專利名稱：能夠產(chǎn)生嘌呤物質(zhì)的細(xì)菌和用于產(chǎn)生嘌呤物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生。票呤衍生物質(zhì)的方法，所述噤呤衍生物質(zhì)如噪呤核
苷酸(其通常包括5'-肌苷酸和5'-鳥苷酸)和嘌呤核苷(如M^苷和鳥苷)，它們作 為合成嘌呤核苷酸的起始材料是重要的物質(zhì)，等等，以及用于所述方法的屬 于芽孢桿菌屬的細(xì)菌。噤呤衍生物質(zhì)用作調(diào)味品(seasoning)、藥物(drug)、它
們的原料等。
背景技術(shù)：
已知通過發(fā)酵來產(chǎn)生肌苷和鳥苷的方法，其使用芽孢桿菌屬CSa"7/us)細(xì) 菌的腺噪呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌抹和其進(jìn)一步被賦予對(duì)多種藥物(如噪呤類似物)的 抗性的衍生株(derivative)(專利文件1至8)，和短桿菌屬(genus BreWk/c&n'wm) 這樣的微生物(專利文件9和10、非專利文件l),等。
通常通過如下獲得這樣的突變菌抹用紫外照射或亞硝基胍(N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍)處理微生物，和使用合適的選擇培養(yǎng)基選擇目標(biāo)突變體。
此外，還使用遺傳工程技術(shù)在芽孢桿菌屬細(xì)菌(專利文件11至20)、短桿 菌屬細(xì)菌(專利文件21)和埃希氏菌屬(五"/zen'c/2^)細(xì)菌(專利文件22)中培育產(chǎn) 生。票呤衍生物質(zhì)的菌抹。具體地，例如，公開了用芽孢桿菌屬細(xì)菌有效地產(chǎn) 生核酸衍生化合物如次黃嘌呤(hypoxanthine)、尿嘧咬(uracil)、鳥噪呤(guanine) 和腺噪呤(adenine)的方法，所述細(xì)菌中將編碼嘌呤操縱子阻抑物的基因 破壞(專利文件23)。
在枯草芽孢桿菌(萬ac/〃w ^to'to)中，已知如上所述的噪呤操縱子阻抑物 調(diào)節(jié)，除嘌呤操縱子(purineoperon)的基因之外，/wM基因，其涉及AMP生 物合成(非專利文件2); g/j^4基因，其涉及曱酰四氫葉酸(formyltetrahydrofolic acid)生物合成(非專利文件3); p6wG基因，其編碼次黃嘌呤/鳥。票呤的轉(zhuǎn)運(yùn)物 (transporter)(非專利文件4);等。
此外，已公開了有效產(chǎn)生肌香的微生物和使用該微生物產(chǎn)生肌苷的方法， 所述微生物是通過除破壞pMW基因之外破壞琥珀酰-AMP合酶基因(/ MM)來賦予腺。票呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型，和通過破壞嘌呤核苷磷酸化酶基因(cfeoD)來抑制肌
苷分解成次黃嘌呤，從而衍生的(專利文件8)。
果糖二磷酸酶是糖異生酶(gluconeogenic enzyme)中的一種，其催化從果 糖-1,6-二磷酸產(chǎn)生果糖-6-磷酸的反應(yīng)。關(guān)于此酶和嘌呤衍生物質(zhì)的生物合成 途徑之間的關(guān)系只知曉很少，且已嘗試通過降低此酶的活性來培育產(chǎn)生嘌呤 衍生物質(zhì)的細(xì)菌。
專利文件1:特公昭(KOKOKU) No. 38-23099
專利文件2:特公昭No. 54-17033
專利文件3:特公昭No. 55-2956
專利文件4:特公昭No. 55-45199
專利文件5:特公昭No. 57-14160
專利文件6:特公昭No. 57-41915
專利文件7:特開昭(KOKAI) No. 59-42895
專利文件8:特開No. 2004-242610
專利文件9:特公昭No. 51-5075
專利文件10:特公昭No. 58-17592
專利文件11:特開昭No. 58-158197
專利文件12:特開昭No. 58-175493
專利文件13:特開昭No. 59-28470
專利文件14:特開昭No. 60-156388
專利文件15:特開平No. 1-27477
專利文件16:特開平No. 1-174385
專利文件17:特開平No. 3-58787
專利文件18:特開平No. 3-164185
專利文件19:特開平No. 5-84067
專利文件20:特開平No. 5-192164
專利文件21:特開昭No. 63-248394
專利文件22:國(guó)際專利公開WO99/03988
專利文件23:美國(guó)專利No. 6,284,495
非專利文件1: Agric. Biol. Chem" 1978， 42, 399-405非專利文件2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92， 7455-7459 非專利文件3: J. Bacteriol.， 2001, 183, 6175-6183 非專利文件4: J. Bacteriol.， 2003， 185， 5200-5209

發(fā)明內(nèi)容
待通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的目的
本發(fā)明的目的是構(gòu)建適用于發(fā)酵產(chǎn)生噤呤衍生物質(zhì)(如噪呤核苷和/或嘌 呤核普酸)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，和提供使用這樣的細(xì)菌產(chǎn)生噤呤衍生物質(zhì)的方
實(shí)現(xiàn)所述目的的手段
本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了多項(xiàng)研究以實(shí)現(xiàn)上述目的。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)如果 在芽孢桿菌屬細(xì)菌中減少糖異生途徑的果糖二磷酸酶的酶活性，則該細(xì)菌產(chǎn) 生噪呤核苷或噪呤核苷酸的能力得到改進(jìn)，并完成了本發(fā)明。
由此本發(fā)明提供如下。
(1) 屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力，其中所述 細(xì)菌已被修飾使得果糖二磷酸酶的酶活性減少。
(2) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中所述嘌呤衍生物質(zhì)是選自下 組的一種或多種噤呤核苷肌苷、黃苷、鳥苦和腺苷。
(3) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中所述嘌呤衍生物質(zhì)是選自下 組的一種或多種噪呤核苷酸肌苷酸、黃苷酸、烏芬酸和腺苷酸。
(4) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中通過破壞編碼果糖二磷酸酶 的基因或減少編碼果糖二磷酸酶的基因的表達(dá)量來減少所述果糖二磷酸酶活性。
(5) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中編碼果糖二磷酸酶的基因是 編碼下列(A)或(B)的蛋白質(zhì)的基因
(A) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
(B) 包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位并具有果糖二磷酸酶活性。
(6) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一步修飾使得磷酸核糖 焦石粦酸合成酶活性增加。(7) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一步修飾使得噤呤操縱 子的表達(dá)量增加。
(8) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中通過破壞/ z^ 基因來增加
噤呤操縱子的表達(dá)量，所述基因是編碼。票呤操縱子的阻抑物的基因。
(9) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一步修飾使得嘌呤核苷 磷酸化酶活性減少。
(10) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一步修飾使得IMP脫 氫酶活性減少。
(11) 如上所述的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其為枯草芽孢桿菌。
(12) 產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的屬于 芽孢桿菌屬的細(xì)菌以在細(xì)菌的細(xì)胞或培養(yǎng)基中引起嘌呤衍生物質(zhì)的積累，和 從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中收集所述。票呤衍生物質(zhì)。
(13) 如上所述的方法，其中所述噤呤衍生物質(zhì)是嘌呤核苷或噪呤核苷酸。
(14) 如上所述的方法，其中所述。票呤^i汙生物質(zhì)是選自下組的一種或多種 噤呤核苷肌苷、黃苦、鳥苷和腺苷。
(15) 如上所述的方法，其中所述噤呤衍生物質(zhì)是選自下組的一種或多種 嘌呤核苷酸肌苷酸、黃苷酸、鳥苷酸和腺苷酸。
(16) 產(chǎn)生噪呤核芬酸的方法，其包括通過如上所述的方法產(chǎn)生嘌呤核苷， 將所述嘌呤核苷與磷酸鹽供體，及樣么生物或酸性磷酸酶進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生嘌呤 核苷酸，所述磷酸鹽供體是選自下組的一種或多種聚磷酸(polyphosphoric acid)、磷酸苯酯(phenylphosphate)和氨曱酰石舞酸(carbamyl phosphate),所述《效 生物具有產(chǎn)生核苷-5'-磷酸酯的能力，和收集所述嘌呤核苷酸。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式 <1>本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌 (I)賦予產(chǎn)生。票呤衍生物質(zhì)的能力
