專利名稱：：二價(jià)ErbB配體結(jié)合分子及其制備和使用方法二價(jià)ErbB配體結(jié)合分子及其制備和使用方法背景受體酪氨酸激酶參與刺激許多癌癥的生長。通常，受體酪氨酸激酶是由下述組分組成的糖蛋白(1)一個(gè)能結(jié)合特異性配體的胞外結(jié)構(gòu)域，(2)—個(gè)跨膜區(qū)域，(3)—個(gè)近膜結(jié)構(gòu)域，受體在這里可以被例如蛋白磷酸化所調(diào)節(jié)，(4)一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，它是受體的酶組分，和(5)—個(gè)羧基末端尾。對(duì)于許多實(shí)體瘤，ErbB家族的I型受體酪氨酸激酶構(gòu)成一個(gè)重要的受體類別，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮閷?dǎo)細(xì)胞生長、分化和存活中的重要性。該受體家族的成員包括ErbBl(也稱作HER1)，ErbB2(HER2/neu),ErbB3(HER3)，和ErbB4(HER4)。這些受體酪氨酸激酶在許多組織中廣泛表達(dá)，所述組織包括上皮、間質(zhì)和神經(jīng)元組織。已經(jīng)將ErbB2或ErbBl的過表達(dá)與有些乳腺癌和多種其它惡性胂瘤中的較差臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。在它們的無活性狀態(tài)，通常認(rèn)為ErbB受體作為單體存在。在結(jié)合它們各自的配體后，可以在受體內(nèi)發(fā)生構(gòu)象變化，這可以導(dǎo)致受體同型-和異型二聚體(即激活的受體形式)的形成。配體結(jié)合和隨后的同型-或異型二聚化可以通過自磷酸化和轉(zhuǎn)磷酸作用來刺激受體的催化活性，也就是說，單個(gè)單體會(huì)在酪氨酸殘基上彼此磷酸化。這可以導(dǎo)致對(duì)受體催化活性的進(jìn)一步刺激。另外，有些磷酸化的酪氨酸殘基會(huì)為下游信號(hào)傳導(dǎo)分子提供停泊位點(diǎn)。ErbB受體的激活可以導(dǎo)致多種不同效應(yīng)中的任一種，所述效應(yīng)例如增殖和細(xì)胞存活。這些不同的結(jié)果通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)生，所述途徑依賴于結(jié)合特定受體的特定配體。配體結(jié)合決定了最終形成的同型-或異型二聚體的群體。許多研究已經(jīng)表明，結(jié)合的配體的類型和隨后形成的同型-或異型二聚體的類型，會(huì)導(dǎo)致激活的ErbB受體上酪氨酸殘基的差異磷酸化。作為一個(gè)實(shí)例，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白("NRG"，也稱作調(diào)蛋白)是一個(gè)可以結(jié)合ErbB受體并引發(fā)多種應(yīng)答的配體家族，所述應(yīng)答包括增殖、分化、存活和遷移。NRG1P和NRG2I3可以結(jié)合ErbB3，并誘導(dǎo)ErbB2/ErbB3異型二聚體，但是，僅NRG1P會(huì)剌激培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的分化。原因是，與結(jié)合NRG2(3時(shí)相比，當(dāng)結(jié)合NRG1P時(shí)不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)分子向激活的ErbB2/ErbB3異型二聚體的募集。例如，盡管NRG1P和NRG2p會(huì)導(dǎo)致類似的ErbB2酪氨酸磷酸化總水平，僅NRG1P導(dǎo)致PI3K(p85)、SHP2、Grb2和She向受體的結(jié)合?，F(xiàn)有的基于受體酪氨酸激酶的治療劑通常落入2類。小分子抑制劑，例如拉帕替尼(Lapatinib)，會(huì)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域并阻止ATP結(jié)合和受體磷酸化。第二類治療劑是基于單克隆抗體，例如赫賽汀(曲妥珠單抗)，其識(shí)別和結(jié)合特定受體的胞外配體結(jié)合域，從而觸發(fā)受體降解。這2類療法均已經(jīng)表現(xiàn)出功效。但是，顯然多種因素會(huì)影響每種療法的相對(duì)功效。例如，已知高水平的IGF-1R會(huì)干擾赫賽汀TM治療，但是不會(huì)干擾拉帕替尼治療。盡管它們的作用機(jī)理不同，赫賽汀TM和拉帕替尼都耙向及結(jié)合受體。激活性配體的過表達(dá)可以造成類似于失調(diào)受體的失控細(xì)胞增殖，這也變得清楚。在這樣的情況下，干擾激活性配體與它的受體的結(jié)合，可以提供可能更有效或可強(qiáng)化單獨(dú)的現(xiàn)有的基于受體的療法或其它療法的新治療策略。千擾配體與ErbB3的結(jié)合的治療劑可能是特別有效的。ErbB3與其它EGFR家族中的受體的不同之處在于，它的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域是功能上無活性的；但是，ErbB2/ErbB3異型二聚體會(huì)發(fā)送ErbB家族的任何同型-或異型二聚體組合的最強(qiáng)效絲裂信號(hào)。因此，ErbB3是一種重要靶物，但也是不能通過靶向激酶區(qū)域的小分子抑制的乾物。因?yàn)樵谛纬杉せ畹漠愋投垠w之前，ErbB3需要激活性配體例如調(diào)蛋白(NDF)，可以干擾ErbB3受體配體的結(jié)合的分子可能被用于阻斷或干擾ErbB二聚體和異型二聚體的形成。這樣的分子的一個(gè)實(shí)例會(huì)是受體分子的胞外域的可溶部分，其保留緊密的配體結(jié)合親和力，因而可以"捕獲"配體，并有效地降低它們的濃度，使它們不能激活ErbB3受體。8存在幾種試圖利用該誘捕或"引誘"現(xiàn)象的治療劑。例如，EnbreT(依那西普-Amgen)是結(jié)合并捕獲促炎癥配體TNFa的可溶修飾形式的TNFR受體。另外，稱作VEGFTrap的VEGFR1和VEGFR2受體的可溶融合蛋白，目前在臨床試驗(yàn)中用于治療黃斑變性和幾種形式的癌癥(RegeneronPharmaceuticals)。ErbB3誘捕分子(trap)也已經(jīng)表現(xiàn)出在經(jīng)NDF處理的細(xì)胞中增強(qiáng)雙重EGFR/ErbB2抑制劑的作用和逆轉(zhuǎn)的GW2974(ErbBl和ErbB2的小分子抑制劑)抗性方面的體外效力。所有目前批準(zhǔn)的ErbB抑制劑都耙向EGFR或ErbB2或二者。但是，目前批準(zhǔn)的療法不會(huì)同時(shí)干擾配體與多個(gè)ErbB受體的結(jié)合。顯然，需要可以用于隔離(sequester)受體配體(例如ErbB配體)并從而阻斷配體與多個(gè)ErbB受體的結(jié)合和隨后的受體激活的新的結(jié)合分子。能結(jié)合所有已知的ErbB配體的結(jié)合分子會(huì)是特別有用的。理想地，如果可以制備這樣的分子，它將會(huì)是單個(gè)共價(jià)結(jié)合的分子，從而僅為單個(gè)分子。這樣的分子會(huì)簡(jiǎn)化生產(chǎn)和給藥方案，當(dāng)用于隔離受體配體時(shí)，會(huì)在理論上提供最大益處。這樣的分子會(huì)提供優(yōu)異的治療功效，尤其對(duì)于過表達(dá)如TGFot和NDF等ErbB配體的腫瘤。簡(jiǎn)述公開了新的二價(jià)的基于ErbB受體的配體結(jié)合分子，以及它們的制備方法和用途。所述結(jié)合分子是由重組DM分子表達(dá)的蛋白。該蛋白可以含有2個(gè)結(jié)合ErbB激活性配體的ErbB胞外結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)合域起誘捕分子的作用，以結(jié)合和隔離配體，從而使它們不能用于結(jié)合細(xì)胞的ErbB受體。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，ErbB受體的胞外域的多個(gè)部分可以在單個(gè)多肽中共價(jià)連接到一起，使得兩個(gè)結(jié)合部分都保留對(duì)它們各自配體的實(shí)質(zhì)親和力，所以它們可以用于結(jié)合和捕獲ErbB配體，如在多種結(jié)合測(cè)定中的任何測(cè)定中的結(jié)合所證實(shí)的，所述測(cè)定包括ELISA測(cè)定，在Biacore裝置上進(jìn)行的測(cè)定等。所公開的蛋白可以包括幾種ErbB受體的部分，優(yōu)選地將結(jié)合多種或所有已知的ErbB配體。也描述了用公開的分子治療疾病或狀況的方法。通過該公開的方法，可以治療通過去除或抑制ErbB配體可好轉(zhuǎn)、改善或抑制的任何疾病。所述方法通常包括，通過將ErbB配體捕獲在公開的結(jié)合分子中，阻止它們與受體的結(jié)合。在一種方法中，這可以通過給需要治療的受試者施用本文公開的二價(jià)結(jié)合分子來實(shí)現(xiàn)。本文描述了其它的特征和優(yōu)點(diǎn)，并將從下面的詳述和附圖中明白。