專利名稱：蝦和對(duì)蝦的性別特異性標(biāo)記的制作方法
蟲(chóng)下和對(duì)蝦的性別特異性標(biāo)記
本發(fā)明涉及蝦(shrimp)和對(duì)蝦(prawn)的性別特異性標(biāo)記。更特別 地，本發(fā)明涉及衍生自斑節(jié)對(duì)蝦(尸e"^M mom^o")的性別特異性的基于 PCR的分子標(biāo)記，其可用于確定蝦和對(duì)蝦的性別，并且可用于需要確定 蟲(chóng)下和對(duì)蟲(chóng)下的遺傳性別的任何及所有需求中，包括但不限于非常幼小的動(dòng) 物的性別確定、對(duì)任何動(dòng)物進(jìn)行的遺傳性別確定及單性培養(yǎng)物的建立。
蝦和對(duì)蝦的養(yǎng)殖和貿(mào)易在全世界均是非常重要的活動(dòng)。目前養(yǎng)殖的 主要品種是斑節(jié)X寸蟲(chóng)下尸ewae^ wcwocfo"(珍王節(jié)對(duì)蝦(Giant tiger prawn)、 墨吉對(duì)蟲(chóng)下 (Jumbo tiger prawn ) 、 Jumbo tiger shrimp 、 Black tiger prawn、 Blue tiger prawn、 草蟲(chóng)下(Grass shrimp)…)，主要在亞洲養(yǎng)殖， 2003年水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為大約600,000噸；va""awe/ (Whiteleg shrimp、南美白對(duì)蝦)，主要在美國(guó)、中國(guó)及泰國(guó)養(yǎng)殖，其水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量 與斑節(jié)對(duì)蝦(P. wo"o&")相當(dāng)。對(duì)于這些品種，水產(chǎn)養(yǎng)殖比捕獲更具重 要性。
對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的日益增加的需求意味著日益增加的開(kāi)發(fā)更有效的生產(chǎn) 系統(tǒng)的緊迫性。現(xiàn)代遺傳學(xué)越來(lái)越多地用于支持原種改良和育種程序 (Hulata, 2001)。近年來(lái)，基因組研究和基因作圖發(fā)展迅速。已經(jīng)鑒定了 DNA標(biāo)記用于建立系譜、連鎖圖譜及鑒別數(shù)量性狀基因座(QTL)。
由于大多數(shù)對(duì)蝦種CPe"aew )是性二態(tài)性的(sexually dimorphic) (Hansford and Hewitt, 1994)，因此進(jìn)行了許多嘗試試圖發(fā)現(xiàn)可有助于建 立和維持單性培養(yǎng)物的可靠的性別標(biāo)記。 一些研究小組開(kāi)發(fā)了連鎖圖 譜，主要基于使用AFLP標(biāo)記(Moore et al., 1999; Wilson et al., 2002)。 P&ez et al. (2004)公布了南美白對(duì)蟲(chóng)下(尸e"ae^ va朋ame/)的性別特異性 連鎖圖譜。然而，他們未鑒別性別相關(guān)的標(biāo)記或連鎖群。Li et al. (2003) 揭示了日本對(duì)蝦CPem^M^pom'cw)的性別特異性連鎖圖譜，在母體連鎖(maternal linkage)圖譜上具有推定的性別標(biāo)記。Zhang et al. (2006)公布了 南美白對(duì)蝦fP. v"""ame/)的連鎖圖譜，在雌性連鎖圖譜上存在性別相關(guān) 的微衛(wèi)星標(biāo)記。然而，在后兩種情況中，性別-標(biāo)記關(guān)聯(lián)在遺傳學(xué)不相關(guān) 的個(gè)體中未被質(zhì)疑。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是設(shè)計(jì)的群體(例如半同胞家系)內(nèi)相對(duì)較 低數(shù)量的樣品減數(shù)分裂導(dǎo)致相對(duì)較長(zhǎng)的染色體節(jié)段處于連鎖不平衡(LD)
