專利名稱：用羥基類固醇脫氫酶通過(guò)還原氧代類固醇化合物或者氧化羥基類固醇化合物制備類固醇 ...的制作方法
用羥基類固醇脫氫酶通ffi原氧代類固醇化合物或者 氧化羥基類固醇化合物制備類固醇衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)映體it擇性酶促還原化合物的方法，所述化合物包括類 固醇結(jié)構(gòu)(ABCD)，該結(jié)構(gòu)在環(huán)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)或多個(gè)雜原子， 一個(gè)或多個(gè)雙 鍵和/或一個(gè)芳香環(huán)，并且在類固醇環(huán)系的3， 7， 11， 12或17位或者在類固醇 骨架任何碳基團(tuán)的a位至少有一個(gè)橋氧基(=氧代類固醇化合物)，其中在存在 NADH或者NADPH作為輔因子的劍牛下，所述氧代類固醇化合物用羥基類固 醇脫氫酶還原。
本發(fā)明還涉及一種氧化化合物的方法，所述化合物包括類固醇結(jié)構(gòu) (ABCD)，該結(jié)構(gòu)在環(huán)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)或多個(gè)雜原子， 一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或一 個(gè)芳香環(huán)，并且在類固醇環(huán)系的3， 7， 11， 12或17位或者在類固醇骨架任何 碳基團(tuán)的a位至少有一個(gè)羥基(=羥基類固醇化合物)，其中在存在NAD或者 NADP作為輔因子的條件下，所述羥基類固醇化合物用羥基類固醇脫氫酶氧化。
類固醇是有膽固醇的環(huán)結(jié)構(gòu)，且隨雙鍵的數(shù)量、功能基團(tuán)的種類、數(shù)量禾口 位置、甲基、烷基側(cè)鏈的數(shù)量以及鍵之構(gòu)型而不同的化合物。類固醇化合物存 在于動(dòng)物以及真菌(Pilzmi)和植物中，并且有多種生物學(xué)作用，例如可作為雄 性和雌性、激素，腎上腺、激素、維生素、膽汁酸(Gallensaeuren)、類固醇皂苷元 (Steroidsapogenine)，作為心臟活性物質(zhì)和作為蟾蜍毒素。
下面氧代類固醇化合物理解為前述定義的類固醇，也S是說(shuō)，其中它們至 少有一個(gè)酮功能團(tuán)，所述酮功能團(tuán)可包含在環(huán)系上或者在類固醇框架的側(cè),5lh。
下面羥基類固醇化合物理解為前述定義的類固醇，也就是說(shuō)，其中它們 至少有一個(gè)羥基功能團(tuán)，所述羥基功能團(tuán)可在環(huán)系上或者在類固醇框架的側(cè) 鏈上。
由于類固醇的很多生理學(xué)作用，人們認(rèn)為類固醇化合物及其更大量的衍生 物可用作醫(yī)學(xué)中治療有效的物質(zhì)和藥物。
例如發(fā)現(xiàn)世界上已廣泛4頓孕激素和雌激素衍生物用于避孕；嫩敫素(睪 酮)例如在治療前列腺癌時(shí)被用作促蛋白合成甾類和抗鄉(xiāng)敫素。糖皮質(zhì)激素(可的松、氫化可的松、強(qiáng)的松龍和強(qiáng)的松)及其衍生物，由于其抗炎、抗過(guò)敏和 免疫抑制作用而被廣泛用于皮膚病、風(fēng)濕性疾病、過(guò)敏反映、腎病、胃腸疾病 以及許多其他疾病的治療中。
生物活性類固醇化合物的市場(chǎng)很大。生物轉(zhuǎn)4W于生產(chǎn)具有不同作用的不 同類固醇衍生物起很大的作用。特別是由羥化酶和脫氫酶催化的反應(yīng)很重要。
在此起重要作用的是5-l-脫氫反應(yīng)、llp-還原、20p-還原、17(3-還原，在3和7 位的立體選擇性還原，另外，還有羥基，特別是3、 7、 12和17位羥基的氧化 作用。
迄今為止，只有用完整的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了對(duì)類固醇的工業(yè)生物還原，但物質(zhì)濃 度遠(yuǎn)低于10g/1。產(chǎn)生這種情況的原因是，生物轉(zhuǎn)化所需的酶迄今尚未被表征或 者表達(dá)出來(lái)，另外，沒(méi)有令人滿意的技術(shù)手段， 一方面，類固酉雜水介質(zhì)中的 溶解度小，另一方面，需要再生足夠量的輔因子NADH和NADPH。
迄今為止，類固醇的氧化是用工業(yè)化學(xué)方法完成的。
從1975-1988年，GCairea就實(shí)質(zhì)上描述了用分離的酶進(jìn)行對(duì)映體選擇還原 類固醇的方法(Eur.丄Biochemistiy 44， 1974 p.401~405; Biotechnology and Bioengineering， Vol 17， 1975， p. 1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol 6， My, 1984， p. 307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol 26， 1984， p. 560-563; J. Org. Chem. 51 ， 1986， p. 2902-2906; J. Org. Chem. 58， 1993， p.499-501; J. Org. Chem. 53， 1988， p.88-92; Enzyme Microb. Technol. ， Vol 10， June, p. 333-339; Archives ofBiochemistiy and Biophysics, 159， 1973， p,7-10)。
為此，需要4頓不同的羥基類固醇脫氫酶(HSHD)，其中，實(shí)質(zhì)上通過(guò)乳 酸脫氫酶、甲酸脫氫酶或者來(lái)自酵母的醇脫氫酶連接可以實(shí)現(xiàn)輔因子NADH的 再生。用葡萄糖脫氫酶實(shí)現(xiàn)NADP的再生。用乙酸乙酯和乙酸丁酯作為有機(jī)相 的兩相體系解決溶解度低的問(wèn)題。在兩相體系中的分離的酶會(huì)以遠(yuǎn)低于10 g/l 的濃度實(shí)施反應(yīng)，其中所達(dá)到的"總轉(zhuǎn)^i〔" (TTN=mol還原的氧代類固醇化 合物/mol所用的輔因子)同樣遠(yuǎn)在1000以下，所述方法與全細(xì)胞方法相比，沒(méi)
