專利名稱：：從混合的胎兒-母體來源中特異性擴增胎兒dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供從混合的胎兒-母體來源中選擇性擴增胎兒DNA序列的方法。該方法利用差異性曱基化來允許從含有高比例非滋養(yǎng)層/胎兒DNA的DNA混合物中選擇性擴增滋養(yǎng)層/胎兒特異的序列。本發(fā)明還提儉使用擴增的胎兒DNA序列進行非整倍性檢測的方法。
背景技術(shù)：
：大量研究表明，新生兒中全染色體非整倍性的發(fā)生率為1至2%。Hsu,A.M.(編輯)GeneticDisordersandtheFetus,179-248頁(1998)。這種染色體異常是出生前發(fā)病和死亡的重要原因及長期存活者嚴(yán)重發(fā)育遲緩的主要原因。考慮到常見三體性的母親年齡依賴性和平均生育年齡的顯著提高，顯然篩選非整倍性的重要性將持續(xù)提高。非常需要用于在妊娠期間檢測非整倍性的可靠、廉價且非侵入性的方法。用于非整倍性檢測的現(xiàn)有選擇不多。目前，通過絨毛膜絨毛取樣("chorionicvillussampling,CVS")或羊膜穿刺進行的侵入性測試是所有35歲及以上婦女和其他已知非整倍性風(fēng)險升高的婦女的一種選擇。因此，大多數(shù)婦女因為她們不屬于這些范疇而不予進行侵入性測試。因為大多數(shù)嬰兒為小于35歲的婦女所生，并且每250名35歲婦女中僅有約l名婦女通過羊膜腔穿刺發(fā)現(xiàn)具有三體性，因此母親年齡作為篩選測試的功能很差。在過去的20年里，21三體("trisomy21，T21")母體血清篩選的效率已有了很大提高。使用兩個妊娠時間點上的母體血清及超聲的現(xiàn)有技術(shù)的篩選對T21的檢測具有~95%的"靈敏度"和5%的假陽性率。參閱如WaldN.J.，等111:521-31.(2004)。然而，這類測試具有三個主要缺點。首先，它不提供診斷，而是提供唐氏綜合征的概率。"陽性"結(jié)果定義為唐氏綜合征的風(fēng)險高于或等于35歲婦女。因此，具有"陽性"結(jié)果的大多數(shù)婦女仍然必須考慮到，實際發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征的幾率仍然低于1%。其次，該測試僅限于21三體和18三體。第三個問題是僅有95%的靈敏度。篩選測試(如該測試)中95%的靈敏度從公共衛(wèi)生觀點出發(fā)是很有價值的，但是對于許多患者，5。/。遺漏T21的幾率是不能接受的。顯然，如果可用的話，那么陽性預(yù)測值和靈敏度高得多的非侵入性測試將對患者有用得多，并將立即取代現(xiàn)有的篩選方法。從約12年前開始，母體血中多種鐠系胎兒細胞的證實引起了人們巨大的興趣。人們開發(fā)了從母體循環(huán)中純化此類細胞的技術(shù)，并展示了對許多疾病進行產(chǎn)前診斷的可行性。然而，這些方法還并不實際。這主要是因為胎兒細胞的貧乏以及純化它們這一棘手的問題。Bianchi，D.W.，等，Br.J.Haematol.105:574-83(1999)。大量近期出版物已經(jīng)證明，游離的胎兒DNA存在于從妊娠早期(thefirsttrimesterr)的前期開始并持續(xù)至分娩的基本上所有妊娠期的母體血漿中。Bischoff，F(xiàn).Z"等，Hum.Reprod.Update11:59-67(2005)。大量研究已經(jīng)證實，可以通過在來自母體血漿的DNA中擴增Y染色體特異性序列來確定胎兒性別，并且其它報道已顯示，還可以確定胎兒Rh血型的基因型。母體血漿中胎兒DNA的絕對量不多，且取決于孕齡及回收技術(shù)。全部基于定量PCR的估計提出，根據(jù)孕齡和其它參數(shù)，每ml全血中可能有相當(dāng)于50-200個基因組當(dāng)量的胎兒DNA。Bischoff等2005HumReprodUpdate11:59-67。來自母體血漿的DNA的來源也不清楚。許多研究者推測它很可能來自滋養(yǎng)層，因為這是與母體循環(huán)接觸最直接的組織。這種推測的直接證據(jù)來自單個出版物，其鑒定了Y染色體異常的胎盤鑲嵌現(xiàn)象。FloriE，等,Casereport.Hum.Reprod.19:723-4(2004)。盡管早期成功地證明了胎兒DNA在母體血漿中的存在，但使用來自母體血漿的DNA還沒有解決產(chǎn)前診斷的主要問題，如確定常見三體性的存在。這是因為母體血漿中胎兒DNA作為與母體DNA的混合物而存在并且母體成分通常豐度更高的事實。胎兒DNA與母體DNA的比例似乎在不同的樣品和方法之間變化很大。最低約為10/o的DNA量，最高可以高得多。BenachiA,等,Clin.Chem.51:242-4(2005)。雖然PCR可用于擴增極少量的DNA,但是沒有一般性方法來選擇性擴增胎兒DNA。擴增胎兒和母親共有序列的任何努力將僅能成功擴增母體序列。迄今為止，僅通過使用對母體組分中不存在的序列(如Y染色體)具有特異性的引物實現(xiàn)了對胎兒序列的選擇性擴增。已經(jīng)使用物理分離技術(shù)來提高血漿來源DNA中胎兒組分的比例。LiY，等Jama293:843-9(2005);LiY,等Prenat.Diagn.24:896-8(2004a);LiY，等，Clin.Chem.50:1002-11。盡管如此，這些技術(shù)不太可能獲得純度足以進行常規(guī)產(chǎn)前診斷的胎兒DNA。來自孕婦宮頸的樣品已顯示包含胎兒細胞，這代表了可用于非侵入性產(chǎn)前診斷的另一可能的胎兒DNA來源。關(guān)于該主題的文獻集中在兩個問題上1)從宮頸回收胎兒細胞的可靠性和改善它的方法和2)從大母體細胞背景中分離胎兒細胞的方法。盡管已經(jīng)使用來自宮頸樣品的胎兒細胞和DNA進行了多種產(chǎn)前診斷，但這兩種問題仍然是該方法常規(guī)使用中的主要障礙。有報導(dǎo)的從母體宮頸樣品中獲得胎兒細胞的最高成功率是82%,這僅在使用鹽水滴注法的半侵入性技術(shù)時實現(xiàn)。CioniR，等，Prenat.Diagn.25:198-202(2005)。形態(tài)學(xué)手段(TutschekB，等，Prenat.Diagn.15:951-60(1995);BussaniC,等，Mol.Diagn.8:259-63(2004))和免疫學(xué)手段(Katz-JaffeM.G.，等，Bjog112:595-600(2004))均已用于從母體細胞中分離胎兒細胞，并且兩者均已顯示可以提高胎兒細胞的比例。然而，這些方法獲得的DNA很可能受母體DNA的高度污染。此外，未曾報道過大規(guī)模的或系統(tǒng)性的研究。顯然，允許檢測和分析處于與母體DNA的混合物中的滋養(yǎng)層DNA序列(因此檢測和分析胎兒的DNA序列)的方法將極其有用。這樣，來自母體血漿或來自宮頸的樣品可以直接用于胎兒分析，而不需要對母體和胎兒的細胞或DNA進行廣泛的物理分離?；蛘?，用于富集胎兒DNA的物理方法可以與滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增組合，以增強兩者的益處。因此，仍然需要提供對得自混合的胎兒/母體DNA來源的胎兒DNA進行選擇性擴增的方法。本發(fā)明滿足了這一需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供從混合的胎兒和母體DNA樣品中選擇性擴增胎兒DNA的方法，所述方法包括以下步驟從混合的胎兒/母體DNA樣品中分離DNA;用甲基化特異性酶消化所述DNA;將消化的DNA與接頭連接；使消化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增，以獲得擴增的PCR產(chǎn)物；從擴增產(chǎn)物中除去接頭和引物DNA;環(huán)化所擴增的PCR產(chǎn)物；使環(huán)化的PCR產(chǎn)物進行外切核酸酶消化，以將任何未環(huán)化的DNA降至單核普酸；以及使產(chǎn)物進行等溫滾環(huán)擴增，以選擇性擴增胎兒DNA，從而由胎兒DNA產(chǎn)生甲基化敏感性代表?？梢允褂萌魏渭谆禺愋悦?，并且優(yōu)選HpyChlV-4、Clal、Acll和BstBI酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，接頭介導(dǎo)的PCR擴增進行12個循環(huán)。此外，在一些優(yōu)選的實施方案中，用Bal-31進行外切核酸酶消化。本發(fā)明還提供鑒定胎兒特異擴增子的方法，所述方法包括以下步驟使用上述選擇性擴增胎兒DNA的方法從胎兒DNA和全血DNA中分別制備甲基化敏感性代表；標(biāo)記胎兒DNA和全血DNA，以產(chǎn)生標(biāo)記的胎兒DNA探針和標(biāo)記的全血DNA探針；使標(biāo)記的DNA探針與兩個相同的寡核苷酸陣列雜交，其中所述核苷酸陣列對應(yīng)于給定甲基化敏感性酶的預(yù)測限制性片段；將兩個陣列相互比較，以定位僅與胎兒DNA探針雜交的寡核苷酸；以及將來自步驟d的雜交寡核苷酸鑒定為胎兒特異性擴增子。在另一些實施方案中，用兩種不同的標(biāo)記對胎兒DNA探針和全血DNA探針進行標(biāo)記，這允許在一個陣列上進行標(biāo)記探針的雜交。標(biāo)記可以是熒光染料。在一些優(yōu)選的實施方案中，用于選擇性擴增的甲基化敏感性酶是HpyCh4陽IV。優(yōu)選地，胎兒DNA在妊娠前期獲得，并更優(yōu)選地在妊娠的約56-84天獲得。本發(fā)明還提供由上述方法產(chǎn)生的胎兒特異性擴增子的文庫。本發(fā)明還提供包含胎兒特異性擴增子文庫的陣列。本發(fā)明還提供確定胎兒和母體DNA的混合物中胎兒DNA預(yù)定基因座上的拷貝數(shù)與該預(yù)定基因座上正?？截悢?shù)相比是減少還是增加的方法。所述方法包括使用上述胎兒DNA的選擇性擴增對測試樣品和對照樣品中胎兒DNA的預(yù)定基因座進行選擇性擴增。對照樣品在胎兒DNA的該預(yù)定基因座上具有正常的拷貝數(shù)。接著，所述方法包括比較測試樣品中擴增DNA的量和對照樣品中擴增DNA的量；并將擴增DNA減少的量與減少的拷貝數(shù)相關(guān)聯(lián)，或?qū)U增DNA增加的量與拷貝數(shù)的增加相關(guān)聯(lián)。在另一個實施方案中，該比較包括將來自預(yù)定基因座的擴增DNA對在測試樣品和對照樣品中以相同拷貝數(shù)存在的對照基因座所擴增的DNA進4亍歸一化。