專利名稱：：生產(chǎn)涎化低聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種大規(guī)模體內(nèi)合成涎化低聚糖的方法用一個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)一種微生物，可選地包含一個(gè)外源前體如乳糖，其中所述微生物包含編碼CMP-Neu5Ac合成酶、唾液酸合酶、GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異源基因，其中編碼唾液酸醛縮酶和ManNac激酶(MwKJ)的內(nèi)源基因被敲除或者滅活。本發(fā)明也涉及這種微生物，其可以產(chǎn)生內(nèi)部激活的唾液酸。
背景技術(shù)：
：N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neii5Ac)是氨基糖的唾液酸家族中最常見(jiàn)的成員。Neu5Ac經(jīng)常作為末端糖被發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞表面碳水化合物復(fù)合物，并且在很多生物過(guò)程例如細(xì)胞黏附以及毒素和病毒結(jié)合(Varki，1993)中扮演重要角色。Neu5Ac也是神經(jīng)節(jié)苷脂的碳水化合物部分的一個(gè)主要成分，其在腦組織中非常豐富，在很多病理過(guò)程中被涉及到(Zhang&Kiechle，2004)。由于其重要的生物學(xué)功能，含有低聚糖的唾液酸吸引了相當(dāng)大的興趣，研發(fā)了很多方法來(lái)合成這種結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行基礎(chǔ)研究以及潛在的治療應(yīng)用。但是，迄今還沒(méi)有達(dá)到大規(guī)模的生產(chǎn)涎化低聚糖。由于很多的保護(hù)和去保護(hù)步驟，化學(xué)合成是不實(shí)際的，很多的努力被放在酶學(xué)和生物技術(shù)方法。唾液酸轉(zhuǎn)移酶使用CMP-Neu5Ac作為活化的糖-核苷酸，通過(guò)鑒定在A"http://中有很好表達(dá)的細(xì)菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和模擬糖核苷酸生物合成的自然途徑的多酶系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，酶學(xué)合成涎化低聚糖的高效過(guò)程的發(fā)展成為可能(Gilbert等人，1998)。后來(lái)由于使用了活體細(xì)菌細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)涎化低聚糖而產(chǎn)生了一個(gè)顯著的改進(jìn)(Priem等人，2002)。在這個(gè)方法中，涎化乳糖通過(guò)培養(yǎng)代謝工程化的大腸桿菌(&c&n'cWaco/D菌株細(xì)胞直接生產(chǎn)，該菌株過(guò)度表達(dá)a-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和CMP-Neu5Ac合酶的腦膜炎雙球菌(A^^en'amew'"g"/cfoJ基因。該細(xì)菌生長(zhǎng)于高細(xì)胞密度，以甘油作為碳源和能量源，提供外源的乳糖和Neu5Ac作為涎化乳糖合成的前體。在生長(zhǎng)過(guò)程中，乳糖和Neu5Ac被￡.co//卩-半乳糖苷和Neu5Ac透性酶活性地內(nèi)在化。為了防止乳糖和Neu5Ac被分解代謝，使用了無(wú)P-半乳糖苷酶和Neu5Ac醛縮酶的突變菌株。乳糖和Neu5Ac在細(xì)胞質(zhì)中積聚，其中Neu5Ac被轉(zhuǎn)化成CMP-Neu5Ac以進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到乳糖上形成涎化乳糖(我們的歐洲專利EP1194584)。通過(guò)另外表達(dá)合適的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，這個(gè)系統(tǒng)被應(yīng)用于神經(jīng)節(jié)苷脂GM2和GM1的碳水化合物部分的生產(chǎn)(Antoine等人，2003)。多涎化的低聚糖(GD3和GT3糖)也通過(guò)這個(gè)方法及使用編碼雙功能a-2,3-和a-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的彎曲菌(。mpy/o6ac^)氾基因來(lái)生產(chǎn)(我們的美國(guó)專利申請(qǐng)US60/6卯，837和Antoine等人，2005)。通過(guò)這種微生物學(xué)方法大規(guī)模生產(chǎn)涎化低聚糖需要相當(dāng)數(shù)量的唾液酸作為前體。唾液酸可從自然來(lái)源例如牛和雞蛋黃中分離，但是產(chǎn)量較低，并且該方法不適合于大規(guī)模生產(chǎn)。唾液酸通常是以N-乙酰-甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸鹽作為底物，由唾液酸醛縮酶通過(guò)酶法合成的。為了降低成本，ManNAc通常由N-乙酰葡萄糖胺的化學(xué)或酶學(xué)差向異構(gòu)化來(lái)制備，N-乙酰葡萄糖胺是比ManNAc更便宜的底物(Lee等人，2004;Maru等人，1998)。雖然有這些改進(jìn)，唾液酸成本仍然相對(duì)較高，這個(gè)成本阻礙了涎化低聚糖生產(chǎn)的較經(jīng)濟(jì)系統(tǒng)的發(fā)展。同時(shí)，像E.coZ/Kl和腦膜炎雙球菌這樣的菌株也能夠產(chǎn)生CMP-Neu5Ac，但他們是病原性的，由于安全原因不能被用于生物技術(shù)過(guò)程。大多數(shù)其它細(xì)菌，包括￡.0^102，沒(méi)有生物合成CMP-Neu5Ac的酶學(xué)機(jī)制，本發(fā)明的目標(biāo)是，遺傳工程操作非病原性菌株，其能夠由內(nèi)源UDP-GlcNAc產(chǎn)生CMP-Neu5Ac。按照本發(fā)明，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)新的微生物系統(tǒng)來(lái)低成本地大規(guī)模生產(chǎn)涎化低聚糖，而不需要外源提供唾液酸。本發(fā)明的代謝工程化的微生物是活的、非病原性的，并能用于大規(guī)模的和工業(yè)培養(yǎng)過(guò)程。它們具有最優(yōu)化的改造的途徑，并去除了無(wú)效代謝循環(huán)，使得可以生物合成活化的CMP-Neu5Ac來(lái)作為體內(nèi)唾液酸供體以形成涎化低聚糖。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)微生物生產(chǎn)涎化低聚糖的方法。特別地，本發(fā)明涉及一種合成帶有一個(gè)或幾個(gè)唾液酸殘基的低聚糖的方法，而不需要向培養(yǎng)基中加入任何外源唾液酸，包括但不限于r神經(jīng)節(jié)苷脂的低聚糖半體，選自GM3(3，涎化乳糖，Neu5Aca-3Gal|3-4Glc)以及包含GM3基序的低聚糖，GD3Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-4GlcGT3(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc)GM2GalNAc(3隱4(Neu5Aca國(guó)3)Gaip-4GlcGM1Gal卩-3GalNAcf3-4(Neu5Aca隱3)Gal(3-4GlcGDlaNeu5Aca-3Gal|3-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Galp-4GlcGTlaNeu5Aca-8Neu5Aca-3Galj3-3Ga脆cP-4(Neu5Aca-3)Galp-4GlcGD2GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal|3-4GlcGT2Ga脆c卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca陽(yáng)8Neu5Aca3)Gal(3陽(yáng)4GlcGDlbGalp-3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGTlbNeu5Aca-3Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal|3-4GlcGQlbNeu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGTlcGal卩陽(yáng)3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGQlcNeu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal(3-4GlcGPlcNeu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGDlaNeu5Aca-3Gal(3-3(Neu5Aca-6)GalNAc卩-4Gal(3-4GlcFucosyl-GMlFuca-2Gaip-3Ga脆c(3-4(Neu5Aca-3)Gal(3-4GIc通過(guò)將以上低聚糖半體與神經(jīng)酰胺反應(yīng)，所有的這些都可延伸至相應(yīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂的生產(chǎn)。其它的涎化糖包括-(6，涎化乳糖，Neu5Aca-6Galp-4Glc)以及包含6，涎化乳糖的低聚糖-SGG六糖(Neu5Aca-3Gal卩-3GalNAcP-3Galct-4Gal卩-4Gal)-涎化四糖(Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc)-五糖LSTD(Neu5Aca-3Gaip誦4GlcNAc卩-3Gaip-4Glc)在一個(gè)特別的方面，本發(fā)明的過(guò)程基于活性攝入一個(gè)外源前體，例如單、雙或三糖，更特別地，選自乳糖、半乳糖、卩-半乳糖苷和a-半乳糖苷例如globotriose(Gala-4Gal卩-4Glc)的外源性前體，細(xì)胞生長(zhǎng)于另外一種碳底物，例如甘油或葡萄糖。"外源性前體"是指，與低聚糖的生物合成途徑相關(guān)的、根據(jù)本發(fā)明被細(xì)胞內(nèi)在化的化合物。同時(shí)提供了代謝工程化的微生物，其可以特別地產(chǎn)生以上涎化低聚糖而沒(méi)有副產(chǎn)物，例如GA1、GA2、GA3、GA4和GA5;以及，為特異性生產(chǎn)GM1，分離自表達(dá)類似GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的脂低聚糖結(jié)構(gòu)的空腸彎曲菌(C;/々wm')菌株的《///基因的應(yīng)用，例如空腸彎曲菌菌株NCTCAccessionNo111168。圖1顯示了以代謝工程化的￡.^//菌株生產(chǎn)涎化乳糖。圖2顯示了以代謝工程化的菌株生產(chǎn)GM1糖時(shí)副產(chǎn)物的產(chǎn)生。圖3顯示GM2糖生物合成中副產(chǎn)物的形成。圖4顯示了UDP-Gal生物合成途徑。圖5顯示了GD2糖生物合成中副產(chǎn)物的形成。圖6顯示了以唾液酸轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)GTla的策略。圖7顯示了從外源乳糖生產(chǎn)LSTD糖(Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNacP-鄧-4Gal)的代謝工程化途徑。圖8顯示了從夕卜源globotriose生產(chǎn)SGG六糖(Neu5Aca-3Gaip-3GalNAc(3-3Gala-4Gal(3-4Gal)的代謝工程化途徑。圖9顯示了生產(chǎn)涎化四糖(Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNac(3-4GlcNAc)的代謝工程化途徑。圖10是一個(gè)以持續(xù)乳糖飼養(yǎng)的DC7菌株的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外部分的TLC分析。第一道乳糖、lacto-iV-neotetraose(LNnT)、lacto-^-neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3，4，5,6，7道加入乳糖后第0，7，23,31，47,54小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第8，9，10，11，12，13道:加入乳糖后第0，7，23，31，47，54小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。涎化乳糖(2)以前已經(jīng)證明如四糖LNnT—樣遷移。圖11顯示了以持續(xù)乳糖詞養(yǎng)的DC7菌株的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的涎化乳糖生產(chǎn)。(A)累積加入的乳糖，(口)細(xì)胞內(nèi)涎化乳糖，(國(guó))細(xì)胞外涎化乳糖，(-)細(xì)菌生長(zhǎng)。圖12是由含有pUC18-cst11和pBBR3-SS質(zhì)粒的NF03菌株的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為3g/L。第1道.乳糖、lacto-//-neotetraose(LNnT)、lacto國(guó)7V"neohexaose(LNnH)禾示準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2和3道加入乳糖后第7和24小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第4禾Q5道加入乳糖后第7和24小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。圖13是DC15菌株(pBS-cgtAII誦nst，pBBR3-SS-wbpP,pSU-cgtB)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為5g/L。第1道孚L糖、lacto-7V-neotetraose(LNnT)、lacto-iV誦neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第7，20，30，44小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第7，20，30，44小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。涎化乳糖(1)和GM1糖(3)分別和LNnT和LNnH—樣遷移。圖14是DC21菌株(pBS-cgtAII-nst，pBBR3-SS-gne,pSU-cgtB)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為5g/L。第1禾卩10道乳糖、lacto畫(huà)7V陽(yáng)neotetraose(LNnT)、lacto-iV-neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3,4，5道加入乳糖后第5，20，28，44小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第5，20，28，44小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。涎化乳糖(1)和GM1糖(3)分別和LNnT和LNnH—樣遷移。圖15是DC22菌株(pBS-cgtIII-cstAII,pBBR3-SS-gne，pSU-cgtB)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為5g/L。第1禾口10道乳糖、lacto-iV-neotetraose(LNnT)、lacto腸iV-neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第7,20，30，44小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第6,7，8，9道加入乳糖后第7，20，30，44小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。涎化乳糖(1)和GM1糖(3)分別和LNnT和LNnH—樣遷移。圖16是ZWT菌株(ZLKA,pBS-nst，pBBR3-SS-gne,pWKS-cgtAII)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為5g/L。第1道乳糖、lacto-TV-neotetraose(LNnT)、lacto-7V-neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3，4道:加入乳糖后第0，7，22'小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第5，6，7道加入乳糖后第0，7，22小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。圖17是ZWU2菌株(ZWU,pBS-nst，pBBR3-SS-gne，pWKS-cgtAII)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為5g/L。