中。因此，在這種連鎖研究中，在標(biāo)記與性別二態(tài)性之間觀測(cè)到的高 LD得自群體的性質(zhì)而不是得自緊密的物理連鎖。因此，通過(guò)連鎖分析 發(fā)現(xiàn)的處于與性別LD中的標(biāo)記通常不能在不相關(guān)個(gè)體群中區(qū)分兩種性 別。實(shí)際上，Li etal. (2003)承認(rèn)推定的標(biāo)記與性別特異性序列非必然相 連鎖，并且未揭示序列數(shù)據(jù)。此外，Zhang et al. (2004)使用AFLP方法 未能在中國(guó)對(duì)蝦(尸e"^w dm'eraW中鑒別性別特異性標(biāo)記。同樣， Khamnamtong et al. (2006)未能在f鬼節(jié)對(duì)蟲(chóng)下(尸e"aez^ mow cfow)中鑒另lJ'性另U 特異性標(biāo)記。
令人驚訝地，使用AFLP技術(shù)，我們能分離對(duì)蝦或蝦性別特異性序 列，由此可以明確進(jìn)行雄性和雌性的性別確定。為了鑒別性別特異性標(biāo) 記，使用AFLP技術(shù)在斑節(jié)對(duì)蝦CPewaews /w "o&")中進(jìn)行了大規(guī)模的混 合分組分析(bulked segregant analysis, BSA)。最初的篩選在一個(gè)實(shí)驗(yàn)性 作圖群體中進(jìn)行。候選的性別特異性標(biāo)記在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)性作圖群體 及在不相關(guān)的野捕成體的一個(gè)大集合中證實(shí)。兩個(gè)標(biāo)記在所有這些情況 中始終是性別特異性的。隨后將這兩個(gè)AFLP標(biāo)記之一轉(zhuǎn)變?yōu)榛赑CR 的共顯性標(biāo)記。
本發(fā)明的第一方面是對(duì)蝦或蝦性別特異性序列。如本文所用，性別 特異性序列是指可用于明確辨別雄性和雌性的序列。優(yōu)選地，所述性別 特異性序列長(zhǎng)度是有限制的，以便于鑒別雄性和雌性序列之間的小差 異。更優(yōu)選地，所述性別特異性序列長(zhǎng)度不超過(guò)2000個(gè)核苷酸，更優(yōu) 選不超過(guò)1000個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選不超過(guò)500個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選不 超過(guò)400個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，所述性別特異性序列包含SEQ ID N° 3禾口/或SEQ IDN。4或其功能片段。 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是由SEQ ID N°3 組成的雌性特異性序列。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是由SEQ ID N° 4組成 的序列，雄性針對(duì)該序列是純合的。如本文所用，功能片段是指攜帶性 別特異性單核苷酸多態(tài)性(SNP)和/或插入缺失(INDEL)的片段，和/或允 許這種性別特異性SNP和/或INDEL擴(kuò)增的片段。非限制性例子為，所 述特異性片段包含位于SEQ ID N° 3的第106、 121、 161、 191、 198和/ 或291位的SNP，和/或位于SEQ ID N。 3的第62、 111-117、 216和/或 272位的INDEL。優(yōu)選地，所述功能片段是引物，其包含、優(yōu)選地由 SEQ ID N°l或SEQ ID N° 2組成。所述引物可用于擴(kuò)增位于SEQ ID N° 3的第111-117位的性別特異性INDEL。優(yōu)選地所述對(duì)蝦或蝦屬于對(duì)蝦 科(尸e"ae/Jae)。更優(yōu)選地，所述對(duì)蟲(chóng)下或蟲(chóng)下是對(duì)蟲(chóng)下種(尸e朋ew ^ .)，包 括但不限于斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下CP. mo"o^9")、南美白對(duì)蝦(尸.va""awe/)、日本對(duì)蟲(chóng)下 CP.力;xw/cws)、印度對(duì)蟲(chóng)下CP. z>wfcw)、墨吉對(duì)蟲(chóng)下(尸.wergw/eraz》、許氏對(duì) 蟲(chóng)下(尸.sc/7m/m')和南美藍(lán)對(duì)奸(P. ^0^>oy/n'"。最優(yōu)選地，所述對(duì)4下或蟲(chóng)下是 斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下(尸."謂f^/o")。