本發(fā)明還提供在測試樣品中確定預(yù)定基因座上的拷貝數(shù)與正常拷貝數(shù)相比是減少還是增加的方法，所述方法包括以下步驟使用上述選擇性擴增胎兒DNA的方法對測試樣品中和對照樣品中的胎兒DNA進行選擇性擴增，其中所述對照樣品在該預(yù)定基因座上具有正常的拷貝數(shù)；用標(biāo)記對來自步驟a中測試樣品的DNA和對照樣品的DNA進行標(biāo)記，以產(chǎn)生標(biāo)記的測試DNA探針和標(biāo)記的對照DNA探針；使標(biāo)記的測試DNA探針和標(biāo)記的對照DNA探針與上述胎兒特異性擴增子的陣列雜交；比較測試DNA探針和對照DNA探針間的雜交量以確定信號強度；并將信號強度與測試樣品中預(yù)定基因座上拷貝數(shù)的增加或減少相關(guān)聯(lián)。在另一個實施方案中，用兩種不同的探針標(biāo)記測試樣品DNA和對照樣品DNA，這允許在一個陣列上進行雜交。圖1描述了幾種酶消化的血液DNA和滋養(yǎng)層/胎兒DNA的乙錠染色瓊脂糖凝膠電泳。"B"和"T"分別表示血液樣品和滋養(yǎng)層/胎兒樣品。水平白線表示約1500bp的分子量。圖2提供接頭介導(dǎo)擴增的代表性實例。上圖顯示的是從四種不同母體血清樣品中純化的DNA的接頭介導(dǎo)PCR。顯示了24個循環(huán)后的產(chǎn)物。下圖顯示從母體血清中純化的DNA的接頭介導(dǎo)PCR。顯示了20個循環(huán)后的產(chǎn)物。泳道1和2在沒有甲醛的情況下收集，泳道3和4收集到含有甲醛的管中。圖3描述了顯示Acll消化的滋養(yǎng)層/胎兒DNA及血液DNA的擴增代表的凝膠。泳道如下1)標(biāo)記；2)滋養(yǎng)層/胎兒；和3)血液。泳道4和5與2和3相同，只是在接頭連接步驟中沒有使用連接酶。白色條帶表示切下用于克隆的部分。圖4顯示使用特異性Acll擴增子的引物的PCR結(jié)果。使用特異性Acll引物的PCR在12個相同制備的滋養(yǎng)層/胎兒和血液DNA代表上進行。顯示了4組引物的結(jié)果。鑒定了總共10組此類滋養(yǎng)層/胎兒"特異性"引物組。"T"和"B，，表示模板分別來自滋養(yǎng)層/胎兒和血液。圖5顯示使用滋養(yǎng)層/胎兒特異性引物組對經(jīng)Bal-31處理的等溫擴增滋養(yǎng)層/胎兒和血液DNA代表所獲得的PCR產(chǎn)物。每一對("T"和"B")是一組引物對滋養(yǎng)層/胎兒和血液代表的結(jié)果。上圖顯示所有6份滋養(yǎng)層/胎兒樣品在22個PCR循環(huán)后均有可見產(chǎn)物，血液樣品則沒有可見產(chǎn)物。下圖顯示35個循環(huán)后，引物1和2具有來自血液代表的可見產(chǎn)物。圖6顯示在滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子中含有信息性SNP的PCR產(chǎn)物的序列。圖A來自輸入的血液DNA。圖B來自輸入的滋養(yǎng)層/胎兒DNA。圖C來自兩種輸入DNA的20:1混合物。圖D來自混合DNA樣品的曱基化敏感性擴增代表。這表明，存在于滋養(yǎng)層/胎兒DNA中的雜合SNP被順利擴增，盡管在起始混合物中僅以5%存在并因此檢測不到。圖7顯示兩種起始DNA的PCR產(chǎn)物以及擴增自20:1混合物的PCR產(chǎn)物。使用在滋養(yǎng)層/胎兒特異性Acll擴增子上擴增CA重復(fù)多態(tài)性的引物來證實在兩種DNA的混合物中的選擇性擴增。圖A是具有基因型198/202的輸入全血DNA。圖B是具有基因型196/196的輸入滋養(yǎng)層/胎兒DNA。圖C是具有基因型198/202的20:1混合物。圖D是20:1混合物的甲基化敏感性擴增，其顯示盡管有95。/。的全血DNA污染，但還是獲得了滋養(yǎng)層/胎兒基因型。圖8顯示來自Lucito等GenomeRes13:2291-305(2003)描述的微陣列的數(shù)據(jù)。每一點代表點在玻璃陣列上并進行比較雜交的10,000個寡聚物的強度的logw平均比值。代表具有內(nèi)部HindIII位點的BglII片段的所有地址均在最左側(cè)。具有內(nèi)部HindIII位點的片段的平均比值通常遠高于l:l(10°)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供從混合的胎兒-母體來源中特異性擴增胎兒DNA序列的方法。通常，所述方法包括以下步驟從混合的胎兒-母體來源中分離DNA;使分離的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR;環(huán)化擴增的PCR產(chǎn)物；外切核酸酶消化；以及最終進行等溫滾環(huán)擴增。DNA可以從混合的胎兒-母體DNA來源中獲得。應(yīng)乂厶-母沐"假^源侵入性方法如絨毛膜絨毛取樣("CVS")和羊膜穿刺可以提供用于產(chǎn)前診斷的純胎兒DNA。雖然這些方法是常規(guī)使用的，但是它們也伴隨有風(fēng)險。另一方面，存在獲得胎兒DNA的幾種非侵入性途徑回收存在于母體血漿中的無細胞DNA以及從母體宮頸回收脫落的胎兒細胞。盡管如此，將胎兒DNA用于常規(guī)產(chǎn)前診斷的努力受限于胎兒DNA存在于與母體DNA的混合物中這一事實。本發(fā)明的方法使得能夠使用胎兒-母體DNA混合物，因為它利用胎兒和母體DNA間DNA曱基化上的差異來提供從混合的胎兒/母體DNA樣品中對胎兒特異性序列的擴增。通過利用這些甲基化差異，本發(fā)明提供從胎兒和母體DNA的混合物中選擇性擴增胎兒序列的方法。該方法因此開啟了在來自母體血漿或來自宮頸拭子的DNA中對諸如常見染色體異常的事件進行產(chǎn)前檢測的可能性。如上文所討論的，本發(fā)明依賴于胎兒和母體DNA間甲基化的差異。DNA甲基化是通過改變基因表達來影響細胞功能的后生遺傳學(xué)事件，指曱基由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化共價添加到CpG二核普酸中胞嘧啶的5號碳上。DNA甲基化分析的方法可以粗略地分為兩種類型整體的和基因特異性的甲基化分析。哺乳動物DNA的甲基化狀態(tài)在胎兒發(fā)育過程中發(fā)生顯著變化。認為在受孕時，母本和父本基因組均被廣泛甲基化。在前幾次細胞分裂過程中，這種甲基化被大量"抹去"，其后在植入時，發(fā)生從頭甲基化，并且再次存在大量曱基化。BirdA，Genes.Dev.16:6-21(2002)。在所有被研究的成人組織中，高比例(高達85%)的CpG二核苷酸被甲基化。GruenbaumY，等，F(xiàn)EBSLett124:67-71(1981)。對哪些序列發(fā)生甲基化的了解目前十分粗淺，很大程度上基于1980年代進行的研究，所述研究依賴于簡單的技術(shù)，如比較DNA的曱基化和非曱基化敏感性消化。BirdAP(1980)NucleicAcidsRes.8:1499-504(1980)。目前人們對甲基化及其在基因表達調(diào)控中的作用有巨大興趣。基因組DNA甲基化方面的所有現(xiàn)有文獻均基于來自胎兒或成人來源(如肝和全血)的樣品。迄今為止，在胚外組織如滋養(yǎng)層/胎兒中對甲基化還未曾有過系統(tǒng)的研究。在對諸如Prader-Willi綜合征和脆性X綜合征的病癥進行產(chǎn)前診斷的過程中，已經(jīng)注意到與來自血、肝或皮膚的DNA相比，滋養(yǎng)層/胎兒DNA是相對低甲基化的。IidaT.，Hum.Reprod.9:1471-3(1994)。當(dāng)利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶進行Southern印跡時該差異最明顯。當(dāng)用具有四堿基識別序列的曱基化敏感性限制性內(nèi)切酶(例如HpaII)消化大多數(shù)哺乳動物DNA時，4艮驚人地發(fā)現(xiàn)多數(shù)DNA保持高分子量。片段的平均分子量高于15kb，然而HpaII的預(yù)計頻率所預(yù)測的平均片段大小要小得多。通過觀察此類消化(見圖1)，人們可以猜測至少80%的HpaII位點沒有切開。雖然在圖中觀察不到，但是如果用更高百分比的瓊脂糖跑膠，很明顯地有片段的雙峰分布，一組很小而另一組4艮大。這些觀察結(jié)果基本上再現(xiàn)了1983.CooperD.N.，等,NucleicAcidsRes.11:647-58(1983)中報道的所i胃"HpaII小片段，旦palllinyfragment"或稱為"HTF島"的發(fā)現(xiàn)。如果用Mspl(與HpaII具相同的識別序列，但不是甲基化敏感性的)消化相同的DNA,則片段的平均分子量與預(yù)計大小接近得多。然而，使用從妊娠早期滋養(yǎng)層/胎兒中制備DNA的相同實驗得到十分不同的結(jié)果。HpaII消化的滋養(yǎng)層/胎兒DNA的平均分子量明顯減小，盡管仍然不等于通過MspI消化獲得的分子量。這明確表明，從滋養(yǎng)層/胎兒中制備的DNA為相對低曱基化(較少地被甲基化)，并導(dǎo)致了重要預(yù)測-低甲基化區(qū)域在整個基因組中比CpG或"HTF"島的分布更廣泛。精確測定滋養(yǎng)層/胎兒DNA相對于全血DNA低甲基化的程度是困難的，但是使用HpyChIV-4酶(與圖1中相似)對滋養(yǎng)層/胎兒和全血DNA消化物進行的i度測定法(densitometry)表明，對于500-l，OOObp的片段窗，得到的彌散條帶的密度對于滋養(yǎng)層/胎兒樣品一直為2-3倍。這提示在該大小范圍內(nèi)，HpyCh4-IV消化的滋養(yǎng)層/胎兒DNA中所包含的片段是全血DNA的2到3倍。滋養(yǎng)層/胎兒和全血來源的DNA之間甲基化差異的孕齡依賴性尚未充分研究。在9至20周孕齡范圍內(nèi)的一系列10份樣品中，在用HpaII和HpyCH4-IV進行的消化中未檢測到差異。然而，Prader-Willi和脆性X基因座的甲基化敏感性DNA印跡分析表明，到妊娠中期的中段，相比于妊娠早期存在的甲基化，可能會有更多的滋養(yǎng)層/胎兒DNA曱基化。因此優(yōu)選地，從妊娠期10-13周獲得混合的DNA樣品(通過LMP)。這樣，本發(fā)明的方法提供利用上述胎兒DNA和母體DNA間甲基化的差異而從混合的胎兒和母體DNA樣品中選擇性擴增胎兒DNA的方法。