在本發(fā)明中，短語"活性減少，，包括所述活性低于在未修飾的菌抹如野 生型芽孢桿菌屬細(xì)菌中的活性的狀態(tài)，和所述活性基本上消除的狀態(tài)。
本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌是具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力且已被修飾使 得果糖二磷酸酶的酶活性減少的芽孢桿菌屬細(xì)菌。
術(shù)語"噪呤衍生物質(zhì)"(purine-derived substance)指具有嘌呤骨架(purineskeleton)的物質(zhì)，且其實(shí)例包括噤呤核芬、噤呤核芬酸，等。噤呤核苷包括肌 苷、黃苷、鳥苷、腺苷等，而嘌呤核苷酸包括嘌呤核苷的5'-磷酸酯，例如， 肌芬酸(肌魯-5'-磷酸，此后也稱為"IMP")、黃苷酸(黃香-5'-磷酸，此后也稱為 "XMP")、鳥苷酸(鳥香-5'-單磷酸，此后也稱為"GMP")、腺苷酸(腺苷-5'-單磷 酸，此后也稱為"AMP"),等。
短語"產(chǎn)生。票呤衍生物質(zhì)的能力"指本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌在培養(yǎng)基中 培養(yǎng)時(shí)，所述細(xì)菌在細(xì)菌細(xì)胞或培養(yǎng)基中產(chǎn)生、分泌。票呤衍生物質(zhì)或引起噪 呤衍生物質(zhì)積累，其程度使得可從細(xì)胞或培養(yǎng)基中收集所述嘌呤衍生物質(zhì)的 能力。本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌可具有產(chǎn)生兩種或更多種前述嘌呤衍生物質(zhì) 的能力。
具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌可為內(nèi)在具有產(chǎn)生噤呤 衍生物質(zhì)的能力的細(xì)菌，或通過如下方法可得到的細(xì)菌使用誘變或重組 DNA技術(shù)修飾如下所述的芽孢桿菌屬細(xì)菌使得它們具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì) 的能力。而且，它可為賦予了產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌或 以如稍后描述的方式通過修飾所述細(xì)菌使得果糖二磷酸酶的酶活性減少來增 強(qiáng)其產(chǎn)生噤呤衍生物質(zhì)的能力的細(xì)菌。
在本發(fā)明中，短語"酶活性減少"包括上述果糖二磷酸酶或稍后描述的 分解噤呤衍生物質(zhì)的酶(如肌苷單磷酸(IMP)脫氫酶)等的酶活性低于在未修飾 的菌抹，例如芽孢桿菌屬細(xì)菌的野生型菌抹中的酶活性的狀態(tài)，和所述活性 基本上消除的狀態(tài)。這也適用于稍后描述的嘌呤操縱子阻抑物的活性。
用于獲得本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括枯草芽 孑包桿菌、解淀粉芽孢桿菌(5acz'〃w aw^/o/z々Me/ac&ra)、短小芽孢桿菌CBac/〃ws jo謂z7—等。
枯草芽孢桿菌的實(shí)例包括枯草芽孢桿菌168 Marburg (ATCC 6051)、枯草 芽孢桿菌PY79 (Plasmid， 1984, 12, l-9)等，而解淀粉芽孢桿菌的實(shí)例包括解淀 粉芽孢桿菌T(ATCC23842)、解淀粉芽孢桿菌N (ATCC 23845)等。短小芽孢 桿菌的實(shí)例包括短小芽孢桿菌Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005,美國(guó)專利 No. 3,616,206)，等。這些菌抹可由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(地址P.O. Box 1549， Manassas, VA 20108, United States of America)獲得。
可通過如下獲得具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌將例如，嘌呤核苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型或?qū)λ幬?如噪呤類似物)的抗性賦予如上所述的芽孢
桿菌屬細(xì)菌(特公昭Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160， 57-41915和 59-42895)?？赏ㄟ^如下獲得具有營(yíng)養(yǎng)缺陷型或藥物抗性的芽孢桿菌屬細(xì)菌 以用于常規(guī)誘變的誘變劑(mutagen),如N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或 EMS (曱磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate))處理細(xì)菌。 產(chǎn)生噤呤核苷的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括如下。
作為屬于芽孢桿菌屬的產(chǎn)生肌苷的菌抹的具體實(shí)例，可使用枯草芽孢桿 菌KMBS16菌抹。該菌林源自已知的枯草芽孢桿菌trpC2菌抹(168 Marburg)， 其中破壞了編碼嘌呤操縱子阻抑物的jwW基因(purR::spc)、編碼琥珀酰-AMP 合酶的pi/n4基因(purA::erm)、和編碼噪呤核普磷酸化酶的^feoD基因 (deoD::kan)(特開昭No. 2004-242610， US2004166575A1)。還可使用枯草芽孢 桿菌AJ3772菌抹(FERM P-2555,特開昭No. 62-014794)等。
具有產(chǎn)生鳥苷的能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括具有增加的IMP脫氫 酶活性的芽孢桿菌屬細(xì)菌(特開昭No. 3-58787)、通過將包含如下基因的載體 導(dǎo)入腺噪呤營(yíng)養(yǎng)缺陷的突變體而獲得的芽孢桿菌屬細(xì)菌，所述基因賦予對(duì)嘌 呤類似物或德夸菌素(decoyinine)的抗性(特公昭No. 4-28357),等。
產(chǎn)生嘌呤核苷酸的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括如下。
作為產(chǎn)生肌苷酸的芽孢桿菌屬細(xì)菌，已報(bào)道了枯草芽孢桿菌的產(chǎn)生肌苷 的菌抹，其具有減弱的磷酸酶活性(Uchida， K.等，Agr. Biol. Chem., 1961， 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida， K.， Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259)。產(chǎn)生鳥 苷酸的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括芽孢桿菌屬細(xì)菌的如下突變體，其具有腺 嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型、對(duì)德夸菌素或蛋氨酸亞砜(methiomne sulfoxide)的抗性和產(chǎn) 生5'-鳥苷酸(烏苷-5'-單磷酸，此后稱為"GMP")的能力(特公昭No. 56-12438)。
此外，可通過用于培育棒狀桿菌型細(xì)菌(通常包括產(chǎn)氨棒桿菌 (C。o^"e6acferz'ww amwo"/age"as))的方法構(gòu)建產(chǎn)生黃普酸的纟田菌。例如,可通 過獲得PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)的菌抹(特開昭No. 8-168383)、脂肪族氨基酸抗 性菌抹(特開昭No. 4-262790)或脫氫脯氨酸(dehydroproline)抗性菌林(韓國(guó)專 利Unexamined Publication No. 2003-56490)來構(gòu)建產(chǎn)生黃苷酸的細(xì)菌。
而且，用于培育具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌的方法 實(shí)例還包括增強(qiáng)涉及噪呤生物合成的酶的活性，所述酶是在細(xì)菌細(xì)胞中嘌呤 核苷和。票呤核苷酸的生物合成所共有的，即，嘌呤生物合成酶。細(xì)胞中所述酶的活性優(yōu)選增加至大于芽孢桿菌屬細(xì)菌的未修飾菌抹(例如，野生型芽孢桿 菌屬細(xì)菌)的酶活性的水平。短語"活性增加"包括，例如，每個(gè)細(xì)胞的酶分子 的數(shù)目增加的情況，和每個(gè)酶分子的比活性增加的情況，等。例如，可通過 增加酶的基因的表達(dá)量來增加活性。
涉及。票呤生物合成的酶的實(shí)例包括，例如，磷酸核糖基焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移
酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶[EC: 2.7.6.1])，等。
通過糖源(如流入戊糖磷酸途徑的葡萄糖)的代謝產(chǎn)生的一些代謝物經(jīng)由 核酮糖-5-磷酸(ribulose-5-phosphate)轉(zhuǎn)變?yōu)楹颂?5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸，產(chǎn)生PRPP，其是用于嘌呤核苷、組氨酸和色氨酸生物合成不可缺少的 前體。具體地，核糖-5-磷酸通過磷酸核糖焦磷酸合成酶轉(zhuǎn)變?yōu)镻RPP。因此， 可通過修飾以使其PRPP合成酶的活性增加將產(chǎn)生噪呤衍生物質(zhì)的能力賦予 芽孢桿菌屬細(xì)菌。