本發(fā)明的另一方面是基于PCR的標(biāo)記在確定對(duì)蝦和奸的性別中的應(yīng) 用。如本文所用，基于PCR的標(biāo)記可以是使得在PCR擴(kuò)增時(shí)能夠無(wú)疑 義確定性別的任何核酸序列。優(yōu)選地，所述標(biāo)記的長(zhǎng)度是有限的，以便 于鑒別小的缺失。更優(yōu)選地，所述標(biāo)記的長(zhǎng)度不超過(guò)2000個(gè)核苷酸， 更優(yōu)選不超過(guò)1000個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選不超過(guò)500個(gè)核苷酸，最優(yōu)選 不超過(guò)400個(gè)核苷酸。如本文所用，核酸序列可以是任何核酸序列，包 括但非限于DNA、 cDNA禾卩RNA。所用的PCR技術(shù)可以是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的任何基于PCR的技術(shù)。優(yōu)選地，擴(kuò)增的序列選自如下組，所 述組包含、更優(yōu)選地由SEQ ID N° 3和SEQ ID N° 4或其攜帶性別特異 性SNP和/或INDEL的功能片段組成。優(yōu)選地，所述標(biāo)記使用選自由 SEQ ID N° 1和SEQ ID N° 2組成的組的引物擴(kuò)增。優(yōu)選所述對(duì)蝦或蝦屬 于對(duì)蝦科(Pe"ae/^^)。更優(yōu)選地，所述對(duì)蝦或蝦是對(duì)蝦種(戶^aew5 ^ .)，包括不限于斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下CP. wo"oA")、南美白對(duì)蟲(chóng)下(P. vaw7"we/)、日本對(duì)蟲(chóng)下 (P. j'a/ om'cw》、印度對(duì)蟲(chóng)下(尸./m^'cw力、墨吉對(duì)蟲(chóng)下(P. we,'gw/e"w力、許氏對(duì) 蟲(chóng)下(尸.sc/w7/m:)和南美藍(lán)對(duì)奸(尸.s(y//ms^;0。最優(yōu)選地，所述對(duì)奸或蟲(chóng)下是 斑節(jié)對(duì)蝦(尸.wo"oJo")。盡管基于PCR的標(biāo)記的檢測(cè)優(yōu)選使用基于PCR 的技術(shù)進(jìn)行，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它技術(shù)例如但非限于DNA-DNA雜交、微陣列技術(shù)或者DNA解鏈曲線圖可單獨(dú)或者與PCR擴(kuò)增組 合，用于檢測(cè)所述標(biāo)記序列。
本發(fā)明的再一方面是在對(duì)蝦和蝦中建立單性培養(yǎng)物的方法，所述方 法包括本發(fā)明的基于PCR的性別確定?；赑CR的性別確定可用于區(qū) 分雄性和雌性，并選擇進(jìn)行培養(yǎng)的生物體。然而，如本文所用，建立單 性培養(yǎng)物不是暗示著本發(fā)明的基于PCR的性別確定應(yīng)該用于每個(gè)培養(yǎng)周 期中。事實(shí)上，作為一個(gè)非限制性實(shí)例，本發(fā)明的基于PCR的性別確定 可以用于選擇同配雌性，其在與同配雄性雜交時(shí)產(chǎn)生完全一致的和異配 的雌性子代，因而獲得單性培養(yǎng)物。優(yōu)選所述方法包括使用選自由SEQ ID N° 1和SEQ ID N° 2組成的組的引物。更優(yōu)選地，通過(guò)基于PCR的 性別確定擴(kuò)增的序列選自由SEQ ID N° 3和SEQ ID N° 4組成的組或其 攜帶性別特異性SNP禾n/或INDEL的功能片段。優(yōu)選地，所述對(duì)蝦或蝦 屬于對(duì)蝦科CPe"fleWfle)。更優(yōu)選地，所述對(duì)蝦或蝦是對(duì)奸種OPe"aeiw W.)，包括但不限于斑節(jié)對(duì)蝦CP. wow cfo")、南美白對(duì)蝦(P. va""ame/)、 日本對(duì)蟲(chóng)下CP. )opo"/cMS)、印度對(duì)蟲(chóng)下(尸./"cfews)、墨吉對(duì)蟲(chóng)下(P. mergw/era&)、 i午氏X寸蟲(chóng)下(尸.sc/zw,"/)禾口南美藍(lán)X寸蟲(chóng)下(尸.^0^VoszW力。最{尤選 地，所述對(duì)蝦或蝦是斑節(jié)對(duì)蝦(P. mowxfo")。
附圖簡(jiǎn)述


