專利名稱：：核酸的制作方法核酸本發(fā)明涉及來源于海生鞭孢簇蟲(亦稱海水派金蟲，尸^h'ra^waWm/力的核酸，其編碼9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶。所有這些編碼序列都可轉(zhuǎn)錄為單一轉(zhuǎn)錄物，這簡化了轉(zhuǎn)化表達(dá)所有三種蛋白質(zhì)所需細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及各個(gè)編碼序列和這些序列所編碼的蛋白質(zhì)以及將亞油酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸的方法。脂肪酸和三酰甘油在食品工業(yè)、動(dòng)物營養(yǎng)、化妝品和藥理學(xué)方面都有多種用途。按照它們是否是游離飽和或不飽和脂肪酸或者是具有高含量飽和或不飽和脂肪酸的三酰甘油，它們適用于各種非常不同的用途。多不飽和脂肪酸例如亞油酸和亞麻酸是哺乳動(dòng)物必不可少的，因?yàn)椴溉閯?dòng)物不能合成之。因此，多不飽和co3-脂肪酸和ca6-脂肪酸是動(dòng)物和人類營養(yǎng)中的重要組分。在下文，多不飽和脂肪酸稱為PUFA或LCPUFA(polyunsaturatedfattygcid，PUFA,!ong￡hain總oly且nsaturatedfatty汪cid,LCPUFA)。多種脂肪酸和甘油三酯主要得自微生物(例如被孢霉和裂殖壺菌)或產(chǎn)油植物(例如大豆、油菜)、藻類(例如隱曱藻或褐指藻)和其它來源，其中它們通常呈三酰甘油(=甘油三酯=三甘油酯)的形式。然而，它們也可得自動(dòng)物，例如魚類。通過水解可以方便地制備游離脂肪酸。油料作物并不合成非常長鏈的多不飽和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(=DHA，C22:6M'7，10'13'16'19)、二十碳五烯酸(二EPA,C20:5A5'8'1U4，17)、花生四烯酸(二ARA，C20:4A5，8，1U4)、二高卞亞麻酸(C20:3A8"'")或二十二碳五烯酸(DPA,C22:5A7'1G，13，16'19)，所述油料作物例如油菜、大豆、向日葵或紅花。這些脂肪酸的常規(guī)天然來源是魚類(例如紳魚、鮭魚、沙丁魚、紅鮭魚、鰻魚、鯉魚、鱒魚、鰈魚、鯖魚、梭鱸或金槍魚)或藻類。根據(jù)預(yù)期用途，優(yōu)選含飽和或不飽和脂肪酸的油。在人類營養(yǎng)中，例如，優(yōu)選含不飽和脂肪酸、尤其是多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。據(jù)說，多不飽和0)3-脂肪酸對血液中膽固醇水平具有積極效果，因此可能對預(yù)防心臟病有效。在食物中添加這些co3-脂肪酸，可明顯降低心臟病、中風(fēng)或高血壓的危險(xiǎn)。而且，0)3-脂肪酸對炎癥、尤其是與免疫性疾病有關(guān)的慢性炎癥(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)進(jìn)程具有積極效果。因此，可將其添加在食物、尤其是營養(yǎng)性食物中，或者用于藥物。co6-脂肪酸(例如花生四烯酸)傾向于對與我們通常飲食攝入所致的這些風(fēng)濕性疾病有關(guān)的疾病具有負(fù)面效果。Q)3-脂肪酸和co6-脂肪酸是組織激素的前體，稱為類二十烷酸，例如前列腺素以及血栓烷和白三烯，其中前列腺素衍生自二高-y-亞麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，而血栓烷和白三烯衍生自花生四烯酸和二十碳五烯酸。由①6-脂肪酸形成的類二十烷酸(稱為PG2系歹寸)通常能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而來自co3-脂肪酸的類二十烷酸(稱為PG3系列)卻沒有或幾乎沒有促炎效果。因?yàn)槎嗖伙柡椭舅峋哂杏欣匦?，所以過去一直在努力制備可用的基因，所述基因參與這些脂肪酸或甘油三酯的合成，用于在具有改良不飽和脂肪酸含量的各種生物中產(chǎn)生油。因此，WO91/13972及其美國等同專利說明書介紹了A9-去飽和酶。WO93/11245要求保護(hù)A15-去飽和酶，而WO94/11516要求保護(hù)A12-去飽和酶。更多的去飽和酶可參見例如EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP-A-0794250，Stukey等，J.Biol.Chem"265，1990:20144-20149，Wada等，Nature347，1990:200-203或Huang等，Lipids34，1999:649-659。然而，迄今為止，對各種去飽和酶的生化特性的了解尚不充分，因?yàn)槊甘悄そY(jié)合蛋白，在其分離和表征方面非常困難(McKeon等，MethodsinEnzymol.71,1981:12141-12147,Wang等，PlantPhysiol.Biochem.,26,1988:777-792)。通常，通過將膜結(jié)合去飽和酶引入合適生物體內(nèi)，再通過分析原料和產(chǎn)物而分析酶活性，從而表征膜結(jié)合去飽和酶。A6-去飽和酶在以下文獻(xiàn)中有描述WO93/06712、US5，614，393、US5614393、WO96/21022、WO00/21557和WO99/27111;而轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生脂肪酸的應(yīng)用可參見WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765。就這一方面而言，WO99/64616或WO98/46776也介紹和要求保護(hù)各種去飽和酶的表達(dá)和多不飽和脂肪酸的形成。有關(guān)去飽和酶表達(dá)功效及其對多不飽和脂肪酸形成的作用，必須注意，迄今為止，所述單一去飽和酶的表達(dá)僅產(chǎn)生少量不飽和脂肪l^/脂質(zhì)，例如"亞麻酸和十八碳四烯酸。此外，通常可得到G)3-脂肪酸和co6-脂肪酸的混合物。用于生產(chǎn)PUFA的特別合適的微生物是微藻類，例如三角褐指藻(/Vzaeodac^/w/w^7.cor"i^wm)、^^求》萊(尸or//z/n'(i/wwspecies)、石皮嚢壺菌(rArawWoc/^fWwwspecies)、裂殖壺菌(*Sc/z/zoc/^^7'wmspecies)或隱曱藻(Oy//7ec0(^m'wmspecies);纖毛蟲類，例濁口棘尾蟲屬(5^/o"yc/z/(3)或豆形蟲屬(Co/pWww);真菌類，例如被孢霉屬(^/0^￡"http://<3)、蟲霉屬(￡"towo//^ora)或毛霉屬(Mwcor);和/或苔蘚類，例如劍葉蘚屬(尸/zj^co附z7re〃a)、角齒蘚屬(Ceratocfo")和地4艮屬(Afo/x/za""a)(R.Vazhappilly&F.Chen(1998)BotanicaMarina41:553-558;K.Totani&K.Oba(1987)Lipids22:1060-1062;M.Akimoto等(1998)Appl.BiochemistryandBiotechnology73:269-278)。株系的選擇導(dǎo)致開發(fā)出大量的微生物突變林，所述株系產(chǎn)生一系列想要的化合物，包括PUFA。然而，改進(jìn)特定分子(例如多不飽和脂肪酸)產(chǎn)量的林系的突變和選擇是耗時(shí)而困難的。這也就是為什么在可能情況下會(huì)優(yōu)選上述重組方法。然而，借助于上述微生物僅可產(chǎn)生有限量的所需多不飽和脂肪酸(例如DPA、EPA或ARA)，而且根據(jù)所用微生物的不同，通常得到的是EPA、DPA和ARA等的脂肪酸混合物。討論了花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)合成的各種合成途徑(圖1)。因此，EPA或DHA是在海洋細(xì)菌中通過聚酮化合物途徑產(chǎn)生的，例如弧菌(WZWosp.)或希瓦氏菌(幼ew朋e〃asp.)(Yu，R.等，Lipids35:1061-1064，2000;Takeyama，H.等,Microbiology143:2725-2731，1997)。一個(gè)替代策略是改變?nèi)ワ柡兔负脱由烀傅幕钚?Zank,T.K.等，PlantJournal31:255-268,2002;Sakuradani,E.等，Gene238:445-453，1999)。對上述通過A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶、A5-延伸酶和A4-去々包和酶途徑的〗務(wù)飾是哺乳動(dòng)物的Sprecher途徑(Sprecher2000,Biochim.Biophys.Acta1486:219-231)。替代A4-去飽和的是，在此導(dǎo)致進(jìn)一步延伸步驟，得到C24,接著再進(jìn)行A6-去飽和和最終的卩-氧化，得到C22鏈長。因此，稱為Sprecher的途徑(參見圖l)并不適合在植物和微生物中進(jìn)行生產(chǎn)，因?yàn)檎{(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。根據(jù)其去飽和方式的不同，可將多不飽和脂肪酸分為兩大類，即co6-脂肪酸或co3-脂肪酸，這兩者在代^射和功能活性上不同(圖1)。0)6-代謝途徑的原料是脂肪酸亞油酸(18:2^'12)，而①3-途徑是通過亞麻酸(18:3"9，12'15)來進(jìn)行。亞麻酸是由co3-去飽和酶活性而形成的(Tocher等，1998,Prog.LipidRes.37，73-117;Domergue等，2002,Eur.J.Biochem.269，4105-4113)。哺乳動(dòng)物和人類都沒有相應(yīng)去飽和酶活性(A12-去飽和酶和0)3-去飽和酶)，而必須通過食物攝入這些脂肪酸(必需脂肪酸)。自這些前體開始，通過去飽和酶和延伸酶反應(yīng)程序，合成生理上重要的多不飽和脂肪酸花生四烯酸^ARA,20:4"'8，11，14)、6-脂肪酸和兩種co3-脂肪酸二十碳五烯酸(=EPA，20:5As'8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6A4，7，iG,i3'n'i9)。應(yīng)用①3—脂肪酸對治療心血管疾病(shimikawa2001,WorldRev.Nutr.Diet.88,100-108)、Entztindungen(Calder2002,Proc.Nutr.Soc.61,345-358)和關(guān)節(jié)炎(Cleland和James2000，J.Rheumatol.27，2305-2307)具有上述治療性活性。脂肪酸通過延伸酶以2個(gè)或4個(gè)碳原子方式延伸，分別對于C2(rPUFA和C22-PUFA的產(chǎn)生而言是至關(guān)重要的。該過程是通過4個(gè)步驟而進(jìn)行的。第一步是通過酮脂酰-CoA合酶(KCS，在下文稱為延伸酶)使丙二酰-CoA與脂肪酸-?；?CoA縮合。這之后是還原步驟(酮脂酰-CoA還原酶，KCR)、脫水步驟(脫水酶)和最終的還原步驟(烯?；?CoA還原酶)。假定延伸酶活性影響整個(gè)過程的特異性和速率(Millar和Kunst,1997PlantJournal12:121-131)。過去一直在努力工作以獲取延伸酶基因。Millar和Kunst,1997(PlantJournal12:121國131)和Millar等，1999，(PlantCellU:825-838)介紹了植物延伸酶的表征，這些酶用于合成單不飽和長鏈脂肪酸(C22:1)和合成非常長鏈脂肪酸(用于形成植物蠟(C28-C32))。有關(guān)花生四烯酸和EPA合成的介紹可參見例如WO0159128、WO0012720、WO02077213和WO0208401。多不飽和(324-脂肪酸的合成可參見例如Tvrdik等，2000，JCB149:707-717或WO0244320。高等植物含有多不飽和脂肪酸，例如亞油酸(18:2化12)和亞麻酸(18:3A9'12，15)。ARA、EPA和DHA在高等植物的種子油中完全不含，或僅含極少量(E.Ucciani:NouveauDictionnairedesHuilesV6g6tales[NewDictionaryofVegetableOils].Technique&Documentation-Lavoisier,1995.ISBN:2-7430-0009-0)。然而，在高等植物、優(yōu)選油料作物(例如油菜、亞麻籽、向日葵和大豆)中，LCPUFA的產(chǎn)量是很有利的，因?yàn)榭梢越?jīng)濟(jì)地獲取大量高品質(zhì)LCPUFA用于食品工業(yè)、動(dòng)物營養(yǎng)和制藥目的。為此，有利的是通過重組方法向油料作物中引入LCPUFA生物合成酶的基因并在其中表達(dá)這些基因。這些基因可編碼例如A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶?？梢员憷貜漠a(chǎn)生LCPUFA并將其結(jié)合在膜上或三酰甘油中的微生物和低等植物中獲取這些基因。因此，已經(jīng)可以從苔蘚展葉劍葉蘚(尸/z^ccw7z7re〃a;a&m)中分離A6-去飽和酶基因，并從展葉劍葉蘚和線蟲——秀麗新小桿線蟲(Ce/ega"力中分離A6-延伸酶基因。含有和表達(dá)LCPUFA生物合成酶編碼基因并且繼而產(chǎn)生LCPUFA的第一種轉(zhuǎn)基因植物首次描述于例如DE-A-10219203(在植物中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法)。然而，這些植物產(chǎn)生LCPUFA的數(shù)量需要進(jìn)一步優(yōu)化，以加工植物中存在的油類。如圖1所示，使用合適的去飽和酶可修飾co6-途徑的產(chǎn)物，并且在必要時(shí)使用延伸酶，得到co3脂肪酸。因此，在遺傳修飾生物中開發(fā)可產(chǎn)生ARA的產(chǎn)物，將會(huì)是非常有價(jià)值的。牡蠣的原生動(dòng)物寄生蟲海生鞭孢簇蟲CPwhVwi^wan'mw/)能通過△-8去飽和酶途徑合成飽和及不飽和脂肪酸，包括必需脂肪酸花生四烯酸[20:4(n-6)。令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)海生鞭孢簇蟲(尸.man'wim')含有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶的編碼核酸，其都轉(zhuǎn)錄為單一轉(zhuǎn)錄物。全長序列見SEQIDNO:1。因此，本發(fā)明第一方面，提供一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077或其同源物的核酸序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽選自SEQIDNO:2、3和4;d)SEQIDNO:1核酸序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性。本發(fā)明核酸序列的優(yōu)勢是，盡管它編碼3種不同的酶，但是它可轉(zhuǎn)錄為單一序列，這使得制備表達(dá)所有3種酶的克隆載體和表達(dá)載體簡單得多。優(yōu)選本發(fā)明的分離的核酸序列與SEQIDNo1(序列1047306867)本身不相同。就本發(fā)明而言，"在嚴(yán)格性條件下雜交"用于描述雜交和洗滌條件，在該條件下與另一序列具有至少60%同源性的核苦酸序列通常可以相互雜交。優(yōu)選這樣的條件使得與另一序列具有至少約65%、優(yōu)選至少約70°/。、特別優(yōu)選至少75%或更高同源性的序列通常能夠相互雜交。這些嚴(yán)格性條件是技術(shù)人員已知的，可參見例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。優(yōu)選的嚴(yán)格性雜交條件的非限制性實(shí)例是在以下條件下雜交6x氯化鈉/檸檬酸鈉^SSC),約45。C,接著在以下條件下進(jìn)行一次或多次洗滌步驟0.2xSSC，0.1%SDS，50-65°C。技術(shù)人員知道，這些雜交條件因核酸種類不同而異，而且例如當(dāng)存在有機(jī)溶劑時(shí)，與溫度和緩沖液濃度有關(guān)。在"標(biāo)準(zhǔn)雜交條件"下，例如雜交溫度根據(jù)核酸類型介于42。C和58。C之間，在含水緩沖液濃度為0.1-5xSSC(pH7.2)。如果有機(jī)溶劑，例如50%曱酰胺存在于上述緩沖液中，則標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度為約42。C。DNA:DNA雜交的雜交條件，例如為O.lxSSC和20。C至45。C,優(yōu)選30。C至45。C。DNA:RNA雜交的雜交條件為例如0.1xSSC和3(TC至55。C,優(yōu)選45。C至55。C。舉例來說，對于長度約100bp(-堿基對)、且G+C含量為50%的核酸，在不含曱酰胺的情況下，確定上述雜交條件。技術(shù)人員知道怎樣根據(jù)上述教科書或例如以下教科書來決定所需雜交條件Sambrook等，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989;Hames和Higgins(編著)1985,"NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(編著)1991,"EssentialMolecularBiology:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。此外，當(dāng)本說明書涉及這樣的核苷酸序列的分離的核酸分子其在嚴(yán)格性條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3所示的核苷酸序列之一或其部分雜交，"其部分"的含義可理解為根據(jù)本發(fā)明，至少25堿基對(-bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp、優(yōu)選至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp、特別優(yōu)選350bp、400bp、450bp、500bp或更多石威基對用于雜交。就本發(fā)明而言，核酸序列與序列SEQIDNO:l的"同源物"是指例如與SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有至少約50%或60%、優(yōu)選至少約60%或70%、更優(yōu)選至少約70%或80°/。、90%或95%、甚至更優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性或同源性的等位變異體。"等位變異體"尤其包括功能變異體，其可通過目標(biāo)序列的核苷酸缺失、插入或取代而得到，然而對于一個(gè)或多個(gè)基因的插入而言，所得合成蛋白質(zhì)的酶活性可有利地保留下來"同源物"也指細(xì)菌、真菌和植物的同源物、截短序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA及其衍生物，例如啟動(dòng)子變異體。所述核苦酸序列上游的啟動(dòng)子可以通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸交換、插入和/或缺失來修飾，而沒有對啟動(dòng)子功能性或活性造成不利影響。此外，啟動(dòng)子序列的》務(wù)飾還可提高其活性或者它們可#:更多活性啟動(dòng)子(包括來源于異源生物的啟動(dòng)子)完全取代。為了測定兩個(gè)氨基酸序列的％同源性(=同一性)，將一個(gè)序列寫在另一序列下面，用于優(yōu)化比較(例如，可將空位引入蛋白質(zhì)序列或核酸序列，以便得到與另一蛋白質(zhì)或另一核酸的優(yōu)化比對)。然后比4支相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。如果序列中的某一位置被與另一序列相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或相同的核苷酸占據(jù)，則分子在該位置上是同源的(即本文所用的氨基酸或核酸"同源性"相當(dāng)于氨基酸或核酸"同一性")。兩個(gè)序列間的％同源性^^列共享位置數(shù)的函數(shù)(即。/。同源性—目同位置銜位置總數(shù)x100)。因此，認(rèn)為術(shù)語同源性和同一性是同義詞。對整個(gè)氨基酸或核酸序列區(qū)計(jì)算同源性。技術(shù)人員可使用基于各種算法的一系列程序來進(jìn)行各種序列的比較。在此，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman算法得到特別可靠的結(jié)果。程序PileUp(J.Mol.Evolution"25，351-360,1987,Higgins等，CABIOS，51989:151-153)或程序Gap和BestFit[Needl函n和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981)]都是GCG軟件包的組成部分[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)]，都可用于序列比對。使用程序GAP和以下設(shè)定，對完整序列區(qū)測定在上文用百分率表示序列0gy值空位權(quán)重50，長度權(quán)重3，平均匹配10.000和平均錯(cuò)配0.000。除非另有說明，否則這些設(shè)置通常作為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置，用于序列比對。就本發(fā)明而言，"A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性"的含義可理解為與序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077所編碼的蛋白質(zhì)/酶相比，SEQIDNO:l或SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077的衍生物所編碼的蛋白質(zhì)保留至少10°/。、優(yōu)選20%、特別優(yōu)選30%、非常特別優(yōu)選40。/。的酶活性，因此可催化亞油酸轉(zhuǎn)化為花生四烯酸。盡管通常將具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性的多肽的編碼核酸轉(zhuǎn)錄為單一序列，但是在某些情況下優(yōu)選使用編碼單一酶(即A9-延伸酶、A8-去飽和酶或A5-去飽和酶)的核酸。