專利名稱：表達(dá)cry1ac基因的轉(zhuǎn)基因茄子(solanum melongena)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含原種事件(elite event)EE-l的抗蟲轉(zhuǎn)基因
茄子植物。
背景技術(shù)：
茄子在農(nóng)村種植已持續(xù)4000年，雖然它經(jīng)常被認(rèn)為是一種 地中?；蛑袞|蔬菜。已普遍認(rèn)為印度是茄子起源的發(fā)源地。在 茄屬蔬菜中，茄子(5^/awwm me/owge"a Linn.)是種植于在印度許 多地理部分中的最普通、普遍和主要的蔬菜作物。茄子種植面 積據(jù)估計(jì)為0.51百萬公項(xiàng)，總產(chǎn)量為8，200,00(VX(FAO數(shù)據(jù)， 2004, http:〃faostat.fao.org/)。茄子由小農(nóng)場主種植并且是收入 的重要來源。它是一種多用途植物，適于不同的農(nóng)業(yè)氣候區(qū)， 并且在印度可全年種植。在農(nóng)村中種植有許多栽培品種，消費(fèi) 者的偏愛依賴于栽培品種的產(chǎn)量、果實(shí)顏色，大小和形狀。它 是高產(chǎn)的作物，果實(shí)以各種方式用作蒸調(diào)的蔬菜，在印度農(nóng)村 人將干燥的莖用作燃料。它是礦物質(zhì)和維生素的優(yōu)質(zhì)來源，并 富含總水分、可溶性糖、自由還原糖和酰胺蛋白質(zhì)等。
然而，由于蟲害侵?jǐn)_，尤其是果實(shí)和嫩梢蛀蟲(fruit and shoot borer)(丄ewc/"odw or6owa/" (Guen.))的牙急定增力口 , 近年來 在印度次大陸茄子產(chǎn)量已受到嚴(yán)重影響。果實(shí)和嫩梢蛀蟲的幼 齡幼蟲鉆入大葉子的葉柄和中脈以及嫩莖，引起莖尖枯萎，并 且隨后它們鉆入花蕾和果實(shí)。受影響的果實(shí)除了產(chǎn)量上可觀的 減少外，還失去它們的市場價(jià)值。在印度，據(jù)估計(jì)果實(shí)和嫩梢 蛀蟲引起果實(shí)的損失為25.8-92.5%，產(chǎn)量減少為20.7-60%。
農(nóng)民單獨(dú)或組合使用大量的化學(xué)殺蟲劑以獲得在市場上取得溢價(jià)的無瑕疵的果實(shí)。殺蟲劑濫用的實(shí)際導(dǎo)致在生產(chǎn)中產(chǎn)生 殺蟲劑殘留、天敵的毀滅、害蟲再猖獗和環(huán)境污染。
為了在茄子作物中減少害蟲相關(guān)的損失以及保護(hù)環(huán)境免受 殺蟲劑的不利影響，配置在用于在茄子中高水平表達(dá)的合適的 啟動子的控制下的鱗翅目特異co^7Jc基因?qū)⑻峁┯行У挠糜诠?實(shí)和嫩梢蛀蟲的內(nèi)置控制。由于與化學(xué)殺蟲劑對茄子種植的貢 獻(xiàn)相當(dāng)，這將導(dǎo)致茄子種植成本的降低。
許多研究小組已使用不同方法進(jìn)行茄子的轉(zhuǎn)化。最成功的
方法是用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法(Kumar等1998 ， Nicola等 1998, Fdri等1995, Rotino等1990)。
c^;/基因的來源有機(jī)體是蘇云金桿菌(Sac///^， Awr,'"g^w" )(Bt)，其為在芽孢形成期間合成殺蟲晶體(Cry)內(nèi) 含物的革蘭氏陽性細(xì)菌。該cr少/Jc基因編碼130kDa的cry 1 Ac蛋 白(5-內(nèi)毒素)，并且對鱗翅目幼蟲高度特異。crylAc蛋白必須被 昆蟲攝取以展現(xiàn)殺蟲活性。晶體形式的該蛋白在中性或酸性pH 下的水溶液中是不溶的，然而幼蟲昆蟲的腸道的pH為有助于該 蛋白質(zhì)晶體溶解的堿性。溶解的蛋白質(zhì)隨后被昆蟲腸道的蛋白 酶激活。這些蛋白酶從該蛋白質(zhì)剩余部分切割羧基末端結(jié)構(gòu)域 以及從該蛋白質(zhì)的氨基末端切割約2 8個(gè)氨基酸。激活的蛋白質(zhì)， 其由約600個(gè)氨基酸組成，通過昆蟲的圍食膜擴(kuò)散至中腸上皮。 在此其結(jié)合到靶昆蟲的中腸上皮表面上的特異高親和受體上。 在該膜上形成孔，導(dǎo)致細(xì)^^內(nèi)含物(如K+》參漏到腸腔，并且水 滲漏入上皮腸道細(xì)胞。由于滲透壓和細(xì)胞溶解引起幼蟲腸道上 皮細(xì)胞膨脹。由于腸道中電解質(zhì)和pH的變化腸道變得癱瘓，導(dǎo) 致幼蟲昆蟲停止進(jìn)食和死亡。
已知植物中外源基因的表達(dá)受植物基因組中轉(zhuǎn)基因的位置 的影響。由于插入到可能為較高轉(zhuǎn)錄活性(常染色質(zhì))或較低活性(異染色質(zhì))的染色質(zhì)區(qū)而引起轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的變化出現(xiàn)。這 些的實(shí)例為甲基化區(qū)，其中基因表達(dá)被抑制，或在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元 件如增強(qiáng)子和抑制子的附近，其分別增加或減少基因表達(dá)。因 此，有必要篩選用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的大量獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，并且 鑒定顯示異源插入基因所期望的表達(dá)的事件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及包含原種事件EE-1的抗蟲轉(zhuǎn)基因茄子植物。該 轉(zhuǎn)基因植物的特征在于包含在茄子基因組中的特異位點(diǎn)的在 CaMV35S啟動子控制下的co;〃c基因。另外，本發(fā)明公開了用 于在茄子植物中檢測原種事件E E -1的方法。本發(fā)明進(jìn) 一 步提供 了用于鑒定包含原種事件EE-1的茄子植物的試劑盒。
本發(fā)明涉及使用cry/^c基因轉(zhuǎn)化茄子植物以賦予抗蟲性。 本發(fā)明涉及通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用植物表達(dá)載體pMON10518轉(zhuǎn) 化茄子植物。另外它還涉及包含co^^4c基因的50個(gè)以上獨(dú)立的 轉(zhuǎn)化事件的生產(chǎn)。篩選和表征所有的獨(dú)立事件以表達(dá)cryl Ac蛋 白質(zhì)?；赾rylAc蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和昆蟲生物測定，選擇兩 個(gè)事件以進(jìn)一步表征。本發(fā)明還涉及鑒定轉(zhuǎn)化事件的方法。將 命名為EE-1的一個(gè)事件鑒定為原種事件并具體表征。
通過分子方法分析異源基因插入的特異位點(diǎn)。這包括將與 T-DNA右邊界側(cè)翼相接的基因組區(qū)克隆入合適的載體。本發(fā)明 還涉及通過測序表征和分析該側(cè)翼區(qū)。本發(fā)明涉及從DNA序列 的該區(qū)設(shè)計(jì)引物以PCR擴(kuò)增茄子原種EE-1事件的基因組DNA。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從其它茄子轉(zhuǎn)化事件和非轉(zhuǎn)基因茄子植 物中辨別E E -1原種事件的診斷工具。
本發(fā)明的一個(gè)方面為提供檢測在樣品中茄子植物EE-1原 種事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括(a) 使樣品與多核苷酸探針接觸，其中所述多核苷酸包括源