附圖簡(jiǎn)述圖l:例示了ErbB單誘捕分子作用機(jī)理和下一代的ErbB雙誘捕分子。圖2:例示了當(dāng)與ErbB單誘捕分子治療一起使用時(shí)，GW2974細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。圖3:提供了從表達(dá)下述構(gòu)建體的293T細(xì)胞制備的裂解物的蛋白印跡的照片1.pEF-ECD3-IRES-P(含有ErbB3受體的胞外域的一部分的單誘捕分子)，2.pEF-IRES-P(陰性對(duì)照載體)，3.pEF-ECD13-IRES-P9(含有在多肽的氨基末端側(cè)的ErbBl受體的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端側(cè)的ErbB3受體的胞外域的一部分的雙誘捕分子)，4.pEF-ECD31-IRES-P(含有在多肽的氨基末端側(cè)的ErbB3受體的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端側(cè)的ErbBl受體的胞外域的一部分的雙誘捕分子)，5.pEF-ECD14-IRES-P(含有在多肽的氨基末端側(cè)的ErbBl受體的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端側(cè)的ErbB4受體的胞外域的一部分的雙誘捕分子)，6.pEF-ECD41-IRES-P(含有在多肽的氨基末端側(cè)的ErbB4受體的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端側(cè)的ErbBl受體的胞外域的一部分的雙誘捕分子)，和7.MDA-MB-468細(xì)胞(陽性抗體對(duì)照)。如實(shí)施例1所述制備構(gòu)建體。用識(shí)別在ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域中的表位的抗體，探測(cè)印跡。圖4:3天后，收集來自表達(dá)不同誘捕分子構(gòu)建體的293T細(xì)胞的培養(yǎng)基。以1:1000稀釋培養(yǎng)基，使用來自R&PSystems的人EGFRDuoSet,—式兩份地對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行ELISA。^吏用Bio-TekEL312e，讀出ELISA測(cè)定。構(gòu)建體如下VC-載體對(duì)照，Her3卜單ErbB3誘捕分子，ECD1-3.p6,ECD3-l.p6,ECD1-4.p5和ECD4-1.p5。如實(shí)施例1所述制備構(gòu)建體。圖5:為了測(cè)試誘捕分子的功能，收集來自293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，過濾，并用新鮮培養(yǎng)基1:1稀釋。該稀釋的條件培養(yǎng)基然后用于培養(yǎng)BT474細(xì)胞。48小時(shí)后，固定細(xì)胞，用在50%甲醇中的1%亞甲藍(lán)溶液染色。在來自下述誘捕分子構(gòu)建體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)BT474細(xì)胞1.pEF-IRES-P(對(duì)照)，2.PEF-ECD13-IRES-P，3.pEF-ECD14-IRES-P,4.pEF-ECD3-IRES-P(單誘捕分子),5.pEF-ECD31-IRES-P和6.pEF-ECD41-IRES-P，構(gòu)建體縮寫在上面圖3中定義。圖6:熱EGF與誘捕分子的交聯(lián)。將二價(jià)和單價(jià)誘捕分子與熱EGF一起溫育，且有/沒有過量的未標(biāo)記的EGF或NDF，隨后與交聯(lián)分子BS3一起溫育。顯示的條帶是與熱EGF交聯(lián)的二價(jià)或單價(jià)誘捕分子。如預(yù)期的，所有二價(jià)誘捕分子結(jié)合EGF，同時(shí)僅ErbBl單價(jià)誘捕分子結(jié)合EGF。如預(yù)期的，冷EGF的加入會(huì)竟?fàn)幍羲姓T捕分子中熱EGF的結(jié)合。令人感興趣地，冷NDF的加入似乎會(huì)干擾ErbBl-ErbB3二價(jià)i秀捕分子中EGF的結(jié)合，但是在ErbB3-ErbBl或ErbB4-ErbBl二價(jià)誘捕分子中則不會(huì)。如實(shí)施例1所述制備構(gòu)建體。圖7:通過Biacore測(cè)得的誘捕分子與特定配體的結(jié)合親和力。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，使用Biacore測(cè)定二價(jià)和單價(jià)誘捕分子對(duì)幾種不同配體的結(jié)合親和力(Kd)。使誘捕分子結(jié)合到Biacore芯片，加入遞增濃度的配體，以測(cè)定誘捕分子和配體之間的結(jié)合親和力。所有二價(jià)誘捕分子都可以結(jié)合ErbBl和ErbB3/ErbB4特異性配體，而單價(jià)誘捕分子僅可結(jié)合它們各自的配體類別。已知全長胞外域具有約412-961nM的對(duì)TGFot的親和力。圖8:在有誘捕分子存在下，標(biāo)記的EGF(1.6ng/ml)與EGFR的結(jié)合。使EGFR結(jié)合到Biacore芯片，然后加入熱EGF。在沒有誘捕分子存在下熱EGF與EGFR的結(jié)合設(shè)定為1。再將3種不同濃度的二價(jià)和單價(jià)誘捕分子加入熱EGF庫(pool),隨后暴露于EGFR結(jié)合的芯片。二價(jià)誘捕分子能減少可利用的熱EGF庫，而相同濃度的單價(jià)ErbBl誘捕分子不能。詳述公開了能結(jié)合多種受體(例如ErbB受體)的配體的共價(jià)連接的二價(jià)結(jié)合分子。優(yōu)選的二價(jià)結(jié)合分子能結(jié)合至少2種不同受體的配體。為了本說明書的目的，這樣的結(jié)合分子稱作"雙誘捕分子"。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子具有對(duì)所有ErbB配體的實(shí)質(zhì)親和力。在圖1中圖解了結(jié)合分子的示例性的實(shí)施方案。圖1也例示了認(rèn)為的這樣的雙重結(jié)合分子的工作機(jī)理。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)結(jié)合不同受體的配體具有實(shí)質(zhì)的結(jié)合親和力的二價(jià)結(jié)合分子。所述二價(jià)結(jié)合分子可以包括受體的胞外域的部分，且優(yōu)選地共價(jià)連接在單個(gè)多肽序列中。在由2種受體結(jié)合的配體譜重疊的情況下，由這些受體的部分制備的二價(jià)結(jié)合分子的每個(gè)結(jié)合部分可以結(jié)合類似的或相同的配體。優(yōu)選地，二價(jià)結(jié)合分子在水性溶液中可溶。在一個(gè)實(shí)施方案中，二價(jià)結(jié)合分子的每個(gè)結(jié)合部分可以是含有受體的胞外結(jié)構(gòu)域的可溶部分。任何合適的受體都可以用于結(jié)合分子中。合適的受體通常含有細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其含有配體結(jié)合必需的且足夠的所有決定簇。在一個(gè)實(shí)施方案中，ErbB受體家族的多個(gè)成員可以用于創(chuàng)建二價(jià)結(jié)合分子。因而，二價(jià)結(jié)合分子可以是ErbB受體的胞外配體結(jié)合域的組合，例如ErbBl和ErbB3，ErbBl和ErbB4或其它組合。結(jié)合域可以以任何次序存在于多肽鏈上，只要維持對(duì)受體配體的合適結(jié)合親和力即可。為了本申請(qǐng)的目的，合適的結(jié)合親和力是高得足以捕獲在生理基質(zhì)中的ErbB配體的親和力。優(yōu)選地，解離常數(shù)將不高于天然受體的解離常數(shù)約100倍至約1000倍。更優(yōu)選地，在納摩爾范圍或更低的解離常數(shù)是優(yōu)選的。盡管如此，足以結(jié)合和捕獲ErbB配體、從而阻止或干擾它們與ErbB受體結(jié)合的任何親和力，適用于公開的組合物中，且可以用于公開的方法中。已知ErbBl、ErbB2、ErbB3和ErbB4的完整核苷酸序列，且可以在Genbank中找到，分別是登錄號(hào)NM-005228(ErbBl)，登錄號(hào)NM—004448(ErbB2),登錄號(hào)M29366或NM-001982(ErbB3)和登錄號(hào)M—005235(ErbB4)。為了本說明書的目的，全長EGFR胞外域是指由ErbBl的氨基酸殘基1-621或EGF受體家族的其它成員的等同殘基組成的胞外域。也已知ErbB受體家族的全長胞外域的氨基酸序列，下面包括了這些序列的部分ErbBl氨基酸殘基1-532的SEQIDNO.2，ErbBl氨基酸殘基1-500的SEQIDNO.22，ErbB3氨基酸殘基1-531的SEQIDNO6，ErbB3氨基酸殘基1-499的SEQIDNO.24，ErbB4氨基酸殘基1-528的SEQIDNO8，和ErbB4氨基酸1-496的SEQIDNO.26。