因此，在本發(fā)明的第二方面中，提供一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基7668-9200或SEQIDNO:9的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的^f汙生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性。在本發(fā)明的第三方面中，提供一種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基9351-10724的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:3具有至少40°/。同一性；其中所述多肽具有A8-去飽和酶活性。在本發(fā)明的第四方面中，提供一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基10842-12077的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A5-去飽和酶活性。在本發(fā)明的再一方面，提供由本發(fā)明第一至第四方面中任一項(xiàng)的核酸序列所編碼的多肽。有利的是，這些核酸分子所編碼的多肽與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少約50%,優(yōu)選至少約60%，更優(yōu)選至少約70%、80%或卯％,最優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性。將該方法所用的核酸序列便利地引入表達(dá)盒，使得這些核酸在微生物或植物等生物中的表達(dá)成為可能。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供基因構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼一個(gè)或多個(gè)具有如上所述的A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶活性的多肽的核酸序列，該核酸序列與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列有效連接。在表達(dá)盒中，編碼A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶的核酸序列與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列有效連接，便于增強(qiáng)基因表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列使特定基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)成為可能。根據(jù)宿主生物的不同，這意味著例如僅當(dāng)發(fā)生基因引入之后，才會(huì)表達(dá)和/或過量表達(dá)該基因，或者立即表達(dá)和/或過量表達(dá)該基因。例如，這些調(diào)節(jié)序列呈現(xiàn)出這樣的序列形式誘導(dǎo)物或阻遏物可與這樣的序列形式結(jié)合，因而控制核酸的表達(dá)。除了這些新調(diào)節(jié)序列之外，或者替代這些序列，如果合適的話，在實(shí)際的結(jié)構(gòu)基因經(jīng)基因改造之前，這些序列的天然調(diào)節(jié)元件也可以存在，所述基因改造的方式消除了它們的天然調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了基因表達(dá)。然而，表達(dá)盒(=表達(dá)構(gòu)建體=基因構(gòu)建體)在構(gòu)建上也可以更簡化，也就是說在核酸序列或其衍生物和具有其調(diào)節(jié)功能的天然啟動(dòng)子沒有除去之前，不插入額外的調(diào)節(jié)信號。而天然調(diào)節(jié)序列的突變方式使得不再發(fā)生調(diào)節(jié)和/或增強(qiáng)了基因表達(dá)。這些修飾的啟動(dòng)子也可位于天然基因之前的它們本身的位置上，呈現(xiàn)部分-序列形式(=帶有本發(fā)明所用的核酸序列部分的啟動(dòng)子)，以增強(qiáng)活性。此外，基因構(gòu)建體還可有利地包含與啟動(dòng)子有效連接的一個(gè)或多個(gè)稱為增強(qiáng)子序列的序列，使得核酸序列的表達(dá)增強(qiáng)成為可能。額外的有利序列，例如更多調(diào)節(jié)元件或終止子序列也可插入到DNA序列的3，端。也可存在一個(gè)或多個(gè)編碼催化ARA轉(zhuǎn)化為co3-不飽和脂肪酸(例如EPA或DHA)的酶的序列。因此，例如，編碼A5-延伸酶、co3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶的序列可存在于表達(dá)盒^基因構(gòu)建體)的一個(gè)或多個(gè)拷貝中。優(yōu)選每個(gè)表達(dá)盒中只存在一個(gè)拷貝的基因。這樣的基因構(gòu)建體可在宿主生物中一起表達(dá)。就這種情況而言，基因構(gòu)建體可插入到一個(gè)或多個(gè)載體中并可以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，或者可插入到基因組內(nèi)。對于更多基因插入到基因組而言，有利的是當(dāng)有待表達(dá)的基因與一個(gè)基因構(gòu)建體一起存在時(shí)。就這種情況而言，調(diào)節(jié)序列或調(diào)節(jié)因子可以如上所述地優(yōu)選對所引入基因的基因表達(dá)具有正面效應(yīng)，因而能增強(qiáng)它。因此，調(diào)節(jié)元件的增強(qiáng)作用(最好在轉(zhuǎn)錄水平上)可通過使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)而發(fā)生。另外，然而，也可能通過例如提高mRNA的穩(wěn)定性來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。具體地講，調(diào)節(jié)序列包括植物序列，例如啟動(dòng)子和終止子序列。在選擇性條件下，構(gòu)建體可在微生物(尤其是大腸桿菌(五.co")和根癌土壤桿菌(y^ra6"cfeW"mft/me/ac&ra))中穩(wěn)定增殖，并能將異源DNA轉(zhuǎn)入植物或微生物。有用的調(diào)節(jié)序列存在于例如啟動(dòng)子中，例如cos、tac、trp、tet、trp畫tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、am、SP6、X-PR或X-PL啟動(dòng)子中，并且可有利地用于革蘭氏陰性菌。更有利的調(diào)節(jié)序列例如存在于革蘭氏陽性啟動(dòng)子amy和SP02中，存在于酵母或真菌的啟動(dòng)子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中，或存在于植物啟動(dòng)子CaMV/35S[Franck等，Cell21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或存在于泛蛋白或菜豆蛋白啟動(dòng)子中。就該情況而言，最好還有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如以下文獻(xiàn)中描述的啟動(dòng)子EP-A-0388186(苯磺酰胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)，PlantJ.2，1992:397-404(Gatz等，四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)，EP-A-0335528(脫落酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)或WO93/21334(乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或環(huán)己烯醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)。更多合適的植物啟動(dòng)子是胞質(zhì)FBPase啟動(dòng)子或馬鈴薯ST畫LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBOJ.8，1989，2445)、大豆(g/jc/"emax)磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子(Genbank登錄號U87999)或node特異性啟動(dòng)子(描述于EP-A-0249676)。特別有利的啟動(dòng)子是使在參與脂肪酸生物合成的組織中表達(dá)成為可能的啟動(dòng)子。非常特別有利的是種子特異性啟動(dòng)子，例如所述的USP啟動(dòng)子和其它啟動(dòng)子(例如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白啟動(dòng)子)。更特別有利的啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子，其可用于單子葉植物或雙子葉植物，其描述于US5，608，152(油菜的油菜籽蛋白啟動(dòng)子)、W098/45461(擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)、US5,504,200(菜豆(戶/2ase0/wvw/gan'力的菜豆蛋白啟動(dòng)子)、WO91/13980(蕓墨的Bce4啟動(dòng)子)、Baeumlein等，PlantJ.,2,2，1992:233-239(豆科植物的LeB4啟動(dòng)子)，這些啟動(dòng)子適用于雙子葉#>物。適用于單子葉植物的啟動(dòng)子實(shí)例是大麥lpt-2或lpt-l啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)、大麥的大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子和其它合適的啟動(dòng)子(描述于WO99/16890)。從原則上說，可使用所有天然啟動(dòng)子以及它們的調(diào)節(jié)序列，例如上述那些。也可方便地使用合成啟動(dòng)子，無論是一起使用還是單獨(dú)使用，尤其是當(dāng)它們介導(dǎo)種子特異性表達(dá)時(shí)，例如WO99/16890中描述的那些。為了得到特別高的ARA含量，尤其是在轉(zhuǎn)基因植物中，應(yīng)當(dāng)在油料作物中以種子特異性方式有利地表達(dá)所述基因。為此，可使用種子特異性啟動(dòng)子或在胚和/或胚乳中具有活性的啟動(dòng)子。從原則上說，種子特異性啟動(dòng)子既可從雙子葉植物又可從單子葉植物中分離。優(yōu)選的啟動(dòng)子列舉如下USP(=未知種子蛋白)和豌豆球蛋白(蠶豆(F"/c/a/Wa))[Baumlein等，Mol.GenGenet"1991，225(3)]、油菜籽蛋白(油菜)[US5,608，152]、?；d體蛋白(油菜)[US5,315,001和WO92/18634]、油質(zhì)蛋白(擬南芥(JrahV/ojM/sAa"a朋))[WO98/45461和WO93/20216]、菜豆蛋白(菜豆)[US5,504,200]、Bce4[WO91/13980]、豆球蛋白B4(LegB4啟動(dòng)子)[B汪umlein等，PlantJ"2,2,1992]、Lpt2和lptl(大麥)[WO95/15389和WO95/23230],水稻、玉米和小麥的種子特異性啟動(dòng)子[WO99/16890]、Amy32b、Amy6-6和aleurain[US5,677,474]、Bce4(油菜)[US5，530，149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571741]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870]、ADRUJ(大豆)[WO98/08962]、異檸檬酸裂合酶(油菜)[US5，689，040]或a-淀粉酶(大麥)[EP781849]。也可通過化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子促進(jìn)植物基因表達(dá)(有關(guān)綜述參見Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"48:89-108)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子尤其合適，當(dāng)希望基因表達(dá)以時(shí)間特異性方式發(fā)生時(shí)。這類啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等(1992)PlantJ.2,397-404)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了確保生物合成基因在多次傳代中穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因植物中，對于每個(gè)目標(biāo)蛋白編碼核酸而言，通常都必須在單獨(dú)的啟動(dòng)子控制之下表達(dá)，優(yōu)選所用啟動(dòng)子不同于其它啟動(dòng)子，因?yàn)橹貜?fù)序列基序可導(dǎo)致T-DNA不穩(wěn)定或?qū)е轮亟M事件。這是本發(fā)明核酸之所以特別有利的一個(gè)原因，因?yàn)锳9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶的編碼序列可作為單一單元而轉(zhuǎn)錄，僅需要一個(gè)啟動(dòng)子。當(dāng)然，對于編碼例如A5-延伸酶、co3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶的其它基因而言，必須處于單獨(dú)的啟動(dòng)子控制之下。在這種情況下，方便地構(gòu)建表達(dá)盒，其方式使得啟動(dòng)子后面接合適的切割位點(diǎn)，最好在多聚接頭中，用于插入有待表達(dá)的核酸，并且如果合適的話，將終止子序列放在多聚接頭后面。該序列重復(fù)幾次，優(yōu)選3、4或5次，使得至多5個(gè)基因可結(jié)合在一個(gè)構(gòu)建體中并導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中，以便表達(dá)。有利的是，序列最多重復(fù)3次。為了表達(dá)核酸序列，通過例如多聚接頭中的合適切割位點(diǎn)，將后者插入到啟動(dòng)子后面。有利的是，各核酸序列具有其各自的啟動(dòng)子，而且如果合適的話，其各自具有終止子序列。這樣有利的構(gòu)建體在例如以下文獻(xiàn)中公開DE10102337或DE10102338。然而，也可以將多個(gè)核^列插入到啟動(dòng)子后面，而且如果合適的話，在終止子序列前面。在此，表達(dá)盒中插入核酸的插入位點(diǎn)或序列并非至關(guān)重要，也就是說，核酸序列可插入在表達(dá)盒的第一個(gè)或最后一個(gè)位置上，而其表達(dá)基本不受影響。有利的是，在表達(dá)盒中可使用不同啟動(dòng)子(例如USP、LegB4或DC3啟動(dòng)子)和不同終止子序列。然而，在表達(dá)盒中也可只用一種類型的啟動(dòng)子。但是，這可能導(dǎo)致不想要的重組事件。如上所述，最好應(yīng)當(dāng)由合適的終止子序列在所導(dǎo)入的生物合成基因的3'端(在終止密碼子后面)終止所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄。用于這種情況的序列的實(shí)例是OCS1終止子序列。就啟動(dòng)子而言，不同終止子序列應(yīng)當(dāng)用于各自的基因。本發(fā)明的基因構(gòu)建體也可包含選自以下的脂肪酸或脂質(zhì)代謝的生物合成基因酰基-CoA去飽和酶、?；?ACP[-酰基載體蛋白]去飽和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基轉(zhuǎn)移酶、酰基-CoA:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙?；?輔酶A羧化酶、酰基-輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶(fattyacidacetylenase)、脂肪氧合酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶(allenoxidesynthase)、氬過氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶和去飽和酶，例如A4-去飽和酶、A5-去飽和酶、A6-去飽和酶、A8-去飽和酶、A9-去飽和酶、A12-去飽和酶或A6-延伸酶?？蓪⑦@些額外核酸或基因克隆到表達(dá)盒中，然后借助于載體(例如土壤桿菌)，用于轉(zhuǎn)化植物。在此，調(diào)節(jié)序列或調(diào)節(jié)因子可如上所述地優(yōu)選對所^1入的表達(dá)基因具有正面效應(yīng)，因而可增強(qiáng)表達(dá)基因。因此，通過使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)可方便地在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生調(diào)節(jié)元件的增強(qiáng)作用。然而，也可以通過例如提高mRNA的穩(wěn)定性來增強(qiáng)翻譯。原則上說，表達(dá)盒可直接用于引入植物或引入載體中。因此，在本發(fā)明的又一方面，提供包含本發(fā)明上述任一方面的核酸或基因構(gòu)建體的栽體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是克隆載體。本發(fā)明的核酸序列可單獨(dú)引入，或優(yōu)選與表達(dá)盒(核酸構(gòu)建體)一起引入生物體內(nèi)。為了引入核酸，可以用已知方法方便地?cái)U(kuò)增和連接后者。優(yōu)選按照PfUDNA聚合酶或PfWTaqDNA聚合酶混合物方案所用的方法。選擇引物時(shí)，考慮需要擴(kuò)增的序列。應(yīng)當(dāng)方便地選擇引物，其方式是擴(kuò)增產(chǎn)物包含從起始密碼子到終止密碼子的完整密碼基因股序列(codogenicsequence)。擴(kuò)增后，方便地分析擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，可以進(jìn)行凝膠電泳分離，再進(jìn)行定量和定性分析。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Qiagen)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。等分的純化擴(kuò)增產(chǎn)物可用于其后的克隆步驟。合適的克隆載體是技術(shù)人員公知的。具體地講，它們包括在微生物系統(tǒng)中能復(fù)制的載體，也就是說主要確保在酵母或真菌中有效克隆并可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的載體。特別要提到的載體是各種二元和共整合載體系統(tǒng)，它們適用于T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。原則上說，這類載體系統(tǒng)的特征在于，它們至少包含土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和T-DNA-邊界序歹'J(T-DNA邊界)所需的vir基因。這些載體系統(tǒng)最好還包含cis-調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子和終止子序列)和/或選擇標(biāo)記，這樣的標(biāo)記可用于鑒定適當(dāng)轉(zhuǎn)化的生物。盡管就共整合載體系統(tǒng)vir基因和T-DNA序列排列在同一載體上而言，二元系統(tǒng)基于至少兩個(gè)載體，其中一個(gè)攜帶vir基因，但沒有T-DNA,而第二個(gè)攜帶T-DNA，但沒有vir基因。因?yàn)檫@個(gè)事實(shí)，最后提到的載體相當(dāng)小，容易操縱并在大腸桿菌和土壤桿菌中都可復(fù)制。這些二元載體包括來自系列pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen的載體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用Binl9、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。有關(guān)二元載體及其用途的概述可參見Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446-451。為了制備載體，可以先用限制性核酸內(nèi)切酶將載體切為線狀，再以合適方式酶促修飾。然后純化載體，其等分試樣用于克隆步驟。在克隆步驟中，將酶切后并純化(如果合適的話)的擴(kuò)增產(chǎn)物與用類似方式制備的載體片段使用連接酶克隆在一起。在這種情況下，特定的核酸構(gòu)建體或載體或質(zhì)粒構(gòu)建體可具有一個(gè)或不止一個(gè)密碼基因股基因區(qū)段。這些構(gòu)建體中的密碼基因股基因區(qū)段優(yōu)選與調(diào)節(jié)序列有效連接。具體地講，調(diào)節(jié)序列包括植物序列，例如上述啟動(dòng)子和終止子序列。在選擇性條件下，構(gòu)建體最好能在微生物(尤其是大腸桿菌和根癌土壤桿菌)中穩(wěn)定增殖并將異源DNA轉(zhuǎn)移至植物或微生物中。本發(fā)明的核酸可引入生物(例如微生物或最好是植物)中，最好使用克隆載體，并因而用于轉(zhuǎn)化植物，所述植物例如以下文獻(xiàn)中公開的和引用的那些PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)lorida),第6/7章，第71-119頁(1993);F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;載于TransgenicPlants,第1巻,EngineeringandUtilization,Kung和R_.Wu編著，AcademicPress,1993，15-38;B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編著，AcademicPress(1993)，128-143;Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991),205-225。