自示于SEQ ID NO: 8中的序列的核苷酸22^f立至核普酸71位的至 少50個(gè)連續(xù)的核苷酸。
(b) 將樣品與所述的多核苷酸探針置于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下；和
(c) 檢測在所述樣品中所述多核苷酸探針至核酸的結(jié)合。 本發(fā)明的另 一方面為提供一種檢測樣品中茄子植物EE-1
原種事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括
(aM吏樣品與示于SEQ ID NO: 11中的第 一核苷酸序列和選 自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14組成的 組中的第二核苷酸序列接觸。
(b) 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增片段；和
(c) 檢測所述的擴(kuò)增片段。
1211堿基對。
本發(fā)明的另 一 方面提供了用于檢測茄子植物EE-1原種事 件的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 8 中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
本發(fā)明的又一方面提供了用于檢測茄子植物EE-l原種事 件的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 9 中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
本發(fā)明的又一方面提供了用于檢測茄子植物EE-l原種事 件的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 10 中的核香酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
本發(fā)明的另 一 方面還提供了用于使用雜交方法檢測樣品中 茄子植物E E -1原種事件核酸序列的存在的試劑盒；其中所述試 劑盒包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10 中的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；和用于雜交的緩沖液。本發(fā)明的另 一 方面還提供了用于檢測樣品中茄子植物
EE-1原種事件核酸序列的存在的試劑盒；其中所述試劑盒包含 具有示于SEQ ID NO: ll的序列的第一核苷酸序列和選自由 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14組成的組中 的第二核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了用于檢測茄子植物EE-l原種事件的存在 的合成寡核苷酸，其中該寡核苷酸的序列選自由SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15組成的組。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有茄子植物EE-l原種事件的轉(zhuǎn)基 因植物或種子，其中所述EE-1原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其 互^卜序歹ll 。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有茄子植物EE-1原種事件的轉(zhuǎn)基 因植物細(xì)胞，其中所述EE-1原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互 補(bǔ)序列。
本發(fā)明進(jìn)一 步提供了具有茄子植物EE-1原種事件的后代， 其中所述EE-l原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。


圖l顯示了構(gòu)建體pMON10518的圖譜。
圖2顯示了使用事件特異引物的源自茄子植物的擴(kuò)增產(chǎn)物 的凝膠圖像。
泳道1:噬菌體V/7/wJ III標(biāo)記
泳道2:源自包含EE-l原種事件植物的顯示580bp擴(kuò)增片段的DNA泳道3和4:源自不包含EE-1事件的轉(zhuǎn)基因茄子植物的DNA 泳道5:源自非轉(zhuǎn)基因茄子植物的DNA模板 泳道6:非DNA(水)-陰性對照
具體實(shí)施例方式
術(shù)語"擴(kuò)增子"或"擴(kuò)增DNA"、"擴(kuò)增片l殳"是指為部分核酸 模板的靶核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。
術(shù)語"異源基因/DNA"是指插入植物基因組的外源DNA序列。
術(shù)語"事件"是指原始轉(zhuǎn)化體，和通過含有異源基因的原始 轉(zhuǎn)化體或其后代和其它茄子品種間的有性異型雜交產(chǎn)生的任一 后代。
術(shù)語"探針"是指用于雜交實(shí)驗(yàn)或檢測的DNA序列。
通過在"嚴(yán)謹(jǐn)條件"下雜交意味著如由Sambrook等(1989)描 述的傳統(tǒng)雜交條件(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)。
此處所用的"原種事件"，為選自一組事件的事件，該事件 基于轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)和穩(wěn)定性以及對包含其的植物不存在對 農(nóng)學(xué)性狀的負(fù)面影響，通過用相同轉(zhuǎn)化的DNA轉(zhuǎn)化或通過用由 該轉(zhuǎn)化獲得的植物回交獲得(即選擇的轉(zhuǎn)化事件)。
本發(fā)明涉及包含原種事件EE-1的抗蟲轉(zhuǎn)基因茄子植物。該 轉(zhuǎn)基因植物的特征在于在茄子基因組中的特異位點(diǎn)包含在 CaMV 35S啟動子的控制下的co^"c基因。另外，本發(fā)明公開了 用于檢測轉(zhuǎn)基因茄子植物中原種事件EE-1的方法。本發(fā)明進(jìn)一 步提供了用于鑒定包含原種事件EE-l的轉(zhuǎn)基因植物的試劑盒。
本發(fā)明的 一 個(gè)實(shí)施方案為提供檢測樣品中茄子植物EE-1 原種事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括(a) 使樣品與多核苷酸探針接觸，其中所述多核苷酸包括源 自示于SEQ ID NO: 8中的序列的核苷酸22位至核苷酸71位的至 少50個(gè)連續(xù)的核苷酸。
(b) 將樣品與所述的多核苷酸探針置于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下；和
(c) 檢測樣品中所述多核苷酸探針至所述核酸的結(jié)合。 本發(fā)明的另 一實(shí)施方案為提供一種檢測樣品中茄子植物
EE-1原種事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括
(a) 使樣品與示于SEQ ID NO: 11中的第 一核苷酸序列和選 自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: M組成的 組中的第二核苷酸序列接觸。
(b) 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增片段；和
(c) 檢測所述的擴(kuò)增片段。
其中，所述的擴(kuò)增片段為約5 8 0堿基對或約1012堿基對或約 1211》咸基對。