圖1:使用INDEL-標(biāo)記對(duì)52個(gè)親蝦(broodstock)動(dòng)物的基因分型。 圖2:雌性特異性AFLP片段(A)和用于獲得這個(gè)片段的完整序列的 PCR片段(B-D)的示意圖。圖3:雌性和雄性斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下的RT-PCR擴(kuò)增的SNP的解鏈曲線。
實(shí)施例
實(shí)施例的材料和方法
動(dòng)激
通過(guò)將兩個(gè)雌性動(dòng)物(IC100與IC67)與兩個(gè)雄性動(dòng)物(AL91和AL99)
以所有四種可能的組合方式雜交產(chǎn)生的四個(gè)半同胞作圖群體(見(jiàn)表1)。
表h本研究中使用的四個(gè)半同胞作圖群體的親代和后代數(shù)目
群體雌性雄性后代數(shù)目雌性數(shù)目雄性數(shù)目疑問(wèn)*數(shù)目
AIC100AL91111554511
BIC67AL9111362456
C1C100AL9912059610
DIC67AL9912056577
*這些個(gè)體的表型性別不能無(wú)疑義確定。
所有四個(gè)親代均是新近野外捕獲的。所有雜交均在Moana Technologies公司進(jìn)行。當(dāng)每個(gè)個(gè)體的性別可以以可接受程度的確定性 被記錄吋，在幼體后期(PL) 120收獲作圖群體。另外，在Moana Technologies公司可獲得一組52個(gè)不相關(guān)的野捕動(dòng)物。這些個(gè)體用于評(píng) 價(jià)性別基因座與在作圖群體中鑒別的潛在的性別標(biāo)記之間的物理連鎖的 緊密性。
H戶嚴(yán)遂
使用針對(duì)蝦組織優(yōu)化的CTAB方法從速凍的腹肢組織中制備 DNA。 AFLP分析如Vos et al (Vos et al. 1995)所述進(jìn)行。親代和后代的 基因組DNA用EcoRI和Msel限制消化。雙鏈銜接子(adaptor)連接在限制片段的末端。稀釋所述消化產(chǎn)物，并使用在每個(gè)引物上具有單個(gè)選擇 性核苷酸的銜接子特異性引物預(yù)擴(kuò)增。在預(yù)擴(kuò)增水平產(chǎn)生了群體A的5
個(gè)個(gè)體的兩個(gè)集合或組(bulk)。在每個(gè)集合或組中，個(gè)體的性別是相同 的，但是它們對(duì)于所有其它基因座是任意的。使用含有2個(gè)額外的選擇 性核苷酸的AFLP-引物擴(kuò)增了限制片段的所選亞集。擴(kuò)增反應(yīng)在AFLP 測(cè)序凝膠上分離，并使用LI-CORlW技術(shù)觀測(cè)。
對(duì)群體A進(jìn)行混合分組分析(BSA)鑒別的性別特異性AFLP標(biāo)記(即 在兩個(gè)雌性組中存在，但是在兩個(gè)雄性組中不存在)被認(rèn)為是候選的性別 特異性標(biāo)記。隨后，對(duì)三個(gè)剩余的作圖群體的成組樣品進(jìn)行這些候選的 性別特異性標(biāo)記的檢測(cè)。然后檢測(cè)了在三個(gè)額外BSA分析中被證實(shí)與 性別相關(guān)的標(biāo)記與四個(gè)作圖群體中的每一個(gè)群體中的性別基因座的連 鎖。
為了通過(guò)連鎖最終評(píng)價(jià)所鑒別的標(biāo)記-性狀-關(guān)聯(lián)性的強(qiáng)度，我們用 發(fā)現(xiàn)與性別連鎖的AFLP標(biāo)記對(duì)52個(gè)不相關(guān)的野捕(親蝦)動(dòng)物(來(lái)自作圖 群體的4個(gè)親代及48個(gè)額外的樣品)進(jìn)行了基因分型。
靜
為了從AFLP標(biāo)記中獲得序列信息，將EcoRI-特異性引物使用33P-ATP放射性標(biāo)記，并將擴(kuò)增產(chǎn)物在5%變性測(cè)序凝膠上分離。使所述凝 膠干燥，并通過(guò)放射自顯影法顯現(xiàn)。在顯現(xiàn)之后，從凝膠中切離條帶， 對(duì)洗脫的片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。
大多數(shù)PCR反應(yīng)均在1XPCR緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液中補(bǔ)加了 1.5 ng/pl每種引物、0.2 mM每種dNTP、 2.5 mM MgCl2、 0.025 U的Taq 聚合酶及100 ng模板DNA。使用引物ATTGCA-1禾卩ATTGCA-2的PCR在20 pl總體積中進(jìn) 行，使用100 ng的基因組DNA作為模板。將反應(yīng)混合物加熱至95 °C 4 分鐘，隨后進(jìn)行35次如下循環(huán)95'C變性30秒，52。C退火30秒及72 。C延伸30秒。最后，在72。C進(jìn)行2分鐘的額外延伸步驟。