因此，所述方法所用的核酸、本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體和/或載體可用于各種各樣的生物(最好是植物)的重組修飾，使后者能更好和/或更有效地產(chǎn)生ARA。A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶蛋白質(zhì)的修飾可能存在著一系列機(jī)制，使得這些修飾的蛋白質(zhì)可以直接影響植物(優(yōu)選油料作物或微生物)中ARA的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率?？稍黾拥鞍踪|(zhì)或基因的數(shù)量或活性，從而可以產(chǎn)生更多基因產(chǎn)物，最終產(chǎn)生更多通式I的化合物。在引入相應(yīng)基因之前缺乏所述化合物生物合成活性和能力的生物中，也可以從頭合成。這同樣也用于更多去飽和酶或延伸酶或者更多脂肪酸和脂質(zhì)代謝的酶的組合。在這種情況下，也可方便地使用各種分歧序列(即在DNA序列水平上不同的序列)，或使用啟動(dòng)子用于基因表達(dá)，這使得不同基因按照時(shí)間進(jìn)程(例如隨種子或貯油組織成熟度而進(jìn)行)的表達(dá)成為可能。因?yàn)閷9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶的編碼基因單獨(dú)或與細(xì)胞中的其它基因一起引入生物中，所以不僅能增加朝向終端產(chǎn)物的生物合成通量，而且能增加或從頭產(chǎn)生相應(yīng)的三酰甘油組成。同樣，可以增加參與營養(yǎng)輸入(這些營養(yǎng)是一種或多種脂肪酸、油、極性和/或中性脂質(zhì)的生物合成所必需)的其它基因的數(shù)量或活性，所以增加了這些前體、輔因子或中間體在細(xì)胞或貯存區(qū)室中的濃度，從而進(jìn)一步提高了細(xì)胞產(chǎn)生如下所述的ARA的能力。通過優(yōu)化參與ARA生物合成的A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶的一個(gè)或多個(gè)編碼基因的活性或增加其數(shù)量，或者通過破壞參與ARA降解的一個(gè)或多個(gè)基因的活性，可以提高植物的脂肪酸和脂質(zhì)分子的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率?？梢苑奖愕赜糜诒景l(fā)明方法的核酸來源于細(xì)菌、真菌、硅藻類、動(dòng)物(例如新小桿線蟲(C"e"or/2a6Afe)或大麻p合魚屬("co^y"c/zws))或植物(例如藻類或苔蘚類)，例如希瓦氏菌屬(57^>^"6//力、劍葉蘚屬(尸/^cow/re〃a)、破嚢壺菌屬(77zraw加c/z,/zw)、嫌孑包屬(Fwsa尸/i/m)、疫霉屬(尸一o/滅ora)、角齒蘚屬(Ceratoc/o")、Ma"to"/e〃"、O欲eococcws、等鞭金藻屬(/soc/z，/s)、爿/ew7Ya、A/wsc'c^es、被孑包霉屬(A/oWere〃a)、Borago、褐指藻屬(尸/zaeot/ac^;/ww7)、隱曱藻屬(C，決eco&"/,)，尤其是虹鱒((9"co/V^wc/2ws、非洲爪蟾(Xewopus/aev/力、玻璃海鞘(C7owa/她Wwafc)、假微型海鏈藻(772a/ow/os7,rajoyewcfowowa)、M"wtomW/as《wCa、(9欲eococcwssp.、Qs^eococcw/awn,、纖纟田凈果條gracz7/s)、展葉劍葉薛(尸/z;^co附z7re〃a/ate"s)、致病疫審(尸/^fop/^onazV/^Wa"s)、禾本牙+鐮孑包(Fksan.wwgra/m."aeww)、寇氏隱曱藻(Oy/tococZ/"/wwco/zw//)、角齒蘚(Ceratodo"/wpwre—、綠光等鞭金藻(750。/7，&ga腸"a)、J/ewnYay^Wwasa、石皮嚢壺菌(772ra附toc/2,z,,sp.)、A/kscan'ozV/esWa〃"、高山爭皮孑包霉(A/oW^""/aa///"a)、琉璃苣(5orago。j^c/"afc)、三角褐指藻(尸/zaeoc/ac(y/wmfWcorwi^w附)、秀麗#斤小4干纟戔蟲(Caewor/za6(iWse/ega"s)或者特別有利的是虹鱒(0"cor/^"c/7^wyhh)、纖細(xì)棵藻(五wg/e"agrac/to)、寸『支樣吏型海鏈藻(7Tza/ow/asz'rap"W(io"o"a)或寇氏隱曱藻在一個(gè)替代實(shí)施方案中，載體可以是設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)化生物的表達(dá)載體，其中表達(dá)核酸并將亞油酸轉(zhuǎn)化為ARA。這些有利的載體(優(yōu)選表達(dá)載體)包含A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶的編碼核酸，其在本發(fā)明的第一至第四方面有描述。本文所用的術(shù)語"載體"是指能轉(zhuǎn)運(yùn)它所結(jié)合的另一核酸的核酸分子。一類載體是"質(zhì)粒"，是環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中連接有額外的DNA區(qū)段。另一類載體是病毒載體，它能夠?qū)㈩~外DNA區(qū)段與病毒基因組連接。某些載體能夠在導(dǎo)入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如帶有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其它載體當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，最好整合到宿主細(xì)胞基因組上并與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體可控制與之有效連接的基因的表達(dá)。這些載體在本文稱為"表達(dá)載體"。通常，適用于DNA重組技術(shù)的表達(dá)載體呈質(zhì)粒的形式。在本發(fā)明的描述中，當(dāng)使用術(shù)語"質(zhì)粒"時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，質(zhì)?？梢员荒馨l(fā)揮相似功能的其它類型的表達(dá)載體(例如病毒載體)替代。此外，術(shù)語"載體，，也包括技術(shù)人員熟悉的其它載體，例如噬菌體、病毒(例如SV40、CMV、TMV)、轉(zhuǎn)座子、IS元件、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、線狀或環(huán)狀DNA?？煞奖愕赜糜诒景l(fā)明方法的重組表達(dá)載體包括下述核酸或上述基因構(gòu)建體，其形式適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所用的核酸，也就是說，重組表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，這些序列是根據(jù)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇的，這些調(diào)節(jié)序列與要表達(dá)的核酸有效連接。在重組表達(dá)載體中，"有效連接"是指目標(biāo)核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列的結(jié)合方式，這樣的方式使核苷酸序列的表達(dá)成為可能，并且它們彼此結(jié)合的方式使這兩個(gè)序列都可發(fā)揮序列本身的預(yù)期功能(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，或在宿主細(xì)胞中，如果載體引入宿主細(xì)胞的話)。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。這些調(diào)節(jié)序列在以下文獻(xiàn)中有描述例如Goeddel:GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)，或參見Gruber和Crosby,載于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida,Glick和Thompson編著，第7章，89-108，包括其中引用的參考文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包括在多種宿主細(xì)胞中控制核苷酸序列組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列以及僅在特定宿主細(xì)胞中、在特定條件下控制核苷酸序列直接表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。技術(shù)人員知道，可根據(jù)以下因素設(shè)計(jì)表達(dá)載體例如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)的所需表達(dá)水平等。所用的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶。這是很有利的，因?yàn)闉榱撕啽愕木壒剩d體構(gòu)建的中間步驟經(jīng)常在微生物中進(jìn)行。例如，A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶的基因可以在以下細(xì)胞或生物中表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母和其它真菌纟田胞(參見Romanos，M.A.等(1992)"Foreigngeneexpressioninyeast:areview",Yeast8:423-488;vandenHondel,C.A.M丄J.等(1991)"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfimgi",載于MoreGeneManipulationsinFungi，J.W.Bennet&L丄.Lasure編著，第396-428頁AcademicPress:SanDiego;和vandenHondel，C.A.M丄J.，&Punt,P.J.(1991)"GenetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfUngi,載于AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy，J.F.等編著，第1-28頁,CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻類(Falciatore等，1999,MarineBiotechnology.1,3:239-251)、纖毛蟲類T/o/ofn'c/w'a、緣毛亞綱(尸eW/n'c/w,a)、旋毛亞纟岡(5^/ra^'c/z/a)、吸管亞纟岡(SwctoWa)、四膜蟲屬(7Wra/z;vwe"a)、草履蟲屬CParamecz'iwz)、豆形蟲屬(0///^//^)、瞬目蟲屬(G7awcowa)、匙口蟲屬(/Vayo//2^ya)、尸otomacw、Z)es^wnxsewdoco/zm7em6ws、游仆蟲屬(五w//ofey)、五"ge/wamW/a和棘尾蟲屬(5^/ow^c/h'")，尤其是5^/o"yc/7/a/em"ae,4吏用載體，采用WO98/01572所述的轉(zhuǎn)化方法，優(yōu)選在多細(xì)胞植物的細(xì)胞中(參見Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)"HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedTransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants"PlantCellRep.:583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton,Florida,第6/7章，第71-119頁(1993);F.F.White,B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer載于TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編著，AcademicPress(1993),128-43;Potrykus,Annu.Rev,PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225(和其中引用的參考文獻(xiàn)))。合適的宿主細(xì)月包還可參見Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)。作為替代，可在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體，例如使用T7-啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7-聚合酶。在大多數(shù)情況下，原核生物的蛋白質(zhì)表達(dá)涉及使用載體，所述載體包含控制融合蛋白或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。典型的融合表達(dá)載體尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖-E結(jié)合蛋白和蛋白A分別與重組靶蛋白融合。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例尤其是pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301-315)和pETlid(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(1990)60-89)。pTrc載體的靶基因表達(dá)基于通過宿主RNA聚合酶，自雜合trp-lac融合啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。載體pETlid的靶基因表達(dá)基于T7-gnl0-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，這是由共同表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的。該病毒聚合酶是由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)從駐留的X-原噬菌體提供的，其攜帶處于lacUV5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下的T7gnl基因。適用于原核生物的其它載體是技術(shù)人員已知的，這些載體是例如在大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR系歹'J(例如pBR322)、pUC系歹'J(例如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN畫IIIl13-B1、Xgtll或pBdCI,在鏈霉菌中的pIJ101、pIJ364、p腦2或p腦l，在芽孢桿菌中的pUB110、pC194或pBD214，在棒狀桿菌中的pSA77或pAJ667。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。在釀酒酵母cs.ce"Ww'ae)中表達(dá)的載體實(shí)例包括pYeDesaturasecl(Baldari等(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。適用于其它真菌(例如絲狀真菌)的載體以及構(gòu)建載體的方法詳見文獻(xiàn)vandenHondel，C.A.M.J丄,&Punt,P.J.(1991)"GenetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfUngi，載于AppliedMolecularGeneticsofflingi，J.F.Peberdy等編著，第1-28頁，CambridgeUniversityPress:Cambridge或載于MoreGeneManipulationsinFungi[J.W.Bennet&L丄.Lasure編著，第396-428頁AcademicPress:SanDiego]。更多合適的酵母載體是例如pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23。作為替代，使用桿狀病毒載體，A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜谠谂囵B(yǎng)昆蟲細(xì)胞(例如細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒表達(dá)載體包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.CellBiol..3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。上述載體僅是可能的合適載體中的一小部分的概述。更多質(zhì)粒是技術(shù)人員已知的，可參見例如載于CloningVectors(Pouwels,P.H.等編著，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。對于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中更多的合適表達(dá)系統(tǒng)而言，可參見Sambrook,J.,Fritsch，E,F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第16和17章，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶可在以下細(xì)胞中表達(dá)單細(xì)胞的植物細(xì)胞(例如藻類)(參見Falciatore等，1999,MarineBiotechnology1(3):239畫251及其引用的參考文獻(xiàn))和高等植物(例如種子植物，例如適于耕作的作物)的植物細(xì)胞。植物表達(dá)載體的實(shí)例詳見以下文獻(xiàn)Becker,D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder",PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bev叫M.W.(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation",Nucl.AcidsRes.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants;載于TransgenicePlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編著,AcademicPress,1993,第15-38頁。植物表達(dá)盒優(yōu)選包含調(diào)節(jié)序列，所述序列能控制基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且與之有效連接，使得每個(gè)序列可完成其功能，例如轉(zhuǎn)錄終止，例如聚腺苷酸化信號。優(yōu)選聚腺苷酸化信號是來源于根癌土壤桿菌T-DNA的信號，例如Ti質(zhì)粒pTiACH5基因3(Gielen等，EMBOJ.3(1984)835etseq.)，它稱為章魚堿合酶或其功能等同物，但是在植物中具有功能活性的所有其它終止子序列也是合適的。因?yàn)橹参锘虮磉_(dá)并不經(jīng)常限于轉(zhuǎn)錄水平，所以植物表達(dá)盒優(yōu)選包含有效連接的其它序列，例如翻譯增強(qiáng)子，例如超驅(qū)動(dòng)(overdrive)序列，所述序列增強(qiáng)煙草花葉病毒5，-非翻譯前導(dǎo)序列，這可提高蛋白質(zhì)/RNA比例(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。如上所述，植物基因表達(dá)與合適的啟動(dòng)子有效連接，所述啟動(dòng)子在正確的時(shí)間或以細(xì)胞或組織特異性方式觸發(fā)基因表達(dá)?？捎玫膯?dòng)子是組成型啟動(dòng)子(Benfey等，EMBOJ.8(1989)2195-2202)，例如來源于植物病毒的啟動(dòng)子(例如35SCaMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(另參見US5352605和WO84/02913))或植物啟動(dòng)子(例如Rubisco亞基啟動(dòng)子，參見US4,962,028)。用于有效連接在植物基因表達(dá)盒中的其它優(yōu)選序列是打靶序列，這是引導(dǎo)基因產(chǎn)物進(jìn)入其相應(yīng)細(xì)胞區(qū)室所需的(有關(guān)綜述參見Kermode，CritRev.PlantSci.15,4(1996)285-423及其中引用的參考文獻(xiàn))，所述區(qū)室例如液泡、核、所有類型的質(zhì)體(例如造粉體、葉綠體、有色體)、細(xì)胞外間隙、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、造油體、過氧化物酶體和其它的植物細(xì)月包區(qū)室。如上所述，植物基因表達(dá)也可由化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)(有關(guān)綜述參見Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"48:89-108)。當(dāng)希望以時(shí)間特異性方式進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特別合適。