另外，本發(fā)明的另 一 實(shí)施方案提供了用于檢測茄子植物 EE-1原種事件的分離的多核普酸，其中所述多核苷酸由示于 SEQ ID NO: 8中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
本發(fā)明的另 一 實(shí)施方案還提供了用于檢測茄子植物EE-l 原種事件的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 9中的核香酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了用于檢測茄子植物EE-l原 種事件的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案提供了用于使用雜交方法檢測樣 品中茄子植物EE-1原種事件核酸序列的存在的試劑盒；其中所 述試劑盒包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: IO中的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；和用于雜交的緩沖液。本發(fā)明的又 一 實(shí)施方案提供了用于檢測樣品中茄子植物
EE-1原種事件核酸序列的存在的試劑盒；其中所述試劑盒包含 具有示于SEQ ID NO: 11的序列的第 一 核苷酸序列和選自由 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14組成的組中 的第二核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了用于檢測茄子植物EE-l原種事件的存在 的合成寡核苷酸，其中該寡核苷酸的序列選自由SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15組成的組。
本發(fā)明進(jìn)一 步涉及具有茄子植物EE-1原種事件的轉(zhuǎn)基因 植物或種子，其中所述EE-l原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其 互^卜序列。
本發(fā)明還涉及具有茄子植物EE-1原種事件的轉(zhuǎn)基因植物 細(xì)胞，其中所述EE-l原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8 或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核普酸序列或其互補(bǔ)序 列。
本發(fā)明進(jìn)一 步涉及具有茄子植物EE-1原種事件的后代，其 中所述EE-l原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
本發(fā)明提供了使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法來轉(zhuǎn)化茄子 (So/""wm me/o"ge"a)的才直才朱、才直物纟田月包和纟且織的有#文方法，以 賦予對昆蟲害蟲的抗性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于轉(zhuǎn)化的外植體，其選自 由具有葉柄的子葉、胚軸、胚芽、幼胚、葉片、子葉葉腋、莖 尖、花粉嚢、根和愈傷組織組成的組或任何其它合適的外植體。
本發(fā)明的另 一實(shí)施方案為提供了 一種通過PCR擴(kuò)增或本原種事件E E -1的轉(zhuǎn)基因插
入位點(diǎn)附近的側(cè)翼序列的方法。核酸擴(kuò)增可通過任一本領(lǐng)域已 知的各種核酸擴(kuò)增方法實(shí)現(xiàn)，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。茄子
植物原種事件EE-1的鑒定方法通過引物步移方法進(jìn)行。這還可
通過本4頁i或乂^^口的方法進(jìn)^f亍。
轉(zhuǎn)基因插入片段和相鄰的側(cè)翼茄子D N A通過瓊脂糖凝膠 電泳純化，并克隆到本領(lǐng)域已知的合適載體中?？寺∑瓮ㄟ^ 本領(lǐng)域已知方法測序。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為提供了用于鑒定茄子植物EE-1 原種事件的診斷方法或檢測。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為提供了在其它的背景或茄子的栽 培品種中導(dǎo)入E E -1原種事件的方法。
本發(fā)明的另 一 實(shí)施方案為提供了使用具有EE-1原種事件 的轉(zhuǎn)基因茄子生產(chǎn)茄子雜交種的方法。
本發(fā)明的另 一實(shí)施方案提供了具有示于SEQ ID NO: 8-10 中的多核苷酸序列和其互補(bǔ)序列的新的DNA分子。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為提供了包含選自由SEQ ID NO: 8、 SEQIDNO: 9和SEQIDNO: 10組成的組中的多核苷酸序列 的轉(zhuǎn)基因茄子植抹、植物細(xì)胞、種子和后代。
本發(fā)明進(jìn)一 步提供了抗昆蟲害蟲的轉(zhuǎn)基因茄子植物的生產(chǎn) 方法，其包括用DNA構(gòu)建體pMON10518轉(zhuǎn)^(匕茄子細(xì)胞。乂人上述 茄子細(xì)胞獲得的該可育茄子植物可自花授粉或與相容的茄子品 種雜交以產(chǎn)生抗蟲茄子植物。
將源自蘇云金桿菌的殺蟲co;"c基因轉(zhuǎn)入由MAHYCO開 發(fā)的茄子系60208。本發(fā)明提供了使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法來 轉(zhuǎn)化癡子0SW^2wm we/o"ge"a)植物的植抹、植物細(xì)胞和組織的 有效方法，以賦予對昆蟲害蟲的抗性。用于茄子植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體選自由具有葉柄 的子葉、胚軸、胚芽、幼胚、葉片、子葉葉腋、莖尖、花粉嚢、 根和愈傷組織組成的組或任何其它合適的外才直體。
將包含在CaMV e35S啟動子和Gm7S終止子控制下的 co;/Jc基因；作為植物篩選標(biāo)記基因的在CaMV 35S啟動子控制 下的"/ ///的基因載體pMON10518(圖l)轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌 (JgroZ ""er/ww /wwe/"c/e"5)纟田月包。將該重纟且才艮癌農(nóng)4干菌4妄種入 用于農(nóng)桿菌生長的適合培養(yǎng)基。將農(nóng)桿菌細(xì)胞接種入在瓶中的 25ml無菌2YT培養(yǎng)基(pH7) 。 2YT培養(yǎng)基包含1 %酵母提取物、 1.6 %胰蛋白胨和0.5 % N a C1 。在接種細(xì)菌前將合適的抗生素加入 到該培養(yǎng)基中以用于具有質(zhì)粒pMON10518的農(nóng)桿菌的選4奪性 生長。將細(xì)菌接種到瓶中的2YT培養(yǎng)基上，并保持在搖床上以 獲得0.01至2范圍內(nèi)，優(yōu)選1.8的光密度(600nm)。
將外植體接種至重組農(nóng)桿菌懸浮液中(優(yōu)選15分鐘)，在無 菌濾紙上印跡干燥(blotted dry)，隨后轉(zhuǎn)移至包含用于共培養(yǎng)的 合適生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。