在每個(gè)序列中，位置編號(hào)"l"是在信號(hào)肽之后的第一個(gè)氨基酸。編碼這些氨基酸的對(duì)應(yīng)的核苷酸序列分別可見SEQIDNO.2，6和8。ErbB受體的全長胞外域含有4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，稱作Ll，CR1,L2和CR2，其中L和CR分別是"大"和"富含cys，，的首字母簡(jiǎn)略縮寫。已經(jīng)測(cè)定了ErbBl、ErbB2、ErbB3和ErbB4的胞外域的氨基酸序列比對(duì)。參見美國專利7>開號(hào)2006/0234343，圖U和1B。認(rèn)為ErbB受體的CR2亞結(jié)構(gòu)域連接配體結(jié)合域(L1,CR1和L2)和跨膜區(qū)，由7個(gè)額外模塊組成，所述模塊由2或3個(gè)氨基酸殘基的接頭連接到一起，并以半胱氨酸殘基為界。對(duì)于ErbBl,這些模塊分別從氨基酸位置482-499，502-511，515-531,534-555,558-567，571-593，和596-612(對(duì)于模塊1-7)延伸。對(duì)于ErbB2，這些模塊分別從490-507,510-519，523-539,542-563，566-575，579-602和605-621(對(duì)于模塊l-7)延伸。對(duì)于ErbB3，這些模塊分別從481-498，501-510,514-530，533-554，557-566，570-591,和594-610(對(duì)于模塊1-7)延伸。對(duì)于ErbB4，這些模塊分別從478-495,498-507，511-527,530-552，555-564，568-589，和592-608(對(duì)于模塊1-7)延伸。通過任何合適的重組DM技術(shù)，可以制備ErbB胞外域的合適部分，如本領(lǐng)域已知的，并在本文的實(shí)施例中描述。例如，現(xiàn)在可以定制編碼希望的胞外域或胞外域部分的核苷酸序列，連接到一起，并克化表達(dá)蛋白的細(xì)胞，然后可以從細(xì)胞或細(xì)胞上清液純化結(jié)合分子。胞外域可以包括每個(gè)受體的全長胞外域。或者，胞外域可以在氨基或羧基末端截短。在氨基末端，胞外域可以始于例如位置1，2，3，4，5，6，7，8，9,IO或更高的位置，只要不實(shí)質(zhì)性減弱所得到的結(jié)合部分的結(jié)合活性。在羧基末端，胞外域可以終止在第7個(gè)模塊、第6個(gè)模塊、第5個(gè)模塊、第4個(gè)模塊、第3個(gè)模塊、第2個(gè)模塊、第1個(gè)模塊之后或之內(nèi)、甚至在第1個(gè)模塊之前，例如參考ErbBl，在氨基酸序號(hào)50Q,512，532，556,568，594，613，對(duì)于ErbB3和ErbB4在對(duì)應(yīng)位置。因而，對(duì)于ErbBl,可以使用例如氨基酸1-532[SEQIDNO2]或1-500[SEQIDNO22〗。對(duì)于ErbB3，可以^使用氨基酸1-499[SEQIDNO.24]或1-531[SEQIDN06],以及其它序列。對(duì)于ErbB4，可以使用氨基酸1-496[SEQIDN026]或1-528[SEQIDNO8]，以及其它序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以修飾結(jié)合部分之一或二者的氨基酸序列，條件是，該修飾不會(huì)不利地影響結(jié)合部分對(duì)它的配體的結(jié)合親和力。例如，通過制備殘基或序列的不同置換或刪除結(jié)合活性不需要的末端或內(nèi)部殘基或序列，可以構(gòu)建經(jīng)修飾的結(jié)合部分。一般而言，置換應(yīng)當(dāng)保守地進(jìn)行；例如，最優(yōu)選的置換氨基酸是具有與要替換的殘基類似的生理化學(xué)特征的那些。類似地，當(dāng)采用刪除或插入策略時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮刪除或插入對(duì)生物活性的潛在影響。為了保持結(jié)合部分的生物活性，刪除和置換優(yōu)選地產(chǎn)生同源的或保守置換的序列，這意味著給定殘基被替換為生物學(xué)類似的殘基。保守置換的實(shí)例包括將一個(gè)脂族殘基置換為另一個(gè)，例如將Ile,Val，Leu，Met或Ala彼此置換，或?qū)⒁粋€(gè)極性殘基置換為另一個(gè)，例如在Lys和Arg;Glu和Asp;或Gln和Asn之間，眾所周知其它這樣的保守置換，例如，具有類似的疏水性特征的整個(gè)區(qū)域的置換。此外，在人、鼠或其它哺乳動(dòng)物EGFR之間的特定氨基酸差異，提示可以在ErbB結(jié)合部分中產(chǎn)生、而不改變結(jié)合部分的基本生物特征的其它保守置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，二價(jià)結(jié)合分子可以以下述基序排列B-L-B-F;B-L-rB-F和B-F-B。B代表結(jié)合部分，其可以源自受體。結(jié)合部分可以相同或不同。rB代表結(jié)合部分，其中氨基酸序列反轉(zhuǎn)，使得氨基末端氨基酸變成羧基末端殘基。ErbBl的一個(gè)示例性的序列是SEQIDNO3，它是編碼SEQIDNO.1的一個(gè)這樣的反轉(zhuǎn)序列的核苷酸序列，以提供SEQIDNO.4的氨基酸序列，它是SEQ.IDNO.2的序列的反轉(zhuǎn)序列。根據(jù)需要，可以為ErbB3和ErbB4構(gòu)建類似的反轉(zhuǎn)。這樣的反轉(zhuǎn)序列可以定位作為羧基末端結(jié)合部分，以模仿受體如在膜中發(fā)現(xiàn)的那樣的結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，2個(gè)結(jié)合部分是不同的。合適的排列包括，例如，Bl-L-B2-F，B2-L-B1-F，B1-F-B2，B2-F-B1。在具體實(shí)施方案中，B1和B2是不同的，是ErbBl，ErbB3和ErbB4的胞外域的部分。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，Bl和B2分別是ErbBl和ErbB4。更具體地，對(duì)于ErbBl，氨基酸1-500和1-532可以用于形成有活性的結(jié)合分子，對(duì)于ErbB4，可以使用氨基酸1-496和1-528，以便當(dāng)將ErbBl和ErbB4連接在單個(gè)多肽中時(shí)，它們形成對(duì)ErbBl和ErbB4配體都具有實(shí)質(zhì)親和力的二價(jià)結(jié)合分子，無論ErbBl是位于ErbB4的氨基還是羧基末端側(cè)。當(dāng)然，Bl或B2可以是任何的其它受體或配體結(jié)合蛋白，且不一定從氨基酸序號(hào)1開始。"L"是一個(gè)可選存在的連接部分，其可以用于連接結(jié)合部分。許多合適的接頭分子是已知的，且可以使用。優(yōu)選地，接頭是非免疫原性的。關(guān)于接頭和鑒別希望的接頭的方法，參見，例如，George等人(2003)ProteinEngineering15:871-879，其通過參考特別地并入本文中。接頭序列可以包括一個(gè)或多個(gè)天然連接到結(jié)合部分上的氨基酸，且可以添加，以提供特別希望的目標(biāo)部位，允許組分結(jié)構(gòu)域形成最佳的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或增強(qiáng)組分與它的靶分子的相互作用。一個(gè)簡(jiǎn)單的接頭是(Gly4Ser)x，其中"X"可以是1到約10或更高的任何數(shù)字，在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)使用其中"X"是3的接頭[SEQIDNO:29]。但是，接頭也可以是酰胺鍵。"F"是一個(gè)可選存在的融合伴侶，可以是增強(qiáng)二價(jià)結(jié)合分子的功能的任何組分。合適的融合伴侶可以增強(qiáng)二價(jià)結(jié)合分子的生物活性，輔助它的產(chǎn)生和/或回收，或通過例如增強(qiáng)它的血清半衰期、組織滲透性、免疫原性的缺乏或穩(wěn)定性，增強(qiáng)融合多肽的藥理學(xué)性質(zhì)或藥代動(dòng)力學(xué)謙。當(dāng)融合伴侶是血清蛋白或其片段時(shí)，它可以是a-l-微球蛋白，AGP-1,血清類粘蛋白，oc-l-酸性糖蛋白，維生素D結(jié)合蛋白(DBP),血液結(jié)合素，人血清白蛋白(hSA)，轉(zhuǎn)鐵蛋白，鐵蛋白，afamin,觸珠蛋白，甲胎蛋白，甲狀腺球蛋白，oc-2-HS-糖蛋白，p-2-糖蛋白，透明質(zhì)烷-結(jié)合蛋白，突觸融合蛋白，C1R,Clqa鏈，半乳凝素3-Mac2結(jié)合蛋白，纖維蛋白原，多聚Ig受體(PIGR)，ot-2-巨球蛋白，尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，觸珠蛋白，IGFBP，巨噬細(xì)胞清除劑受體，纖連蛋白，巨蛋白，F(xiàn)c(尤其包括IgGFc結(jié)構(gòu)域)，oc-l-抗糜蛋白，oc-l-抗胰蛋白酶，抗凝血酶III,載脂蛋白A-I，載脂蛋白B，p-2-微球蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，補(bǔ)體成分C3或C4，CI酯酶抑制劑，C反應(yīng)蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，和蛋白C。