短語"磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加"指磷酸核糖焦磷酸合成酶的活 性與未修飾的菌抹如野生型菌抹或親本菌抹的活性相比增加。可通過例如， Switzer等(Methods Enzymol., 1978， 51， 3誦11)或Roth等(Methods Enzymol., 1978, 51， 12-17)的方法測(cè)量磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性?？赏ㄟ^如下方法來 產(chǎn)生磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加的芽孢桿菌屬細(xì)菌，例如，根據(jù)使用 含有基因的質(zhì)粒或?qū)⒒蛘先肴旧w的方法在芽孢桿菌屬細(xì)菌中增加編碼 磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因的表達(dá)，其可以以與在特開昭No. 2004-242610 所述方法相同的方式進(jìn)行。盡管源自芽孢桿菌屬細(xì)菌的SEQ ID NO: 3的pra 基因(Genbank登錄號(hào)X16518)可作為可用于本發(fā)明的編碼磷酸核糖焦磷酸合 成酶的基因提及，但可以使用源自其它細(xì)菌、動(dòng)物或植物的編碼具有磷酸核 糖焦磷S吏合成酶活性的蛋白質(zhì)的任何基因。
此外，當(dāng)用于噪呤核苷、組氨酸和色氨酸生物合成所不可缺少的前體 PRPP —旦產(chǎn)生時(shí)，其中一些通過涉及嘌呤生物合成的酶轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账岷?噤呤核苦。編碼這些酶的基因的實(shí)例包括來自枯草芽孢桿菌的嘌呤操縱子的 基因，具體地，purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J)-purD操縱子的基因(Ebbole D丄和Zalkin H.， J. Biol. Chem.， 1987， 262， 17, 8274-87)(目前,也稱為 purEKBCSQLFMNHD， Bac/〃ws w6"to and Its Closest Relatives,主編A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, Genbank登錄號(hào)NC—000964), 和來自大腸桿菌(EscAen'c/z/a co//)的pur調(diào)節(jié)子的基因C&c/zen'c/n'o andSa/mo"e〃fl，第二版，主編F.C Neidhardt， ASM Press, Washington D.C., 1996)。 因此，增強(qiáng)這些基因的表達(dá)賦予或增強(qiáng)產(chǎn)生噤呤衍生物質(zhì)的能力。此外，
可用于本發(fā)明的嘌呤操縱子的基因不限于這些，并且還可使用源自其它微生
物、動(dòng)物和植物的基因。
用于增加噤呤操縱子的表達(dá)量的方法的實(shí)例包括通過使用含有基因的質(zhì)
?；?qū)⒒蛘先肴旧w等的方法在芽孢桿菌屬細(xì)菌中增加。票呤操縱子的基
因的表達(dá)。
用于增加嘌呤操縱子的表達(dá)量的第二種方法包括用更強(qiáng)的啟動(dòng)子代替嘌 呤操縱子的啟動(dòng)子，和用共有序列代替天然啟動(dòng)子的-35或-10區(qū)。
例如，在枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹,ATCC6051)中， 。票呤操縱子的-35序列是共有序歹^(TTGACA)，但-10序列是TAAGAT，其不 同于共有序列TATAAT (Ebbole, D丄和H. Zalikn, J. Biol. Chem.， 1987， 262, 8274-8287)。因此，通過將-10序歹'j(TAAGAT)改變?yōu)轭愃频墓灿行蛄蠺ATAAT、 TATGAT或TAAAAT，可增加噤呤操縱子的轉(zhuǎn)錄活性。可通過下述與基因取 代的方法相同的方法代替啟動(dòng)子序列。
用于增加噤呤搡縱子的表達(dá)量的第三種方法包括降低噤呤操縱子阻抑物 的表達(dá)量(美國(guó)專利No. 6,284,495)。短語"嘌呤操縱子阻抑物的表達(dá)"包括嘌呤 操縱子基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯二者。此外，"表達(dá)量減少"包括表達(dá)量 低于未修飾的菌抹如野生型芽孢桿菌屬細(xì)菌中的表達(dá)量的情況，和表達(dá)已基 本上消除的情況。
可通過如下方法來減少噪呤操縱子阻抑物(噪呤阻抑物)的表達(dá)量例如， 可采用以紫外線照射或用于常規(guī)誘變處理的誘變劑如NTG或EMS處理芽孢 桿菌屬細(xì)菌并選擇顯示噪呤阻抑物的表達(dá)量減少的突變體。
此外，顯示噪呤阻抑物的表達(dá)量減少的芽孢桿菌屬細(xì)菌也可通過如下方 法獲得例如，除誘變處理之外，通過使用基因重組技術(shù)的同源重組用相應(yīng) 的不正常發(fā)揮功能的基因(此后，也稱為"破壞型基因，，)代替在染色體上編碼嘌 呤阻抑物的基因(pwi , GenBank登錄號(hào)NC一000964,編碼區(qū)對(duì)應(yīng)于核苷酸號(hào) 54439至55293, SEQ ID NO: 5) (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S.和Mizushima, S,， J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202)。
例如，可用破壞型基因以如下所述的方式代替宿主染色體上的正?；?。在下文中，解釋了 ； wri 基因的破壞?？深愃频仄茐钠渌颍?；wM、 c/eoD、 評(píng)薛*基因。
將具有與染色體上的序列同源的序列且不能在芽孢桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞中 復(fù)制的質(zhì)粒等導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，導(dǎo)致在具有同源性的序列的位點(diǎn)以一定頻率的 重組。然后將整個(gè)質(zhì)粒重組入染色體中。其后，如果重組又在染色體上具有 同源性的序列的位點(diǎn)發(fā)生，則將質(zhì)粒從染色體中去除。此時(shí)，依賴于重組發(fā) 生的位點(diǎn)，可將破壞型基因保留在染色體上，且可將原始的正?；蚺c質(zhì)粒 一起從染色體去除。通過選擇這樣的菌抹，可能獲得其染色體上正常的pw^ 基因已被破壞型pwW基因代替的菌抹。
已經(jīng)建立了這樣的基于同源重組的基因破壞技術(shù)，且其包括使用線性 DNA的方法、使用溫度敏感型質(zhì)粒的方法等。此外，還可通過使用如下質(zhì)粒 來破壞/ wW基因，所述質(zhì)粒含有其中已插入標(biāo)記基因(如藥物抗性基因)的 /^M基因且其不能在目標(biāo)細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。即，在已用如上所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 的轉(zhuǎn)化體中，將標(biāo)記基因并入染色體DNA并賦予藥物抗性。由于通過將質(zhì)粒 上把標(biāo)記基因夾在中間的pwW基因序列與染色體上的pwri 基因進(jìn)行同源重 組將標(biāo)記基因以高比率(high rate)并入染色體，因此可有效地選擇pz^ 基因破 壞的菌抹。
可通過如下獲得用于基因破壞的破壞型pw^基因具體地，通過用限制 酶消化和再連接(re-ligation)來缺失基因的某個(gè)區(qū)域，將另一個(gè)DNA片 段(標(biāo)記基因等)插入/ wri 基因中，或在pwW基因的編碼區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)等的核 苷酸序列中引起一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，其通 過4立點(diǎn)特異性i秀變(Kramer， W.和Frits, H丄，Methods in Enzymology, 1987, 154, 350-367)或通過重組PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989))或通過用化 學(xué)試劑(如硫代硫酸鈉(sodium hyposulfite)或羥胺(hydroxylamine))處理(Shortle: D.和Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978, 75, 2170國(guó)2174)來進(jìn)行，然 后是選擇其中由戶W基因編碼的阻抑物的活性減少或基因的轉(zhuǎn)錄減少的菌 抹。在這些方法中，考慮到可靠性和穩(wěn)定性，通過用限制酶消化和再連接來 缺失pwi 基因的某個(gè)區(qū)域或另一個(gè)DNA片段插入jwW 基因中是優(yōu)選的。
列。然而，如果該區(qū)域占/ wi 基因全長(zhǎng)的90%以上，更優(yōu)選95%以上，特別 是97%以上，則阻抑物活性降低的確定性增加。此外，當(dāng)； zW 基因的編碼區(qū)中核普酸的缺失或插入引起移碼突變時(shí)，考慮到確定地降低阻抑物活性，優(yōu) 選的是引起核苷酸在多個(gè)位點(diǎn)的缺失或插入和引起核香酸在3，端側(cè)上的缺失 或插入。
