專利名稱：：在真核細胞中同源重組的改進的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及將核酸有效和定向整合進細胞染色體中的改進的方法。
發(fā)明內容不同的細胞類型被用于不同的工業(yè)目的。例如，哺乳動物細胞系被用于抗體生產；真菌細胞是生產多肽和次級代謝產物的優(yōu)選生物；細菌細胞被優(yōu)選用于小代謝產物和抗生素生產；植物細胞被優(yōu)選用于口味和香味化合物。重組技術被廣泛地用于細胞和/或方法的生產力的最優(yōu)化。這可包括大量選擇，包括但不限于感興趣的基因的過表達、競爭途徑的刪除或滅活、改變酶的區(qū)室化、增加蛋白質或代謝產物分泌、提高細胞器官含量等等(見例如KhetanandHu(1999)In:ManualofIndustrialMicrobiologyBiotechnology,Eds.DemainandDavies,pg.717-724)。為了使用這些方法獲得成功，關鍵是重組構建體被穩(wěn)定維持在生產宿主中。這可以是作為附加型載體(episomalvector)的部分或通過整合進入基因組中。后一種情形是優(yōu)選的解決方法，因為這是最穩(wěn)定的情形。進一步更優(yōu)選的是在預定的、正確的基因組基因座處整合。因為在若干種物種中，特別是大部分真核生物中，DNA進入基因組的整合以高頻率隨機發(fā)生，通過重組DNA技術構建工業(yè)生產細胞常引起不想要的多核苷酸整合，導致隨機的基因組修飾。另外，這常導致多重整合和由此導致的不穩(wěn)定情形。這種不受控制的、多核苷酸的"隨機多重整合"是可能危險的方法，其能夠引起不想要的宿主基因組修飾，導致降低的生產力。因此，高度期望能夠通過感興趣的多核苷酸的高效正確的基因組靶向構建工業(yè)生產細胞系。另外，既然可獲得越來越大量生物的完整基因組序列，那么構建全基因組過表達和刪除文庫的機會是開放的。有效構建這類文庫的重要要求是所考慮的生物能夠被有效地轉化，感興趣的多核苷酸以高頻率被正確靶向，將核酸正確定向整合入基因組所需的同源性相對較短。文獻描述了若干種方法降低細胞中該不期望的、隨機的多核苷酸整合的頻率。真核細胞具有至少兩種獨立的將核酸(當然尤其是DNA)整合進宿主基因組中的途徑(一個通過同源重組，一個通過非同源重組)。酵母5Vzcc/arcw^c^cerevWae是對同源重組(HR)具有偏好的生物。該生物的同源重組對非同源重組的比例(HR/NHR)可從約0.9到1變化。與5"acc/^ram少c^ce"v&'ae相反，大部分高級真核細胞(包括真菌、植物和哺乳動物)對非同源重組(NHR)具有偏好。其中，HR/NHR比例范圍在0.0001和0.5之間。在這類生物中，定向整合頻率相當?shù)?。要被整合進這類生物基因組中的多核苷酸序列側翼的同源區(qū)的長度也必須相對較長，例如至少2,000堿基對用于斷裂單個基因。這類側翼區(qū)的必要性代表了克隆包含所述多核苷酸的DNA構建體和用該構建體轉化生物時的沉重負擔。另外，位于這些側翼區(qū)內的相鄰基因在轉化后的重組過程期間能夠被輕易地破壞，從而引起不想要的和預料外的副作用。最近，若干個公開文件描述了非常有效率的非同源末端連接(NHEJ)途徑，該途徑負責細胞中多核苷酸的隨機整合，這是改進HR/NHR比例的一種方法(參閱例如Ninomiya"a/.,2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:12248-12253;Krappmann&a/"2006,Eukaryot.Cell.5:212-215)。這可能是一種非常有力的方法，其導致基因靶向效力的非常顯著的提高(甚至高達60倍)。然而，該方法仍然有一些缺點。首先，該方法不是對所有物種都適用的。例如，己經分離了A"70(NHEJ途徑的組件之一)缺陷的哺乳動物細胞(Pierce"a/"2001,GenesandDevelopment15:3237-3242)。這些突變體具有高出六倍的同源性指導的修復頻率，但是同源性指導的定向整合效率沒有提高。其次，盡管在若干真菌物種中其對NHR/HR比例具有積極作用(參f閱伊」鄉(xiāng)口Ninomiya"a/.,2004;KrappmannWa/.，2006)，在大咅P^^青7兄下其被限制為60-90%的正確基因靶向。這對于使用一個或若干個基因而言是可接受的改進，但是對于高通量全基因組分析和/或基因功能的修飾而言則不是。在獲得100%正確轉化體的個體情況下涉及長的側翼區(qū)，這也不適合高通量全基因組分析和/或基因功能的修飾。第三，為了獲得具有改進的HR/NHR比例的這類菌株，需要修飾宿主細胞的重組機制，這可能導致不想要的副作用(參閱例如Celli"a/.,NatCellBiol(2006),8:885-8卯)。也可以通過過表達HR途徑的組分改進HR/NHR比例。該方法的一個例子由Shakedaa/.(2005,ProcNatl.Acad.Sci.USA.102:12265-12269)給出。他們顯示通過過表達酵母RAD54可以將HR頻率提高100倍。該結果仍然僅得到1-10%的正確突變體，使得該方法不適用于高通量全基因組分析和/或基因功能修飾。另一種方法是所謂的二分基因靶向方法(bipartitegene-targetingmethod)(Nielsen&a/.,2006，43:54-64)。該方法使用選擇標記物的兩個重疊的無功能部分。在正確的同源重組后，選擇標記物成為有功能的。他們用最有效的同源重組體系J^ergz7/imV/w/a似在真菌物種中測試了該方法，在WT細胞中具有24%的正確基因靶向。該方法導致超過標準方法2.5倍的提高，但是即便是在mVMa朋中，獲得的轉化體僅有62%是正確的。還使用相當長的側翼區(qū)來獲得正確的靶向。這對于使用一個或若干個基因而言是可接收的改進，但是對高通量全基因組分析和/或基因功能修飾而言不是。Liu"a/.(2001，J.Bacteriol.,183:1765-1772)描述了另一種方法，該方法使用第二選擇標記物來富集Aremom'wmcAo^ogemwi中具有靶基因破壞的轉化體。該方法導致超過標準方法10倍的改進，但是獲得的轉化體仍然僅8%是正確的。Kang和Khang(US2005/0181509)還描述了另一種方法。這是Liu"a/.(2001)方法的變更。他們應用負選擇標記物即單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因作為第二選擇標記物。如果選擇步驟能正確工作，則基因組中隨機整合的多核苷酸會殺死細胞，因為/^K汰基因會將瓊脂平板中的5-氟-2、-脫氧尿苷轉化為毒性化合物。該方法也提高了細胞中正確靶向的頻率，但是其被限制為50%的細胞。更重要的是獲得了非常高的假陽性百分比(9-100%)，這使得該方法不適合高通量全基因組分析和/或基因功能的修飾。Kang禾QKhang(US2005/0181509)也描述了白喉毒素A(t/")基因的測試。該基因已經在植物和哺乳動物細胞中被用作第二標記物，將正確基因靶向的頻率提高至1-2%(參閱例如Terada"。/.，2004,PlantCellRep.22:653-659;YagiWa/.,1993,Anal.Biochem.214:77-86)。然而，他們不能夠使該標記物在真菌物種中有功能。出人意料的是，我們發(fā)現(xiàn)通過將提高HR/NHR比例的方法與使用第二可選擇標記物的方法組合起來，能夠在通常具有NHR偏好的細胞中獲得100%的正確基因靶向。