專利名稱：提高造血干細(xì)胞植入的方法和組合物的制作方法
提高造血干細(xì)胞植入的方法和組合物
1. 相關(guān)應(yīng)用的交叉文獻(xiàn)本申請(qǐng)要求根據(jù)35 U.S.C.S119(e)在2006年2月14日 提交的U. S.S.N. 60/773， 405，所以在此全文引用作為參考。
2. 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及提高干細(xì)胞治療的方法和組合物，而且尤其是 有助亞優(yōu)化劑量(suboptimal doses)造血干細(xì)胞植入的方法和組合 物。
3.
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞移植 (Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT )是眾多造血障礙療法的重要組成部分。 一般 來(lái)講，有兩種HSCT:自體移植和同種異體移植。自體移植涉及清髓治 療后受體自身細(xì)胞的注入。自體細(xì)胞移植可最小化移植物抗宿主 (Graft versus host disease, GVHD)疾病的風(fēng)險(xiǎn)并減少并發(fā)癥。 同種異體移植涉及供體干細(xì)胞的注入，典型的是使用與受體MHC相配 的供體。但是，相配非相關(guān)供體(Matched unrelated donor, MUD)移 植也有很強(qiáng)的移植物抗宿主反應(yīng)，因而導(dǎo)致較高的死亡率。造血千細(xì)胞(HSC)有三種主要來(lái)源骨髓，外周血及臍帶 血。臍帶血(Umbilical cord blood, UCB )是其他造血始源(也即骨 髓和動(dòng)員后的外周血)的實(shí)用替代來(lái)源，可用于相關(guān)及非相關(guān)異體造 血千細(xì)胞移植。然而不幸的是，雖然臍帶血容易獲得，并展示了較低 的移植物對(duì)抗宿主疾病的發(fā)病率，但是它有延時(shí)植入的特性。
相應(yīng)地，盡管從臍帶血中獲取HSC用以治療造血障礙有廣 大前景，但造血功能恢復(fù)緩慢仍然是一個(gè)主要問(wèn)題。Laughlin等人， f/^. /. 351: 22; 2265-2275 (2004)。 低溫儲(chǔ)藏的有核細(xì)
胞(Nucleated cell, NC )劑量是決定嗜中性粒細(xì)胞恢復(fù)的主要因素， 較高的CD34+細(xì)胞量與非相關(guān)供體臍帶血UCB移植中增高的存活率相 關(guān)。Laughlin等人。注入的細(xì)胞量少于1. 8 x 107個(gè)NC/kg或少于1. 7 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞/kg受體重量的UCB成人受體移植， 一般移植較差 存活率較低。Wagner等人，"/ood 100; 51 1611-1618。當(dāng)有核細(xì)胞 量低于1. 5 x 107kg時(shí)，尤為糟糕的結(jié)果曾發(fā)生在UCB移植中。Grewal 等人""od， 101; 11; 4233-4244。人白細(xì)胞抗^f、 (Human leukocyte antigen, HLA)錯(cuò)酉己7JC 平和HSCT存活率之間的關(guān)系已經(jīng)被很好的建立。例如，當(dāng)移植物至少 有1. 7 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞/kg時(shí)，不超過(guò)兩個(gè)相異HLA的UCB移植受 體有較高的存活率。Wagner等人。因此，含較高細(xì)胞量的UCB移植物是成人患者優(yōu)化移植的 必須物這一事實(shí)已得到公認(rèn)。Rocha等人建議一單位的臍帶血冷凍時(shí) 應(yīng)至少含有2. 0 x 10'個(gè)有核細(xì)胞/kg,并且在與受體HLA、 B或DRB1 相配性上(單一或混合)，相異體不應(yīng)多于兩個(gè)。Rocha等人，見(jiàn) /. 351: 22; 2276-2285 (2004)。然而可接受的最小UCB移植
物細(xì)胞注入劑量仍未統(tǒng)一，有人提出最小可接受劑量約為1.5xl(T有 核細(xì)胞/kg至約1. 7 x 105 kg CD34+細(xì)胞。Grewal等人，Wagner等人。不論任何情況下，即使UCG細(xì)胞量等于或高于上述劑量， 其移植效率仍明顯低于從骨髓或周邊血而得的HSC移植。Rocha等人， p. 2281和圖A。此外，即使只有一個(gè)錯(cuò)配，移植效果也會(huì)變得更糟。 Gluckflian等人，^r/ . #ei WoL 32: 397-407 (2004)。因此，人們?nèi)詷O 為關(guān)注提高從UCB所獲HSC的移植以及提高干細(xì)胞移植效率。4. 發(fā)明概述本公開(kāi)內(nèi)容描述了用于提高干細(xì)胞移植的方法、組合物和 試劑盒。尤其是提供了輔助造血干細(xì)胞(HSC)移植的方法，包括對(duì)移 植患者施用HSC移植物時(shí)聯(lián)合使用髓系祖細(xì)胞(Myeloid progenitor cell, MP)移植物。該MP移植物可以是該HSC移植物和/或該患者的 自體或異體物質(zhì)，并且可以進(jìn)一步包括異體MP細(xì)胞的混合體。在優(yōu)選 實(shí)施方案中，施用前會(huì)對(duì)MP細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增。如此處所述，MP聯(lián)合HSC的使用能極大地提高HSC移植， 尤其是在患者所受HSC為亞優(yōu)化劑量的情況下。因此， 一方面本發(fā)明 提供了提高亞優(yōu)化HSC移植的方法，包括對(duì)患者聯(lián)合施用HSC移植物 和MP移植物。 一般來(lái)講，優(yōu)化的HSC移植劑量是指有核細(xì)胞(NC)和/ 或CD34+細(xì)胞在HSC移植物中的有效數(shù)量，以及/或者患者和HSC移植 物MHC的錯(cuò)配程度。—方面為獲得成功的干細(xì)胞移植，優(yōu)化的HSC移植物需達(dá) 到一臨界細(xì)胞/患者kg量。優(yōu)化的造血干細(xì)胞移植物一般包含至少約 1. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者、至少約2. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每 kg/患者、優(yōu)選的至少約3.0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者、更優(yōu)選 的至少約4. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者以及最優(yōu)選的高于5. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者。因此， 一方面來(lái)講本發(fā)明使用MP移植物聯(lián)合亞優(yōu)化HSC 移植物的方法，該亞優(yōu)化狀態(tài)一般包含小于約5. 0 x 106 CD34+細(xì)胞每 kg/患者，更具體來(lái)講小于約4.0 x 106 CD34+細(xì)胞每kg/患者、優(yōu)選 小于約3. 0 x 106 CD34+細(xì)胞每kg/患者、更優(yōu)選小于約2. 0 x 106 CD34+ 細(xì)胞每kg/患者或最優(yōu)選小于約1. 0 x 10' CD34+細(xì)胞每kg/患者。
在某些實(shí)施方案中，從骨髓或周邊血中獲得亞優(yōu)化移植物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，注入的亞優(yōu)化移植物包括少于約5 x 108個(gè)有核 細(xì)胞/kg患者、更優(yōu)選的少于4. 5或4. 0 x 1()8個(gè)有核細(xì)胞/kg患者以 及最優(yōu)選的少于約4. 1 x 1()8個(gè)有核細(xì)胞/kg患者。另一替代實(shí)施方案 中，注入的亞優(yōu)化移植物可包括少于約6 x 1(T個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者、 更優(yōu)選的少于約4. 5至5.5 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者/kg以及最優(yōu) 選的少于約5. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。在某些實(shí)施方案中，從臍帶血中獲得亞優(yōu)化移植物。在一 個(gè)實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物包括從少于兩單位臍帶血中衍生的HSC， 更優(yōu)選的是只從一單位臍帶血中獲取。在另一例實(shí)施方案中，注入的 亞優(yōu)化移植物包括少于約4 x 10'個(gè)有核細(xì)胞/kg患者、更優(yōu)選的少于 約3. 0 x 1()7個(gè)有核細(xì)胞/kg患者以及最優(yōu)選的少于約3.5 x 107個(gè)有 核細(xì)胞/kg患者。在另一替代實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物可包括少于 約5 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者、更優(yōu)選的少于約3. 5至4. 5 x 105 個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者/kg以及最優(yōu)選的少于約4. 0 x 105個(gè)CD3f細(xì)胞 /kg患者。另一方面，亞優(yōu)化移植物包括與患者表型相比多于一個(gè) MHC錯(cuò)配的HSC。本發(fā)明還提供了用于提高干細(xì)胞移植的組合物。 一方面， 該組合物包括造血千細(xì)胞和髓系祖細(xì)胞自體或異體混合物。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該MP細(xì)胞在與HSC結(jié)合前被擴(kuò)增。同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法提供 試劑盒用以分離、擴(kuò)增、保存和施用MP和HSC。
5. 附圖簡(jiǎn)述技術(shù)人員會(huì)理解附圖只是用于說(shuō)明目的，而不是在任何方 面對(duì)本發(fā)明范圍進(jìn)行限制。
圖l表示從C57B6/Ka(Thy-1.1， CD45. 2)中收集KTLS HSC 的分類門(Sortgate)。圖3表示同源移植模型的存活數(shù)據(jù)。圖4表示同種異體(相匹配的非相關(guān)供體)移植模型的存 活數(shù)據(jù)。圖5表示同種異體(完全錯(cuò)配的)移植模型的存活數(shù)據(jù)。圖6概述三種移植模型(同源、相匹配的非相關(guān)供體和錯(cuò) 配異體)的存活及嵌合數(shù)據(jù)。圖7表示實(shí)施例3中用于純化KTLS C57B6/Ka (Thy-l. 1、 CD45. 1、 H2b)HSC的分選。圖8表示AKR(Thy-l. 1、 CD45. 2、 H2k)培育衍生的MP的 分析數(shù)據(jù)。圖9表示移植模型的存活數(shù)據(jù)，相匹配的非相關(guān)供體KTLS HSC和完全錯(cuò)配的同種異體培育衍生的MP被共同移植入此模型。圖IO表示移植模型的存活數(shù)據(jù)，MHC相匹配的非相關(guān)供體 HSC和從2 MHC錯(cuò)配供體衍生的MPC被共同移植入此模型。