有實(shí)質(zhì)上的經(jīng)濟(jì)it勢(shì)。
3ffilit—?dú)i努力，fflil結(jié)^il化和還原反應(yīng)，7a羥^^?；?p羥基。這可 以M3！ 7aHSDH和7卩HSDH的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)(Pedrim et al. ， Steroids 71 (2006) pl89-198)。但是，在該方法中，濃度也是遠(yuǎn)低于10g/1，且所達(dá)到的"總轉(zhuǎn)變數(shù)"(TTN^mol還原的氧代類固醇化合物/mol所用的輔因子)同樣在100以下，該 方法也是相對(duì)不經(jīng)濟(jì)的。
本發(fā)明的目的是為了克月gJ^缺陷和困難并以此為己任，發(fā)明了一種方法:
在較高濃度下，以較高的轉(zhuǎn)變能力，和較高的輔因子TTN并因此以經(jīng)濟(jì)的方式 可以完成氧代類固醇化合物或者羥基類固醇化合物的對(duì)映體選擇還原或者氧化反應(yīng)。
就開始提及類型的方法而言，所述任務(wù)是通過(guò)下述方法完成的
a) 氧代類固醇化合物在反應(yīng)混合物中的濃fe50g/1，
b) 通過(guò)氧化通式為RxRyCHOH的二級(jí)醇，或者S51氧化C4-C6環(huán)烷醇持 續(xù)性地再生由羥基類固醇脫氫酶形成的氧化輔因子NAD或者NADP，其中Rx， RY彼此^Ut是氫、支鏈或者無(wú)支鏈C廣C8烷基，且C總^3，禾口
c) 另外的氧化還原,醇脫氫酶用于氧化通式為RxRyCHOH的二級(jí)醇或者 環(huán)烷醇。
就開始提及類型的方法而言，J^任務(wù)還可以ffl31另一種方法完成
a) 羥基類固醇化合物在反應(yīng)混合物中的濃fe50g/1，
b) M31iS原通式為RxRyCO的酮化合物，或者通過(guò)還原C4-C6環(huán)烷酮， f煞賣性地再生由羥基類固醇脫氫酶形成的氧化輔因子NADH或者NADPH，其 中Rx， RY彼此3拉是氫、支鏈或者無(wú)支鏈C廣Q烷基，且C總&3，禾口
c) 另外的氧化還原 郭兌氫酶用于還原通式為RxRyCO的酮或者環(huán)烷酮。 本發(fā)明描述了明顯改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)類固醇結(jié)構(gòu)中對(duì)映體選擇性酶i^原
和氧化反應(yīng)的方法。本發(fā)明可以用大大高于現(xiàn)有技術(shù)所述濃度的自由酶，將氧
代類固醇化合物還原或^il化成相應(yīng)的羥基-或^it代類固醇。
在本發(fā)明方法中使用了輔因子NADH或者NADPH。在所述概念中， "NADP"是煙酉劃安腺嘌呤二核苷酸^^酸，"NADPH"是還原型煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸。"NAD"是煙酉劃安腺嘌呤二核苷酸，"NADH"是還原型煙酉劃安腺 嘌呤二核苷酸。
按照4，的實(shí)施方案，本發(fā)明方法的特征在于，使用下列通式I的氧代類 固醇化合物其中，
!^是氫、甲基、羥基或者橋氧基(Oxogruppe); R2是氫、甲基、羥基或者橋氧基； R3是氫、羥基、橋氧基或者甲基； R4是氫或者羥基；
Rs是氫，-COR1Q，其中，R化是未取代的或者用羥基取代的C1-C4烷基， 或者取代的或者未取代的Cl-C4羧烷基； 或者&和R5 —起表示橋氧基； Re是氫、甲基、羥基或者橋氧基； R7是氫、甲基、羥基或者橋氧基； Rs是氫、甲基或者鹵素；禾口 R9是氫、甲基、羥基或者橋氧基或者卣素；
其中R!、 R2、 R4+R5、 R6、 Rg或者R9至少之一是氧橋基，或者Rs是-CORk 且下列結(jié)構(gòu)式
是苯環(huán)或者有0、 1或2個(gè)C-C雙鍵的C6環(huán)。
按照本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明發(fā)明特征在于，使用有下列通式I的
羥基類固醇化合物<formula>formula see original document page 12</formula>(I)
R9
其中
Rj是氫、甲基、羥基或者撟氧基； R2是氫、甲基、橋氧基或者羥基； R3是氫、羥基、橋氧基或者甲基； R4是氫或者羥基；
Rs是氫，畫CORk)，其中，RK)是未取代的或者用羥基取代的C1畫C4烷基， 或者取4戈的或者未取代的Cl-C4 M^烷基； 或者&和R5 —起表示橋氧基； R6是氫、甲基、橋氧基或者羥基； R7是氫、甲基、橋氧基或者羥基； Rs是氫、甲基或者鹵素；和 R9是氫、甲基、羥基、橋氧基或者鹵素；
其中Ri、 R2、 R4、 R6、 R7、 Rs或者R9至少之一是羥基，且下列結(jié)構(gòu)式 ^環(huán)或者有0、 1或2個(gè)C-C雙鍵的C6環(huán)。
雌是用2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、5-甲 基-2-己醇或者2-辛醇作為通式RxRyCHOH的二級(jí)醇，和用環(huán)己醇作為環(huán)烷醇。
雌是用2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、5-甲^~2-己酮 或者2-辛酮作為通式RxRyCO的酮，和用環(huán)己酮作為環(huán)烷酮。
下面，將通式為RxRyCO的酮或C4-C6環(huán)烷酮與通式為RxRyCHOH的二 級(jí)醇或C4-C6環(huán)烷酉鯡誠(chéng)為總的術(shù)i吾共底物(Cosubstot)。