另外，我們驚人地發(fā)現(xiàn)白喉毒素AW")基因在絲狀真菌中起作用，并可在真菌物種中被有效地用作第二(和致死的)標記物，以富集其中發(fā)生了正確基因靶向事件的細胞。本發(fā)明公開了構建真核細胞的方法，所述真核細胞中染色體DNA序列中的靶序列被置換為想要的置換序列，所述方法包括修飾對NHR具有偏好的親本真核細胞，提供與親本細胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核細胞，提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置換序列，該置換序列5'和3'側的側翼是與靶序列側翼的染色體DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表達盒，所述表達盒包含編碼選擇標記物的基因和與之可操作地連接的、在真核細胞中有功能的調節(jié)序列；用所述DNA分子轉化經修飾的真核細胞；培養(yǎng)細胞，獲得經轉化的后代細胞，所述后代細胞染色體中插入了所述DNA分子，通過表達選擇標記物，取消選定其中DNA分子通過非同源重組事件被插入染色體中的后代細胞；和獲得其中染色體DNA序列中的靶序列被想要的置換序列置換的細胞。具有NHR偏好的親本真核細胞可以是具有下述HR/NHR比例的任何真核細胞，所述比例《.5，優(yōu)選地a.2，更優(yōu)選地《.1，最優(yōu)選地^.05。精確的比例可在一個物種中不同的基因座之間變化。測定上述比例的合適基因組為w'oD基因座(及其在所有物種中的同源物)和Kt/70基因座(及其在所有物種中的同源物)。通過分析一組轉化體測定HR/NHR比例，以確定轉化體的哪部分具有正確的基因靶向(HR)和轉化體的哪部分具有不正確的重組(NHR)。有若干種獲得這些數(shù)據的方法(i)表型分析；如果同源的靶基因座具有易于檢測的表型，如m'aD基因座(如果被刪除，則細胞成為抗氯酸鹽的)，則可在合適的識別培養(yǎng)基(例如含有或不含有氯酸鹽)上測試所有的轉化體，以獲得HR和NHR事件的頻率(ii)PCR分析；可對分離自轉化體的DNA進行PCR分析，所述PCR分析使用在側翼序列外退火的一個引物和在置換序列內退火的一個引物。如果獲得了預期大小的擴增，則證實了HR事件。如果未獲得片段或獲得錯誤大小的片段，則可進行對照PCR，所述對照PCR使用的兩個引物均與待置換的靶基因座退火。如果獲得了預期大小的擴增，則證實了NHR事件。(iii)Southem分析；用限制性酶消化分離自轉化體的DNA，所述分析產生取決于HR或NHR事件或野生型狀態(tài)的不同雜交模式?？焖賿呙柙S多轉化體的優(yōu)選方法是PCR。與親本細胞相比具有提高的NR/NHR比例的真核宿主細胞可以通過修飾親本真核細胞獲得，所述修飾通過提高HR途徑的效率和/或通過降低NHR途徑的效率。從而將HR/NHR比例提高了至少2倍，優(yōu)選地至少4倍，更優(yōu)選地至少10倍。在本發(fā)明的上下文中，HR途徑被定義為涉及控制多核苷酸定向整合進宿主基因組中的基因和元件，所述多核苷酸與宿主基因組的某個預定位點具有某種同源性，所述位點是整合靶向的位點。NHR途徑被定義為涉及控制多核苷酸整合進宿主基因組中的所有基因和元件，與多核苷酸與宿主基因組序列的同源性程度無關。提高HR途徑的效率和/或降低NHR途徑的效率可以通過上調和/或下調HR和/或NHR中涉及的基因表達來完成。當獲得的真核細胞中DNA序列的表達水平與親本真核細胞中相同DNA序列的表達水平相比分別更高或更低、優(yōu)選地更高或更低至少2倍、更優(yōu)選地更高或更低至少4倍、進一步更優(yōu)選地更高或更低至少IO倍時，該DNA序列(例如基因)的表達水平分別被上調或下調。被下調時，DNA序列的表達最優(yōu)選為不可檢測的。DNA序列表達水平的上調和/或下調可以如下監(jiān)測通過Northern印跡(參閱例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,Sambrooka/.，NewYork:ColdSpringHarbourPress,1989)來定量測量存在于細胞中的相應的mRNA的量，和/或通過Western印跡來定量測量存在于細胞中相應的蛋白質的量。也可以通過"組學"技術如轉錄本組學(transcriptomics)和/或蛋白質組學測量mRNA和蛋白質水平。MRNA量中的差異也可以通過DNA陣歹U分析定量(Eisen,M.B.andBrown,P.O.DNAarraysforanalysisofgeneexpression.MethodsEnzymol.1999:303:179-205)?？梢酝ㄟ^對親本真核細胞進行重組體基因操作技術和/或經典誘變技術獲得DNA序列表達水平的上調和/或下調。使用重組體基因操作技術上調DNA序列的表達優(yōu)選地包括DNA序列的過表達。使用重組基因操作技術下調DNA序列的表達優(yōu)選地包括DNA序列的滅活?？梢酝ㄟ^將DNA序列置換為其無功能的變體或通過將DNA序列的部分或全部從基因組中刪除來完成滅活。在一個實施方案中，DNA序列表達水平的上調和/或下調可以是可誘導的。這可以通過將DNA序列的內源調節(jié)區(qū)(即編碼HR禾口/或NHR中涉及的組件的基因)置換為新的調節(jié)區(qū)來達成，所述新的調節(jié)區(qū)優(yōu)選地包含可阻遏或可誘導的啟動子，更優(yōu)選地包含可以被(例如被葡萄糖阻遏、氨阻遏和/或pH阻遏)接通和/或切斷的啟動子。真菌葡萄糖-阻遏的啟動子的例子是Pem'"7/〖Mwc/o^oge""附pcbAB啟動子(Martin&fl/"1999,AntonieVanLeeuwenhoek.75:21-31)或A^erg/〃wm'ger葡萄糖淀粉酶啟動子?？山油?切斷的啟動子的例子描述于以下的出版物中激活/阻遏二元體系允許芽殖酵母中緊密的四環(huán)素調節(jié)的基因表達(Belli"a/.，1998，Nucl.AcidRes.26:942-947);可被光接通的基因啟動子體系(ShimizuWa/.,2002，NatBiotech.20:1041-1044)。隨后可以通過監(jiān)測相關DNA序列的表達水平選擇合適的真核細胞。任選地，可以通過測量NHR禾n/或HR途徑的效率和/或HR/NHR比例選擇真核細胞。在本發(fā)明的上下文中，可以通過使用給定的同源性區(qū)將給定的多核苷酸序列定向整合進絲狀真菌基因組中預定位點的效率來測量絲狀真菌HR途徑的效率。在本發(fā)明的上下文中，可以通過給定的多核苷酸序列在絲狀真菌基因組中的非定向整合的效率來測量絲狀真菌NHR途徑的效率，而不考慮任何同源性區(qū)。在一個優(yōu)選的實施方案中，與親本細胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核細胞可以通過降低NHR途徑的效率獲得。這可以通過下調涉及真核細胞中NHR的基因表達來達成，所述下調是與相同條件下測量的親本真核細胞中所述基因的表達相比。根據一個優(yōu)選的實施方案，與親本細胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核細胞在至少一個其內源基因上是有缺陷的，所述內源基因是涉及NHR途徑的以下酵母基因的等價物尺t/70、《t/朋、iAD50、Mi￡/7、Xi52、丄/G4、丄/FA和S/i^(vandenBoschaa/.,2002，Biol.Chem.383:873-892andAllen"a/.,2003，Mol.CancerRes.1:913-920)。