6. 發(fā)明詳述 6. 1定義參照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容，除非特殊定義，本文敘述所用科技 術(shù)語(yǔ)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的含義。因此，以下術(shù)語(yǔ)有如下含 義"同種異體的(Allogeneic)"指衍生于、起源于相同物 種或是為相同物種的成員，此處所說(shuō)成員為遺傳相關(guān)或遺傳不相關(guān)但 相似。"異體移植"指從供體向受體轉(zhuǎn)移細(xì)胞或器官，此處受體和供 體為同一物種。"自體的(Autologous)"指衍生或起源于相同目標(biāo)物或患者。"自體移植"指目標(biāo)物自身細(xì)胞或器官的收集和再移植。"常見(jiàn)髄系祖細(xì)胞"或"髓系祖細(xì)胞，，或"MP"指能最終 發(fā)育成任何一種髓系終端分化細(xì)胞的多能或單能祖細(xì)胞，但該細(xì)胞一 般不會(huì)分化成淋巴系細(xì)胞。因此，"髄系祖細(xì)胞"指髓系的任何祖細(xì) 胞。如此處所定義的，髓系常見(jiàn)祖細(xì)胞包括寡能干細(xì)胞CMP、 GMP和 MEP，也包括單能紅系祖細(xì)胞、巨核祖細(xì)胞、粒系祖細(xì)胞和巨嗜祖細(xì) 胞。髓系祖細(xì)胞的分化細(xì)胞群不同于其他細(xì)胞的是它們的分化潛能和 一套特征性的細(xì)胞標(biāo)記。"常見(jiàn)髓系祖細(xì)胞(Common myeloid progenitor cell)，， 或"CMP，，有能生成津立/單核4且細(xì)胞(Granulocyte/monocyte progenitor cell, GMP)以及巨核/紅系祖細(xì)胞的細(xì)胞(Megakaryocyte/erythroid progenitor cell, MEP)的特性。該祖細(xì)胞有有限的或不具備自我更 新能力，但能生成髓系樹突狀細(xì)胞、髓系紅細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、 粒細(xì)胞/巨嚆細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。"同類系(Congenic)"指衍生或起源于相同物種，或是 為相同物種的成員，此處所說(shuō)的成員除一小部分遺傳區(qū)域外(一般為 單遺傳位點(diǎn)，即單一基因)有相同的遺傳學(xué)特性。"同類系移植"指 將細(xì)胞或器官?gòu)墓w轉(zhuǎn)移到受體，此處受體與供體除單遺傳位點(diǎn)外有 相同的遺傳學(xué)特性。文中所述細(xì)胞"擴(kuò)增，，或"擴(kuò)增的，，指從初始細(xì)胞群增加 特定細(xì)胞型(們)的數(shù)量，此處的細(xì)胞群可以或不需為單一性的。用 于擴(kuò)增的初始細(xì)胞不必與所得擴(kuò)增細(xì)胞相同。例如，被擴(kuò)增的細(xì)胞可 以經(jīng)由初始細(xì)胞群間接體內(nèi)或體外生長(zhǎng)分化而的。本術(shù)語(yǔ)不包括用于 鑒定細(xì)胞分化潛能的有限稀釋分析法。
文中所述細(xì)胞"功能的，，指能運(yùn)作的細(xì)胞或是保有特殊細(xì) 胞型相關(guān)常規(guī)功能或活性的細(xì)胞，該功能可用定義的功能分析法(們) 鑒定。例如，"有功能的GMP細(xì)胞"指能最終分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì) 胞的祖細(xì)胞，此處所指終端分化的細(xì)胞有正常的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的 功能。"移植物對(duì)抗宿主反應(yīng)"或"GVH"或"G濯"指當(dāng)不同的 MHC類淋巴細(xì)胞被引入宿主時(shí)，引起的淋巴細(xì)胞對(duì)抗宿主的細(xì)胞學(xué)反應(yīng)。"粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞"或"GMP"指一種細(xì)胞，該細(xì) 胞衍生于常見(jiàn)髓系祖細(xì)胞、有能生成粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特性，但是 一般不能生成紅系髓系細(xì)胞或巨核髓系細(xì)胞。"分離的，，指從至少另一種產(chǎn)物、化合物或組合物中分離 出的產(chǎn)物、化合物或組合物，不論是自然產(chǎn)生或合成而的，所得產(chǎn)物、 化合物或組合物為其自然態(tài)。"造血干細(xì)胞"或"HSC，，為克隆性的、能自我更新的多能 細(xì)胞，該細(xì)胞能最終分化成造血體系所有的細(xì)胞型，包括B細(xì)胞T細(xì) 胞、NK細(xì)胞、淋巴樹突細(xì)胞、髓系樹突細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、巨 核細(xì)胞和紅細(xì)胞。與造血系統(tǒng)其他細(xì)胞相同，HSC也有一套特定的細(xì) 胞標(biāo)記來(lái)區(qū)別鑒定。"標(biāo)記表型，，指細(xì)胞上決定其表型(例如分化狀態(tài)和/或細(xì) 胞型)的特征性標(biāo)記和抗原。這可用免疫表型來(lái)鑒定，即用抗體來(lái)識(shí) 別細(xì)胞表面抗原?？贵w可為單克隆或多克隆抗體，但一般選用與其他 細(xì)胞標(biāo)記交叉反應(yīng)最小的抗體。眾所周知特定細(xì)胞分化或細(xì)胞表面標(biāo) 記對(duì)于待生出該細(xì)胞的動(dòng)物物種是獨(dú)特的，然而其他細(xì)胞標(biāo)記可能常見(jiàn)于不同物種中。盡管物種結(jié)構(gòu)不同(例如氨基酸序列)，定義物種 間等效細(xì)胞型的標(biāo)記為相同的識(shí)別標(biāo)記。細(xì)胞標(biāo)記包括細(xì)胞表面分子
(特定情況也稱為細(xì)胞分化(Cell differentiation, CD)標(biāo)記)和 基因表達(dá)標(biāo)記。基因表達(dá)標(biāo)記是用于指示細(xì)胞型或分化狀態(tài)的表達(dá)基 因。部分地，盡管基因表達(dá)鐠可能包括非細(xì)胞表面分子，它們反映了 細(xì)胞表面4示i己。"錯(cuò)配的同種異體的"指衍生或起源于相同物種或?yàn)橄嗤?物種的成員，該物種有非相同的主要組織復(fù)合物(Major histo函patability complex, MHC )抗原(即蛋白質(zhì))，該抗原一 般是用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)分析法鑒定的(例如定義多種MHC抗原的血清學(xué)和 分子學(xué)分析)。"部分錯(cuò)配"指所測(cè)成員間(一般指供體和受體間) MHC抗原型部分相配。例如，"半數(shù)錯(cuò)配"指兩成員間所測(cè)MHC抗原 有50%的不同。"全部，，或"完全"錯(cuò)配指兩成員間所測(cè)MHC抗原全 部不同。"清髓性的(Myeloablative)，，或"清髓"指損壞或摧毀 造血系統(tǒng)， 一般用細(xì)胞毒試劑或輻射療法進(jìn)行。清髓包括完全清髓， 指用高劑量細(xì)胞毒試劑或全身輻射來(lái)摧毀造血系統(tǒng)。清髓也包括用非 清髓性條件造成的不完全清髓狀態(tài)。因此，非清髓性條件指不完全摧 毀患者造血系統(tǒng)的療法。"自我更新"指細(xì)胞能分裂生成至少一個(gè)與母細(xì)胞有相同 特性(例如，自我更新)子細(xì)胞的能力。第二個(gè)子細(xì)胞可能形成特姝的分化途徑。例如，自我更新造血干細(xì)胞分裂形成一個(gè)子干細(xì)胞和另 一個(gè)向髓系或淋巴系分化的子細(xì)胞。常見(jiàn)祖細(xì)胞一般會(huì)失去自我更新 能力，而細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞，它們表現(xiàn)出更為分化的(即限制 性的)表型。細(xì)胞"分選"指基于物理特性或所含標(biāo)記進(jìn)行的細(xì)胞分離 (如用測(cè)向散射(Side scatter, SSC)和前向散射(Forward scatter, FSC)分選或用標(biāo)記的抗體進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分類(Fluorescence activation cell sorting, FACS ))，或是基于所含細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行 的細(xì)胞分析，例如不分選的FACS。"超純細(xì)胞群，，指有特殊細(xì)胞標(biāo)記特征和分化潛能的細(xì)胞 群，至少約50%、優(yōu)選至少約75-80%、更優(yōu)選至少約85-90%、以及最 優(yōu)選至少約95%的細(xì)胞組成總細(xì)胞群。因此，"超純細(xì)胞群"指在所 設(shè)計(jì)的分析條件下，沒(méi)有特殊細(xì)胞標(biāo)記特征和分化潛能的細(xì)胞占細(xì)胞 群的比例少于約50°/。、優(yōu)選少于約20-25°/。、更優(yōu)選少于約10-15%、以 及最優(yōu)選少于約5%。"目標(biāo)物"或"患者，，可相互替換，除特別說(shuō)明外， 一般
指哺乳動(dòng)物例如人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，也可指兔子、大鼠、小鼠、 山羊、豬和其他哺乳類物種。"同源的(Syngeneic)，，指衍生或起源于相同物種，或?yàn)?相同物種的成員，此處相同物種指遺傳相同，尤其是指抗原或免疫反 應(yīng)相同。包括有相配MHC型的同卵雙胞胎。因此"同源移植"指從供 體轉(zhuǎn)移細(xì)胞或器官到受體，該受體與供體遺傳相同。"異種的(Xenogeneic)"指衍生或起源于不同物種，或 為不同物種的成員，例如人類和嚙齒類、人和豬、人和黑猩猩等。"異種移植，，指從供體轉(zhuǎn)移細(xì)胞或器官到受體，該受體與供體屬于不同物種。
6.2提高造血干細(xì)胞移植物的移植本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容描述了輔助干細(xì)胞移植的方法、組合物和 試劑盒。 一方面，本文提供了提高所需患者HSC移植的方法，包括施 用(MP)細(xì)胞。如本文首次說(shuō)明，MP細(xì)胞提高多種HSC移植，因此提 高了接受HSC移植的患者生存率，尤其是在細(xì)胞計(jì)數(shù)及/或HLA錯(cuò)配為 亞優(yōu)化情況下的HSC移植。造血干細(xì)胞為多能干細(xì)胞，能自我更新并且具有在許可條 件下生成造血系統(tǒng)所有細(xì)胞型的特性。HSC自我更新指HSC細(xì)胞分裂 產(chǎn)生至少一個(gè)與HSC —樣具有自我更新和分化潛能的子細(xì)胞的能力； 也即，細(xì)胞分裂產(chǎn)生額外的HSC。自我更新為造血系統(tǒng)補(bǔ)給提供了連 續(xù)的非分化干細(xì)胞來(lái)源。用于鑒定HSC的標(biāo)記表型為在本領(lǐng)域常見(jiàn)表 型。對(duì)于人類HSC，細(xì)胞標(biāo)記表型優(yōu)選為CD34+CD38—CD90(Thyl)+Lin—。 對(duì)于小鼠HSC，細(xì)胞標(biāo)i己表型例證為Sca-l+CD90+(見(jiàn)例證，Spangrude， G. J.等人，Sc/e/ ce 1: 661-673 (1988))或c-kit+Thy'。Lin—Sca-r(見(jiàn)， Uchida， N,等人，/. //jyeW. 101 (5): 961-966 (1998))。替代