也可通過如下得到噤呤阻抑物活性的降低除前述的基因破壞之外，基 于常規(guī)的誘變方法將降低胞內(nèi)噤呤阻抑物活性的突變導(dǎo)入染色體上的 基因。例如，可通過導(dǎo)入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、終止密碼子(無義突變)或添 加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的移碼突變，或通過部分地或全部地缺失基因來 得到。此外，也可通過將轉(zhuǎn)座子插入染色體上的pw/^基因來減少阻抑物的活 性。
還可通過如下得到噤呤阻抑物活性的降低用較弱的表達(dá)控制序列代替 pwi 基因的表達(dá)控制序列，如染色體DNA上的啟動(dòng)子。通過RNA合成的起 始作用(initiation act)的頻率來定義啟動(dòng)子的強(qiáng)度。Goldstein等的文章 (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev" 1995， 1, 105-128)等中描述了用于評(píng)價(jià)啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法及強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例。此外，還
待弱化的(tobeweakened)啟動(dòng)子，如國(guó)際專利公開WOOO/18935中所披露的。 此外，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)(spacer)，尤其 是起始密碼子緊鄰上游的序列中幾個(gè)核苷酸的取代極大地影響了 mRNA的翻 譯效率?？蓪BS的此修飾與減少目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行組合。
此外，可制備重組DNA并將其轉(zhuǎn)化入宿主芽孢桿菌屬細(xì)菌，在所述重組 DNA中導(dǎo)入使由； zW 基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA不穩(wěn)定的突變。
也可以與上述相同的方式減少由稍后描述的pwM、 &oD、 和yz，p基 因編碼的酶的活性。
可使用基于/7Wi 基因的已知核苷^列制備的寡核苷酸作為引物通過 PCR由具有噪呤操縱子的微生物的染色體DNA獲得基因。還可使用基 于戶W基因的已知核香酸序列制備的寡核芬酸作為探針通過雜交由具有嘌 呤操縱子的微生物的染色體DNA文庫(kù)獲得基因。已報(bào)道了枯草芽孢桿 菌168 Marburg菌抹的pwW 基因的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)D26185 (編碼 區(qū)對(duì)應(yīng)于核苷酸號(hào)118041至118898)，或NC—000964 (編碼區(qū)對(duì)應(yīng)于核苷酸 號(hào)54439至55296))。pw^基因的核苷i^列和由該基因編碼的氨基酸序列示 于序列表的SEQ IDNOS: 5和6 (特開昭No. 2004-242610)。用于獲得/7Wi 基因的用于PCR的引物可為能夠擴(kuò)增基因的部分或
全長(zhǎng)的任何引物，而具體實(shí)例包括具有示于SEQ ID NO: 15 (GAAGTTGATGATCAAAA)和SEQ ID NO: 16 (ACATATTGTTGACGATAAT) 的核香酸序列的寡核苷酸。
上述標(biāo)記基因的實(shí)例包括藥物抗性基因，如大觀霉素(spectinomycin)抗性 基因和卡那霉素抗性基因?？赏ㄟ^由大腸桿菌ECEIOI菌抹(從芽孢桿菌屬遺 傳原種中心(萬acz'〃w Genetic Stock Center) (BGSC)商業(yè)上可得到的)制備質(zhì)粒 pDG1726并從質(zhì)粒中作為盒(as a cassette)去除抗性基因來獲得糞腸球菌 C&7teracoccw /^c"/Z力的大觀霉素抗性基因。可通過由大腸桿菌ECE91菌抹 (從芽孢桿菌屬遺傳原種中心(BGSC)商業(yè)上可得到的)制備質(zhì)粒pDG646并從 質(zhì)粒中作為盒去除抗性基因來獲得金黃色葡萄球菌OStop/^/ococcw aWMM"的 紅霉素抗性基因?？赏ㄟ^由大腸桿菌ECE94菌株(從芽孢桿菌屬遺傳原種中 心(BGSC)商業(yè)上可得到的)制備質(zhì)粒pDG783并從質(zhì)粒中作為盒去除抗性基 因來獲得源自糞鏈球菌(5^ptococcm/aeca/^)的卡那霉素抗性基因。此外，可 通過由枯草芽孢桿菌1E17菌抹(從芽孢桿菌屬遺傳原種中心(BGSC)商業(yè)上可 得到的)制備質(zhì)粒pC194并使用該質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR以擴(kuò)增該質(zhì)粒來獲 得金黃色葡萄球菌的氯霉素抗性基因。
將藥物抗性基因用作標(biāo)記基因時(shí)，可通過如下來獲得基因破壞的菌 林將藥物抗性基因在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)插入質(zhì)粒中的/w;^基因，用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化微生物和選擇變成藥物抗性的轉(zhuǎn)化體。可通過使用Southern印跡或PCR分 析染色體上的標(biāo)記基因或戶W基因來確認(rèn)染色體上的，W基因的破壞?？?使用能夠擴(kuò)增這些基因的引物通過PCR來確認(rèn)將前述的大觀霉素抗性基因、 紅霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因并入染色體DNA。
還已知通過^[立于啟動(dòng)子下游的終止子畫抗終止子(terminator-antiterminator) 序列(此后稱為弱化子(attenuator)序列)調(diào)節(jié)噪呤操縱子的表達(dá)(Ebbole, D丄和 Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987， 262, 8274-8287; Ebbole D丄和Zalkin H., J. Biol. Chem.， 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D丄和Zalkin, H.， J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141)。因此，可通過將弱化子序列缺失來增加。票呤操縱子的表達(dá)量。 可通過與用于破壞戶W的方法相同的方法得到弱化子序列的缺失。
為了進(jìn)一步增加噪呤操縱子的轉(zhuǎn)錄，可將上述方法進(jìn)行組合。例如，可 將pw^基因破壞，并進(jìn)一步，可使用質(zhì)粒擴(kuò)增其中弱化子序列缺失的噪呤操縱子或可將這樣的噤呤操縱子的多個(gè)拷貝導(dǎo)入染色體。
也可通過如下方法來增強(qiáng)涉及嘌呤生物合成的酶的活性使涉及噤呤生
物合成的酶對(duì)其調(diào)節(jié)脫敏，例如，根據(jù)使酶對(duì)反饋抑制脫敏的前述方法
(WO99/03988)進(jìn)行。
此外，還可通過減弱細(xì)胞對(duì)嘌呤衍生物質(zhì)的攝取來增強(qiáng)產(chǎn)生噤呤衍生物 質(zhì)的能力。例如，可通過將涉及細(xì)胞對(duì)噪呤核苷的攝取的反應(yīng)阻斷來減弱細(xì) 胞對(duì)噤呤核苦的攝取。涉及細(xì)胞對(duì)噪呤核苷的攝取的反應(yīng)的實(shí)例包括通過核 苦通透酶(nucleoside permease)4崔4b的反應(yīng)。
此外，當(dāng)產(chǎn)生嘌呤核苷時(shí)，可減少分解嘌呤核苷的酶的活性以增強(qiáng)產(chǎn)生 嘌呤核普的能力。這樣的酶的實(shí)例包括噤呤核苷磷酸化酶。
將通過涉及噪呤生物合成的酶由PRPP生物合成的噪呤核苦酸脫磷酸化 (dephosphorylate)并由此轉(zhuǎn)變?yōu)?。票呤核苷。為了有效地引起嘌呤核苷的積累， 優(yōu)選降低噤呤核香磷酸化酶的活性，所述酶進(jìn)一步將噤呤核苷降解為次黃。票 呤等。即，優(yōu)選減弱或消除利用嘌呤核苷(如肌苷)作為底物的嘌呤核苷磷酸化 酶的活性。
具體地，可通過在芽孢桿菌屬細(xì)菌中破壞編碼。票呤核苷磷酸化酶的t/eoD 和pw; ( 基因來減少嘌呤核苷磷酸化酶活性?？赏ㄟ^破壞和/7W戶G基因 中的一種或兩者來修飾本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌。作為^oD和pwpG基因， 例如，可使用源自芽孢桿菌屬細(xì)菌的那些基因(yeoZ): Genbank登錄號(hào) NC—000964 (SEQ ID NO: 7), / w/ G: Genbank登錄號(hào)NC—000964 (SEQ ID NO: 9)),并且可以以與用于前述破壞wi 基因相同的方式獲得基因破壞的菌抹。
也可通過減少琥珀酰-AMP合酶的活性來增強(qiáng)產(chǎn)生噪呤衍生物質(zhì)的能力。 編碼琥珀酰-AMP合酶的基因的實(shí)例包括基因。； w^基因的實(shí)例包括， 例如，具有登記為GenBank登錄號(hào)NC—000964 (編碼區(qū)對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈的核苷 酸號(hào)4153460至4155749, SEQ ID NO: ll)的核普酸序列的那些。
也可通過減少肌苷單磷酸(IMP)脫氫酶的活性來增強(qiáng)產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì) 的能力。編碼IMP脫氫酶的基因的實(shí)例包括g船萬基因。g"aS基因的實(shí)例包 括，例如，具有登記為GenBank登錄號(hào)NC—000964 (編碼區(qū)對(duì)應(yīng)于核普酸號(hào) 15913至17376, SEQ ID NO: 13)的核苷酸序列的那些。
