonzalez等，2007以及臨時申請60/867,581)。(3)增加NADPH的可用性以通過經(jīng)過度表達轉氫酶的或改造在核心代謝途徑中酶的輔助因子的特異性改善NADH到NADPH的轉化，驅(qū)使DHAP轉化為l，2-PDO，所述核心代謝途徑中的酶包括甘油脫氫酶、甘油-3-P脫氫酶、甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶等?？商鎿Q地，這些處于天然形式的使用NADP作為輔助因子的酶的改變可以由其他生物體克隆并在大腸桿菌中表達。(4)改造甘油脫氫酶(GD，其本性為通過將其轉化為3-羥基丙醛而使甘油脫氫)以使甘油一步轉化為HA。然后HA由GldA或大腸桿菌中的其他酶轉化為l，2-PDO，正如我們在實驗中已經(jīng)證實的那樣，在所述實驗中，最初存在于培養(yǎng)介質(zhì)中的HA被等化學計量地轉化為1,2-PDO(臨時申請60/867,581)。此途徑可以避免甲基乙二醛作為中間體(非常有毒的產(chǎn)物)并代表更能量有效的將甘油轉化為1,2-PDO的途徑，因為不需要消耗ATP，這導致產(chǎn)率顯著增加。所述改造的GD是由誘變丁酸梭菌(C.ZwOT/cwm)GD(鼎WJ)而獲得的，其不像其他的GD，其活性不需要輔酶Bi2。我們還進行了可以將甘油轉化為HA的天然微生物GD的搜索。一旦發(fā)現(xiàn)，此活性就將被克隆并在大腸桿菌中表達。(5)將化學的(甘油到HA)和生物的(HA到1,2-PDO)組合策略。已經(jīng)用使用固體催化齊i」、適宜溫度(200。C)和常壓的工藝下有效實現(xiàn)甘油到HA的脫水(Crabtree等，2006)。僅有的產(chǎn)物是HA和水。我們已經(jīng)證實在含有甘油的介質(zhì)中通過大腸桿菌細胞將HA有效轉化為1,2-PDO(Gonzalez等，2007以及臨時申請60/867,581)。甘油的消耗量是最小的并且在非常短的發(fā)酵中實現(xiàn)HA到1,2-PDO的等化學計量轉化。在上面描述的并在圖4和5中顯示的結果明確證實開發(fā)用于由甘油生產(chǎn)燃料和還原化學品平臺的可行性。其生產(chǎn)經(jīng)甘油發(fā)酵將會是有利的其余產(chǎn)物包括丙醇酰胺(pr叩anolamide)、丙酸、丁醇等(Gonzalez等，2007)。這些工藝將真正的生物煉制得以實施并通過大幅改進其經(jīng)濟效果而使生物燃料工業(yè)革命化。參考文獻為了讀者的方便，所有的參考此列出。每篇都通過引用整體包括在本文中。1.Bachler，C.,等,B.大腸桿菌二羥基丙酮激酶通過結合到轉錄因子DhaR而控制基因表達(五5r/2e〃'cWaco//dihydroxyacetonekinasecontrolsgeneexpressionbybindingtotranscriptionfactorDhaR.)EMBOJ.24:283-293(2005).2.Crabtree,S.,等，從生物質(zhì)生產(chǎn)甘油的最優(yōu)化(Optimizeglycolproductionfrombiomass).HydrocarbonProcessing:87-92(2006).3.Datsenko,K.A.,Wanner.B丄.用PCR產(chǎn)物使大腸桿菌K-12中的染色體基因一步去活化(One-stepinactivationofchromosomalgenesinEsc/zm'c/n'aco/ZK-12usingPCR'products.)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6640-5(2000).4.Dharmadi，Y.，&R.Gonzalez.用于優(yōu)化HPLC分離的較好整體分辨功能與新型迭代隨豐幾篩選方》去(AbetterglobalresolutionfUnctionandanoveliterativestochasticsearchmethodforoptimizationofHPLCseparation.)J.Chromatogr.A.1070:89-101(2005).5.Dharmadi，Y.,等，由大腸桿菌厭氧發(fā)酵甘油針對代謝工程的新平臺(AnaerobicfermentationofglycerolbyEscten'c/z/aco//:anewplatformformetabolicengineering.)Biotechnol.Bioeng.94:821-829(2006).6.Gonzalez,R.