使用引物ATTGCA-1組合引物Msel+GCA或Msel+AAA的PCR以 及使用引物ATTGCA-2組合引物EcoRI+ATT的PCR在50 pl總體積中 進(jìn)行，使用5 ^的1/20稀釋的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)如下35次如下 循環(huán)95 。C變性30秒，適當(dāng)退火溫度(對(duì)于ATTGCA-1為55 。C，對(duì)于 ATTGCA-2為53 。C)退火30秒及72 。C延伸30秒；隨后在72 。C進(jìn)行2 分鐘的額外延伸步驟。
對(duì)于INDEL-標(biāo)記的PCR使用放射性標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的引物 INDEL-4進(jìn)行。反應(yīng)在1XPCR緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液中補(bǔ)加了 0.3 ng/|il每種引物、0.2 mM每種dNTP、 2.5 mM MgCl2、 0.025 U的Taq聚 合酶及50 ng基因組DNA。將反應(yīng)混合物加熱至95 。C 4分鐘，隨后進(jìn) 行35次如下循環(huán)95 。C變性30秒，55 °C退火30秒及72 °C延伸30 秒。最后，在72 。C進(jìn)行2分鐘的額外延伸步驟。對(duì)于熒光分析，進(jìn)行 的反應(yīng)基本與放射性分析一樣，不同之處是加入0.03 mM的IRD700-標(biāo) 記的INDEL-4引物以及加入0.3 mM的INDEL-5引物。引物序列在表2 中示出。
表2:本研究中使用的引物序列
;i物名稱
引物序列(5'-3')
EcoRI-特異性AFLP弓!物
Msel-特異性AFLP引物
ATTGCA-1
ATTGCA-2
INDEL-4
INDEL-5
GAC TGC GTA CCA ATT C
TGA GTC CTG AGT AA
TCT AAC AGT TCA TAA AGC ATC CTA T
TTA AGC ATA TAC TAA GAA TCC AT
GGG GTC GCG AAT GTA AAA TA
TTT TCA AAT GCA TAA CTG TTA GCT G基因組DNA通過(guò)在75 (il堿性裂解緩沖液(25 mM NaOH， 0.2 mM EDTA， pH = 12)中于95'C加熱30分鐘而從小組織樣品(例如5 mm的步 行足尖端)中制備。樣品在冰上冷卻，加入75 ^ll中和緩沖液(40mMTriS-HCl， pH = 5)。對(duì)5 )il的1/20稀釋的DNA進(jìn)行PCR。
使用Platinum sybr green qPCR supermix-UDG i式齊ll盒(Invitrogen)進(jìn) 行PCR，使用引物FemaleForward_2、 MaleForward—2禾CI Reverse_2。初 始的變性步驟(5分鐘，95。C)之后進(jìn)行40次如下循環(huán)95°C 20秒， 55°C 30秒，及72°C 20秒。隨后進(jìn)行變性(l分鐘，95。C)和復(fù)性(1分 鐘，40°C)。解鏈曲線分析在iCycler系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行。
引物序列
FemaleForward—2: GCGGGCGTTAGCTGATATTCATAATTCATGCTC MaleForward—2: GCGGGCAGGGCGGCGTTAGCTGATATTCATAATCCATGCAA Reverse—2 : AAGGGGTCGCGAATGTAAAATA
實(shí)施例l:標(biāo)記鑒別
在第一次篩選中，我們?cè)趤?lái)自作圖群體A的混合樣品(bulked samples)上分析了大約1,408禾中AFLP引物組合。AFLP EcoRI+3/MseI+3 引物組合產(chǎn)生50-80個(gè)AFLP片段。因此，所述混合樣品用超過(guò)70,400 個(gè)AFLP片段進(jìn)行了指紋分析。在這些片段中，13個(gè)片段經(jīng)BSA分析 鑒別為性別特異性的。為了證實(shí)這個(gè)結(jié)果，將來(lái)自其它三個(gè)作圖群體 (B、 C和D)的混合樣品(bulked samples)針對(duì)這13個(gè)性別特異性標(biāo)記進(jìn) 行指紋分析。在9例中可以證實(shí)所述標(biāo)記-性別關(guān)聯(lián)性。所有這些標(biāo)記均 存在于雌性組(bulk)中，但是在雄性組中不存在。