在需要時(shí)，包含融合伴倡組分，可以延長本發(fā)明的融合多肽的血清半衰期。對(duì)于ErbB受體，在下面的表1中顯示了已知的配體和受體結(jié)合特異性。因而，ErbBl和ErbB3結(jié)合部分的組合可以用于創(chuàng)建具有對(duì)EGF、TGFa、HB-EGF、P動(dòng)物纖維素(Betacellulin)、雙調(diào)蛋白、表皮調(diào)節(jié)素(Epiregulin)、Epigen、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白lct、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2a和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2P的特異性的二價(jià)結(jié)合分子。ErbBl和ErbB4的結(jié)合域的組合具有對(duì)EGF、TGFot、HB-EGF、P動(dòng)物纖維素、雙調(diào)蛋白、表皮調(diào)節(jié)素、Epigen、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白la、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2a、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2|3、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4的結(jié)合親和力，這包括所有已知的ErbB配體。表1_<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二價(jià)結(jié)合分子還將通常包括在它們的氨基末端處的信號(hào)序列?？梢允褂萌魏魏线m的信號(hào)序列，其中的許多是已知的。例如，在二價(jià)結(jié)合分子的第一個(gè)位置中的ErbB胞外域可以含有它自己的天然信號(hào)肽?；蛘?，可以修飾該信號(hào)肽，以符合共有Kozak序列(GCCGCCACCATGG)，其中ATG是ErbB胞外域的起始密碼子，在+4的位置改變成G，以符合共有Kozak序列。在下面的表2中可以發(fā)現(xiàn)合適的序列。表2____信號(hào)肽序列合適的ErbBl信號(hào)肽正常核苷酸序列ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCT[SEQIDNO.9]正常氨基酸序列MRPSGTAGAALLALLAALCPASRA[SEQIDNO.10]修飾的核苷酸序列ATGGGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCT[SEQID亂11]修飾的氨基酸序列MGPSGTAGAALLALLAALCPASRA[SEQIDNO12]合適的ErbB3信號(hào)肽正常核苷酸序列ATGAGGGCGAACGACGCTCTGCAGGTGCTGGGCTTGCTTTTCAGCCTGGCCCGGGGC[SEQIDNO13]正常氨基酸序列MRANDALQVLGLLFSLARG[SEQIDNO14]修飾的核苷酸序列ATGGGGGCGAACGACGCTCTGCAGGTGCTGGGCTTGCTTTTCAGCCTGGCCCGGGGC修飾的氨基酸序列MGANDALQVLGLLFSLARG[SEQIDNO16]合適的ErbB4信號(hào)肽正常核苷酸序列ATGAAGCCGGCGACAGGACTTTGGGTCTGGGTGAGCCTTCTCGTGGCGGCGGGGACCGTCCAGCCCAGCGATTCT[SEQIDNO17]正常氨基酸序列MKPATGLWVWVSLLVAAGTVQPSDS[SEQIDNO18]修飾的核苷酸序列ATGGGGCCGGCGACAGGACTTTGGGTCTGGGTGAGCCTTCTCGTGGCGGCGGGGACCGTCCAGCCCAGCGATTCT[SEQIDNO19]修飾的氨基酸序列MGPATGLWVWVSLLVAAGTVQPSDS[SEQIDNO20]公開的二價(jià)結(jié)合分子將包括從重組DNA分子表達(dá)的氨基酸序列。如上面指出的，重組DM分子可以包括編碼第一受體蛋白的一部分的第一核苷酸序列和編碼第二受體蛋白的一部分的第二核苷酸序列。受體蛋白可以相同或不同，但是通常優(yōu)選地包括不同的受體蛋白，使得二價(jià)結(jié)合分子會(huì)結(jié)合更廣譜的結(jié)合分子。在這樣的情況下，第一和第二受體蛋白通常從不同的基因編碼?？梢詫⒕幋a二價(jià)結(jié)合部分、可選存在的接頭和可選存在的融合伴侶的核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄和翻譯序列一起克隆進(jìn)重組DM構(gòu)建體，其排列使得二價(jià)結(jié)合分子可以作為單個(gè)多肽鏈在合適的宿主中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的將DNA片段插入栽體中的任何方法，可以用于構(gòu)建在轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)控制下的編碼本發(fā)明的融合多肽的表達(dá)載體。選擇可以用于在合適宿主中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列，是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。可以使用從它們的重組基因產(chǎn)生公開的分子的任何宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括、但不限于，細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在許多情況下，將受體糖基化，糖基化可以影響配體結(jié)合。因而，宿主的選擇可依賴于宿主細(xì)胞產(chǎn)生的糖基化模式?？梢允褂每缮删哂泻线m的結(jié)合親和力的配體結(jié)合分子的任何宿主細(xì)胞。在含有ErbB的結(jié)合分子的情況下，可以使用例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，例如更具體的CHO細(xì)胞。許多合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件是本領(lǐng)域已知的?？梢杂糜诳刂魄逗隙嚯姆肿拥谋磉_(dá)的啟動(dòng)子包括、但不限于，長末端重復(fù)序列；SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域，CMV，M-MuLV，胸苷激酶啟動(dòng)子，金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列；原核表達(dá)載體例如P-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子或tac啟動(dòng)子；來自酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件例如Gal4啟動(dòng)子，ADH，PGK，堿性磷酸酶，和源自諸如彈性蛋白酶I的基因的組織特異性的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。通過允許所產(chǎn)生的雙誘捕分子的穩(wěn)定二價(jià)結(jié)合的任何技術(shù)，可以純化所公開的二價(jià)結(jié)合分子。例如，二價(jià)結(jié)合分子可以作為可溶蛋白或作為包涵體從細(xì)胞回收，通過8M鹽酸胍和透析可以從包涵體中將它們定量提取，如已知的?；蛘撸梢允褂枚r(jià)結(jié)合分子、常規(guī)的離子交換色譜、疏水相互作用色譜、反相色譜或凝膠過濾。也可以使用利用固定化的配體或配體模仿物的親和技術(shù)。使用生物傳感器技術(shù)或通過本領(lǐng)域眾所周知的經(jīng)典結(jié)合測(cè)定例如ELISA,可以測(cè)量二價(jià)結(jié)合分子中候選截短胞外域的結(jié)合親和力和抑制劑效力。二價(jià)結(jié)合分子可以用作單一療法或用于聯(lián)合療法中。在許多實(shí)施方案中，二價(jià)結(jié)合分子可以與一種或多種其它化合物或療法聯(lián)合施用，包括化療劑、手術(shù)、導(dǎo)管裝置和輻照。聯(lián)合療法包括施用含有二價(jià)結(jié)合分子和一種或多種其它試劑的單一藥物給藥制劑；以及將二價(jià)結(jié)合分子和一種或多種其它試劑在其各自分開的藥物給藥制劑中給藥。