這類啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等(1992)PlantJ.2,397-404)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。響應(yīng)生物性或非生物性脅迫條件的啟動(dòng)子也是合適的，例如病原體誘導(dǎo)的PRPl基因啟動(dòng)子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、熱誘導(dǎo)型番茄hsp80啟動(dòng)子(US5,187,267)、冷誘導(dǎo)型馬鈴薯a-淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(EP-A-O375091)。特別優(yōu)選的是在組織和器官中引起基因表達(dá)的啟動(dòng)子，其中在種子細(xì)胞(例如胚乳細(xì)胞和發(fā)育中的胚細(xì)胞)中進(jìn)行脂肪酸、脂質(zhì)和油的生物合成。合適的啟動(dòng)子是油菜的油菜籽蛋白啟動(dòng)子(US5,608,152)、蠶豆的USP啟動(dòng)子(Baeumlein等，MolGenGenet,1991，225(3):459-67)、擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO98/45461)、菜豆的菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5,504,200)、蕓薹的Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)或豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4;Baeumlein等，1992,PlantJournal,2(2):233-9)和在單子葉植物植物(例如玉米、大麥、小麥、黑麥、水稻等)中引起種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。合適的重要啟動(dòng)子是大麥lpt2或lptl基因啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)或來自以下基因的啟動(dòng)子大麥的大麥醇溶蛋白基因、水稻的谷蛋白基因、水稻的水稻素(oryzin)基因、水稻的谷醇溶蛋白基因、小麥的麥醇溶蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因或黑麥的黑麥醇溶蛋白基因，參見WO99/16890。如上所述，表達(dá)盒中最好包含能夠?qū)RA轉(zhuǎn)化成w3-不飽和脂肪酸(例如EPA或DHA)的酶的編碼核酸。因此，例如表達(dá)盒也可包含A5-延伸酶、co3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶的編碼核酸?？赏ㄟ^同時(shí)轉(zhuǎn)化大量的單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，或者優(yōu)選通過將大量表達(dá)盒組合在一個(gè)構(gòu)建體中，而引入這類表達(dá)盒。另外，在所有情況下，大量載體可以與大量表達(dá)盒一起轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中。同樣特別合適的其它啟動(dòng)子是引起質(zhì)體特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，因?yàn)橘|(zhì)體組成區(qū)室，其中合成前體和一些脂質(zhì)生物合成的終端產(chǎn)物。合適的啟動(dòng)子例如病毒RNA聚合酶啟動(dòng)子可參見WO95/16783和WO97/06250，而來自擬南芥的clpP啟動(dòng)子可參見WO99/46394。通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，可將載體DNA引入到原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)包括現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于將外源核酸(例如DNA)引入宿主細(xì)胞的多種方法，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔或離子轟擊。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主ALaboratoryManual.,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)和其它實(shí)驗(yàn)室教科書，例如MethodsinMolecularBiology,1995,第44巻，Agrobacteriumprotocols,Gartland和Davey編著，HumanaPress,Totowa,NewJersey。在本發(fā)明的另一方面，提供轉(zhuǎn)基因非人類生物，其包含至少一種本發(fā)明前述任一方面的核酸、基因構(gòu)建體或載體。轉(zhuǎn)基因非人類生物可以是微生物、非人類動(dòng)物或植物。原則上適于引入本發(fā)明核酸、本發(fā)明基因產(chǎn)物或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞是所有的原核生物或真核生物。最方便使用的宿主生物是微生物(例如真菌或酵母)或植物細(xì)胞，優(yōu)選植物或其組成部分。真菌、酵母或植物也優(yōu)選使用，特別是植物，例如高脂質(zhì)化合物的油料作物(例如白菜型油菜、月見草、大麻、大薊、花生、甘蘭型油菜(亦稱雙低油菜，canola)、亞麻籽、大豆、紅花、向日葵、琉璃苣)或植物(例如玉米、小麥、黑麥、燕麥、小黑麥、水稻、大麥、棉花、木薯、辣椒、萬壽菊、茄科植物(例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄)、蠶豆、豌豆、苜蓿、灌木才直物(咖啡、可可、茶)、柳樹(Salixspecies)、喬木(油棕、椰子)和多年生牧草和飼料作物。特別優(yōu)選的本發(fā)明植物是油料作物，例如大豆、花生、白菜型油菜、甘蘭型油菜、亞麻籽、大麻、月見草、向日葵、紅花、喬木(油棕、椰子)。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語"核酸(分子)"還包括在編碼基因區(qū)3'端和5'端的非翻譯序列編碼區(qū)5'端上游的至少500、優(yōu)選200、特別優(yōu)選100個(gè)核苷酸的序列以及編碼基因區(qū)3，端下游的至少100、優(yōu)選50、特別優(yōu)選20個(gè)核苦酸的序列。"分離的""分離的"核酸優(yōu)選不含天然側(cè)接其核酸來源生物基因組DNA中的核酸的序列(例如位于核酸5'端和3'端的序列)。在各種實(shí)施方案中，分離的A9-延伸酶、A8-去飽和酶或A5-去飽和酶分子可包含例如少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的天然側(cè)接其核酸來源細(xì)胞基因組DNA中的核酸分子的核苷酸序列。這同樣適用于包含在表達(dá)盒中的其它核酸序列，例如A5-延伸酶、①3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶的編碼序列?？捎梅肿由飳W(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本文提供的序列信息，分離出本發(fā)明的核酸分子(例如具有SEQIDNO:1或其殘基7668-12077或本發(fā)明第二至第四方面所述的部分SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子)。另外，借助于比較算法，可在DNA或氨基酸水平上鑒定出例如同源序列或同源的保守序列區(qū)。它們可用作雜交探針和標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如參見Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，用于分離更多可用于本發(fā)明方法的核酸序列。此外，可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離出來自海生鞭孢蔟蟲并包含SEQIDNO:1完整序列或其部分的核酸分子，其中寡核苷酸引物基于該序列或其部分(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用基于該相同序列而產(chǎn)生寡核苷酸引物，可分離包含完整序列或其部分的核酸分子)。例如，可從細(xì)胞(例如通過硫氰酸胍提取法(Chirgwin等(1979)Biochemistry18:5294-5299))和cDNA(通過逆轉(zhuǎn)錄酶(例如MoloneyMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(可得自Gibco/BRL,Bethesda,MD)或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(可得自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg，F(xiàn)L))分離到mRNA。根據(jù)SEQIDNO:1所示序列之一或借助于SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的氨基酸序列，可產(chǎn)生用于聚合酴漣式反應(yīng)擴(kuò)增的合成寡核香酸引物。具體的合適引物見實(shí)施例中的SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA或者基因組DNA為模板(SEQIDNO9)并使用合適的寡核苷酸引物(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可克隆到合適載體中，并通過DNA序列分析來表征?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)合成方法，例如使用自動(dòng)化DNA合成儀，產(chǎn)生去飽和酶或延伸酶核苷酸序列的相應(yīng)寡核苷酸。上述核酸和具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶活因此，在本發(fā)明的另一方面，提供在生物體內(nèi)將亞油酸或其衍生物轉(zhuǎn)化為花生四烯酸或其衍生物的方法，所述方法包括向含有亞油酸的生物中引入至少一個(gè)包含以下的核酸序列a)SEQIDNO:1(全序列1047306867)、包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077的序列或其中之一的同源物；b)在嚴(yán)格性條件下與SEQIDNO:1的核酸序列或包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077的序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽選自SEQIDNO:2、3和4;d)SEQIDNO:1的核酸序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性；并且表達(dá)所述核酸序列。就本發(fā)明而言，亞麻酸或花生四烯酸的"衍生物"是羧酸部分的OH被W部分置換的化合物，其中Ri為輔酶A(硫酯)、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰肌醇、鞘堿(sphingobase)或下式II的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>其中R2=氬、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰肌醇或飽和或不飽和C2-C24-烷基羰基，R3=氫、飽和或不飽和(:2《24-烷基羰基，或者f和R"皮此獨(dú)立地為下式Ia的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>n=2、3、4、5、6、7或9,m=2、3、4、5或6，p-0或3;并且其中R1基團(tuán)中的氧可以被硫置換，使得R1通過硫酯鍵與該分子的剩余部分連接。本發(fā)明的方法優(yōu)選得到總ARA含量為轉(zhuǎn)基因生物(優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物)的總脂肪酸重量的至少1%，最好至少3%。因?yàn)樵诒景l(fā)明的方法中，自原料化合物亞油酸(18:2"'12)進(jìn)行了大量反應(yīng)步驟，所以沒有得到純品ARA(20:4A5，8，11，14》極少量前體通常存在于終產(chǎn)物中。也可通過上述方法合成化學(xué)純的ARA。為此，按照已知方法(例如通過提取、蒸餾、結(jié)晶、色譜或這些方法的組合)，從生物例如微生物或植物或生物生長的培養(yǎng)基，或從生物和培養(yǎng)基中分離出ARA或其衍生物。這些化學(xué)ARA或ARA衍生物最好用于食品工業(yè)、化妝品工業(yè)，尤其是制藥工業(yè)。本發(fā)明方法可包括將ARA轉(zhuǎn)化為co-3脂肪酸的額外步驟，即通過將co-3去飽和酶和任選A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去飽和酶的編碼核酸《1入生物中。在本發(fā)明的另一方面包括將18:2A9，12(亞油酸)轉(zhuǎn)化為20:2A"'"的方法，所述方法包括向含有亞油酸的生物中引入至少一種編碼具有A9-延伸酶活性的多肽的核酸序列并且所述核酸序列包含a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基7668-9200或SEQIDNO:9的核^列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的^f汙生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40°/。同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性；并且表達(dá)所述核酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供將20:2A"'"轉(zhuǎn)化為20:3AS'"'"的方法，所述方法包括向含有20:2An'"的生物或含有亞油酸和A9延伸酶的生物中引入一種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽并且所述核酸序列選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-l(T724或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基9351-10724的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724的序列的書于生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:3具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A8-去^^包和酶活性；和表達(dá)所述核酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供將20:3A8'1U4轉(zhuǎn)化為20:4A5，8，u'14(ARA)的方法，所述方法包括向含有20:3a8'11'14的生物或含有20:2A1U4和A8-去飽和酶的生物，或含有亞油酸、A9延伸酶和A8-去飽和酶的生物中，引入一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基10842-12077的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A5-去飽和酶活性；并且表達(dá)所述核酸序列。本發(fā)明方法可包括將ARA轉(zhuǎn)化為co-3脂肪酸的額外步驟，即通過向生物中引入co-3去飽和酶和任選A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去飽和酶的編碼核酸。對于上述方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用半乳糖誘導(dǎo)可最有效地進(jìn)行表達(dá)。原則上說，按照本發(fā)明方法進(jìn)行生產(chǎn)的合適生物是任何生物，例如微生物、非人類動(dòng)物或植物。原則上說，合適的植物是能夠合成脂肪酸的所有植物，例如所有雙子葉植物或單子葉植物、藻類或莒蘚類。最好植物選自以下科的植物J(ie/o^zec/aceae、漆樹科(^4mcaW"ceae)、菊科(」他raceae)、傘形一牛(v4//aceae)、樺木科(5efw/aceae)、紫草一牛(iorag/打aceae)、十字花-牛(萬ms57'c"ceae)、鳳梨科(5ra膨/z'ace—、番木瓜科(Carz'c"ceae)、大麻科(Ca"""Z)aceag)、旋花科(Co"vo/vw/ac^3e)、藜科(C77e"o;Waceae)、隱甲藻科(Oyp^ecoWw.flceae)、葫蘆科(C"cwA"aceae)、牛毛蘚一斗(D/r/c/zaceae)、胡頹子科(五/aeagwace—、杜鵑花科(五n'c"ceae)、大戟科(5w//2oWaceae)、豆科(FaZ)"ceae)、維牛兒苗科(Geram'aceae)、禾本^f牛(Gra/m'"eae)、胡杉匕牙牛(Jwg7a"cfaceae)、樟-牛(丄awrace"e)、豆牙牛(丄eg訓(xùn)/wos—、亞麻科(丄/"aceae)、棵藻科(五wg/e"ace—、綠枝藻纟岡CPraw'"op/2少ceae)或蔬菜植物或觀賞植物例如萬壽菊?？商峒暗膶?shí)例是選自以下的植物爿tfe/o&ec/aceae，例如劍葉蘚屬(尸/7少scowzYre〃a),例如展葉劍葉蘚(尸/z^com^e〃a/"fera),漆樹牙牛(^"acan^aceae)，例如黃連木屬(尸/Wacz'a)、芒果屬(Afo"gz/era)、腰果屬04wacan^'ww)，例^口P可月渾子(尸&toc/avera)、芒果(Afa"gi/^r/wZ/ca)或腰果04""cwWw附occ/<ie"fa/e);菊科(^4Weracefle)，例如金盞花屬(C"/e"血/a)、紅花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Ce"towra^)、菊苣屬(C7c/zoW麵)、菜薊屬(Qv"ara)、向日葵屬(//e/z'a"f/z—、萬苣屬(丄a"wca)、丄ocwsto、萬壽菊屬(7bgetes)、絲貞草屬(Ka/en'a"o)，i"列^口金盞花(Ca/e"(iw/"c^c/"a,/j)、紅花(Gar^2附^"'"cton.—、矢車菊(Ce齒weacy朋ws)、菊苣(C/c/zon',—、洋薊(Qy"ara向曰蔡(//6//""^a朋w"、萬苣(丄a"wcas油'va)、缺葉萵苣(丄acfwcacn's/a)、芋(丄ad/ca&scw/ewto)、Z^"wcascan'o/a丄.ssp.sa"va、丄acfwcascaWo/a丄.v"t-./wfegraf"、丄acfwcascan'o/a丄./她gnyb/Za、丄a由cas加'vasubsp.ram朋a、丄ocw加com附wm's、沙拉菜(F"a/m'朋(3/ocusto)、香葉萬壽菊(7bgetes/wc/(ia)、萬壽菊(7bgetesg"ecto)或者非洲或法國萬壽菊(7bgetesfe"wz》/Zfl);傘形牙牛(^(//aceae)，例如胡蘿卜屬(Z)awcw力，例如胡蘿卜(Z)awci^;樺木科(Sdw/aceae)，例^口榛屬(Cb/j/i^)，例^口歐洲榛(Cb/^/w^"ve〃a"")或榛子(Co7j/wsco/w"a);紫草一+(5orag/"aceae)，例如琉璃苣屬(5orago),例如琉璃苣(5oragoo^7c/"afc);十字花一牛CSra^s/caceae),例如蕓墨屬(5raw/ca)、亞麻齊屬(C畫e/f"a)、Me/朋owV7a一、白芥屬(;S7w，》、擬南芥屬04rakwto/wh)，例如甘藍(lán)型油菜(5rasw'cawa/w"、白菜型油菜(6ra咖'cara/assp.)、野歐白芥(57"—sarvem7's)、芥菜型油菜(5mw/ca、芥菜型油菜芥菜變種(萬mw/c"/w"cea)、芥菜型油菜纟皮葉變種(5ras^'ca￡^&/^》/&)、芥菜型油菜大葉變種(份ass/cay""ceavar.yb/z'as")、黑芥(Braxsz'ca"/gra)、Sra咖'caw'"a/z'o^fes、亞麻齊(CamW"asWra)、齊菜(Me/"was7'""一com/ww"Z力、野甘藍(lán)(Brasw'ca0/eracea)或4以南芥(Jra6/(io/w/sf/za//awa);鳳梨一牛(5^^//"(^^)，例如鳳梨屬(Jw"wa)、(菠蘿)，例如鳳梨(y4wawaco附ayws)、^4wa"as或_Srome//acomosa['菠蘿];番木瓜牙牛(Can'caceae)，侈寸^口番木瓜屬(Can'ca)，^f列^口番木瓜(Carz'ca/apaya);大麻-牛(Caw7akceae),例如大麻屬(Caw2aW力，例如大麻(Qmm^^■saWva);》走花牙斗(Cowvo/vw/"ce"e),例^口番薯屬(^!cwefl)、-走花屬(Co"vo/vw/ms)，例^口甘薯(^fomoea6atofus)、^omoea/a"(^wra;to、甘薯(Cowvo/vm/ms6atoto)、Cowo/vw/iwh7/aceus、i^omoeay^st/g/ata、^7Cwoea"7/"ce"、三裂葉箸(^o附oea/n7oZw)或紅著(Cowvo/vw/uy/wwt/wafws;藜牙牛(C/ze"o/ocZ/aceae)，i"列長口甜菜屬(5eto),例》口甜菜(J5eta或5etovw/gwnivan[話甘菜];隱曱藻^牛(CVy/^/zeco(iz'm'aceae)，例如隱曱藻屬(07/^ecoc//m'wm),例如寇氏隱曱藻(CVypfeco&w/wwco/w//);葫,科(Cwcw^"aceae)，例如南瓜屬(Cwcwr6/to)，例如夢瓜(Gwcwr6"a、灰子南瓜(Gwcwr6/fam/x^3)、西萌聲(Cwcw^)zYa/epo)或南瓜(CwcMrZ,A3附osc/ato);橋彎藻牙牛(Cyw6e〃aceae)，i"列i口義又眉藻屬(Jwp/zom)、橋彎藻屬(Qw6e〃a)、(9A:ecfew'a、褐指藻CP/zaeotfoc0^m)、仰葉蘚屬(ie/weWa),例如三角褐指藻(尸/z(3gO(iac^/wm^7'cor"wfw附)、牛毛蘚牙+(D/n'c/2aceae)，例^口牛毛蘚-牛CD"n'c/wceae)的種屬，高地蘚屬(Astomiopsis)、角齒蘚屬(Ceratoob")、C770^oWoste〃a、牛毛蘚屬(D〖Wc/zww)、對葉蘚屬(Z)/W/c/w'wm)、五ccrew/t/z'ww、Z/Op/wW/ow、/72///6eW/e〃a、叢毛蘚屬(^P/ewnW應(yīng))、石縫蘚屬(&e/aw/a)、毛齒蘚屬(7Wc/zocitow)、5feto6erg/a,例如南極角齒蘚(Ceratodo"awtorWcMj)、哥倫比亞角齒蘚(Cera/ocfo"co/,6/ae)、Ceratoctow、Ceratot/ow/wrpMmscew、角齒蘚(Ceratot/ow/wr/wrew)、Ceratocfew/7w7wreMSssp.cowvo/wft^、Ceratot/owpi/r/wre船ssp.Wewocarpi^、角齒蘚圓葉變種(Cerato^fow/wrpwrewsvot-.ra加w^yb//—、Ceratoafo"ratocfow、祝蒴角齒蘚(Ceratot/ow他"ocarpw力、C7z，o6/a他〃ac/n7e,'s、D^/c/mwam6一謂、短齒牛毛蘚(D"n'c/z,^eWsef謂)、皴波牛毛蘚(Z)"n'c/zwwcn^/af&w'wM附)、巻pt牛毛薛(D"n'c/zwm、、牛毛薛(￡>/r/c/mm/zeferoma〃ww7)、D/fr/c/mm//weare、D/frv'c/zww、黃牛毛蘚/7"〃zV/,)、￡>/Wc/zww/柳"w/aftwz、細(xì)葉牛毛蘚(D"n'c/zww/tm7/ww)、纟田葉牛毛蘚扭葉變種sc/w'wpen'、D"〃.c/zzw7toW/e、對葉蘚(D/Wc/n'w附cap〖〃"cewm)、小7于葉薛(Z)^"c/n'i/附Aagew//)、殺牛萌只于pt薛(Z)/M/c/n'w附z>c/z>7a^ww)、w/zzYe/eggez.