，等，針對大腸桿菌和其他腸道細菌中發(fā)酵甘油的新范式以及其在生物燃料工業(yè)的含義(ANewParadigmforGlycerolFermentationinEsc/zm'c/z/aco"andotherEntericBacteriaanditsImplicationsfortheBiofuelIndustry).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(InPress)(2007).7.Jin,R.Z.,等，在大腸桿菌中甘油異化新途徑的實驗進展(Experimentalevolutionofanovelpathwayforglyceroldissimilationin￡^c/7m'c/z/aco//.)J.Mol.Evol.19:429-436(1983).8.KangY，等，大腸桿菌基因組中的系統(tǒng)性誘變(Systematicmutagenesisofthe￡^c/zm'cWaco/Zgenome.)JBacteriol186:4921-4930(2004).9.Neidhardt,F.C.,等，針對腸道細菌的培養(yǎng)介質(zhì)(Culturemediumforenterobacteria.)J.Bacteriol.119:736-747(1974).10.Sambrook,J.，等，分子克隆實驗室手冊，第二版(Molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y,1989).11.Schomburgl.,等，BRENDA，酶數(shù)據(jù)庫更新和主要的新進展(BRENDA，theenzymedatabase:updatesandmajornewdevelopments.)NucleicAcidsRes.D431-433(2004).12.Tang,J.C.,等，來自大腸桿菌和肺炎莢膜桿菌NAD+相關的甘油脫氫酶的免疫化學性質(zhì)(ImmunochemicalpropertiesofNAD十-linkedglyceroldehydrogenasesfrom￡sc/m'c/n'aco/〖and幻eZw'e〃ap"e謂匿'aeJ.J.Bacteriol.152:1169-1174(1982).13.Tang，J.C.，等，用于大腸桿菌在甘油上生長的NAD相關的脫氫酶的解阻遏(DerepressionofanNAD-linkeddehydrogenasethatservesan￡lyc/7m'c/z/aco//mutantforgrowthonglycerol.)J.Bacteriol.152:1001-1007(1982).14.Tanaka，S.，等，用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸相關的脫氫酶取代磷酸烯醇式丙酮酸依賴的磷酰轉移酶以用于甘露糖的利用(Replacementofaphosphoenolpyruvate-d印endentphosphotransferasebyanicotinamideadeninedinucleotide-linkeddehydrogenasefortheutilizationofmannitol.)J.Bacteriol.93:642-648(1967).15.Tao，H.，等，改造大腸桿菌中的同源乙醇途徑在木糖發(fā)酵期間增加糖酵解流量以及糖酵解基因的表達水平的基因(Engineeringahomo-ethanolpathwayini^c/zen'c/n'aco/z':increasedglycolyticfluxandexpressionlevelsofglycolyticgenesduringxylosefermentation.)J.Bacteriol.183:2979-2988(2001).權利要求1.