第1道孚L糖、lacto-iV-neotetraose(LNnT)、lacto畫(huà)iV-neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第0，7，22，30小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第0,7，22，30小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。圖18顯示了分離自對(duì)照菌株ZWT(A)和ga/f7突變菌株ZWU2(B)的細(xì)胞內(nèi)部分的化合物(2)的ESI質(zhì)譜，峰為對(duì)應(yīng)于GM2糖的m/z835和對(duì)應(yīng)于半乳糖苷化類似物(GA2糖)的m/z794。圖19是分離物的TLC分析，其來(lái)自一升ZWU1菌株培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)部分的分離物。分離以0-1M的NaHC03梯度在Dowexl(HC(V形式)上進(jìn)行。每個(gè)管的體積是10ml。分部A，B，C和D的產(chǎn)量分別是0.5g，0.85g，0.6g和1.2g。圖20是NF17菌株(ZLKA，pBS陽(yáng)cgtA-cstn,pSU-cgtB，pBBR陽(yáng)SS-gne)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物生產(chǎn)的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初濃度為5g/L。第1禾B10道乳糖、lacto-7V-neotetraose(LNnT)、lacto-iV隱neohexaose(LNnH)標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)為2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第7，22，30，46小時(shí)后所提取的細(xì)胞內(nèi)部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第7，22，30，46小時(shí)后所提取的細(xì)胞外部分。遺傳材料來(lái)源披露表l本發(fā)明中所用的基因、質(zhì)粒、大腸桿菌(Esc/zeWcWflco//)菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>發(fā)明詳述在第一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)包括至少一個(gè)唾液酸殘基的低聚糖的方法，以下稱為涎化低聚糖，該方法包括這些步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)微生物，可選地包含外源前體，其中所述微生物能夠生產(chǎn)被內(nèi)部激活的唾液酸，并包含編碼CMP-Neu5Ac合成酶、唾液酸合酶、GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異源基因，其中編碼唾液酸醛縮酶和ManNac激酶(7Va"v4J的內(nèi)源基因被敲除或者滅活。在上述方法中以及基于末點(diǎn)，異源唾液酸轉(zhuǎn)移酶可能選自例如由"W編碼的a-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，a-2，3a-2,8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和a-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(cW///)或a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。異源CMP-Neu5Ac合成酶可能是^"，異源唾液酸合酶可能是"w^，異源GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶可能是^wC。wewzl，"ewS和恥wC基因可分離自在其細(xì)胞被中含有涎化結(jié)構(gòu)的細(xì)菌菌株，例如空腸彎曲菌菌株ATCCAccessionNo.43438."朋r，wa"^，"awX"和"朋五基因是同一操縱子的部分，由DNA結(jié)合蛋白NanR調(diào)控并由Neu5Ac誘導(dǎo)(Kalivoda等人，2003)。因此，本發(fā)明的微生物也可以是"tmXE4r-?；蚬こ袒倪^(guò)度表達(dá)"o/5C4基因的菌株合成CMP-Neu5Ac過(guò)程中，作為中間體的Neu5Ac的生產(chǎn)因此可以誘導(dǎo)唾液酸代謝的途徑，并且產(chǎn)生兩條無(wú)效循環(huán)而減少細(xì)菌的CMP-Neu5Ac生物合成。第一個(gè)無(wú)效循環(huán)來(lái)自唾液酸合酶NeuB活性和唾液酸醛縮酶NanA的結(jié)合。第二個(gè)無(wú)效循環(huán)來(lái)自UDP-GlcNAc2差向異構(gòu)酶NeuC和催化從ManNAc形成UDP-GlcNAc的四個(gè)酶NanKNanENagAGlmM和GlmU的組合作用。根據(jù)這里所建議的方法，Neu5Ac和ManNAc的降解被防止。這可通過(guò)破壞菌株中用于低聚糖生產(chǎn)的和Ma"《基因來(lái)有利地實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，m^r，加"尺和"a"五基因被敲除或滅活。例如，這可通過(guò)除去所有的操縱子來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，以上的微生物編碼一個(gè)可促進(jìn)乳糖攝入的蛋白并缺少代謝乳糖的酶。例如，在E.coli中，優(yōu)選地，細(xì)胞優(yōu)選為iacF+(p半乳糖苷透性酶)，JLmZ+$-半乳糖苷酶)和可選為(a半乳糖苷酶)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含外源前體，選自例如乳糖、半乳糖、P-半乳糖苷酶和a-半乳糖苷酶例如globotriose(Gala-4Gal卩-4Glc)。本發(fā)明也涉及上述微生物以及一個(gè)含有上述微生物和選自乳糖、半乳糖、P-半乳糖苷酶和a半乳糖苷酶例如globotriose(Gala-4Gal卩-4Glc)的細(xì)胞培養(yǎng)基。定義術(shù)語(yǔ)"唾液酸"是指9碳的羧化糖家族的任何成員。最常見(jiàn)的唾液酸家族的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3,5二脫氧-D-甘油畫(huà)D-galactononulopyranos-l-onicacid(通常簡(jiǎn)寫(xiě)為Neu5Ac，Neu5Ac或NANA)。該家族第二個(gè)成員是N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中Neu5Ac的N-乙?；鶊F(tuán)被羥基化。唾液酸家族的第三個(gè)成員是2-酮-3-脫氧-nonulosonicacid(KDN)(Nadano等人，(1986)乂5/o/.C7zew.261:11550-11557;Kanamori等人，《/S/o/.C/2ew.265:21811-21819(1990))。還包括，9-位取代的唾液酸例如9畫(huà)氧-C廣CV酰基-Neu5Ac，像9-氧-乳酰基-Neu5Ac或9-氧-?；?Neu5Ac，9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮-9-脫氧-Neu5Ac。對(duì)唾液酸家族的綜述，可參見(jiàn)，例如，Varki，G^co&'o/ogy2:25-40(1992);爿cz'^:Ozew^/^Afeftafeo/z'smawdFwwc"o"，R.Schauer，Ed.(Springer國(guó)Verlag，NewYork(1992))。在涎化程序中唾液酸的合成和使用在國(guó)際申請(qǐng)WO92/16640中被公開(kāi)，公布日為1992年10月1日。術(shù)語(yǔ)"雙功能空腸彎曲菌(0^/^/o6ac妙CstII唾液酸轉(zhuǎn)移酶"是指同時(shí)表現(xiàn)出a-2,3和a-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在一些實(shí)施方式中，使用了來(lái)自ATCCAccessionNo.43438的CstII唾液酸轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶的"受體底物"或"受體糖"是一個(gè)低聚糖半體，可以作為特定的糖基轉(zhuǎn)移酶的受體。當(dāng)受體底物與相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖供體底物和其它必要的反應(yīng)混合物,成分接觸時(shí)，反應(yīng)混合物被溫育足夠長(zhǎng)的時(shí)間，糖基轉(zhuǎn)移酶把糖殘基從糖供體底物轉(zhuǎn)移到糖受體底物。例如，本發(fā)明的方法中所用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)受體底物為乳糖Gaipi，4-Glc.糖基轉(zhuǎn)移酶的"供體底物"是活化的核苷酸糖。這種活化的糖通常由糖的尿苷、鳥(niǎo)苷和胞啶單磷酸衍生物(分別為UMP，GMP和CMP)組成，或糖的雙磷酸衍生物(分別為UDP，GDP和CDP)，其中單磷酸核苷或雙磷酸核苷作為離去基團(tuán)。例如，本發(fā)明的方法中所用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)供體底物是CMP-Neu5Ac。"培養(yǎng)基"是指可用來(lái)支持本發(fā)明的方法所用的微生物生長(zhǎng)的任何液體、半固體或固體媒介。在一些實(shí)施方式中，微生物為細(xì)菌，例如￡.co//。微生物的培養(yǎng)基是已知的，參見(jiàn)，例如，Sambrook等人和CurrentProtocolsinMolecularBiolopgy，F(xiàn).M.Ausubel等人編，CWra^/Votoc,s，GreenePublishingAssociate,Inc.禾口JohnWiley&Sons,Inc.,合資(1998Supplemental)(Ausubel)。培養(yǎng)基可以是富培養(yǎng)基，例如Luriabroth或terrificbroth，或合成或半合成培養(yǎng)基，例如M9培養(yǎng)基。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含乳糖和唾液酸。-"商業(yè)規(guī)模的"是指在一個(gè)單獨(dú)反應(yīng)中對(duì)誕化糖產(chǎn)物的克數(shù)量級(jí)的生產(chǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，商業(yè)規(guī)模的是指生產(chǎn)大于大約50，75,80，90，或100，125，150，175或200克。術(shù)語(yǔ)"可操作的連接"是指一個(gè)核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子，，信號(hào)序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的排列)和第二個(gè)核酸序列的功能性連接，其中表達(dá)控制序列影響對(duì)應(yīng)于第二個(gè)序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。這里所用的"異源的多核苷酸"或"異源基因"是指對(duì)特定宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)為外源的，或者，如果是同源的，則經(jīng)過(guò)對(duì)其原始形式的修飾。因此，一個(gè)細(xì)胞中的異源唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因包括對(duì)特定宿主細(xì)胞是內(nèi)源、但經(jīng)過(guò)修飾的基因。對(duì)異源序列的修飾可能這樣產(chǎn)生例如以一個(gè)限制性酶處理DNA以產(chǎn)生DNA片段，其能夠被可操作地連接到啟動(dòng)子。一些技術(shù)例如定點(diǎn)誘變對(duì)修飾異源序列也是有用的。"重組表達(dá)框"或簡(jiǎn)單的"表達(dá)框"是一個(gè)由重組或合成而產(chǎn)生的核酸結(jié)構(gòu)，具有核酸元件，其可以影響與這些序列兼容的宿主的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。表達(dá)框至少包括啟動(dòng)子，可選的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。通常，重組表達(dá)框包括一個(gè)待轉(zhuǎn)錄的核酸(例如，一個(gè)編碼所需要的多肽的核酸)和一個(gè)啟動(dòng)子。也可使用另外的必要的或在影響表達(dá)中有用的因子。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、增強(qiáng)子和其它影響基因表達(dá)的核酸序列也可以被包括在表達(dá)框中。當(dāng)多于一個(gè)的異源蛋白在微生物中被表達(dá)時(shí)，編碼蛋白的基因可以在一個(gè)單獨(dú)表達(dá)框中被表達(dá)或在相互兼容的多個(gè)表達(dá)框中被表達(dá)而保持在同一細(xì)胞中。如此處所用，表達(dá)框也包括被插入到宿主微生物染色體中的核酸結(jié)構(gòu)。技術(shù)人員了解，將核酸插入到染色體中可通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)。一個(gè)表達(dá)框可被構(gòu)建來(lái)生產(chǎn)多于一個(gè)蛋白。該蛋白可被一個(gè)單一啟動(dòng)子序列調(diào)控，例如，操縱子?；蛘?，多個(gè)蛋白可被具有單獨(dú)的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的核酸編碼。術(shù)語(yǔ)"分離"是指材料充分地或?qū)嵸|(zhì)上從和生物活性分子相互作用的成分脫離。對(duì)于本發(fā)明的細(xì)胞、糖、核酸和多肽，術(shù)語(yǔ)"分離"是指材料充分地或?qū)嵸|(zhì)上從通常伴隨該材料(如自然狀態(tài)下所發(fā)現(xiàn))的成分脫離。通常，本發(fā)明的分離的糖、低聚糖、蛋白質(zhì)或核酸為至少大約50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%或85%純，通常為至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97°/。，98°/?；?9%純，以銀染的凝膠上的帶亮度所測(cè)或其它測(cè)定純度的方法所測(cè)。純度或同質(zhì)性可通過(guò)很多本領(lǐng)域已知的方法來(lái)指示，例如蛋白或和核酸樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后通過(guò)染色顯色。對(duì)于一些目的，需要高分辨率，使用HPLC或類似的純化方法。對(duì)于低聚糖，例如，涎化產(chǎn)物，純度可用例如薄層色譜、HPLC或質(zhì)譜來(lái)測(cè)定。術(shù)語(yǔ)"同一的"或"同一性"百分率在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的情況下，是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列，當(dāng)通過(guò)下面的一種序列比對(duì)算法或通過(guò)外觀檢查被比較并作最大相關(guān)性排列時(shí)，具有相同的、或者具有特定比例的相同的氨基酸殘基或核苷酸。詞組"實(shí)質(zhì)上相同"，在兩個(gè)核酸或多肽的情況下，是指兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列，當(dāng)通過(guò)下面的一種序列比對(duì)算法或通過(guò)外觀檢査被比較并作最大相關(guān)性排列時(shí)，具有至少60%，優(yōu)選為80%或85%，最優(yōu)選為至少90%，91%，92%，93%，94%，95°/。，96%，97%,98%或99%的核苷酸或氨基酸殘基的同一性。優(yōu)選地，實(shí)質(zhì)上同一性存在于長(zhǎng)度為至少大約50.個(gè)殘基的序列的區(qū)域，更優(yōu)選的在至少大約IOO個(gè)殘基的序列的區(qū)域，最優(yōu)選地，該序列在至少大約150個(gè)殘基上實(shí)質(zhì)上相同。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，序列在編碼區(qū)域的整個(gè)長(zhǎng)度實(shí)質(zhì)上相同。對(duì)于序列比對(duì)，通常一個(gè)序列作為參考序列，測(cè)試序列與之比較。當(dāng)使用一個(gè)序列比對(duì)算法時(shí)，測(cè)試和參考序列被輸入計(jì)算機(jī)，如果必要，亞序列坐標(biāo)被指定，序列算法程序參數(shù)被指定。然后序列比對(duì)算法基于所指定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)序列對(duì)比的最優(yōu)化排列可這樣實(shí)現(xiàn)，通過(guò)例如，Smith&Waterman的本地同源算法^^.Ma仇2:482(1981)，Needleman和Wunsch的同源算法，《/Mo/.