酵母和《C/^基因的等價物的一個例子分別是來自絲狀真菌的基因或mi5/禾Q/^/S或mi52(見WO05095624和Ninomiya"a/.,2004)。酵母基因的哺乳動物等價物也是已知的，為Km70或《m朋基因(參閱例如Pierce"a/.,2001)。與上文提到的親本細胞相比具有提高的NR/NHR比例的真核細胞優(yōu)選地被用作使用下文描述的DNA分子轉化的宿主細胞。DNA分子的第一DNA片段包含想要的置換序列，其5'和3'側的側翼是與靶序列側翼的染色體DNA序列基本同源的DNA序列。本發(fā)明中使用術語"基本同源"表示置換序列側翼的DNA序列與靶序列側翼的染色體DNA序列在不多于3kb、優(yōu)選地不多于2kb、更優(yōu)選地不多于lkb、進一步更優(yōu)選地不多于0.5kb、進一步更優(yōu)選地不多于0.2kb、進一步更優(yōu)選地不多于0.1kb、進一步更優(yōu)選地不多于0.05kb、最優(yōu)選地不多于0.03kb的區(qū)域上具有至少80%、優(yōu)選地至少90%的同一性程度。因此需要的同一性程度可取決于基本同源的序列的長度。同源序列越短，同一性百分比越高。技術人員明白，為了通過雙重交叉事件達成同源重組，這些側翼序列需要存在于置換序列的兩側，并且需要與染色體中靶序列兩側的序列基本同源。置換序列的性質可取決于想要的用途而變化。置換序列可例如對真核細胞賦予可選擇的表型。在該情況下，置換序列包含選擇標記物。優(yōu)選地，選擇標記物是陽性選擇標記物。優(yōu)選的陽性選擇標記物是am必基因。當需要滅活靶序列時，優(yōu)選地將選擇標記物用作置換序列。置換序列還可以是靶序列的經修飾的版本，例如提供感興趣的序列的改變的調節(jié)或表達與原始基因產物相比具有改變的特性的經修飾的基因產物。置換序列還可使得感興趣的序列的額外拷貝存在于真核細胞基因組中，以獲得該感興趣的基因的擴增。置換序列可以是與感興趣的真核細胞同源或異源的序列。其可以從任何合適的來源獲得或可以通過定制合成制備。靶序列可以是感興趣的任何序列。例如，靶序列可以是要通過滅活或修飾該序列研究其功能的序列。靶序列也可以是需要其滅活、修飾或過表達來賦予真核細胞想要的表型的序列。第二DNA片段包含表達盒，所述表達盒提供選擇標記物的表達。然而，僅僅非同源重組事件會導致選擇標記物盒的真實整合。這意味著包含第一和第二DNA片段的DNA分子通過非同源重組進入真核細胞染色體中后會發(fā)生該選擇標記物產物的表達。因此當DNA分子在與靶序列不同源的位點整合時，會發(fā)生表達盒的整合?？梢匀∠x定(deselect)那些表達可選擇標記物的細胞，即將其從經轉化的后代細胞的種群中去除。在本發(fā)明的上下文中，編碼選擇標記物的第二DNA片段賦予受體真核細胞可檢測的表型?？蓹z測的表型選擇標記物的例子是綠色熒光蛋白(eGFP)、黃色熒光蛋白(eYFP)、藍綠色熒光蛋白(eCFP)、藍色熒光蛋白(eBFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、/3-半乳糖苷酶(/3-gal)、葡萄糖苷酸酶(glucoronidase,GUS)。優(yōu)選地，這類可檢測的表型選擇標記物是可選擇的標記物。可選擇的標記物的例子是，但不限于tn5-ble(腐草霉素R)、hyg(潮霉素R)、kan(卡那霉素R)、gen(G418R)、amdS(乙酰胺利用)。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼可檢測表型選擇標記物的第二DNA片段是致死的選擇標記物，其賦予真核細胞致死的表型。這類致死表型可以通過多種方式達成。例如當致死選擇標記物編碼對細胞有毒的化合物(例如白喉毒素A或抑制型tRNA)時，可以直接達成致死表型。當致死選擇標記物編碼酶，所述酶將具體的底物轉化為毒性化合物時，還可以有條件地達成致死表型。這類條件致死標記物與可以被轉化為毒性化合物的底物的組合為硝酸鹽還原酶(mVLD基因)與氯酸鹽組合，乳清酸核苷-5，-單磷酸鹽脫羧酶(pjtG基因)與氟-乳清酸組合，乙酰胺酶(am^基因)與氟-乙酰胺組合，或胸苷激酶(汰基因)與5-氟-2，-脫氧尿苷組合。提供選擇標記物表達的表達盒包含與選擇標記物編碼基因可操作地連接的調節(jié)序列。術語"可操作地連接"是指下述并置狀態(tài)，其中所述組件處于允許它們以其想要的方式作用的聯(lián)系中。與編碼序列"可操作地連接的"調節(jié)序列如啟動子、增強子或另一表達調節(jié)信號以下述方式安置來自其編碼序列的多核苷酸的表達在與調節(jié)序列相容的條件下達成。選擇標記物表達盒的調節(jié)序列優(yōu)選地對感興趣的真核細胞的染色體而言是異源的，即調節(jié)序列來自與待轉化的感興趣的真核細胞不同的真核物種。在該背景中使用同源調節(jié)序列可導致對應于同源調節(jié)序列的染色體位點上的定向整合。這類整合事件是不期望的，因為其降低了對包含靶向序列的位點的正確靶向百分比。使用的調節(jié)序列可驅動組成型表達；這使得能夠在轉染后直接使用陰性選擇?；蛘?，可以使用驅動選擇標記物基因的可調節(jié)表達或可誘導表達的調節(jié)序列；這涉及兩步步驟。首先，在不發(fā)生選擇標記物基因轉錄的條件下進行轉化體的轉染和隨后的分離。其次，將經分離的轉化體轉移至誘導陰性選擇標記物基因轉錄的條件下，從而選擇性地殺死經歷了隨機整合事件的所有隔離群。DNA分子可以以任何順序包含第一和第二DNA片段，優(yōu)選是線性的。如果置換序列不包含選擇標記物，則這類標記物可在獨立的DNA分子中提供。使用本領域普遍已知的技術，用包含第一和第二DNA片段的DNA分子和任選的包含選擇標記物的DNA分子轉化真核細胞。簡言之，通過將真核細胞與合適量的DNA分子(優(yōu)選是線性的形式)接觸來轉化真核細胞，并通過在僅經轉化的細胞能夠生長的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)細胞來選擇經轉化的細胞的菌落。轉化后，包含第一和第二DNA片段的DNA分子通過同源或異源整合事件整合進真核宿主細胞的染色體中。通過置換序列和靶序列側翼的同源序列上的雙重交叉事件，在宿主染色體的靶序列上發(fā)生同源整合事件。這類事件確保包含選擇標記物表達盒的第二DNA片段不被整合進染色體中。非同源整合事件導致包含第一和第二DNA片段的完整DNA分子的整合。當選擇標記物基因在整合后被表達時，取消選定其中發(fā)生了非同源整合事件的細胞。選擇標記物基因的表達可以與轉化體的選擇同時發(fā)生，或者在選擇了轉化體后的較晚階段發(fā)生。在后一情況下，選擇標記物基因的表達可以被合適的誘導物誘導。真核細胞是具有NHR偏好的真核細胞。優(yōu)選地，真核細胞是真菌、植物或動物細胞。更優(yōu)選地，真菌是JW6Tg/〃M、尸em'"7/^w、或尸/c/n'a的屬；最優(yōu)選As^erg〃/wsw'ger、^pergz7/wsm'c/w/朋s、v4s/7erg7'〃w51—/wa、CA，o/o"'簡/wc/:"o衡m^、A7炒veram少ces/ac"i"、/^'c/n'a戸s/on.51或尸/c/n'aa/ern7的禾中。