如先前指出，通常所述方法包括以下步驟從混合的胎兒-母體來源中分離DNA;使分離的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR;將擴增的PCR產(chǎn)物環(huán)化；外切核酸酶消化；以及最后進行等溫滾環(huán)擴增。本發(fā)明的方法包括使分離的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR。凝興介,^戶C及通常，接頭介導(dǎo)的PCR從用限制性內(nèi)切酶消化DNA和將雙鏈接頭與消化末端連接開始。然后用對應(yīng)于接頭的引物進行PCR，擴增高達約1.5kb的片段。見R.D.，等，NucleicAcidsRes.17:9027-37(1989)和Lisitsyn,N.A.，等，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.59:585-7(1994)。使用該技術(shù)，已經(jīng)可能從單個細胞中擴增DNA，并隨后通過使用擴增產(chǎn)物進行比較雜交來檢測非整倍性。Klein,C.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:4494-9(1999)。在另一項研究中，通過4吏用擴增代表作為BAC微陣列的雜交探針而將其用于檢測單基因組拷貝數(shù)變化。Guillaud誦Bataille，M.,等，NucleicAcidsRes.32:ell2(2004)。在該方法中，限制性內(nèi)切酶的消化頻率決定了所產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的復(fù)雜度。通過選擇切割不頻繁的酶，可以將擴增代表的復(fù)雜度降低至起始基因組DNA的一部分，使得隨后的雜交步驟更容易實施。這在希望在兩種復(fù)雜基因組來源間進行比較雜交的情況下特別有用。一個重要的實例是稱作"ROMA"(RepresentationalOligonucleotideMicroarrayAnalysis,代表性寡核苷酸微陣列分析)的技術(shù)，它已用于揭示人類中高度的基因組拷貝數(shù)變化。Lucito，R.，等，GenomeRes.13:2291-305(2003);Sebat，J"等，Science305:525-8(2004);Jobanputra,V"等，GenetMed7:111-8(2005)。實施例1顯示對從孕婦血漿中分離的DNA成功使用接頭介導(dǎo)的擴增。擴增前，使用CpG甲基化敏感性酶HpyCh4-IV來消化純化的DNA。消化后，將接頭退火并連接到消化的DNA上，最后使用接頭對的上鏈(topstrand)才艮據(jù)已公開的方案進行PCR。見實施例1和Guillaud-Bataille，M"等,NucleicAcidsRes.32:ell2(2004)。值得注意的是，已經(jīng)確定，母體血液收集方法中應(yīng)該優(yōu)選不涉及曱醛。實施例2顯示對滋養(yǎng)層/胎兒DNA進行成功的接頭介導(dǎo)的甲基化特異性擴增。使用CpG甲基化敏感性酶Acll消化滋養(yǎng)層/胎兒DNA及來自全血的DNA樣品。與實施例l類似，酶消化后，將接頭退火并連接到消化的DNA上，最后使用接頭對的上鏈根據(jù)與實施例1中所述相同的PCR方案進行PCR。值得注意的是，滋養(yǎng)層/胎兒DNA始終比全血產(chǎn)生更多和表觀不同的PCR產(chǎn)物。然而，已經(jīng)確定，盡管事實是使用CpG甲基化敏感性酶，但仍然會擴增非滋養(yǎng)層/胎兒DNA(即來自全血的DNA)。因此，本發(fā)明人確定，僅有接頭介導(dǎo)的PCR擴增對于特異性擴增滋養(yǎng)層/胎兒DNA是不夠的。因此，在本發(fā)明的接頭介導(dǎo)的PCR步驟中，獲得DNA的混合樣品并用CpG曱基化敏感性酶消化，以形成具有已消化末端的已消化DNA。甲基化敏感性酶為本領(lǐng)域已知，包括但不僅限于HpyChIV-4、Clal、Acll和BstBI。通過在連接接頭之前使用CpG甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶切割DNA，僅由未甲基化位點限定的片段可被擴增。在來自兩種不同來源DNA(—種的甲基化低于另一種)的混合物的情況下，用曱基化敏感性酶消化以及隨后的接頭連接和擴增允許對差異性甲基化位點所限定的片段進行選擇性擴增。該想法已經(jīng)與"代表性差異分析"結(jié)合，用于探測正常與癌組織間的曱基化差異。參閱Ushijima,T.，等，ProcNatl.Acad.Sci.USA94:2284-9(1997)和Kaneda，A.,等,Acad.Sci.983:131-41(2003)?？梢酝ㄟ^此方法實現(xiàn)的差異性擴增程度(部分)取決于所存在的甲基化差異程度。例如，如果給定位點在一種DNA中100%甲基化而在另一種中0%甲基化，則預(yù)期發(fā)生高度差異性擴增。對許多基因組位點的曱基化程度目前知之甚少。測定曱基化狀態(tài)的工具(即Southern印跡和亞硫酸氫鹽測序)通常顯示特定位點是完全曱基化或完全未甲基化的，提示給定位點的甲基化狀態(tài)是受嚴(yán)格調(diào)節(jié)和維持的。某一位點上的兩個等位基因在顯示印記(imprinting)和劑量補償?shù)幕蚪M區(qū)域中被精確地差異甲基化，這一事實進一步確證了這種想法。然而，已廣泛研究的特定位點的數(shù)目有限。檢測方法(Southern印跡和亞硫酸鹽測序)也不能區(qū)分甲基化程度的微小差異。然而，使用本發(fā)明的方法，確定具有高特異性的滋養(yǎng)層/胎兒序列差異性擴增。如上文所指出，哺乳動物基因組的甲基化是高度非隨機的。富含GC區(qū)和CpG或"HTF"島相對低曱基化，而富含AT的序列相對高甲基化。例如，稀有的切割富含GC的酶NotI多于90%的位點位于低甲基化的GpG島中，導(dǎo)致該酶的消化比最初預(yù)測的更為頻繁。見Fazzari，M丄，GreallyJM，Nat.Rev.Genet.5:446-55.(2004)。由于本發(fā)明利用甲基化差異來差異性擴增滋養(yǎng)層/胎兒特異性序列，并且CpG島看來很有可能在滋養(yǎng)層/胎兒和其它DNA中都是低甲基化的，因此本方法著眼于非GC富含DNA中的CpG甲基化。為此，包含甲基化敏感性CpG而其他部分由AT組成的限制性內(nèi)切酶是優(yōu)選的。四種酶屬于該范疇。一種是四堿基酶HpyChlV-4，在ACGT處進行切割。其余三種酶是六堿基酶分別具有^列ATCGTA、AACGTT和TTCGAA的Clal、Acll和BstBI。對隨機選擇的基因組1千萬堿基的非正式分析表明，這些酶的切割位點幾乎完全不存在于CpG島中。將Notl位點的限制性酶切圖與Acll、Clal和BstBI進行比較。分析顯示，這些富含AT的位點不聚集在CpG烏，相反，它們基本上從來不在CpG島中出現(xiàn)。令人驚奇的是，Acll、BstBI和ClaI的識別位點也很稀少。似乎人類基因組中僅包含~150,000個AclI位點，而不是基因組序列在A、C、T和G頻率方面是平衡的這一推測下所預(yù)測的750,000個。這一與預(yù)期相比Acll實際位點數(shù)~80%的減少是由于CpG二核苷酸相對缺乏。因為接頭介導(dǎo)的PCR僅能擴增達約1，500bp的片段，因此我們檢索了400到1500bp間的所有預(yù)測Acll片段，發(fā)現(xiàn)人類基因組中的總數(shù)僅為~15,000個。如果假設(shè)全血DNA中高達90%的預(yù)測位點被甲基化封閉(基于CpG曱基化在富含AT序列中增加這一事實的保守假設(shè))，那么在該大小范圍內(nèi)預(yù)計片段的真實數(shù)量可能是1,000-2,000個?？偟膩碚f，這~2,000個片段將代表全部基因組序列的低于0.1%。對滋養(yǎng)層/胎兒DNA的相同計算(假設(shè)僅有~80%的位點被甲基化)預(yù)測了約2,000-4,000個可擴增的Adl片段。這一計算得出了重要的預(yù)測，即相比于類似制備的全血代表，預(yù)計滋養(yǎng)層/胎兒DNA甲基化敏感性代表的全部擴增片段中約一半是"特異性的"或高度富集的。如上述用曱基化特異性酶消化從混合樣品中獲得的DNA后，然后將所述DNA連接到接頭上。優(yōu)選地，所述接頭具有內(nèi)建的限制性位點，所述位點其后將用于提供環(huán)化步驟所需的相容性粘末端?？梢允褂迷谙螽a(chǎn)生粘末端的任何限制性酶位點。例如，Mlul提供粘末端。連接接頭后，使用與該接頭內(nèi)位點結(jié)合的引物對得到的DNA進行擴增。然后進行PCR擴增。循環(huán)數(shù)可以不同，但優(yōu)選地，循環(huán)數(shù)將產(chǎn)生選定大小的消化片段代表。在一些優(yōu)選的實施方案中，進行5到15個循環(huán)的擴增。在一些更優(yōu)選的實施方案中，進行8-14個循環(huán)的擴增。在一些最優(yōu)選的實施方案中，進行12個循環(huán)的擴增。除了接頭介導(dǎo)的PCR擴增以外，本發(fā)明的方法還包括使擴增的PCR產(chǎn)物環(huán)化；外切核酸酶消化；以及最后的等溫滾環(huán)擴增(如上所述)，因為本發(fā)明人確定，接頭介導(dǎo)的PCR不足以特異性擴增胎兒DNA。實施例2顯示擴增了一些非胎兒DNA序列。炎^"增辨PC及進行擴增循環(huán)后，然后用切下接頭的酶消化擴增產(chǎn)物。例如，如果接頭具有內(nèi)建的Mlul位點，那么將對產(chǎn)物進行Mlul酶消化。消化以切割接頭之后，去除低分子量DNA(接頭和引物DNA)。可使用去除低分子量DNA的任何適當(dāng)?shù)姆椒?，如瓊脂糖凝膠純化或柱純化。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用柱純化。然后稀釋純化的DNA，產(chǎn)生非常稀的溶液。然后用T4DNA連接酶過夜處理該DNA，以通過使由之前酶消化所產(chǎn)生的粘末端發(fā)生連接而進行環(huán)化。通過消化和在非常稀的溶液(例如0.5ml1X連接緩沖液)中進行連接，非常有利于使具有相容粘末端的分子發(fā)生分子內(nèi)自身連接(環(huán)化)。已經(jīng)解鏈并部分重退火12次(在PCR擴增過程中)的原始起始DNA的消化和環(huán)化效率很低。此外，缺少合適末端的非特異性擴增的產(chǎn)物也將不太可能形成共價閉環(huán)。