￡z'o/.48'.443(1970)，Pearson和Lipman的尋找相似性方法，Proc.iVfl"，JcW.Sc/.U&485:2444(1988)，對(duì)這些算法的計(jì)算機(jī)化應(yīng)用(WisconsinGenetics的軟件包中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison,WI)，或者通過(guò)夕卜觀檢査(大體上可參見(jiàn)，CWe加/Votoco/sM/ecw/ar5油gy,RM.Ausubel等人編,Cw^re/^'GreenePublishingAssociate,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.，合資(1995Supplemental)(Ausubel))。適合于測(cè)定序列同一性百分率和序列相似度的算法的實(shí)例為BLAST和BLAST2.0算法，在Altschul等人(1990)/Mo/.215:403-410和Altschuel等人(1977)Wwc/e/c爿c^及仏25:3389-3402中分別有描述。實(shí)現(xiàn)BLAST分析的軟件可通過(guò)NationalCenterforBiotechnologyInformation(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開(kāi)獲f尋這個(gè)算、法包括，首先通過(guò)鑒定隊(duì)序列中的W長(zhǎng)度的短單詞來(lái)鑒定高分值序列對(duì)(HSP),當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的一個(gè)單詞比對(duì)時(shí)，其可匹配或滿足正值闕值的分值T。T是指臨近單詞分值闕值(Altschul等人，如上)。這些最初的臨近單詞命中作為啟動(dòng)尋找更長(zhǎng)的包含他們的HSP的種子。單詞命中然后在兩個(gè)方向沿著每個(gè)序列被延伸，只要累積比對(duì)分值可被增加。對(duì)于核苷酸序列，累積分值以M參數(shù)(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分值；總是大于0)和N(不匹配殘基的懲罰分值；總是小于0)來(lái)計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，用一個(gè)分值矩陣來(lái)計(jì)算累計(jì)分值。當(dāng)，累積比對(duì)分值從其所達(dá)到的最大值下降數(shù)量X;—個(gè)或多個(gè)負(fù)分值殘基比對(duì)的積累導(dǎo)致累積比對(duì)分值到達(dá)零或零以下；或者，達(dá)到任何一個(gè)序列的末端時(shí)，在每個(gè)方向的單詞命中延伸被中止。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定了比對(duì)的敏感性和速度。BLASTN程序(對(duì)核苷酸序列來(lái)說(shuō))使用一個(gè)單詞長(zhǎng)度(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N二4作為默認(rèn)，以及對(duì)兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用一個(gè)單詞長(zhǎng)度(W)為3，期望值(E)為10以及BLOSUM62分值矩陣作為默認(rèn)(參見(jiàn)Henikoff&Henikoff,iVoc.A^/Jc^/.5W.89:10915(1989))。除了計(jì)算序列同一性百分率，BLAST算法也進(jìn)行連個(gè)序列間相似度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見(jiàn)，例如，Karlin&AltschuliVoc.Ato/.A^d5W.90:5873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一個(gè)相似度測(cè)量為最小總概率(smallestsumprobability)(p(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間機(jī)會(huì)性發(fā)生匹配的概率的指示。例如，在一個(gè)對(duì)比中，當(dāng)測(cè)試核酸相對(duì)于參考核酸的最小總概率小于大約0.1，更優(yōu)選地小于大約0.01，最優(yōu)選地小于大約0.001時(shí)，此核酸被認(rèn)為是與參考序列相似。一個(gè)特定的多核苷酸序列的"保守性修改的變異"是指那些編碼相同的或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的多核苷酸，或者如果該多核苷酸不編碼氨基酸序列，則指實(shí)質(zhì)上相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，很多的功能上相同的核酸編碼任何給定的多肽。例如，密碼子CGU,CGC,CGA，CGG，AGA和AGG都編碼氨基酸精氨酸。因此，在任何精氨酸被一個(gè)密碼子指定的位置，可以將密碼子更改為以上任何相應(yīng)的密碼子而不改變所編碼的多肽。這種核酸變異為"沉默取代"或"沉默變異"，為"保守性修改的變異"的一類。除非另外指出這里描述的每個(gè)編碼一個(gè)多肽的多核苷酸序列也描述了每個(gè)可能的沉默變異。因此，沉默取代是每個(gè)編碼一個(gè)氨基酸的核酸的暗示特征。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG，其通常為蛋氨酸的唯一密碼子)都可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被修改而產(chǎn)生一個(gè)功能上相同的分子。在一些實(shí)施方式中，編碼酶的核苷酸序列在一個(gè)特定()中優(yōu)選地被最優(yōu)化表達(dá)。類似的，在一個(gè)氨基酸序列中，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的"保守性氨基酸取代"，經(jīng)不同的具有高度相似特性的氨基酸取代后，容易被鑒定為與特定的氨基酸序列，或者與編碼一個(gè)氨基酸的特定核酸序列高度類似。任何特定序列的此種保守性取代變異是本發(fā)明的一個(gè)特征。在一個(gè)編碼的序列中改變、加入或敲除一個(gè)單獨(dú)氨基酸或很小比例的氨基酸(通常小于5%，更通常為小于1%)的個(gè)別的取代、敲除或增加為"保守性修改的變異"，其中的改變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸被一個(gè)化學(xué)上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表在本領(lǐng)域是已知的，參見(jiàn)例如，Creighton(1984)/Vo^/ra,W.H.FreemanandCompany。雙功能的唾液酸轉(zhuǎn)移酶如上所注意的那樣，本發(fā)明的方法中使用了雙功能的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。編碼這種酶的核酸分離自空腸彎曲菌，在U.S.專利號(hào)6,699,705和6,503,744和WO/02074942中有揭露?？梢宰鳛殡p功能的唾液酸轉(zhuǎn)移酶來(lái)源的示例性空腸彎曲菌菌株包括OH4384(核酸序列在GenBankaccessionsAR271700和AX934425可以找到)，OH4382,O:IO(核酸序列在GenBankaccessionsAR271701(SEQIDNo1)，AX934427(SEQIDNo2)可以找到)，0:23和0:41(核酸序列在GenbankaccessionsAR271702(SEQIDNo3)禾卩AX934429(SEQIDNo4)可以找到)。應(yīng)該理解，如上所定義的、對(duì)SEQIDNol，2，3，4的保守性修改的變異在這里也可以應(yīng)用。宿主細(xì)胞本發(fā)明的重組細(xì)胞大體上這樣制備:,U作或者獲得一個(gè)編碼特定感興趣的酶的多核苷酸，將該多核苷酸置于啟動(dòng)子和其它合適控制信號(hào)控制的表達(dá)框中，然后將該表達(dá)框引入細(xì)胞。使用很多的方法可使多于一個(gè)的酶在同一個(gè)宿主細(xì)胞中被表達(dá)。例如，一個(gè)單獨(dú)的染色體外載體可包括多個(gè)表達(dá)框，或者多于一個(gè)的兼容性染色體外載體可被用來(lái)保持宿主細(xì)胞中的表達(dá)框。表達(dá)框也可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法被插入宿主細(xì)胞的染色體中。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，也可以將染色體外載體中的表達(dá)框和插入宿主細(xì)胞染色體的表達(dá)框結(jié)合起來(lái)使用。對(duì)宿主細(xì)胞的其它修改，如以下詳細(xì)描述，可被用來(lái)增強(qiáng)所需要的低聚糖的生產(chǎn)。例如，該微生物可以是LacY+，以允許乳糖的活性運(yùn)輸。宿主細(xì)胞不需要是NanT+，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明，唾液酸為內(nèi)在產(chǎn)生。本發(fā)明的重組細(xì)胞大體上為微生物，例如，酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。合適的細(xì)胞的例子包括，例如，固氮細(xì)菌屬(^zoto6w^(例女口棕色固氮菌(Av/"e/awA7)、假單胞菌屬(/wez^fowo"os5^.)、根瘤菌屬(i/^o6/wm^.A歐文氏菌屬(五rvW"/as;.)、桿菌屬(5acz7/ws鏈霉菌屬(5^e/tomyces5^.)、埃希氏菌屬C&c/^r/c/n'asp.)禾口克雷伯氏菌屬(A7e^z'e^)，及眾多其它的。細(xì)胞可以是任何類，包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(51.cewv/w'ae))，假絲酵母屬(Candida)(例如產(chǎn)朊假絲酵母(C.W!7&)、全細(xì)胞近平滑假絲酵母(C.para;^7o^)、克魯斯假絲酵母(C.Arw^/)、多變假絲酵母(Cvem^7/s)、解脂假絲酵母(C./*o/W^)、涎沫假絲酵母(C.z^/"朋W^)、高里假絲酵母(C.gw/〃fmno"^)、白假絲酵母(C.a/6/cara)和土生假絲酵母(C./mm/co/a))，畢赤酵母屬(Pichia)(例如粉狀畢赤酵母(P/an'"wa)和奧默畢赤酵母(Po/zmm'))，球擬酵母屬(Torulopsis)(例如白色球擬酵母(TOwAWfl)、圓球形球擬酵母(7:w/2flen'ca)、木質(zhì)球擬酵母(j;x少/z'"m)、無(wú)名球擬酵母(7:/awato)和多變球擬酵母(J!vera加7/力)，德巴利(氏)酵母屬(Debaiyomyces)(例如亞球形德巴利酵母(D.sw6g/ob(ww力、(Z).ca"to"http:////)、球形德巴利酵母(Z).g/oZjoswj)、漢遜德巴利酵母(D./wme"http://)和日本德巴利酵母(DJ^o"/cw))，接合酵母(Zygosaccharomyces)(例如，魯氏接合酵母(Zrawx/z')和拜氏接合酵母(Z.6m7//)),克魯維酵母屬OGuyveromyces)(例如馬克思克魯維酵母(K/mw^am^))，漢森酵母屬(Hansenula)(例如異常漢森酵母(Ha"o附fl/a)禾H/fja&m')和酒香酵母屬(Brettanomyces)(例如及/aw6/c^和異常酒香酵母(及a"owa/w5))?！?"http://中所用的啟動(dòng)子包括17、trp或lambda啟動(dòng)子。同時(shí)提供了核糖體結(jié)合位點(diǎn)及優(yōu)選地，一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。對(duì)于除了￡."http://的原核細(xì)胞中異源蛋白的表達(dá)，需要一個(gè)能在特定的原核物種中作用的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可由克隆自該物種的基因獲得，或者使用異源啟動(dòng)子。例如，一個(gè)雜交的trp-lac啟動(dòng)子除了在Eco//還在桿菌屬(B"a7/w)中作用。轉(zhuǎn)化除E.coli之外的原核細(xì)胞的方法是已知的。例如，可被用來(lái)轉(zhuǎn)化桿菌屬的方法和表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子在美國(guó)專利號(hào)6,255,706和美國(guó)專利號(hào)6,770,475中有教導(dǎo)。在酵母中，常規(guī)的啟動(dòng)子包括GAL1-10(Johnson和Davies(1984)Mo/.4:1440-1448)、ADH2(Russell等人(1983)所o/.258:2674-2682)、PH05(￡雄(9J(1982)6:675-680)以及MFa(Herskowitz禾口Oshima(1982)7TzeAfo/ecw/ar5/。/o^。/Kost5"acc/2flrra，ces(編者Strathern，Jones和Broach)ColdSpringHarborLab"ColdSpringHarbor,N.Y.pp.181-209)。另外一個(gè)適合應(yīng)用于酵母的啟動(dòng)子是ADH2/GAPDH雜交啟動(dòng)子，如Cousens等人，Ge"e61:265-275(1987)所描述。對(duì)于絲狀真菌，例如，曲霉真菌(Aspergillus)的菌株(McKnight等人，美國(guó)專利號(hào)4,935,349)，可用的啟動(dòng)子的例子包括，來(lái)自構(gòu)巢曲霉"w^g///^"/^/a似)糖分解基因的啟動(dòng)子，例如ADH3啟動(dòng)子(McKnight等人，4:2093-2099(1985))和/p/A啟動(dòng)子。合適的終止子的例子為ADH3終止子(McKnight等人)。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸被置于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制下，其是這樣的啟動(dòng)子指導(dǎo)基因的表達(dá)，該基因表達(dá)的水平可被在環(huán)境的或發(fā)展的因素例如溫度、pH、無(wú)氧或有氧條件、光、轉(zhuǎn)錄因子和化學(xué)物所改變。這樣的啟動(dòng)子這里被稱為"可誘導(dǎo)"啟動(dòng)子，其可以允許對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶或核苷糖合成中有關(guān)的酶的表達(dá)時(shí)間進(jìn)行控制。對(duì)于￡."http://和其它細(xì)菌宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。這些包括，例如，/^啟動(dòng)子。一個(gè)特別優(yōu)選的在原核細(xì)胞中表達(dá)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是雙啟動(dòng)子，包括一個(gè)/M啟動(dòng)子成分，連接到取自編碼半乳糖代謝中有關(guān)酶的基因的啟動(dòng)子成分(例如，來(lái)自UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶基因(g"/E)的啟動(dòng)子)。對(duì)于其它有機(jī)體的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在本領(lǐng)域技術(shù)人中也是已知的。這些包括，例如，樹(shù)膠醛糖啟動(dòng)子、lazZ啟動(dòng)子、金屬硫因啟動(dòng)子和熱擊啟動(dòng)子，以及其它很多。多核苷酸結(jié)構(gòu)的構(gòu)建大體上需要使用可以在細(xì)菌中復(fù)制的載體。商業(yè)上可獲得很多從細(xì)菌中分離的質(zhì)粒的試劑盒。對(duì)于其正確的應(yīng)用，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明即可(參見(jiàn)，例如，EasyPrepJ，F(xiàn)lexiPrepJ二者均來(lái)自PharmaciaBiotech;StrataCleanJ，來(lái)自Stratagene;以及QIAexpressExpressionSystem,Qiagen)。分離和純化的質(zhì)粒可被進(jìn)一步操作以生產(chǎn)其它的質(zhì)粒，并用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。也可以在鏈霉菌屬和桿菌屬中克隆。經(jīng)常在表達(dá)載體中插入選擇性標(biāo)記以構(gòu)建本發(fā)明的細(xì)胞。這些基因編碼一個(gè)基因產(chǎn)物，例如一個(gè)蛋白，在選擇性培養(yǎng)基上對(duì)于經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生存或生長(zhǎng)是必須的。沒(méi)有經(jīng)包含選擇性基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在該培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。典型的選擇性基因編碼對(duì)抗生素或其它毒素產(chǎn)生抗性的蛋白，例如安比西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素?；蛘?，選擇性標(biāo)記可能編碼補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型或提供培養(yǎng)基復(fù)合物中沒(méi)有的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白，例如為細(xì)菌編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。