HSC才示i己:i口乙搭脫氛酵(見(jiàn)Storms等人，尸roc. A"at， / Sc/. 96:9118-23 (1999)、 AC133 (見(jiàn)Yin等人，Woc^ 90: 5002-12 (1997) 和CD150(SLAM)(見(jiàn)Kiel Ce// 2005， 121(7) 1109-21)有時(shí)也可便 利使用。 HSC生成常見(jiàn)淋系或髓系祖細(xì)胞(MP)。如本文所用，常 見(jiàn)髓系祖細(xì)胞指能分化成任一髓系終端分化細(xì)胞的細(xì)胞群。髓系祖細(xì) 胞包括常見(jiàn)髓系祖細(xì)胞(CMP)，指自我更新有限或非自我更新的細(xì)胞 群，但是它們能進(jìn)行細(xì)胞分裂形成粒/巨噬祖細(xì)胞(GMP )和巨核/紅系 祖細(xì)胞(MEP)。非自我更新細(xì)胞指細(xì)胞分裂產(chǎn)生子細(xì)胞，然而所有子細(xì)胞都沒(méi)有母細(xì)胞型的分化潛能，而反之產(chǎn)生分化了的子細(xì)胞。用于
鑒別CMP的標(biāo)記表型包括本領(lǐng)域通常所知的表型。對(duì)于鼠源CMP細(xì)胞， 細(xì)胞群的特異性標(biāo)記表型為 c-Kithi"(CD117)CD16一CD34一 Sca-inesLin^和更為特異性的標(biāo)記表型Fc y R'。IL-7R aneg (CD127)。鼠 CMP細(xì)胞群也特異性缺少某些標(biāo)記的表達(dá)，包括B220、 CD4、 CD8、 CD3、 Terll9、Gr-1和Mac-l。對(duì)于人源CMP細(xì)胞，細(xì)胞群的特性為CD34+CD38+ 以及更為特異性的標(biāo)記表型CD123+(IL-3Ra)CD45RAneg。人CMP細(xì)胞群 也特異性缺少一些細(xì)胞標(biāo)記，包括CD3、 CD4、 CD7、 CD8、 CDIO、 CDllb、 CD14、 CD19、 C訓(xùn)、CD56和CD235a。對(duì)多種髓性祖細(xì)胞標(biāo)記表型的描 述都有記載，例如U.S. Patent Nos. 6, 465, 247和6, 761, 883; Akashi, iVa^re 404: 193-197 (2000)和Manz，tV^〃.力cad. /7W 99 (18): 11872-7 (2002);所有出版物在此全文引用作為參考。另一髓系常見(jiàn)祖細(xì)胞為粒/巨噬祖細(xì)胞(GMP)。該祖細(xì)胞 群的細(xì)胞特征為其產(chǎn)生粒細(xì)胞(例如嗜堿細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜中性 粒細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞的能力。與其他常見(jiàn)祖細(xì)胞相似，GMP細(xì)胞缺少 自我更新能力。鼠 GMP 細(xì)胞特征性標(biāo)記表型為 c-Kithi(CD117)Sca-lnesFcYRhi(CD16)IL-7RYnegCD34p°s。鼠GMP細(xì)胞也 缺少某些標(biāo)記表達(dá)，如B220、 Terl19、 CD4、 CD8、 CD3、 Gr-l、 Mac-l 和C謂。人GMP細(xì)胞的特征性標(biāo)記表型為CD34+CD38+CD123+CD45RA+。 人GMP細(xì)胞群也特征性的缺少標(biāo)記CD3、 CD4、 CD7、 CD8、 CDIO、 CDllb、 CD14、 CD19、 CD20、 CD56和CD235a。從CMP細(xì)胞衍生的巨核/紅系祖細(xì)胞(MEP)其特征為分化 成常見(jiàn)巨核祖細(xì)胞和紅系祖細(xì)胞的能力。成熟巨核細(xì)胞為多倍體細(xì)胞， 是形成血小板的先驅(qū)細(xì)胞，此發(fā)育過(guò)程由血小板生成素調(diào)節(jié)。紅細(xì)胞 由常見(jiàn)紅系祖細(xì)胞生成，該過(guò)程由促紅細(xì)胞生成素調(diào)節(jié)，最終分化成 成熟的血紅細(xì)胞。鼠MEP特征性細(xì)胞標(biāo)記表型為C-Kitw和IL-7Rneg，并進(jìn)一步由FclT和CD34^特異化。鼠MEP細(xì)胞群也特異性的缺少標(biāo) 記B220、 Terl19、 CD4、 CD8、 CD3、 Gr-l和C謂。另一'J、鼠MEP標(biāo)記 表型例證為c-kithighSca-niiT"^CD16^CD34':人MEP細(xì)胞特征性 標(biāo)記表型為CD34+CD38+CD123negCD45RAneg。人MEP細(xì)胞群也特征性缺少 標(biāo)記CD3、 CD4、 CD7、 CD8、 CDIO、 CDllb、 CD14、 CD19、 CD20、 CD56 和CD235a。髓系中被進(jìn)一步限定的祖細(xì)胞為粒祖細(xì)胞、巨噬祖細(xì)胞、 巨核祖細(xì)胞和紅系祖細(xì)胞。粒祖細(xì)胞特征為具有分化成終端分化粒細(xì) 胞的能力，包括嗜曙紅細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。粒祖細(xì)胞一 般不分化成髓系其他細(xì)胞。巨核祖細(xì)胞(Megakaryocyte progenitor cell, MKP)特征為能分化成終端分化巨核細(xì)胞，但不能分化成髓系其 他細(xì)胞(見(jiàn)例證W0 2004/024875 )。可從多種來(lái)源獲得HSC和MP細(xì)胞，包括骨髓、周邊血、臍
帶血和其它已知收集造血和髓系祖細(xì)胞的來(lái)源，包括肝臟尤其是胎兒 肝臟。周邊和臍帶血富含HSC和MP細(xì)胞。細(xì)胞用本領(lǐng)域已知或常用方 法獲得。例如，準(zhǔn)備骨髓細(xì)胞的方法在Sutherland等人，丑o/3e他rrofr 尸roces"'/7"/^/戶ui^/2g.'爿戶ra"/ca/ (7w/ e (Gee, A. P. ed.) ， CRC Press Inc. (1991))中有所描述。HSC和MP細(xì)胞也可用適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增和 分化技術(shù)從原始干細(xì)胞資源獲得，例如胚胎干細(xì)胞(Thomson等人， ^r/e/7ce 282: 1145 (1998))和生殖細(xì)胞(Shamblott等人，尸roc. ^s〃. Xc". Sc/.咖95: 13726 (1998))。如本文所述，HSC和MP細(xì)胞可衍生于任何有造血系統(tǒng)的動(dòng) 物物種。優(yōu)選地，合適的動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，包括(僅為例證但不限于) 嚙齒動(dòng)物、兔子、犬、貓、豬、馬、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，人)等。某些實(shí)施方案中，用到擴(kuò)增的干細(xì)胞群?？稍诤?xì)胞因子混合物的不同培養(yǎng)液中擴(kuò)增干細(xì)胞。擴(kuò)增的干細(xì)胞群不受任何細(xì)胞起
源機(jī)制或理論的限制，并可體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，因此可提高細(xì)胞CD34 抗原表達(dá)或結(jié)合。在本領(lǐng)域有已知的干細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)，包括U. S. Pat. No. 6, 326, 198、 U.S. Pat. No. 6,338,942; U.S. Pat. No. 6， 335， 195， 在此全文引用作為參考。某些實(shí)施方案中，用到擴(kuò)增的MP群。可在含細(xì)胞因子混合 物的不同培養(yǎng)液中擴(kuò)增MP細(xì)胞。擴(kuò)增的MP細(xì)胞群不受任何細(xì)胞起源 機(jī)制或理論的限制，并可體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，因此可提高細(xì)胞CD34 抗原表達(dá)或結(jié)合。在本領(lǐng)域有已知的MP細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)，例如包括待定 專利U.S. Patent App. Ser. No. 11/259, 592 (標(biāo)題為擴(kuò)增髓系細(xì)胞 群的方法及其相關(guān)應(yīng)用)和U. S. Patent No: 6， 967， 029，在此全文引 用作為參考。本發(fā)明可用于自體或同種異體HSC移植。因此，在某一實(shí) 施方案中，提供了通過(guò)使用MP細(xì)胞提高自體HSC移植物移植的方法， 如本文所述，該MP細(xì)胞對(duì)于HSC移植物或患者可為自體或異體的。在 其他實(shí)施方案中，提供了通過(guò)使用MP細(xì)胞提高異體HSC移植物移植的 方法，如本文所述，該MP細(xì)胞對(duì)于HSC移植物或宿主可為自體或異體 的。因此，本發(fā)明確定了所述方法中使用的HSC和MP細(xì)胞相對(duì)于HSC 移植物的MHC和移植患者來(lái)說(shuō)，可為完全匹配的細(xì)胞、部分錯(cuò)配異體 細(xì)胞和/或完全錯(cuò)配異體細(xì)胞，它們可來(lái)自于有關(guān)聯(lián)的供體(通常為有 相同親本等位基因的兄弟或姐妹)或不相關(guān)供體。HSC和MP細(xì)胞可被進(jìn)一步篩選和純化(包括正篩選和負(fù)篩 選)，以獲得超純細(xì)胞群。 一方面，用熒光激活細(xì)胞分類(Fluorescence activated cell sorting, FACS )(也作流式細(xì)胞術(shù))分選和分析不 同細(xì)胞群。帶有HSC和MP細(xì)胞群特異性細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞,皮與細(xì)胞標(biāo)記 相結(jié)合的抗體(或一般來(lái)說(shuō)抗體混合物)標(biāo)識(shí)。識(shí)別不同標(biāo)記的每一抗體都有與可檢測(cè)的分子相結(jié)合，尤其是熒光染料，該染料能與偶連 在其他抗體上的熒光染料相區(qū)別。標(biāo)記或"染色"的細(xì)胞流通過(guò)激發(fā) 熒光的光源，檢測(cè)到的細(xì)胞發(fā)射譜可決定某一特殊標(biāo)記抗體的存在。 通過(guò)檢測(cè)同時(shí)發(fā)生的不同熒光(在本領(lǐng)域也作多色熒光細(xì)胞分選)， 攜帶不同標(biāo)記組的細(xì)胞可從群中其他細(xì)胞中被鑒別和分離出來(lái)。其他
FACS參數(shù)，包括(僅為例證并不局限于)測(cè)向散射(SSC)、前向散 射(FSC)和活體染色(例如，碘化吡咬染色)，可通過(guò)大小和存活性 來(lái)篩選細(xì)胞。HSC和祖細(xì)胞的FACS分選和分析描述在U. S. Patent Nos. 5, 137, 809、 5， 750， 397 、 5, 840, 580; 6, 465, 249; Manz， M. G.等人， 尸roc. ^〃. JcaA 99: 11872-11877 (2002);和Akashi， K.