共培養(yǎng)后(共培養(yǎng)2至5天，優(yōu)選2天)，將這些外植體在液體 MS0培養(yǎng)基中用500mg/l的頭孢p塞肟洗滌，以抑制農(nóng)桿菌的生 長，并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上。
將在選擇培養(yǎng)基上再生的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，并將 生根的植物在溫室中固化(harden)和定植(established)。
用p M O N10 518構(gòu)建體轉(zhuǎn)化茄子植物的具體方法在實(shí)施例1 中提供。
在本發(fā)明中，源自蘇云金桿菌的co;/爿c基因已轉(zhuǎn)移至由 MAHYCO開發(fā)的茄子系60208中，該茄子系60208具有以下性 狀
果實(shí)顏色紫色、白色夾雜果實(shí)形狀:卵形
植物習(xí)性:茂密
果實(shí)發(fā)育聚簇
花萼刺狀
篩選超過5 0個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件以筌定原種茄子植物E E -1 事件。所有事件進(jìn)行轉(zhuǎn)基因分離分析和蛋白表達(dá)評價(jià)以確定用 于商業(yè)化的最優(yōu)事件。詳情在實(shí)施例2中提供。
進(jìn)行茄子植物EE-1原種事件的分子表征。具體在實(shí)施例3 中提供。進(jìn)行進(jìn)一步的用于鑒定茄子植物EE-1原種事件的診斷 方法。詳情在實(shí)施例4中提供。實(shí)施例5描述了進(jìn)行對于茄子植 物EE-1原種事件的合子檢測。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用由Sambrook等描述的Southern雜 交方法檢測在樣品中茄子植物EE-1原種事件核酸序列的存在 的方法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二片反，Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)。 該方法包4舌1)在濾月莫 (filter)上固定植物基因組DNA片段，2)在42。C下在50%甲酰胺、 5XSSPE、 2X Denhardt試劑和0.1% SDS中預(yù)雜交濾膜l至2小時(shí)， 或在68。C下在6X SSC、 2X Denhardt試劑和0.1 %SDS中預(yù)雜交 濾膜1至2小時(shí)，3)加入已標(biāo)記的雜交探針，4)溫育16至24小時(shí)， 5)在室溫下在1X.SSC、 0.P/。SDS中洗滌濾膜20分鐘，6)各在68。C 下在0.2XSSC、 0.1。/。SDS中洗滌濾膜20分鐘3次，和7)在-70。C下 用增光屏將濾膜曝光在X-射線膠片上24至48小時(shí)。雜交可通過 本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)4亍。
茄子植物EE-1原種事件基于許多標(biāo)準(zhǔn)選擇。超過三代的分 離分析表明在該系中存在co^^c基因插入的單一位點(diǎn)。這通過 DNA印跡分析確認(rèn)。在許多茄子單一插入事件上進(jìn)行使用定量 ELISA的蛋白質(zhì)定量研究。這些研究表明EE-1系為最高的crylAc蛋白表達(dá)系，插入基因的表達(dá)在許多不同的遺傳背景下 經(jīng)過多個(gè)世代是穩(wěn)定的。EE-1原種事件承載系的表型分析表明 其在形態(tài)學(xué)上不能區(qū)別于其所起源的非轉(zhuǎn)化親本系，因此最適 合用于進(jìn)一步回交育種。使用原種植物以將EE-1原種事件轉(zhuǎn)移 至其它茄子栽培品種。
核酸擴(kuò)增可通過任何本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增方法實(shí) 現(xiàn)，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。本領(lǐng)域已知各種擴(kuò)增方法，并 描述于PCR protocols: a guide to methods and applications(Innis 等主編，Academic Press, San Diego, 1990)中。轉(zhuǎn)基因插入 和相鄰的側(cè)翼茄子D N A通過瓊脂糖凝膠電泳純化并克隆?？寺?片#殳通過本領(lǐng)域已知的方法測序。
雖然本發(fā)明已粗略的如上定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到 其不限于此，并且其還包括以下描述給出了實(shí)施例的實(shí)施方案。
實(shí)施例
給出的實(shí)施例僅為本發(fā)明中要求的用途、方法和產(chǎn)品的說 明，本發(fā)明自身的實(shí)施不限于所描述的實(shí)施例，或由所描述的 實(shí)施例i兌明。
實(shí)施例l
茄子的轉(zhuǎn)化
種子的消毒和接種
在50ml塑料離心管中用1.5。/。NaOCl將來自系60208的茄子 種子進(jìn)行表面消毒10分鐘，同時(shí)劇烈搖晃(500粒種子用 20mlNaOCl)。 5分鐘后將溶液倒出，并用無菌蒸餾水洗滌種子5 次。將種子在無菌濾紙上印跡干燥l小時(shí)，并以10粒種子/每瓶 接種到瓶中的MS0培養(yǎng)基(表1 )上。在16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗 的光周期狀況下將種子保持在25。C下12-15天以萌發(fā)。
農(nóng)桿菌培養(yǎng)進(jìn)行共培養(yǎng)的前一天，將包含轉(zhuǎn)化載體pMON10518的農(nóng)斥干 菌菌林的培養(yǎng)物在28。C下在25ml液體LB培養(yǎng)基中在175rpm的 搖動下用各自的抗生素培養(yǎng)過夜。該過夜培養(yǎng)物起始自菌環(huán)量 的取自含相同抗生素的新制的條狀(freshly-streaked)固態(tài)培養(yǎng)
基盤的細(xì)菌細(xì)胞。 外植體制備
在共培養(yǎng)的當(dāng)天，將子葉從2-15天大的幼苗除去，并沿中 脈縱向剪成兩半，并用作外植體。將外植體保持在在培養(yǎng)皿中 用液體MS培養(yǎng)基(表1)浸濕的無菌濾紙上，以防止外植體干燥。
共培養(yǎng)
在共培養(yǎng)的早上，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物在1 OOOOrpm下 離心10分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸于液體MS培養(yǎng)基(25ml) 中，并充分混合(表l)。將25 ju l的100mM乙酰丁香酮力口入到細(xì) 菌培養(yǎng)物中，將該細(xì)菌培養(yǎng)物隨后放置于培養(yǎng)箱中在搖晃下另 外2小時(shí)以生長。纟田菌培養(yǎng)物的光密度(OD)在600nm下測量，直 到達(dá)到1.5-1.8的OD。外植體在培養(yǎng)皿或玻璃燒杯中的細(xì)菌培養(yǎng) 物中在緩慢攪拌下培育10分鐘。隨后將外植體在無菌濾紙上印 跡以除去過量的細(xì)菌，并放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基BlAsP(請?jiān)诒碇?查找該培養(yǎng)基組合物)中三天以共培養(yǎng)。(15個(gè)外植體/每盤)。
將該盤在25°C下在16小時(shí)光照+8小時(shí)黑暗的光周期狀況 下在光照下培育三天。
還在各實(shí)驗(yàn)中保持陽性或陰性對照。陽'性對照為在無抗生 素的培養(yǎng)基上再生的外植體，以校驗(yàn)組織培養(yǎng)物再生，而陰性 對照為保持在含抗生素的培養(yǎng)基上的外植體，以確保抗生素檢 驗(yàn)生長。