而且，作為增強(qiáng)產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力的方法，可預(yù)期的是擴(kuò)增編碼 如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有分泌嘌呤衍生物質(zhì)的活性。其中這樣的基因已得到擴(kuò)增的細(xì)菌的實(shí)例包括，其中a"基因得到擴(kuò)增的芽孢桿菌屬細(xì)
菌(特開昭No. 2003-219876)。
如上所述待破壞的/ wW 、 cfeoD、 /w; G、 pwv4和gwa萬基因和其表達(dá)待增 強(qiáng)的pw基因可為保守的變體，例如，編碼分別具有SEQIDNOS:6、 8、 10、 12、 14、 16和4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘 基的取代、缺失、插入、添加或倒位，且分別具有噪呤阻抑物、嘌呤核苦磷 酸化酶、琥珀酰-AMP合酶、IMP脫氬酶或磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性。 前述術(shù)語"幾個(gè)"所指的數(shù)目為，例如2至50,優(yōu)選2至30，更優(yōu)選2至 10。
如上所述的氨基酸序列的這種變化通常是保守的變化，其保持蛋白質(zhì)的 活性。保守氨基酸取代的實(shí)例包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、 His或 Lys取代Arg;用Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp取代Asn;用Asn、 Glu或Gin 耳又4戈Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp或Arg取代 Gln;用Asn、 Gln、 Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr取代His;用Leu、 Met、 Val或Phe取代lie;用Ile、 Met、 Val或 Phe取代Leu;用Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg取代Lys;用Ile、 Leu、 Val或 Phe取代Met;用Trp、 Tyr、 Met、 Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser; 用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Tip;用His、 Phe或Tip取代Tyr; 和用Met、 Ile或Leu取代Val。
上述pwi 、 fifeoD、 jto; G、尸wM、 和/Zj/ 基因和pns基因的保守變體
的具體實(shí)例包括分別與具有SEQIDNOS: 5、 7、 9、 11、 13、 15和3的核苷 酸序列的DNA顯示例如，70%以上，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上，特別 優(yōu)選95%以上的同源性的DNA。更具體地，保守變體的實(shí)例包括在嚴(yán)格條件 下能夠與具有與SEQ ID NOS: 5、 7、 9、 11、 13、 15和3的核芬酸序列互補(bǔ) 的核香酸序列的DNA雜交的DNA。嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在60°C和lxSSC、 0.1%SDS,優(yōu)選0.1xSSC、 0.1%SDS的鹽濃度洗滌一次或多次，優(yōu)選兩次或 三次的條件。
可通過BLAST檢索、FASTA檢索、CrustalW的計(jì)算方法等評(píng)價(jià)DNA的
同源性。
BLAST (基本局部比對(duì)檢索工具(basic local alignment search tool))是程序 blastp、 blastn、 blastx、 megablast、 tblastn和tblastx所使用的探索式的檢索算法(heuristic search algorithm),而且在使用Karlin、 Samuel和Stephen F. Altschul 的纟克"i十方法("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993， 90:5873畫7)的基礎(chǔ)上 通過這些程序獲得的結(jié)果被認(rèn)為是顯著的。W.R. Pearson描述了 FASTA檢索 方法("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology， 1990 183:63-98)。 Thompson J.D.、 Higgins D.G.和 Gibson T丄描述了 Clustal W方法("CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res,, 1994, 22:4673-4680)。
而且，用于制備破壞型基因的DNA也可為pwi 、 cfeoD、 pwpG、 pwM或 gwa^基因的保守變體。
可以與稍后描述的用于編碼果糖二磷酸酶的基因相同的方式將目標(biāo)基因 并入芽孢桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA 。
(II)用于減少果糖二磷酸酶的酶活性的修飾
可通過如下獲得本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌修飾具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì) 的能力的菌抹(如上述的那些)使得果糖二磷酸酶的酶活性減少。對(duì)修飾的次序 沒有限制，且在修飾細(xì)菌使得其果糖二磷酸酶的酶活性減少之后，可將產(chǎn)生 噪呤核苷酸的能力賦予細(xì)菌。
果糖二磷酸酶是催化由果糖-l,6-二磷酸產(chǎn)生果糖-6-磷酸的反應(yīng)的酶，且 此反應(yīng)是糖異生途徑的反應(yīng)中的一個(gè)。"糖異生途徑"指如下途徑其中胞內(nèi) 的草酰乙酸通過由蜂醇丙酉同酸石舞酸羧;敫酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase) (EC: 4丄1.49)催化的脫羧和磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐急?，磷酸烯醇丙酮?通過糖酵解酶的逆反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)楣?l,6-二磷酸，果糖-l，6-二磷酸進(jìn)一步通過 果糖二磷酸酶(EC: 3丄3.11)轉(zhuǎn)變?yōu)楣?6-磷酸，及通過葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶 和葡萄糖-6-磷酸酶(EC: 3.1.3.9)從果糖-6-磷酸生物合成葡萄糖。
可通過如下方法測(cè)量果糖二磷酸酶的酶活性。例如，可通過將產(chǎn)生的果 糖-6-磷酸通過葡糖磷酸異構(gòu)酶(phosphoglucoisomerase)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH,并測(cè)量NADPH來測(cè)量活性。
果糖二磷酸酶的酶活性減少的這樣的修飾可通過如下得到例如，如上
面用于破壞； wri 基因所說明的，通過同源重組用不正常發(fā)揮功能的相應(yīng)基因 (例如，通過將標(biāo)記基因(如藥物抗性基因)插入果糖二磷酸酶基因所獲得的破 壞型基因)取代染色體上的果糖二磷酸酶基因。此外，如用于pw^基因所述， 可通過常規(guī)誘變方法將降低胞內(nèi)果糖二磷酸酶的酶活性的突變導(dǎo)入染色體上 的果糖二磷酸酶基因。
枯草芽孢桿菌的果糖二磷酸酶的實(shí)例包括由如SEQ ID NO: 2所示的671 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，并可將編碼該蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選具有SEQIDNO: 1的核苷酸序列的基因(/Z^基因，Genbank登錄號(hào)NC—000964的核苷酸號(hào) 4127053至4129065)用于修飾?！? 基因位于枯草芽孢桿菌染色體上大約323°處。
編碼基本上與果糖二磷酸酶相同的蛋白質(zhì)的DNA的實(shí)例包括，具體地， 編碼如下蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列 顯示50%以上，優(yōu)選70°/。以上，更優(yōu)選80°/。以上，特別優(yōu)選90%以上，最優(yōu) 選95%以上的同源性，并具有果糖二磷酸酶的酶活性。
編碼果糖二磷酸酶的基因還可像前述基因一樣為y&p基因的保守的變體。 具體地，實(shí)例包括編碼如下蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列，包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒 位，并具有果糖二磷酸酶活性。實(shí)例還包括編碼如下蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋 白質(zhì)與SEQIDNO: 2中所示的氨基酸序列顯示50%以上，優(yōu)選70%以上，更 優(yōu)選80%以上，特別優(yōu)選卯％以上，最優(yōu)選95%以上的同源性，并具有果糖 二磷酸酶的酶活性。更具體地，實(shí)例包括在嚴(yán)格條件下能夠與具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。嚴(yán)格條件包括在60°C和lxSSC、 0.1% SDS，優(yōu)選60。C、 O.lxSSC、 0.1% SDS的鹽濃度洗滌一次或多次，優(yōu)選兩次 或三次的條件。