，本發(fā)明的方法在含水的有機(jī)兩相體系中完成。這里合適地，用于輔酶再生的共底物不能與水混合，并因此形成含水的有機(jī)兩相體系中的有機(jī)相。
進(jìn)一步的實(shí)施方案是在本發(fā)明方法中還使用不參與輔因子再生的有機(jī)溶
齊!J，例如乙醚、叔-丁甲醚、二異丙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、 己烷或者環(huán)己烷。
進(jìn)一步{，本發(fā)明方法的TTN^103。
此外，優(yōu)選地，在2-96小時(shí)內(nèi)，至少50%所用的氧代類固醇化合物或者羥 基類固醇化合物，被還原成相應(yīng)的羥基類固醇化合物或者被氧化成氧代類固醇 化合物。
本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案的特征在于，用例如酮石膽酸 (Ketolithocholsaeure)(式n)、地塞米松(式m)、 4-雄甾烯-3,17-二酮(式IV)、 1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(式V)、雌酮(式VI)、孕烯醇酮(式VH)和可的松
(式vm)作為氧代類固醇化合物。
進(jìn)一步說(shuō)，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的特征在于，用例如膽汁酸的不同衍生
物，如膽酸、鵝脫割旦酸、12-氧ftl旦酸、3-羥基-12-氧代膽酸、酮石膽酸、石膽 酸(l他ocholsaeure)或者氫化可的松作為羥基類固醇化合物。
所謂羥基類固醇脫氫酶，通常理解為這樣一種酶，即該酶旨詢多催化類固醇 結(jié)構(gòu)中酮基還原成羥基或者羥基氧化成相應(yīng)酮基的反應(yīng)。這里，所述氧化或 者還原反應(yīng)可以在類固醇自身的環(huán)系統(tǒng)中(例如7-oc羥基類固S享-脫氫酶)或者 也可在類固醇基本結(jié)構(gòu)的碳上(例如20-P羥基類固醇脫氫酶)發(fā)生。
用于氧代類固醇化合物還原反應(yīng)的適宜的羥基類固醇脫氫酶是例如3-a羥 基類固醇脫氫酶(HSDH)、 3(3HSDH、 12aHSDH、 20(3HSDH、 7aHSDH、 7pHSDH、 17(3HSDH和11陽(yáng)SDH。
一種適宜的3-a羥基類固醇脫氫酶例如得自睪丸酮假單胞菌(Pseudomonas testosteroni) (J.Biol.Chem. 276 (13)， 9961-9970 (2001))，并可以用于3-a-羥基 類固醇的氧化反應(yīng)或者3-酮類固醇，象例如3-酮-膽汁酸、孕烯醇酮、4-雄甾烯 -3,17-二酮、5-a-雄甾烷-3,17-二酮等的還原反應(yīng)。
具有3-P-羥基類固醇脫氫酶活性的適宜的酶可以例如得自無(wú)害梭菌 (Clostridium innocuum) (Applied and Environmental Microbiology, June 1989， p.1656-1659)或者得自睪丸酮假單胞菌，并可以用于3-(3-羥基類固醇的氧化反 應(yīng)或者3-酮類固醇，象例如3-酮-膽汁酸、孕烯醇酮、4-雄烯-3,17-二酮、5-a-雄甾烷-3,17-二酮等的還原反應(yīng)。
12oHSDH例如得自梭菌(Clostndien) (Eur.J.Biochem. 196 (1991 )439450)，
并可以用于12ot羥基類固醇(例如膽酸)的氧化反應(yīng)，或者12-酮類固醇，例如 象12-酮膽汁酸(12-酮鵝脫氧膽酸、脫MI旦酸)的還原反應(yīng)。同樣具有l(wèi)鄰羥基 類固醇脫氫酶活性的酶也來(lái)自梭菌(Biochim.Biophys.Acta 1988 Octl4; 962 (3): 362-370)。
具有20-p羥基類固醇脫氫酶活性的酶例如得自鏈霉菌屬的生物(The Journal of Biological Chemistry, 1977， Vol.252 Nol， JanlO， 205-211)，并可以用 于可的松和氫化可的松衍生物(可的松、氫化可的松、11-脫氧皮甾醇、黃體酮) 生成相應(yīng)20-(3-羥基類固醇的還原反應(yīng)(例如20-(3羥基黃體酮)。
具有20-oc-羥基類固醇脫氫酶活性的相應(yīng)酶例如得自梭菌，特別是得自閃爍 梭菌(Clostridium scindens) (Journal of Bacteriology, June 1989， p.2925-2932)， 以及得自梨形四膜蟲(Tetrahymena Pynfo醒s) (Biochem.J. (1994) 297， 195-200) 的相應(yīng)酶。
特別地，適宜的7-oc羥基類固醇脫氫酶是來(lái)自腸內(nèi)微生物區(qū)系的生物，例 如來(lái)自梭菌(不同梭菌、腸內(nèi)微生物區(qū)系氏梭菌)(Journal of Bacteriology, Aug. 1994， p.4865-4874),來(lái)自大腸桿菌(Journal of Bacteriology, Apr.， 1991， p.2173-2179),來(lái)自脆弱擬桿菌(CurrentMicrobiology, Vol47 (2003) 475484)， 布魯氏菌屬、真桿菌屬，并可以用于7-a-羥基類固醇(鵝石膽酸 (Chenolithochlosaeure))的氧化反應(yīng)，或者7-酮類固醇，例如象7-酮-膽汁酸(酮 石膽酸)的還原反應(yīng)。
具有7-p-羥基類固醇脫氫酶活性的相應(yīng)酶同樣得自梭菌，瘤胃球菌科的微 生物aBiochemistry102， 1987， p.613-619)，或者得自消化鏈球菌屬(Biochimica and Biophysica Acta 1004， 1989， p.230-238)，得自產(chǎn)氣真桿菌(Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p. 1057-1063 )和嗜麥芽假單胞菌(Pednm etal.， Steroids71 (2006) p. 189-198)。通過(guò)7-pHSDH可以從酮石膽酸產(chǎn)生烏索