選擇(B1KC培養(yǎng)基)
三天后，將外植體轉(zhuǎn)移至具有卡那霉素50mg/l和頭孢噻肟250mg/l的選擇培養(yǎng)基BlKC(表l)培養(yǎng)基上2周的時(shí)間。轉(zhuǎn)化的 外植體在外植體的切割端產(chǎn)生愈傷組織，而未轉(zhuǎn)化的外植體變
上兩周。在選擇培養(yǎng)基上重復(fù)此操作6周的總時(shí)間。在第六周末， 產(chǎn)生綠色的分生組織/愈傷組織。 再生(CF2KC培養(yǎng)基)
將綠色的分生組織轉(zhuǎn)移至具有卡那霉素50mg/l和頭孢噻肟 250mg/l的再生培養(yǎng)基，CF2KC(表1)兩周的時(shí)間。將愈傷組織 在新鮮培養(yǎng)基上每兩周傳代培養(yǎng)三次(3次選擇)，產(chǎn)生源自愈傷 組織的小的綠色枝芽(shoot buds)。
伸長(BrootKC培養(yǎng)基)
將枝芽轉(zhuǎn)移至具有卡那霉素5Omg/1和頭孢噻肟25Omg/1的 BrootKC培養(yǎng)基(表1)兩周的時(shí)間。將該枝芽在新鮮培養(yǎng)基上每 兩周進(jìn)行2次傳代培養(yǎng)(2次選擇)。在第四個(gè)周末，枝芽伸長并 準(zhǔn)備生根。有時(shí)在伸長培養(yǎng)基上可能開始生根。如果生根在伸 長培養(yǎng)基上開始，保持小植物不受干擾以免損傷根。
生根(TMRGKC培養(yǎng)基)
將該莖轉(zhuǎn)移至有卡那霉素50mg/l和頭孢噻力虧250mg/l的生 根培養(yǎng)基TMRGKC(表l)上兩周的時(shí)間。每兩周將該莖傳代培養(yǎng) 直到出現(xiàn)生根。
固化(harden)
將生根的植物用無菌蒸餾水徹底洗滌以除去膠凝劑(瓊脂 或植物凝膠(phytagel))。在轉(zhuǎn)移至含普羅米克斯(promix)(60%) 和土壤(40%)的混合物的杯中之前，將該植物用0.1 %的多菌靈 殺菌劑(Bavistin)處理至少l小時(shí)。將該植物用聚乙烯袋罩住7 天。7天后，將聚乙烯袋從角剪開，以允許固化過程開始，其在 約2周內(nèi)完成。目的
細(xì)菌 細(xì)菌接押 纟田菌再懸浮—
<formula>formula see original document page 18</formula>
種子接種 共培養(yǎng)
選擇
表l:用于茄子轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基的組分 Sr. ) ^錄i ■ 一
No.—
1 — : LS ——固尿:胰^白胨—i0gm/L,，每哀泉物5gm/L, NaCl 10 :
gm/L,pH7.0,瓊脂15gm/L 2丄B液體(胰蛋白胨10gm/L,酵母哀取物5gm/L,NaCl 10 ::
i ! ;gm/L,pH7.0
3 ;MS液體；MS大量(MS m^jor)100ml/L, MS微量(MS
^ninor)10ml/L, MS CaCl2 10ml/L, MS鐵10ml/L， MS; :維生素lOml/L,肌醇lOml/L,蔗糖3%, pH 5.8 | MS大量100ml/L,MS微量lOml/L, MS CaCl2 : 10ml/L，MS鐵10ml/L,B5維生素10ml/L,月幾醇；
; 10ml/L,蔗糖3%, pH5.8,瓊脂0.8%
5 : BlAsP 1 MS大量lOOml/L, MS微量lOml/L, MS CaCl2 | !10ml/L,MS鐵lOml/L, B5維生素lOml/L,肌醇 :10ml/L,NAA0.05mg/L，玉米素2mg/L,乙酰丁香i
; :S同lOOuM，葡萄糖1.5%, pH5.8, 植物凝膠
: 0.35% I
6 B1KC : MS大量100ml/L,MS微量lOml/L, MS CaCl2 :
10ml/L,MS鐵lOml/L, B5維生素10ml/L，肌醇； I 10ml/L,NAA0.05mg/L,玉米素2mg/L,葡萄糖 ; |l.5%,卡那霉素50mg/l,頭孢噻肟250mg/l,pH:
i : 5.8, 瓊脂0.8%
7 : CF2KCMS大量100ml/L， MS微量lOml/L, MS CaCl2 !
!10ml/L, MS鐵10ml/L,B5維生素lOml/L,肌醇 ;10ml/L, BAP2.5mg/L,激動素lmg/l,腺噪呤(自 ;由基)2mg/L， IAA0.5mg/1,蔗糖3%卡那霉素50: ' ! m名/1,頭孢噻肟250mg/l,pH5,8, 瓊脂0.8% ;
! 8 ;BrootKC[ MS大量100ml/L,MSi量10ml/L， MS CaCl2 : I |10ml/L,MS鐵10ml/L,MS維生素lOml/L,肌醇|
I j :10ml/L, IAA0.5mg/1,葡萄糖1.5% ，卡那霉素^
; i50mg/1,頭孢^月T 250mg/l,pH5.8, 瓊脂0.8%!
9 : TMRGK: MS大量50ml/L， MS#* 1 Oml/L, MS CaCl2 ! C :10ml/L, MS鐵10ml/L,B5維生素lOml/L,肌醇: : ; :10ml/L,葡萄糖0.75%， 卡那霉素50mg/L,頭孢i
: 1 漆月虧250mg/L，pH 5.8,植物凝膠10.35%. :
實(shí)施例2
茄子植物EE-l原種事件的鑒定
產(chǎn)生大量(>50)的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件以最大化高-轉(zhuǎn)基因-表達(dá)的 遺傳穩(wěn)定的事件的機(jī)會用于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因茄子系的生產(chǎn)。將轉(zhuǎn)
，基因存在的分
再生
伸長
生根析，并將陽性植物進(jìn)行ELISA以確定該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)性。將起 始轉(zhuǎn)化體CTO)通過自交發(fā)展下一代，通過PCR檢查T1后代植物 以確定轉(zhuǎn)基因的分離。在具有單co;^Mc基因插入的系中對于轉(zhuǎn) 基因的預(yù)期T1分離率為基于孟德爾遺傳學(xué)的3:1。另外，由于當(dāng) 導(dǎo)入作為轉(zhuǎn)基因時(shí)，c^;/Jc擔(dān)當(dāng)顯性基因，該基因的表達(dá)在T1 代中通過ELISA監(jiān)視。此外，在單一插入事件中，crylAc表達(dá) 植物與未表達(dá)植物的預(yù)期比值為3:1。在源自選擇的系的組織上 進(jìn)行昆蟲生物測定以確定哪一 系將具有抗果實(shí)和嫩梢蛀蟲害蟲 的較好功效。進(jìn)行選擇的個(gè)體轉(zhuǎn)化事件的Southern印跡分析以 確認(rèn)位點(diǎn)的數(shù)目(插入拷貝數(shù)目)，在所述位點(diǎn)處轉(zhuǎn)基因整合到 茄子基因組。
基于上述標(biāo)準(zhǔn)，選擇轉(zhuǎn)化系，該轉(zhuǎn)化系顯示單一位點(diǎn)插入 事件的分離性狀和顯示對果實(shí)和嫩梢蛀蟲的有效耐性。相反地， 不再采用那些發(fā)現(xiàn)具有異常分離率和/或抗害蟲低功效的系。將 選擇用于進(jìn)展的系種植于溫室中，通過定量ELISA在作物的整 個(gè)生命周期評價(jià)CrylAc蛋白質(zhì)，其能夠確定最高蛋白表達(dá)系。 所分析的組織為葉、芽、莖、花和根。仔細(xì)分析上述參數(shù)后， 根據(jù)三個(gè)植物世代的CrylAc表達(dá)、抗害蟲功效和遺傳穩(wěn)定性， 發(fā)現(xiàn)事件EE-1為最有效的事件。將EE-1原種事件用于進(jìn)一步的 育種以開發(fā)果實(shí)和嫩梢蛀蟲抗性茄子。