鞋核凝雜郝將DNA沉淀(使用本領(lǐng)域公知的方法)并重懸在適當(dāng)緩沖液(如水)中之后，通過用攻擊單鏈和雙鏈DNA末端的外切核酸酶(例如核酸酶Bal-31)進行充分消化來處理連接混合物。通過連接產(chǎn)生的環(huán)狀分子對消化具有抵抗力，但是充分消化會將任何線性分子降至單核苷酸。使用該消化來清除起始基因組DNA及非特異性擴增產(chǎn)物?；蛘?，除了單個外切核酸酶(如Bal-31)以外，還可以使用外切核酸酶的混合物。例如，一種酶攻擊單鏈DNA(綠豆外切核酸酶)而另一種酶攻擊雙鏈DNA(1外切核酸酶)，并且其中兩種酶均無內(nèi)切核酸酶活性，也不在缺口處切割雙鏈DNA。術(shù)語"充分消化"指所使用的酶量多至足以不成為限制，并且進行消化的時間長至足以不成為限制。例如，在一個實施方案中，在消化混合物中使用2單位的Bal-31核酸酶，并允許進行45分鐘。該單位在功能上定義為10分鐘內(nèi)在40ng/ul溶液中消化線性DNA的400個堿基所需的酶量。爭溫漠環(huán)^"增接著使用核酸酶處理的連接物作為等溫滾環(huán)擴增的模板。等溫滾環(huán)擴增為本領(lǐng)域已知，通常是使用耐外切核酸酶的隨機引物和具有高持續(xù)合成能力的DNA聚合酶進行的擴增環(huán)狀DNA的擴增。可以使用任何等溫滾環(huán)擴增方法。根據(jù)制造商的說明書使用可從Amersham獲得的公知試劑盒。使用本發(fā)明的方法，本發(fā)明人能夠證實，混合DNA樣品中滋養(yǎng)層/胎兒組分(因此胎兒DNA)的特異性擴增從胎兒DNA中產(chǎn)生了甲基化敏感性代表。見實施例4。本發(fā)明還提供鑒定胎兒特異性擴增子的方法。詳細說明見實施例5。該方法包括使用上述選擇性擴增胎兒DNA的方法從胎兒DNA和全血DNA中分別制備甲基化敏感性代表。胎兒特異性擴增子指使用本文所述方法將從滋養(yǎng)層/胎兒DNA而不是其它DNA中擴增的擴增子。滋養(yǎng)層/胎兒DNA是與成人DNA相比低曱基化的DNA。對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶將切割低甲基化的胎兒基因座，但不切割曱基化的母體基因座。用第一熒光染料標(biāo)記來自胎兒DNA的甲基化敏感性代表，并用不同于第一熒光染料的第二熒光染料標(biāo)記全血DNA，以產(chǎn)生標(biāo)記的胎兒DNA探針和標(biāo)記的全血DNA探針。使標(biāo)記的探針與對應(yīng)于給定甲基化敏感性酶的預(yù)計限制性片段的寡核苷酸陣列雜交。或者，如果使用兩個分開的相同陣列，則不需要用不同的熒光染料來標(biāo)記探針。研究陣列以定位僅與胎兒DNA探針雜交的寡核苷酸。將這些寡核苷酸鑒定為胎兒特異性擴增子。在一些優(yōu)選的實施方案中，用于胎兒特異性DNA擴增的甲基化敏感性酶是HpyCh4-IV。優(yōu)選地，從妊娠前三個月中約第56-84天獲得胎兒DNA,因為懷疑胎兒DA和母體DNA間的甲基化差異在妊娠早期更顯著。本發(fā)明還提供通過上述方法產(chǎn)生的胎兒特異性擴增子。本發(fā)明還提供陣列，其包含使用本發(fā)明方法鑒定的胎兒特異性擴增子文庫。本發(fā)明還提供用于確定胎兒和母體DNA混合物中胎兒DNA預(yù)定基因座上的拷貝數(shù)與預(yù)定基因座上的正常拷貝數(shù)相比是減少還是增加的方法。詳細討論見實施例6。該方法包括使用上述選擇性擴增胎兒DNA的方法在測試樣品中和對照樣品中選擇性擴增胎兒DNA的預(yù)定基因座。所述對照樣品在胎兒DNA的預(yù)定基因座上具有正常的拷貝數(shù)。將測試樣品中給定基因座上擴增DNA的相對量與對照樣品中相同基因座上擴增DNA的相對量進行比較。擴增DNA量的減少與拷貝數(shù)的減少相關(guān)，DNA量的增加與拷貝數(shù)的增加相關(guān)。在一些優(yōu)選的實施方案中，該比較包括將來自預(yù)定基因座的擴增DNA對在測試樣品和對照樣品中以相同拷貝數(shù)存在的對照基因座所擴增的DNA進行歸一化。本發(fā)明還提供在測試樣品中確定預(yù)定基因座的拷貝數(shù)與正?？截悢?shù)相比是減少還是增加的另一方法。詳細討論見實施例7。該方法包括使用上述選擇性胎兒DNA擴增方法在測試樣品和對照樣品中選擇性擴增胎兒DNA。所述對照樣品在預(yù)定基因座上具有正常的拷貝數(shù)。標(biāo)記來自步驟a的測試樣品及對照樣品的DNA，以提供標(biāo)記探針。進行標(biāo)記以提供檢測雜交的手段。例如，如果將使用一個陣列，則用第一熒光染料標(biāo)記來自測試樣品的DNA并用不同的第二熒光染料標(biāo)記來自對照樣品的DNA?；蛘?，如果使用兩個單獨的相同陣列，一個用于測試DNA探針且一個用于測試樣品DNA探針，就不需要兩種不同的標(biāo)記。標(biāo)記DNA探針后，它們與如通過本發(fā)明方法描述并產(chǎn)生的胎兒特異性擴增子雜交。測定測試DNA探針與對照DNA探針間的雜交量，來確定信號強度。與對照DNA相比，來自測試DNA的強信號與拷貝數(shù)的增加相關(guān)。與對照DNA相比，來自測試DNA的弱信號與拷貝數(shù)的減少相關(guān)。實施例實施例1:接頭(linker)-銜接子(adapter)PCR從血漿DNA中進行擴增使用接頭介導(dǎo)的PCR來從孕婦血漿中擴增DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)方案(Johnson,K丄.，等，Clin.Chem.50:516-21(2004))從10ml抗凝全血(母體血漿)樣品中純化DNA。將樣品離心兩次以除去細胞。使所得血漿穿過DNA結(jié)合膜。從膜上移出DNA并用HpyCh4-IV(在ACGT處切割)消化所得DNA。將接頭退火并連接，根據(jù)已公開的方案(Guillaud-Bataille,M.,等，NucleicAcids.Res.32:ell2(2004))使用接頭對的上鏈進行PCR。將接頭稍加修飾，以使其與用HpyCh4-IV消化的DNA連接時產(chǎn)生Mhil位點。所述接頭如下CTAGGAGCTGGCAGATCGTACATTGACGGCATGTAACTGCGC圖2顯示此類擴增的代表性實例，并顯示PCR產(chǎn)物易于檢測。為證明擴增是特異性的且是接頭介導(dǎo)的，使用標(biāo)準(zhǔn)TA克隆方案克隆PCR產(chǎn)物。挑取十個隨機克隆并測序，在10例中有9例的序列顯示，接頭銜接子的每個末端均與正確的HypCH4-N位點連接。該實驗提供了接頭連接物PCR可用于從血漿來源DNA中擴增的有力證據(jù)。圖2下圖的檢驗顯示，由此方案產(chǎn)生的接頭介導(dǎo)PCR產(chǎn)物根據(jù)在母體血采集過程中是否使用甲醛而截然不同的。僅顯示了兩個實例，但該結(jié)果在12個獨立采集的樣品中是一致的。在甲醛存在下采集血液時所見的梯狀帶很容易使人想到細胞凋亡梯狀帶，提示曱醛有利于細胞凋亡片段的擴增?？赡軐⒌鞍踪|(zhì)固定至DNA會產(chǎn)生用限制性內(nèi)切酶無法消化的DNA,或者梯狀帶可能只是代表PCR產(chǎn)物復(fù)雜度的顯著降低。因此，母體血釆集優(yōu)選不涉及甲醛。這種看法與最近的出版物相一致，其反駁了甲醛提高胎兒DNA比例的觀點。Chinnapapagari,S.K.，等,Clin.Chem.51:652-5(2005)。實施例2:證實滋養(yǎng)層/胎兒DNA的甲基化特異性擴增為了顯示滋養(yǎng)層/胎兒DNA與全血DNA之間的差異甲基化，通過使用稀有切割富含AT的酶得到高度降低的復(fù)雜度是有益的。因此，使用AclI制備滋養(yǎng)層/胎兒DNA和全血DNA樣品中的擴增代表。滋養(yǎng)層/胎兒DNA樣品來自選擇性終止的妊娠前三個月的56至80天，從正常成年志愿者制備所有全血DNA。所有擴增均根據(jù)已公開方案進行。見Guillaud-Bataille，M.，等，NucleicAcids.Res.32:ell2(2004)。簡言之，用推薦緩沖液中過量的Acll消化0.5ug基因組DNA。25ng該DNA用于連接至接頭/銜接子對。連接后，將2.5ng連接的DNA用作PCR模板。14個循環(huán)后，將1/10體積的產(chǎn)物用作第二輪PCR模板，使用相同引物再進行10個循環(huán)。此時，將產(chǎn)物展示于微型膠上(見圖3)。與差異曱基化的預(yù)測一致，來自滋養(yǎng)PCR產(chǎn)物。將泳動于~500至l，OOObp之間的條帶從膠上切下，用Mlul消化來除去接頭/銜接子并連接至Mlul消化的克隆載體上。將接頭/銜接子設(shè)計成使得與Acll突出端的連接產(chǎn)生Mlul位點。將這些連接物轉(zhuǎn)化至細菌中，以產(chǎn)生來自滋養(yǎng)層/胎兒起始DNA和全血起始DNA的擴增Acll片段的微型文庫。在克隆時，滋養(yǎng)層/胎兒代表始終產(chǎn)生至少兩倍的集落，使得與最優(yōu)全血文庫約3,000個重組體相比，最優(yōu)滋養(yǎng)層/胎兒微型文庫包含約8,000個重組體。從滋養(yǎng)層/胎兒文庫挑取三十五個隨機克隆并將其插入片段測序。用UCSC瀏覽器進行的分析顯示，除四條序列外所有序列均對應(yīng)于預(yù)計的長度少于1kb的Acll片段，說明消化、接頭連接和擴增步驟均如預(yù)計發(fā)生。應(yīng)當(dāng)指出，該克隆方法強烈選擇排除非預(yù)期擴增產(chǎn)物，因為Mlul位點僅在將接頭連接至Acll突出端時產(chǎn)生。當(dāng)嘗試?yán)肨A克隆方法克隆PCR產(chǎn)物時，克隆效率低下，且很大一部分克隆反映了非特異擴增產(chǎn)物。因此可以推斷，由接頭介導(dǎo)的擴增所產(chǎn)生的相當(dāng)一部分DNA量是非特異性的。設(shè)計總計30組特異性PCR引物對，對擴增Acll片段的亞區(qū)段進行擴增。然后使用全血DNA和滋養(yǎng)層/胎兒DNA的擴增Acll代表作為模板進行PCR。對于這些實驗，將上述"第二輪"代表稀釋1至10倍并用作每組特異引物組的模板，并在一組標(biāo)準(zhǔn)條件下進行20個循環(huán)的擴增。通過從6個滋養(yǎng)層/胎兒和6個全血代表的組中進行擴增來進一步檢測從滋養(yǎng)層/胎兒代表中擴增而不從全血代表中擴增的引物組(見圖4)。其中，10組被證明為滋養(yǎng)層/胎兒"特異性"，其含義為所有6個滋養(yǎng)層/胎兒代表均產(chǎn)生明顯可見的產(chǎn)物，而相同條件下6個全血代表均未產(chǎn)生產(chǎn)物。