一種厭氧發(fā)酵甘油以生產(chǎn)產(chǎn)物的方法，包括將細菌細胞在厭氧條件下在介質(zhì)中培養(yǎng)以使甘油被轉化為產(chǎn)物，其中所述細菌細胞缺乏功能性1，3-丙二醇途徑，但具有功能性1，2-丙二醇途徑、功能性II型甘油脫氫酶-二羥基丙酮激酶途徑，以及功能性F0F1-ATP酶途徑，其中所述介質(zhì)包括至少10g/L的甘油作為碳源，小于10mM的鉀，小于50mM的磷酸鹽、大于或等于10％的CO2以及在5.0和7.5之間的pH。2.如權利要求l所述的方法，其中所述介質(zhì)由羥基丙酮(HA)補充，但不用胰蛋白胨補充。3.如權利要求l所述的方法，其中所述介質(zhì)用30mM的HA補充。4.如權利要求l所述的方法，其中當所述介質(zhì)pH小于或等于6.5時細菌細胞還具有功能性FHL途徑。5.如權利要求l所述的方法，其中當所述pH是大約7.5時C02是至少208/。。6.如權利要求l所述的方法，其中所述介質(zhì)具有小于或等于2mM的鉀以及小于或等于10mM的磷酸鹽。7.如權利要求l所述的方法，其中所述介質(zhì)具有小于或等于1mM的鉀以及小于或等于5mM的磷酸鹽。8.如權利要求1所述的方法，其中所述產(chǎn)物選自由乙醇、琥珀酸、甲酸、氫、1，2-PD0、丙醇酰胺、丙酸和丁醇所組成的組。9.如權利要求8所述的方法，其中所述介質(zhì)具有小于或等于1mM的鉀以及小于或等于2mM的磷酸鹽。10.如權利要求9所述的方法，其中所述pH是大約6.3并且所述介質(zhì)用惰性氣體吹掃，并且所述產(chǎn)物是乙醇和氫。11.如權利要求10所述的方法，其中天然的甘油脫氫酶-二羥基丙酮激酶途徑被過度表達，pto和/W^被去活化，所述甘油是粗甘油且所述介質(zhì)還包括玉米漿，但沒有胰蛋白胨。12.如權利要求9所述的方法，其中所述細菌細胞缺乏功能性FHL酶，pH為大約7并且所述介質(zhì)用惰性氣體吹掃，所述產(chǎn)物是乙醇和甲酸鹽。13.如權利要求12所述的方法，其中所述天然的甘油脫氫酶-二羥基丙酮激酶途徑被過度表達，pto和/W^被去活化，所述甘油是粗甘油，且所述介質(zhì)還包括玉米漿，但沒有胰蛋白胨。14.如權利要求9所述的方法，其中所述細菌細胞缺乏天然的二羥基丙酮激酶亞單位，并且表達來自弗氏檸檬酸桿菌的二羥基丙酮激酶，并且所述產(chǎn)物是琥珀酸鹽。15.如權利要求14所述的方法，其中所述介質(zhì)包括10-20%的CCb而pH是6-7.5。16.如權利要求15所述的方法，其中天然的甘油脫氫酶和弗氏檸檬酸桿菌二羥基丙酮激酶被過度表達，天然的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶被去活化，來自大腸桿菌或琥珀酸放線桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶被過度表達，pto和fl^五被去活化，所述甘油是粗甘油，而所述介質(zhì)還包括玉米漿。17.如權利要求9所述的方法，其中天然甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶被過度表達，而所述產(chǎn)物是1,2-PDO。18.如權利要求17所述的方法，其中所述天然的二羥基丙酮激酶被弗氏檸檬酸桿菌的二羥基丙酮激酶代替，而多種酶甲基乙二醛合成酶、甘油脫氫酶以及甲基乙二醛還原酶都被過度表達。19.如權利要求17所述的方法，其中改造或天然存在的能夠?qū)⒏视娃D化為羥基丙酮的甘油脫氫酶被過度表達。全文摘要本發(fā)明涉及用于細菌在甘油底物上厭氧(發(fā)酵地)生長的適當?shù)呐囵B(yǎng)條件的開發(fā)。所述方法需要在中性到弱酸性pH、低鉀鹽和磷酸鹽水平和高CO₂水平，含高甘油濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有功能性1，2-丙二醇途徑和功能性II型甘油脫氫酶-二羥基丙酮激酶途徑的細菌，以使甘油由此被轉化為合乎期望的產(chǎn)物，例如乙醇、氫氣、甲酸鹽、琥珀酸鹽或1，2-丙二醇。文檔編號C12P1/00GK101415830SQ200780012069公開日2009年4月22日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權日2006年3月31日發(fā)明者R·岡薩雷斯申請人:萊斯大學