實(shí)施例3
EE-1原種事件的分子性狀
使用Cottage等，2001的方法分析茄子轉(zhuǎn)基因EE-1原種事 件，以鑒定與CrylAc基因表達(dá)盒側(cè)翼相接的茄子基因組DNA序 列。使用本領(lǐng)域已知的方法從具有EE-1原種事件的植物的新鮮 嫩葉中，提取植物基因組DNA。將基因組DNA(2i^g)在使用標(biāo)準(zhǔn) 緩沖液的20jil反應(yīng)體積中用Zww/酶消化。消化反應(yīng)在37。C下溫育過夜。然后將消化產(chǎn)物在65。C下溫育以使酶失活，并用3M醋 酸鈉和乙醇沉淀。將DNA風(fēng)干和溶解于12pl無菌蒸餾水中。在 由廠商提供的連接酶緩沖液中將已消化的DNA連接到退火的 銜接子上。銜接子的序列如下
ADAP 1: !T-CTA ATACGACTCACTATAGGGCGGCCGCCCGGGCAGGT- 3'SEQ !D. NO: 1
ADAP 2: 5，- P-ACC TGC CC-, -3' SEQ ID NO: 2
兩種銜接子首先相互退火和然后連接到EE-1原種事件的 已消化的基因組DNA上。
將連接混合物在15-16°C下溫育過夜以使已消化的基因組 D N A連接到退火的銜接子上。將連接混合物稀釋至10 0 p 1以獲得 銜接子文庫，并且使用以下的引物組合進(jìn)行第一輪擴(kuò)增與插 入的異源DNA SEQ ID NO: 3互補(bǔ)的正向引物，和與攤f接子DNA 序列SEQ ID NO: 4互補(bǔ)的反向引物。
國P隱10 - 5'- TTG GGT CTT TCA GAC T(]A CAA G -3' SEQ〖D NO: 3 AP - 5'- GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' S已Q ID NO: 4 限制酶切消化
基因組DNA
12.0^il (2嗎) 2.0[il(最終濃度lx)
10X反應(yīng)緩沖液
為"I酶
1.0pl(10單位/ial)
無菌水
補(bǔ)足體積至20.0^1.連接
消化的基因組DNA(熱失活) 退火的銜接子
10X反應(yīng)緩沖液 T4-連接酶
第一PCR:
無菌水
試劑 無核酸酶水
10X反應(yīng)緩沖液(具有MgCl2) 10mMdNTPs 引物MHIP-10(100ng/(11) 引物AP(100ng/pl) Taq DNA聚合酶(5單位/pl) DNA模板
熱循環(huán)4義程序
95 °C 94 °C 58°C 68 °C 68 °C 4°C
時(shí)間 5分鐘
30秒
30秒 4分鐘 10分鐘
保持
12単(2嗎) 2.0|il(100ng/(il)
3.0pl(最終濃度lx) 1.0(11(5單位/fil)
補(bǔ)足體積至30.0|il
體積 補(bǔ)足至25^1 2.5(xl 0.5(^1 1.0|il l単 0.5|il
循環(huán) 1
40第二輪P C R是必需的以獲得與插入的異源基因相鄰的特異
側(cè)翼區(qū)。PCR用正向引物(SEQ ID NO: 5)和反向引物(SEQ ID NO:6)進(jìn)4亍。具體如下纟合出
MHIP-11- 5'- CTG ACA AGA TCG ATC TGA AGT C -3' SE( TD NO: 5
NAP ^ 5'- TAT AGG GCT CGA GCG GC-3'
第二PCR
式劑
無核酸酶水
10X反應(yīng)緩沖液(具有MgCl2) 10mMdNTPs 引物MHIP-1 l(100ng/pl) 引物NAP(100ng/pl) TaqDNA聚合酶(5單位/pl) DNA模板
熱循環(huán)程序
溫度 95 °C 94 °C 58°C 68。C 68 °C 4°C
時(shí)間 5分鐘
30秒
30秒 4分鐘 10分鐘
保持
SEQ ID NO: 6
體積 補(bǔ)足至25^1 2， 0.5jil l.Ojil 1， 0.5 (il 2単
循環(huán) 1
40
在1 %瓊脂糖凝膠上分析少量的PCR產(chǎn)物，通過使用本領(lǐng)域已知的方法從凝膠上洗脫擴(kuò)增片段。兩4侖PCR(使用引物
MHIP-ll SEQ ID NO: 5和NAP SEQ ID NO: 6)后，將309bp的
增子)克隆至pGEM-T Easy載體上以獲得重組載體。將該重組載 體通過本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌抹中。菌林可為 DH5a， ToplO等。將選擇的用于分析序列的包含該重組載體的克 隆稱之為EE-l-Xmnl-4。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離源自 克隆EE-1 -XmnI-4.的質(zhì)粒DNA 。使用T7引物測序該克隆片段(擴(kuò) 增子)。獲得的多核苷酸序列如SEQIDNO: 7所示。該序列包含 由部分Gm7S終止子和右邊界、銜接子序列和與茄子基因組 DNA序列側(cè)翼相接的EE-1 T-DNA構(gòu)成的T-DNA載體序列。
序列ID NO: 7由以引物MHIP-11開始(SEQ ID NO: 5，堿基 對1-22)、之后為附近是EE-1原種事件的側(cè)翼茄子基因組DNA序 列(堿基對143至278)的右邊界序列(堿基對97-142)的部分 T-DNA序列構(gòu)成。銜接子序列(堿基對279至309)在該側(cè)翼基因 組序列之后。
SEQ ID NO: 7
CTGACAAGATCGATCTGAAGTCTAAACAATTCTAAGAGGTATCATGTAGCAGTGTCC TGCCACAATATTGAATTGACCTGCAGGCATGCAAGCTGGGM CA(3ATAGTCGTTTCC CGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTA GAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAAGAAAAAAATAAATGTAAGATTTAAATTTCTA ACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGATATTCCAAGAATACCTGC CCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATA
序歹'JIDNO: 8由右邊界序列(1-46)、之后的EE-1原種事件的 側(cè)翼茄子基因組DNA序列(47-182)構(gòu)成。該完整的多核苷酸序 列示于SEQ ID NO: 8。SEQ ID NO: 8
GATCAGJVTAGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAA2\AGT
GTAAGATTTAAATTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGA TATTCCAAGAA
序列ID NO.' 9由右邊界序列(1-41)、之后的EE-l原種事件的 側(cè)翼茄子基因組DNA序列(41-125)構(gòu)成。該完整的多核香酸序 列示于SEQ ID NO: 9。
SEQ ID NO: 9
GTAAGATTTAA
序列IDNO: 10由右邊界序列(1-15)、之后的EE-l原種事件 的側(cè)翼茄子基因組DNA序列(16-75)構(gòu)成。該完整的多核苷酸序 列示于SEQ ID NO: 10。
SEQIDNO: 10
TTATCCMATTTTAAAAA
實(shí)施例4
用于鑒定EE-l原種事件的診斷方法
PCR方法