如上所述，這樣的編碼基本上與果糖二磷酸酶相同的蛋白質(zhì)的DNA可通 過如下獲得，例如，修飾編碼所述酶的核苷酸序列使得特定部分的氨基酸殘 基通過位點(diǎn)特異性誘變進(jìn)行取代、缺失、插入、添加或倒位。如上所述，也 可通過常規(guī)已知的誘變處理獲得這種修飾的DNA。誘變處理的實(shí)例包括體外 處理DNA然后用羥胺i秀變處理，和處理含有DNA的樣i生物如埃希氏菌屬細(xì)菌然后用紫外照射或用于常規(guī)誘變處理的誘變劑(如N-曱基-N'-硝基-N-亞硝 基胍(NTG)或亞硝酸)誘變處理。
例如，可使用芽孢桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA作為模板和基于目標(biāo)基因的 核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物通過PCR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction), White, T丄等,Trends Genet" 1989, 5, 185-189)獲得 目才示基因。可通過，例如Saito和Miura的方法(H. Saito禾口 K. Miura， Biochem. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629; Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifokan, 1992)等由作為DNA供體的細(xì)菌制備染色體DNA。用于PCR的引物可基于 芽孢桿菌屬細(xì)菌的已知基因序列，或基于有關(guān)在其序列已知的其它細(xì)菌的基 因中保守的區(qū)域的信息來制備。
用于將目標(biāo)基因并入芽孢桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA的載體的實(shí)例包括 具有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的載體，如pHV1248 (Prtit, M,A.,等，J. Bacteriol., 1990, 172， 6736-6740);用于大腸桿菌的載體，如pHSG398 (Takara Shuzo)和 pBluescript SK-(Stratagene); 等。
為了連接目的基因和攜帶在芽孢桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能的標(biāo)記物的載體 以制備重組DNA,將載體用與目的基因的末端匹配的限制酶消化。通常使用 連才妻酶如T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。
為了將如上所述制備的重組DNA導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)菌，可使用到目前為 止已報(bào)道的任何公知的轉(zhuǎn)化方法。實(shí)例包括，例如，由處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞制 備感受態(tài)細(xì)胞，然后往其中導(dǎo)入DNA的方法(DubunauD.和Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971， 56， 209-221)和將宿主細(xì)胞制成可容易吸收(take up)重組 DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，然后將重組DNA導(dǎo)入DNA受體細(xì)胞的方法 (Chang, S.和Choen， S.N.， Molec. Gen. Genet" 1979, 168, 111-115)。
<2>用于產(chǎn)生噪呤衍生物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌有效地產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)。因此，通過在適當(dāng) 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，可在細(xì)菌的細(xì)胞或培養(yǎng)基中產(chǎn)生 并積累。票呤^"生物質(zhì)，如嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。
至于用于本發(fā)明的培養(yǎng)基，可使用常規(guī)培養(yǎng)基以常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)，所
述培養(yǎng)基包含碳源、氮源和礦物鹽以及有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物如氨基酸和維生素，根據(jù)需要?？墒褂煤铣膳囵B(yǎng)基或天然培養(yǎng)基?？墒褂萌魏畏N類的碳源和氮源， 只要待培養(yǎng)的菌抹可以使用它們。
作為碳源，使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、 阿拉伯糖、木糖、海藻糖、核糖、淀粉水解物和糖蜜，和醇如甘油和甘露醇， 而且也可獨(dú)立地使用或與其它碳源組合使用有機(jī)酸如葡糖酸、乙酸、檸檬酸、 馬來酸、富馬酸和琥珀酸。
作為氮源，使用氨、銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨、 硝酸鹽、有機(jī)氮如大豆水解物，等。 ■
作為有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物，使用氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸、含有這些 物質(zhì)的那些如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解產(chǎn)物等。 當(dāng)使用生長(zhǎng)需要氨基酸等的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌抹時(shí)，需要補(bǔ)充所需的營(yíng)養(yǎng)物。
作為礦物鹽，使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。
雖然培養(yǎng)條件可根據(jù)待使用的芽孢桿菌屬細(xì)菌的類型而變化，但將枯草
芽孢桿菌，例如，作為通氣培養(yǎng)物培養(yǎng)，同時(shí)將發(fā)酵溫度控制為20至50。C， 將pH控制為4至9。在培養(yǎng)過程中當(dāng)pH下降時(shí)，用堿如氨氣中和培養(yǎng)基。 在大約40小時(shí)至3天的如上所述方式的培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基中積累嘌呤核苷。
培養(yǎng)完成后，可以常規(guī)的方式收集在培養(yǎng)基中積累的肌苷。例如，它可 通過沉淀、離子交換層析等來分離。
此外，如果用于本發(fā)明的微生物缺少編碼核苦酶或核苷酸酶的基因，則 可積累相應(yīng)的核苷或核香酸。此外，如果賦予肌苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型，則可積累涉 及其生物合成途徑的相關(guān)物質(zhì)或前體。
此外，通過將由本發(fā)明的方法制備的肌苷或鳥苷與噪呤核苷磷酸化酶或 磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，可獲得5，-肌苷酸或5'-鳥苷酸。
而且，還可能通過使磷酸轉(zhuǎn)移酶與噤呤核苷反應(yīng)將使用本發(fā)明的微生物 產(chǎn)生的噪呤核苷進(jìn)行磷酸化以產(chǎn)生嘌呤核苷酸(核苷5'-磷酸酯)(特開昭No. 2000-295996)。例如，可使用如下方法使用埃希氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)生嘌呤核苷酸 的方法，所述細(xì)菌中導(dǎo)入了編碼大腸桿菌的肌苷鳥苷激酶的基因 (WO91/08286),和使用產(chǎn)氨棒桿菌產(chǎn)生嘌呤核苷酸的方法，所述細(xì)菌中導(dǎo)入 了編碼乙酰微小桿菌(五x/gwo6acfen'i^ ace/^/z'cwm)的月幾芬鳥苷激酶的基因 (WO96鹿01)。
而且，還可能通過將使用本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的嘌呤核苷與磷酸鹽供體，及微生物或酸性磷酸酶(EC 3丄3.2)反應(yīng)來產(chǎn)生噤呤核苦酸(核芬5'-磷酸酯)， 所述磷酸鹽供體是選自下組的一種或多種聚磷酸、磷酸苯酯和氨曱酰磷酸， 所述微生物具有產(chǎn)生核苷5'-磷酸酯的能力。雖然對(duì)具有產(chǎn)生核香5'-磷酸酯 的能力的微生物沒有特別的限制，只要選擇了具有將嘌呤核苷轉(zhuǎn)變?yōu)?。票呤?苷酸的能力的微生物，實(shí)例包括，例如，國(guó)際專利公開WO96/37603中披露 的微生物。
而且，也可以使用蟑瑯埃希氏菌(Esc/^n'c/^" 6A^toe) JCM 1650 、無花果 沙雷氏菌(&rrariaATCC 33105、植生克雷伯氏菌(尺/eZm'e〃a; /a"Wco/a) IFO 14939 (ATCC 33531)、肺炎克雷伯氏菌(A7eZwW/a IFO 3318