脫w酸。
已矢卩17-(3羥基類固醇脫氫酶來(lái)自真菌，如Cylindrocarpon radicola (J.Biochemistry 103， 1988， 1039-1044 )和Cochliobolus lunatus (J. Steroid Biochem. Molec.Biol. Vol. 59， 1996，No.2，p.205-214)，來(lái)自鏈霉菌科的細(xì)菌(Hoppe-Seyler，sZ. Physiol. Chem.， Bd.356， 1975， 1843-1852)，假單胞菌(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 252No.ll， June 10， 1977， p.3775陽(yáng)3783)和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes) (The Journal of Biological Chemistry ， Vol. 260 ， No.25 ， Nov.5 , 1985 ， p.l3648陽(yáng)13655)。
17-p羥基類固醇脫氫酶例如可用于17-(3羥基類固醇的氧化反應(yīng)，或者17-酮類固醇，如4-雄甾烯-3,17-二酮、雄酮(Androsteron)、雌酮(Estron)的還原反應(yīng)。
具有17a羥基類固醇脫氫酶活性的相應(yīng)酶是來(lái)自真桿菌屬(Journal of Lipid Research, Vol. 35， 1994， p.922-929)。
ll-p羥基類固醇脫氫酶己知來(lái)自高等哺乳動(dòng)物，并能夠例如用于將氫化可 的松氧化成可的松。
然而在催化類固醇結(jié)構(gòu)的氧化或者還原反應(yīng)中，還可以用任何其他氧化還 原謝乍為羥基類固醇脫氫酶。
用于NADH或者NAD再生的合適的二級(jí)S郭兌氫酶例如當(dāng)使用來(lái)自睪丸酮 假單胞菌的17-p羥基類固醇脫氫酶、來(lái)自無(wú)害梭菌的3-p羥基類固醇脫氫酶或者 來(lái)卽危弱擬桿菌的7-oc羥基類固醇脫氫酶時(shí)是例如上面描述的那些，并且分離自 念珠菌屬和Pichia的酵母中分離，如來(lái)自Candida parapsilosis的羰基還原酶 (CPCR) (US 5,523,223和US5,763,236; Enzyme Mcrob. Technol. 1993 Nov; 15 (11) :950-8)， Pichiacapsulata (DE 10327454.4)， Pichiafarinosa (A 1261/2005， K.C12N), Pichiafinlandica (EP1179595 Al)， Candida腿odendra (A 1261/2005， Kl. C12N)， Pichiatrehalophila (A 1261/2005， Kl. C12N)， Rhodotorula mucilaginosa (A 1261/2005， K1.C12N)， Lodderomyces elongisporus (A 1261/2005， K1.C12N) 和Pichia stipidis (A 1261/2005， K1.C12N)。
另外，所述二級(jí)醇S媳,氧化還原酶也可以完成NADH的再生，所述二 級(jí)醇脫氫酶/氧化還原酶如所述并且分離自放線菌科的細(xì)菌，例如紅城紅球菌 (US5523223X Norcardm fUsca (Biosci.Biotechnol.Biochem.， 63 (10) (1999)， p.1721-1729; Appl.Mcrobiol.Biotechnol.2003 Sep; 62 (4): 380-6， Epub 2003 Apr.26)、赤紅球菌(J.Org.Chem.2003Jan24; 8 (2) :402-6)或者微桿菌屬(A 1261/2005，幻.C12N)。
用于NADPH或者NADP再生的合適的二級(jí)醇脫氫藤氧化還原酶，例如在用來(lái)自累腐敗梭菌的12-a羥基類固醇脫氫酶、來(lái)自真桿菌屬的17-OC羥基類固醇 脫氫酶，或者來(lái)自索氏梭菌的7-ot羥基類固醇S腹酶時(shí)，是如所述并分離自下列 微生物的所述酶乳桿菌屬(高加索酸奶乳桿菌US5200335)、短乳桿菌 (DE19610984A1; Acta Qystallogr.D.Biol. Qystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8)、 稍小乳桿菌(DE 10119274)、肉色明串球菌(A 1261/2005，幻.C12N)，或者如 所述來(lái)自布氏熱厭氧菌、Thermoanerobmmethanolicus或者拜氏梭菌的那些。
兩種酶，羥基類固醇脫氫酶和氧化還原,郭兌氫,t^用于在大腸桿菌中 重組過(guò)表達(dá)。在本發(fā)明方法中，兩種酶，羥基類固醇脫氫酶和醇脫氫,氧4K 原酶可以以完全純化地、部分純化地，或者以含在細(xì)胞中的形式使用。所用的 細(xì)胞可以是天然的、有滲透性的或者溶解形式存在。
每公斤待轉(zhuǎn)化的氧代類固醇化合物或者羥^類固醇化合物{吏用50 000至10 Mo U羥基類固醇脫氫酶，以及50 000至10 Mo U醇脫氫酶(如上所公開的)。
酶單位1U相當(dāng)于，對(duì)于羥基類固醇脫氫酶來(lái)說(shuō)，每么H中(min)轉(zhuǎn)化1 !imol 氧代類固醇化合物所需的羥基類固醇脫氫酶酶量，或者每^H中(min)氧化1 fimol 2-醇所需的醇脫氫酶酶量。
^似地，每公斤待轉(zhuǎn)化的氧代類固醇化合物或者羥基類固醇化合物f吏用約 10 g至500 g含羥基類固醇脫氫酶的大腸桿菌生物濕物質(zhì)，和10 g至500 g含醇 脫氫,氧化還原酶的大腸桿菌生物濕物質(zhì)(按上文所公開的)。
NAD (P) H的再生用所述的酶偶聯(lián)方式完成。