為了檢測茄子EE-1原種事件的存在或不存在，開發(fā)了分子 診斷方法。進(jìn)行如SEQ ID NO: 8所示的片段的序列分析，并設(shè) 計(jì)引物來擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)以用作診斷工具。設(shè)計(jì)的兩種引物為正向引物MI-ITBJ-2 (SEQ ID NO: 1 l)和第二引物MHIP-2 (SEQIDNO: 12),以擴(kuò)增源自EE-l基因組DNA的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)。
MHTBJ-2: 5、 TGC GGT GAT AAT TGA ATG CAT C -3' SEQ II) NO: 11
M證-2: 5'- GGA GCT TCT CTT GAT GGA GG -3' SEQ ID MO: 12
這些引物對包4舌{旦不限于SEQ ID NO: ll和SEQ ID NO: 12。為了3，區(qū)的擴(kuò)增，衍生自SEQ ID NO: 8的任一引物對，當(dāng) 其用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生用于EE-l原種事件i貪斷的DNA擴(kuò) 增子，為本發(fā)明的一方面。多核苷酸序列為從CrylAc基因至右 邊界(從SEQ ID NO: 16中提供的核普酸位點(diǎn)1至4091位點(diǎn))。完 整的多核苷酸序列由GM7S終止子側(cè)接的Oj〃c基因、之后的 右邊界，該右邊界進(jìn)一步之后的茄子基因組DNA和銜接子序列 構(gòu)成，提供于SEQ ID NO: 16中。
然而，使用DNA分子或其互補(bǔ)物以產(chǎn)生用于EE-1診斷的擴(kuò) 增子DNA分子的這些方法的任何變型，為本領(lǐng)域的公知常識。 例如如果SEQ ID: ll引物與引物l(SEQ ID NO: 13)組合使用將 產(chǎn)生1012堿基對的擴(kuò)增子，或與引物2 (SEQ ID NO: 14)組合使 用將擴(kuò)增源自EE-1事件的1211堿基對。該引物l和2的序列如 下
Primer 1:- 5，- CGAGCTTAAGTTCTCCAACTGC-3， SEQ ID NO: 13
Pri證2:- 5，- GGAATGTGAAAGGTCATGTGG- 3' SEQ ID NO: 14
對于分析，具有陽性和陰性對照是重要的。設(shè)計(jì)PCR方法 以從其他茄子轉(zhuǎn)基因事件和非轉(zhuǎn)基因系中辨別出EE-l原種事 件。使用本領(lǐng)域已知的方法從葉子中分離源自茄子EE-l原種事 件的基因組DNA。還從其它茄子轉(zhuǎn)基因事件和非轉(zhuǎn)基因茄子系中分離基因組DNA以作為用于PCR4企測方法的對照。還包括在 反應(yīng)混合物中不含DNA的對照反應(yīng)。
使用兩種引物，即SEQ ID NO: ll和SEQ ID NO: 12,將源 自不同植物的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，具體如下
試劑 加入量 無核酸酶水 補(bǔ)足至25pl
10X反應(yīng)緩沖液(具有MgCl2) 2.5^1
lOmMdNTPs 0，
I物MI-IIP-2( 1 OOng/pl) 1.0)il
虧！物MHTBJ-2( 1 OOng/pl) 1 .Ojil
Taq DNA聚合酶(5單位/jil) 0.5|il
DNA模板 2.0jil
溫度時(shí)間循環(huán)
95 °C5分鐘1
94 °C30秒
58°C30秒35
72 °Cl分鐘
72 °C5分鐘1
4°C保持___
將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分析。獲得的結(jié)果如圖2 所示。泳道l包含用/i7wd III標(biāo)記消化的X噬菌體DNA。在泳道2 中的樣品包含源自EE-1原種事件的DNA,而泳道3和4中的樣品 包含源自其它不包含EE-1原種事件的轉(zhuǎn)基因茄子植物的DNA。道6為非DNA對照樣品。從圖 中明顯看出580bp片段擴(kuò)增自茄子EE-1原種事件，而不是其它 轉(zhuǎn)基因事件和非轉(zhuǎn)基因茄子植抹。 實(shí)施例5
用于茄子EE-1原種事件的合子檢測
表征插入位,泉附近的基因組區(qū)。將插入位點(diǎn)的 一 端進(jìn)行序 列分析，該序列為如在SEQ ID NO: 8中示出。分析源自T-DNA 的其它側(cè)翼側(cè)的茄子基因組DNA序列，設(shè)計(jì)具有如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的引物。當(dāng)該引物與具有SEQ ID NO: 11 和SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列的引物組合^f吏用時(shí)，由于擴(kuò) 增轉(zhuǎn)基因特異等位基因，從包含EE-1原種事件的轉(zhuǎn)基因茄子植 物獲得580堿基對片段，和由于從SEQIDNO: ll和SEQIDNO: 15擴(kuò)增非轉(zhuǎn)基因等位基因帶，從非轉(zhuǎn)基因茄子植物獲得330堿基 對片段。
MHTBM: 5，-CCA TCT ACT AAC GGT GAT GGT -3， SEQ ID NO: 15
為了鑒定包含EE-1原種事件的純合和雜合轉(zhuǎn)基因茄子植 物，使用具有SEQIDNO: 11、 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 15 所示的核苷酸序列的三個(gè)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。
使用本領(lǐng)域已知的方法分離源自包含EE-l原種事件的轉(zhuǎn) 基因茄子植物和非轉(zhuǎn)基因茄子植物的基因組DNA。利用該DNA 作為DNA模板進(jìn)行PCR分析。用于進(jìn)行用于EE-l原種事件的接 合性PCR的PCR條件給出如下i式劑 力O入量
無核酸酶水 補(bǔ)足至25(il
10X反應(yīng)緩沖液(具有MgCl2) 2.5(il
10mMdNTPs 0，
虧1物MHTBJ-6(1 OOng/pl) 1.0|il
虧1物MHIP-2( 100ng/|il) 1.0(il
1物MHTBJ-2( 1 OOng/jil) 1 .Opl
Taq DNA聚合酶(5單位/pl) 0.5^1
DNA模板 2.0(^1
熱循環(huán)程序
溫度 時(shí)間 循環(huán)
95 °C 5分鐘 1
94 °C 40秒
58°C 40秒 35
72 °C l:40分鐘
72 °C 5分鐘 1
4°C 保持 ---
聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增了源自包含EE-l原種事件的純合茄子 植物的580堿基對的片段；580和330堿基對大小的兩個(gè)片段從包 含EE-1事件的雜合茄子植物獲得；330堿基對大小的片段從非 轉(zhuǎn)基因茄子植物獲得。 SEQIDNO: 16<formula>formula see original document page 29</formula>GTTCGTGAACTCCCAATATGATCAGTTGCAAGCCGACACCAACATCGCCATGATCCA CGCCGCAGACAAAa3TGT GCACAGCATTCGTGAGGCTTACTTGCCTGAGTTGTCCGT GATCCCTGGTGTGAACGCTGCCATCTTCCmGGAACTTGAGGGACG'rATCTTmCCGC ATTCTCCTTGTACGATGCCAGAAACGTCATCAAGAACGGTGACTTCAACTATGGCCT