、丄o//z/c^owsr/d^、尖口十叢毛蘚(/Vewn'(i/ww2(2cww/"o^ww)、尸/ewn,dz'wwa/fe7-"i/b/z'wm、/Vew/^VZ/wmZzo/t/nV/ge/、尸/ewnVZ/wwmex/cowwm、尸/ewnVZ/wmnave"e///、叢毛蘚(尸/ei/nV^wmsw6w/她Aw)、石縫蘚(iS"e/am'ag/awcescms)、Th'c/zocfow60m3fc、毛齒蘚(7Wc/zocfowcy/zWWcw力或7Wc/zc^owcy/zWiT/cwsva八胡頹子科(￡/(3ea^2aceae),例如胡頹子屬(￡/aeag"w"，例如橄才覽(O/ea杜鵑花科(五Wcaceae),例如山月桂屬(ATa/m^)，例如寬葉山月才圭(^a/w/a/a^/b//(3)、狹葉山月桂(Xa/m/aawgusfi/b/^f)、小葉山月才圭(《a/mfaw/cra_p/7_y〃a)、沼'澤山月才圭(Xa/m/a/o/zyb/z'a)、西洋山月才圭(Xa/m/aocc/cfewtafc)、C7s加c/zamaeWzcxiewt/ras或山月桂(Xa/m/a/wc/da);凈果藻科CEwg/e""c^ae),例如嚢月包藻屬(v4scog/e"a)、變月包藻屬(/^tos/a)、柄棵藻屬(Co/acfw附)、長梭藻屬(Cyc/Wop^)、棵藻屬(五wg/e"a)、擬棵藻屬(五wg7e"o/w/s)、T^a/a//zotci^、卡克藻屬(^/wwh'we")、鱗孑L藻屬(丄e;o"力cfc)、扁棵藻屬(尸/zacws)、陀螺藻屬0^romZowowos)、嚢凈果'藻屬(7>ac/2e/omowos)，例^口纖纟田凈果'藻gra"'fo);大戟科(五w//zor6/ace—，例如木薯屬(M"w7zo/)、J^w妙"、麻風(fēng)樹屬(Jia^—a)、荒麻屬(Wc,"ws)，例如木薯(M麵'/zof、Jiaw一a膨m720/、Ja/ro/3/2awawz7zc^、甜木薯(Ma"http://2。/m)//)、Mam7zc^、木著(AfomTzofwam7zof)、MamTzofwe/a"06as7i、木薯(Afaw7zofascw/e她)或荒麻油植物(Wc/wasco附wM"/力；豆牙牛(F"6aceae)，寸列^口3宛豆屬(尸/swm)、合5!欠屬(y4/6/z/a)、Ca^2omw,o"、Fewz7/ea、音力口屬(/"gw)、圍涎初于屬(尸///2^0/06/"附)、阿拉伯膠屬(jc"c/a)、含羞草屬(M/mosa)、苜蓿屬(Me&cq/0)、大豆屬(G(y"力e)、鐮扁豆屬(Do/!'c/zcw)、菜豆屬CF7iaseo/ws)、大豆，例如豌豆(jP&w附j(luò)af/vw附)、々司津牛i宛豆(P&w附(3rvewse)、至宛豆(/Vsw附//wwz'/e)、爿/始/<36eWm'朋a、合歡(^4/始/aj'w說〃'肌'w)、山合歡(J/6/z/a/eZ)6ec&)、」c'a6e他n.a"a、Jca"'a//加rafc、爿/6iz/a6e他n'a"a、爿/6/zz/a6e/Yer/a"a、G^/zorw/o"ZeWer/"""、尸ew/〃e"Z>eWe〃'""<3、/"g"y^agraw51、尸"/2ece〃o6/ww76eWen'awww、尸"/zece〃o6/wmyhagra/w、7,"http://6〃'肌'"、Jc"c/"weww、J/Z)/^,aweww、Fewz'〃ee"yW/Zn,肌'"、M/way"yw/z'Z〃.肌."、Miiwosas/ec/cwa、(Sm'cawrafaJw/z'6W肌'"、闊莢金合歡(jcac/a/e6Z>ec&)、大葉相思初于(^4c"c/a附acro/7/2;;〃a)、大葉合歡(J/Z)/z/a/e66ecA)、FeMz7/eea/e66ecA:、大葉含羞草(M/附oya/eZZecA:)、Mifmas"s/g"'osG、紫苜蓿(MWcagos加Va)、野苜蓿(MWcago々/cato)、雜交苜蓿(Afei/c"gov"Wflf)、大豆(G7ycz'"ewax)、鐮扁豆(Z)o/z.c/zos寬葉蔓豆(G7yc/wegracz'fc)、G7戸'"e/H'—cb、大菜豆(P/7oseo/附mox)、5"q/"/n'5p/(i"或大豆(5byamax);葫蘆蘚一牛(FMwaWaceae),例^口^/z朋o;r/zegma、五"to威octo"、葫蘆蘚屬CFw""W")、劍葉蘚屬(尸/^scom"re〃a)、立石宛蘚屬(/V7>\ycom/n'wm)，例J(口/^/rawo^r/zegwzaserrafwm、EWtosf/20(io打、五ntosf/iocfow6oZanofen.、c^wmcw必、五"加f/20ctow/am&yom'z'、五"tos^20cfow/e/6erg77、■spa^w/i/^/^、5"tost/zocfowfwcsow'、美國葫"蘚(Fwwan,atamen'ca"a)、Fw"aWa6o/awcfen-、齒葉萌,薛(Fwwan'aca/cwea)、力口州葫,蘚(Fw"an.(3ca/zybr"/cfl)、Fwwar/aca/v&scera、合生葫蘆蘚(Fw"w'aco"vo/wto)、Fw"a"'ay"v/cara、Fwwa〃,a、葫，蘚(Fw"an'"/^gromefn'cfl)、葫,蘚；)匕才及變種(Fw"ar/a/z_ygrc>we^-/cavar.orWca)、葫,蘚暖地變種(Fw"an'a/2_ygroweWc<3var.ca/v&scms)、mwrafc、/^grom欲/cavar.wto/ze,S、小口葫蘆蘚(Fw加n'aw/cToWowa)、Fwwan'aw/crcMtowavar.o6fti/b//G、刺邊葫,蘚(尸M"ar/a鵬綠"6eirg//)、orcw船、p/awo-cowvexa、Fw"ar/apo/a/^s、Fw""Waravewe///、Fwwan'ara6nieto、Fw"ar/aserrato、wworae、Fwwan'aswMm6adFwrarz'a加csom'、力口州劍葉蘚(尸/2"coAm'&e〃aca/i/^"/ca)、展葉劍葉蘚(//^■scow/^W/a、尸/7>^(70附/&6//<3！reac/en'、南方立碗薛(尸/^scom/^7'wmawWra/e)、立石宛蘚(尸/yAscom/^7',ca/^/bw/cwm)、P/7>wcow/Wwmcw/w/zy^rww、/Vzj^com"n'wwt/nw7mowt/z7、纟工蒴立碗蘚(P/^scoAw/r/wmew/7sf0wwm)、戶/2j^cowzYn'w/wy/ex7》/z'wm、尸/^scow"n'ww/200A;en'、P/z>wcom"n'wm/zoo&erz'var.serrafwm、R急、萌立石宛薛(P/zj^co附zYn'ww附ega/oca;77M附、梨萌立石宛薛(尸/2j^co附/Zr/w附^yn》rwe)、尸/zyscom/^7'wwS(3waf6e;-g"、尸/2jKscom"n'wm5:wZw/7/7aen'cwm、華盛牽頁立石宛蘚(P/2_>^ccAwYn,w/wwoy/n'"gtow/era^);雜牛JL苗牙牛(Gera77/ace"e),例^口天蘭葵屬(Pe/argom'訓(xùn))、椰子屬(Cocos)、OZe,，例如椰子(Cocas"wci/^ra)、茶薦子天竺蔡CPg/argo",w附gras^w/an.o/cfes)或斗耶子(0/ewwcoco/力；禾本牙牛(GVv^w'"eae)，侈'J長口甘蔗屬(Sacc/Mm/w)，侈寸i口甘濕(5^cc/araw(^c/wwwm);胡杉匕^牛(J^g/a"t/aceae),例如核才兆屬(Jwg7a/w)、胡才兆屬(『a〃/a)，例如核沖兆(Jwg7ara、Jwg7araa//aw//w》//<2、山核沖兆(Jwg7am1s/e6o/6feit"a)、灰核杉&(c/wg/am1c/werea)、灰胡$匕(『a〃/a、Jwg7ara6/xZ^'、力口州黑核杉匕(/wg/araca/i/brm'ca)、印度黑核沖兆(Jwg/am1Zn'"(is/0、中型核桃(Jiwg/aram/cracor/a、黑核杉匕(/wg/ara或黑胡杉匕(『a〃/am'gra);掉:f牛，例如聘梨屬(尸ensea)、月桂屬，例如月桂(丄awn^wo&fc)、聘梨(尸eraeaamen'ccma)、gra^s^ma或油聘梨(尸eraea/ersea);豆考牛(丄egiW2/"cw"e)，i"列^口花生屬(^4ra;c/n'iS)，侈J^口花生(v4rafc/n's/^/ogaea);亞麻;f牛(Ziw"c^e)，i"列^口_<4(^"0//""附，i"列i口亞麻(Zi"wmus"a^s^/附wm)、Zi"ww、奧i也矛j亞麻(￡/"wwawWn'acwm)、丄/"ww6/ewwe、窄p十亞麻(丄/wwma"gws^/b/Zww)、5寫亞麻(Zi"訓(xùn)caf/zaWc)、金黃亞麻(丄/"wmyZaw附)、大花亞麻(丄/"wmgra"^yor腦)、gra"^/7orwm、劉易斯亞麻(丄/",/e>Ww'z')、那旁亞麻(Zi"wmwarZowe"se)、宿才艮亞麻(Zi"wm/e/-ewe)、宿才艮亞麻劉易斯變種(Zi"wwvw./eM^//)、Zi"wwprafe"se或亞麻子(Ii"ww^7'gy"ww);千屈菜-牛(Z^/zra〃,eae)，例如石榴屬(尸ww'ca)，例Jt口石^留(尸wm'C(2graw"mw);4帛葵牙牛(TWla/vaceae)，例i口才帛屬(Gossypium),例j(口陸i也才帛(Gos^少//i/m/h>si^waw)、木本才帛(Go^y//wmarZorewm)、海島沖帛(Go^j^z'wm6ar6acferae)、草本才帛(Gos^y/j/wm/2er6acewm)或才帛花(Gas57//wm^wr6en');;也^i考牛CMaAr/zaw"aceae)，例^口i也4艮屬(Aforc/fl"f，例i口Aforc/7"w^76e/-te/x>a"a、Aforc/zawW<3_/b/z'acea、大孑包i也^i(Aforc/za"^j！wacra/oraf);芭蕉詳牛(A/ksaceae)，仿H口芭蕉屬(A/ws")，例^口香蕉CMws""""a)、小果野蕉CMws""cwm/""to)、大;^(7W"w>ya/rarac//1s/aca)、香蕉(A/wsaspp.);杉卩p十菜-牛((9wagr"ceae),Y列^口Cam/^om'a、月見草屬(C^wc^/zera)，例^(口月見草(Oe"o/Zzera6/em7/s)或夜來香(Own'^om.a6rev^&y)[月見草];棕沖閭牙牛(尸a/mae)，例力口油棕屬(五/ae/s)，例如油才宗(五/aezigw/"eera&);嬰粟牙牛(尸qpaveraceae),例如嬰栗屬(尸a/aver)，例如東方罌粟CPopavwon'ewto/e)、虞美人(尸apmwr/zoeos)、長莢翼粟(尸apaverc/w6/wm)[嬰粟];胡麻-牛(尸￡^/"http://"<^0^)，例^口芝麻屬(5fesamwm)，i"列J(口芝麻(5kso附wm/"<i/cwm);胡祐又一牛(尸—raceae)，例如胡椒屬(尸—r)、草胡椒屬(尸e/ero柳'a)、Sf^bw/a，〈列^口杉于胡才杈(尸^eradw"cwm)、awa/(3go、狹p十胡裙又(尸—rG"gm咖//,)、大胡椒(P—r、萎葉胡椒(尸zj^r6ete/)、畢澄癡(P!》erci(6e6a)、Pz》er/owgwm、i^perm'gnwz、Pz)ere/o"gata、長胡椒(尸—re/o"g(^ww)、辣椒(;S^fe,'fife/o"gato);禾木科,例如大麥屬(//on^wm)、黑麥屬(5feca/e)、燕麥屬(Jve—、高粱屬(5brg/z,)、須芒草屬04"t/ra/7ogo")、絨毛草屬(//o/c—、稷屬(尸薩'c)、稻屬、玉蜀黍?qū)?Zea)、小麥屬(Th."cww)，i"列^口大麥(//orafew附vw/g"re)、芒l貞大麥草(T/oniew附、鼠大麥(//or(iew附/wwn'www)、4豆芒大麥草(7/orcfew附seca/z,wzw2)、栽培二梭大麥(Z/orc/ewm(i/Wc/zo")、//orafewmaeg/ceraw、//orafeww/zexos/ic/zo"、六歹1大麥(Z/orafeww/zexos^'c/zw附)、六才麥大麥不夫見貝'j大麥(Z/on/ew附z>regw/are)、大麥(Z/oniew附sgAVw附)、4豆芒大麥草(//orcfewmseca/z'wwm)[大麥]、，繁、麥(Seca/ecerea&)、麥(^4vewas加Va)、野燕麥(jvewa力她)、比贊燕麥(」ve加—"油>2<3)、jveway^wavw.s加'va、雜交燕麥(^ve"a/zj6Wt/a)、兩色高粱(5brg/2訓(xùn)6/co/or)、石茅高粱(5brg/z簡/za/e/erae)、甜高粱(5brg/zww■sacc/zaraf謹(jǐn))、高粱(5brg/z,vw/gare)、Jwt/ra/wgow<irwmmoWz'、兩色纟戎毛草(//0/(71Z/co/or)、i/o/cwssorg/2wm、5brg/zw附ae^2/op/cw附、5brg/zw附arwwc//wac6i/m、5brg/zwwcq^orwm、垂;^t'高梁草(^Sbrg/zw附c^7wwm)、工藝高粱(5brg/zwmcfoc/wza)、5brg/z訓(xùn)cfr訓(xùn)mo"必、硬高脈高粱草(5brg/zwm"ervosww7)、甜高粱(5"org7zwwracc/zara^/m)、蘇丹草(5brg/zwm■swZg/aZ>/-&sce/)、垂卩十高梁草(5brg/zwwveW/c/〃i/7orww)、高粱(5brg/z,vw/gare)、石茅高粱(i/o/cws/za/e/em7\s)、Sorg/2訓(xùn)w//z'ace,、粟(尸aw/cwz7/tocewm)、水稻(O，as加,va)、水稻(Oyza/a爭/Za)、玉米(Zeawa^y力、普通小麥(7hY/cwwaeW/v,)、硬粒小麥(7Wricwmdwnwz)、圓斗主小麥(7Wn.cwmfwrg^ww)、Th'ricww/z少6e;-"wm、馬卡'!、麥(7hY/cwmwac/za)、普通'■!、麥(JhY/cwms"Wvww)或d、麥(7>/"cvw/gare);紫球藻科(Porphyridiaceae)，例如C7wxx^/zece、、尸e&ovawe〃a、J求藻屬(尸o/7/^nVZ/ww)、纟工藻屬(i/zotfe〃a)、i/zo6tosorws、Fiaw/zoe,m'a，例如紫球藻(尸or//z,Wwwcn/e"fwm);山龍目艮一牛(iVoto3ceae),例長口澳洲堅(jiān)果屬(JWacacfa;w'a),例如澳洲堅(jiān)果(M2C(3c/a附/az'"te^7》,/a);綠枝藻綱CPms/"qp/^ceae)，例^口腎》菓屬(7Ve//^o化/附/力、/Vos7'"ococcus、ScAe^fe/z'"、四專便'藻屬(7"e/rawe/m/力、Afowtow'e〃a、OWreococcws，<列長口纟錄腎藻(7Ve//zrose/w/51。//vacea)、尸ms/"ococc^ca戸w/a加、iSb/2e;^fe//a^Z)/a、周氏四鞭藻(re^-ose/mkc/z"0、四孝便'簾(refrase/m/sswec/ca)、A/awfowz'e〃as《wawato、(9s^reococcMstown';萏草牙牛(T^6/aceae),例^口咖叫卜屬(Co#ea)，例如咖啡(Co^^a^p.)、阿拉伯咖啡(G^eaflra6/co)、中果咖p非(Co,ac"we//zora;)或大果咖叫—(Cb,a/f6er/ca);玄參-牛OScro//zw/"Waceae)，例如毛蔬花屬(F"er6ascwm),例如毛瓣毛蔬花(Ke^ascwwZ/a"an,")、東、方毛JI花(「(2WascMmc/za/jc/z')、密p十毛,M:花(F"er6osc謹(jǐn)(imsi/7or謂)、F"er6osc/agwms、長葉毛蔬花(Fer6oscww/owgi/b//wm)、F"e/^oscwm(vc/7w/^s、f^r6oscwmw/gn/m、奧4木匹克毛'H花(Ker6oscwmo/_ymp/cwm)、F"er6asc廳//z/owo/t/es、紫毛蔬花(P^r6aycww//oewz,cww)、rer6aycw/wpw/venz/ewft/m或毛，露花(F^Wasciw2//za/ww力；癡牙牛(5b/"w"ceae)，例^口夢束祐又屬(C"/w'cwm)、煙草屬(jV/co"Vma)、癡屬(5b/a"wm)、番癡屬(Z^copera/co")，<列J(口l束才杈(Ca/w/ca""www)、Ca戸/cg/a6z-^cw/w/77、小米椒(Ca/w/cwmyh^esce/w)、#束對權(quán)(C"opw'cwm、煙草(/V/co"awa勵(lì)"cww)、花煙草(Wc加.a"aa/ato)、長頭煙草(Mcori朋a加e做ato)、光煙草(Mco/""ag/awc")、iV/co^3"a/a"g^o^z'、Mcof/a""o^i^i/b/Za、《W(2t/n'va/v/s、A7cof/a"are/a"t/a、黃花^因草(Mcorifl"ar組/cfl)、煙草(Mcof/""a^/vesrz》、馬鈴薯(5b/a"w附fw6eras畫)、癡子(5b/aw,me/owgewa)、番癡(Z^coperafco"escw/e齒w)、Z^cc;/em'cci"/少co/em'c、梨形番恭(Z^co/erw.ccw/"ybr膨)、紅癡(5b/a",或番癡(5"o/a"w附/少co/en7,cww);>^#);f+OS/e/rw//aceae),例^口可可屬(772eoZ^owo),例:i口可可(T7zeo6romacacao);或山茶-牛(77e"ceae)，Y列^口山茶屬(C"we〃/a)，i"列^口茶(Came〃/a。最好微生物是例如選自以下科的真菌毛殼科(Ozaetow/aceae)、笄霉科(C/zoawe//zoraceae)、隋J求酵母一牛(Oy/^ococcaceae)、小克4艮漢霉(Cw"w'7g/2a附e〃acgae)、暗梗孑包牙+(Z)emeriaceae)、叢梗孑包-牛(Mo"/Z/"ceae)、被孑包霉科(MoWere〃aceae)、毛霉科(Mwcoraceae)、腐霉科(i^/z/aceae)、酵母科(&c/(3rowjFc加ceae)、水霉科(Sa/ro/eg"/ace—、裂殖酵母科(5"c/zizasac/zarowjv"cetoce"e)、5bcbn'aceae或瘤座孢科(亦稱結(jié)節(jié)菌科，rwZe/rw/aWacefle)。可提及的微生物的實(shí)例如下笄霉科(Ctoan印/zoraceae)，例如布拉霉屬(說d^s/ea)、笄霉屬(C/2oa"ep/zora),例如三孢布拉霉(j5/"^s/eaWs/ora)、瓜笄霉(C/20a"e//20racwcwr6/torw附)、漏斗并霉瓜變種(C7zo朋e/7/zoraf"/ww<i/Wi/^ravar.cwcw/^tor謂)；被孑包霉科(AfoW/ere〃aceae)，例如浮皮孑包霉屬(AfoWere〃a)，例如深黃#皮孑包霉(Mort7,e/"e〃a/sa6e〃/—、多頭被孑包霉(M0Were〃ap0/yce;7/7a/a)、拉曼被孑包霉(AfoWere〃arama""/""")、葡酒色浮皮孑包霉(AfoWere〃aW""ce")、環(huán)帶被孢霉(肘^"6"http://<3腐霉科CP"/2/aceae)，例如腐霉屬(尸;^/ww)、疫霉屬CP/2_ytop/^ora)，例如德巴利腐霉(/y/z/wwdeZ)(3，w,)、間型腐霉(尸yf/n',/"ter附W,)、畸雄腐霉(i^/n'i/mparoec"W(irw附)、戶;^/n'w/wsy/varicw附、終才及腐審(/y^H'www/W附w附)、,惡、橘生疫霉(尸/^op/^orac"Wco/a)、柑橘褐腐疫霉CP/z7top/2^0rac/的p涵謹(jǐn))、隱地疫霉CP一o盧/zorac，to爐)、德雷疫霉(尸/2少to;/^/zora公ecfo/en')、紅腐疫霉(尸/^to;/^/orae^y決rase;^/C(3)、側(cè)生疫霉(i%fop/zf/zora/aferafc)、大雄疫霉CP/7,盧/20ramegaspenwa)、》因草疫霉(尸/i;vto//zf/zoraw'cof/awae)、煙草疫霉寄生變種(尸/,/滅oram'c加'a""ev"r./arawY/c")、棕櫚疫霉(尸一o/楊ora/(3/脂Vora)、寄生疫霉(尸一o/她orapamszY/cfl)、丁香疫霉(_P/i!