在本發(fā)明方法中氧代類固醇化合物或者羥基類固醇化合物的轉(zhuǎn)化t^用兩 相系統(tǒng)完成，所述兩相系統(tǒng)含有用于輔因子再生的2-醇或者酮化合物、羥基類 固醇脫氫酶、醇脫氫酶、水、輔因子以及氧代類固醇化合物或者羥基類固醇化 合物。此外，還含有另外的有機(jī)溶劑，所述溶劑不參與輔因子的再生，也就是 說(shuō)，沒(méi)有Mil所用的醇脫氫酶可氧化的羥基或者可還原的酮基而含有。
兩相系統(tǒng)中與水不混合的有機(jī)組分的含量為占反應(yīng)混合物總體積量的10% 至90%，優(yōu)選20%至80%。水占反應(yīng)混合物總體積量的90%至10%，優(yōu)選80% 至20%。
可將pH值為5-10，雌6-9的緩沖液，例如磷酸媽-、Tns/HCl、甘氨酸-或者三乙翻安-緩沖液加至詠中。所述緩沖液還可含有用于穩(wěn)定或者活化所述兩 種酶的離子，例如f美離子或者鋅離子。另外本發(fā)明方法中還可使用用于穩(wěn)定羥基類固醇脫氫酶和醇脫氫酶的附加
組分，例如甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫蘇糖醇(DTT)或者二甲基亞砜(DMSO)。
輔因子NAD (P) H的濃度，以7jC相為^5出計(jì)算，為0.001 mM-10 mM， 特別地0.01-1.0 mM。溫度可取決于所用酶具體的特點(diǎn)，為1(TC-7(TC， 20°C-35°C。
本發(fā)明方法達(dá)到的TTN (總轉(zhuǎn)變數(shù)^mo1還原的氧代類固醇化合物/mol所 用的輔因子)可以為102-105，通常TTN〉103。
待還原的氧代類固醇化合物或者羥基類固醇化合物通常難溶于水。在反應(yīng) 過(guò)程中，所述底物可以完全或者不完全溶解。若所述底物在反應(yīng)混合物中不完 全溶解，貝ij一部分底物以固體形式存在，因此，可以形成第三固相。在轉(zhuǎn)化過(guò) 程中，反應(yīng)混合物可以形成臨時(shí)的乳液。
本發(fā)明方法中，待還原的氧代類固醇化合物或者待氧化的羥基類固醇化合 物的量為，以總反應(yīng)混合物的體積計(jì)》50 g/1。,為50 g/1400 g/1氧代類固醇 化合物/羥基類固醇化合物，特別i^50^-200g/1。
優(yōu)選的不參與輔因子再生的其他有機(jī)溶劑是，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、 叔丁基甲級(jí)醚、異丙基醚、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲垸或者環(huán)己烷或者其不 同組成的混合物。
ilil氧化通式為RxRyCHOH的二級(jí)醇或者C4-C6環(huán)烷醇完成NAD (P) H的再生。形成通式為RxRyC二0的酮或者C4-C6環(huán)烷酮的反應(yīng)產(chǎn)物。這里優(yōu) 選二級(jí)醇是脂肪族2-醇，例如異丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、2-辛 醇、4一甲基_2一戊醇、5-甲基-2-己醇，以及環(huán)二級(jí)醇，例如環(huán)己醇、環(huán)戊醇。原 則上，二醇化合物也是可行的，例如l,4-環(huán)己二醇。
M313S原通式為RxRyC二O的酮或者C4-C6環(huán)烷酮完成NAD(P)的再生。 形 式為RxRyCHOH的二級(jí)醇或者C4-C6環(huán)烷醇的反應(yīng)產(chǎn)物。優(yōu)選的酮化 合物是酮，例如丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、4-甲基-2-戊 嗣、5-甲基-2-己酮，以及環(huán)酮，例如環(huán)己酮、環(huán)戊酮。原則上，二酮化合物也 是可行的，例如l,4-環(huán)己二酮。
本發(fā)明方法例如在玻璃或者^(guò)屬反應(yīng)^^器中完成。這樣組分在反應(yīng)容器中 單獨(dú)轉(zhuǎn)化，同時(shí)在例如氮?dú)饣蛘呖諝庀聰嚢?。根?jù)所用的氧代類固醇化合物計(jì) 算反應(yīng)時(shí)間，為1小時(shí)至96小時(shí)，特別是2小時(shí)48小時(shí)。在所述反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，至少50%的氧代類固醇化合物被還原城相應(yīng)的羥基類固醇或者將羥基類固醇氧 化城相應(yīng)的氧代類固醇化合物。
下來(lái)實(shí)施例將用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例
1.將雄甾烯-3,17-二酮還原成17-P-羥基4-雄甾烯-3-酮(睪酮)
A) 用于輔酶再生的含4-甲基-2-戊醇的兩相系統(tǒng)
為了合成17f3-羥基-4-雄甾烯-3-酮(睪酮)，向含有0.1mgNAD， 30單位來(lái) 自睪丸酮假單胞菌的重組17-f3-羥基類固醇脫氫酶(J.Steroid B10chem.M0l.B10l. 44 (2)， 133-139 (1993)， PubmedP19871)和50單位來(lái)自Pichiacapsulata (DE畫A 103 27 454)的重組醇脫氫酶的0.5ml緩沖液(lOOmM三乙醇胺，pH=7， 1 mM MgCl2， 10%甘油)中，加入100mg溶于0.4m14-甲基-2-戊醇中的雄甾烯-3,17-二酮。將混合物在室溫，恒定攪拌下培養(yǎng)24小時(shí)。雄甾烯-3,17-二酮在總反應(yīng) 體積中的濃度為大約100 ^1。
反應(yīng)結(jié)束后，例如處理反應(yīng)混合物，其中用有機(jī)^f(j提取反應(yīng)混合物，然 后蒸餾除去所述有機(jī)溶劑。
24小時(shí)后，約94%的所用雄甾烯-3,17-二酮轉(zhuǎn)化成n-P-羥基-4-雄甾膝3-酮(睪酮)。