例如，二價(jià)結(jié)合分子和細(xì)胞毒性劑、化療劑或生長抑制劑可以在單一給藥組合物(例如聯(lián)合制劑)中一起施用給患者，或每種試劑可以在分開的給藥制劑中施用。更具體地，二價(jià)結(jié)合分子可以在聯(lián)合療法中與治療劑(例如拉帕替尼，赫賽汀TM，艾比特思(Erbitux)等)一起使用。在使用分開的給藥制劑的情況下，本發(fā)明的融合多肽和一種或多種其它試劑可以同時(shí)或在分別錯(cuò)開的時(shí)間(即，序貫)施用。圖2證實(shí)了當(dāng)用乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)試時(shí)，幾種二價(jià)結(jié)合分子的體外功效。在圖2的上排，在對(duì)照培養(yǎng)基(上排)或先前用ErbBS配體結(jié)合分子"單誘捕分子"或單價(jià)結(jié)合分子進(jìn)行條件作用的培養(yǎng)基(下排)中培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞。然后將細(xì)胞不作處理、用1jjMGW2974(普通的GWS"01。或用GW2974+NDF(調(diào)蛋白)處理。可以觀察到，ErbB3單誘捕分子增強(qiáng)了雙重抑制劑毒性，并逆轉(zhuǎn)了NDF依賴性的對(duì)雙重抑制劑的抗性。本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的二價(jià)結(jié)合分子。這樣的組合物包含治療有效量的二價(jià)結(jié)合分子和藥學(xué)可接受的載體。術(shù)語"藥學(xué)可接受的"是指被聯(lián)邦或者州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或列在美國藥典或其它公認(rèn)的用于動(dòng)物更特別是人的藥典中。術(shù)語"栽體"是指與治療劑一起施用的稀釋劑、輔劑、賦形劑或介質(zhì)。這樣的藥用載體可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的那些油，例如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。合適的藥物賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，稻米，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，組合物也可以含有小量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠嚢劑、粉劑、持續(xù)釋放制劑等的形式。藥學(xué)可接受的載體包括在制劑中使用的其它成分，例如DPPC，DOPE,DSPC和D0PC?？梢允褂锰烊坏幕蚝铣傻谋砻婊钚詣？梢允褂肞EG(甚至除了它衍生蛋白或類似物的用途之外)?？梢允褂闷暇厶?，例如環(huán)葡聚糖(環(huán)糊精)?？梢允褂媚懼}和其它有關(guān)的增強(qiáng)劑?？梢允褂美w維素和纖維素衍生物。可以使用氨基酸，例如用于緩沖制劑中。藥學(xué)可接受的稀釋劑包括，具有不同內(nèi)容物(例如，Tris-HCl，醋酸鹽，磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的緩沖劑；添加劑例如去污劑和增溶劑(例如，TWEED80，聚山梨酯80)，抗氧化劑(例如，抗壞血酸，偏亞硫酸氫鈉)，防腐劑(例如，硫柳汞，苯甲醇)和填充物(例如，乳糖，甘露醇)；所述材料摻入諸如聚乳酸、聚乙醇酸等聚合化合物的顆粒制劑中，或摻入脂質(zhì)體中。也可以使用玻璃酸，這可以具有促進(jìn)在循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間的作用。這樣的組合物可以影響本發(fā)明的蛋白和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋》丈速率和體內(nèi)清除速率。參見，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd.(1990，MackPuBlishingCo.，Easton，PA18042)第1435-1712頁，其通過參考并入本文中。組合物可以制成液體形式，或可以是干燥的粉末，例如低壓凍干形式。也考慮到可植入的持續(xù)釋放制劑，例如透皮制劑。也考慮到脂質(zhì)體、微嚢或微球、包合復(fù)合物或其它類型的載體。基于本發(fā)明的描述，通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)，可以確定對(duì)于它的目的治療用途有效的活性二價(jià)結(jié)合分子的量。另外，體外測(cè)定可以任選地用于輔助確定最佳劑量范圍。通常，日給藥方案應(yīng)當(dāng)在0.1-1000賴t克活性物/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.1-150微克/kg。有效劑量可以從衍生自體外或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的劑量響應(yīng)曲線推知?？梢詥蝹€(gè)地調(diào)節(jié)給藥量和間隔時(shí)間，以提供足以維持治療效果的化合物血漿水平。在局部給藥或選擇性攝入的情況下，化合物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。主治醫(yī)師考慮會(huì)改變藥物作用的不同因素，例如患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食，疾病的嚴(yán)重性，給藥時(shí)間和其它臨床因素，可以確定在治療方法中涉及的給藥方案。施用的化合物的量當(dāng)然依賴于所治療的受試者、受試者的體重、疾患的嚴(yán)重性、給藥方式和處方醫(yī)師的判斷。在癥狀可檢測(cè)到，或甚至檢測(cè)不到時(shí)，可以間歇地重復(fù)治療。可以單獨(dú)地或與其它藥物組合地提供治療。公開了用于治療需要治療的患者的方法,其包括，得到可結(jié)合ErbB配體的結(jié)合分子，和從血清去除該配體的一部分。本文公開的結(jié)合分子可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法固定化到固體支持物上，例如apheresis(血液成分部分清除)或biocore支持物。當(dāng)將結(jié)合分子固定化在固體支持物上時(shí)，可以使患者的血清或血液接觸在apheresis柱中的所述固體支持物，以從血液中去除所述ErbB配體的一部分。在一種方法中，公開的二價(jià)結(jié)合分子可以用于檢測(cè)ErbB配體的過表達(dá)的診斷方法中。特征在于ErbB受體的過度激活的癌癥，可以由超過相同組織類型的非癌性細(xì)胞中的過度激活造成。這樣的過度激活可以由ErbB受體的過表達(dá)和/或超過正常水平的ErbB配體造成。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)后測(cè)定，以確定ErbB受體的過度激活是否由ErbB配體的過表達(dá)造成。可以用任何檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記二價(jià)結(jié)合分子，例如放射性或?qū)Ρ葮?biāo)記。然后可以使所述分子接觸癌細(xì)胞，并使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來顯現(xiàn)觀察。例如，該方法可以如下進(jìn)行施用二價(jià)結(jié)合分子，它會(huì)結(jié)合待檢測(cè)分子且用檢測(cè)標(biāo)記(例如放射性同位素)予以標(biāo)記，和在外部掃描患者以定位標(biāo)記。實(shí)施例1本實(shí)施例證實(shí)了具有2個(gè)ErbB受體胞外結(jié)構(gòu)域的二價(jià)結(jié)合分子的代表性組合物的構(gòu)建。通過結(jié)合ErbBl和ErbB3或ErbBl和ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域，將ErbB二價(jià)結(jié)合分子設(shè)計(jì)成結(jié)合ErbB家族的所有配體。為每對(duì)設(shè)計(jì)2個(gè)不同的方向。從而制備了下述組合ErbBl-ErbB3，ErbB3-ErbBl，ErbBl-ErbB4和ErbB4-ErbBl。pcDM3.1(+)載體用作克隆載體，以促進(jìn)構(gòu)建體的構(gòu)建，這是因?yàn)樗膹V泛的多克隆位點(diǎn)。首先，將煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識(shí)別序列(ETVRFQG/S)[SEQIDNO:27]的寡核苷酸、隨后為6x組氨酸標(biāo)記和終止密碼子克隆進(jìn)pcDM3.1(+)的Xbal和Apal位點(diǎn)，以產(chǎn)生pcDNA3.1(+)-TH。