更優(yōu)選地，植物是Jra^Wo/w^、Wcoriawa、6V/fl"wm、丄a"wca、SrasWca、(9^za、J5paragi^、尸/swm、A/edZcago、Zea、//on/ewm、Seca/e、7V/ricw附、CVzp57'cw附、C"wcwm^、C^cm/^wY"、C"r函.5、C"ms、5brgA畫的屬；最優(yōu)選地是爿ra/^Woi戸SAa/^a、A^co0.firnato^acci/附、iS"o/awi/附/yco/er^cwm、6b/awmfw/e廠os"Mm、iSo/aww附附e/owge朋、5b/a鹿wescw/e幽w、丄a由cas加'va、6ms\s7,cawa戸51、5ra肌'cao/eracefl、Sra肌'cara戸、(9，ag勵e/rz.ma、(9，a5"fl/fra、q/^c/wa/^、P/5M附saZ/vw/w、MetZ/cagosariva、Zeama_y5、i7onieMmvw/gare、Seca/ecerea/e、7hYz'cw附aes^'vwm、7V7.ricwmdMn/w、C"o/zs7'cwmsa/vtw、CwcM/""6"a/epo、C"rw〃ws/朋a加、Q/c訓^we/o、C"ms1awrawftyb//a、C"n^moxz'ma、C"n^附ecZ/ca、C"ms廠ericw/ato的禾中。更優(yōu)選地，動物細胞是//麵o、ia"t^、Mws、iSW、5as、Z)am'o、Cam's、、E《薦s、屬；最優(yōu)選的是//omos—^s1、朋rveg7'ci^、MwsmwscM/i"、scr—、5tw她ms、Ajw/o、C朋/s/w/t^、、E《wwscfl/a〃i"、/Sa/mosfl/,、Owco/^ywc/^，^y、GW/ig"〃ws、Me/eagr^gfl〃o/avo、Droop/n7a附e/a/7oga對er、Caewor/mZc//toe/ega朋的禾中。通過使用具有提高的HR/NHR比例的真核細胞，本發(fā)明的方法有利地確保了多核苷酸至感興趣的染色體靶位點的增加的靶向。本發(fā)明的方法還有利地允許提供經轉化的真核細胞，所述經轉化的真核細胞富含其中發(fā)生了正確定向重組事件的細胞。尤其是與使用無第二片段(其包含選擇標記物)的轉化中的1-2%相比，至少50%的經轉化的克隆具有靶向了染色體中靶序列的置換序列。圖1顯示質粒pdel-hdfA的克隆方案。五個PCR反應PCR1A、PCR2A、PCR3、PCR4A和PCR5的細節(jié)在實施例1中詳細說明。其中指出了每個中間體質粒名稱和相關的限制性酶切位點。圖例*=圖解用酶限制性消化；帶垂直線的方框=5'同源側翼序列；帶水平線的方框=3'同源側翼序列；白色方框-mm^選擇標記物盒；大黑色方框=腐草霉素選擇標記物盒；小黑方框=重組序列圖2顯示真菌中兩種不同的重組途徑。A.(雙重)同源重組，導致定向整合事件。在該情況下非同源的We基因不會整合，從而使得轉化體對腐草霉素敏感。B.非同源重組，導致隨機整合事件。在該情況下非同源的We基因會整合，從而使得轉化體抗腐草霉素。在此之上，靶基因座(在該情況下為保持完整。圖例LF二5，同源側翼序列；《m^=am^S選擇標記物盒；RF-3'同源側翼序列；ble=腐草霉素選擇標記物盒；hdfA=尸ew'"7/z'wmc/zo^oge"wm基因(酵母KU70同系物)。"X"表示重組事件。圖3顯示為了確定cAoAwge艦m基因是否被正確刪除的PCR對照。A.WT基因座。B.正確的基因靶向使用寡核苷酸SEQIDNO11和SEQIDNO12會產生2.6kb的片段；WT不會產生片段。C.正確的基因耙向用寡核苷酸SEQIDNO13和SEQIDNO14會產生3.6kb的片段；WT不會產生片段。D.正確的基因靶向用SEQIDNO15和SEQIDNO16不會產生片段；WT會產生2.2kb的片段。圖例LF二5，同源側翼序列；am必=am必選擇標記物盒；RF=3'同源側翼序列；=尸em'c/肌wmc/o^oge"ww基因(酵母KU70同系物)。箭頭指出實施例1文中描述的寡核苷酸退火位置。粗線指出在實施例1文中描述的PCR反應中擴增的PCR片段。圖4是PCR對照的圖示，所述PCR用于確定是否獲得了不含標記物版本的Pem'd〃/wmc/o^oge"wm刪除突變體。A.ama^標記物仍然存在的刪除使用寡核苷酸SEQIDNO17和SEQIDNO18應當產生5kb的片段。B.選擇的重組事件的圖示，使得細胞成為氟乙酰胺抗性的。B.不含標記物的刪除用寡核苷酸SEQIDNO17和SEQIDNO18會產生1kb的片段。圖例LF=5，同源側翼序列；am必=am必選擇標記物盒；RF=3'同源側翼序列；箭頭指出實施例1文中描述的寡核苷酸退火位置。粗線指出在實施例l文中描述的PCR反應中擴增的PCR片段。圖5顯示在Pe"/c/〃/wmc/^wge冊m的niaD基因座上定向整合的途徑。A.質粒pDESTR4R3Naw必N.B.線性化的pDESTR4R3Nam必N在基因組"&D基因座上誘導了雙重同源重組(或交換)。C.flmc/S交換后的基因組m'aZ)基因座構成。圖例LFniaD=w'oD基因基因座的5'同源側翼序列；am必二aw必選擇標記物盒；RFniaD^m'aD基因基因座的3'同源側翼序列；"X"表示重組事件。圖6顯示通過使用第二可選擇標記物與具有改進的同源重組頻率的菌株組合在尸ew'd肌wmc/o^oge"wm的"&Z)基因座上定向整合的途徑。A.質粒pDESTR4R3NphleoNam必。B.線性化的pDESTR4R3NphleoNam必在基因組基因座上誘導了雙重同源重組(或交換)。C.We交換和喪失am必基因后的基因組wVLD基因座構成。指出了證實正確基因靶向的PCR擴增，包括預期的片段大小。圖例LFniaD=基因基因座的5'同源側翼序列；We=腐草霉素選擇標記物盒；RFniaD=m'aZ)基因基因座的3'同源側翼序列；am^S=am^S選擇標記物盒；"X"表示重組事件。箭頭指出實施例4文中描述的寡核苷酸退火位置。粗線指出在實施例4文中描述的PCR反應中擴增的PCR片段。圖7顯示通過使用第二可選擇標記物與具有改進的同源重組頻率的菌株組合在Pe"/d〃Zwwc/zo^oge履m的w/aZ)基因座上定向恢復的途徑。A.質粒pDONR201aw必ni800禾QpDONR201a/w必ni1200的圖示。B.(被M/wI或7VnJ任一)線性化的載體pDONR201am必ni800和pDONR201am^S"ni1200在基因組wVlD基因座上產生了雙重同源重組(或交換)。C.中心441bp恢復后的基因組m'aZ)基因座構成。圖例LFniaD=m'aZ)基因基因座的5'同源側翼序列；=部分"/flD開放讀碼框；RFniaD="/aD基因基因座的3'同源側翼序列；am必=am必選擇標記物盒；"X"表示重組事件。箭頭指出實施例5文中描述的寡核苷酸退火位置。粗線指出在實施例5文中描述的PCR反應中擴增的PCR片段。實施例通用材料和方法標準步驟如另ij處(Sambrooke,fl/"1989,Molecularcloning:alaboratorymanual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)所述進行。使用校正讀碼聚合酶Phusion(Finnzymes)根據制造建的菌株和質粒的驗證通過使用Taq聚合酶完成。限制性酶來自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。對于常規(guī)克隆，使用^c/2er油,"co//菌株Top10和DH10B(Invitrogen)。根據制造商手冊使用Invitrogen的Gateway體系。構建的質粒的驗證通過限制性分析和隨后的測序進行。實施例1冊!j除尸em'cz7/z'M附c/zrysogewMW白勺Z;J/^基因載體構建為了刪除涉及非同源末端連接途徑的酵母KU70基因的真菌等價物尸em'd〃/wmc/o^ge聰m基因(見WO05095624)的染色體拷貝，構建了整合載體pdeW^/4。