等人，iV^"re 404 (6774): 193-197 (2000))及其他文獻(xiàn)中。關(guān)于熒光 激活細(xì)胞分選的一般性指導(dǎo)描述在，如，Shapiro, H. M.，戶rac〃ca/ 尸/o^6W咖"ix 4th Ed. ， Wiley-Liss (2003)和Ormerod, M. G. ， Cyfo邁"w j /Vac〃ca/ y4/7proac力,3rd Ed. ， Oxford University Press (2000)。已知細(xì)胞純化的方法也包括本文所述的組合法。典型的組 合措施包括有效移除多余細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)的初始步驟，例如白細(xì)胞去 除術(shù)。第二步包括用抗體結(jié)合底物的免疫吸附法分離表達(dá)一個(gè)或多個(gè) 祖細(xì)胞群常見(jiàn)標(biāo)記的細(xì)胞。例如，攜帶抗CD3卩抗體的磁珠可結(jié)合并捕 獲通常表達(dá)CD34抗原的HSC、 CMP和GMP細(xì)胞。另一額外步驟提供對(duì) 不同細(xì)胞型更高的分辨率(例如用識(shí)別一套特異性細(xì)胞標(biāo)記的抗體進(jìn) 行FACS分選)，該步驟可用于獲得超純目標(biāo)細(xì)胞群。另一聯(lián)合方法可 包括用攜帶抗CD34的磁珠進(jìn)行初步分離，而后用FACS進(jìn)一步純化。根據(jù)特殊目的的常規(guī)程序?qū)⒂脤?shí)證決定治療效果所需細(xì)胞 量。 一般來(lái)講，為治療目的使用的細(xì)胞需達(dá)到藥理有效劑量。"藥理 有效量，，或"藥理有效劑量"指足以產(chǎn)生所要病理效果的劑量或是能 得到所要結(jié)果的劑量，特別是指患者的移植或存活。不論癥狀是否得到改善，治療效果也包括暫停或減緩疾病或失調(diào)進(jìn)程。如上所說(shuō)，藥 理有效計(jì)量也可用于和細(xì)胞結(jié)合的治療復(fù)合物，這在下文有所描述。干細(xì)胞移植物的功能可隨患者的年齡、體重和健康狀態(tài)及 適應(yīng)癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度變動(dòng)。HSC的適用劑量根據(jù)這些條件變動(dòng)。為得到成功的干細(xì)胞移植，優(yōu)化的HSC移植物需要達(dá)到一 個(gè)細(xì)胞/kg患者的閾值。根據(jù)已出版資料和最近的臨床研究結(jié)論，優(yōu) 化的HSC移植物一般應(yīng)含至少約1. 0 x 1()6個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者、 至少約2. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者、優(yōu)選的至少約3. 0 x 106 個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者、更優(yōu)選的至少約4. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每 kg/患者以及最優(yōu)選的大于5.0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者。例證 見(jiàn)01ivieri, A.等人(1998 )〃織"o/og/c3, 83: 329-337; Mavroudis， D.等人(1996 ) S/一 Vo. 88， No. 8 (October 15); pp3223-3229; Singhal， S.等人(2000 )A7/7e他r/w7ya卿/fl/ "〃叫26， 489-96; Bittencourt， H.等人(2002 ) Woo《Vol. 99， No. 8 (April 15); 2726-2733)。優(yōu)化方面，主體方法和組合物被用于少于優(yōu)化HSC劑量的 移植物，例如用本領(lǐng)域已知方法決定的、導(dǎo)致低于中間療效的劑量。 在某些實(shí)施案例中，使用MP細(xì)胞提高亞優(yōu)化劑量造血干細(xì)胞的移植。 在某些實(shí)施案例中，結(jié)合使用MP細(xì)胞和亞優(yōu)化劑量造血千細(xì)胞可提高 患者生存率。該方法中，對(duì)患者使用結(jié)合MP的亞優(yōu)化移植物可整體改
善有效治療。因此，一方面本發(fā)明所用方法結(jié)合^f吏用MP移植物和亞優(yōu)化 的HSC移植物， 一般來(lái)講亞優(yōu)化的HSC移植物包括少于約5.0 x 106 個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者、更特異的是少于約4. 0 x 1(^個(gè)CDM+細(xì)胞 每kg/患者、優(yōu)選少于約3.0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞^^kg/患者、更優(yōu)選少于約2. 0 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者或是最優(yōu)選少于約1. 0 x 106 個(gè)CD34+細(xì)胞每kg/患者。 —單位臍帶血指從單個(gè)胚胎和臍帶中收集的血。臍帶血中 的有核細(xì)胞數(shù)是變化的。此外， 一單位臍帶血中的有核細(xì)胞數(shù)在冷凍 和解凍的過(guò)程中可能會(huì)減少。因此，使用HSC時(shí)，應(yīng)注意單位血中的 有核細(xì)胞數(shù)是在解凍之前或之后計(jì)量的。在某些實(shí)施方案中，亞優(yōu)化 移植物包括少于兩單位的臍帶血。在某些實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物 包括一單位的臍帶血。在某些實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物功效取決于給患者施用 的每kg患者體重的個(gè)有核細(xì)胞(Nucleated cell, NC )。在一個(gè)實(shí)施 方案中，注入的亞優(yōu)化UCB移植物約為4 x 10'個(gè)有核細(xì)胞/kg患者。 在一個(gè)實(shí)施方案中，亞優(yōu)化UCB移植物為少于3 x 1()7個(gè)有核細(xì)胞/kg 患者、優(yōu)選的為少于約3. 5 x 1()7個(gè)有核細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí)施方 案中，注入的亞優(yōu)化UCB移植物約為2或2. 5 x 10'個(gè)有核細(xì)胞/kg患 者。源自骨髓或周邊血的優(yōu)化HSC移植物細(xì)胞計(jì)數(shù)閾值一般比 UCB移植物大一個(gè)數(shù)量級(jí)。在一個(gè)實(shí)施案例中，從上述來(lái)源所得用于 注入的亞優(yōu)化移植物約為5 x 1()8個(gè)有核細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí)施案 例中，亞優(yōu)化移植物少于4或4. 5 x 1()8個(gè)有核細(xì)胞/kg患者，而優(yōu)選 量少于約4. 1 x 1()8個(gè)有核細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí)施案例中，亞優(yōu)化 移植物少于約3或3. 5 x 1()S個(gè)有核細(xì)胞/kg患者。在某些實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物功效取決于向患者施用 的有效CD34+細(xì)胞數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，注入的亞優(yōu)化UCB移植物少 于約5 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，注入的亞優(yōu) 化UCB移植物少于約3. 5至4. 5 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者，而優(yōu)選的少于約4 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，注入的 亞優(yōu)化UCB移植物少于約3 x 10s個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。源自骨髓或周邊血的優(yōu)化HSC移植物細(xì)胞計(jì)數(shù)閾值一般約 比UCB移植物大一個(gè)數(shù)量級(jí)。在一個(gè)實(shí)施案例中，來(lái)自上述資源用于 注入的亞優(yōu)化移植物少于約5 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí) 施案例中，用于注入的亞優(yōu)化移植物少于約4 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞/kg 患者，而優(yōu)選的少于約3 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。在一個(gè)實(shí)施方 案中，注入的亞優(yōu)化移植物少于約2或1 x 106個(gè)CD34+細(xì)胞/kg患者。在某些實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物的功效取決于MHC錯(cuò)配 數(shù)，例如，亞優(yōu)化移植物可來(lái)自部分或完全錯(cuò)配的異體供體。在某些 實(shí)施方案中，相對(duì)于患者亞優(yōu)化移植物至少在一個(gè)MHC連鎖位點(diǎn)有錯(cuò) 配。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物對(duì)一個(gè)或多個(gè)抗原有錯(cuò)配。在 一個(gè)實(shí)施方案中，亞優(yōu)化移植物至少對(duì)兩個(gè)抗原有MHC錯(cuò)配。該抗原 們可在相同的或不同的MHC連鎖位點(diǎn)。用本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來(lái)決定MHC錯(cuò)配程度。例如，人類 有至少6種主要的MHC基因分類，它們對(duì)移植生物學(xué)有重要作用。 HLA-A、 HLA-B、 HLA-C編碼HLA I型蛋白，而HLA-DR、 HU-DQ和HLA-DP 編碼HLAII型蛋白。