(ATCC 8724)、 土生克雷伯氏菌(《/e^/e〃G te〃/ge"a) IFO 14941 (ATCC 33257)、 摩氏摩根氏菌(Mwg朋e〃a worgam7) IFO 3168、產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera^"er 群og潔s) IFO 12010、產(chǎn)氣腸桿菌IFO 13534 (ATCC 13048)、河流色桿菌 (C7zramoZ)a"en'ww _/7wv/a^7e) IAM 13652 、 紫色色4干菌(C/2ramoZ)Gtc&n.wm v/o/acewm) IFO 12614 、拉氏西地西菌(C"fece" /"/ age/) JCM 1684 、戴氏西地 西菌(Ceofecea davWae) JCM 1685、奈氏西地西菌(Ce&cea JCM 5909、
等，其公開于特開昭No. 07-231793。
作為酸性磷酸酶，例如，可使用特開昭No. 2002-000289中公開的酸性磷 酸酶，而且可更優(yōu)選地^使用對(duì)核苷的親和性增加的酸性^疇酸酶(特開昭No. 10-201481)、核香酸酶活性減少的突變體酸性磷酸酶(W096/37603)、磷酸酯 水解活性減少的突變體酸性磷酸酶(特開昭No, 2001-245676)等。
還可能通過將使用本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的噪呤核苷以化學(xué)方法進(jìn)行磷酸 化來獲得噪，冷核芬酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan, 42， 3505)。而 且，還可以使用如下方法通過將本發(fā)明的具有產(chǎn)生XMP的能力的微生物和 使用微生物的ATP再生系統(tǒng)的XMP脫氨基酶(aminase)活性偶聯(lián)來獲得GMP 的方法，和通過偶聯(lián)肌苦激酶來獲得IMP的方法(Biosci. Biotech. Biochem.， 51, 840(1997);特開昭No. 63-230094)。
通過本發(fā)明方法制備的用于前述噪呤核苷酸制備的肌苷、鳥苷或嘌呤核 苷可為純化的產(chǎn)物或嘌呤核苷發(fā)酵液，或含有噤呤核苷的粗產(chǎn)物。
實(shí)施例
此后，將參考實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。實(shí)施例1
<構(gòu)建在編碼嘌呤核苷磷酸化酶的/W/ G和^feoD基因中有缺陷的細(xì)菌菌
抹>
如下所述，由重組菌抹KMBS310構(gòu)建在噤呤核苷磷酸化酶基因(cfeoD) 中有缺陷的菌抹。源自枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051)的KMBS310菌抹(日本專利申請(qǐng)No. 2005-280186)在噤呤操縱子阻抑物 基因(pwW)、琥珀酰-AMP合酶基因(p^4)和噤呤核普磷酸化酶基因(pw/ G)中 有缺陷，并具有減弱的IMP脫氫酶基因(gwaS)，其中對(duì)PRPP合成酶基因(/ ra) 的SD序列和噤呤操縱子啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行修飾。通過分別修飾啟動(dòng)子區(qū)和SD序 列增強(qiáng)了 。票呤操縱子和PRPP合成酶基因的表達(dá)。
將通過Fouet和Sonenshein的方法(J. Bacteriol., 19卯，172, 835國(guó)844)由 KMBS16菌抹(purR::spc purA::erm deoD::kan,特開昭No. 2004-242610)制備
1971, 56, 209-221)制備的枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹的感受態(tài)細(xì)胞，并獲 得在含有5 ng/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從獲得的菌落中選 擇未變成大觀霉素抗性也不是紅霉素抗性的菌落，并將它們之中的一個(gè)菌抹 命名為KMBS5 (deoD::kan)。
將通過Fouet和Sonenshein的方法(J. Bacteriol., 1990， 172， 835-844)由 KMBS5制備的基因組DNA用于轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法 (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)制備的KMBS310菌株的感受態(tài)細(xì)胞，并獲得 在含有5 ]ig/ml卡那霉素和20 pg/ml鳥嘌呤的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從 如上所述獲得的菌落中選擇幾個(gè)菌落，并將一個(gè)轉(zhuǎn)化體命名為KMBS321，所 述轉(zhuǎn)化體中可以證實(shí)用deoD::kan取代野生型AoZ)基因，且源自KMBS310 的所有突變未被野生型序列代替。
實(shí)施例2
<構(gòu)建在編碼果糖二磷酸酶的yz^基因中有缺陷的細(xì)菌菌抹、其培養(yǎng)及評(píng)
(l)制備#p基因缺陷的菌抹
如下所述，由前述的重組菌抹KMBS321構(gòu)建在果糖二磷酸酶基因(/Z，p)中有缺陷的菌抹。源自枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051)的KMBS321菌抹在噤呤操縱子阻抑物基因(/7wr/0、琥珀酰-AMP合酶基 因(pw^)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(pi^G)中有缺陷，并具有減弱的IMP脫氫 酶基因(gwa^),其中對(duì)PRPP合成酶基因(pra)的SD序列和噤呤操縱子啟動(dòng)子 區(qū)進(jìn)行修飾。
(i) 通過PCR擴(kuò)增上游區(qū)
基于基因數(shù)據(jù)庫(kù)的信息(GenBank登錄號(hào)NC—000964和V01277)制備具有 如下核苷酸序列的28聚物(28-mer)和50聚物(50-mer) PCR引物。
cg卿tgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA (SEQ ID NO:
18, 以小寫字母表示的核苷酸對(duì)應(yīng)于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(c一的 啟動(dòng)子上游區(qū))
使用枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹的染色體DNA作為模板和前述的引 物進(jìn)行PCR(98。C IO秒、55。C30秒、72。C1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)，Gene Amp PCR系統(tǒng)9600型，Perkin-Elmer)以獲得含有#/ 基因5，端區(qū)和大約1350 bp上 游區(qū)的擴(kuò)增片段。
(ii) 通過PCR擴(kuò)增下游區(qū)
基于基因數(shù)據(jù)庫(kù)的信息(GenBank登錄號(hào)NC—000964和V01277)制備具有 如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和27聚物(27-mer) PCR引物。
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG (SEQ ID NO:
19, 以小寫字母表示的核苷酸對(duì)應(yīng)于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(caO的 結(jié)構(gòu)基因的下游區(qū))
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEQ ID NO: 20)
使用枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹的染色體DNA作為模板和前述的引 物進(jìn)行PCR (98。C 10秒、55°C 30秒、72。C 1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)，Gene Amp PCR系統(tǒng)9600型，Perkin-Elmer)以獲得含有yZ^基因3，端區(qū)和大約1770 bp下游區(qū)的擴(kuò)增片段。
(iii) 通過PCR擴(kuò)增cw基因
基于基因數(shù)據(jù)庫(kù)的信息(GenBank登錄號(hào)V01277和NC—000964)制備具有 如下核苷酸序列的50聚物(50-mer) PCR引物。
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 21，以小寫字母表示的核苷酸對(duì)應(yīng)于^/Z^基因的5'端區(qū)的序列，且對(duì)它們進(jìn) 行設(shè)計(jì)使其互補(bǔ)于SEQIDNO: 18的3'端區(qū))
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 22,以小寫字母表示的核香酸對(duì)應(yīng)于/^基因的3，端區(qū)的序列，且對(duì)它們進(jìn) 行i殳計(jì)4吏其互補(bǔ)于SEQIDNO: 19的3'端區(qū))
使用攜帶氯霉素抗性基因(c的的質(zhì)粒pC194作為模板和前述的引物進(jìn)行 PCR(98。C10秒、55。C30秒、72。C1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)，GeneAmpPCR系 統(tǒng)9600型，Perkin-Elmer)以獲得含有基因的大約980 bp的擴(kuò)增片段。