為此PCR擴增/^//J基因的緊鄰上游和緊鄰下游的2500bp基因組DNA片段。使用SEQIDNO1和SEQIDNO2的寡核苷酸從基因組DNA中PCR擴增上游區(qū)(別名左側翼；圖1中PCR1A)，從而在遠左側端引入lal位點。為了簡化隨后的am^S標記物的去除，通過從基因組DNA中PCR擴增基因下游第一個1000bp并將其融合至左側翼，將該盒周圍的1000bp重復引入構建體中(圖1中PCR2A)。為此使用寡核苷酸SEQIDN03和SEQIDN04，在右側末端引入禾Q位點。整個片段(3.5kb)被克隆進pZERO-TOPO(Invitrogen)中，產生質粒pTOPO-LFA-RFA2。使用寡核苷酸SEQIDNO5和SEQIDNO6從pHELY-Al(見WO04106347)中PCR擴增a,w^選擇標記物盒，在左端引入mrt、^yi和幼yi位點和在右端引入丄ci和mwi位點(圖1中PCR3)。還將該片段克隆進pZERO-TOPO中(即產生質粒pTOPO-L-amdS)并隨后將片段再克隆進pTOPO-LFA-RFA2中，產生質粒pLFA2-RFA2-Lox-"w必。使用寡核苷酸SEQIDNO7和SEQIDNO8從基因組DNA中PCR擴增下游區(qū)(別名右側翼；圖1中的PCR4A)，從而在左端引入A>"I、和血d位點和在右端引入X/"I位點。將片段再次克隆進pZERO-TOPO中，產生質粒pTOPO-L-RFA。為了有助于隨后針對基因座上定向整合的有效篩選，使用寡核苷酸SEQIDNO9和SEQIDNO10從pAMPF21(Fierro^a/.,1996,CurrGenet29:482-489)中PCR擴增腐草霉素抗性盒(圖1中PCR5;Phleo)，從而在左端引入歷打rfin、Jscl和Kj^I位點和在右端引入iVort位點。用和消化片段并將其克隆進pCR2.1中，產生pCR2.1-Phleo。用止cl和消化后從pTOPO-L-RFA中分離右側翼；并將其克隆進pCR2.1-Phleo，產生質粒pLox-RFA-Phleo。分離pLox-RFA-Phleo的爿c5l-Vo,1片段并將其連接在用Jd-A^I消化過的pLFA-RFA2-Lox-am必中后獲得的完全刪除構建體，產生質粒pdel-Z^/4(見圖l)。染色體拷貝的刪除從質粒pdel-;W/A中以鄰I片段形式分離出刪除片段，并轉染至尸em'c/〃/w附cA/^^ogewiwz原生質體中。尸em'c/〃/wwc/z^ysogewwm原生質體根據標準方案生產(參閱例如Cantoral"a/.,1987，Biotechnology5:494-497;Swinkels"a/.,1997，WO97/06261)，然而使用Glucanex(Sigma)作為分解酶。轉染后將原生質體涂布在用乙酰胺作為唯一氮源的選擇性再生瓊脂平板上(培養(yǎng)基的精確描述參閱Swinkelsfl/.，1997)。利用乙酰胺的菌落被轉移至新鮮的乙酰胺平板(無蔗糖誘導孢子形成)上并隨后針對腐草霉素敏感性篩選300個菌落(在如US2002/003975中針對Pem'd〃/wm"0^oge""m所述的礦物培養(yǎng)基瓊脂上，不含苯乙酸但是補充有15g/L的瓊脂用于固化和50mg/L的腐草霉素)。由此獲得的轉化體應當針對基因座上的定向整合被富集，因為隨機轉化體會是腐草霉素抗性的(見圖2)。300個利用乙酰胺的轉化體中僅9個是腐草霉素敏感性的。這表明3%的原始轉化體是推定的正確轉化體，即朝向/^/^的靶向可以是成功的。這與針對絲狀真菌報導的值是一致的，其中在WT狀態(tài)下大部分轉化體是隨機整合的結果。通過添加針對腐草霉素敏感性的篩選，我們能有效地取消選定這些并對有限量(即9個)推定的/^/4突變體作出更多努力。/^/M刪除的驗證用菌落PCR篩選9個推定的突變體中的六個，確定刪除是否正確。為此，將一塊孢子化的菌落重懸在50ml水中并在98。C煮沸10分鐘。離心細胞碎片并在3個PCR反應中使用1ml上清液(見圖3)。使用下述引物組，只有帶有正確整合事件的轉化體能夠產生2.6kb的片段(見圖3B)，所述引物組中正向引物在am^S盒的終止子處退火，反向引物在刪除盒中使用的右側翼下游退火。使用寡核苷酸SEQIDNO11和SEQIDNO12的PCR反應顯示所有6個候選者在該位點上具有正確的整合。使用下述引物組，只有具有正確整合的轉化體會得到3.6kb的片段(見圖3C)，所述引物組中正向引物在刪除盒中使用的左側翼上游退火，反向引物在am必盒的伊W啟動子處退火。使用寡核苷酸SEQIDNO13和SEQIDNO14的PCR反應顯示只有一個候選者在該位點處具有正確的整合。使用下述引物組，具有正確整合事件的轉化體不會產生片段，所述引物組含有在基因ATG處起始的正向引物和恰好在的STOP密碼子之前起始的反向引物。使用寡核苷酸SEQIDNO15和SEQIDNO16的PCR反應顯示在最先的兩個PCR后剩余的單個候選者確實未得到條帶，而其他五個候選者中仍然能夠擴增/^/A指出在后一組中，/^/J基因座上發(fā)生了奇數(shù)重組。然而，證實了SA1菌株是真正的/^/j刪除菌株。因此結論是6個轉化體中的l個具有正確的/^/4基因置換。獲得不含標記物的突變體為了獲得清潔的/^/j突變體，必須去除^m^選擇標記物。為了簡化起見，在克隆時引入1000bp重復片段(見圖l)。該1000bp與刪除構建體中使用的右側翼區(qū)的最先1000bp完全相同。因此，如果該1000bp中會發(fā)生重組，則能獲得清潔的刪除，其中側翼區(qū)被保留而整個/^/J基因座會被去除。^m/S選擇標記物具有下述優(yōu)點可以選擇該基因的存在(即能夠在乙酰胺作為唯一氮源時生長)以及不存在(即存在"m^S時氟乙酰胺會產生有毒的氟)。將菌株SA1的孢子涂布在含氟乙酰胺的瓊脂平板上(W09706261)，分離生長的菌落并用菌落PCR檢驗。為此，如上所述獲得PCR模板材料，并使用寡核苷酸SEQIDNO17和SEQIDNO18進行PCR。在SA1的情況下，這可產生5kb的片段，而在重組的情況下(即不含標記物的/^/C4刪除)，這可產生lkb的片段(見圖4)。檢驗了10個氟乙酰胺抗性的菌落，其均顯示1kb的條帶。據此，這10個候選者均不能夠在乙酰胺平板上生長，證實了雙重同源重組的發(fā)生"m必基因已經被去除，這些菌落是真正的無標記物刪除菌株(AS1到AS10)。無標記物突變體的表型為了確定/^^突變體是否具有明顯的表型，檢驗了5個項目青霉素V生產、形態(tài)學、生長速率、孢子形成和腐草霉素敏感性。如US2002/0039758所述在液體培養(yǎng)基中檢驗青霉素V生產。檢驗了四個菌株WT、SA1(含flm必的/^/^突變體)、AS1和AS2(均無標記物的突變體)。生產力分別為100%、114%、105%和100%。因此，hdfA刪除不引起青霉素生產的明顯改變。通過在平板上培養(yǎng)突變體檢驗形態(tài)學。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^^刪除不引起形態(tài)學的明顯改變。在如上所述的青霉素V生產力測試中通過測量OD600檢驗生長速率。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^/J刪除不引起生長速率的明顯改變。通過用眼睛比較瓊脂平板上菌落的著色和結構檢驗孢子形成。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/W/4刪除不引起孢子形成的明顯改變。