通常，載體含有一個(gè)選擇性標(biāo)記，可在例如E.co/z'或其它細(xì)胞中作用，其中該載體在被引入靶細(xì)胞前被復(fù)制。一些選擇性標(biāo)記對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是己知的，在例如之前Sambmok等人中有描述。細(xì)菌細(xì)胞中優(yōu)選使用的選擇性標(biāo)記是卡那霉素抗性標(biāo)記(Vieira和Messing，Ge恥19:259(1982))。使用卡那霉素選擇比例如安比西林優(yōu)越，因?yàn)榘脖任髁衷谂囵B(yǎng)基中被P，內(nèi)酰胺酶迅速降解，因此除去了選擇壓力從而允許培養(yǎng)物中不含載體的細(xì)胞過(guò)生長(zhǎng)。含有以上所列的一個(gè)或多個(gè)所列成分的合適載體的構(gòu)建可使用如上所列參考文獻(xiàn)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)的連接方法。分離的質(zhì)粒或DNA片段被切割，加尾并以需要的形式重連，從而產(chǎn)生需要的質(zhì)粒。為了確定所構(gòu)建的質(zhì)粒中的正確的序列，該質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如限制性內(nèi)切酶消化和/或根據(jù)異源方法來(lái)測(cè)序來(lái)分析。達(dá)到這些目的的分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。很多的適合重組核酸構(gòu)建的克隆和體外擴(kuò)增方法對(duì)技術(shù)人員是已知的。很多的適合構(gòu)建本發(fā)明的重組細(xì)胞的普通載體在本領(lǐng)域是已知的。對(duì)于細(xì)菌中的克隆，普通的載體包括源自pBR322的載體例如pBLUESCRIPTTM,以及源自X噬菌體的載體。在酵母中，載體包括酵母整合質(zhì)粒(例如Yip5)和酵母復(fù)制質(zhì)粒(YRp系列質(zhì)粒)和pGPD-2。將表達(dá)載體導(dǎo)入所選宿主細(xì)胞的方法不是特別重要，這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，表達(dá)載體可通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入原核細(xì)胞，包括可通過(guò)磷酸鈣處理或電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入真核細(xì)胞。其它的轉(zhuǎn)化方法也是適合的。優(yōu)選的實(shí)施方式3'涎化乳糖的生產(chǎn)3'涎化乳糖的生產(chǎn)可通過(guò)如上定義的代謝工程化的菌株實(shí)現(xiàn)，該菌株表達(dá)編碼包含a-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶，例如使用乳糖作為受體的a-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶或雙功能的a-2,3和a-2，8唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因。如所指出的，這個(gè)菌株不含唾液酸醛縮酶，ManNAc激酶和p-半乳糖苷酶活性，并表達(dá)編碼CMP-Neu5Ac合成酶、一種唾液酸合酶、一個(gè)GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶的異源基因。對(duì)于涎化乳糖的大規(guī)模生產(chǎn)，這個(gè)菌株可在便宜的底物例如葡萄糖或甘油上以高細(xì)胞密度培養(yǎng)，并以乳糖飼養(yǎng)，乳糖會(huì)被乳糖透性酶內(nèi)在化并被重組唾液酸轉(zhuǎn)移酶使用從如圖1所示的UDP-GlcNAc中外源產(chǎn)生的CMP-Neu5Ac所涎化。6'涎化乳糖的生產(chǎn)這里，唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因是一個(gè)編碼a-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因，例如來(lái)自美人魚(yú)發(fā)光桿菌(p/zo/o6""en.Mwdawwe/a)(Yamamoto等人，1998)的基因，其導(dǎo)致6，涎化乳糖(Neu5Aca-6Gal(3-4Glc)。GD3和GT3糖的生產(chǎn)GD3(Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal卩-4GlcCer)是在高等脊椎動(dòng)物包括人中大多數(shù)正常組織所發(fā)現(xiàn)的少數(shù)神經(jīng)節(jié)苷脂。已經(jīng)表明在一些病理情況例如癌癥(神經(jīng)膠質(zhì)瘤，黑素瘤)中GD3水平升高，在腫瘤形成中具有重要作用(Zeng等人，C""cw7m，60:6670(2000)。因此大規(guī)模低成本的生產(chǎn)GD3具有重要意義。為此目的，以上所述的異源唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因被選自一個(gè)編碼雙功能a-2，3和ct-2,8唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因，例如來(lái)自空腸彎曲菌(02mpy/okicferGilbert等人，2002，保藏于ATCCAccessionNo.43438)的基因，并導(dǎo)致GD3和GT3糖的生產(chǎn)。雙功能唾液酸轉(zhuǎn)移酶多肽催化來(lái)自經(jīng)內(nèi)在產(chǎn)生的活化唾液酸分子的sialyl半體轉(zhuǎn)移至Neu5Aca-3Gal|3-4Glc(GM3)以形成Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal(3-4Glc。這個(gè)反應(yīng)可進(jìn)一步延伸而生成GT3，其為C系列神經(jīng)節(jié)苷脂的前體，是成年魚(yú)類腦中的主要成分，在高等脊椎動(dòng)物胚胎腦組織中被發(fā)現(xiàn)很豐富(Letinic等人A^^Ywc^7ce，86，1(1998))。他們也被發(fā)現(xiàn)于各種神經(jīng)外胚層腫瘤，因此具有潛在的可以很容易獲取GT3低聚糖的很大的興趣。為了這個(gè)目的，本發(fā)明這里進(jìn)一步包括培養(yǎng)該微生物從而雙功能的空腸彎曲菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶多肽催化來(lái)自經(jīng)內(nèi)在產(chǎn)生的活化唾液酸分子的sialyl半體轉(zhuǎn)移至Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal|3-4Glc(GD3)以形成Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal(3-4Glc(GT3)。GM1糖的生產(chǎn)如圖2所示，以上所示的生產(chǎn)涎化乳糖的系統(tǒng)(同時(shí)參見(jiàn)圖l)，通過(guò)表達(dá)另外的j3-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶和|3-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，可被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的碳水化合物部分的生產(chǎn)。這里，本發(fā)明的微生物如圖1所示并進(jìn)一步包含編碼P-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶和卩-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的異源序列。在這個(gè)實(shí)施方式中，p-l,4GalNAc轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移一個(gè)UDP-GalNAc殘基到涎化乳糖(GM3)以形成GM2，卩-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移一個(gè)半乳糖基到GM2以形成GM1.菌株例如K12可能不能自然產(chǎn)生UDP-GalNAc。這種情況下，本發(fā)明的菌株可由一個(gè)編碼UDP-GalNAc4差向異構(gòu)酶的基因補(bǔ)充，，例如來(lái)自綠膿桿菌(戶aen/g/raosa)的w6;尸基因(Creuzenet等人2000)和來(lái)自C."/的基因(Bernatchez等人2005)。GM1糖具有一個(gè)末端非還原半乳糖，這個(gè)結(jié)構(gòu)可被用來(lái)作為a-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體以產(chǎn)生GDla糖。GDla糖除了涎化乳糖具有同樣的末端非還原二糖結(jié)構(gòu)，可被用于P-l,4GalNAc轉(zhuǎn)移酶的受體以形成七糖中間體，可被半乳糖苷化為八糖，以GA1代表(Gaip-3GalNAcp匿4(Neu5Aca-3)Gal卩-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Galp畫(huà)4Glc如圖2.GDla和其較大的衍生物的形成減少了GM1糖的產(chǎn)量，本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方式為減少或消除這些副產(chǎn)物的形成。為此目的，我們發(fā)現(xiàn)一種不能用GM1作為受體的a-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶。C."/NCTC111168菌株表達(dá)類似GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的脂低聚糖結(jié)構(gòu)(Linton等人2000)。這個(gè)脂低聚糖外核心結(jié)構(gòu)被Linton等人(2000)稱為外核心VI。Cm'NCTC111168菌株含有一個(gè)叫做^〃//的基因，其編碼的一個(gè)蛋白，與來(lái)自其它C."/菌株的表達(dá)GDla類似物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶(CstII)表現(xiàn)出53%的序列同一性(Gilbert等人2002)。CstIII蛋白的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性使得可以將GM1糖作為唯一低聚糖產(chǎn)物有利地生產(chǎn)。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明考慮到上述方法來(lái)特異性生產(chǎn)GM1，其中異源唾液酸轉(zhuǎn)移酶為"http:////基因編碼的a-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，分離自表達(dá)類似GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的脂低聚糖結(jié)構(gòu)的C.m'菌株，例如C.m'NCTCAccessionNo.111168菌株。GM2糖的生產(chǎn)以上所述的生產(chǎn)涎化乳糖的系統(tǒng)，通過(guò)表達(dá)另外的(3-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶和UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶，可被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂GM2的碳水化合物部分的生產(chǎn)。以前曾經(jīng)報(bào)道，來(lái)自的CgtAP-l,4GalNAc轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出卩-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶副活性，其導(dǎo)致GM2糖類似物的生產(chǎn)，在圖3中指明為GA2(Antoine等人2003)。GA2糖含有一個(gè)末端非還原含乳糖，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個(gè)半乳糖可以作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體以產(chǎn)生雙涎化的四糖(GA5,圖3)，其可被非?；钴S的CgtAIip-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化成五糖GA4或GA3(圖3)。副產(chǎn)物GA2，GA3，GA4和GA5降低GM2糖的產(chǎn)量并使其純化更難。因此除去這些副產(chǎn)物的形成在本發(fā)明的范圍內(nèi)。P-l,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶副活性可通過(guò)使用不能生產(chǎn)UDP-Gal的突變體有利地抑制。如圖4所示，這樣的突變體可通過(guò)打亂以下三個(gè)基因中的一個(gè)來(lái)獲得編碼UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶的ga/五基因，編碼UDP-Glc焦磷酸化酶的g"/t/基因，以及編碼葡萄糖磷酸變位酶的p^2基因。因此，本發(fā)明針對(duì)如上所定義的生產(chǎn)涎化低聚糖的方法，可延伸至生產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂GalNAc卩-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc(GM2)的碳水化合物部分，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼(3-l,4GalNAc轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自其它C"/O:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgM7/基因，和一個(gè)UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶的異源序列，其中該微生物的以下三個(gè)基因中至少一個(gè)被敲除或滅活，以打亂UDP-Gal的外源生產(chǎn)編碼UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶的g"/五基因，編碼UDP-Glc焦磷酸化酶的ga/t/基因，以及編碼葡萄糖磷酸變位酶的pgm基因，所述打亂可避免副產(chǎn)物禮物GA2，GA3，GA4和GA5的產(chǎn)生。GD2糖的生產(chǎn)通過(guò)表達(dá)使用GD3糖作為受體的另外的編碼UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶和|3-1，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶的異源基因，生產(chǎn)GD3糖的系統(tǒng)可被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的碳水化合物部分的生產(chǎn)，例如來(lái)自Cm'O:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgtAII蛋白。在這個(gè)系統(tǒng)中，CstII唾液酸轉(zhuǎn)移酶和CgtAIIGalNAc轉(zhuǎn)移酶共同競(jìng)爭(zhēng)使用涎化乳糖作為受體(圖5)。為了促進(jìn)GD2糖的生產(chǎn)，我們?cè)谂囵B(yǎng)的第一階段減少了(^"http://的表達(dá)(以使涎化乳糖大部分被轉(zhuǎn)化為GD3糖)，然后在第二階段增加cgMJ/的表達(dá)以把GD3轉(zhuǎn)化成GD2.這可以通過(guò)將cg"http://基因置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，其獨(dú)立于控制其它基因的啟動(dòng)子。CgtAI1蛋白的(3-l，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶副活性會(huì)導(dǎo)致半乳糖苷化的類似物，例如如圖5所代表的化合物GA2，:GA5和GA6的產(chǎn)生。雖然對(duì)這些低聚糖可能也有興趣，但是，利用如上所述的不能為生產(chǎn)GM2而產(chǎn)生UDP-Gal的突變菌株來(lái)防止這些副產(chǎn)物的形成，從而特異性的生產(chǎn)GD2，也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。GDlb，GTlc，GTlb,GQlb，GQlc和GPlc糖的生產(chǎn)GDlb糖(Gaip-3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal卩畫(huà)4Glc)和GTlc糖(Gaip-3GalNAcP畫(huà)4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal(3-4Glc)的生產(chǎn)可通過(guò)組合如上所述的GD2糖生產(chǎn)系統(tǒng)中的基因以及另外的表達(dá)P-3Gal轉(zhuǎn)移酶的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。