用氣相色譜足跟宗雄甾烯-3，17-二酮向17-P-羥基-4-雄甾烯-3-酮(睪酮)的轉(zhuǎn) 化。為此，用帶有手性分離柱LipodexE， 12m (Macheiy-Nagel， Dueren，德國(guó))， Flammen-Ionisations-Detektor和氦作為載氣的Shimadzu的氣相色譜GC-17A進(jìn) 行檢測(cè)。
B) 帶有用于輔酶再生的乙酸丁酯和2-丙醇的兩相系統(tǒng)
為了合成17-p-羥基4-雄甾烯-3-酮(睪酮)，向含有0.1mgNAD， 30單位 來(lái)自睪丸酮假單胞菌的重組17-(3-羥基類固醇脫氫酶(J.SteroidBiochem.Mol.Bi01. 44(2)， 133-139 (1993)， PubmedP19871)和50單位來(lái)自Pichiacapsulata (DE國(guó)A 103 27 454)的重組醇脫氫酶的0.5ml緩沖液(lOOmM三乙醇胺，pH=7， 1 mM MgCl2， 10%甘油)中，加入100 mg溶于0.3 ml乙酸丁酯和0.1 ml 2-丙醇中的 雄甾烯-3,17-二酮。將混合物在室溫，恒定攪拌下i咅養(yǎng)24小時(shí)。雄甾烯-3，17-二 酮在總反應(yīng)體積中的濃度為大約100 g/1。
反應(yīng)結(jié)束后，例如處理反應(yīng)混合物，其中用有機(jī)^^提取反應(yīng)混合物，然后蒸餾除去所述有機(jī)溶劑。
24小時(shí)后，約90%-95%所用雄甾烯-3,17-二酮轉(zhuǎn)化成17-(3-羥基4-雄甾烯-3-
酮(睪酮)。
2. 將酮石膽酸還原成鵝石膽酸
A) 用來(lái)自布氏熱厭氧菌的ADH/兩相系統(tǒng)完成輔酶再生
為了合成3a-7oc-二羥基-5-f3-膽酸(鵝石膽酸)，向含0.1mgNADP、 10單 位來(lái)自閃爍梭菌的重組7-a-羥基類固醇脫氫酶(PubmedAAB61151)和10單位 來(lái)自布氏熱厭氧菌的重組醇脫氫酶的0.2 ml緩沖液(100 mM磷酸鈣緩沖液， pH=8.5， lmMMgCl2， 10%甘油)中加入在0.5ml甲基戊醇中的100mg3a-羥 基-7-氧代-5-P-膽酸(酮石膽酸)。將混合物在室溫，恒定攪拌下培養(yǎng)24小時(shí)。 酮石膽酸在總反應(yīng)體積中的濃度為大約100 g/L
24小時(shí)后，約90-98%的所用酮石，旦酸轉(zhuǎn)化成鵝石膽酸。 用HPLC跟蹤酮石膽酸向鵝石膽酸的轉(zhuǎn)化。為此，用分離柱EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagd， Dueren，德國(guó)，)，MeOH/zK (80: 20) 混合物進(jìn)行檢測(cè)。
B) 用來(lái)自乳酸桿菌的ADH (DE 10119274) /兩相系統(tǒng)完成輔酶再生
為了合成3a-7a-二羥基-5-p-膽酸(鵝石膽酸)，例如向含O.l mg NADP、 10單位來(lái)自閃爍梭菌的重組7-a-羥基類固醇脫氫酶(PubmedAAB61151)和10 單位來(lái)自乳酸桿菌的重組醇脫氫酶(DE 10119274)的0.3ml緩沖液(100 mM 三乙醇胺緩沖液，pH=7， lmMMgCl2， 10%甘油)中加入在0.5 ml辛醇中的100 mg 3a-羥基-7-氧代-5-p-膽酸(酮石膽酸)。將混合物在室溫，恒定攪拌下培養(yǎng) 24小時(shí)。酮石膽酸在總反應(yīng)體積中的濃度為大約100 g/l。
24小時(shí)后，約70-80%的所用酮石膽酸轉(zhuǎn)化成鵝石膽酸。
3. 將1，4-雄甾二烯-3,17-二酮還原成17-p-羥基-l,4-雄甾二烯-3-酮
為了合成17-P-羥基-l,4-雄甾二烯-3-酮，向含有0.1mgNAD， 30單位來(lái)自 睪丸酮假單胞菌的重組17-p-羥基類固醇脫氫酶asteroid Biochem.Mol.Biol. 44 (2)， 133-139 (1993), PubmedP19871)和5單位來(lái)自Pichiacapsulata (DE-A103 27 454)的重組醇脫氫酶的0.5 ml緩沖液GOO mM三乙醇胺，pH-7， 1 mMMgCl2， 10%甘油)中，加入100mg溶于0.4m14甲基-2-戊醇中的l,4-雄甾二烯-3,17-二 酮。將混合物在室溫，恒定攪拌下培養(yǎng)24小時(shí)。1，4-雄甾二烯-3,17-二酮在總反應(yīng)體積中的濃度為大約100 g/l。
反應(yīng)結(jié)束后，例如反應(yīng)混合物進(jìn)行處理，其中有機(jī)相進(jìn)行分離，然后蒸餾 除去所述有機(jī)溶劑。
24小時(shí)后，約90%-98%的所用雄甾烯-3,17-二酮轉(zhuǎn)化成17-(3-羥基-1,4-雄甾 二烯-3-酮。
用氣相色譜足殿宗1,4-雄甾二烯-3,17-二酮向17-P-羥基-l,4-雄甾二烯-3-酮的 轉(zhuǎn)化。為此，用Perkin Elmer的氣相色譜AutosystemXL，配有帶FS-毛細(xì)管柱 Optima-5-MS (Machery-Nagel, Dueren，德國(guó))的質(zhì)譜儀，以氦作為載氣，進(jìn)行 檢測(cè)。
4.鵝石膽酸氧化成酮石膽酸
A) 用來(lái)自布氏熱厭氧菌的ADH/兩相系統(tǒng)完成輔酶再生
為了合成3a-羥基-7-氧代-5-P-膽酸(酮石膽酸)，向0.4 ml緩沖液(100 mM 磷歡tf丐緩沖液，pH=8.5， lmMMgCl2， 10%甘油)中，加入在0.5ml甲基異丁 酮中的100mg3a-7a-二羥基-5-p-膽酸(鵝石膽酸)，所述緩沖液含O.l mgNADP、 10 mg大腸桿菌生物濕物質(zhì)(其中含有來(lái)自閃爍梭菌的過(guò)表達(dá)的7-a-羥基類固醇 脫氫酶(PubmedAAB61151))和5 mg大腸桿菌生物濕物質(zhì)(其中含有來(lái)自布 氏熱厭氧菌的過(guò)表達(dá)的醇脫氫酶)。將混合物在室溫，恒定攪拌下i咅養(yǎng)24小時(shí)。 酮石膽酸在總反應(yīng)體積中的濃度為大約100 g/1。
24小時(shí)后，80。/。以上的所用鵝石膽酸轉(zhuǎn)化成酮石膽酸。