因為/^^基因產物可能在腐草霉素敏感性的修復機制中起作用，檢驗了一種已知的DNA斷裂誘導物。這通過在如US2002/0039758中針對Pew'c/Wwmc/zo^ogewwm而描述的礦物培養(yǎng)基瓊脂平板上測試生長完成，所述培養(yǎng)基不含苯乙酸，但是補充有15g/L用于固化的瓊脂和0-50mg/L腐草霉素。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^/」刪除不引起腐草霉素敏感性的明顯改變。最后，我們得出結論突變體沒有明顯的表型，并可被用于進一步的研究。冊lj除尸ew'd〃/讓c/zrys收e"騰的hdffi基因載體構建為了刪除涉及非同源末端連接途徑的酵母KU80基因的真菌等價物尸em'd肌wmcAo^oge鹿mAc(/B基因(見WO05095624)的染色體拷貝，構建了整合載體pdeW^/B。構建一般與圖1中針對基因所列的相同。首先，PCR擴增Ac^B基因的緊鄰上游和緊鄰下游的2500bp基因組DNA片段。使用寡核苷酸SEQIDNO19和SEQIDNO20從基因組DNA中PCR擴增上游區(qū)(別名左側翼)，從而在遠左端引入lal位點。為了有助于隨后去除畫必選擇標記物，通過從基因組DNA中PCR擴增/^/B基因上游的最初1000bp并將其融合進左側翼，將該盒周圍的1000bp重復引入構建體中。為此，使用寡核苷酸SEQIDN021和SEQIDN022，在右端引入^yi禾n位點。將整個片段(3.5kb)克隆進pZERO-TOPO(Invitrogen)中，產生質粒pTOPO-LFB-RFB2。將pTOPO-L-amdS的Sr^I-AAM片段再克隆進pTOPO-LFB-RFB2中，產生質粒pLFB2-RFB2-Lox-amdS。使用寡核苷酸SEQIDNO23和SEQIDNO24從基因組DNA中PCR擴增A^B的下游區(qū)(別名右側翼)，從而在左端引入《p"I、^/I和Acl位點，和在右端引入X/"I位點。將該片段克隆進pZERO-TOPO中，產生質粒pTOPO-L-RFB。用Ad和AT;"I消化后從pTOPO-L-RFB中分離該右側翼；并克隆進pCR2.1-Phleo，產生質粒pLox-RFB-Phleo。分離pLox-RFB-Phleo的Jcd-A/ort片段并將其連接在用Jcd-A^I消化的pLFB-RFB2-Lox-am必中后，獲得M/S的完整刪除構建體，產生質粒pdel-M歷(見圖1)。染色體拷貝的刪除從質粒pdel-Z^/S中以片段的形式分離出刪除片段，并轉染至尸em'c/〃/w附c/o^oge"w附原生質體(根據標準方案生產，艮卩根據Cantoral"a/.，1987,Biotechnology5:494-497;Swinkels"a/.,1997，WO97/06261,但是使用Glucanex(Sigma)作為分解酶)。轉染后將原生質體涂布在使用乙酰胺作為唯一氮源的選擇性再生瓊脂平板上(SwinkelsW1997中描述的培養(yǎng)基)。利用乙酰胺的菌落被轉移至新鮮的乙酰胺平板(無蔗糖誘導孢子形成)上并隨后針對腐草霉素敏感性篩選375個菌落(在如US2002/0039758中針對c/owgem/m所述的礦物培養(yǎng)基瓊脂上，不含苯乙酸但是補充有15g/L用于固化的瓊脂和50mg/L的腐草霉素)。由此獲得的轉化體應當針對/^^基因座上的定向整合被富集，因為隨機轉化體會是腐草霉素抗性的(在圖2中針對/^0概述)。375個利用乙酰胺的轉化體中僅12個是腐草霉素敏感性的。這表明了3.2%的原始轉化體是推定的正確轉化體，即朝向/^/B基因的耙向可以是成功的。這與針對絲狀真菌報導的值是一致的，其中在WT狀態(tài)下大部分轉化體是隨機整合的結果。通過添加針對腐草霉素敏感性的篩選，我們能有效地取消選定這些，并對有限量(即12個)推定的/^/B突變體作出更多努力。/^/B刪除的驗證用菌落PCR篩選12個推定的/^/B突變體中的八個，確定刪除是否正確。為此，將部分孢子化的菌落重懸在50ml水中并在98'C煮沸10分鐘。離心細胞碎片并在3個PCR反應中使用1ml上清液(與圖3中針對概述的設置類似)。使用下述引物組，只有帶有正確整合事件的轉化體能夠產生2.6kb的片段，所述引物組中正向引物在mm^盒的終止子處退火，反向引物在刪除盒中使用的右側翼下游退火。使用寡核苷酸SEQIDNO11和SEQIDNO25的PCR反應顯示所有8個候選者在該位點上具有正確的整合。使用下述引物組，只有具有正確整合事件的轉化體會得到3.6kb的片段，所述引物組中正向引物在刪除盒中使用的左側翼上游退火，反向引物在am^S盒的g;c^啟動子處退火。使用寡核苷酸SEQIDNO26和SEQIDNO14的PCR反應顯示8個候選者中的7個在該位點處具有正確的整合。使用下述引物組，具有正確整合事件的轉化體不會產生片段，所述引物組含有在/^/S基因ATG處起始的正向引物和恰好在的STOP密碼子之前起始的反向引物。使用寡核苷酸SEQIDNO27和SEQIDNO28的PCR反應顯示在最先的兩個PCR后剩余的7個候選者中5個的確未得到條帶，而在其他三個候選者中仍然能夠擴增(部分)/^歷，表明在后一組中，基因座上發(fā)生了奇數(shù)重組。然而，證實了SB2、SB3、SB4、SB5和SB12菌株是真正的/^/S刪除菌株。因此結論是8個轉化體中的5個具有正確的/^/B基因置換。獲得無標記物的突變體為了獲得清潔的/^/B突變體，必須去除am^S選擇標記物。為了簡化起見，在克隆時引入1000bp重復片段(見上文)。該1000bp與刪除構建體中使用的右側翼區(qū)的最先1000bp完全相同。因此，如果該1000bp中會發(fā)生重組，則能獲得清潔的k/ys刪除，其中側翼區(qū)被保留而整個/^/B基因座會被去除。am^S選擇標記物具有下述優(yōu)點可以選擇該基因的存在(即能夠在乙酰胺作為唯一氮源時生長)以及不存在(即存在amdS時氟乙酰胺會產生有毒的氟)。將5個Ac/yB菌株的孢子涂布在含氟乙酰胺的瓊脂平板上(W09706261)，分離生長的菌落并用菌落PCR檢驗。為此，如上所述獲得PCR模板材料，并使用寡核苷酸SEQIDNO29和SEQIDNO30進行PCR。如果am必存在，這會產生5.5kb的片段，而在重組的情況下(即無標記物的/^/S刪除)，這會產生1kb的片段(如在圖4中針對/^/4所概述的)。針對5個/^/B菌株中的每個檢驗了IO個氟乙酰胺抗性的菌落，所有的衍生物均顯示1kb的條帶。據此，這50個衍生物均不能夠在乙酰胺平板上生長，證實發(fā)生了重組"m必基因已經被去除，這些菌落是真正的/^/S無標記物刪除菌株(ASI到ASIO)。無標記物/^詔突變體的表型和對突變體一樣，我們確定了/^/S突變體是否不具有明顯的表型。檢驗了相同的個5項目青霉素V生產、形態(tài)學、生長速率、孢子形成和腐草霉素敏感性。如US2002/0039758中所述在液體培養(yǎng)基中檢驗青霉素V生產。對每個amt^陽性/^/B菌株檢驗了兩個無標記衍生物，并與WT菌株的生產力比較(表1)。表1./^/S突變體的青霉素V生產力；WT的生產力被設定為100。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>生產力均在WT菌株的100+/-10%左右。因此，A^B刪除不引起青霉素生產的明顯改變。通過在平板上培養(yǎng)突變體檢驗形態(tài)學。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^/B刪除不引起形態(tài)學的明顯改變。在如上所述的青霉素V生產力測試中通過測量OD600檢驗生長速率。