這里，微生物進(jìn)一步包含異源序列，其編碼UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶，以GD3和GT3糖為受體的卩-1，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自Cm'0:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgtAII蛋白，以及P-l,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自0>"/0:2菌株NCTCAccessionNo11168的cg詔基因。生產(chǎn)GDlb和GTlc的系統(tǒng)可通過(guò)表達(dá)編碼能夠以GDlb和GTlc作受體的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因而延伸至GTlb，GQlc,GQlb和GPlc的生產(chǎn)。GDla和GTla糖的生產(chǎn).圖6顯示了GTla糖的生產(chǎn)策略，依賴于為雙功能唾液酸轉(zhuǎn)移酶c^7/基因與編碼p-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶而不以GD3糖作受體的eg"基因的共表達(dá)，末端產(chǎn)物為GD3，GDla和GTla糖。這里，本發(fā)明涉及按以上所述的生產(chǎn)涎化低聚糖的方法，其應(yīng)用與生產(chǎn)特異性的Neu5Aca-3Gal卩-3Ga隨c卩-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc(GDla)和Neu5Aca-8Neu5Aca誦3Gal卩-3Ga脆cp陽(yáng)4(Neu5Aca陽(yáng)3)Gaip-4Glc(GTla)，其中該微生物包含異源序列，其編碼雙功能a-2,3和a-2，8唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自Cm'菌株ATCCAccessionNo43438的cW基因，卩-1,4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自O(shè):36菌株ATCCAccessionNo43456，不以003糖作受體的0^"http://基因，以及P_l，3Gal轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自O(shè):2菌株NCTCAccessionNo111'68的基因。LSTD(涎化-LNiiT)和涎化-路易斯X(sialyl-iewisX)低聚糖的生產(chǎn)已經(jīng)被描述，四糖LNnt(Galp-4GlcNAcP-3Gal(3-4Glc)可通過(guò)代謝工程化的表達(dá)分別編碼P-l，3GlcNAc轉(zhuǎn)移酶和(3-l,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的/g"和/g詔基因的菌株由外源乳糖產(chǎn)生(Priem等人，2002)。通過(guò)在如圖7所示的nanK-，nanA-菌株中表達(dá)另外的"Wh和wew萬(wàn)C4基因，以上生產(chǎn)涎化低聚糖的系統(tǒng)可被延伸至生產(chǎn)五糖LSTD(Neu5Acct-3Gaip-4GlcNAc卩-3Gaip-4Glc)。合成LSTD的系統(tǒng)可與被描述(Dumon等人2004)來(lái)生產(chǎn)在其非還原末端攜帶涎化路易斯X基序(Neu5Aca-3Gaip-4(Fuca-3)GlcNAcp)的低聚糖鹽藻糖基化系統(tǒng)。由此，該微生物進(jìn)一步包含異源基因，其編碼a-l，3-fiicosyl轉(zhuǎn)移酶，例如幽門(mén)螺桿菌(He/fcc^acto";^/on'/w")(例如SEQIDNo18-來(lái)自幽門(mén)螺桿菌ATCCAccessionNo26695)以及/^B(例如SEQIDNo19-來(lái)自幽門(mén)螺桿菌ATCCAccessionNo26695)。涎化半乳糖基紅細(xì)胞糖苷(SGG)六糖的生產(chǎn)涎化半乳糖基紅細(xì)胞糖苷(Neu5Aca-3Gaip-3GalNAc卩-3Gala-4Gal卩-4Glc)被發(fā)現(xiàn)為尿路致病性大腸桿菌的優(yōu)選結(jié)合受體(Stapleton等人1998)，其潛在可被用為抗感染制劑。最近有描述利用外源加入的唾液酸從globotriose生產(chǎn)SGG六糖(我們的美國(guó)專利申請(qǐng)US60/711,406，利用代謝工程化的微生物高效生產(chǎn)globosides糖)。SGG六糖的生產(chǎn)可由表達(dá)(i)編碼GalNAc轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的流感嗜血桿菌(//^mo;M^/"yZwewzae(rd菌株)的lgtD基因；(ii)似/唾液酸轉(zhuǎn)移酶(a-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自腦膜炎雙球菌(iV.wem'"g/"6fcMC58菌株，GenBankaccession號(hào)60660-SEQIDNo5，protein—id為AAC44541.1國(guó)SEQIDNo6)，其催化sialyl半體從活化的唾液酸分子轉(zhuǎn)移到globopentaose以形成涎化半乳糖基紅細(xì)胞糖苷(SGG)六糖；(iii)CMPNeu5Ac合酶的基因和(iv)UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶的H^尸基因的加"J-weM-菌株來(lái)實(shí)現(xiàn)。這個(gè)系統(tǒng)可被修改為不加入唾液酸而工作，通過(guò)使用脂"尺-wa^4-we"-菌株并另外表達(dá)"e"》C基因，如圖8所示。在一些實(shí)施方式中，該微生物被操作以加強(qiáng)受體糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞。這里，當(dāng)乳糖或globotriose為受體糖時(shí)，可以使用表達(dá)或過(guò)度表達(dá)LacY透性酶的￡."http://細(xì)胞。因此本發(fā)明包含以上的方法，其中微生物在一個(gè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其含有g(shù)lobotriose,并且為Zacr+，A/e/J-，wawr+，wa"J-,w""ii:-，包含異源基因，a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和UGP-GlcNAcC4差向異構(gòu)酶的基因，以及"e"BC基因。'本發(fā)明也提供了一些方法，其中第一個(gè)微生物被用于制備紅細(xì)胞糖苷脂。如上面提到的，培養(yǎng)基可能包括乳糖或globotriose,但是不需要在配置中提供唾液酸，因?yàn)樗粌?nèi)在地產(chǎn)生。當(dāng)使用globotriose時(shí)，本發(fā)明也考慮到一套兩個(gè)不同的微生物，所述第一個(gè)微生物在一個(gè)含有乳糖，并且為丄ac;r+，丄azZ-,Me"-，含有異源/^C基因以產(chǎn)生globotriose(a-l,4Gal轉(zhuǎn)移酶可被腦膜炎雙球菌，淋球菌(JV.gwwT^^e)，流感嗜血桿菌的丄gfC基因編碼，更特別的，腦膜炎雙球菌Ll(126E)GenBankaccession號(hào)U65788漏SEQIDNo7，protein—id為AAB48385-SEQIDNo8)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；第二個(gè)微生物在含有g(shù)lobotriose，并且為￡ocr+，MeL4-謂r+，畫(huà)^-,顏K畫(huà)，包含異源的/g/A涵/7尸和"W基因以及"e"SC基因的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。/g①基因編碼卩-3GalNAc轉(zhuǎn)移酶以催化半乳糖半體從UDP-Gal到globotetraose的轉(zhuǎn)移以形成globopentaose(p-3Gal轉(zhuǎn)移酶活性)。例如，可以使用來(lái)自流感嗜血桿菌HI1578的/g^)基因，GenBankaccession號(hào)U32832-SEQIDNo9，protein—id=AAC23227-SEQIDNo10。涎化半乳糖的生產(chǎn)近來(lái)已經(jīng)證明，缺少半乳糖激酶活性的^z/《突變可以使用外源半乳糖作為受體來(lái)合成具有耒端還原半乳糖的低聚糖(Dmnon等人2005)。如上所述的生產(chǎn)涎化低聚糖的方法可被有利地用于生產(chǎn)二糖涎化半乳糖(Neu5Aca-3Gal)，通過(guò)在ga/《-,加"J-和nanK-(或mwii^4r-)，表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和"w》C4基因的含有半乳糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物。具有末端還原半乳糖的涎化低聚糖的生產(chǎn)合成涎化半乳糖的方法可適用于上面提到的所有涎化結(jié)構(gòu)的類^l物的生產(chǎn)。使用半乳糖而不是乳糖作為受體會(huì)導(dǎo)致缺少末端葡萄糖殘基的類似物的形成。具有末端乳糖或半乳糖帶有潛在化學(xué)官能團(tuán)的涎化低聚糖的生產(chǎn)糖透性酶的廣特異性可用來(lái)內(nèi)在化帶有潛在化學(xué)官能團(tuán)的乳糖或半乳糖，以產(chǎn)生可結(jié)合的低聚糖。這個(gè)策略己被成功應(yīng)用于帶有烯丙基或丙炔基糖苷的GM2和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂的低聚糖部分的合成(Fort等人2005)。炔官能團(tuán)使得在水溶液中可能加入疊氮，烯官能團(tuán)可被轉(zhuǎn)化為醛以通過(guò)還原性胺化連接到蛋白，或者通過(guò)加入半胱胺可被轉(zhuǎn)化成多功能胺。也可以使用其它的化學(xué)官能團(tuán)例如疊氮化物或胺。所有這些乳糖或半乳糖衍生物可被有利地用于生產(chǎn)上面提到的所有涎化結(jié)構(gòu)的可結(jié)合類似物。在還原末端具有殼質(zhì)低聚糖的涎化低聚糖的生產(chǎn)已經(jīng)表明，過(guò)度表達(dá)莖瘤固氮根瘤菌"zo^n'zoZn'wmcaw/^o^ra)的殼質(zhì)低聚糖合酶的nodC基因的Eco/z'菌株，當(dāng)以高細(xì)胞密度培養(yǎng)時(shí)，可以產(chǎn)生多于2g/L的殼質(zhì)戊糖(Samain等人1997)。一旦在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生，殼質(zhì)戊糖可作為糖基轉(zhuǎn)移酶的受體而識(shí)別末端非還原GlcNAc殘基。通過(guò)共表達(dá)莖瘤固氮根瘤菌"^/C基因和(3-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的腦膜炎雙球菌/gW基因(Bettkr等人1999)，這個(gè)策略被用于六糖Gal(3-4[GlcNAcP-4]4GlcNAc的合成。這個(gè)六糖的末端N-乙酰乳糖胺基序?yàn)橥僖核徂D(zhuǎn)移酶的受體。涎化七糖Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAcP-4]4GlcNAc因此可在共表達(dá)"ocC,/gW,"W和wei^C4的突變菌株上被有利地生產(chǎn)。近期發(fā)展的一個(gè)減小其大小的策略為，在活體細(xì)菌中，殼質(zhì)戊糖被NodC產(chǎn)生時(shí)即刻以殼質(zhì)酶酶法催化(C(ttaz&Samain，2005)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法范圍內(nèi)可以防止較大的殼質(zhì)戊糖引物的形成，例如，其可以通過(guò)使用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的殼質(zhì)酶基因顯著增加靶結(jié)構(gòu)的分子重量。如圖9所示，本發(fā)明的方法能夠以共表達(dá)m^C,c/zLi/g汲"W和"ew丑C4基因的"a","。W-菌-株形成四糖Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNAcp-4GlcNAc。因此，本發(fā)明涉及以上方法，或者沒(méi)有向培養(yǎng)基中加入外源的方法，來(lái)生產(chǎn)末端具有殼質(zhì)低聚糖結(jié)構(gòu)的涎化低聚糖，例如涎化七糖Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAc(3-4]4GlcNAc，其中唾液酸轉(zhuǎn)移酶是a-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如腦膜炎雙球菌的"W基因；該微生物進(jìn)一步包含殼質(zhì)低聚糖合酶例如莖瘤固氮根瘤菌"odC基因和(3-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因例如腦膜炎雙球菌的/gW基因。它可以被延伸至涎化四糖Neu5Aca-3Gal(3-4GlcNAcP-4GlcNAc的生產(chǎn)，其中微生物進(jìn)一步包含編碼殼質(zhì)酶，例如C/2"基因的異源序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明針對(duì)如上所定義的微生物以及細(xì)胞培養(yǎng)基，包含選自乳糖，半乳糖，P-半乳糖苷以及(i-半乳糖苷例如globotriose(Gala-4Gal(3-4Glc)的外源前體以及所述微生物。實(shí)施例1:朋"v4，"朋JL4和"朋虹7^突變株的構(gòu)建所有的突變株構(gòu)建自DC菌株(Dumon等人2005)，其為一個(gè)攜帶/^Z和突變的DH1菌株衍生體。因?yàn)樗械腄H1菌株衍生體均為w"突變，他們被攜帶功能性w"基因和卡那霉素抗性的低拷貝質(zhì)粒pEXT22轉(zhuǎn)化，為包含DNA重組的基因失活程序恢復(fù)為瞬間RecA+表型。一旦該基因被破壞，可通過(guò)在沒(méi)有卡那霉素下培養(yǎng)細(xì)胞及篩選RecA-表型來(lái)恢復(fù)質(zhì)粒。AZL菌株通過(guò)使用自殺質(zhì)粒pMAK705(Hamilton等人1989)滅活"a"^基因而構(gòu)建子DC菌株，如以前所描述(Priem等人，2002)。為了從DC菌株構(gòu)建ZLKA，使用以前描述的使用PCR引物來(lái)提供靶序列同、竭性的一步步驟(Datsenko&Wanner,2000)，"a"/^K4基因通過(guò)除去染色體DNA中一個(gè)3.339kb的片段被破壞。上游引物的序列為5'GCAATTATTGATTCGGCGGATGGTTTGCCGATGGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQIDNo11);下游引物的序列為5'CTCGTCACCCTGCCCGGCGCGCGTGAAAATAGTTTTCGCATATGAATATCCTCCTTAG(SEQIDNo12).使用同樣的程序來(lái)滅活A(yù)ZL菌株中的mm尺基因以獲取AZK菌株，只是所敲除的片段大小為0.537kb，上有引物的序列為GCTGCTTC(SEQIDNo13)。實(shí)施例2:"^BC4基因的克隆一個(gè)包含"ez^C4基因序列的2.995(kb)的DNA片段使用空腸彎曲菌菌株ATCC43438作模板經(jīng)PCR擴(kuò)增。在左側(cè)引物加入一個(gè)ATpn/位點(diǎn)5'GGTACCTAAGGAGGAAAATAAATGAAAGAAATAAAAATACAA(SEQIDNO14)在右側(cè)弓I物加入一個(gè)^o/位點(diǎn)5'CTCGAGTTAAGTCTCTAATCGATTGTTTTCCAATG(SEQIDNo15)。擴(kuò)增片段首先被克隆進(jìn)pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen)然后亞克隆進(jìn)入pBBRl-MCS3載體的《p"/和J^o/位點(diǎn)以形成pBBR3-SS。實(shí)施例3:由代謝工程化的菌株生產(chǎn)涎化乳糖涎化乳糖的生產(chǎn)以不同的包含ct-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的腦膜炎雙球菌"W基因的突變菌株和包含空腸彎曲菌的分別編碼N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸-差向異構(gòu)酶，唾液酸合酶和CMP-5Neu5Ac合成酶的"ewC，"ew5和we"基因的pBBR-3-SS質(zhì)粒進(jìn)行研究。涎化乳糖生產(chǎn)以細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外片段的比色定量來(lái)估計(jì)(表2)。結(jié)果表明，加"J突變的AW1和DC6而在在唾液酸操縱子沒(méi)有突變的菌株，以相似的產(chǎn)率產(chǎn)生少量的涎化乳糖。兩個(gè)攜帶naw夂和加W突變的突變株AZK1和DC7則都產(chǎn)生四倍數(shù)量的涎化乳糖。以不含乳糖溫育的DC7對(duì)照培養(yǎng)物中檢測(cè)不到唾液酸，表明高水平的總唾液酸對(duì)應(yīng)于涎化乳糖的形成。.