這對應(yīng)于有10/30或33%的概率使得隨機選擇的擴增Acll限制性片段僅在起始DNA來自滋養(yǎng)層/胎兒時存在。這與對滋養(yǎng)層/胎兒DNA的整體低甲基化程度的估計(上文)是一致的。在其余20組引物中，10組從滋養(yǎng)層/胎兒和血液代表中同樣地擴增，另外10組給出不一致的結(jié)果。當(dāng)用于從某些Acll代表中擴增時擴增了預(yù)計的產(chǎn)物，而在其它一些情況下則沒有。這些結(jié)果提示l)在相關(guān)Acll位點上有甲基化的極端變異；2)常見SNP改變了某些Acll位點；或者3)SNP的存在影響了PCR效率。事實上，鑒定了SNP改變AclI位點的幾個實例以及SNP影響PCR效率的實例。這種類型的序列變異是預(yù)料之中的，且不改變一大部分隨機挑選的Acll擴增子具有相對的滋養(yǎng)層/胎兒特異性的結(jié)論。更受關(guān)注的是觀察到某些引物組從滋養(yǎng)層/胎兒代表中擴增到強條帶，而從全血代表中擴增到弱得多的條帶。見圖4中從上方起第3圖的弱條帶。此外，當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)從20增加至30時，幾乎所有引物組均從全血代表中擴增到可見條帶(未顯示)。因為本發(fā)明的目的是特異性擴增與其他DNA混合的滋養(yǎng)層/胎兒DNA，所以非滋養(yǎng)層/胎兒DNA的"滲漏"擴增會產(chǎn)生問題。在狹窄的線性范圍內(nèi)，人們可以預(yù)計，3-4個PCR循環(huán)對應(yīng)于10倍的擴增，檢測閾值上3-4個循環(huán)的差異對應(yīng)于模板量上一倍對數(shù)倍數(shù)的差異。當(dāng)滋養(yǎng)層/胎兒DNA代表混合物中1%的DNA時，為了檢測滋養(yǎng)層/胎兒DNA,6-8個PCR循環(huán)的差異性擴增是必需的。在10組滋養(yǎng)層/胎兒"特異性"引物組中，僅1或2組達到此嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。考慮了從全血代表中微弱擴增的三種可能原因。首先，仍存在于擴增代表中的少量起始基因組DNA可提供足夠的模板來獲得微量產(chǎn)物。經(jīng)計算，在2.5ng起始基因組DNA中僅幾皮克存在于稀釋的代表中，使得其不太可能是20個PCR循環(huán)后微弱擴增條帶的來源。然而，這可假定解釋30個循環(huán)之后的擴增。其次，許多CpG位點上曱基化可能是不完全的。高度但不完全甲基化的位點會產(chǎn)生代表，其中相應(yīng)限制片段以低但可檢測到的水平存在。顯然，這種解釋在極端情況下可能有效。此時許多位點可能為99%甲基化而其它位點為99.9%甲基化。全血擴增子中微弱擴增的第三個解釋是上述代表形成過程中的非特異性擴增。變性、重退火和與含大量重復(fù)序列的復(fù)雜基因組DNA進行引物延伸的過程當(dāng)然會產(chǎn)生大量非預(yù)期產(chǎn)物。為確定這三種可能中哪一種是全血DNA"滲漏"擴增的原因，設(shè)計了代表性擴增的替代方案。實施例3:核酸酶消化后環(huán)狀分子的等溫擴增為克服實施例2中討論的滲漏擴增問題，本發(fā)明人試圖開發(fā)一種方便的擴增方法，它像克隆一樣將強烈地選擇真正的限制性片段且去除非特異性擴增產(chǎn)物。為此，用AclI消化基因組DNA并如上文所述制備接頭連接物。用接頭引物擴增12個循環(huán)后，用Mlul(其可切下接頭)消化產(chǎn)物，通過柱純化去除低分子量(接頭和引物)DNA，在1X連接緩沖液中稀釋至0.5ml(以產(chǎn)生非常稀的溶液)并用T4DNA連接酶處理過夜。其中的原理如下。PCR的最初12個循環(huán)產(chǎn)生Acll片段選定大小的代表以及不想要的非特異性產(chǎn)物。通過消化和連接非常稀的溶液，非常有利于具有相容粘末端的分子進行分子內(nèi)自身連接(環(huán)化)。已解鏈并部分重退火12次的最初起始DNA進行消化及環(huán)化的效率極低。缺少合適末端的非特異性擴增產(chǎn)物也不太可能形成共價閉合的環(huán)。沉淀后，用核酸酶Bal-31通過充分消化來處理連接混合物，Bal-31是攻擊單鏈和雙鏈DNA末端的外切核酸酶。通過連接形成的環(huán)狀分子對消化有抗性，但充分消化將把線性分子降至單核苷酸。預(yù)計這會去除起始基因組DNA及非特異性擴增產(chǎn)物。然后將核酸酶處理的連接物作為模板，使用商品化試劑盒(Amersham)按制造商的說明進行等溫滾環(huán)擴增。這導(dǎo)致約10，000倍的擴增，其不涉及解鏈和重退夂。Dean，F(xiàn).B.，等,GenomeRes.11:1095-9(2001)。在該方法最后，將所得DNA稀釋并作為模板，用上述滋養(yǎng)層/胎兒"特異性"引物對進行PCR。該分析(最初30組中)產(chǎn)生共5組引物組，使用所述引物組在22個循環(huán)時可從滋養(yǎng)層/胎兒代表中明顯檢測到PCR產(chǎn)物，而在多達35個循環(huán)時在全血代表中也不產(chǎn)生可見產(chǎn)物。成功及失敗的實例均示于圖5。PCR檢測閾值上13個循環(huán)的差異對應(yīng)于起始模板至少1000倍的差異，預(yù)計這些擴增子在滋養(yǎng)層/胎兒組分僅為1%的DNA混合物中也應(yīng)該易于檢測到。本發(fā)明人推斷，常規(guī)的接頭介導(dǎo)擴增中非特異性擴增是"滲漏"或背景的主要來源，核酸酶/等溫擴增方案顯著地改善了這一情況。此外，許多基因組位點上也很可能存在不完全曱基化，這降低了強曱基化特異性擴增子的總數(shù)。實施例4:擴增混合的滋養(yǎng)層/胎兒及全血樣品為了測試是否有可能特異性擴增混合DNA樣品中的滋養(yǎng)層/胎兒組分，鑒定了包含改變BanII位點的常見單核苷酸多態(tài)性("SNP")的滋養(yǎng)層/胎兒特異性Acll擴增子。將上文所用六份滋養(yǎng)層/胎兒測試DNA和六份全血測試DNA對該SNP進行基因分型，發(fā)現(xiàn)在該基因座具有獨特基因型的全血/滋養(yǎng)層/胎兒對之后，制備基因組DNA的10:1和20:1混合物。這些混合物中DNA的絕對量為25ng,意味著在20:1混合物中滋養(yǎng)層/胎兒組分僅為~100Pg，因此少于10ml血漿樣品中所存在的胎兒組分。如上述制備甲基化敏感性代表，并然后將稀釋的代表用作模板進行PCR。通過限制酶切消化及直接測序來分析產(chǎn)物(圖6)。在該測定的靈敏度范圍內(nèi)，沒有全血組分?jǐn)U增的跡象。為進一步證實選擇性擴增DNA混合物中滋養(yǎng)層/胎兒組分的能力，本發(fā)明人使用簡單序列重復(fù)("simplesequencerepeat,SSR")多態(tài)性。除了比SNP信息量更大以外(雜合性遠高于50°/。)，通過用自動測序儀測量相對峰高或面積，SSR還提供容易地評估在相同DNA樣品中等位基因擴增的相對程度的可能性。為尋找含有潛在多態(tài)SSR的Acll擴增子，用Mlul消化來自滋養(yǎng)層/胎兒微型文庫(上文)的質(zhì)粒DNA并將新接頭連接至片段末端。使用由(CA)H)組成的引物以及對應(yīng)接頭"下"鏈的引物來進行PCR。預(yù)計該方法擴增Acll片段中含有CA重復(fù)的部分?？寺CR產(chǎn)物并挑取隨機集落進行測序。在15條這樣的序列中，全部都對應(yīng)于預(yù)計的小于1Kb長的Acll片段，五條含有長度足以包含潛在多態(tài)性的CA重復(fù)。合成CA重復(fù)側(cè)翼的特異性引物并用于對擴增代表進行PCR，五對中有三對顯示為滋養(yǎng)層/胎兒特異性的。十二份測試DNA中的十份在這些CA長度之一上顯示具有雜合變異，選擇具有不同基因型的一對DNA(滋養(yǎng)層/胎兒和全血)用于產(chǎn)生分別由10:1和20:1的全血DNA和滋養(yǎng)層/胎兒DNA組成的測試混合物。然后用混合基因組DNA制備甲基化敏感性代表，然后將這些代表的稀釋物作為模板，用多態(tài)性的引物進行PCR。圖7顯示兩種起始DNA中每種DNA的PCR產(chǎn)物以及從20:1混合物中擴增的PCR產(chǎn)物。顯然，這種甲基化敏感性擴增子從滋養(yǎng)層/胎兒DNA中的擴增比從全血中的擴增至少高效20倍。這些實驗結(jié)果證明，用本發(fā)明的方法，滋養(yǎng)層/胎兒DNA的偏好性擴增是可能的。實施例5:用于大規(guī)模鑒定滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子的微陣列分析開發(fā)滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子文庫是通往下述非整倍性測試的第一步。定制寡核苷酸微陣列的比較雜交目前已經(jīng)是常規(guī)且商品化的技術(shù)，廣泛用于評估基因組拷貝數(shù)的差異。同一技術(shù)提供了用于大規(guī)模鑒定滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子的理想方法。為實現(xiàn)此目的，將分別制備自滋養(yǎng)層/胎兒DNA和全血DNA的甲基化敏感性代表用不同的熒光染料進行標(biāo)記，并與寡核苷酸陣列(其對應(yīng)于給定甲基化敏感性酶的預(yù)計限制性片段)進行比較雜交。與用于拷貝數(shù)變化的微陣列雜交不同(其中雜交水平上的差異非常微小)，鑒定僅與滋養(yǎng)層/胎兒探針雜交的寡核苷酸(陣列地址)，其反映在來自血液的DNA中相應(yīng)限制性位點的消化為0或接近于0。通過使用來自多種不同滋養(yǎng)層/胎兒樣品的探針進行這樣的微陣列分析，鑒定了始終顯示高度差異擴增的那些擴增子，用于提供定位于靶染色體上的大量滋養(yǎng)層/胎兒特異擴增子的目錄。限制性內(nèi)切酶的選擇在目的為證實滋養(yǎng)層/胎兒特異擴增子存在的上述研究中，有意使用了導(dǎo)致擴增代表的復(fù)雜度顯著降低的稀有切割酶。為了將來產(chǎn)前診斷的目的，對靶染色體13、18、21、X和Y中的每條染色體獲得幾百個滋養(yǎng)層/胎兒特異擴增子，并且，由f血漿來源DNA的平均分子量低，因此著眼于短區(qū)段上。顯然，諸如Acll的酶所產(chǎn)生的片段對于此目的而言太少，因此使用用于微陣列分析的切割更頻繁的酶。酶HpyCh4-IV對產(chǎn)生微陣列實驗所用代表而言是理想的。