所述寡核苷酸包括在Apal位點(diǎn)上游的Notl位點(diǎn)，所以該構(gòu)建體最終會(huì)從pcDNA3.1(+)釋放出來。使用具有嵌入Apal位點(diǎn)上游的XbaI位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)的TEV-6xHis-ST0P有義寡核苷酸VCTAGAGAAAACCTGTACTTCCAGTCCCATCATCATCATCATCATTGAGCGGCCGCGGGCC[SEQIDNO28],以及具有嵌入Apal位點(diǎn)上游的Xbal位點(diǎn)和Notl位點(diǎn)的TEV-6xHis-ST0P反義寡核苷酸5'CGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGGGACTGGAAGTACAGGTTTTCT[SEQIDNO30]。將ErbBl或ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的前3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(LI，SI，LII，如已知的)和第4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(SII，如已知的)的第1個(gè)模塊與接頭序列一起克隆進(jìn)pcDM3.1(+)-TH的Nhel和Kpnl位點(diǎn)。具體地，所述接頭序列編碼以下組成的15個(gè)氨基酸的(Gly4Ser)3肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQIDNO:29]。將正向PCR引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增信號(hào)肽加上ErbBl和ErbB4的LI，SI，LII以及SII亞結(jié)構(gòu)域的第1個(gè)才莫塊。如已知的，將共有的"Kozak"序列摻入引物中信號(hào)肽起始密碼子的立即上游。將反向PCR引物設(shè)計(jì)成包括多至(且包含)ErbBl的V500氨基酸和ErbB4的L496氨基酸(在ErbBl的信號(hào)肽后面的亮氨酸定義為Ll氨基酸，在ErbB4的信號(hào)肽后面的谷氨酰胺定義為Ql氨基酸)，其后是Agel位點(diǎn)、(Gly4Serh接頭序列[SEQIDNO29]和Kpnl位點(diǎn)。具有Nhel位點(diǎn)和共有的"Kozak"序列的ErbBl正向引物序列如下AGCTGCTAGCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGCCG[SEQIDNO31]。具有Nhel位點(diǎn)和共有的"Kozak"序列的ErbB4正向引物序列如下5'AGCTGCTAGCGCCACCATGAAGCCGGCGACAGGACTTT[SEQIDNO32]。具有AgeI位點(diǎn)、(Gly4Ser)3接頭序列和Kpnl位點(diǎn)的ErbBl反向引物序列是5'TCTGGTACCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCACCGGTGACGCAGTCCCTGGGCTCCGGGCCC[SEQIDNO33]。具有Agel位點(diǎn)、(Gly4Ser)3[SEQTDNO:29]接頭序列和Kpnl位點(diǎn)的ErbBl反向引物序列是5'TCTGGTACCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCACCGGTCAGACATTGGTCTGGCCCAGGTCCC[SEQIDNO34]。從ErbBl或ErbB4的全長cDM擴(kuò)增胞外結(jié)構(gòu)域。這產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ECD1—GS-TH和pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH。為了構(gòu)建ErbB3構(gòu)建體，通過PCR從全長cDNA擴(kuò)增ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的前3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(L1，SI和LII)和第4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(SII)的第1個(gè)模塊，并克隆進(jìn)pc腿3.1(+)-ECD4-GS-TH的Nhel和Agel位點(diǎn)。如前所述設(shè)計(jì)正向PCR引物，以將Nhel位點(diǎn)和共有的"Kozak"序列摻入ErbB3的信號(hào)肽起始密碼子的立即上游。具有Nhel位點(diǎn)和共有的"Kozak"序列的ErbB3正向引物序列是5'AGCGCTAGCGCCACCATGAGGGCGAACGACGCTCTGCAGG[SEQIDNO35]，具有Agel位點(diǎn)的ErbB3反向引物序列是5'AGCACCGGTCAAGCACTGACCAGGGCCTGGGCCC[SEQIDNO36]。從ErbB3的全長cDNA擴(kuò)增胞外結(jié)構(gòu)域，并用于產(chǎn)生質(zhì)粒pcDM3.1(+)-ECD3-GS-TH。將第2個(gè)ErbB胞外結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)每個(gè)構(gòu)建體。這通過擴(kuò)增ErbBl、ErbB3或ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的前3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(LI，SI和LII)和SII亞結(jié)構(gòu)域的第1個(gè)模塊來實(shí)現(xiàn)。與第一個(gè)位置相比，置于構(gòu)建體的第二個(gè)位置中的胞外結(jié)構(gòu)域之間的唯一差別是，沒有包含信號(hào)肽。設(shè)計(jì)具有Kpnl位點(diǎn)的正向PCR引物，以擴(kuò)增ErbBl、ErbB3或ErbB4的前3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域和第4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的笫1個(gè)模塊。還設(shè)計(jì)具有Xbal位點(diǎn)的反向PCR引物，以擴(kuò)增ErbBl、ErbB3或ErbB4。每個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域的最后一個(gè)氨基酸是V500(Er認(rèn))，L499(ErbB3)和L496(ErbB4)。具有Kpnl位點(diǎn)的ErbBl第二位置正向引物是5'CGGGGTACCCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCC[SEQIDNO37〗。具有Kpnl位點(diǎn)的ErbB3第二位置正向引物是5'CGGGGTACCTCCGAGGTGGGCAACTCTCAGGCAG[SEQIDNO.:38]。具有Kpnl位點(diǎn)的ErbB4第二位置正向引物是5'CGGGGTACCCAGTCAGTGTGTGCAGGAACGG[SEQIDNO.:39]。具有Xbal位點(diǎn)的ErbBl第二位置反向引物是VTGCTCTAGAGACGCAGTCCCTGGGCTCCGGG[SEQIDNO.:40]。具有Xbal位點(diǎn)的ErbB3第二位置反向引物是5'TGCTCTAGACAAGCACTGACCAGGGCCTGGGCCC[SEQIDNO.:41]。具有Xbal位點(diǎn)的ErbB4第二位置反向引物是5'TGCTCTAGACAGACATTGGTCTGGCCCAGGT[SEQIDNO.:42]。將ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-TH和pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH的第二位置，以產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-ECD1-TH和pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-ECDl-TH。將ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)pcDM3.1(+)-ECD1-GS-TH的第二位置，以產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ECDl-GS-ECD3-TH。將ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域克隆進(jìn)pcDNA3.1(+)-ECDl-GS-TH的第二位置，以產(chǎn)生質(zhì)粒pc薩3.1(+)-ECD1—GS-ECD4-TH。