涎化乳糖生產(chǎn)的改進(jìn)通過(guò)TLC分析得到確定，其表明對(duì)應(yīng)于涎化乳糖的帶，在DC7和AZK1提取物中比在DC6和AW1提取物中更深。表2基因工程化的生產(chǎn)涎化乳糖的菌株的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外部分的唾液酸定量比色，<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>總唾液酸通過(guò)二苯胺方法(Werner&Odin，1952)來(lái)定量。除了不加乳糖的DC7對(duì)照培養(yǎng)，加入濃度為7.5g/L的乳糖后，溫育培養(yǎng)物30小時(shí)。實(shí)施例4:以持續(xù)乳糖飼養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)涎化乳糖通過(guò)將培養(yǎng)時(shí)間延伸到71小時(shí)，產(chǎn)量被提高。在加料分批培養(yǎng)期開(kāi)始，以2g/L的濃度加入乳糖。最初以0.52g/L/h的輸入率以高甘油飼養(yǎng)率持續(xù)加入5小時(shí)。乳糖輸入率然后降至0.3g/L/h直至低甘油飼養(yǎng)的第二階段的末期。TLC分析表明涎化乳糖(化合物2，圖10)被持續(xù)產(chǎn)生，直至培養(yǎng)末期，而且涎化乳糖生產(chǎn)不受乳糖(化合物1)供給的限制，其在細(xì)胞—內(nèi)部分的培養(yǎng)過(guò)程中均可以很小數(shù)量被檢測(cè)到。唾液酸的定量比色表明涎化乳糖主要在培養(yǎng)物第一部分的細(xì)胞內(nèi)部分積聚。細(xì)胞內(nèi)涎化乳糖濃度然后上升穩(wěn)定至10g/L左右，另外產(chǎn)生的誕化乳糖被分泌到細(xì)胞外介質(zhì)，其積聚至最終濃度為15.5g/L(圖11)。實(shí)施例5:涎化乳糖的純化從1升來(lái)自如實(shí)施例4中所描述的DC7培養(yǎng)物中純化涎化乳糖。在培養(yǎng)末期，通過(guò)離心把細(xì)胞外部分從細(xì)胞分離出來(lái)。通過(guò)加入強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(AmberliteIR120H"形式)使細(xì)胞外部分的pH值降低至3.00。這導(dǎo)致被離心所除去的蛋白的沉積。通過(guò)加入弱陰離子交換樹(shù)脂(Dowex66自由基形式)，上清的pH值被調(diào)整為6.0，一半上清被加入至ijDowexl(HC03形式)柱(5x20cm)。涎化乳糖被Dowex1樹(shù)脂保留，以蒸餾水洗滌后，以0-500mM連續(xù)NaHC03梯度洗脫。對(duì)另外一半上清重復(fù)同樣的程序。收集含有涎化乳糖的洗脫部，通過(guò)AmberliteIR120(K形式)處理除去NaHC03直至pH為3.0。以NaOH調(diào)整pH值至6.0，并凍干涎化乳糖。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)部分的純化，以熱處理(UKTC，45分鐘)浸透細(xì)胞，并以最初培養(yǎng)基相同的體積重懸。低聚糖自由擴(kuò)散出細(xì)胞，離心后在上清中被恢復(fù)。涎化乳糖的純化以和細(xì)胞外部分相同的程序進(jìn)行。從一升DC7的培養(yǎng)物，純化的涎化乳糖的產(chǎn)量為來(lái)自細(xì)胞外部分為9克，來(lái)自細(xì)胞內(nèi)部分為6克。對(duì)純化產(chǎn)物為涎化乳糖的鑒定通過(guò)質(zhì)譜分析確認(rèn)。實(shí)施例6:GD3和GT3糖的生產(chǎn)使用代謝工程化的、表達(dá)雙功能a-2-3和a-2-8唾液酸轉(zhuǎn)移酶的空腸彎曲菌^^//基因從外源乳糖和Neu5Ac生產(chǎn)GD3和GT3糖已經(jīng)被描述(Antoine等人，2005)。這里我們研究了使用實(shí)施例3中描述的系統(tǒng)而不提供外源唾液酸來(lái)生產(chǎn)這兩個(gè)低聚糖。產(chǎn)生GD3的菌株NF3是wa"ii^4r突變，其共表達(dá)c^7/和"ew5C4基因(表1)。NF3菌株在3g/i:的乳糖存在下以高細(xì)胞密度培養(yǎng)。TLC分析(圖12)表明，乳糖被全部轉(zhuǎn)化成3個(gè)化合物，推測(cè)為GM3(1)、GD3(2)和GT3(3)糖。菌株NF03培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)部分通過(guò)離子交換樹(shù)脂色譜在Dowexl上純化，如實(shí)施例4所描述，三個(gè)含有GM3，GD3和GT3的低聚糖片段被分別分離。三種糖片段的產(chǎn)量分別是0.16g，0.75g和1.26g。鑒定通過(guò)對(duì)純化片段的質(zhì)譜分析確認(rèn)。實(shí)施例7:使用腦膜炎雙球菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶和綠膿桿菌UDP-GlcNAcC4差向異構(gòu)酶生產(chǎn)GM1糖以前已經(jīng)描述過(guò)，使用表達(dá)以下基因的代謝工程化的菌株從外源乳糖和Neu5Ac生產(chǎn)GM1糖(0a-2-3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的腦膜炎雙球菌"M基因；(ii)編碼P-l,4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶的來(lái)自空腸彎曲菌的O:19菌株OH4384的cgL4基因；(iii.)編碼P-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的來(lái)自空腸彎曲菌的O:19菌株NCTC11168的基因；(iv)編碼UDP-GlcNAcC4差向異構(gòu)酶的來(lái)自綠膿桿菌的w&戶基因(Antoine等人，2003)。通過(guò)與MewBC4共表達(dá)cg",cg出和w"而不外源加入唾液酸來(lái)生產(chǎn)GM1糖的第一個(gè)嘗試表明，限制步驟是通過(guò)CgtAGalNAc轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化涎化乳糖為GM2糖。GalNAc轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)被證明可以不同的形成存在，取決于彎曲桿菌菌株?？寺∽設(shè)H4384菌株的cgL4形式被報(bào)告具有遠(yuǎn)低于來(lái)自ATCC4356菌株或NTCC11168菌株的特異性活性(Gilbert等人，2002;Varki，1993)。因此通過(guò)PCR從ATCC4356菌株的基因組DNA克隆了eg"http://基因，然后和"W基因被亞克隆至pBluescript質(zhì)粒，產(chǎn)生pBS-cgtAII-nst質(zhì)粒(表l)。在pBBR-3-SS中，克隆自pBBRwbpP質(zhì)粒(Antoine等人，2003)的vt^;尸基因位于"ew5C4基因下游，形成pBBR-SS-wbpP。克隆自pACT3cgtAB質(zhì)粒的cg^(Antoine等人，2003)被克隆入pSU27-18質(zhì)粒，產(chǎn)生pSU18-cgtB。通過(guò)以三個(gè)質(zhì)粒pBS-cgtAII-nst，pBBR-SS-wbpP和pSU18-cgtB轉(zhuǎn)化w^7A^4r突變菌株ZLKA來(lái)構(gòu)建DC15菌株(表l)。如圖13所示，DC15菌株沒(méi)有積聚GM3糖(1),表明來(lái)自ATCC4356菌株的CgtAII比來(lái)自O(shè)H4384菌株的CgtA更加活躍。在培養(yǎng)末期，主要產(chǎn)物是化合物(5)，其比GM1糖和如GM2—樣遷移的化合物(2)遷移更慢。在Dowexl上純化后，質(zhì)譜分析表明化合物(2)是GM2糖類似物，其在GalNAc的位置具有一個(gè)Gal殘基，被進(jìn)一步命名為'GA2糖(表3)，結(jié)構(gòu)為Galp-4(Neu5Aca-3)GalJ34Glc?；衔?5)的質(zhì)譜分析表明它是雙涎化的八糖，通過(guò)兩個(gè)糖殘基(一個(gè)HexNAc，一個(gè)Hex)轉(zhuǎn)移到GDla糖上而形成。由于這兩個(gè)糖最有可能是被CgtAII和CgtB所加，后被命名為GA1糖的化合物(5)的結(jié)構(gòu)，可能是Gal0-3GalNAce-4Neu5Aea畫(huà)3GalP-3GalNAce-4(Neu5Aca-3)Gal0-4Glc(表3)。表3由于CgtAp-1，4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶的(3-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性而在神經(jīng)節(jié)苷脂糖合成中作為副產(chǎn)物而形成的神經(jīng)節(jié)苷脂糖類似物的結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實(shí)施例8:使用腦膜炎雙球菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶和彎曲桿菌UDP-GalC4差向異構(gòu)酶(GNE)生產(chǎn)GM1糖GA2糖通過(guò)培養(yǎng)DC15來(lái)生產(chǎn)，因?yàn)镃gtAII特別活躍，在缺乏UDP-GalNAc的情況下可使用UDP-Gal取代UDP-GalNAc作為糖供體。由于這種缺乏可能由于Wp戶基因所編碼的UDP-GlcNAcC4差向異構(gòu)酶活性不足；研究了對(duì)空腸彎曲菌所編碼的g恥基因的差向異構(gòu)酶的利用。這個(gè)基因最近被表明活性高于WbpP(Bernatchez等人，2005)。Gwe基因由PCR克隆自空腸彎曲菌NCTCU168菌株的基因組DNA，在wewBC4基因下游亞克隆至pBBR-SS質(zhì)粒。所產(chǎn)生的pBBR-SS-gne質(zhì)粒被用于構(gòu)建DC21菌株，其類似于DC15,除了表達(dá)而不是wbpP(表l)。如圖14所示，另外的g"e基因的表達(dá)幾乎完全破壞了異GM2糖的積聚，兩個(gè)主要產(chǎn)物為GM1糖(3)和GA1糖(5)。GM1為瞬時(shí)積聚；其細(xì)胞內(nèi)濃度在加入乳糖28小時(shí)候達(dá)到最大，然后由于化合物(5)的形成而降低。實(shí)施例9:使用空腸彎曲菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶CstIII生產(chǎn)GMl糖以空腸彎曲菌0:2菌株NCTC11168作模板通過(guò)PCR克隆cw///基因。棊因然后被亞克隆進(jìn)入pBluescript質(zhì)粒，在cg^4/i上游。產(chǎn)生的pBS-cstIII-cgtAII質(zhì)粒被用來(lái)構(gòu)建DC22菌株，其也表達(dá)cgf萬(wàn)和CMP-Neu5Ac合成的恥w5C4基因。TLC分析(圖15)表明，GM1糖(3)幾乎是培養(yǎng)末期DC22菌株細(xì)胞內(nèi)部分所發(fā)現(xiàn)的唯一低聚糖。涎化乳糖(1)和GM2糖(2)幾乎不能被作為中間體除去。如實(shí)施例5所描述，在Dowexl上純化后，從一升培養(yǎng)物中GM1糖的產(chǎn)量為6g。實(shí)施例10:GM2糖的生產(chǎn)使用ZWT菌株研究GM2糖的生產(chǎn)，其與產(chǎn)生GM1的DC21菌株類似，除了不表達(dá)^W基因。如圖16所示，乳糖在如GM2—樣遷移的化合物(2)中被ZWT菌株迅速轉(zhuǎn)化。令人驚奇的是，還產(chǎn)生了一個(gè)比GM2遷移慢的化合物(3)。通過(guò)Dowexl上色譜，化合物(2)和(3)純化自ZWT菌株培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)部分。質(zhì)譜分析表明純化的化合物(2)由GM2糖和GA2糖類似物的混合組成。片段B的ESI質(zhì)譜在m/z1310和1269表現(xiàn)出兩個(gè)峰。在m/z1310處的峰可能對(duì)應(yīng)于源自后來(lái)被命名為GA3糖(表3)的六糖GalNAc卩-4(Neu5Aca-3)Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc的準(zhǔn)分子離子[(MT"Na-H)-H]'。在m/z1269處的第二個(gè)峰對(duì)應(yīng)于源自Gaip畫(huà)4(Neu5Aca-3)Gal卩-4(Neu5Aca-3)Gal卩-4Glc(被稱為GA4糖)'的準(zhǔn)分子離子[(M^a-H)-H]'。在圖11中解釋說(shuō)明了GA3和GA4糖的形成Nst唾液酸轉(zhuǎn)移酶的副活性似乎能夠涎化GA2糖的末端非還原性Gal。由此產(chǎn)生的雙涎化五糖(GA6糖)可作為CgtAII的受體被轉(zhuǎn)化為GA3或者GA4糖。實(shí)施例ll:g"/C/突變的構(gòu)建為了構(gòu)建g"/U突變，用五xo/z'K12的基因組DNA作模板和以下兩個(gè)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增了含有序列的1.88kb的DNA片段5，CAATGCCAAATATGGGGAAC(SEQIDNo16)和5'GCGGCCGCGTCTTTTCTGGCTAA(SEQIDNo17).擴(kuò)增的片段被克隆至pCR4blunt-TOPO載體(Invi加gen)，一個(gè)位于galU序列中兩個(gè)A^fe/位點(diǎn)之間的0.244kb的片段被A^/e/消化切割。截短的ga/t/基因被亞克隆至pK03載體的5^//A^/位點(diǎn)。在ZLKA菌株中按照pK03基因取代程序(Link等人，1997)進(jìn)行^/t/的破壞，讓步于ZWU宿主菌株。實(shí)施例12:通過(guò)w/r突變生產(chǎn)GM2糖ZWU2菌株與實(shí)施例10中所用的用于GM2糖生產(chǎn)的ZWT菌株類似，除了使用g"/t/菌株ZWU而不是ZLKA菌株作為宿主菌株(表1)。如圖17所示，在ZWU2培養(yǎng)末期，沒(méi)有檢測(cè)到更多的副產(chǎn)物(3)。而且，質(zhì)譜分析表明化合物(2)只是由GM2糖組成，在分離自ZWT培養(yǎng)物的化合物(2)中存在的GA2糖類似物，可被檢測(cè)到(圖18)。實(shí)施例13:GD2糖的生產(chǎn)第一個(gè)生產(chǎn)GD2糖的嘗試由NF08菌株進(jìn)行，其構(gòu)建自以三個(gè)質(zhì)粒pUC18-cstII，pBBR3-SS-gne,pWKS-cgtAII轉(zhuǎn)化ZJJCA宿主菌株(表1)。對(duì)NF08產(chǎn)生的低聚糖的鑒定表明，主要的產(chǎn)物為GD2糖及其半乳糖基化類似物GA2糖。也形成了少量的GD2糖，但其被純化為半乳糖苷化的類似物GA5和GA6的混合物(圖5)。""http://基因被亞克隆至阿拉伯糖啟動(dòng)子(Para)控制下的pBAD33質(zhì)粒。通過(guò)這種方式《"http://的表達(dá)可被調(diào)控，而獨(dú)立于其它受P^啟動(dòng)子調(diào)控的基因。含有pBAD33-cgtAI1質(zhì)粒而不是pWKS-cgtAII的NF09菌株在沒(méi)有阿拉伯糖下先培養(yǎng)24小時(shí)，接著加入3g/L的乳糖。然后加入阿拉伯糖，菌株被培養(yǎng)另外24小時(shí)。這個(gè)策略能夠有效的減少GM2糖的生產(chǎn)，同時(shí)GD2糖產(chǎn)量升高。但是，半乳糖苷化的類似物GA5或GA6仍熱以相當(dāng)?shù)臄?shù)量被生產(chǎn)。為防止這些很難從GD2分離的類似物的形成，研究了galU突變菌株ZWUl中GD2的生產(chǎn)。ZWU1菌株與NF09菌株類似，除了ga/f/菌株ZWU而不是ZLKA菌株被用作宿主菌株(表1)。在培養(yǎng)25小時(shí)后、幾乎所有的涎化乳糖都消失后，加入阿拉伯糖以增加cgtAII的表達(dá)。Dowexl上對(duì)細(xì)胞內(nèi)部分的純化導(dǎo)致四個(gè)片段的分離(圖19)。質(zhì)譜分析表明片段A由GM2糖組成，片段B有GD2糖組成。片段C主要含有GD3，片段D含有GT2糖。檢測(cè)不到半乳糖苷化的類似物，GD2作為主要產(chǎn)物被獲得。實(shí)施例14:GDlb和GTl的生產(chǎn)cW/7和基因被克隆至同一pBluescript質(zhì)粒(pBS-cstII-cgtB)。NF21菌株通過(guò)以pBS-cstII-cgtB質(zhì)粒以及pBBR-SS-gne質(zhì)粒和pBAD33-cgtAH轉(zhuǎn)化ZLKA宿主菌株來(lái)構(gòu)建。以實(shí)施例13中所描述的培養(yǎng)NF09菌株的促進(jìn)GD2形成的條件以高細(xì)胞密度來(lái)培養(yǎng)NF21菌株。從一升NF21菌株培養(yǎng)物中產(chǎn)生的低聚糖首先以Dowexl(HC03)樹(shù)脂純化，以NaHC03梯度(0-1M)洗脫三個(gè)片段(A，B和C)。質(zhì)譜分析表明，片段A(490mg)含有GD1糖，片段B(870mg)含有GD1糖和GA5或GA6類似物的混合物，片段C(960mg)含有GT1糖。在ToyopearlHW40S柱以100mMNaHCO3作洗脫液，通過(guò)分子排阻色譜從片段A和片段C中純化出GDI和GT1糖。如表4所示，'HNMR分析表明GDI和GT1的末端半乳糖的H-l質(zhì)子化學(xué)位移與末端半乳糖未被取代的GMla糖的H-l值非常接近。然而，由于其被唾液酸取代，GDla和GTla的末端半乳糖的H-l信號(hào)移動(dòng)了4.62ppm。這些結(jié)果清楚地顯示出NF21菌株產(chǎn)生的GDI和GT1糖具有GDlb和GTlc的結(jié)構(gòu)。