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^/B刪除不引起生長速率的明顯改變。通過用眼睛比較瓊脂平板上菌落的著色和結構檢驗孢子形成。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^/B刪除不引起孢子形成的明顯改變。因為/^/B基因產物可能在腐草霉素敏感性的修復機制中起作用，檢驗了一種已知的DNA斷裂誘導物。這通過在如US2002/0039758中針對尸ew'd〃/wwc/o^ogem/m而描述的礦物培養(yǎng)基瓊脂平板上測試生長來完成，所述培養(yǎng)基不含苯乙酸，但是補充有15g/L用于固化的瓊脂和0-50mg/L腐草霉素。未觀察到相對于WT的顯著差異。因此，/^/S刪除不引起腐草霉素敏感性的明顯改變。最后，我們得出結論像突變體一樣，/^/B突變體沒有明顯的表型，并可被用于進一步的研究。實施例3尸ew'd'w7c/;n^oge麗m的Zfi^或突變體菌株中的同源重組頻率為了確定與WT相比/^/J和/z^B刪除菌株的同源重組頻率，構建了編碼硝酸鹽還原酶的m力D基因座的刪除盒。為此，擴增了mVLD基因座的兩個1800bp片段，通過flw^S表達盒分離，并應該使得m'a/)基因的部分被交換為flmdS表達盒，從而賦予轉化體氯酸鹽抗性(歸因于"&D的刪除)和能夠使用乙酰胺作為唯一的氮源。進行了三個PCR反應(見表2)并將其克隆進Invitrogen的GatewaypDONR載體中，使得能夠通過Multi-Gateway4本系P逭后有效鬲蟲合(見www.Invitrogen.com)。表2.用于克隆niaD-刪除盒的寡核苷酸和pENTR載體。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>三個獲得的的載體被用于進行進入pDESTR4-R3的多位點Gateway反應，產生質粒pDESTR4R3Namd，(見圖5)。用EcoRI線性化該質粒并轉染至Penicilliumchrysogenum原生質4本。Penicilliumchrysogenum原生質體根據標準方案(參閱例如Cantoral"a/.,1987，Biotechnology5:494-497;Swinkelsa/.,1997，WO97/06261)生產，但是使用Glucanex(Sigma)作為分解酶。轉染后將原生質體涂布在使用乙酰胺作為唯一氮源的選擇性再生瓊脂平板上(培養(yǎng)基的詳細描述見SwinkelsWa/.,1997)。利用乙酰胺的菌落被轉移至新鮮的乙酰胺平板(無蔗糖誘導孢子形成)上并隨后針對氯酸鹽敏感性(每升NaCl，3g;KH2P04,1g;FeS04.7H20，10mg;MgS04,7H20,0.5g;OxoidAgarno.l,15g;葡萄糖，20g;孢子元素，見WO970626L第10-11頁，從ZnS04到生物素的所有元素；腺嘌呤，1.85g;KC103,12.5g)篩選100個菌落。從表3中存在的結果可以清楚地概括出，/^/J或/^/S中任一個的刪除對定向整合的頻率具有顯著的影響定向整合從WT中的1%提高到突變體中的47-56%。表3.WT、hdfA和HDFb突變體中的基因靶向頻率。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例4使用第二可選擇標記物在Penicilliumchrysogenumm的hdfA或hdfB突變體菌株中改進的同源重組效率為了測定第二可選擇標記物的影響，獲得pDESTR4R3NphleoNaw必的刪除構建體(見圖6)。破壞w'aD基因座后將/^/4和/^/B刪除菌株的同源重組頻率再次與WT相比較。為此，如實施例3中所述使用"&D基因座的1800bp側翼片段，但是這次通過We表達盒分離這些，產生腐草霉素抗性。處于同源側翼區(qū)之外，am^S表達盒可被用于取消選定任何因為非同源整合事件而不想要的轉化體。事實上，應該可能在氟乙酰胺/腐草霉素選擇平板(甚至不含氯酸鹽)上直接選擇正確的轉化體。進行PCR反應擴增We基因盒并引入必需的Gateway位點(見表4);出于對完整性的考慮，從實施例3中復制兩個側翼區(qū)PCR。表4.用于構建pDESTR4R3NphleoNamdS的寡核苷酸和pENTR載體<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>三個獲得的的載體被用于進行進入pDESTR4-R3的多位點Gateway反應，產生質粒pDESTR4R3NphleoN。使用寡核苷酸SEQIDNO39和40進行PCR擴增后，可以作為Ap"I-五coRI片段從質粒pHELY::Al(WO04106347)中分離P砂cL4-am必片段，并克隆進pDESTR4R3NphleoN的五c(^I-^p"I位點中，產生質粒pDESTR4R3NphleoNamdS。用iV^I線性化該質粒并轉染至Pem'"'〃/MmcAo^ogemmi原生質體(根據標準方案生產，艮口根據Cantoral"1987,Biotechnology5:494-497;Swinkels"g/"1997，WO97/06261,但是使用Glucanex(Sigma)作為分解酶)。轉染后將原生質體涂布在含腐草霉素的選擇性再生瓊脂平板上(在如US2002/0039758中的礦物培養(yǎng)基瓊脂上，不含苯乙酸但是補充有1M蔗糖、15g/L用于固化的瓊脂和50mg/L腐草霉素)。孢子形成后在乙酰胺和氟乙酰胺瓊脂平板(WO9706261)上檢驗mw必基因的不存在。使用兩個特異的引物組通過PCR進行最終的檢驗，所述引物組應當僅在帶有定向刪除的突變體中給出片段(圖6)。通過使用寡核苷酸SEQIDNO41和42檢驗左側翼的整合，同時使用寡核苷酸SEQIDNO43和44檢驗右側翼的整合。所有的腐草霉素抗性菌落和不利用am^S的菌落顯示具有朝向niaD基因座的基因耙向。對于WT而言，95個腐草霉素抗性菌落中僅有l(wèi)個也是不利用am^S"的。因此，通過使用具有改進的HR/NHR比例和能夠被用作可選擇標記物的第二DNA片段的菌株的組合，基因靶向效率從1.1%(WT)被提高至100%(/^//4和/^^突變體二者)，所述菌株。從兩個實驗中均純化了具有正確m'"D刪除的隔離群，分別稱作HTAN禾QHTBN。這些結果顯示了組合具有改進的HR/NHR比例的菌株和使用第二可選擇標記物的有益作用。WT菌株中的基因靶向頻率為1%左右(實施例3)。具有改進的HR/NHR比例、但是未用第二可選擇標記物轉化的菌株顯示47-56%的正確基因靶向(實施例3)。具有正常的HR/NHR比例(即WT菌株)、但是用第二可選擇標記物轉化的菌株顯示16-63%的正確基因靶向(實施例1和2)。然而，當使用具有改進的HR/NHR比例和第二可選擇標記物的菌株時，獲得了驚人的100%正確的基因靶向(本實施例)。實施例5使用第二可選擇標記物在尸em'd〃^mcAr^oge腦m的Ad/g突變體菌株中改進的同源重組效率通過使用名為pDONR201fl/w必ni800和pDONR201flw^Sni1200的兩個構建體(圖7)獲得非常有效的基因靶向的第二個例子，所述基因靶向通過組合具有最優(yōu)化的同源重組頻率的作用菌株和使用第二可選擇標記物完成。使用實施例4的HTBN菌株作為受體菌株。通過并僅通過精確的基因靶向恢復菌株HTBN中缺乏的m'oD基因的441bp中心部分。為此，重建m'^D片段被800bp(如在pDONR201flm必ni800中)或1200bp(如在pDONR201am^Sni1200中)的同源耙向序列側翼包圍。