兩組中的所有基因都有高度的多態(tài)性，例如在人 類群體中有很多HLA等位基因或變化，而且不同組間的個(gè)體差異與對(duì) 抗移植細(xì)胞的免疫反應(yīng)強(qiáng)度相關(guān)。檢測(cè)MHC相配性的標(biāo)準(zhǔn)方法是檢查 HLA-B和HLA-DR或HLA-A、 HLA-B和HLA-DR組的等位基因。因此，兩 組HLA測(cè)試4個(gè)MHC抗原或優(yōu)選為三組HLA測(cè)試6個(gè)MHC抗原。血清學(xué)MHC測(cè)試中，將對(duì)抗各種HLA抗原的抗體與目標(biāo)物 (例如供體)的細(xì)胞反應(yīng)，用以決定與抗體反應(yīng)的特定MHC抗原是否 存在。將結(jié)果與其他目標(biāo)物(例如受體)的反應(yīng)特性相比較。將抗體與細(xì)胞一起孵育以檢測(cè)抗體與MHC抗原的反應(yīng)，然后加入補(bǔ)充物誘導(dǎo) 細(xì)胞裂解(也即淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn))。根據(jù)反應(yīng)的細(xì)胞裂解量來(lái)檢測(cè)和 評(píng)定反應(yīng)(Mickelson, E.和Petersdorf, E. W. ， ^e邁"，/e〃c 6W/ rra/7Sp/a力^sThomas, E. D.等人 eds. ， pg28一37， Blackwell Scientific, Maiden, MA (1999)。其它以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析包括^f吏用 才示i己抗體的；充式細(xì)胞術(shù)或酶聯(lián)免疫反應(yīng)(Enzyme linked immuno assays, ELISA)。檢測(cè)MHC類型的分子方法一般為使用合成探針和/或引物 來(lái)檢測(cè)編碼HLA蛋白的特殊基因序列。合成寡核苷酸可用作雜交探針 來(lái)檢測(cè)特定HLA類型的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(Vaughn, R. W.， //7 M /,/" "/o/of 露戶r由coh 210: 45-60 (2002))。 或者可用引物擴(kuò)增HLA序列(例如通過(guò)多聚酶鏈反應(yīng)或連接鏈反應(yīng))， 所得產(chǎn)物可進(jìn)一步用DM測(cè)序、限制性片斷多肽分析(Restriction fragment polymorphism analysis, RFLP )檢測(cè)或通過(guò)與序歹'J特異性 寡核脊酸引物(Sequence specific oligonucleotide primer, SS0P ) 雜交來(lái)檢測(cè)(Petersdorf, E. W.等人，Wood92 (10): 3515-20 (1998); Morishima， Y.等人，(11): 4200—6 (2002);和Middleton， D. 和Williams, F.， //7淑ecw/ar S/o/of 柳C尸r"oco/s
210: 67-112 (2002))。盡管可用上述方法測(cè)定亞優(yōu)化移植物，本公開(kāi)內(nèi)容不局限 于這些方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其他替代方法。例如，可用下述方 法測(cè)定亞優(yōu)化移植物成細(xì)胞克隆數(shù)、粒-巨嗜成細(xì)胞克隆數(shù)、.突發(fā)成 單位紅細(xì)胞數(shù)或成單位粒細(xì)胞紅細(xì)胞單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞克隆數(shù)，可收 集、解凍或施用這些細(xì)胞?！銇?lái)講，為醫(yī)療目的使用MP細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞需達(dá)到藥理有 效劑量。"藥瑝有效量，，或"藥理有效劑量，，指足以產(chǎn)生所要求病理效果的劑量，或是能得到所要求結(jié)果的劑量(尤其是治療失調(diào)或疾病 的情況)，包括減少或消除失調(diào)或疾病的一種或多種癥狀表現(xiàn)。不論 是否得到改善，治療效果也包括暫?；蜓泳徏膊』蚴д{(diào)的進(jìn)程。可根據(jù)特定目的的常用程序來(lái)決定達(dá)到治療效果所需MP 細(xì)胞量。MP細(xì)胞的用量可隨患者的年齡、體重和健康狀態(tài)以及適應(yīng)癥 的性質(zhì)和嚴(yán)重程度變動(dòng)。此外，MP細(xì)胞的用量可隨干細(xì)胞移植物變動(dòng)， 但是一般來(lái)講，MP細(xì)胞用量為可提高HSC移植的劑量。某些實(shí)施案例 中，MP細(xì)胞用量為提高患者存活率的劑量。在某些實(shí)施案例中，注入MP細(xì)胞數(shù)可從約1 x 105變動(dòng)到 約1 x 1(T個(gè)細(xì)胞/kg、更優(yōu)選的是從約1 x 106個(gè)變動(dòng)到約1 x 108 個(gè)細(xì)胞/kg、而最優(yōu)選的是約1 x 10'個(gè)細(xì)胞/kg體重或在必要情況下 更多。用本領(lǐng)域常用方法將細(xì)胞移植入患者。優(yōu)選操作方法為靜 脈注射。如上所述，會(huì)結(jié)合考慮性別、年齡、體重、疾病或失調(diào)類型、 失調(diào)狀態(tài)、所需細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞群的百分比(例如細(xì)胞群的純度)以及 達(dá)到療效所需細(xì)胞數(shù)等綜合因素來(lái)決定移入的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞可一次注入，或在所定足以產(chǎn)生療效的時(shí)間內(nèi)連續(xù)注 入。當(dāng)用連續(xù)注入治療時(shí)，可用不同細(xì)胞群。如下所述，可用藥學(xué)適 用載體將細(xì)胞注入患者。 一般包括如緩沖鹽水(例如磷酸緩沖液)、補(bǔ) 充的基本細(xì)胞培養(yǎng)基，或是本領(lǐng)域已知其他培養(yǎng)基。在某些實(shí)施案例 中，MP細(xì)胞可與干細(xì)胞移植同時(shí)或是在其之前或之后使用。用髓系祖細(xì)胞提高造血干細(xì)胞移植物移植的方法可用于治 療多種失調(diào)。在某些實(shí)施方案中，該失調(diào)與疾病或清髓治療引起的造 血系統(tǒng)殘缺有關(guān)。如本文所用，"治療"指療效性的或預(yù)防性的處理，或?qū)膊　⑹д{(diào)或不適情況的抑制方法。治療包括在病發(fā)之前、和/ 或有臨床表現(xiàn)或疾病及狀況其他表現(xiàn)之后，以合適的形式施用目標(biāo)細(xì) 胞，以減輕疾病嚴(yán)重性、暫緩疾病進(jìn)程或消除疾病。疾病預(yù)防包括延 長(zhǎng)或拖延失調(diào)或疾病發(fā)生的癥狀，優(yōu)選對(duì)失調(diào)有較高易感性的目標(biāo)物。本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步提供了在實(shí)體器官、細(xì)胞或組織移植領(lǐng) 域中，用MP細(xì)胞提高造血干細(xì)胞移植物移植的方法。例如(但不局限 于)，本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步提供了用MP細(xì)胞提高造血干細(xì)胞移植物在心、 肺肝、腎、胰島細(xì)胞、皮膚、內(nèi)分泌器官或胰腺移植上的應(yīng)用。
6.3輔佐療法(Adjunctive Treatments)多種輔佐療法可與本文所述方法合用。 一方面，輔佐療法 包括抗真菌制劑、抗細(xì)菌制劑、抗病毒制劑以及其他?！矫妫o佐使用的制劑為抗真菌制劑。真菌感染是清髓 治療和HSCT移植的重要問(wèn)題。通常延緩移植的受體和形成GVHD的患
者有很高的真菌感染幾率。真菌感染有很多種，包括念珠菌感染 (candidiasis)(例如克魯斯念珠菌感染(Candida krusei)、光 滑念珠菌感染(Candida glabrata)、 白念珠菌感染(Candida albicans)、熱帶念珠菌感染(Candida tropicalis))、曲霉菌感染 (aspergillosis)(例如煙曲霉感染Aspergillus fumigatus)、黃 曲霉感染(aspergillus f lavus))、毛霉菌感染(mucormycosis)(例 如根瘤菌感染(rhizobium arrhizus)、傘枝犁頭霉感染(absidia corymbifera)、微小根毛菌感染(rhizomucor pusillus))、隱球菌 感染(cryptococcosis)、 莢膜組織胞漿菌感染(histoplasma capsulatum)和球袍子菌感染(coccidioides immitis)。用于輔佐使用的抗真菌制劑一般為全身性抗真菌制劑。其 中一種有用的此類抗真菌制劑為多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素兩性霉素B(amphotericinB)。兩性霉素B常見(jiàn)于多種配方，包括與脫氧膽酸鹽 組成復(fù)合物；與膽甾硫酸酯形成膠體懸液；用于由大豆卵磷脂、膽固 醇和雙硬脂磷脂酰甘油組成的脂質(zhì)體膠囊中，或是用于其它本領(lǐng)域已 知配方中o另 一抗真菌制劑是氟胞嘧啶(flucytosine)， 一種氟化的嘧 啶。真菌導(dǎo)致的氟胞嘧啶脫氨基化可產(chǎn)生5-氟尿嘧啶 (5-flurouracil)，它是抗代謝物和DNA合成的抑制物。通常氟胞嘧啶 用于對(duì)抗隱球菌(cryptococcus)和念球菌。盡管可單獨(dú)使用，氟胞嘧 啶一般與兩性霉素B結(jié)合使用。咪唑和三唑代表了廣大的唑類抗真菌制劑。據(jù)信咪唑和三 唑抑制甾醇14-oc-脫甲基酶，導(dǎo)致麥角甾醇合成受損而且干擾給予細(xì) 胞膜的活性(例如電子傳遞)。基于咪唑的抗真菌劑可有效對(duì)抗特定 類型的念球菌，例如白念球菌、光滑念球菌和新型念球菌。咪唑抗真菌 劑用于全身施用的例證包括酮康唑(ketoconzaole )、異草康唑 (itracanazole )、氟康峻(fluconazole)、益康喳(econazole)、伏 立康喳(voriconazole)和四康峻(tercanozole )。除了真菌感染，中性粒細(xì)胞減少癥的患者也易受多種細(xì)菌 病原體感染。接受清髓治療和HSCT移植的患者很易感染革蘭氏陽(yáng)性菌