表4神經(jīng)節(jié)苷脂糖在343°K下的NMR質(zhì)子化學(xué)位移<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)施例15:GTla糖的生產(chǎn)將兩個(gè)基因cW//和eg"克隆至同一pBIuescript質(zhì)粒以在突變的ZLKA宿主菌株中共表達(dá)cg詔和"e"萬(wàn)C基因(表l)。""/基因克隆與cgtA.下游以具有最大量表達(dá)的cgtA和較低表達(dá)的c^//以實(shí)現(xiàn)GD3形成的最小化。如圖20所示，NF17培養(yǎng)物的TLC分析表明像涎化乳糖(1)和'GM1糖(3)—樣遷移的化合物為瞬間產(chǎn)生。少量的如GD3一樣遷移的化合物(2)在培養(yǎng)末期被恢復(fù)，但主要的終產(chǎn)物為比GM1遷移慢的化合物(4)和(5)。對(duì)純化的化合物質(zhì)譜分析表明化合物(4)和(5)具有分別對(duì)應(yīng)于GDla和GTla的分子量。實(shí)施例16:涎化半乳糖的生產(chǎn)通過(guò)敲除GalK突變菌株GLK染色體中的mw^^4r基因來(lái)構(gòu)建GLKA菌株(Dumon等人，2005)。通過(guò)以質(zhì)粒pBS-nst和pBBR3-SS(表1)轉(zhuǎn)化GLKA菌株而獲得GLK7菌株。在3g/L的半乳糖存在下，以高細(xì)胞密度培養(yǎng)GLK7菌株導(dǎo)致形成一個(gè)二糖，其通過(guò)質(zhì)譜分析為與涎化半乳糖相同。涎化半乳糖的產(chǎn)量通過(guò)總唾液酸定量比色估計(jì)為6g/L。實(shí)施例17:四糖Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNAcp-4GlcNAc的生產(chǎn)在pBS-nst的五coiFX/"/位點(diǎn)從pBS-nodC質(zhì)粒(Cottaz&Samain，2005)克隆莖瘤固氮根瘤菌nodC基因來(lái)構(gòu)建pBS-nst-nodC質(zhì)粒。以3個(gè)質(zhì)粒pBS-nst-nodC,pBBR3-SS,pWKS-lgtB-chiA(表l)轉(zhuǎn)化ZLKA菌株從而獲得SN4菌株。以高細(xì)胞密度培養(yǎng)SN4菌株導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)主要的低聚糖，其經(jīng)質(zhì)譜分析被鑒定為Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcJ3-4GlcNAc。參考文獻(xiàn)Antoine，T.,Priem，B.,Heyraud,A.,Greffe，L，Gilbert,M.,Wakarchuk,W.W.，Lam，J.S.&Samain,E.(2003).Large-scaleinvivosynthesisofthecarbohydratemoietiesofgangliosidesGM1andGM2bymetabolicallyengineeredEscherichiacoli.Chembiochem4,406-412.Antoine,T.，Heyraud,A"Bosso，C.&Samain，E.(2005).HighlyefficientbiosynthesisoftheoligosaccharidemoietyoftheGD3gangliosidebyusingmetabolicallyengineeredEscherichiacoli.AngewChemIntEdEngl44，1350-1352.-Bematchez，S.，Szymanski,C.M.，Ishiyama，N.，Li，J.，Jarrell,H.C,Lau,P.C，Berghuis,A.M.,Young,N.M&Wakarchuk,W.W.(2005).AsinglebiflinctionalUDP-GlcNAc/Glc4-epimerasesupportsthesynthesisofthree.cellsurfaceglycoconjugatesinCampylobacterjejuni.JBiolChem280，4792-4802.Bettler，E.,Samain,E.，Chazalet，V.,Bosso，C,Heyraud，A.，Joziasse,D.H.,Wakarchuk,W.W.,Imberty,A.&Geremia,A.R.(1999).Thelivingfactory:invivoproductionofN-acetyllactosaminecontainingcarbohydratesinE.coli.GlycoconjJ16，205-212.Cottaz，S.&Samain,E.(2005).GeneticengineeringofEscherichiacolifortheproductionofN(I),N(II)-diacetylchitobiose(chitinbiose)anditsutilizationasaprimerforthesynthesisofcomplexcarbohydrates.MetabEng7,3U-317.'Creuzenet，C，Belanger,M.，Wakarchuk,W.W.&Lam，J.S.(2000).Expression,purification,andbiochemicalcharacterizationofWbpP,anewUDP-GIcNAcC4epimerasefromPseudomonasaeruginosaserotype06.JBiolChem275，l卯60畫(huà)19067.Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000).One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA97,6640-6645.Dumon,C，Samain,E.&Priem,B.(2004).AssessmentofthetwoHelicobacterpylorialpha-1,3-fbcosyltransferaseorthologgenesforthelarge-scalesynthesisofLewisXhumanmilkoligosaccharidesbymetabolicallyengineeredEscherichiacoli.BiotechnolProg20，412-419.Dumon，C，Bosso，C,Utille，J.P.,Heyraud,A.&Samain,E.(2005).ProductionofLewisxTetrasaccharidesbyMetabolicallyEngineeredEscherichiacoli.Chembiochem7,359-365.Dykxhoom,D.M.，StPierre,R.&Linn,T.(1996).Asetofcompatibletacpromoterexpressionvectors.Gene111，133-136.Fort，S.,Birikaki,L.，Dubois,M.P.，Antoine，T.,Samain,E.&Driguez,H.(2005).BiosynthesisofconjugatablesaccharidicmoietiesofGM2andGM3gangliosidesbyengineeredE.coli.ChemCommun(Camb),2558-2560.Ganguli,S.,Zapata,G.，Wallis，T.，Reid，C，Boulnois,G.,Vann，W.F.&Roberts,I.S.(1994).MolecularcloningandanalysisofgenesforsialicacidsynthesisinNeisseriameningitidisgroupBandpurificationofthemeningococcalCMP-NeuNAcsynthetaseenzyme.JBacteriol176，4583-4589.Gilbert,M.，Bayer,R.，Cunningham,A.M.，DeFrees,S.,Gao，Y.，Watson，D.C，Young,N.M.&Wakarchuk,W.W.(1998).ThesynthesisofsialylatedoligosaccharidesusingaCMP畫(huà)Neu5Acsynthetase/sialyltransferasefUsion.NatBiotechnol16,769-772.Gilbert,M.,Karwaski,M.F.，Bematchez,S.，Young,N.M.,Taboada,E.,Michniewicz,J.,Cunningham,A.M.&Wakarchuk,W.W.(2002).Thegeneticbasesforthevariationinthelipo-oligosaccharideofthemucosalpathogen,Campylobacterjejuni.Biosynthesisofsialylatedgangliosidemimicsinthecoreoligosaccharide.JBiolChem277，327-337.Hamilton,C.M.,Aldea,M.，Washburn,B.K.,Babitzke,P.&Kushner,S.R.(1989).NewmethodforgeneratingdeletionsandgenereplacementsinEscherichiacoli.JBacteriol111，4617-4622.Kalivoda,K.A.，Steenbergen,S.M.,Vimr,E.R.&Plumbridge，J.(2003).RegulationofsialicacidcatabolismbytheDNAbindingproteinNanRinEscherichiacoli.JBacteriol185,4806-4815.Kovach,M.E.,Elzer,P.H.,Hill，D.S.，Robertson,G.T.,Farris，M.A.，Roop,R.M.，2nd&Peterson,K.M.(1995).Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBRIMCS，carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes.Gene166，175-176.Lee,J.,Yi，J"Lee，S.，Takahashi,S.&Kim,B.(2004).ProductionofN陽(yáng)acetylneuraminicacidfromNacetylglucosamineandpyruvateusingrecombinanthumanreninbindingproteinandsialicaldolaseinonepot.EnzymeMicrobTechnol35,121-125.Link,A.J"Phillips,D.&Church,G.M.(1997).Methodsforgeneratingprecisedeletionsandinsertionsinthegenomeofwild-typeEscherichiacoli:applicationtoopenreadingframecharacterization.JBacteriol119，6228-6237.Linton，D.，Gilbert,M.,Hitchen,P.G.,Dell,A.，Morris,H.R.，Wakarchuk,W.W.，Gregson,N.A.&Wren,B.W.(2000).Phasevariationofabeta-1，3galactosyltransferaseinvolvedingenerationofthegangliosideGMl-likelipo曙oligosaccharideofCampylobacterjejuni.MolMicrobiol31，501-514.Martinez,E.,Bartolome,B.&delaCruz,F.(1988).pACYC184-derivedcloningvectorscontainingthemultiplecloningsiteandlacZalpha,reportergeneofpUC8/9andpUC18/19plasmids.Gene68,159-162.Maru,I"Ohnishi，J.,Ohta，Y.&Tsukada，Y.(1998).Simpleandlarge-scaleproductionofN-acetylneuraminicacidfromN畫(huà)acetyl-D-glucosamineandpyruvateusingN-acyl-D-glucosamine2-epimeraseandN-acetylneuraminatelyase.CarbohydrRes306,575-578.Plumbridge,J.&Vimr,E.(1999).ConvergentpathwaysforutilizationoftheaminosugarsN-acetylglucosamine，N-acetylmannosamine，andN-acetylneuraminicaddbyEscherichiacoli.JBacteriol181,47-54.Priem,B.,Gilbert,M.，Wakarchuk,W.W.，Heyraud，A.&Samain，E.(2002).Anewfermentationprocessallowslarge-scaleproductionofhumanmilkoligosaccharidesbymetabolicallyengineeredbacteria.Glycobiology12,235-240.Samain,E.，Drouillard,S.，Heyraud,A.，Driguez，H.&Geremia，R.A.(1997).Gram-scalesynthesisofrecombinantchitooligosaccharidesinEscherichiacoli.CarbohydrRes302，35-42.Stapleton,A.E.,Stroud，M.R.,Hakomori，S.I.&Sta匪，W.E.(1998).ThegloboseriesglycosphingolipidsialosylgalactosylglobosideisfoundinurinarytracttissuesandisapreferredbindingreceptorInvitroforuropathogenicEscherichiacoliexpressingpap-encodedadhesins.JnfectImmun66，3856-3861.Vann,W.F.，Tavarez，J.J"Crowley,J"Vimr，E.&Silver,R.P.(1997).PurificationandcharacterizationoftheEscherichiacoliKlneuBgeneproductN-acetylneuraminicacidsynthetase.Glycobiology7,697-701.Vann,W.F.，Dairies,D.A.,Murkin，A.S.，Tanner,M.E.，Chaffln,D.O.，Rubens,C.E.,Vionnet，J.&Silver,R.P.(2004).TheNeUCproteinofEscherichiacoliKlisaUDPN-acetylglucosamine2-epimerase.JBacteriol186,706-712.Varki，A.(1993).Biologicalrolesofoligosaccharides:allofthetheoriesarecorrect.Glycobiology3,97-130.Vimr，E.R.&Troy，F(xiàn).A.(1985).Identificationofaninduciblecatabolicsystemforsialicacids(nan)inEscherichiacoli.JBacteriol164,845-853.Wang,R.F.&Kushner,S.R.(1991).Constructionofversatilelow-copy-numbervectorsforcloning,sequencingandgeneexpressioninEscherichiacoli.Gene100，195-199.Werner,I.&Odin,L.(1952).Onthepresenceofsialicacidincertainglycoproteinsandingangliosides.ActaSocMedUps57，230-241.Yamamoto,T.，Nakashizuka，M.&Terada，I.(1998).Cloningandexpressionofamarinebacterialbeta-galactosidealpha2，6-sialyltransferasegenefromPhotobacteriumdamselaJTO160.JBiochem(Tokyo)123，94-100.Zhang,X.&Kiechle，F(xiàn).L(2004).Review:Glycosphingolipidsinhealthanddisease.AnnClinLabSci34，3-13.權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)包含至少一個(gè)唾液酸殘基的低聚糖的方法，以下稱為涎化低聚糖，包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，可選地包含外源前體，其中所述微生物包含編碼CMP-Neu5Ac合成酶，唾液酸合酶，GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的外源基因，其中編碼唾液酸醛縮酶(NanA)和ManNac激酶(NanK)的內(nèi)源基因被敲除或滅活，所述微生物能夠生產(chǎn)內(nèi)部激活的唾液酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中外源唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因選自a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，a-2,3-和a-2,8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(c^//)和a-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中的一項(xiàng)所述的方法，其中外源CMP-Neu5Ac合成酶是"e^，外源唾液酸合酶是"ewB，外源GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶是^"C。