(iv) 通過重組PCR擴(kuò)增包含插入有基因的/Z，p區(qū)的片段
使用MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech)純化上述(i) 至(iii)中擴(kuò)增的DNA片段，然后將它們的混合物以適當(dāng)?shù)牧坑米髂０澹B同 SEQ ID NOS: 17和20的序列以進(jìn)行PCR (98°C 10秒、55。C 30秒、72°C 4.5 分鐘，30個(gè)循環(huán)，Gene Amp PCR系統(tǒng)9600型，Perkin-Elmer)，并由此獲得包 含插入有基因的區(qū)的片段。 '
(v) 制備/bp破壞的產(chǎn)生肌苷的菌抹
將(iv)中獲得的包含其中已插入cw基因的區(qū)的DNA片段(fbp::cat)進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳，并從該凝膠提取目標(biāo)片段。將如上所述純化的DNA片段 用于轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)制備的枯草芽孢桿菌KMBS321菌抹的感受態(tài)細(xì)胞，并獲得在含有 2.5嗎/ml氯霉素和20嗎/ml鳥噤呤的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這些菌 落制備染色體DNA，通過(iv)所述的PCR方法鑒定如下菌抹，其中通過雙重組用其內(nèi)部序列被氯霉素抗性基因代替的#p區(qū)(fbp::c^)代替染色體上的 區(qū)，并將這些菌抹中的一個(gè)命名為TABS133。
(2)通過在#p基因中有缺陷的產(chǎn)生肌苷的菌抹產(chǎn)生嘌呤核苷。 yZ^基因缺陷菌抹TABS133和對(duì)照菌抹KMBS321各自均勻地涂布于含 有20 mg/L鳥噪呤的LB培養(yǎng)基平板上，并在34°C培養(yǎng)過夜。將對(duì)應(yīng)于平板 的1/8的細(xì)胞接種入500-ml容積坂口燒瓶(Sakaguchi flask)中所含的20 ml發(fā) 酵培養(yǎng)基中，然后將50 g/L碳酸鉤加入培養(yǎng)基，并在34。C搖動(dòng)培養(yǎng)細(xì)胞。培 養(yǎng)開始后72小時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基取樣，并通過已知方法測(cè)量培養(yǎng)基中所含的肌香 和次黃噤呤的量。以^p基因缺陷菌株TABS133觀察到的積累的肌苷量高于 以KMBS321菌抹作為對(duì)照菌抹觀察到的肌苷量。
葡萄糖30g/L
KH2P04lg/L
NH4Cl32g/L
豆?jié)?Mameno) (T-N)*1.35 g/L
DL-曱硫氨酸0.4 g/L
L-色氨酸0.02 g/L
腺嘌呤0.1 g/L
鳥苷0.075 g/L
MgS040.4 g/L
FeS040.01 g/L
MnS040.01 g/L
Adekanol (消泡劑)0.5 ml/L
(用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0)
碳酸4丐50g/L
*:大豆蛋白水解物
表1__
枯草芽孢桿菌菌才朱~~I肌苷(g/L)KMBS3215.3
TABS 1335.8
SEQIDNO:l: yZp基因的核苦酸序列
SEQ ID NO: 2:果糖二磷酸酶的氨基酸序列
SEQIDNO:3: ; ra基因的核芬S^列
SEQ ID NO: 4:磷酸核糖焦磷酸合成酶的氨基酸序列
SEQ ID NO: 5: pw/ 基因的核苷斷列
SEQ ID NO: 6:噪呤阻抑物的氨基酸序列
SEQ ID NO: 7: &oD基因的核苷酸序列
SEQ ID NO: 8: ^oD基因產(chǎn)物(噤呤核普磷酸化酶)的氨基酸序列 SEQ ID NO: 9: pwpG基因的核普酸序列
SEQ ID NO: 10: 基因產(chǎn)物(。票呤核苦磷酸化酶)的氨基酸序列
SEQ ID NO: 11: 基因的核苷酸序列
SEQ ID NO: 12:琥珀酰-AMP合酶的氨基酸序列
SEQ ID NO: 13: gwa5基因的核苷酸序列
SEQ ID NO: 14: IMP脫氫酶的氨基酸序列
SEQIDNO:15:用于pwW基因擴(kuò)增的引物
SEQIDNO:16:用于/^W基因擴(kuò)增的引物
SEQ ID NO: 17:用于/Z)/ 基因上游區(qū)擴(kuò)增的引物
SEQ ID NO: 18:用于#/ 基因上游區(qū)擴(kuò)增的引物
SEQ ID NO: 19:用于#/ 基因下游區(qū)擴(kuò)增的引物
SEQ ID NO: 20:用于/Z^基因下游區(qū)擴(kuò)增的引物
SEQ ID NO: 21:用于cW基因擴(kuò)增的引物
SEQ ID NO: 22:用于cW基因擴(kuò)增的引物
工業(yè)實(shí)用性
通過使用本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，可改進(jìn)噤呤核苷和/或噤呤核苷酸的 生產(chǎn)效率。
權(quán)利要求
1. 屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其具有產(chǎn)生嘌呤衍生物質(zhì)的能力，其中所述細(xì)菌已被修飾使得果糖二磷酸酶的酶活性減少。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中所述噪呤衍生物質(zhì)是 選自下組的一種或多種噪呤核苷肌苷、黃苷、烏苷和腺苦。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中所述噪呤衍生物質(zhì)是 選自下組的一種或多種噪呤核芬酸肌香酸、黃芬酸、鳥普酸和腺香酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中通過破 壞編碼果糖二磷酸酶的基因或減少編碼果糖二磷酸酶的基因的表達(dá)量來減少 所述果糖二磷酸酶活性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中編碼果糖二磷酸酶的 基因是編碼下列(A)或(B)的蛋白質(zhì)的基因(A) 包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B) 包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位并具有果糖二磷酸酶活性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一 步修飾使得磷g臾核糖焦磷酸合成酶活性增加。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一 步修飾使得噪呤操縱子的表達(dá)量增加。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中通過破壞pw^基因 來增加噤呤操縱子的表達(dá)量，所述基因是編碼噪呤搡縱子的阻抑物的基 因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn)一 步修飾使得噪呤核苷磷酸化酶活性減少。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其已被進(jìn) 一步修飾使得IMP脫氬酶活性減少。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其為枯草 芽孢桿菌。
12. 產(chǎn)生噤呤衍生物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌以在細(xì)菌的細(xì)胞或培養(yǎng)基中引起噤呤衍生物質(zhì)的積累，和 從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中收集所述噤呤衍生物質(zhì)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述嘌呤衍生物質(zhì)是嘌呤核苷或嘌呤核苷酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述噪呤衍生物質(zhì)是選自下組的一種 或多種噪呤核苷肌苷、黃苷、鳥苷和腺苷。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述嘌呤衍生物質(zhì)是選自下組的一種 或多種。票呤核苦酸肌苷酸、黃苦酸、鳥苷酸和腺苷酸。
16. 產(chǎn)生嘌呤核苷酸的方法，其包括 通過根據(jù)權(quán)利要求14的方法產(chǎn)生嘌呤核苷，將所述噤呤核苷與磷酸鹽供體，及微生物或酸性磷酸酶進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生 噪呤核普酸，所述磷酸鹽供體是選自下組的一種或多種聚磷酸、磷酸苯酯 和氨曱酰磷酸，所述微生物具有產(chǎn)生核苷-5'-磷酸酯的能力，和收集所述嘌呤核苷酸。
全文摘要
嘌呤物質(zhì)可如下生產(chǎn)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其能夠產(chǎn)生嘌呤物質(zhì)且具有減少的果糖二磷酸酶的酶活性從而在培養(yǎng)基或細(xì)菌的細(xì)胞中產(chǎn)生并積累嘌呤物質(zhì)，和從所述培養(yǎng)基或細(xì)胞中收集嘌呤物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N9/16GK101432417SQ200780014810
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者松野潔, 森由起子, 淺原貴之 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社