CGTCCTGGTTGTGCCTOM3TGGGAAGC'rGAAGTGTCCCAAGAGGTTAGAGTCTGTCC AGGTMmGGCTACATTCTCCGTGTGACCGCTTACAAGGAGGGATACGGTGAGGGTTG CGTGACCATCCACGAGATCGAGAACAACACCGACCmGCTTAACTTCTCCAACTGCGT CGAGGAAGAAATC'rATCCCAACAaCACCGTTACTTGCAACSaCTACACTCTGAATCA GGAAGMn'ACGGAGGTGC'CTACACTAGCCGTAACAGAGG'rTACAACGAAGCTCCTTC CGTTCCTGCTGACTATGCCTCCGTGTACGAG-GAGAAATCCTACACAGATGGCAGACG TGAGAACCCTTGeGAGTTCAACAGAGGrrACAGGGACTACACACCmCTTCCAGTTGG C:T7iTGTTACCAAGGAGCTTGAGTilC:TTTCCTC5AGAC■CGACAAAGTGTGGATCmG■M, CGGTGAJmCCGAGGGAACCTTCATCGTGGACAGCGT.GGAGCTTCTCTTCATGGAGGA
MTTTGAGGGCTTTTTMrTGA:TAAGTATGTAGTACTAAAATGTA,rGCI1CTAATAG;
TCA丁AGTGAGCGAGCmAAGTATCGGGCTATTT iACTATGACTTGAGCTCCATCTJVTG AATAAATJmATCAGCATM'GATGCTTTTGTTTTGTGTACTTCAACTGTCTGCTTAGC TAATTTGAT ATGGTTGGCAC TTGIG CACGTATAAATATGCTGAACTAATTTACT CTG A A3C"I'AAATAACTAGATTAGATGAGTGTATTAmTAX:'AAAAGGOlTTAAA:rCMmTAC ATCTT船ACAAATTGTCACGGTCTACCAGJiiyiAGAAATTGCATTTGTTTTTGC5G'rCT TTCAGACTGACAAGATCGA了CTGAAGTC'rAAMmATTCTAAGAGC5'mTCATGTAGCA AT(3"TCCTGCCACAATATTC^ATTGACCTGCAGGCATGCAAGerGGGATCAGA-TAGTC GTTTCCCGCCTTC!ACTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAOTGCTGTCAATAAA CACTTAGAAAGC-TGTTA'fCCAAATT'rTAAAAAGAAAAAAA'TAAATGTAAGA'rrTAAA TTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTA CACCGCATTATATGATATTCCAAGAAT ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATA
參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1. 一種檢測樣品中茄子植物EE-1原種事件核酸序列的存在的方法，其中所述方法包括(a)使樣品與多核苷酸探針接觸，其中所述多核苷酸包括源自SEQ ID NO8中示出的序列的核苷酸22位至核苷酸71位的至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸；(b)將樣品與所述多核苷酸探針置于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下；和(c)檢測在所述樣品中所述多核苷酸探針至核酸的結(jié)合。
2. —種#r測樣品中茄子植物E E -1原種事件核酸序列的存 在的方法，其中所述方法包括(a) 使樣品與示于SEQ ID NO: 11中的第 一核苷酸序列和選 自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14組成的 組中的第二核苷酸序列接觸；(b) 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增片段；和(c) 檢測所述的擴(kuò)增片段；其中，所述的擴(kuò)增片段為約580堿基對或約1012堿基對或約 1211堿基對。
3. —種分離的多核苷酸，其用于檢測茄子植物EE-1原種事 件，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 8中的核苷酸序列或 其互補(bǔ)序列組成。
4. 一種分離的多核苷酸，其用于檢測茄子植物EE-1原種事 件，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: 9中的核苷酸序列或 其互補(bǔ)序列組成。
5. —種分離的多核香酸，其用于檢測茄子植物EE-1原種事 件，其中所述多核苷酸由示于SEQ ID NO: IO中的核苷酸序列或 其互補(bǔ)序列組成。
6. —種試劑盒，其用于使用雜交方法檢測樣品中茄子植物 EE-1原種事件核酸序列的存在，其中所述試劑盒包含示于SEQID NO: 8或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: IO中的多核苷酸序列或 其互補(bǔ)序列；和緩沖液。
7. —種試劑盒，其用于檢測樣品中茄子植物EE-l原種事件 核酸序列的存在，其中所述試劑盒包含具有示于SEQ ID NO: 11 中的序歹'J的第一核普酸和選自由SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14組成的組中的第二核苷酸序列。
8. —種合成寡核苷酸，其用于檢測茄子植物EE-l原種事件 的存在，其中該寡核苷酸的序列選自由SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15組成 的組。
9. 一種轉(zhuǎn)基因植物或種子，其具有茄子植物EE-l原種事 件，其中所述EE-l原種事件的基因組包含示于SEQIDNO: 8或 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
10. —種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其具有茄子植物EE-l原種事件， 其中所述EE-l原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
11. 一種具有茄子植物EE-1原種事件的后代，其中所述 EE-l原種事件的基因組包含示于SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10中的核普酸序列或其互補(bǔ)序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含特異事件EE-1的抗蟲轉(zhuǎn)基因茄子(Solanummelongena，茄子)植物、植物細(xì)胞、種子及其后代。EE-1事件由表達(dá)蘇云金桿菌的crylAc基因的構(gòu)建體的單位點(diǎn)整合產(chǎn)生。另外，本發(fā)明提供了與茄子植物EE-1事件的插入位點(diǎn)側(cè)翼相接的區(qū)域的DNA序列。其還涉及檢測特異茄子植物EE-1事件存在或不存在的方法。本發(fā)明還提供了用于在轉(zhuǎn)基因茄子植物中辨別上述特異茄子植物EE-1原種事件的診斷方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于鑒定包含原種事件EE-1的轉(zhuǎn)基因植物的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101421404SQ200780012769
公開日2009年4月29日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者拉格納特·巴拉特·查爾, 波帕特拉·拉特那帕爾·甘地 申請人:馬哈拉施特拉雜交種子有限公司