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中we^4，"ez^和wewC基因分離自在其細(xì)胞被中含有涎化結(jié)構(gòu)的細(xì)菌菌株，例如空腸彎曲菌(Q/^"m')菌株ATCCAccessionNo43438.5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的一項(xiàng)所述的方法，其中"a";"a^i"朋《和"""￡基因被敲除或滅活(wa"X￡L4r-)。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物進(jìn)一步編碼促進(jìn)乳糖攝取的蛋白，并缺少代謝乳糖的酶。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物是大腸桿菌(五.co/z')菌株，其為丄ac;r+(卩-半乳糖苷透性酶)，丄acZ-(卩-半乳糖苷酶)和可選地A^"-(a-半乳糖苷酶)。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7中的一項(xiàng)所述的方法，其中該外源前體選自乳糖、半乳糖、P-半乳糖苷和a-半乳糖苷，例如globotriose(Gala-4Gal(3-4Glc)。9.如權(quán)利要求1-7中的任一項(xiàng)所定義的微生物。10.包含乳糖作為前體以及權(quán)利要求9所述的微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基，。11.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)3，涎化乳糖或6'涎化乳糖的方法，該微生物可以高細(xì)胞密度在碳底物例如葡萄糖或甘油上培養(yǎng)，并以乳糖詞養(yǎng)，乳糖被乳糖透性酶內(nèi)在化并且被所述重組唾液酸轉(zhuǎn)移酶使用由UDP-GlcNAc內(nèi)源生成的CMP-Neu5Ac涎化。12.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述生產(chǎn)GD3的方法，其中該異源唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因是雙功能的a-2,3和a-2，8唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌、保藏為ATCCAccessionNo43438的cstll基因，其催化sialyl半體從內(nèi)部產(chǎn)生的活化的唾液酸分子轉(zhuǎn)移到Neu5Aca腸3Galp誦4Glc(GM3)以形成Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp畫(huà)4Glc(GD3)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其被延伸至GT3的生產(chǎn)，其中該微生物被進(jìn)一步培養(yǎng)以致雙功能的唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化sialyl半體從內(nèi)部產(chǎn)生的活化的唾液酸分子轉(zhuǎn)移到Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc(GD3)以形成Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal(3-4Glc(GT3)。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂Gaip-3GalNAcj3-4(Neu5Aca-3)Gal!3-4Glc(GMl)的碳水化合物部分的生產(chǎn)，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼P-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶和(3-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的異源序列，卩-l,4GalNAc轉(zhuǎn)移酶將UDP-GalNAc殘基轉(zhuǎn)移到涎化乳糖(GM3)而形成GalNAc卩-4(Neu5Acct-3)Galp-4Glc(GM2)，|3-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶將半乳糖基轉(zhuǎn)移到GM2而形成GM1。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶的外源序列，例如來(lái)自綠膿桿菌(Poerwg/"OM)的w6p戶基因或者來(lái)自空腸彎曲菌的^7e基因。16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其被延伸至Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Gal|3-4Glc(GDla)和Galp-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gal卩-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc(GA1)的生產(chǎn)。17.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的特異性生產(chǎn)GM1的方法，其中外源唾液酸轉(zhuǎn)移酶是a-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，由分離自表達(dá)類似GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的脂低聚糖結(jié)構(gòu)的空腸彎曲菌菌株的"http:////基因編碼，例如空腸彎曲菌菌株NCTCAccessionNo111168.18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gal卩-4Glc(GM2)的碳水化合物部分的生產(chǎn)，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼卩-l，4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌0:36菌株ATCCAccessionNo43456的^^^4//基因，和UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶的外源序列，其中該微生物具有以下三個(gè)被敲除或滅活的基因中的至少一個(gè)以破壞UDP-Gal的內(nèi)源產(chǎn)生編碼UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶的ga/五基因，編碼UDP-Glc焦磷酸化酶的ga/t/基因和編碼葡萄糖磷酸變位酶的pgm基因。19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂GD2GalNAc卩畫(huà)4Gal(3-4GlcNeu5Aca-8Neu5Aca3的碳水化合物部分的生產(chǎn)，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶和以GD3糖作受體的卩-l,4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶的外源序列，例如來(lái)自空腸彎曲菌O:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgtAII蛋白。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其被延伸至GDlb糖(Gal卩-3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-3)Gaip-4Glc)和GTlc糖(Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc)的生產(chǎn)，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼P-3Gal轉(zhuǎn)移酶基因的外源序列，例如來(lái)自空腸彎曲菌0:2菌株NCTCAccessionNo11168的cg詔基因。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其被延伸至GTlb(Neu5Aca-3Gal卩誦3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc)，GQlc(Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca曙8Neu5Aca3)Gaip-4Glc)，GQlb(Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc)和GPlc(Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-3GalNAc(3-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc的生產(chǎn)，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼以GDlb和GTlc作受體的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因的外源序列。22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該微生物具有以下三個(gè)被敲除或滅活的基因中的至少一個(gè)以破壞UDP-Gal的內(nèi)源產(chǎn)生編碼UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶的g"壓基因，編碼UDP-Glc焦磷酸化酶的ga/t/基因和pgw基因。23.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其被延伸至神經(jīng)節(jié)苷脂GTlbNeu5Aca3Gal(3-3GalNAc|3-4Gaip-4GlcNeu5Aca-8Neu5Aca3的碳水化合物部分的生產(chǎn)，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼UDP-GlcNAc4差向異構(gòu)酶，以GD3糖作受體的(3-l，4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌O:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgtAII蛋白，以及卩-l,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌O:2菌株NCTCAccessionNo11168的外源序列。24.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)^115八0(1-3031卩-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Gal|3-4Glc(GDla)和Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Gal|3-4Glc(GTla)的方法，其中該微生物包含編碼雙功能a-2，3a-2,8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌ATCCAccessionNo43438的cw//基因，不以GD3糖作為受體的卩-l，4GalNAc轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌O:36菌株ATCCAccessionNo43456的<^"http://基因，以及P-l,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，例如來(lái)自空腸彎曲菌O:2菌株NCTCAccessionNo111168的基因。25.根據(jù)權(quán)科要求1-8中的任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)五糖LSTD(Neu5Aca-3Gal(3-4GlcNAcp-3Gaip-4Glc)的方法，其中唾液酸轉(zhuǎn)移酶是a-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如mf基因，其中該微生物進(jìn)一步包含外源的分別編碼P-l,3-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶和|3-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的和/g^基因。26.根據(jù)權(quán)利要求23的所述的生產(chǎn)涎化-路易斯X(sialyl-lewisX)低聚糖的方法，其中該微生物進(jìn)一步包含一個(gè)編碼a-l，3-fucosyl轉(zhuǎn)移酶的外源序列，例如幽門(mén)螺桿菌(//e//co6ac/w;j;/oW/w")(SEQIDNo18)或者/w^(SEQIDNo19)。27.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)半乳糖基紅細(xì)胞糖苷(Neu5Aca-3Gal卩-3GalNAc卩-3Gak-4Gal卩-4Gal)的方法，其中該微生物在含有g(shù)lobotriose且為丄Gcr+，Me"-,麵r+，麵j-畫(huà)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并且包含外源lgtD，例如來(lái)自流感嗜血桿菌(7foemo/7M^/"y/we"zaeHI1578，GenBankaccession號(hào)U32832的lgtD基因,a-2，3畫(huà)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因和UGP-GlcNAcC4差向異構(gòu)酶以及"edBC基因。28.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)涎化半乳糖(Neu5Aca-3Gal)和帶有一個(gè)末端還原半乳糖的涎化低聚糖的方法，其中該微生物為ga^-，mm豐amf(br加wA^47V,表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因和we"5C4基因，并且在具有半乳糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。29.根據(jù)權(quán)利要1所述的生產(chǎn)在其還原末端帶有殼質(zhì)低聚糖結(jié)構(gòu)的涎化低聚糖的方法，例如涎化七糖Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAcp-4]4GlcNAc，其中唾液酸轉(zhuǎn)移酶是a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如腦膜炎雙球菌"W基因，該微生物進(jìn)一步包含殼質(zhì)低聚糖合酶例如莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)"o^C基因和p-l，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，例如腦膜炎雙球菌的扭萬(wàn)基因?；奶荖eu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc的方法，其中該微生物進(jìn)一步包含編碼殼質(zhì)酶，例如c/7"基因的外源序列。30<image>imageseeoriginaldocumentpage0</image>31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的方法，其中沒(méi)有向培養(yǎng)基中加入外源前體。32.根據(jù)權(quán)利要求11-31中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該微生物在甘油或葡萄糖為碳底物上生長(zhǎng)。33.如權(quán)利要求11-30中的任一項(xiàng)所定義的微生物。全文摘要本發(fā)明涉及大規(guī)模體內(nèi)合成涎化低聚糖的方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，培養(yǎng)基可選地包含外源前體例如乳糖，其中所述微生物包含編碼CMP-Neu5Ac合成酶，唾液酸合酶，GlcNAc-6-磷酸2差向異構(gòu)酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異源基因，其中編碼唾液酸醛縮酶(NanA)和ManNac激酶(NanK)的內(nèi)源基因被敲除或滅活。本發(fā)明還涉及可以產(chǎn)生內(nèi)部激活的唾液酸的這些微生物。文檔編號(hào)C12N9/04GK101415834SQ200780012535公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年3月7日優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日發(fā)明者E·薩滿申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心