另外，am^S表達盒被用作同源側翼區(qū)外的第二可選擇標記物。首先，從pHELY-Al中PCR擴增am^S表達盒并通過Gateway技術克隆進pDONR201載體中，得到質粒pDONR201-a附必(表5)。其次，從基因組DNA中PCR擴增(表5)，用MM禾卩消化并克隆進pDONR201am^S中，分別產生質粒pDONR201amc^ni800禾卩pDONR201amG^ni1200后獲得2041(=800+441+800)和2841(=1200+441+1200)的恢復片段。表5.用于PCR擴增的寡核苷酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>用M/mI或MiJ線性化載體pDONR201am必W800和pDONR201am必hi1200，并轉染進Pew'c/肌wwcAowge"Mm原生質體(根據標準方案生產，即根據Cantoral"a/.,1987，Biotechnology5:494-497;Swinkels"a/"1997,WO97/06261,但是使用Glucanex(Sigma)作為分解酶)。轉染后將原生質體涂布在用硝酸鹽作為唯一氮源的選擇性再生瓊脂平板上(每升NaCl，3.0g;KH2P04,1.0g;FeS04.7H20,10.0mg;MgS04.7H20，0.5mg;葡萄糖，10.0g;蔗糖，342.0g;OxoidAgar,15.0g;NaN03，1g;1M磷酸鹽緩沖液pH6.8,10ml)。獲得了H^—個轉化體(見表6)并將其轉移至新鮮的平板(無蔗糖誘導孢子形成)上。孢子形成后在乙酰胺瓊脂平板(見W09706261)上檢驗amc^基因的不存在，轉化體均不能夠生長，表明發(fā)生了非同源重組且僅獲得100%的正確基因靶向。結果清楚地表明組合具有改進的HR/NHR比例的菌株和使用第二可選擇標記物的有益效應。WT菌株中的基因靶向頻率為1%左右(見實施例3)。具有改進的HR/NHR比例、但是未用第二可選擇標記物轉化的菌株顯示47-56%的正確基因靶向(見實施例3)。具有正常的HR/NHR比例(即WT菌株)、但是用第二可選擇標記物轉化的菌株顯示16-63%的正確基因耙向(實施例1和2)。然而，當使用具有改進的HR/NHR比例和第二可選擇標記物時，獲得了驚人的100%正確的基因靶向(本實施例)。表6.在菌株HTBN中恢復441bp中心niaD片段后獲得的轉化體。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權利要求1.構建真核細胞的方法，所述真核細胞染色體DNA序列中的靶序列被置換為想要的置換序列，所述方法包括修飾對NHR具有偏好的親本真核細胞，提供與所述親本細胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核細胞，提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置換序列，該置換序列5’和3’側的側翼是與靶序列側翼的染色體DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表達盒，所述表達盒包含編碼選擇標記物的基因和與之可操作地連接的、在真核細胞中有功能的調節(jié)序列；用所述DNA分子轉化所述經修飾的真核細胞；培養(yǎng)所述細胞，獲得經轉化的后代細胞，所述后代細胞染色體中插入了所述DNA分子，通過表達所述第二標記物，取消選定其中所述DNA分子通過非同源重組事件被插入所述染色體中的后代細胞；和獲得其中所述染色體DNA序列中的所述靶序列被所述想要的置換序列置換的細胞。2.根據權利要求1的方法，其中對NHR具有偏好的所述親本真核細胞是具有下述HR/NHR比例的真核細胞，所述比例S0.5，優(yōu)選地^0.2，更優(yōu)選地SO.l，最優(yōu)選地S0.05。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述HR/NHR比例被提高至少2倍，優(yōu)選地至少4倍。4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中通過提高HR途徑的效力和/或降低NHR途徑的效力來達成對所述親本真核細胞的修飾。5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中通過下調、優(yōu)選地滅活NHR途徑中涉及的酵母基因〖t/70、Kt/柳、WD50、Mi五〃、Z^S2、ZJG4、￡/F7、AS7/和/或S/i^的等價物，來達成對所述親本真核細胞的修飾。6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中所述置換序列側翼的所述基本同源的DNA序列與所述靶序列側翼的染色體DNA序列在不多于3kb的區(qū)域上具有至少80%的同一性程度。7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述置換序列包含選擇標記物、經修飾的耙序列版本和/或存在于所述真核細胞基因組中的感興趣的序列的額外拷貝。8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中所述選擇標記物表達盒的所述調節(jié)序列對所述真菌細胞是異源的。9.根據權利要求1-8中任一項的方法，其中所述選擇標記物表達盒的所述調節(jié)序列包含組成型或誘導型啟動子。10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述選擇標記物是毒素。11.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述選擇標記物是有條件的選擇標記物。12.根據權利要求1-11中任一項的方法，其中所述選擇標記物是由t/"基因編碼的白喉毒素A、由基因編碼的硝酸鹽還原酶、由基因編碼的乳清酸核苷-5，-單磷酸鹽脫羧酶、由"w^S基因編碼的乙酰胺酶或由汰基因編碼的胸苷激酶。全文摘要本發(fā)明公開了構建真核細胞的方法，所述真核細胞染色體DNA序列中的靶序列被置換為想要的置換序列，所述方法包括修飾對NHR具有偏好的親本真核細胞，提供與親本細胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核細胞；提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置換序列，該置換序列5’和3’側的側翼是與靶序列側翼的染色體DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表達盒，所述表達盒包含編碼選擇標記物的基因和與之可操作地連接的、在真核細胞中有功能的調節(jié)序列；用DNA分子轉化經修飾的真核細胞；培養(yǎng)細胞，獲得經轉化的后代細胞，所述后代細胞染色體中插入了所述DNA分子，通過表達選擇標記物，取消選定其中DNA分子通過非同源重組事件被插入染色體中的后代細胞；和獲得其中染色體DNA序列中的靶序列被想要的置換序列置換的細胞。文檔編號C12N15/90GK101421401SQ200780012737公開日2009年4月29日申請日期2007年3月14日優(yōu)先權日2006年4月8日發(fā)明者海瑟里恩·圖-里爾,理查德·克爾曼,馬可·亞歷山大·伯格·范德申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司