(例如鏈球菌(streptococcus)和金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus))和革蘭氏陰性菌(例如大腸桿菌(E. col i.)和綠膿桿菌
(pseudomonas aeruginosa))。敗血癥是常發(fā)生病癥。此夕卜，延緩的 移植和對(duì)抗包膜細(xì)菌(例如肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae) 或流感嗜血桿菌(haemophilus influenza))免疫應(yīng)答的失調(diào)會(huì)增高 GVHD移植患者的發(fā)病率?？捎眠m于特異細(xì)菌病原體的已知抗生素進(jìn)行輔佐抗細(xì)菌治療。包括廣鐠抗生素和更為針對(duì)性的抗細(xì)菌化合物。適于擴(kuò)增的髓系 細(xì)胞的多種抗細(xì)菌制劑包括(僅為例證并不局限于)全諾酮
(quinolone )和氟會(huì)諾酮(fluoroquinolone) 、 P -內(nèi)酰胺抗生素(P -lactam antibiotic)、 氨基葡萄糖* (aminoglycoside)、 四環(huán)素 (tetracycline)、大環(huán)內(nèi)酉旨(macrolide)和各種協(xié)同肌(cogener)等。 會(huì)諾酮化合物包括環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、 施帕沙星(sparf loxacin)、 洛美沙、星(lomef loxacin)和莫西沙星 (moxif loxacin) 。 P-內(nèi)酰胺抗生素包括青霉素(penici 11 in)(例如 青霉素G、青霉素V)、氨芐西林(ampicillin)、羧芐青霉素 (carbenicillin)、 甲氧西林(methici 11 in)、碳青霉烯(carbapenem) 和先鋒霉素(cephalosporin)(例如頭孢蓬汾(cephalothin)、頭孢孟 多(cefamandole)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢尼西(cefonicid)、頭 孢替坦(cefotetan)、 頭孢漆將(cefatoxime)、 頭孢他啶 (cef tazidime)、頭孢峻將(cef t izoxime)和頭孢他坊(cef epime))。 氨基葡萄糖苷包括新霹素(neomycin)、鏈霉素(streptomycin)、卡那 霉素(ka謹(jǐn)ycin)、慶大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)、 阿米卡星(amikacin)和奈替米星(netilmicin)。大環(huán)內(nèi)酯類包括紅霉 素(erythromycin)、 克拉霉素(clarithromycin)和阿奇霉素 (azithromycin)。其他抗生素4皮本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。病毒感染也是清髓或HSCT患者面對(duì)的問(wèn)題。 一般來(lái)講來(lái)清 髓治療引起的免疫系統(tǒng)損壞增高了病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。許多感染源自潛 在于血清陽(yáng)性患者或血清陽(yáng)性供體細(xì)胞中病毒的活化。常見(jiàn)病毒包括 巨細(xì)胞病毒、單純皰滲病毒、水痘-帶狀皰滲病毒、帶狀皰疹病毒-6、 eb病毒、腺病毒以及其他。作為細(xì)胞注入的輔助物，所選抗病毒化合 物為適用于患者所感染病毒的藥物。有效抗病毒化合物包括(僅為例 證但不局限于)阿昔洛韋(acyclovir)、西多福韋(cidofovir)、更 昔洛韋(ganciclovir)、 皰滲凈(idoxuridine)、 噴昔洛韋 (penciclovir)、 纈更昔洛韋(valganciclovir)、 伐昔洛韋(valacyclovir)、阿糖腺香(vidarabine)、金剛烷胺(amantadine)、 金岡'J乙胺(rimantadine)、 扎那米韋(zanamivir)、 福米韋生 (fomivirsen)、咪會(huì)莫特(imiquimod)和利巴韋林(ribavirin)。針對(duì) 反轉(zhuǎn)錄病毒的治療物包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(例如齊多夫定 (zidovudine)、 去羥肌普(didanosine)、 司他夫定(stavudine)、 扎 西他濱(zalcitabine)、拉米韋定(lamividudine )、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄 酵沖卬制劑(例:i口奈韋拉平(nevirapine)、依,法韋倉(cāng)(efavirenz)、第 侖韋定(delvirudine)和蛋白酶抑制劑(例如服妥美(saquinivir)、 印地那韋(indinavir)、 利托那韋(ritonavir)、 那非那韋 (nelf inavir)、安潑那韋(ampre謂ir)和洛匹那韋(lopinavir))?？拐婢?、抗細(xì)菌和抗病毒制劑可用作預(yù)防藥以減少感染的 發(fā)生或疾病的表癥。尤其是用于預(yù)防免疫抑制患者常見(jiàn)的真菌感染， 以及血清陽(yáng)性患者或血清移植供體的病毒感染。因此，用于治療的實(shí) 施方案包括HSC、 MP細(xì)胞和抗真菌、抗細(xì)菌、或抗病毒化合物的組合 成份。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，附加使用的制劑為提高終端分化
髓系細(xì)胞(尤其是粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞)分化和動(dòng) 員的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子?？捎眉?xì)胞因子C-CSF和GM-CSF提高粒細(xì)胞
發(fā)育。G-CSF可有效提高HSCT移植和中性粒細(xì)胞生成。在另一個(gè)實(shí)施 案例中，細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子為促血小板生成素。使用TPO可提高移 植祖細(xì)胞的植入，并促進(jìn)巨核細(xì)胞和血小板的發(fā)育(Fox， N等人，/. 67/". //2mW. 110: 389-394 (2002); Akahori， H.等人，5Ye邊 14 (6): 678-689 (1996))。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，多種載體、賦形劑和施用方 法可用于附加治療。代表性的制劑技術(shù)記栽于 /""r a7ifl, to7/一o/7.' 7力"c/e/2ce a/7d戶ra"/ce of戶力ar鵬cy, 19th Ed. ， MackPublishing Co.， Eastern, PA(1995)和Handbook of Pharmaceutical Excipients， 3rd Ed， Kibbe， A. H. ed. ， Washington DC, American Pharmaceutical Association(2000);在此全文引用作為參考。藥物組合物一般包括藥學(xué)適用載體和藥學(xué)有效劑量化合 物、或其混合物、或其鹽物質(zhì)。藥學(xué)組合物可被制成粉劑、粒劑、溶 液、懸浮液、氣霧劑、固形劑、丸劑、片劑、膠囊劑、凝膠劑、局部 軟膏、栓劑、透皮貼劑和其他本領(lǐng)域已知制劑。本文所用"藥學(xué)適用載體，，包括本領(lǐng)域藥劑學(xué)技術(shù)人員所 知的任一標(biāo)準(zhǔn)藥用載體。因此，化合物自身(例如藥學(xué)適用鹽類)或 作為結(jié)合物可用作制藥時(shí)的藥用稀釋劑；例如，生理鹽水、磷酸鹽緩 沖液(Phosphate buffer saline, PBS)、乙醇水溶液、或是葡萄糖 溶液、甘露醇溶液、葡聚糖溶液、丙二醇溶液、油液(例如植物油、 動(dòng)物油、合成油等)、微晶纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維 素、硬脂酸鎂、磷酸鈣、明膠、聚山梨酸酯80或類似物質(zhì)、或和適當(dāng) 的賦形劑用作固體制劑。藥學(xué)組合物進(jìn)一步包括一種或多種緩沖液(例如中性緩沖 鹽水或磷酸緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或 葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化劑(例 如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉、二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等)、 制菌劑、螯合劑(例如EDTA或谷胱甘肽)、適應(yīng)受者血液的等滲、 低滲或弱高滲溶質(zhì)、懸浮液、增稠劑、防腐劑、調(diào)味劑、甜味劑和合 適的賦色化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何適用栽體都可用于組合物，載 體類型一般取決于施用方法。治療組合物可做成制劑用于任何合適的 施用途徑，例如包括口服、經(jīng)鼻入、粘膜用、直腸用、陰道用、局部用、靜脈用、腹腔用、皮內(nèi)用、皮下用和通過(guò)肌肉施用。本文所述藥物組合物可置于單劑量或多劑量容器，例如密
封安瓶或藥瓶。該容器一般密封以保證無(wú)菌和藥劑使用的穩(wěn)定性。一 般來(lái)講，如上所述，制劑可在油或水載體中作為懸液、溶液或乳液保 存。又或者，藥物組合物可在凍干狀態(tài)下儲(chǔ)存，只需在使用前加入滅 菌液體載體。對(duì)宿主的施用量根據(jù)施用物質(zhì)、施用目的(如預(yù)防或治
療)、宿主狀態(tài)、施用方法、施用次數(shù)、施用間隔等決定。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可依經(jīng)驗(yàn)決定施用量并根據(jù)療效程度調(diào)節(jié)。用于決定合適劑量 的因素包括(但不局限于)目標(biāo)物大小和體重、年齡和性別、癥狀嚴(yán) 重度、疾病狀態(tài)、制劑傳送法、制劑半衰期和制劑效率。所考慮的疾 病狀態(tài)包括急性還是慢性、復(fù)發(fā)還是緩解期以及疾病進(jìn)程。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知達(dá)到有效治療的劑量或施用時(shí)間。例 如，可用細(xì)胞培養(yǎng)或其他體外分析決定初始有效量?？捎脛?dòng)物模型做