通過直接測(cè)序，驗(yàn)證所有構(gòu)建體。將雙順反子質(zhì)粒pEF-IRES-P用于表達(dá)，其含有延伸因子loc(EFla)啟動(dòng)子和由IRES序列表達(dá)的嘌呤霉素抗性基因(在多克隆位點(diǎn)后)。通過用Nhel和Notl進(jìn)行限制內(nèi)切核酸酶消化，從pcDNA3.1(+)釋放所有4個(gè)雙誘捕分子構(gòu)建體，并克隆進(jìn)pEF-IRES-P中的相同位點(diǎn)。這產(chǎn)生質(zhì)粒pEF-ECD13-IRES-P，pEF-ECD31-IRES-P，pEF-ECD14-IRES-P和pEF-ECD41-IRES-P，它們分別用于表達(dá)ErbBl-ErbB3，ErbB3-ErbBl，ErbBl-ErbB4，和ErbB4-ErbBl蛋白，第一結(jié)合部分位于靠近蛋白的氨基末端。實(shí)施例2本實(shí)施例證實(shí)了在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由重組DNA分子表達(dá)雙誘捕分子及其活性形式的純化。用Pvul消化來自實(shí)施例1的所有4個(gè)構(gòu)建體，以產(chǎn)生線性重組DM分子，其更適合于穩(wěn)定地整合進(jìn)細(xì)胞基因組DNA。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，將4種線性化的雙誘捕分子轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，然后在逐漸升高濃度的嘌呤霉素中選擇，以產(chǎn)生穩(wěn)定整合了構(gòu)建體的細(xì)胞群體?？梢酝ㄟ^不同方式評(píng)判構(gòu)建體的表達(dá)，例如蛋白印跡，以檢測(cè)在分泌之前細(xì)胞中誘捕分子的水平，如圖3所示，或ELISA，如圖4所示，以測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中結(jié)合分子的濃度。ELISA測(cè)定用于篩選大量單個(gè)細(xì)胞，以建立克隆衍生的表達(dá)最高水平誘捕分子的細(xì)胞系。結(jié)合分子含有組氨酸標(biāo)記，這允許通過簡(jiǎn)單的親和純化方法純化所述分子。為了測(cè)試結(jié)合分子的功能，收集來自293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，過濾，并用于培養(yǎng)BT474細(xì)胞。在用來自表達(dá)pEF-ECD14-IRES-P構(gòu)建體的293T細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的BT474細(xì)胞中，在48小時(shí)后觀察到細(xì)胞數(shù)的顯著減少。參見圖5。權(quán)利要求1.二價(jià)結(jié)合分子，其在單個(gè)共價(jià)結(jié)合的蛋白分子中的分開的結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)第一和第二ErbB配體的結(jié)合親和力。2.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子可溶于水性溶液中。3.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子另外包含ErbB受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB受體的配體。4.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbBl的配體。5.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbBl的配體，其中所述部分包括ErbB受體的氨基酸1-500。6.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbBl的配體，其中所述部分包括ErbBl受體的氨基酸1-532。7.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbBl的配體，其中所述部分包括ErbBl受體的氨基酸1-621。8.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB3的配體。9.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB3的配體，其中所述部分包括ErbB3受體的氨基酸1-499。10.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB3的配體，其中所述部分包括ErbB3受體的氨基酸1-531。11.權(quán)利要求l的結(jié)合分子，其另外包含ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB3的配體，其中所述部分包括ErbB3受體的氨基酸1-624。12.權(quán)利要求l的結(jié)合分子，其另外包含ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB4的配體。13.權(quán)利要求l的結(jié)合分子，其另外包含ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB4的配體，其中所述部分包括ErbB4受體的氨基酸1-496。14.權(quán)利要求l的結(jié)合分子，其另外包含ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB4的配體，其中所述部分包括ErbB4受體的氨基酸1-528。15.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其另外包含ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB4的配體，其中所述部分包括ErbB4受體的氨基酸1-626。16.權(quán)利要求l的結(jié)合分子，其另外包含會(huì)結(jié)合ErbBl的配體的ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分和會(huì)結(jié)合ErbB3的配體的ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分。17.權(quán)利要求l的結(jié)合分子，其另外包含會(huì)結(jié)合ErbBl的配體的ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分和會(huì)結(jié)合ErbB4的配體的ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分。18.權(quán)利要求16和17中任一項(xiàng)的結(jié)合分子，其中所述羧基末端ErbB配體結(jié)合位點(diǎn)具有將氨基至羧基末端方向反轉(zhuǎn)的氨基酸序列。19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的結(jié)合分子，另外包含在結(jié)合位點(diǎn)之間的接頭。20.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的結(jié)合分子，另外包含融合伴侶。21.重組DM分子，其編碼在單個(gè)共價(jià)結(jié)合的蛋白分子中的分開的結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)第一和第二ErbB配體的結(jié)合親和力的蛋白。22.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB受體蛋白的一部分的核苷酸序列，所述部分會(huì)結(jié)合ErbB的配體。23.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼會(huì)結(jié)合ErbB的配體的ErbB受體蛋白的一部分的核苷酸序列，和編碼會(huì)結(jié)合ErbB的配體的ErbB受體蛋白的一部分的第二核苷酸序列。24.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbBl受體蛋白的一部分的核苷酸序列，該部分會(huì)結(jié)合ErbBl的配體。25.權(quán)利要求21的重組DM分子，另外包含編碼ErbBl受體的氨基酸1-500的核苷酸序列。26.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbBl受體的氨基酸1-532的核苷酸序列。27.權(quán)利要求21的重組DM分子，另外包含編碼ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的核苷酸序列，其中所述部分編碼ErbBl受體的氨基酸1-621。28.