_ytop/^/oras少n'"gae);酵母牙牛(S"cc/7atromycetoceae),侈'^口、)又遜酵母屬(/7a"se"w/a)、畢赤酵母屬Wc/z/a)、酵母屬(5""cc/z"rawyces)、類酵母屬(&cc/^w^co&力、西洋蓍霉屬(7aATovWa)，例如異常漢遜酵母(//a"化"w/aawom"/a)、力口州漢遜酵母(/f"raeww/aca/zybm/ca)、力口拿大漢遜酵母(//ara^2w/aca"油"—、碎嚢漢遜酵母(//ara^"w/aca;ra/"to)、西弗漢遜酵母(//aw""w/a"y^r/0、葡糖酶漢遜酵母(//(mse"w/<2g/wcc^wa)、亨利漢遜酵母(Z/imsg""/"/ze"W"7)、//arae"w/a/zo/W"小漢遜酵母(7/a"""w/aAm>wfa)、不發(fā)酵漢遜酵母(//om^"w/a"o"y^7we"to"力、//arae"w/a、多形漢遜酵母(//"""■se""/"po/，o^/za)、土星漢遜酵母(^mse"w/as齒;-"附)、亞膜漢遜酵母(i/"wse"w/asw^pe/Z/c"/osa)、威克漢遜酵母(ifa"se"w/aw/cA:er/za柳7)、溫奇漢遜酵母(//a聰"w/awz'"gez')、嗜酒畢赤酵母(尸/c/w.aa/co/zo/qp/n'/a)、尸/c/z/aa"gw加、異常畢赤酵母朋owa/a)、雙孢畢赤酵母(尸/c/2z'aZ^/ora)、伯頓畢赤酵母CPz'cWa6wWom7)、力口拿大畢赤酵母(尸/c/w'aca"a^"w》、碎嚢畢赤酵母(尸/c/z/aca戸w/"to)、卡氏畢赤酵母(P/c/w'acamm7)、聚纖維二糖畢赤酵母(尸/c/n'"ce〃oZnVw(3)、西弗畢赤酵母(尸/c/^ci/br//)、粉狀畢赤酵母(尸/c/^/an'"OM)、發(fā)酵性畢赤酵母(尸k/n'a/erme"tora)、芬蘭畢赤酵母(尸/c/z/ayw/朋d/ca)、葡糖酶畢赤酵母(戶/c/^g/wcc^yma)、季也蒙畢赤酵母(尸/c/h'"、曱蟲畢赤酵母(尸/c/wV3/2"http://o//n7a)、亨利畢赤酵母(P/c/n'aAe肌'"'0、■fVc/n'a/zo/st"、/^c/H.ay"ci/m7、尸z'c/n'a//"t/"en7、膜醭畢赤酵母(戶/c/w."附eAw6rG"fl咖c/e"s)、曱酉孚畢赤酵母(/Vc/z/amef/2<a"o//cfl)、小畢赤酵母小變種(P/c/zz'am/"wfav"r.脂'"齒)、小畢赤酵母不發(fā)酵變種(i^'c/n'ami'"wtovar.now/enwewfara)、扭P威畢赤酵母(尸/c/z/a"orvege"w》、奧默畢赤酵母CPz'c/z/ao/zww/)、巴斯德畢赤酵母(尸z'c/n'apostor&)、i^c/H'a;/n',o<^e"c/n'、松畢赤酵母(尸z'c/n'ap一、多形畢赤酵母(尸z'c/H'apo(ymo77/2a)、櫟畢赤酵母(P/c/7/agwerc柳m)、羅丹畢赤酵母(尸/c/w'ar/zo^3"ms7'力、i^'c/n'asorge"fe"^、樹干畢赤酵母(尸z'c/^W—to)、斯地畢赤酵母(尸/c/^Wra^wge"w》、亞膜畢赤酵母s咖e〃/cw/麵)、帽孢畢赤酵母(尸油'ato/eto"a)、喜海藻糖畢赤酵母(尸/c/2/fit^/za/o//w7")、尸/c/h'"vz'"/、木糖畢赤酵母CP/c/z/a"/osa)、酸酒酵母(iSacc/zor麵;Kc&sac幼〕、拜耳酵母(&cc/z"ra附y(tǒng)c^s6az7")、貝酵母(Sacc/zaramycesfeaycwMs)、雙孑包酵母(Sacc/zaramyces6/5pora力、好望角酵母OSacc/zaroT^ycascape"w'5)、卡斯伯酵母(5Wcc/z"ra/wycascm7s6e;^era&)、酉良酒酵母(iSacc/zaromyc^scerevz'w'"e)、酉良酒酵母摘圓變種(iSacc/zorom_yc&scerev/sz'aee〃扭o/c/ew力、薛瓦酵母(5"acc/z"ra，cesc/ev"http://m.)、德爾布酵母(iSacc/zflro，cas必6n^c嗣、糖化酵母(&cc/zarawjKcesc/z.os她'c—、/Sacc/narowycesc/mso/Man/m、雅致酵母(&cc/z"ra附y(tǒng)c^se/egara)、橢圓酵母(5"acc/zaramycese/一oz'c/ews)、發(fā)酵性酵母(iS"(3cc/2aramyc&s^rmewta")、弗羅棱酵母(<Sacc/iarow_ycesy/orew""ws)、脆壁酵母(Sacc/7"ro附y(tǒng)cwyhargifo)、異質(zhì)酵母0S"cc/2"ra附y(tǒng)cas/7e敏oge"/c—、椒攬油酵母(;S"cc/zoramycesZ^"z)/ms7》、荷蘭酵母(&cc/zara，c^/",'to加)、意大利酵母(iSflcc/zarow;/ces/to/z'cw力、克魯弗酵母(Sacc/7flra考c^sA:/w;/ver,)、克魯斯酵母(iSacc/7"ramjcasAtt^0、乳酸酵母(5^cc/2"ramycey/ac嗣、馬克斯酵母(&ccAaro"casmaoiaww力、小橢圓酵母(5^cc/^ramyc^y附/crae仏)wozVfes)、摩拿酵母(5^cc/zara附y(tǒng)cesmo打to"—、諾地酵母(Sacc/zaramyces"or6ms&)、椒欖酵母(Sacc/zflramyces。/eacews)、奇異酵母(iSacc/zaram少ces、巴斯德酵母OSflcc/zaramyc&y/oston'fl"—、普地酵母(Sacc/zarawyc^s/reton-ms/力、羅斯酵母(&cc/wra附少cesmsez〕、魯酵母(&cc/wra考casro腿7)、葡萄汁酵母(5"acc/z"romjKceswvar簡)、路德類酵母(iSacc/"nw7ycoafey/w血妙)、解月旨西洋蓍霉(Tamw/a/—/,'c");裂殖酵母科(5b/^os"c/zaromyc"aceae)，例如裂殖酵母屬CSc/z/zosacc/zarcwjc&y)，例^口日本裂歹直酵母日本變種(Sc/zizcwocc/z"raw少cas7'"/0Wcwsvar.y,a/ow,cas)、曰本裂殖酵母易變變種(5b/H,zo犯cc/zaramj;cesy'a/o"/cusvera加'fc)、解蘋果酸裂殖酵母(5"c/z/zc^cc/2ara附;;casma/^vorara)、八孑包裂殖酵母(5"c/z/zc^"cc/7(^omycayo"osporw力、粟酒裂歹直酵母解蘋果酸變種(iSc/zizas"cc/2aromycas/ow6evor.ma/zV/evoraw力、粟酒裂歹直酵母粟酒變種(iSc/2/zosacc/^ra附少c&s/om6evar./om6e);破嚢壺菌科(7T7ra;w5toc/^n'aceae)，<列長口v4/^zo/-"/<3、jp/awoc/z^^n'ww、0/i3/o"oc/2,/畫、裂殖壺菌屬(5b/^oc一n'w附)、破嚢壺菌屬(7Tzra^stoc/^r/ww)，侈J長口聚集裂歹直壺菌(5"c/z/zoc/2少fn'wmaggreg^ww)、5"c/zizoc/z;Kfr7'w附/zVwac/ww附、纟工樹沖木裂歹直壺菌(Sc/z/zoc/z;^〃'w附附awgrove/)、、裂歹直壺菌(《Sc/2/zoc/z_yfr7'MWm/"wfwm)、/\孑包裂歹直壺菌(5b/^oc/,/訓(xùn)octos/or謂)、聚集破嚢壺菌(77zraw加c—n'訓(xùn)aggregart/w)、7T2raw"oc/2j^n'M附amoeZo/cfewm、南才及石皮囊壺菌色石皮囊壺菌(72raustoc/2j^n.w柳awrew附)、7TwawWoc/y^WwwZe"^n'co/a、J求形破囊壺菌(77zrai^oc/z_yr/M2g/060sw附)、7Tzn3wsfoc/y^n'Mm動(dòng)破嚢壺菌(7T7rawWoc/^〃'w附/wo"vww)、多初級石皮嚢壺菌(7TzraM5toc/^fn'wmmw/^'n/c^wewfa/e)、厚皮石皮囊壺菌(7TzrowWoc/zj^Wwm/ac/7_y<ierwww)、i曾歹直石皮囊壺菌(77z廠awWoc/z;^rzYw2/ro/zy^rwm)、粉鄉(xiāng)工破囊壺菌(772n3"Woc/z;^n.Mmroseww)、羅氏石皮囊壺菌(TTznafwWoc/^fn'ww更多有利的微生物是例如選自以下科的細(xì)菌芽孢桿菌科(5a"7/aceae)、腸4干菌科(五"&ra6ac^7'acae)或才艮瘤菌科(//zizo6/ace"e)?？商峒暗膶?shí)例是選自以下的孩史生物芽孢桿菌科(5""7/aceae)，例如芽孢桿菌屬(萬"cz'〃w)，例如酸熱芽孢桿菌(Sac/〃wsac〖cfoo7/c/an'w力、酸土芽孑包桿菌(5flcz7/wsflc/cfo^resWs)、嗜堿芽孑包桿菌(6ac/〃ws"/ca/o//7z7w力、解淀4分芽孑包#干菌C6ac/〃wsamy/o/Z^wey^c/ewshf定4分芽孑包4干菌(5ac/〃i^amy/o/^^cw力、4豆芽孑包4干菌(5acz7/ws6reW力、蠟樣芽孑包桿菌(5acz'〃wscerew力、環(huán)狀芽孑包桿菌(B"",〃ws">cw/(ms)、凝結(jié)芽孑包桿菌(Sa"7/wscoagw/mw)、球形芽孑包軒菌梭形亞種CSa"7/ws—am'固subsp.yki/bnmX)、嗜乳糖芽孑包桿菌(Bac/〃usga/a"o//w7ws)、圓孑包芽孑包牙干菌(S"cz'〃usg/o6/spon^)、圓孑包芽孑包桿菌海生亞種(5a"'腸g/oZ^pomssubsp.,W"—、嗜鹽堿芽孑包桿菌(5ac/〃us/7a/op/w7us)、纟爰病芽孑包桿菌(Ba"7/iAs/e"^mo^ws)、遲緩芽孑包桿菌C8fl"7/附/e"加)、地衣芽孑包軒菌C8flc/〃ws//c/zew》m/s)、巨大芽孑包桿菌(5"c/〃wsmegafeWwAw)、多粘芽孑包桿菌(5ac/〃ws、冷解糖芽孑包桿菌(5ac/〃w戸;;c/zrasacc/zara/;;"cw力、短小芽孑包桿菌(Sac/〃tw;wm7w"、3求形芽孑包4干菌(8ac/〃z^s//z(3en'cws)、斗古草芽孑包才干菌斯氏亞種(5acz'〃wswto'fcsubsp.>5;&&6"http://)、枯草芽孢桿菌枯草亞種(5a"'〃wss由/fcsubsp.Sw6"fc)或蘇云金芽孑包桿菌(5acz.〃ws^2wn'"g/em/s);腸桿菌科(五"fera^"er/ac"e),例如4寧才蒙酸牙干菌屬(C/化o6acfer)、愛德華氏菌屬CEdwanis/e〃a)、腸桿菌屬(五"ferate敏)、歐文氏菌屬(五削'"/a)、埃希氏菌屬(Esc/2m'c/n'a)、克雷伯氏菌屬(尺/eZwW/a)、沙門氏菌屬(Sa/wcwe〃")或沙雷氏菌屬(5W"ra"a),例如無丙二酸檸檬酸桿菌(CzYraZja"erama/owa"cw力、差異檸檬酸桿菌(Cz>o6a"erWveraw)、弗氏檸檬酸桿菌(C7fro6acfer戶ewm///)、C7&o6acfergewcwospec/es、C7fra6a"erg7'〃em7、中間4寧才蒙酸桿菌(C^o6a"er、合適檸檬酸桿菌(C"ra6acferA:osen')、C7fraZac^mz^7/"fae、梓樣酸軒菌(C7fra6acfersp.)、?？剖蠍鄣氯A氏菌(￡^vraniszW/a/os/z/"ae)、給魚愛德華氏菌(五cwanis/e〃(3/cto/wn')、遲鈍愛德華氏菌CE<iwflniszW/a、赤揚(yáng)歐文氏菌(五rvv/"/(3a/"/)、解淀4分歐文氏菌(5Wv/"/aa^y/ovora)、菠蘿歐文氏菌(EWv/m.aa"朋加's)、五rvW"/aqp/z/血o/a、五rw/w'a6/〃/"g/"e、滅仙人掌歐文氏菌(五rvW"/"cac"'c/(ia)、生癌歐文氏菌(五rvWm'acfl"cerage"")、大仙人掌歐文氏菌(五rw/"/acameg/eaw")、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑腐亞種(五rw/m'acarofovorasubsp.afro"/"ca)、胡蘿卜壽欠腐歐文氏菌維管束亞種(五rw/m'acorotovorasubsp.6etovoscw/or謂)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌臭味亞種(5nv/w'(3caratovorasubsp.oc/on;/^ra)、胡蘿卜4欠腐歐文氏菌山葵亞種(五nW"/"caratovorasubsp.麗涵〖ae)、菊歐文氏菌(jBrvWm'ac/wysa"欲e附/)、毛芍蘭才艮歐文氏菌(五rvv/"/ac^/n^7gd//)、溶解歐文氏菌(五rvW"/a(ii^o/vms)、草生歐文氏菌(五rwz'"/a/zer6/co/a)、野梧桐歐文氏菌(五nWm'ama〃o"vora)、小米歐文氏菌(五rvWm'a附/〃幼'ae)、流黑歐文氏菌CEnW"/aw'grzyZwe"s)、超壓歐文氏菌(五nWm'arn'mz^pms^wra/^h^i色歐文氏菌(五rvWm'a/era/c/wa)、番石榴歐文氏菌(五rwz'm.a/w淑)、五rvW"z'ap"》/Zae、櫟歐文氏菌(5rvWw'o《wwc/"")、大黃歐文氏菌(五rv^m'aAa/70"ricz')、生紅歐文氏菌(五rwz'm'arwZ)咖"'，)、柳歐文氏菌CE環(huán),"/ara/Zc/力、斯氏歐文氏菌(EWW"/aWew"W//)、嗜管歐文氏菌CEm/m'a/rac/2ez>/w7")、嗜夏孢歐文氏菌(EnWw'awmsfovora)、非脫欲埃希氏菌(jEsc/zm'c/2/aacfecw6ca7/ato)、不產(chǎn)。引"朱埃希氏菌(Esc/ze〃'c/2/aaw/"<io//ca)、金色埃希氏菌(jEsc/zm'c/^"wmscms)、蟑螂埃希氏菌(Esc/^r/c/H'a6/a加e)、大腸埃希氏菌(^Esc/zen'c/2/aco/z')、大腸埃希氏菌共生變種(Esc/zm'c/n'aco//vor.commwm'or)、大腸可變埃希氏菌(^sc/2m'c/z,aco/"臓toMe)、弗氏埃希氏菌(Eyc/^〃.c/w.ay^g^yom力、赫氏埃希氏菌(&c/^〃'c/w'fl/7erm"""/z')、埃希氏菌(Eic/zen'c/n'asp.)、傷口埃希氏菌(_Eyc/ze/-/c/w'avw/"m》、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(《/eZwW/a^rag^7M)、愛德華克雷伯氏菌亞特蘭大亞種(《/eZw/e〃aedwanis//subsp.W/a"toe)、解鳥氨酸克雷伯氏菌(A7eZw'e〃aor""/n'"o/;^'ca)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(〖/^^/"o"toca)、才直生克雷伯氏菌(X7血/e〃a//a油'co/a)、肺炎克雷伯氏菌(A7血/e〃a/"e畫ow'ae)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種(^7eZw.e〃ap"g,o"z'"esubsp.p"ewwom'—、克雷伯氏菌(尺/eZwW/asp.)、土生克雷伯氏菌(尺/eZw'e〃"^r&e"")、特氏克雷"f白氏菌(A7e6sz'e//afrev&am'z')、奧1"粵尼妙、門氏菌(Sa/附owe〃aa6ow力、亞利桑那沙門氏菌(&/mo"e//aw&o"ae)、邦戈?duì)柹抽T氏菌0Sa/mo"e〃a6owgoW)、豬霍亂沙門氏菌亞利桑那亞種0S"/wo"e〃ac/o/era&sw^subsp."Wzo"ae)、豬霍話L沙門氏菌邦戈?duì)杹喎N(5^/mowe〃ac/2o/erar&yw^subsp.Zowgon')、豬霍舌L;少門氏菌豬霍舌L亞種(iS"/;wo"e〃ac/zo/era&sz^subsp.c/zo/emaww&)、豬霍亂沙門氏菌雙亞利桑那亞種(Sa/wo"e〃flc/zo/eraasw"subsp.d/aWzo"ae)、豬霍^U少門氏菌豪牽頁亞種(iSa/w2owe〃"c/zo/era^sw/ssubsp./owfewae)、豬霍舌U少門氏菌印度亞種0Sa/mwxe〃ac/zo/erafesw!'ssubsp.z'm^ca)、豬霍^U少門氏菌薩^立姆亞種(5W/wo"e〃ac/w/eraesw/ssubsp.sa/a附"e)、達(dá)累斯薩拉姆沙門氏菌(iSa/wo"e〃a(iare^fl/a"附)、腸炎沙、門氏菌豪牽頁亞種(5"a/附o"e〃"e"fen'casubsp.、腸炎沙門氏菌薩拉姆亞種(iSa/mowe〃(3subsp.sfl/fl麵e)、腸炎沙門氏菌(5W,"e〃a、雞沙門氏菌(iSa/wowe/Zaga//z>MTwm)、、海^^、堡沙、門氏菌(Sa/mo"e/Za/ze〖Gfe/Zerg)、巴拿馬沙、門氏菌0SW/wowe〃a/awama)、森夫牽頁沙、門氏菌(Sa/mowe〃a化"ye"6erg)、鼠4另寒沙門氏菌(Sa/附owe〃a/);//7/wwr/ww)、口耆蟲沙雷氏菌(5Wrra"'ae"to附o/M")、無花果沙雷氏菌(5ferra"a，an'a)、居7良沙雷氏菌(5fe冊^3yb""'co/a)、葛氏沙雷氏菌(5Wra^3gW附e^')、變形斑沙雷氏菌(5fe/r加'a/—咖c/e"力、複色沙雷氏菌(5fe/r加V3marcescms)、褪色沙雷氏菌褪色亞種OSerra"awarcasce;wsubsp.附orc&sce"力、海紅沙雷氏菌(i9ema^/a/war/"orMZra)、氣味沙雷氏菌(/Sferra""oc/w^ra)、普城沙雷氏菌0Serraf/apfymow^era/s)、普利茅斯沙雷氏菌OSerrafz'a//jwwf/z/ca)、變形斑沙雷氏菌(5ferra"a/rofe"附acw/ara)、變形斑沙雷氏菌食酉昆亞種(5fe;ra"a/^ofeawofciz/flMSsubsp.《w/"ovon3)、食酉昆沙、雷氏菌(5"erraH"《wz'"/vorara)或^果紅沙雷氏菌OSerraWan^j/c/aga);才艮瘤菌科，例如土i裏桿菌屬(^graZ)acten'Mm)、嗜碳菌屬(CaAop/H7w力、螯合桿菌屬(C/ze/"to^"er)、劍菌屬(五"w/er)、才艮瘤菌屬(i/2izoZ/wm)、中華根瘤菌屬(5V"or/z&o6/wm),i"列^口大西洋土i裏4干菌(^groZ""e〃'wwaf/awdcww)、銹色土i裏才干菌(y4gro6a"en,wm々m^/"eww)、食明月交土》裏土i襄^干菌(/igro6acfen'w附、i文射形土^裏4干菌(^4gro6"cfen'w附raWo/acfer)、發(fā)根土壤軒菌(々ra6acfen'wmr/^oge"e力、懸鉤子土壤4干菌(Jgro6flcfen'wwrwZ/)、星J趕土》裏4干菌(^4gro6acfeWw附ste〃w/a加w)、才艮癌土i裏4干菌(JgraZacfen'wm加m咖c/era)、葡萄土i裏4干菌(^ro6"c&n'w附W嗣、碳酸嗜碳菌(Gar6o/Mwscar6ox油力、何氏螯合桿菌(C7^/atoZa"er/2e/"te")、粘著劍菌(五"w，a(i/2aerms)、棲樹劍菌(五rai/b"or6oni)、弗氏劍菌(五"57y^戶e(&')、五rai/^Aas打'e"wi、雞目艮草&J菌(E"w^ferAwwwerowz'"e)、草木樨^1〗菌(五"si/^rwe&c"e)、苜蓿劍菌(￡"7^we///o&')、薩赫勒劍菌(五"wy^sa/;e//)、適宜劍菌(五ra7y^"fera"gae)、達(dá)斤疆劍菌(五m7y^x/"力'a"ge"w》、鷹"觜豆才艮瘤菌(A/zizo6/wmc/cen')、豆才艮瘤菌(i^/zoZ)z'wmef//)、弗氏才艮瘤菌(i/^oZ/wmy^e<i/0、山羊豆才艮瘤菌(7/z/zo6z'w附g"/egae)、高盧才艮瘤菌(及/^zo6fw附g"〃/cww)、賈氏根瘤菌(i/^o6z'wmg7'ani/"z7)、海南才艮瘤菌(i/n!zo6/ww/2"/"朋erae)、華癸才艮瘤菌(A/^o6/m附/maA:w//)、華特拉才艮瘤菌(i/z/zo6/wm/mawf/era^)、木蘭才艮瘤菌(//z/zo6/wm/"d/go^rae)、日本才艮瘤菌(//z/zo6/wm乂a/om'cwm)、3宛豆才艮瘤菌(i/z/zo6/wm/egwm'"osan/w)、黃土根瘤菌(7/z/zoZ/ww/oawerae)、百脈根根瘤菌(//z&o6/wm/ori)、羽扇豆根瘤菌(i/7/zoWwm/w;z'w')、地中海才艮瘤菌(7/7&o6/wm、苜蓿才艮瘤菌(W/w!zoZj/m;w、內(nèi)蒙古才艮瘤菌(i/7izoWi/附mo"go/erae)、菜豆才艮瘤菌(i/z/zo6/"w//7似eo//)、i文射形才艮瘤菌(//7/zo6/wmrad/o6acfe"、發(fā)才艮才艮瘤菌(i/z/zo6/wmr/z/zogewas)、懸鉤子根瘤菌(//^o6/wmn/6/)、黃芪根瘤菌(及/^zo6/wwsw〃ae)、天山才艮瘤菌(i/w'zoWwnf/ara/zflwerae)、三葉草才艮瘤菌(//7Z,zo6/wwfn》/〃)、熱帶才艮瘤菌(i/z/zo6/wm"o//c()、i/z/zoZz'wmwwc^co/"、葡萄才艮瘤菌(i/2/zo6/wmvfto)、粘著中華根瘤菌(5V"or/H'zo&wm"c/zaerem1)、棲樹中華才艮瘤菌(5Vwor/7&o6/MmaAcW力、弗氏中華才艮瘤菌OSVwor/z&oZn'wmWewe、雞目艮草中華根瘤菌(5Vww/w'zo6z'wmA:wmweraw/ae)、草木樨中華根瘤菌(iS/"oWz/zo6/wmme&cae)、苜蓿中華才艮瘤菌0S/"oA&o6/i^me/z7o")、莫雷蘭中華才艮瘤菌(5V"or/zz:zoZH'wwwore/eme)、薩赫勒中華根瘤菌(&力or/i/zoWwwsa/7e")或新疆中華根瘤用于本發(fā)明方法的有利微生物的更多實(shí)例是選自以下的原生生物或石圭條類溝萆便藥纟岡(Dz'"o//^ce"e)、Twram'e〃/(iae或QxjKn'c/nWae,例如寇氏隱曱藻(O7/^/2ecoG^w'wwco/zm7)、三角褐指藻(尸/zaeoc/ac(y/wm/n'cor"wfww)、貝臺(tái)貝棘尾蟲(5^/o"_yc/H'<3mj^z7w力、氳棘尾蟲(5^/o"少c/w'a/wWw/ato)、腐生凈束尾蟲0S^/o7^c/n'"pw^/wa)、背一大凈束尾蟲(5^/o"yc/w'awotop/zora)、棘尾蟲(《S^/o"_yc/z/asp.)、彎曲豆形蟲(Co/;/(^w附caw/少/wm)或豆形蟲(Cb/p/t/z'wmsp.)。方便地用于本發(fā)明方法的生物是轉(zhuǎn)基因生物，例如真菌(例如被孢霉屬或破嚢壺菌屬、酵母(例如酵母屬或裂殖酵母屬)、苔蘚類(例如劍葉蘚屬或角齒蘚屬)、非人類動(dòng)物(例如新小桿線蟲(CaewoAaZxi/to))、'藻類(<列^口P/z;^scow/^"e〃a、尸seMcfc^cow^/e/c/a、/Vos7'"ococcws、Sc/^^^feZ/a、四鞭藻屬(71欲0^//&)、Afo"/omW/a、Qs/mcoccw51、隱甲藻屬或褐指藻屬)或植物(例如雙子葉植物或單子葉植物)。特別方便用于本發(fā)明方法的生物是屬于產(chǎn)油生物類的生物(既用于生產(chǎn)油的生物)，例如真菌(例如被孢霉屬或破嚢壺菌屬)、藻類(例如尸/y^com/Zre〃a、尸化W(iayco"/yeA^"、7Voy/wococcm1、&/ze/^//a、四鞭藻屬(7^^0^/附/5)、AfowtowW/a、(95treococcw、隱曱藻屬、褐指藻屬)或植物，尤其是植物，優(yōu)選含油種子或油料作物，其含有大量脂質(zhì)化合物，例如花生、白菜型油菜、甘蘭型油菜、向日葵、紅花(a^/2"wmsa"ctor/a)、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻油植物、橄欖、芝麻、金盞草、石榴(Punica)、月見草、毛蕊花、大薊、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲堅(jiān)果、鱘梨、月桂、西葫蘆/南瓜、亞麻籽、大豆、阿月渾子、琉璃苣、喬木(油棕、椰子或核桃)或適于耕作的作物例如玉米、小麥、黑麥、燕麥、小黑麥、水稻、大麥、棉花、木薯、辣椒、萬壽菊、茄科植物(例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄)、蠶豆、豌豆、苜?