劑量試驗(yàn)來(lái)產(chǎn)生循環(huán)濃度或組織濃度，包括細(xì)胞培養(yǎng)分析決定的ic5。。
6.4試劑盒本文描述方法可輔以試劑盒來(lái)提高HSC移植。試劑盒可包 括(但不限于)HSC、 MP細(xì)胞(包括擴(kuò)增或分離的細(xì)胞)和/或附加治療 化合物、分離或擴(kuò)增HSC和MP的方法、對(duì)患者用藥的方法或它們的任 意組合。更優(yōu)化的試劑盒可包括任何或所有藥學(xué)適用載體、病理學(xué)適 用載體、使用指導(dǎo)、容器、施用容器、抗體或它們的任意組合。試劑 盒一般帶有標(biāo)記，包括任何書寫或記錄材料，這些材料可為電子的或 計(jì)算機(jī)識(shí)別形式(例如磁盤、光盤、閃存或磁帶)，用來(lái)提供使用指
導(dǎo)或其他實(shí)際盒內(nèi)容物的使用信息。7.實(shí)施例以下實(shí)施例會(huì)為本發(fā)明技術(shù)方面提供更好的理解，但不應(yīng) 在任何方面限制本發(fā)明的范圍。
7. 1實(shí)施例1:實(shí)驗(yàn)方法從小鼠中制備HSC或MP細(xì)胞。為獲得鼠骨髓細(xì)胞，無(wú)痛 處死動(dòng)物并清除股骨/脛骨肌肉。用研缽碾碎骨頭，用尼龍膜過(guò)濾骨髓， 而后1200RPM離心5分鐘。用lml ACK溶液(0. 3MN出C1、 0. 2MKHC03、 MiliQ過(guò)濾水)在水上重懸細(xì)胞3-4分，而后用標(biāo)記培養(yǎng)液(含2% FCS 和2fflMEDTA不含鉀、鎂和酚紅的HANKs生理鹽水)灌注清洗。用標(biāo)記 培養(yǎng)液離心、過(guò)濾和重懸細(xì)胞，加入小鼠IgG(l:50稀釋lmg/ml儲(chǔ)藏 液，Sigraa， St Louis MO)。冰育細(xì)胞10-15分，而后與10nl/小鼠體 積CD117微珠混合(Miltenyi Biotech, Auburn CA)，標(biāo)記培養(yǎng)液 終體積為100pl/小鼠。冰育細(xì)胞25分鐘。以終體積約lml/小鼠的標(biāo) 記培養(yǎng)液清洗和重懸細(xì)胞，用尼龍膜過(guò)濾。根據(jù)生產(chǎn)商指導(dǎo)手冊(cè)富集 設(shè)置，用AutoMACs (Miltenyi, Auburn, CA)富集細(xì)胞。用約1 x 10s 細(xì)胞/ml標(biāo)記培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，加入合適濃度的下列聯(lián)合抗體 (eBioscience， San Diego, CA ) : Sca-l 另'J藻藍(lán)蛋白 (Allophycocyanin， APC)、 c-kit R-藻紅蛋白-花青 7 串 (Phycoerythrin-cyanine 7 tandem, PE-Cy7) 、 Thy-l. 1異硫氰酸焚光 素(Fluorescein isothiocyanate， FITC) 、 i脊系(CD3、 CD4、 CD5、 CD8、B220、mac-l、Gr-l和Terl19)R-藻紅蛋白(Phycoerythrin， PE)。 冰育細(xì)胞25分鐘，用標(biāo)記培養(yǎng)液清洗、離心和重懸細(xì)胞。加入碘化吡 咬(Propidium iodide， PI)去除死細(xì)胞。用FACS分離小鼠KTLS-HSC、 c-kit一Thy^Sca-lP。siineage峭或MP c-kithighThynegSca-lneglineageneg/low。細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增。從 AKR 小鼠中分選Lin—KTLS-HSC(H2Kk)，鋪入500^1/孔無(wú)血清培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含 細(xì)胞因子和成長(zhǎng)因子并結(jié)合c-KUL、 FL、 TP0和IL-6(X-Vivol5基質(zhì) (Cambrex Bioscience, MD); 青霉素—鏈霉素(100x)、 glutamax(100x) 、 2-巰基乙醇(5xl(T5M ) 、 c-KitL(50ng/ml)、 FL(30ng/ml) 、TP0(5ng/ml)和IL-6(10ng/ml) (Biosource， Camarillo， CA和R&D Systems, Minneapolis, MN)。細(xì)胞鋪入約10， 000細(xì)胞/孔 的24孔板。培養(yǎng)7天細(xì)胞以獲得MPc(培養(yǎng)衍生MP)。在第2和第4 天給細(xì)胞換液(500ul/孔)，用新鮮培養(yǎng)液替換孔中一半培養(yǎng)液。笫 五天，加入lml新鮮培養(yǎng)液并將細(xì)胞移入6孔板。在第7天，收集細(xì) 胞并移取三小份用作分析。標(biāo)記擴(kuò)增細(xì)胞群中小鼠HSC:移取孔中細(xì)胞，清洗并轉(zhuǎn)移 到錐形FACS管，用血球計(jì)計(jì)數(shù)。1100rpm離心細(xì)胞5分鐘，移除上清。 加入50ul封閉抗體(大鼠IgG和小鼠IgG 1: 50)，孵育10分鐘，加 入50—100ul合適濃度的下歹'J抗體(eBioscience， San Diego， CA): Sca-l別藻藍(lán)蛋白(APC)、 Thy-l. 1異疏氰酸熒光素(FITC)、 c-kit藻 紅蛋白-花蕢7串(PE-Cy7) 、 B220、 Mac-l、 GR-1 R-藻紅蛋白(PE)。 水育25分鐘，用含PI的標(biāo)記培養(yǎng)液清洗、離心和重懸細(xì)胞。用FACS 分析細(xì)胞HSC。標(biāo)記培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞群中髓系祖細(xì)胞用上述標(biāo)記HSC細(xì)胞 的相同方法準(zhǔn)備細(xì)胞。用50ul封閉抗體(大鼠IgG和小鼠IgG 1: 50) 賻育，每管加入50-100ul鐠系-生物素(Terl19、 Gr-l、 B220 )，冰 上放置20分。用2-3mlSM清洗細(xì)胞，離心，然后用50-100ul合適濃 度的下歹'J抗體重懸細(xì)胞Streptavidin Cascade Blue (Molecular Probes, Eugene, OR) 、 c-kit藻紅蛋白-花菁7串(PE-Cy7) 、 Sca-l 別藻藍(lán)蛋白(APC)、 CD34異硫氰酸熒光素(FITC) 、 2. 4G2 (Fc Y R) R-藻紅蛋白(eBioscience， SanDiego， CA)。用FACS分析細(xì)胞MP (CMP、 GMP、 MEP)。
為成熟祖細(xì)胞亞群標(biāo)記培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞用上述方法處理細(xì) 胞。用封閉抗體孵育，用50-100ul抗體液重懸細(xì)胞CD3藻紅蛋白-菁7串(PE-Cy7) 、 B220太平洋藍(lán)、Gr-l R-藻紅蛋白(PE)和Mac-l 別 藻藍(lán)蛋白 (APC) (eBioscience, San Diego， CA))。冰上孵育25分， 用上述方法進(jìn)行FACS分析。掃描重構(gòu)小鼠檢測(cè)供體細(xì)胞。室溫收集約10-15滴血至 0. 5ml含5mM EDTA的PBS中，用其掃描HSC和/或MP移植的小鼠檢測(cè) 供體細(xì)胞群。加入lml含2%右旋糖苷-500的PBS，混合，在37C孵育 30-45分。多數(shù)血紅細(xì)胞被沉積。將上清移入一新管，離心收集細(xì)胞 (5分，1000rpm)，用1. 0ml IX ACK (0. 3M NH4C1， 0. 2MKHC03, MiliQ 過(guò)濾水)在冰上裂解剩余紅細(xì)胞5-6分。清洗，而后1200rpm離心5 分。如果沉淀物仍為紅色，重復(fù)清洗。用50ul/管大鼠IgG和小鼠IgG(各 為1: 50)在水上封閉細(xì)胞10到15分鐘。加入合適濃度的生物素標(biāo)識(shí) Mac-l和GR-1 (eBioscience, San Deigo， CA)，在暗處水育20分。 清洗細(xì)胞，1200rpm離心5分。對(duì)同源或MUD移植物(C57B6/Ka， CD45. 1; C57B16/Ka CD45. 2或129 )加入合適濃度下例抗體，Streptaviden Cascade Blue (Molecular Probes, Eugene, OR) 、 CD45. 1另'J藻藍(lán) 蛋白(APC)、 CD45. 2異硫氰酸熒光素(FITC)、 B220 R-藻紅蛋白菁 串(PE-Cy7)和CD3、 CD4、 CD8 R-藻紅蛋白 (PE) (eBioscience, San Diego, CA)。向異體移植物(C57B6/Ka、 H2Kb; Balb/b、 H2Kd)加入
Eugele， 0R)、CD3別藻藍(lán)蛋白(APC) 、 H2Kb異硫氰酸熒光素(FITC)、 B220 R-藻紅蛋白菁串(PE-Cy7)和 H2Kd R-藻紅蛋白 (PE) (eBioscience, San Diego， CA)。向培養(yǎng)的異體MP ( C57B6/Ka、 CD45. 1; 129、 CD45. 2; AKR、 H2Kk ) MUD移植物加入合適濃度的下列 抗體CD45. 2生物素(eBioscience, San Diego, CA)。清洗后，加 入合適濃度的下列抗體Streptaviden R-藻紅蛋白串(PE-Cy5 )、CD45. l別藻藍(lán)蛋白(APC)、 H2Kk異硫氰酸熒光素(FITC) 、 Mac-l和 Gr-l R-藻紅蛋白菁串(PE-Cy7)、 B220太平洋藍(lán)和CD3 R-藻紅蛋白 (PE) (eBioscience， San Diego， CA)。冰育25分鐘，清洗，離心， 用含PI的SM重懸細(xì)胞。用FACS分析細(xì)胞。冷凍培養(yǎng)衍生MP:以2千萬(wàn)細(xì)胞/ml的濃度冷凍細(xì)胞。準(zhǔn) 備含85%FCS和15%DMS0的冷凍培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)和清洗培育衍生MP細(xì)胞。 1100RPM離心。以1千萬(wàn)細(xì)胞/ml的濃度重懸細(xì)胞。緩慢滴加等體積 DMS0冷凍液，輕柔混合試管。按lml每瓶分裝細(xì)胞。在-80匸過(guò)夜冷 凍細(xì)胞。第二天移入液氮長(zhǎng)期保存。
7.2實(shí)施例2:用純化的髓系祖細(xì)胞聯(lián)合亞優(yōu)化劑量HSC提高存