用薄層色譜足跟宗鵝石膽酸向酮石膽酸的轉(zhuǎn)化
B) 用來(lái)自孚L酸桿菌的ADH (DE 10119274) /兩相系統(tǒng)完成輔酶再生
為了合成3a-羥基-7-氧代-5-(3-膽酸(酮石膽酸)，向0.15 ml緩沖液(IOO mM 磷Mf丐緩沖液，pH=7.5， lmMMgCl2， 10%甘油)中，加入在0.7ml甲基異丁 酮中的100mg3a-7a-二羥基-5-p-膽酸(鵝石膽酸)，所述緩沖液含0.1 mgNADP、 10 mg大腸桿菌生物濕物質(zhì)(其中含有來(lái)自閃爍梭菌的過(guò)表達(dá)的7-a-羥基類固醇 脫氫酶(PubmedAAB61151))和5 mg大腸桿菌生物濕物質(zhì)(其中含有來(lái)自乳 酸桿菌的過(guò)表達(dá)的醇脫氫酶(DE10119274))。將混合物在室溫，恒定攪拌下培 養(yǎng)24小時(shí)。酮石膽酸在總反應(yīng)體積中的濃度為大約100 g/l。
24小時(shí)后，90%以上的所用鵝石膽酸轉(zhuǎn)化成酮石膽酸。
權(quán)利要求
1、一種對(duì)映體選擇性酶還原化合物的方法，所述化合物包括類固醇結(jié)構(gòu)(ABCD)，該結(jié)構(gòu)在環(huán)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或一個(gè)芳香環(huán)，并且在類固醇環(huán)系的3，7，11，12或17位或者在類固醇骨架任何碳基團(tuán)的α位至少有一個(gè)橋氧基(＝氧代類固醇化合物)，其中在輔因子NADH或者NADPH存在的條件下，用羥基類固醇脫氫酶還原所述氧代類固醇化合物，其特征在于a)氧代類固醇化合物在反應(yīng)混合物中的濃度≥50g/l，b)通過(guò)氧化通式為RXRYCHOH的二級(jí)醇，或者通過(guò)氧化C4-C6環(huán)烷醇持續(xù)性地再生由羥基類固醇脫氫酶形成的氧化輔因子NAD或者NADP，其中RX，RY彼此獨(dú)立是氫、支鏈或者無(wú)支鏈C1-C8烷基，且C總數(shù)≥3，和c)另外的氧化還原酶/醇脫氫酶用于氧化通式為RXRYCHOH的二級(jí)醇或者環(huán)烷醇。
2、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于，是具有下列通式I的化合物用作 氧代類固醇化合物 <formula>formula see original document page 2</formula>(I)其中R!是氫、甲基、羥基或者橋氧基； R2是氫、甲基、羥基或者橋氧基； R3是氫、羥基、橋氧基或者甲基；R4是氫或者羥基；Rs是氫，-COR10，其中，R化是未取代的或者用羥基取代的C1-C4烷基，或者取代的或者未取代的Cl-C4鄉(xiāng)基； 或者R4和R5—起表示橋氧基； R6是氫、甲基、羥基或者橋氧基； R7是氫、甲基、羥基或者橋氧基； Rs是氫、甲基或者鹵素；禾口 R9是氫、甲基羥基、橋氧基或者卣素；其中R!、 R2、 R4+R5、 R6、 Rg或者R9至少之一是氧橋基，或者Rs是-C01^且下列結(jié)構(gòu)式;^環(huán)或者有0、 1或2個(gè)C-C雙鍵的C6環(huán)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其特征在于2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、 4-甲基-2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、5-甲基-2-己醇或者2-辛醇用作通式為RxRyCHOH 的二級(jí)醇以及環(huán)己醇作為環(huán)烷醇。
4、 根據(jù)豐又利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其特征在于J^述方法在含7jC的有豐幾兩 相系統(tǒng)中完成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于另外地4柳有機(jī)溶齊,如乙醚、叔 丁基甲基醚、二異丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者 環(huán)己烷。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的方法，其特征在于TTN (總轉(zhuǎn)變數(shù)mol 還原的氧代類固醇化合物/mol所用的輔因子)
7、 根據(jù)禾又利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其特征在于在2-96小時(shí)內(nèi)，至少 50%的所用氧代類固醇化合物被還原成羥基類固醇化合物。
8、 根據(jù)禾又利要求1-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用酮石膽酸(式n)作 為氧代類固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
9、根據(jù)權(quán)利要求l-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用土也塞米松(式m)作為氧代類固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
10、根據(jù)權(quán)禾腰求1-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(式IV)作為氧代類固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
11、根據(jù)權(quán)禾腰求1-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(式V)作為氧代類固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>(V)