該酶是識別序列(其為ACGT)符合在除中心CpG之外的位置上具有A或T這一標(biāo)準(zhǔn)的唯一市售酶。在A、C、G和T比例均衡的基因組中，HpyCh4-IV位點應(yīng)比Acll位點多16倍，相應(yīng)地，這對于21號染色體將預(yù)計有2400個長度為100至1500bp的片段。實際上，預(yù)計21號染色體上大小為100-1500的HpyCh4-IV片段真實數(shù)目為17,152個，這反映出與富含AT序列相關(guān)的CpG二核普酸的分布極不均勻。如果假定滋養(yǎng)層/胎兒DNA上80%的位點被甲基化封閉，則可估計21號染色體上乾標(biāo)大小范圍內(nèi)片段的真實數(shù)目為2-3000。如果15°/。為滋養(yǎng)層/胎兒特異性，則預(yù)計有300-450個此類擴增子。陣列構(gòu)建目前的技術(shù)允許生產(chǎn)含380，000種不同寡聚物的陣列，足以在單次實驗中評估整個基因組中所有HpyCh4-IV片段的一半以上。然而，對10份樣品對進行這樣的分析將需要最少20個這樣的陣列，因此將非常昂貴。作為節(jié)約費用的替代方案，在同一"芯片"上合成這樣的陣列形式，其中提供4個相同的陣列，每個由98，000種寡聚物組成。單個該類型的"芯片"允許4次雜交，足以進行2次顏色互換的一式二份雜交。98,000種寡聚物提供的空間足以一式二份地用每種寡聚物檢索4條相關(guān)染色體(13、18、21和X)中每條上的12，000個片段。12,000足以代表位于21號染色體上的大部分100-1500bp片段，相應(yīng)地，預(yù)計每條染色體產(chǎn)生幾百個滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子。由于所有Y區(qū)段均為胎兒特異性，故陣列中僅呈現(xiàn)1000個Y區(qū)段。預(yù)計產(chǎn)生~200個Y染色體擴增子，這應(yīng)該足夠了。寡核苷酸制備包含21號、18號、13號、X和Y染色體上長度為100至1,500bp的所有~17,000個預(yù)計HpyCh4-IV片段的序列的數(shù)據(jù)庫。然后將這些文件用于探針設(shè)計和陣列合成。由于血漿DNA具有低分子量，因此陣列中將呈現(xiàn)最大的可能短片段數(shù)。因為小于400bp的片段中約50。/。將不具有用于寡核苷酸設(shè)計的合適序列，因此這將保留約2，500個呈現(xiàn)于陣列中。所有陣列還包含一系列陰性對照寡核苷酸。滋養(yǎng)層/胎兒樣品如上文討論的，由于以下兩點考慮而使用了妊娠前三個月的滋養(yǎng)層/胎兒DNA:1)滋養(yǎng)層/胎兒DNA與其它DNA之間甲基化的差異在妊娠早期更為明顯；和2)妊娠前三個月的診斷方法是理想的。使用同一邏輯，使用從來源于56-84天妊娠的滋養(yǎng)層/胎兒中擴增的代表進行微陣列雜交?？梢詮倪x擇性終止妊娠中收集這些樣品，并通過常規(guī)的蛋白酶-K消化和其后的苯酚/氯仿提取來制備DNA。非滋養(yǎng)層/胎兒樣品合并10份隨機選取的女性樣品，而不是試圖選擇合適的個體全血DNA樣品。通過合并血液來源的DNA,產(chǎn)生了具有平均甲基化鐠的單個代表。推測污染宮頸所得樣品的母體DNA來源于宮頸上皮，因此與來自皮膚成纖維細胞的DNA相似。還沒有比較血液來源DNA和皮膚來源DNA中甲基化的系統(tǒng)研究，但沒有理由相信它們在這方面存在差異。過去進行了將含有甲基化敏感消化物的Southern印跡與超過20種不同探針雜交的基因作圖實驗，沒有發(fā)現(xiàn)血液DNA與成纖維細胞DNA間的差異。探針合成上述核酸酶/滾環(huán)擴增方案用于制備滋養(yǎng)層/胎兒DNA和非滋養(yǎng)層/胎兒DNA的甲基化敏感性代表。用過量的HpyCh4-IV消化0.5ug每種基因組DNA。將25ng消化產(chǎn)物與接頭對連接，并將1/10的連接物用于進行12個循環(huán)的PCR。在使用Acll消化物的以上實例中，接頭與片段末端的同型連接產(chǎn)生Mlul位點(ACGCGT)，使用在A后面切割產(chǎn)生CGT的HpyCh4-IV時獲得了相同的結(jié)果。12個PCR循環(huán)后，將所得產(chǎn)物用Mlul消化并如上進行環(huán)化。連接后，用核酸酶Bal-31消化剩余的線性DNA，并在用SephadexG50柱進行緩沖液交換后使用市售試劑盒(AmershamBioscience)進行等溫滾環(huán)擴增。此時，在微型膠上檢測DNA，以確定是否存在合適產(chǎn)物。使用該方案的DNA產(chǎn)量一般為3到5ug，但由于僅有一部分環(huán)化PCR產(chǎn)物用于擴增，因此它可容易地擴大至更大的量。在經(jīng)熒光術(shù)定量并在微型膠上電泳MluI消化產(chǎn)物來確定質(zhì)量后，將DNA提供給陣列制造商，如NimbleGen，用于探針標(biāo)記和陣列雜交。微陣列數(shù)據(jù)的解釋處理原始數(shù)據(jù)是重要的第一步。評估每一陣列地址的信號強度(相對于對照寡聚物)。將證實為不可靠的點排除于分析之外。對于每一具有足夠信號的陣列地址，確定兩種信號(Cy3和Cy5)的強度比值。由于對數(shù)轉(zhuǎn)換的比例比簡單比例具有更好的統(tǒng)計學(xué)特性，因此所有比值均進行對數(shù)轉(zhuǎn)換(以2為底)。通過從陣列的每一個體值中減去整個陣列l(wèi)og2中位數(shù)來對陣列數(shù)據(jù)進行歸一化。由于每一寡聚物均以一式兩份存在，因此將一式二份地址的歸一化比值進行平均，并將這些均值與同一一式二份地址上相應(yīng)的顏色互換平均比值進行平均。因此，每一區(qū)段的最終值是基于四次雜交及其相應(yīng)的10g2平均值。用現(xiàn)有軟件包可容易地實現(xiàn)該分析。對在滋養(yǎng)層/胎兒代表中存在但在全血代表中不存在或幾乎不存在的擴增子進行定位與在典型基因組比較實驗(其中尋找基因組連續(xù)的陣列地址上雜交比例的微小差異)中的定位十分不同。來自Lucito等,GenomeRes.13;2291-305(2003)的數(shù)據(jù)提供了數(shù)據(jù)將可能如何出現(xiàn)的例子。8。這些作者進行了與含10,000條對應(yīng)于BglII片段的寡核苷酸玻片陣列的比較雜交。一個雜交探針由基因組DNA的"完整"BglII代表組成，另一個由相似的代表組成，只是DNA還用HindIII進行了消化，這在很大程度上去除了所有含內(nèi)在HindIII位點的片段。這產(chǎn)生與本發(fā)明相似的情形，其中一種代表包含另一代表中基本不存在的要素。如圖中所示，logw平均比值信號從O變化至遠超過l，反映許多區(qū)段強度上>10倍的差異。本發(fā)明陣列的結(jié)果將與此相似，但是由于探針擴增方法比這些作者使用的方法產(chǎn)生更少的非特異擴增，因此可能會觀察到，1og^平均比值大于1的地址的比例更高。認為具有10倍或更大平均比值的地址是"滋養(yǎng)層/胎兒特異性"的。顯然，具有最高平均比值的地址是最理想的。對每一雜交的分析產(chǎn)生信號滿足此標(biāo)準(zhǔn)的探針地址列表，IO次計劃雜交的配對比較獲得在樣品中一致最后地址列表，提供了五條相關(guān)染色體上滋養(yǎng)層/胎兒特異性HpyCh4-IV擴增子的期望目錄。實施例6:從母體血漿DNA和宮頸DNA中擴增胎兒特異的多態(tài)性擴增胎兒多態(tài)性也是非侵入性非整倍性檢測的一種可能途徑。已顯示STR多態(tài)性的QF-PCR在傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷中對非整倍性的快速診斷是非常成功(Nicolini等,Hum.Reprod.Update10:541-48(2004))的，并且其可適應(yīng)于使用曱基化敏感性代表。因此，鑒定了位于實施例5中所定義曱基化特異性擴增子上的有用多態(tài)性，并檢測了宮頸DNA和血漿DNA樣品中這些多態(tài)性的胎兒等位基因。發(fā)現(xiàn)有用的多態(tài)性28就遺傳作圖的目的而言，SNP已成為最有用和最豐富的多態(tài)性類型。盡管公眾域數(shù)據(jù)庫中有數(shù)百萬SNP,且有大量用于SNP的測定方法，但它們在非整倍性檢測中的用途存在比STR多態(tài)性更大的挑戰(zhàn)。它們不僅多態(tài)性更低，而且使用它們進行非整倍性測試的方法(Pont-Kingdon，G.等，Clin.Chem49:1087-94(2003))依賴于等位基因的等同擴增，這在曱基化敏感性代表的情況下可能是不現(xiàn)實的。鑒于這一點，鑒定了位于甲基化特異性擴增子上的有用STR。為了證明對位于曱基化特異性擴增子上的STR進行定位的可行性，在21號染色體上檢索含有簡單序列潛在多態(tài)性的HpyCh4-IV片段。在~17,000個預(yù)計的片段中，近400個含有可能具有多態(tài)性的STR。見表l。表l:潛在的21號染色體多態(tài)性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>上文實施例5中描述的陣列包含對應(yīng)盡于可能多的這些STR的寡聚物，從而提高了在甲基化特異性擴增子中發(fā)現(xiàn)潛在多態(tài)性位點的機率。考慮到約15%的片段很可能為高度甲基化特異性，在21號染色體上鑒定了高達60個潛在多態(tài)性的滋養(yǎng)層/胎兒特異擴增子。因為它們通常產(chǎn)生更易解釋的PCR產(chǎn)物，所以使用了三核苷酸和四核苷酸的重復(fù)。設(shè)計了靶定多態(tài)性側(cè)翼的引物對。用熒光染料標(biāo)記兩種引物之一，用于在自動測序儀上進行簡單的片段長度分析，并對IO份隨機基因組DNA樣品進行PCR。用此方法顯示了具有合理雜合性的標(biāo)記物，并進一步測試有前途的候選標(biāo)記物。擴增混合DNA樣品的測試將現(xiàn)有的滋養(yǎng)層/胎兒和全血DNA樣品就上文鑒定的多態(tài)性進行基因分型，并制備具有不同基因型的混合樣品對。數(shù)據(jù)表明，在滋養(yǎng)層/胎兒組分占總起始DNA5%的混合物中檢測滋養(yǎng)層/胎兒基因型是可行的，所以我們先測試20:1的混合物，再用50:1和100:1的比例進行測試分析。測試胎兒特異性擴增將鑒定到的在上文測試中運行良好的多態(tài)性用于測試能否從母體樣品中擴增胎兒等位基因。