活率該研究用于決定MP細(xì)胞能否提高特定案例的存活率，在 這些案例中為給100。/。受體鼠提供輻射保護(hù)，所用的HSC細(xì)胞不足。該 研究調(diào)查了 MP細(xì)胞能否提高純化的HSC同源移植后的恢復(fù)(圖3)、 相配非相關(guān)供體(MUD)純化HSC移植后的恢復(fù)(圖4)或是完全錯(cuò)配 異體移植后的恢復(fù)(圖5)。各項(xiàng)研究中，HSC和MP衍生于相同供體。從小鼠骨髓(BM)中準(zhǔn)備HSC，從C57B1/6KA小鼠(H-2b、 CD90. 1 、 CD45. 2 )中分選LinnegKTLS-HSCs 。圖 1表示從 C57B6/Ka(Thy-l. 1、 CD45. 2)分選KTLS HSC的分選門。全骨髓和c-kit 富集后的門剖面都有標(biāo)示。用該門參數(shù)分選的HSC用于移植實(shí)驗(yàn)。從小鼠骨髓(BM)準(zhǔn)備MP，從C57B1/6KA小鼠(H-2b、 CD90丄CD45.2)分選。圖2表示從C57B6/Ka (Thy-l. 1、 CD45.2)分 選MP的門。全骨髓分選和c-kit富集后的門剖面都有標(biāo)示。用該門參 數(shù)分選的MP用于移植實(shí)驗(yàn)。
在第0天對(duì)宿主鼠、C57Bl/Ka(H-2b、 CD90. 1、 CD45. 1)、 129(H-2b、 CD45. 2)或Balb/c(H-2d、 CD45. 2)進(jìn)行分次劑量致死輻射 (總共9-llGy，銫源)。分選的HSC和MP按所需劑量混合，在眼球 后注射入受體動(dòng)物。監(jiān)控動(dòng)物存活率和供體嵌合性。圖3表示同源移植模型存活率資料。50KTLS C57B6/Ka(Thy-l. 1 、 CD45.2)HSC可被單獨(dú)移植或與 100,000 C57B6/Ka (Thy-1. 1、CD45. 2)MP混合移植入C57B6/Ka (Thy-1. 1、CD45. 1) 宿主。圖3表示加入MP可提高HSC移植存活率。圖4表示同種異體(相配非相關(guān)供體)移植模型的存活率 資料。100 (圖4A)或250 (圖4B) KTLSC57B6/Ka (Thy-l. 1、 CD45. 2、 H2b) HSC可單獨(dú)移植或和200， 000 C57B6/Ka (Thy-l. 1、 CD45. 2、 H2b)MP 一起移入129 (CD45. 1、 H2b)宿主。圖4表示加入MP可提高100和 250兩個(gè)干細(xì)胞劑量的HSC移植存活率。圖5表示同種異體(完全錯(cuò)配)移植模型的存活率資料。 500(圖5A)或2000(圖5B)KTLSC57B6/Ka (Thy-l. 1、 CD45. 2、 H2b) HSC 可單獨(dú)移植或和200,000 C57B6/Ka(Thy-l. 1、 CD45.2、 H2b)MP —起 移入Balb/c(CD45. 1、H2b)宿主。圖5表示加入MP可提高500和2000 兩個(gè)千細(xì)胞劑量的HSC移植存活率。圖6概述三種移植模型的存活率和嵌合性資料(同源、相 配非相關(guān)供體和錯(cuò)配異體)。在所有三種模型中(同源、MUD和錯(cuò)配異體)，與HSC單 獨(dú)移植相比，結(jié)合MP的亞優(yōu)化劑量HSC可提高存活率。7. 3實(shí)施例3結(jié)合使用異體培養(yǎng)衍生的髓系祖細(xì)胞可提高亞優(yōu)化 劑量HSC的存活率本研究用于決定當(dāng)HSC低于輻射防護(hù)劑量時(shí)，加入異體培 養(yǎng)-衍生MP是否能提高相配非相關(guān)供體(MUD) HSC移植的存活率。從小鼠骨髓(BM)制備HSC，從AKR小鼠(H-2k、 C跳1、 CD45. 2)分選Lirr^。TTLS-HSCs。將分選的細(xì)胞鋪入含c-Ki tL、 FL、 TPO和IL-6的無(wú)血清培養(yǎng)基。培育細(xì)胞7天。培育期后收集細(xì)胞，用 FACS分析MP(CMP/GMP/MEP)和HSC含量，然后冷凍。圖8表示對(duì)AO (Thy-l.l、 CD45.2、 H2k )培育衍生的MP的分析。圖7表示移植當(dāng)天從小鼠C57B1/Ka (H-2b、C謂.1、CD45. 1) 分選Lin^KTLS-HSC。分選AKR KTLS HSC并按所述方法培育7天。培 育期后分析和冷凍細(xì)胞。根據(jù)培養(yǎng)液中c-kit+細(xì)胞數(shù)計(jì)算移植所用細(xì) 胞量。圖9表示移植模型的存活資料，相配非相關(guān)供體KTLS HSC 與完全錯(cuò)配異體培育衍生的MP共同移植入該模型。100KTLS C57B6/Ka(Thy-l. 1 、 CD45. 1 、 H2b)HSC 被單獨(dú)移植或與 500, 000c-kit+AKR(Thy-l. 1、 CD45. 2、 H2k)培育衍生的MP ( MPc ) — 起移植入129 (CD45. 2、 H2d)宿主。向HSC移植物中加入MPc可提高 存活率。相對(duì)于單獨(dú)使用相同劑量的HSC或MPc,兩者結(jié)合的移植有更高的存活率。該模型中，相對(duì)于HSC或MP單獨(dú)移植，異體(MUD)HSC 和第三方異體培育衍生的MP共同移植可提高存活率(圖9)。

圖10表示移植模型的存活率數(shù)據(jù)，MHC相配非相關(guān)供體 HSC與從2 MHC錯(cuò)配供體衍生的MP細(xì)胞被共同移植入此模型。50異體 HSC(Balb/b、 H-2b)被單獨(dú)移植或與1或2百萬(wàn)混合異體培育衍生的 MP( FVB、 H-2q; AKR、 H2k )共同移植入致死輻射宿主(C57B1/Ka、 H-2b )。 與HSC單獨(dú)移植相比，加入MP細(xì)胞的HSC移植有更高的存活率。相對(duì) 于HSC或MP細(xì)胞單獨(dú)移植，HSC和MP細(xì)胞共同移植可提高存活率。前述本發(fā)明特殊實(shí)施案例用于說(shuō)明和解釋。并不限制本發(fā) 明于確切的公開(kāi)形式，顯而易見(jiàn)，可在上述技術(shù)上進(jìn)行很多調(diào)節(jié)和變 動(dòng)。所選用和描述的實(shí)施案例是為了最好的解釋本發(fā)明的原理和其特 殊應(yīng)用，因此能^f吏本領(lǐng)域其他技術(shù)人員最有效地利用本發(fā)明，而且多 種實(shí)施案例的多種調(diào)節(jié)方法是之可適用于所需特殊應(yīng)用情況。所有的專利、專利應(yīng)用、出版物和本文引用的參考文獻(xiàn)在 此原文引用作為參考，每一出版物或?qū)＠麘?yīng)用都是特殊的，都單獨(dú)引 用作為參考。
權(quán)利要求
1. 提高患者造血干細(xì)胞移植物植物的方法，包括對(duì)該患者施用有效量的髓系祖細(xì)胞(MP)移植物以提高造血干細(xì)胞移植入。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述造血干細(xì)胞移植物為亞優(yōu)化移 植物。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物包括少于約5. 0 x 106個(gè)CD34+造血干細(xì)胞(HSC)每kg患者體重。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物包括少于約1. 0 x 106個(gè)CD34+ HSCs每kg患者體重。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物是從周邊血或骨 髓中獲得。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物是從臍帶血(UBC) 中獲得。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物包括少于約4. 0x 107個(gè)有核細(xì)胞每kg患者體重。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物包括少于約4. 0 x 105個(gè)CD34+細(xì)胞每kg患者體重。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物包括衍生于少于 兩臍帶血單位的HSC。
10. 權(quán)利要求6的方法，其中所述亞優(yōu)化移植物包括衍生于一臍 帶血單位的HSC。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述MP細(xì)胞移植物和所述HSC移植 物為所述患者的同種異體移植物。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述同種異體移植物相對(duì)于患者至 少部分MHC錯(cuò)配。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中所述同種異體移植物相對(duì)于患者為 MHC完全錯(cuò)配。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述同種異體移植物相對(duì)于患者為 一個(gè)或多個(gè)MHC抗原錯(cuò)配。
15. 權(quán)利要求11的方法，其中所述同種異體移植物相對(duì)于患者為 MHC完全相配。
16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述髓系祖細(xì)胞移植物與所述造血 干細(xì)胞移植物共同施用。
17. 權(quán)利要求l的方法，其中所述髓系祖細(xì)胞移植物在所述造血 干細(xì)胞移植12小時(shí)內(nèi)施用。
18. 權(quán)利要求l的方法，其中所述髓系祖細(xì)胞移植物包括擴(kuò)增的 髓系;f且細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述擴(kuò)增的髓系祖細(xì)胞為同種異體 髓系;組細(xì)胞的混合物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述同種異體髓系祖細(xì)胞對(duì)于造血 干細(xì)胞移植物至少部分MHC錯(cuò)配。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于方便造血干細(xì)胞植入的方法和組合物，包括聯(lián)合施用髓系祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101421393SQ200780012781
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者H·卡爾塞基, J·L·克里斯蒂森 申請(qǐng)人:塞勒蘭特治療公司