；蚬嗄局参?咖啡、可可、茶)、柳樹和多年生牧草和飼料作物。本發(fā)明優(yōu)選的植物是油料作物，例如花生、白菜型油菜、甘蘭型油菜、向日葵、紅花、翼粟、芥菜、大麻、蓖麻油植物、橄欖、金盞草、石榴(Punica)、月見草、西葫，/南瓜、亞麻籽、大豆、琉璃苣、喬木(油棕、椰子)。用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的植物是C18:2-脂肪酸含量高的植物，例如向曰葵、紅花、煙草、毛蕊花、芝麻、棉花、西葫蘆/南瓜、罌粟、月見草、核桃、亞麻籽、大麻或大薊。非常特別優(yōu)選的植物是紅花、向日葵、罌粟、月見草、核桃、亞麻籽或大麻等植物。對上述本發(fā)明的方法有利的是，除了本發(fā)明第一至第四方面的核酸之外，還向生物中引入脂肪酸或脂質(zhì)代謝的酶的編碼核酸。這類核酸最好來源于植物，例如藻類，例如綠枝藻綱(/Vos7'"o//z_ycefle),寸列^口異毛藻屬(//efero附osf/x)、Afa附附e〃a、Afo"tomW/a、Mfcromo"os、腎藻屬(7Ve//zmye/附/s)、O欲eococcus、綠枝藻屬(尸ms/"oc/ac/w力、尸ms/"ococcw51、尸"wcfoscow/ye/ca、/yc"ococcws、尸,aw/wowos、iSc/ze^fe//"或四鞭藻屬(7^rase/w/s)，例Mz,crawo"ow/w"〃a、綠腎藻(iVe//zrase/w^o//vace")、梨形腎藻(A^p/zrase/m/s/_yn》nw/s)、圓形腎藻(iYe//zT-ose/m^ra加wc^2)、O欲eococcws、Qs^mcoccwssp.、尸ms/woc/at/wsoscws、sp.、r欲ose/附^a//cw/她、7fefrase/附/scorten.q/bnm^、周氏四鞭藻(reraje/m/51c/z"0、7i^raye/wz'scowvo/wfae、refrase/w/scfes/^ac/za;^/、r欲ose/mz,sgracz,fe、r欲ose/m^/zazem'、T^mse/m^/wpe〃wc油、re^rase/wziswec/ca、T^^rose/w/sfe^""Zn3c/n'a、四肩哭四孝便'菜(7V^ose/w7^fefra仏e/e)、J"erase/柳'sverwcosa、r掛ase/柳iverwcosaiw6ms或re^ose/附"sp.或凈果'藻牙牛(五wg7e打aceae)的'藻類，侈1^口嚢月包'藻屬(^scog/e"")、變胞藻屬(血az'a)、柄棵藻屬(Co/""'w附)、長梭藻屬(Qyc/zWo/w&)、棵條屬(五wg/e"a)、才以凈果藥屬(Ewg7e"o/w&)、外a/0/7/2acws、卡克藻屬(A7/awA7'"efl)、鱗孑L藻屬(i^po""cfo)、扁凈果藻屬(尸/2acw力、陀螺藻屬(5Vram6omowa5)或嚢棵藻屬(rrac/ze/omo"os),例如梭形棵藻(五wg/e"fl、膝曲棵藻(五wg7e"age"/cw/ato)、纖細(xì)棵藻grac/to)、五wg/ewam/xoqy/zWracea、五wg/ewams//^ra、綠色棵藻v/n'cfc1)、Go/ac/w附ste"^rz'ww、圓斗主囊凈果'蓬(7Vac/2e/o附o"oscW"t/n'c")或旋轉(zhuǎn)嚢棵藻(rrac/7e/owo"osvo/vo"."")。所用的核酸最好來源于棵藻屬(五wg7e"")、Mi"tom'e〃a或(9sfreococcus。更多有利的植物是藻類(例如等鞭金藻屬或隱甲藻屬)、藻類/硅藻類(例如海鏈藻屬(77^/osw'ow'ra)或褐指藻屬(尸/^eodac/y/wm))、莒蘚類(例如劍葉蘚屬或角齒蘚屬)或高等植物(例如報(bào)春花科CFWww/ace"e)，例如J/ewnY/a、C"/e"dw/"他〃"to、(9他as^emww一"eyce附或C^teos/emmw7Zz;;aserazVfey)、樣i生物(例如真菌，例如曲霉、破嚢壺菌、疫霉、蟲霉、毛霉或被孢霉，細(xì)菌(例如希瓦氏菌、酵母)或動(dòng)物(例如線蟲，例如新小桿線蟲、昆蟲、蛙、鮑魚或魚)。本發(fā)明分離的核酸序列最好來源于脊推動(dòng)物門。優(yōu)選的核酸序列來源于脊推動(dòng)物綱；五w化/easto附/,輻鰭亞纟岡(Jc"w0p&;7g");偉斤鰭亞纟岡(iVeo;^eo^");石更骨魚綱(7WeosfeO;五wfe/eos的'、原鰭魚總目CPrataccmf/zop&o^")、鮭形目(Sa/,wybr膨s);鮭科(&/附0"油6)或大麻哈魚屬(0""0咖"^—或脊推動(dòng)物亞門(J^We6rato)、兩棲綱(Jm/9/w力/a)、無尾目(^"wra)、負(fù)子蟾科(/V/cfae)、爪蟾(xe"opw力或無脊推動(dòng)物(五veWe6rato)例如原索動(dòng)物門(尸ratoc/on/ato)、4皮嚢亞門(r"m'cato)、》每參綱(7i/o/(^/mro/dea)、；每革肖牙牛(CVomV^ae)例如星座歹l)4青海革肖(^附arawc/w附c<myfe〃a,ww)、史氏菊海鞘(5o吵〃船sc/z/o5^eW)、玻璃海鞘(C7cwaz'她幼'wafc)、Mo/gw/acz7r/wa、曼哈頓皮海革肖(Mo/gw/a,"/z""ms7》、連莖海鞘(尸era//zora由'cfo)或裂柄海鞘(5^e/a/aW/to)。核酸特別有利的是來源于真菌、動(dòng)物或植物(例如藻類或苔蘚類)，優(yōu)選來源于鮭形目(&/mo"z/o/7was),例如鮭科例如斑鱒屬(Sa/mo),例如虹鱒(O7cor/2y"c/7usw;;Hs^)、歐鱒(7Vw加？rw"a)或河鱒(亦稱亞東鮭，5"a/mo/a〃'o);藻類，例如Afo"/o"zW/a或Os/reococcw;或石圭藻類(例如海鏈藻屬或褐指藻屬)或藻類(例如隱曱藻屬)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法還包括得到包含獲取方法所用核酸序列的細(xì)胞或完整生物的步驟，其中用本發(fā)明的核酸序列、如上所述的基因構(gòu)建體或載體，單獨(dú)或與更多的脂肪酸或脂質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)的編碼核酸序列一起轉(zhuǎn)化細(xì)胞和/或生物，其中本發(fā)明的核酸序列編碼A9-延伸酶、A8-去飽和酶和/或A5-去飽和酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括從生物或培養(yǎng)物中獲取油、脂質(zhì)或游離脂肪酸的步驟。培養(yǎng)物可以例如是發(fā)酵培養(yǎng)物，例如是微生物培養(yǎng)物(例如被孑包霉、海鏈藻、她wto"/e〃a、O欲eococ譜、酵母或破嚢壺菌)或者是溫室栽培的植物或大田栽培的植物。由此產(chǎn)生的細(xì)胞或生物最好是產(chǎn)油生物的細(xì)胞，所述產(chǎn)油生物例如油料作物，例如花生、白菜型油菜、甘蘭型油菜、亞麻籽、大麻、花生、大豆、紅花、大麻、向日葵或琉璃苣。就植物細(xì)胞、植物組織或植物器官而言，"生長"的含義可理解為例如完整植林生長在營養(yǎng)培養(yǎng)基上，或生長在基質(zhì)上，例如生長在水培營養(yǎng)液中、盆栽土上或可耕土上。對于本發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)基因"或"重組"是指例如核酸序列、表達(dá)盒(=基因構(gòu)建體)或包含核酸序列的載體或由本發(fā)明核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物，所有這些都通過重組方法而構(gòu)建，其中a)本發(fā)明的核酸序列，或b)與本發(fā)明核酸序列有效連接的遺傳控制序列，例如啟動(dòng)子，或c)a)和b)并非位于其天然遺傳環(huán)境中或者以通過重組方法而修飾，其可能的》務(wù)飾形式為例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境的含義可理解為在原始生物中的天然基因組或染色體基因座或存在于基因組文庫中。就基因組文庫而言，優(yōu)選保留、至少部分保留核酸序列的天然遺傳環(huán)境。環(huán)境至少在一側(cè)鄰接核酸序列并且其序列長度為至少50bp、優(yōu)選至少500bp、特別優(yōu)選至少1000bp、最優(yōu)選至少5000bp。天然存在的表達(dá)盒-例如核酸序列的天然啟動(dòng)子與相應(yīng)的A5-去飽和酶基因的天然組合-成為轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，當(dāng)該表達(dá)盒經(jīng)誘變處理等非天然的合成("人工，，)方法修飾后。合適的方法可參見例如US5,565,350或WO00/15815。因此，用于本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)基因生物或轉(zhuǎn)基因植物的含義可如上所述地理解為方法所用的核酸不在其生物基因組的天然基因座上，它可能與要表達(dá)的核酸同源或異源。然而，如上所述，轉(zhuǎn)基因也意味著，盡管本發(fā)明核酸位于生物基因組的天然位置上，但相對于天然序列而言，其序列已經(jīng)^務(wù)飾，和/或天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)》f飾。轉(zhuǎn)基因的源表達(dá))，或者優(yōu)選該核酸發(fā)生異源表達(dá)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因生物是真菌(例如被孢霉或疫霉)、莒蘚類(例如劍葉蘚)、藻類(例如M""tomW/a、棵藻、隱曱藻或a^eococcw"、硅藻類(例如海鏈藻或褐指藻)或植物(例如油料作物)。原則上說，用于本發(fā)明方法所用的核酸、表達(dá)盒或載體的生物或宿主生物最好是能合成脂肪酸、尤其是不飽和脂肪酸和/或適于重組基因表達(dá)的所有生物。可提及的實(shí)例是植物，例如擬南芥04ra&Wop^)、菊科(例如金盞草)或栽培植物(例如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亞麻、白菜型油菜、椰子、油棕、紅花(CaW/zawmsWwctoh附)或可可豆)；微生物，例如真菌，例如被孢霉屬、破嚢壺菌屬、水霉屬(5"apra/egw'a)、疫霉屬或腐霉屬)；細(xì)菌(例如埃希氏菌屬或希瓦氏菌屬)；酵母，例如酵母屬；藍(lán)細(xì)菌屬(Qva"o6a"eWa);纖毛蟲；藻類(例^口^Wa"tomW/a、凈果藻屬、海鏈藻屬或Os^reococcw力；或原生動(dòng)物，例如溝鞭藻(&"0^^^//"^),例如隱曱藻。優(yōu)選的生物是能天然合成大量油的生物，例如真菌(例如高山被孢霉(Mo^ere/Zaa//z>za)、間型腐霉(尸;^/z/ww/"^7we&wm)、致病疫霉(尸/z少top/ztora/"7festa"力或才直物(例如大豆、白菜型油菜、椰子、油棕、紅花、亞麻、大麻、蓖麻油植物、金盞草、花生、可可豆或向日葵)、或酵母(例如釀酒酵母)，其中特別優(yōu)選大豆、亞麻、白菜型油菜、紅花、向日葵、金盞草、被孢霉或釀酒酵母。原則上說，除了上述轉(zhuǎn)基因生物之外，宿主生物也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，最好是非人類動(dòng)物，例如秀麗新小桿線蟲(C.e/egara)、玻璃海孝肖(CVo"az'"加""afe)或非洲爪蟾(Ze"o/ms/aev&)。更多可用的宿主細(xì)胞詳見Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)。可以使用的表達(dá)抹系例如具有較低蛋白酶活性的那些，詳見Gottesman,S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，California(1990)119-128。它們包括呈所有表型形式的植物細(xì)胞和植物的某些組織、器官和部分，例如花藥、纖維、根毛、莖、胚、愈傷組織、子葉(cotelydon)、葉柄、收獲材料、植物組織、繁殖組織和細(xì)胞培養(yǎng)物，其來源于真正的轉(zhuǎn)基因植物和/或可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。包含由本發(fā)明方法合成的多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因植物最好是直接上市，而無需分離其合成的油、脂質(zhì)或脂肪酸。列舉的用于本發(fā)明方法的植物可以是完整植物和所有植物部分、植物器官或植物部分，例如葉、莖、種子、根、塊莖、花藥、纖維、根毛、莖、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收獲材料、植物組織、繁殖組織和細(xì)胞培養(yǎng)物，其來源于真正的轉(zhuǎn)基因植物和/或可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在這種情況下，種子包含種子的所有部分，例如種皮、表皮細(xì)胞、種子細(xì)胞、胚乳或胚組織。然而，也可從生物、最好是植物中分離出由本發(fā)明方法產(chǎn)生的化合物，其形式是油、脂、脂質(zhì)和/或游離脂肪酸?？赏ㄟ^從生長的莊稼或從大田收獲生物來獲取該方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸?？梢酝ㄟ^壓搾或提取植物部分(優(yōu)選植物種子)來獲取多不飽和脂肪酸。在這種情況下，可以通過無需加熱的冷軋法或冷榨法，而獲取油、脂、脂質(zhì)和/或游離脂肪酸。為了更容易地破碎植物部分(尤其是種子)，可以先對其進(jìn)4于4分碎、蒸煮或焙烤。然后，對經(jīng)該方式預(yù)處理的種子進(jìn)行壓榨或用溶劑(例如熱己烷)萃取。之后去除溶劑。就微生物而言，在收獲后，后者無需進(jìn)一步加工步驟而直接提取，或者在》皮碎后用才支術(shù)人員熟悉的各種方法進(jìn)行提取。按照該方式，可以分離出超過96%的該方法所產(chǎn)生的化合物。然后，對所得產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步加工，即精制。在該方法中，先除去植物粘液和懸浮物等物質(zhì)。通過添加磷酸等酸，可以經(jīng)酶促或理化反應(yīng)達(dá)到被稱為脫泥(desliming)的目的。然后，用氫氧化鈉溶液等堿處理，除去游離脂肪酸。所得產(chǎn)物用水充分洗滌以除去產(chǎn)物中殘留的^5成，然后干燥。為了除去產(chǎn)物中殘留的色素，將產(chǎn)物漂白，例如使用填充土(filler，searth)或活性炭。最后，用蒸汽使產(chǎn)物脫臭。可從生物中分離出本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸，其形式是油、脂質(zhì)或游離脂肪酸。合適的生物是例如上述生物。優(yōu)選的生物是轉(zhuǎn)基因植物。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是經(jīng)上述方法產(chǎn)生的式I的油、脂質(zhì)或脂肪酸或其片段，特別優(yōu)選包含式I的化合物并且來源于轉(zhuǎn)基因植物的油、脂質(zhì)或脂肪酸組合物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是油、脂質(zhì)、脂肪酸和/或脂肪酸組合物在飼料、食品、化妝品或藥品中的用途。本發(fā)明的油、脂質(zhì)、脂肪酸或脂肪酸混合物可以技術(shù)人員熟悉的方式用于與動(dòng)物來源的其它油(例如魚油)、脂質(zhì)、脂肪酸或脂肪酸混合物混合。這些由植物或動(dòng)物成分組成的油、脂質(zhì)、脂肪酸或脂肪酸混合物也可用于制備祠料、食品、化妝品或藥品。術(shù)語"油"、"脂質(zhì)"或"脂"的含義可理解為包含不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、優(yōu)選酯化脂肪酸的脂肪酸混合物。油、脂質(zhì)或脂優(yōu)選含大量的多不飽和游離脂肪酸、最好是酯化脂肪酸、尤其是亞油酸、？亞麻酸、二高-y-亞麻酸、花生四烯酸、a-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。不飽和酯化脂肪酸含量優(yōu)選達(dá)約30%,更優(yōu)選含量為50%,甚至還更優(yōu)選含量為60%、70%、80°/。或更高。對于分析而言，可以通過例如氣相色譜，通過轉(zhuǎn)酯作用將脂肪酸轉(zhuǎn)化為甲基酯，來測定脂肪酸。油、脂質(zhì)或脂可包括各種其它飽和或不飽和脂肪酸，例如桐油酸(calendulicacid)、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸等。油脂中的各種脂肪酸含量各不相同，尤其因起始生物不同而異。本發(fā)明方法產(chǎn)生的ARA可以如上所述地呈脂肪酸衍生物的形式，例如神經(jīng)鞘脂(sphingolipid)、磷酸甘油酯、脂質(zhì)、糖脂、磷脂、單酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其它脂肪酸酯?？赏ㄟ^例如堿(例如含水KOH或NaOH)處理或酸水解，最好在甲醇或乙醇等醇存在下，或通過酶切，釋放ARA和存在的其它多不飽和脂肪酸，并且通過相分離等方法而分離，然后用H2S04等進(jìn)行酸化。無需以上處理步驟也可釋放脂肪酸。將本發(fā)明方法所用的核酸引入生物(最好是植物細(xì)胞或植物)之后，其可存在于分離的質(zhì)粒上，或者最好整合到宿主細(xì)胞基因組上。就整合在基因組上而言，整合可以是偶然的，或者通過重組使天然基因被引入的拷貝替代而達(dá)到，因此細(xì)胞產(chǎn)生所需混合物的產(chǎn)量可以調(diào)節(jié)，或者通過使用基因(反式)，使基因與功能表達(dá)單元有效連接，所述單元包含至少一個(gè)確?；虮磉_(dá)的序列和至少一個(gè)確保功能性轉(zhuǎn)錄基因聚腺苷酸化的序列。核酸最好通過多表達(dá)盒或構(gòu)建體？1入到生物中，可進(jìn)行多平行表達(dá)，最好是引入植物中，進(jìn)行基因的多平行的種子特異性表達(dá)。如果酵母(例如酵母屬或裂殖酵母屬)、真菌(例如被孢霉屬、曲霉屬、疫霉屬、蟲霉屬、毛霉屬或破嚢壺菌屬)、藻類(例如等鞭金藻屬、Ma"to"/e〃a、凈果藻屬、a^reococcws、褐指藻屬或隱曱藻屬)等樣丈生物作為本發(fā)明方法所用的生物，則這些生物最好生長在發(fā)酵培養(yǎng)物中。如果微生物作為本發(fā)明方法所用的生物，則它們生長或培養(yǎng)的方式是技術(shù)人員熟悉的，這取決于宿主生物。通常，微生物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含有碳源(通常是糖形式)、氮源(通常是酵母膏等有機(jī)氮源形式，或硫酸銨等鹽形式)、微量元素(例如鐵、錳和鎂的鹽)和維生素(如果合適的話)，溫度介于(TC-10(TC之間，優(yōu)選介于10°C-60°C之間，同時(shí)通入氧氣。液體培養(yǎng)基的pH可保持恒定(即在培養(yǎng)期間進(jìn)行調(diào)節(jié))或不保持恒定。培養(yǎng)可以是分批、半分批或連續(xù)培養(yǎng)。可以在發(fā)酵開始提供營養(yǎng)，或者以半連續(xù)或連續(xù)方式加料。如上所述，可通過提取、蒸餾、結(jié)晶、鹽沉淀(如果合適的話)和/或色譜等技術(shù)人員已知工藝，從生物中分離所產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。為此，最好事先破碎生物。如果宿主生物是孩i生物，本發(fā)明的方法最好在介于0。C-95。C之間的溫度進(jìn)行，優(yōu)選介于1(TC和85。C之間，特別優(yōu)選介于15。C和75。C之間，非常特別優(yōu)選介于15。C和45。C之間。在該方法中，pH值最好保持在pH4-12，優(yōu)選pH6-9，特別優(yōu)選pH7-8。本發(fā)明的方法可分批、半分批或連續(xù)才喿作。有關(guān)已知培養(yǎng)方法的概述可參見以下教科書Chmiel(Bioprozei3technik1.EinfUhrungindieBioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology1.IntroductiontoBioprocesstechnology](GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991》或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen[Bioreactors和peripheralequipment](ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994》。所用的培養(yǎng)基必須適當(dāng)?shù)貪M足所用菌株的需要。各種微生物培養(yǎng)基的介紹可參見以下教科書"ManualofMethodsftirGeneralBacteriology".AmericanSocietyforBacteriology(WashingtonD.C.，USA，1981)。如上所述，可用于本發(fā)明的這些培養(yǎng)基通常包含一種或多種碳源、氮源、無^l鹽、維生素和/或;微量元素。優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、雙糖或多糖。非常好的碳源的實(shí)例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。也可通過復(fù)雜化合物(例如糖蜜或糖精制過程的其它副產(chǎn)品)將糖添加到培養(yǎng)基中。最好也添加不同碳源的混合物。其它可能的碳源是油和脂(例如豆油、向日葵油、花生油和/或椰子油)、脂肪酸(例如棕櫚酸、硬脂酸和/或亞油酸)、醇和/或多元醇(例如甘油、曱醇和/或乙醇)和/或有機(jī)酸(例如乙酸和/或乳酸)。氮源通常是有機(jī)或無機(jī)氮化合物或含有這些化合物的材料。氮源的實(shí)例包括液態(tài)或氣態(tài)形式的氨或銨鹽(例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨)、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)雜氮源(例如玉米浸膏、大豆粉、大豆蛋白、酵母膏、肉膏等)。氮源可單獨(dú)使用或混合使用。