為此，從每種母體血漿樣品和/或?qū)m頸灌洗樣品中獲得母體和胎兒DNA樣品。對于妊娠中的血漿樣品，從CVS樣品中獲得胎兒DNA，對于灌洗樣品，則從終止樣品中獲得。對于有母血樣品但無直接的胎兒樣品的情況，母體樣品的可用性將允許鑒定胎兒特異性等位基因。使用熒光PCR將母本和胎兒(或父本)樣品就這些多態(tài)性進行基因分型。在已獲得的5-10個基因座中，很可能有一個或兩個基因座將對于幾乎所有妊娠都具有信息性。選擇預(yù)計允許進行胎兒等位基因明確鑒定的樣品。鑒定到合適的樣品之后，如上所述制備混合胎兒/母體樣品(宮頸的或血漿的)的甲基化敏感性代表。因為血漿DNA的大小選擇似乎顯著富集胎兒DNA(Li等Clin.Chem.50:1002-11(2004))，如下進行大小選擇。經(jīng)最初消化、接頭連接和12個循環(huán)擴增后，將PCR產(chǎn)物上樣到2%瓊脂糖微型膠中。切下含有100至400片段的膠條，用于后續(xù)的Mlul消化、環(huán)化和等溫擴增步驟。該方案具有與對DNA直接進行大小選擇相同的優(yōu)點。對于宮頸灌洗液，制備(根據(jù)以上方案獲得的)得自灌洗樣品的全細胞沉淀的樣品，并用于甲基化敏感性擴增。將擴增產(chǎn)物用作模板來擴增信息性多態(tài)性，片段分析揭示是否可擴增胎兒特異性等位基因。檢測非整倍性在開始可用時即獲得來自具有高嫌疑21三體的妊娠的樣品。如上述從這些樣品中制備甲基化敏感性擴增的代表。使用如上文討論用于大小選擇的相同方法。就滋養(yǎng)層/胎兒特異性21號染色體標(biāo)記物的模式確定了真實胎兒基因型后(使用來自CVS或終止期的DNA)，在擴增代表上進行同一組PCR。實施例7:甲基化特異性代表用于微陣列比較基因組雜交("comparativegenomehybridization,CGH")的用途總則寡核苷酸陣列的比較雜交能檢測微小的基因組缺失和重復(fù)(Sebat等2004;Jobanputra等2005;Selzer等2005)。利用該技術(shù)檢測在細胞遺傳學(xué)上可見的缺失和全染色體非整倍性是相對簡單的。從歷史上看，該:技術(shù)成功的關(guān)鍵因素是這一事實，即擴增代表降低了探針的復(fù)雜度，使得事實上與靶標(biāo)寡核苷酸同源的比例高得多。最近，探針標(biāo)記技術(shù)的改進已使得在寡核普酸微陣列上直接使用標(biāo)記的全基因組探針成為可能。若干研究小組已報道了該技術(shù)用于檢測小的單個拷貝數(shù)變化的用途，證明高度復(fù)雜的探針通常是成功的(Brennan等2004;Selzer等2005;Hinds等2006)。因此，甲基化特異性代表與對應(yīng)于滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子的寡核苷酸陣列的比較雜交可用于檢測胎兒的非整倍性。在該方案中，從來自上述孕婦血漿或?qū)m頸樣品的DNA樣品中制備甲基化敏感性代表。接著將來自兩個不同個體(一個是正常對照，另一個核型未知)的擴增代表用作實施例5中所定義滋養(yǎng)層/胎兒特異性寡核苷酸靶標(biāo)組的比較雜交探針。如果兩種妊娠均具有正常核型(并且是相同性別)，那么預(yù)計在該陣列中對全部5條染色體均顯示相似的平衡雜交信號。如果兩種妊娠中一種具有全染色體非整倍性(例如21三體)，那么與其它4條染色體相比，預(yù)計代表該染色體的寡聚物組顯示出兩種熒光染料信號的整體相對不平衡性。胎兒性別將由來自性染色體探針組的信號的平均比值來反映。陣列中任何指定地址上信號不平衡的程度不需要很大，因為總共考慮來自代表該染色體的所有~100個地址的數(shù)據(jù)。決定該方案成功的主要參數(shù)是雜交探針中滋養(yǎng)層/胎兒特異性擴增子得到代表的程度。顯然，如果以純的胎兒DNA開始，那么利用該技術(shù)進行非整倍性的檢測將是輕而易舉的。同樣，如果以胎兒和母體DNA的等同混合物開始，則滋養(yǎng)層/胎兒序列的甲基化敏感性代表將遠超過50%的探針量，預(yù)計非整倍性的檢測將像以純的胎兒DNA開始一樣順利進行。該方案成功的容易程度顯然隨滋養(yǎng)層/胎兒DNA的比例減少而降低。鑒于這一點，下面考慮并討論了這樣的情況，其中起始DNA的1%來自滋養(yǎng)層/胎兒，99%來自母體。對此99:1混合物進行的甲基化敏感性擴增將產(chǎn)生兩個主要結(jié)果。首先，總體序列復(fù)雜度將降低~98%(見下文)；其次，將存在滋養(yǎng)層/胎兒特異性片段。就DNA的量而言，滋養(yǎng)層/胎兒來源的組分(特異性和非特異性)將仍然僅占全部的約1,5-2%。就滋養(yǎng)層/胎兒DNA低甲基化的程度而言，其擴增效率和比例提高了，但是這一效率是微小的，因為數(shù)據(jù)表明，滋養(yǎng)層/胎兒代表中不超過30%的片段是滋養(yǎng)層/胎兒特異性的。僅代表探針混合物中2。/。DNA總量的雜交探針能提供可靠的信號嗎？這取決于探針混合物的總體復(fù)雜度。為了計算通過我們的曱基化敏感性方法所產(chǎn)生探針的近似復(fù)雜度，認為由~49MbDNA組成的21號染色體包含17,000個大小為100-1500bp的HpyCh4-IV片段。甲基化將阻斷這些片段中80-卯％的擴增，使得擴增片段的總數(shù)為1,700-3,400。由于這些片段的平均大小為~500bp，因此總體擴增復(fù)雜度為約0.85-1.7xl06,或總起始序列的約1.5-3%.與基因組DNA相比，這對應(yīng)于復(fù)雜度約97-98%的降低。預(yù)計從包含1%滋養(yǎng)層/胎兒DNA的DNA樣品中產(chǎn)生的雜交探針中僅含有~2%的滋養(yǎng)層/胎兒組分，但是，因為總體復(fù)雜度降低了98%,所以滋養(yǎng)層/胎兒特異性探針的有效濃度與全基因組探針中任何給定區(qū)段的濃度相似。因此，預(yù)計來自DNA甲信號，所述DNA至少1。/。來自滋養(yǎng)層/胎兒DNA。顯然，更高的滋養(yǎng)層/胎兒DNA起始比例將成比例地提供更強的信號。實驗設(shè)計陣列實施例5討論了來自5條相關(guān)染色體的滋養(yǎng)層/胎兒特異擴增子的寡核苷酸探針。如上文所述，估計此類擴增子的數(shù)量將為每條染色體約200或總計約IOOO個。可以使用任何陣列。例如，可以^使用將常規(guī)合成的寡聚物固定在載玻片上的陣列。已經(jīng)描述了在載玻片上產(chǎn)生寡核苷酸陣列的許多方法。(Guo等NucleicAcidsRes22:5456-65(1994);Zammatteo等AnalBiochem280:143-50(2000);Kimura等NucleicAcidsRes32:e68(2004))。獲得了對應(yīng)于~1000個如實施例5測定的預(yù)計滋養(yǎng)層/胎兒特異性序列的寡核苷酸序列以及其中~500個常規(guī)合成的寡聚物(每條染色體~100個)。根據(jù)現(xiàn)有方案產(chǎn)生這些寡聚物的陣列。所有寡聚物均以一式兩份點樣，并且點樣具有相似預(yù)計Tm的非同源寡聚物作為陰性對照。作為陽性雜交對照，還包括了與滋養(yǎng)層/胎兒和外周血來源探針(來自實施例5)同樣持續(xù)雜交的每條染色體~10個擴增子。將在下述測試雜交中不能很好發(fā)揮功能的這些寡聚物從陣列中去除，并用可以更好發(fā)揮功能的其它寡聚物代替。用于陣列評估的雜交探針首先確定是否可以通過如上文所設(shè)想的比較雜交來獲得可靠的滋養(yǎng)層/胎兒特異性雜交信號。首先用這些陣列進行的雜交嘗試?yán)眉毎z傳學(xué)上正常的滋養(yǎng)層/胎兒和全血DNA的"人工"混合物，而不是實際母體樣品。首先，從3組單獨的滋養(yǎng)層/胎兒/血液DNA對中制備3種這樣的混合物(A、B和C),并且在所有3種都將使用l:l比例的兩種DNA。在3種中的每一種中，全血DNA來自女性，而兩種滋養(yǎng)層/胎兒樣品來自男性，第三種來自女性。然后根據(jù)如上相同的方案制備甲基化特異性代表。線性化并確定平均大小和濃度后，探針標(biāo)記將遵循現(xiàn)有方案。(Ushijima等ProcNatlAcadSciUSA94:2284-9(1997);Breiman等CancerRes64:4744-8(2004))。這些的關(guān)鍵是在Klenow延伸過程中使用直接標(biāo)記的隨機引物及標(biāo)記的dNTP。全部3種混合物(A、B和C)將在單獨的反應(yīng)中用Cy》和Cy5均進行標(biāo)記(共6種探針)，使得每組混合物可以與其自身及其它混合物進行比較雜交。從1:1混合物制備的探針應(yīng)該導(dǎo)致非常強的雜交信號，并且當(dāng)滋養(yǎng)層/胎兒DNA的比例降低時，信號強度將相應(yīng)地降低。對來自3種滋養(yǎng)層/胎兒/全血混合物的6種可能對(AA、AB、AC、BB、BC和CC)進行比較雜交，產(chǎn)生了關(guān)于該技術(shù)的可靠性和重復(fù)性的重要數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析像實施例5中那樣，通過測定相對于陽性和陰性雜交對照的信號強度以及復(fù)制一致性來評估原始陣列數(shù)據(jù)，排除不可靠的點。對于每一雜交，測定與每一陣列地址相關(guān)的平均信號比值。將比值進行1og2轉(zhuǎn)化，并通過從陣列的每一個體值中減去整個陣列的中位數(shù)log比值來進行歸一化。每一平均比值是基于四次雜交，因為以一式兩份點樣放置每一寡聚物，并且每一雜交均顏色互換地進行兩次。對于所有這些比較，三條常染色體的歸一化log比值集中在0左右，因為它們都是細胞遺傳學(xué)上正常的。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方差分析技術(shù)(analysisofvariance,"ANOVA")來獲得對利用細胞遺傳學(xué)上正常的樣品進行的雜交之間可見的變異程度。來自該分析的性染色體信號比值應(yīng)該是明顯的。檢測了男性對男性、女性對男性和女性對女性的所有三種可能性。如在所有這些情況下，當(dāng)XX與XY比較雜交時，應(yīng)該有~2:1的X來源信號是一種顏色，并且很明顯有另一種顏色的不同比例Y信號。在1:1比例的滋養(yǎng)層/胎兒DNA和全血DNA導(dǎo)致可靠雜交后，使用相同的DNA(但全血:滋養(yǎng)層/胎兒DNA的比例為10:1)進行同一組對照雜交。類似地，使用50:1混合物進行試驗。