12、根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用雌酮(式VI)作為 氧代類固醇化合物<formula>formula see original document page 0</formula>
13、根據(jù)權(quán)利要求l-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用孕烯醇酮(式vn)<formula>formula see original document page 0</formula>
14.作為氧代類固醇化合物<formula>formula see original document page 0</formula>
15、 一種對(duì)映體選擇性酶氧化化合物的方法，所述化合物包括類固醇結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 0</formula>(ABCD)，該結(jié)構(gòu)在環(huán)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)或多個(gè)雜原子， 一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或一 個(gè)芳香環(huán)，并且在類固醇環(huán)的3， 7， 11， 12或17位或者在類固醇骨架任何碳 基團(tuán)的a位至少有一個(gè)羥基(=羥基類固醇化合物)，<formula>formula see original document page 6</formula>(ABCD) 其中在輔因子NAD或者NADP存在的^f牛下，用羥基類固醇脫氫酶氧化 所述羥基類固醇化合物，其特征在于a) 羥基類固醇化合物在反應(yīng)混合物中的濃fe50^1，b) Mil還原通式RxRYCO的酮化合物，或者ffiii^原C4-C6環(huán)烷酮，持 續(xù)性地再生由羥基類固醇脫氫酶形成的氧化輔因子NADH或者NADPH，其中 Rx， Ry彼此獨(dú)立是氫、支f連或者無(wú)支f連C廣C8烷基，且C總&3，禾口c) 另外的氧化還原敏醇脫氫酶用于還原通式為RxRyCO的酮或者環(huán)烷酮。
16、根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，具有下列通式I的化合物用作羥基類固醇化合物<formula>formula see original document page 6</formula>其中Rj是氫、甲基羥基或者橋氧基； R2是氫、甲基、橋氧基或者羥基； R3是氫、羥基、橋氧基或者甲基； R4是氫或者羥基；Rs是氫，-COR10，其中，R化是未取代的或者用羥基取代的C1誦C4烷基， 或者取代的或者未取代的Cl-C4羧烷基； 或者&和R5 —起表示橋氧基； R6是氫、甲基、橋氧基或者羥基；R7是氫、甲基橋氧基或者羥基；Rs是氫、甲基或者鹵素；和R9是氫、甲基羥基、橋氧基或者鹵素；其中R" R2、 R4、 R6、 R7、 R8或者R9至少之一是羥基，且下列結(jié)構(gòu)式:是,或者有0、 1或2個(gè)C-C雙鍵的C6環(huán)。
17、 根據(jù)禾又利要求15或者16的方法，其f寺征在于為2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、5-甲基-2-己酮或者2-辛酮作為通式RxRYCO的酮，和用環(huán)己酮作為環(huán)烷酮。
18、 根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法在含水的有 機(jī)兩相系統(tǒng)中完成。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于另外地j頓有機(jī)溶劑，例如乙醚、 叔丁基甲基醚、二異丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或 者環(huán)己烷。
20、 根據(jù)權(quán)利要求15-19的任一項(xiàng)的方法，其特征在于TTN (總轉(zhuǎn)變數(shù)= mol還原的羥基類固醇化合物/mol所用的輔因子)
21、 根據(jù)權(quán)利要求15-21的任一項(xiàng)的方法，其特征在于在2-96小時(shí)內(nèi)，至 少50%的所用羥基類固醇化合物被氧化^^基類固醇化合物。
全文摘要
一種對(duì)映體選擇性酶促還原類固醇結(jié)構(gòu)之化合物(ABCD)的方法，所述類固醇結(jié)構(gòu)之化合物在環(huán)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或一個(gè)芳香環(huán)，并且在類固醇環(huán)系的3，7，11，12或17位或者在類固醇骨架任何碳基團(tuán)的α位至少有一個(gè)橋氧基(＝氧代類固醇化合物/羥基類固醇化合物)，其中在存在NADH或者NADPH作為輔因子的條件下，所述氧代類固醇化合物用羥基類固醇脫氫酶還原，其特征在于a)氧代類固醇化合物在反應(yīng)混合物中的濃度為＞50g/l，b)通過(guò)氧化通式為R_XR_YCHOH的二級(jí)醇，其中R_X，R_Y彼此獨(dú)立是氫、支鏈或者無(wú)支鏈C₁-C₈烷基，且C_總數(shù)≥3，或者通過(guò)氧化C4-C6-環(huán)烷醇，持續(xù)性地再生由羥基類固醇脫氫酶形成的氧化輔因子NAD或者NADP，和c)另外的氧化還原酶/醇脫氫酶用于氧化通式為R_XR_YCHOH的二級(jí)醇或者環(huán)烷醇。
文檔編號(hào)C12P33/16GK101421413SQ200780012874
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日
發(fā)明者A·古普塔, A·申特謝爾, M·博布科瓦 申請(qǐng)人:Iep有限責(zé)任公司