培養(yǎng)基中可含有的無機(jī)鹽化合物包括鉀、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽。無機(jī)含硫化合物(例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物)或有機(jī)硫化合物(例如硫醇類(mercaptans)和硫醇類(thiols))都可用作疏源，用于產(chǎn)生含硫精細(xì)化學(xué)品，尤其是甲硫氨酸。磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽可用作磷源。螯合劑可添加到培養(yǎng)基中，以維持溶液中的金屬離子。特別合適的螯合劑包括二羥基苯酚(例如鄰苯二酚或原兒茶酚)和有機(jī)酸(例如檸檬酸)。本發(fā)明所用的用于培養(yǎng)微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基通常還包含其它生長因子，例如維生素或生長促進(jìn)劑，其包括例如生物素、核黃素、疏胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長因子和鹽通常來自復(fù)合培養(yǎng)基成分，例如酵母膏、糖蜜、玉米浸膏等。而且，可以將合適的前體添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基化合物的準(zhǔn)確組成極大地取決于具體實(shí)驗(yàn)，每次具體情況都要分別確定。培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可參見教科書"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(P.M.Rhodes,P.F.Stanbury編著，IRLPress(1997)第53-73頁，ISBN0199635773)。生長培養(yǎng)基也可得自供應(yīng)商，例如Standard1(Merck)或BHI(腦心浸汁，DIFCO)等。通過加熱(20min,1.5bar和121。C)或過濾除菌，將所有培養(yǎng)基組分滅菌。各組分可以一起滅菌，或者視需要分開滅菌。所有培養(yǎng)基組分可以在培養(yǎng)開始時(shí)就存在，也可以視需要連續(xù)或分批添加。培養(yǎng)溫度通常介于15。C-45。C之間，優(yōu)選25。C-40。C,并可維持恒定，或在實(shí)驗(yàn)期間變溫。培養(yǎng)基的pH范圍應(yīng)當(dāng)在5-8.5，優(yōu)選在7.0左右。在培養(yǎng)期間可以通過添加石威性化合物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，來控制培養(yǎng)pH。通過使用消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)控制泡沫。為了維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，可向培養(yǎng)基中添加具有選擇性效應(yīng)的合適物質(zhì)，例如抗生素。通過向培養(yǎng)物內(nèi)通入氧氣或含氧的混合氣體(例如周圍空氣)，維持需氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常為20°C-40°C，優(yōu)選25。C-4(TC。持續(xù)培養(yǎng)，直到形成的所需產(chǎn)物達(dá)到最大值。在10-160小時(shí)內(nèi)通常都能達(dá)到該目的。按照該方法得到的發(fā)酵肉湯、尤其是含多不飽和脂肪酸的肉湯，通常含有7.5-25%干物質(zhì)(重量)。發(fā)酵肉湯還可進(jìn)一步處理。按照需要，可以通過離心、過濾、傾析或這些方法的組合等分離方法，從發(fā)酵肉湯中完全或部分除去生物量，或?qū)⑵渫耆粼谒鋈鉁?。最好在分離后處理生物量。然而，也可用已知方法濃縮發(fā)酵肉湯，例如借助于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、降膜蒸發(fā)器、反滲透或納米過濾。最終，可以處理該濃縮發(fā)酵肉湯，獲取其中存在的脂肪酸。從該方法得到的脂肪酸也適合作為原料，用于更多目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)合成。例如，它們可組合或單獨(dú)用于制備制備藥品、食品、動(dòng)物飼料或化妝品。本發(fā)明方法所用的所有核酸序列最好都來源于真核生物，例如植物、孩i生物或動(dòng)物。核酸序列優(yōu)選來源于鮭形目(Sa/wow/orm&y)，藻類(例如AfowtowW/a、隱甲藻屬、凈果藻屬或Os^eococcw力，真菌(例如疫霉屬)或硅藻類(例如海鏈藻屬或褐指藻屬)。參考以下實(shí)施例和，可以更詳細(xì)地介紹本發(fā)明，其中圖1顯示-6和(o-3脂肪酸生物合成的各種合成途徑。圖2是氣相色譜圖，顯示在經(jīng)半乳糖(圖2A)或葡萄糖(圖2B)誘導(dǎo)的酵母中，通過海生鞭孢簇蟲A9-延伸酶序列(SEQIDNO:1，殘基7668-9200)的異源表達(dá)，將A9，12-18:2(亞油酸)轉(zhuǎn)化成A11,14-20:2。實(shí)施例1-來源于海生鞭孢簇蟲的FAE1延伸酶的克隆海生鞭孢蔟蟲是牡蠣的原生動(dòng)物寄生蟲，它能合成飽和和不飽和脂肪酸，包括必需脂肪酸花生四烯酸[20:4(w-6)]。海生鞭孢簇蟲使用△-8(delta-8)去飽和酶途徑合成花生四烯酸。材料與方法海生鞭孢蔟蟲的生長和收獲在28°C，在按照LaPeyre等(JEukaiyotMicrobiol1993;40:304-10)所述制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)海生鞭孢簇蟲分裂體，所述培養(yǎng)基含有氨基酸、核苦酸、碳水化合物和維生素，不含胎牛血清。核酸操作和基于PCR的克隆用DNeasyDNA小型試劑盒(minikit)(Qiagen)從細(xì)胞中提取DNA。用對A5去飽和酶基因具有特異性的引物，按以下步驟擴(kuò)增DNA:將反應(yīng)物加熱至95。C2min,再在95°C1min、52。C2min和72。C4min進(jìn)行35次循環(huán)，然后在72°C5min—次。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到TOPO載體(Invitrogen)中，經(jīng)過測序而"^正實(shí)。用"&計(jì)用于編碼區(qū)5'和3'端的基因特異性引物(表I)擴(kuò)增FAE延伸酶基因，其限制位點(diǎn)便于克隆到酵母載體中(表I)。經(jīng)設(shè)計(jì)，用于克隆到酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)中的正向引物在位置-3含有G/A，而在位置+4含有G，以便改進(jìn)在真核細(xì)胞中的翻譯起始。用于該項(xiàng)研究的寡核苷酸引物用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)分析海生鞭孢簇蟲的轉(zhuǎn)錄物。用RNeasy植物小型試劑盒(plantminikit)(Qiagen)，從細(xì)胞中提取總RNA。按照制造商的使用說明，用SMARTRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒(Amplificationkit)(BD畫Clontech,Basingstoke,UK)，自總RNA合成cDNA的第一條鏈。用以下引物擴(kuò)增單鏈cDNA。FAE操縱子正向5，-GGAATTCGAGGAGTAGGATCTTATCTGAGGATAGTCACACTAGTCGTACT-3'FAE操縱子反向5，-CATCTGCGAATACTAACCATACATT將反應(yīng)物加熱至95。C2分鐘，再在94。C30秒，55-72。C的溫度范圍30秒(按照引物設(shè)計(jì))和72°C2分鐘進(jìn)行35次循環(huán)，然后在72°C10分鐘一次。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到TOPO載體(Invitrogen)中，經(jīng)過測序而證實(shí)。令人吃驚的是，A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶的轉(zhuǎn)錄物顯示出都存在于同一mRNA上。這是顯示PUFA基因組織在操縱子樣結(jié)構(gòu)中的第一個(gè)實(shí)例。在另一項(xiàng)研究中，分析了A9-延伸酶的特異性。為了該目的，通過如上所述的RT-PCR，用以下引物擴(kuò)增該基因的編碼序列。Elo2正向5，-ATGCAAGTTCCCGCGGAGCATCACTCC-3'Elo2反向5，-CGTTACGCATCAATATTATGCATAGCCAACC-3'按照制造商(Stratagen)的推薦，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物再克隆到pCRscript載體中。在第二個(gè)PCR步驟中，用以下引物引入修飾的序列，用于酵母表達(dá)。酵母表達(dá)KpnElo2正向5，-TTGGTACCATGGGATTTCCTGCGGAG-3'SacElol反向5，-GGGAGCTCTTACGCATCAATATTATGCATAGC-3，所給出的引物序列是從5，至3'方向用于克隆的限制位點(diǎn)用粗體字顯示。結(jié)果從海生鞭孢簇蟲中分離FAE1延伸酶.使用來自TIGR所進(jìn)行的海生鞭孢簇蟲基因組測序計(jì)劃的公眾可得的數(shù)據(jù)(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/pmg/),我們鑒定了一個(gè)重疊群(contig)(1047306867),其顯示出與已知延伸酶的顯著同源性，其耙序列(稱為ElolFor,SEQIDNO:9)由511個(gè)殘基的可讀框組成，沒有內(nèi)含子。由把序列獲得的推定氨基酸是SEQIDNO:10。釀酒酵母的功能特性將對應(yīng)于推定A9脂肪酸延伸酶(SEQIDNO:9)的全長cDNA克隆到酵母表達(dá)載體pYES2中，得到稱為pYPmFAE的構(gòu)建體。用pYPmFAE或空載體作為對照，轉(zhuǎn)化釀酒酵母(51.ce"v^ae)菌林W303-1A。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在含棉子糖的基本培養(yǎng)基中并用2°/。半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)48小時(shí)后，提取總酵母脂肪酸，用GC分析所得FAME。GC分析(圖2)表明，用pYPmFAE轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞產(chǎn)生額外的脂肪酸，經(jīng)鑒定為二十碳二烯酸，這表明我們克隆的基因編碼A9脂肪酸延伸酶。表達(dá)海生鞭孢簇蟲A9脂肪酸延伸酶的酵母細(xì)胞能夠識別C18:2(c9,12)底物，其轉(zhuǎn)化率為8.2%。表1顯示用pYPmFAE(+)或空載體pYES2(-)轉(zhuǎn)化并用2%半乳糖誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞的脂肪酸含量。通過例如下列公式計(jì)算出18:2化12轉(zhuǎn)化為20:2^'14的轉(zhuǎn)化百分率轉(zhuǎn)化率(％)=[18:2,]+[20:嚴(yán)]<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表1所示的結(jié)果表明沒有檢出20:4A"'u'"的延伸酶活性，而對于18:3"，9，12有最小活性(1°/。轉(zhuǎn)化)。由此看來，A9脂肪酸延伸酶對亞油酸具有選擇性，而并不延伸其它PUFA。權(quán)利要求1.一種分離的核酸序列，其編碼具有Δ9-延伸酶、Δ8-去飽和酶和Δ5-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO1的核酸殘基7668-12077或其同源物的核酸序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO1的核酸殘基7668-12077的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有Δ9-延伸酶、Δ8-去飽和酶和Δ5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽選自SEQIDNO2、3和4；d)SEQIDNO1的核酸序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO2、SEQIDNO3和SEQIDNO4具有至少40％同一性；其中所述多肽具有Δ9-延伸酶、Δ8-去飽和酶和Δ5-去飽和酶活性。2.—種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基7668-9200或SEQIDNO:9的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性。3.—種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基9351-10724的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽，其中所迷多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:3具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A8-去飽和酶活性。4.一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽并且其選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基10842-12077的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077的序列的書f生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所迷多肽具有A5-去飽和酶活性。5.由權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸序列編碼的多肽。6.—種基因構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸序列及與之有效連接的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列。7.權(quán)利要求6的基因構(gòu)建體，其還包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶的序列，所述酶催化ARA轉(zhuǎn)化為co3-不飽和脂肪酸。8.權(quán)利要求7的基因構(gòu)建體，其包含編碼A5-延伸酶、co3-去飽和酶和/或A4-去々包和酶的序列。9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其還包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的脂肪酸或脂質(zhì)代謝的生物合成基因?；?CoA脫氫酶、?；?ACP[=?；d體蛋白]去飽和酶、?；?ACP硫酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、酰基-CoA:溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰-輔酶A羧化酶、?；?輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶、脂肪氧合酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶和去飽和酶。10.—種載體，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體。11.一種轉(zhuǎn)基因非人類生物，其包含至少一種權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸、權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的基因構(gòu)建體或權(quán)利要求10的載體。12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因非人類生物，所述生物是微生物、非人類動(dòng)物或植物。13.權(quán)利要求22或12的轉(zhuǎn)基因非人類生物，所述生物是植物。14.一種在生物體內(nèi)將亞油酸或其^"生物轉(zhuǎn)化為花生四烯酸或其衍生物的方法，所述方法包括向含有亞油酸的生物中引入至少一個(gè)包含以下的核酸序列a)SEQIDNO:1(全序列1047306867)、包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077的序列或其中之一的同源物；b)在嚴(yán)格性條件下與SEQIDNO:1的核酸序列或包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-12077的序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽選自SEQIDNO:2、3和4;d)SEQIDNO:1的核酸序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶、A8-去飽和酶和A5-去飽和酶活性；并且表達(dá)所述核酸序列。15.權(quán)利要求14的方法，所述方法還包括將ARA轉(zhuǎn)化為Q)-3脂肪酸的額外步驟，即通過向所述生物引入①-3去飽和酶和任選A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去飽和酶的編碼核酸。16.—種將18:2維12(亞油酸)轉(zhuǎn)化為20:2眠14的方法，所述方法包括向包含亞油酸的生物引入至少一個(gè)編碼具有A9-延伸酶活性的多肽的核酸序列并且其包含a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200、SEQIDNO:9或其中之一的同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基7668-9200或SEQIDNO:9的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A9-延伸酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:10;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基7668-9200或SEQIDNO:9的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:2或SEQIDNO:10具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A9-延伸酶活性；并且表達(dá)所述核酸序列。17.—種將20:2A"'"轉(zhuǎn)化為20:3AS'"，"的方法，所述方法包括向包含20:2A1U4、或包含亞油酸和A9延伸酶的生物引入一種分離的核酸序列，所述核酸序列編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽并且選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基9351-10724的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A8-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基9351-10724的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:3具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A8-去飽和酶活性；和表達(dá)所述核酸序列。18.—種將20:3A8'1U4轉(zhuǎn)化為20:4a5'8'11'14(ARA)的方法，所述方法包括向包含20:3純11，14、或者包含20:2Au'"和A8-去飽和酶、或者包含亞油酸、A9延伸酶和A8-去飽和酶的生物引入一種分離的核酸序列，所述核酸序列編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽并且選自a)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077或其同源物的序列；b)在嚴(yán)格性條件下與包含SEQIDNO:1的殘基10842-12077的核酸序列雜交的核酸序列；c)一種分離的核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4;d)包含SEQIDNO:1的核酸殘基10842-12077的序列的衍生物，其編碼的多肽在氨基酸水平上與SEQIDNO:4具有至少40%同一性；其中所述多肽具有A5-去飽和酶活性；并且表達(dá)所述核酸序列。19.權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括將ARA轉(zhuǎn)化為co-3脂肪酸的額外步驟，即通過向所述生物引入co-3去飽和酶和任選A5-延伸酶和/或A4-延伸酶和/或A4-去飽和酶的編碼核酸。20.權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括用半乳糖誘導(dǎo)的步驟。21.權(quán)利要求14-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物是微生物、非人類動(dòng)物或植物。全文摘要本發(fā)明涉及來源于海生鞭孢簇蟲(Perkinsusmarinus)的核酸，其編碼9-延伸酶、Δ8-去飽和酶和Δ5-去飽和酶。所有這些編碼序列都可轉(zhuǎn)錄為單一轉(zhuǎn)錄物。文檔編號C12N15/53GK101421399SQ200780013148公開日2009年4月29日申請日期2007年2月13日優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日發(fā)明者J·納皮爾,M·貝內(nèi)加斯卡萊倫,O·薩亞諾瓦申請人:羅塔姆斯特德研究有限公司