該試驗對測定胎兒DNA(其為必須通過該技術(shù)成功分析的樣品)的初始比例而言是很重要的。如果全血DNA與滋養(yǎng)層/胎兒DNA的比例為50:1在這種情況下是可用的，那么應(yīng)該有可能使用母體血漿和/或?qū)m頸樣品作為擴增代表的起始材料。非整倍性檢測來自上面實驗的數(shù)據(jù)允許使用甲基化特異性擴增來檢測非整倍性。為此，制備了比例為10:1和50:1的正常全血DNA與21三體滋養(yǎng)層/胎兒DNA的"人工"混合物。這些混合物用于產(chǎn)生具有Cy3和Cy5的甲基化特異性雜交探針，并且這些混合物與它們自身及上述3種細胞遺傳學(xué)上正常的混合物進行比較雜交。在21三體混合物與其自身的比較雜交中，21號染色體的平均比值與其它2條常染色體的平均比值相似，因為每一探針具有3個拷貝的21號染色體。當(dāng)21三體混合物與正常混合物進行比較雜交時，21號染色體的平均比值顯著不同于其它常染色體的平均比值，反映一種樣品中有3個拷貝的21號染色體，而另一樣品中有2個拷貝。為了使該分析定型，使用ANOVA比較所有3條常染色體的平均1og2比值。這提供了測試全部染色體的平均log比值都相同這一整體零假設(shè)(globalnullhypothesis)的能力，拒絕該零假設(shè)將暗示至少一條染色體具有不平衡性。通過在來自個體染色體與來自其它染色體的數(shù)據(jù)的10g2平均比值間進行配對比較，有可能確定哪條染色體提供不平衡信號。因為將檢測3種額外的假設(shè)，因此應(yīng)用Bonferroni校正。因此，將在0.05水平上檢測該整體零假設(shè)，如果被拒絕，則將在0.015水平上檢測染色體特異性配對假說。每條染色體具有約100個陣列地址，檢測非整倍性的能力很強。理論上，期望檢測對應(yīng)平均比值為1.5(在1og2尺度上為0.58)的任何拷貝數(shù)增加。然而經(jīng)驗顯示，由于數(shù)據(jù)中的噪音，3:2的拷貝數(shù)(如在三體性中)增加可對應(yīng)于低至1.15的實測比值(在log2尺度上為0.2)。功效分析表明，對于給定的配對比較，如果推測log2平均信號比值的標(biāo)準(zhǔn)差為0.1到0.2(典型值)并推測有0.01的1類錯誤率，則將具有高于~99.99%的功效來檢測0.2的拷貝數(shù)增加(1og2尺度上)。即使具有0.4的標(biāo)準(zhǔn)差(這將代表噪音很高、質(zhì)量很低的雜交)，檢測非整倍性的功效也為97%。測試實際的母本樣品來自所有上述雜交的數(shù)據(jù)允許測定獲得可靠雜交所必需的胎兒DNA比例并因此測定三體性，上述雜交比較已知正常及已知為三體性的DNA混合物。由于上文提到的所有原因，相信即使低比例的胎兒DNA(2-5%)也會成功。因此，如實施例6中，血漿和宮頸灌洗來源的DNA均用于進行分析，因為每一類型的樣品具有自己的優(yōu)勢和缺點。如實施例6中一樣從妊娠期(母體血液樣品)及選擇性終止病例中進行樣品收集。同樣，擴增代表的制備也是相同的。事實上，相同的擴增代表可以用于實施例6及本實施例中。使用樣品對進行比較雜交，所述樣品對通過常規(guī)細胞遺傳分析或通過QF-PCR確定具有正常的胎兒核型。在實踐中，在血漿DNA組及宮頸灌洗組中均使用四種這樣的妊娠樣品及兩種非妊娠對照，共產(chǎn)生12份樣品。配對比較對每組進行15次分析。實際雜交數(shù)為30，因為每一雜交均將染料互換進行。如上述對來自這些雜交的數(shù)據(jù)進行分析，這提供了幾條重要的信息可靠地獲得高于背景的信號的能力；信號強度的預(yù)計正常變異范圍；以及對于細胞遺傳學(xué)上正常的樣品而言染色體間log平均比值的比較是否正確地集中在0附近?？梢詮哪阁w樣品的甲基化敏感性擴增代表中獲得可靠的胎兒雜交信號，然后將其用于檢測非整倍性。如上討論，該嘗試以21三體開始，因為這是最相關(guān)且最易得到的。從宮頸和血漿樣品中制備探針，所述宮頸和血漿樣品得自已證實具有21三體妊娠的患者。將它們彼此之間進行比較雜交并與從正常病例中制備的探針進行比較雜交。完全像在上述實驗中那樣進行統(tǒng)計學(xué)分析。因為獲得了可靠的雜交，因此檢測非整倍性的能力非常高。除了產(chǎn)前診斷的可能性以外，本發(fā)明的方法可用于進一步了解生物學(xué)。例如，實施例5中討論的微陣列分析類型可用于檢測滋養(yǎng)層/胎兒甲基化的孕齡依賴性。初步觀察提示，隨著，的進程曱基化具有廣泛變化，但是不知道這種變化在胎盤基因表達或功能中可能具有怎樣的作用。同樣，對胎盤曱基化在疾病中的作用還沒有研究。除了本申請中所設(shè)想的這一功利目的以外，開發(fā)綜合評估滋養(yǎng)層/胎兒與來自其它來源的體細胞DNA之間甲基化差異的方法可能具有許多重要的生物學(xué)應(yīng)用。例如，可以尋找疾病狀態(tài)如先兆子癇、子宮內(nèi)胎兒生長限制(intrauterinefetalgrowthrestriction),葡萄胎:fe^和其它疾病中滋養(yǎng)層/胎兒甲基化的總體變化。最失敗、子宮內(nèi)生長限制、先兆子癇和其它疾病中對胎盤甲基化ii行系統(tǒng)性評估。權(quán)利要求1.用于從混合的胎兒和母體DNA樣品中選擇性擴增胎兒DNA的方法，其包括a)從混合的胎兒/母體DNA樣品中分離DNA；b)用甲基化特異性酶消化所述DNA；c)將消化的DNA與接頭連接；d)使消化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增，以獲得擴增的PCR產(chǎn)物；e)從擴增產(chǎn)物中去除接頭和引物DNA；f)使所擴增的PCR產(chǎn)物環(huán)化；g)使環(huán)化的PCR產(chǎn)物進行外切核酸酶消化，以將任何未環(huán)化的DNA降至單核苷酸；和h)使來自步驟g的產(chǎn)物進行等溫滾環(huán)擴增，以選擇性擴增胎兒DNA，從而產(chǎn)生來自胎兒DNA的甲基化敏感性代表。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲基化特異性酶是HpyChlV-4、Clal、AclI或BstBI。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述接頭介導(dǎo)的PCR擴增進行12個循環(huán)。4.權(quán)利要求1的方法，其中外切核酸酶消化利用Bal-31來進行。5.用于鑒定胎兒特異性擴增子的方法，其包括a)使用權(quán)利要求1的方法從胎兒DNA和全血DNA中分別制備甲基化敏感性代表；b)標(biāo)記胎兒DNA和全血DNA，以產(chǎn)生標(biāo)記的胎兒DNA探針和標(biāo)記的全血DNA探針；c)將標(biāo)記的DNA探針與兩個相同的寡核普酸陣列進行雜交，其中所述核苷酸陣列對應(yīng)于給定甲基化敏感性酶的預(yù)計限制性片段；d)將兩個陣列相互比較，以定位僅與胎兒DNA探針雜交的寡核苷酸；e)將來自步驟d的雜交寡核苷酸鑒定為胎兒特異性擴增子。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述胎兒DNA探針和所述全血DNA探針用兩種不同的標(biāo)記進行標(biāo)記，并且其中標(biāo)記的探針與一個陣列雜交。7.權(quán)利要求5的方法，其中用于步驟a的甲基化敏感性酶是HpyCh4-IV。8.權(quán)利要求5的方法，其中所述胎兒DNA在妊娠早期獲得。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述胎兒DNA在妊娠的約56-84天獲得。10.通過權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的胎兒特異性擴增子文庫。11.包含權(quán)利要求10所述胎兒特異性擴增子文庫的陣列。12.用于確定胎兒和母體DNA的混合物中胎兒DNA預(yù)定基因座上的拷貝數(shù)與該預(yù)定基因座上正常拷貝數(shù)相比是減少還是增加的方法，其包括a)使用權(quán)利要求l的方法在測試樣品和對照樣品中選擇性擴增胎兒DNA的預(yù)定基因座，其中所述對照樣品在胎兒DNA的該預(yù)定基因座上具有正常的拷貝數(shù)；b)將測試樣品中擴增DNA的量與對照樣品中擴增DNA的量進行比較；和c)將擴增DNA量的減少與拷貝數(shù)的減少相關(guān)聯(lián)，或?qū)U增DNA量的增加與拷貝數(shù)的增加相關(guān)聯(lián)。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述比較包括將來自預(yù)定基因座的擴增DNA對在測試樣品和對照樣品中以相同拷貝數(shù)存在的對照基因座所擴增的DNA進行歸一化。14.用于確定測試樣品中預(yù)定基因座上的拷貝數(shù)與正?？截悢?shù)相比是減少還是增加的方法，所述方法包括a)使用權(quán)利要求l的方法在測試樣品和對照樣品中選擇性擴增胎兒DNA，其中所述對照樣品在預(yù)定基因座上具有正常的拷貝數(shù)；b)用標(biāo)記對來自步驟a的測試樣品DNA和對照樣品DNA進行標(biāo)記，以產(chǎn)生標(biāo)記的測試DNA探針和標(biāo)記的對照DNA探針；c)將標(biāo)記的測試DNA和標(biāo)記的對照DNA探針與權(quán)利要求11的胎3兒特異性擴增子陣列進行雜交；d)比較測試DNA探針和對照DNA探針間的雜交量，以測定信號強度；e)將信號強度與測試樣品中該預(yù)定基因座上拷貝數(shù)的增加或減少相關(guān)聯(lián)。15.權(quán)利要求14的方法，其中用兩種不同的探針對所述測試樣品DNA和所述對照樣品DNA進行標(biāo)記，并且其中對一個陣列進行所述雜交。全文摘要本發(fā)明提供從混合的胎兒-母體來源中選擇性擴增胎兒DNA序列的方法。該方法利用差異性甲基化來允許從包含高比例非滋養(yǎng)層/胎兒DNA的DNA混合物中選擇性擴增滋養(yǎng)層/胎兒特異性序列。本發(fā)明還提供使用擴增的胎兒DNA序列進行非整倍性檢測的方法。文檔編號C12N15/87GK101421410SQ200780013508公開日2009年4月29日申請日期2007年3月6日優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日發(fā)明者史蒂芬·布朗申請人:紐約市哥倫比亞大學(xué)托管會