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的核苷酸序列，該部分會(huì)結(jié)合ErbB3的配體。29.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB3受體的氨基酸1-499的核苷酸序列。30.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB3受體的氨基酸1-531的核苷酸序列。31.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB3受體的氨基酸1-624的核苷酸序列。32.權(quán)利要求21的重組DM分子，另外包含編碼ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的核普酸序列，該部分會(huì)結(jié)合ErbB4的配體。33.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB4受體的氨基酸1-496的核苷酸序列。34.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼ErbB4受體的氨基酸1-528的核苷酸序列。35.權(quán)利要求21的重組DM分子，另外包含編碼ErbB4受體的氨基酸1-626的核苷酸序列。36.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼會(huì)結(jié)合ErbBl的配體的ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分和會(huì)結(jié)合ErbB3的配體的ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的核苷酸序列。37.權(quán)利要求21的重組DNA分子，另外包含編碼會(huì)結(jié)合ErbBl的配體的ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分和會(huì)結(jié)合ErbB4的配體的ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的核苷酸序列。38.權(quán)利要求32和33中任一項(xiàng)的重組DNA分子，其中編碼羧基末端ErbB配體結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列編碼將氨基至羧基末端方向反轉(zhuǎn)的氨基酸序列。39.權(quán)利要求21-38中任一項(xiàng)的重組DNA分子，其中所述核苦酸序列編碼連接結(jié)合位點(diǎn)的接頭。40.權(quán)利要求21-38中任一項(xiàng)的重組DM分子，其中所述核苷酸序列還編碼融合伴侶。41.宿主細(xì)胞，其包含重組DNA分子，所述重組DNA分子編碼在單個(gè)共價(jià)結(jié)合的蛋白分子中的分開的結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)第一和第二ErbB配體的結(jié)合親和力的蛋白。42.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生在單個(gè)共價(jià)結(jié)合的蛋白分子中的分開的結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)第一和第二ErbB配體的結(jié)合親和力的二價(jià)結(jié)合分子。43.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞將結(jié)合分子的一部分轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外和周圍培養(yǎng)基中。44.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述重組DM分子編碼ErbB受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB受體的配體。45.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述重組DM分子編碼ErbBl受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbBl受體的配體。46.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述重組DM分子編碼ErbB3受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB3受體的配體。47.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述重組DNA分子編碼ErbB4受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，該部分會(huì)結(jié)合ErbB4受體的配體。48.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。49.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。50.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。51.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。52.權(quán)利要求41的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。53.治療疾病的方法，其包括，給需要治療的患者施用有效量的二價(jià)結(jié)合分子，所述二價(jià)結(jié)合分子在單個(gè)共價(jià)結(jié)合的蛋白分子中的分開的結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)第一和第二ErbB配體的結(jié)合親和力。54.權(quán)利要求53的治療疾病的方法，其中所述結(jié)合分子另外包含ErbB受體的胞外結(jié)構(gòu)域。55.權(quán)利要求53的治療疾病的方法，其中所述結(jié)合分子另外包含ErbBl的胞外結(jié)構(gòu)域，它會(huì)結(jié)合ErbBl的配體。56.權(quán)利要求53的治療疾病的方法，其中所述結(jié)合分子另外包含ErbB3的胞外結(jié)構(gòu)域，它會(huì)結(jié)合ErbB3的配體。57.權(quán)利要求53的治療疾病的方法，其中所述結(jié)合分子另外包含ErbB4的胞外結(jié)構(gòu)域，它會(huì)結(jié)合ErbB4的配體。58.診斷癌癥的方法，其包括，使腫瘤細(xì)胞接觸二價(jià)結(jié)合分子，所述二價(jià)結(jié)合分子在單個(gè)共價(jià)結(jié)合的蛋白分子中的分開的結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)第一和第二ErbB配體的結(jié)合親和力。59.結(jié)合分子，其包含對(duì)EGF、TGFa、HB-EGF、P動(dòng)物纖維素、雙調(diào)蛋白、表皮調(diào)節(jié)素、Epigen、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白la、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1P、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2a、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2P、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4具有親和力的單個(gè)分子。60.治療通過去除或抑制ErbB配體可好轉(zhuǎn)、改善或抑制的疾病或:況，方法,、其包括:給需要的，試者施，二價(jià)結(jié)合分子，、所述二價(jià)和第二ErbB配體的結(jié)合親和力。全文摘要公開了新的二價(jià)的基于ErbB的配體結(jié)合分子，連同其制備方法和用途。所述結(jié)合分子可以是由重組DNA分子表達(dá)的蛋白。該蛋白可以含有2個(gè)均可結(jié)合ErbB受體配體的ErbB受體胞外結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)合分子起誘捕分子的作用，以結(jié)合和隔離配體，從而使它們不能用于結(jié)合細(xì)胞ErbB受體。文檔編號(hào)C12P21/06GK101611150SQ200780012744公開日2009年12月23日申請(qǐng)日期2007年2月8日優(yōu)先權(quán)日2006年2月8日發(fā)明者B·S·科庫普拉卡爾,J·E·希爾,S·S·巴克斯,Y·亞登申請(qǐng)人:利佳賽普特有限責(zé)任公司;耶達(dá)研究與開發(fā)有限公司