為了確定這九個(gè)標(biāo)記與性別基因座連鎖的緊密性，在四個(gè)作圖群體 的所有后代中對(duì)標(biāo)記進(jìn)行評(píng)分。表3中示出了重組頻率(即以作為分析的 個(gè)體總數(shù)的百分比表示的未示出條帶的雌性數(shù)目和示出條帶的雄性數(shù) 目)。表3:在四個(gè)作圖群體的每個(gè)群體中性別基因座與9個(gè)性別連鎖的 AFLP標(biāo)記的每一個(gè)標(biāo)記之間的重組頻率
標(biāo)記(*)POPAPOPBPOPCPOPD
IC100XAL911C67XAL911C100XAL991C67XAL99
E+AAG/M+CGC-72.80/1000/%0/1200/109
E+ACC/M+GGG-183.80/990Z890/1150/111
E+AAC/M+TAG-200.71/996Z942/1184/110
E+AGA/M+CAG-333.00/991Z920/1171/雨
E+CAG/M+GAG-148.20/980Z970/1160/112
E+ACT/M+GTC-284.40/980/980/1190/112
E+AAA/M+GTG-125.40/980/910/H90/112
E+CGG/M+TTG-柳.31/965/920/1190/1U
E+ATTZM;GCA-347.00細(xì)0/%0/1200/109
(*) E: EcoRI; M: Msel -表示出用適用的選擇性核苷酸延伸的表2 的特異性引物的序列。
為了評(píng)價(jià)遺傳學(xué)不相關(guān)的個(gè)體群體中AFLP標(biāo)記單元型與性二態(tài)性 的LD程度，對(duì)4個(gè)親代動(dòng)物和在太平洋一些區(qū)域新近野捕的48個(gè)額外 的親蝦動(dòng)物在九個(gè)性別連鎖的AFLP標(biāo)記基因座進(jìn)行了基因分型。在兩 個(gè)基因座，AFLP *示記等4立基因(EcoRI+AAG/Msel+CGC-72.8和 EcoRI+ATT/MseI+GCA-347.0)與斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下0P.Ano"c^o")的性別呈完全 LD。
實(shí)施例2:標(biāo)記測(cè)序
對(duì)相應(yīng)的EcoRl-特異性引物進(jìn)行放射性標(biāo)記。在變性聚丙烯酰胺測(cè) 序凝膠上分離AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用放射自顯影法觀測(cè)。雌性 EcoRI+AAG/MseI+CGC-72.8禾G EcoRI+ATT/MseI+GCA-347.0標(biāo)記等位 基因從AFLP凝膠中切離、洗脫、擴(kuò)增并測(cè)序。由于我們獲得多個(gè)可能 的序列，因此我們通過(guò)兩個(gè)額外的選擇性核苷酸增加了 AFLP反應(yīng)的選 皆性(+3/+3 AFLP反應(yīng)今+4/+4 AFLP反應(yīng))。現(xiàn)在獲得的雌性特異性片段為 EcoRI+AAGT/MseI+CGCT-72.8禾P EcoRI+ATTA/Msel+GCAT-347.0。對(duì)EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0標(biāo)記條帶的分離及隨后的測(cè) 序獲得唯一的序列。非特異性條帶妨礙了 EcoRI+AAGT/Msel+CGCT-72.8片段的分離及其隨后唯一序列的產(chǎn)生。另外，該序列較短，使得更 難以設(shè)計(jì)針對(duì)這個(gè)片段的特異性PCR 。因此，選擇標(biāo)記 EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成共顯性PCR-標(biāo)記。
對(duì)于標(biāo)記EcoRI+ATTA/Msel+GCAT-347.0，我們?cè)O(shè)計(jì)了 PCR引物 以在雌性和雄性個(gè)體中擴(kuò)增所述標(biāo)記。使用引物ATTGCA-1和 ATTGCA-2，我們能在雌性和雄性個(gè)體的基因組DNA上擴(kuò)增出大約285 個(gè)堿基對(duì)(bp)的片段。從凝膠中分離這些PCR片段并測(cè)序。這樣獲得這 個(gè)標(biāo)記的雌性和雄性特異性序列。對(duì)這些序列進(jìn)行仔細(xì)檢査揭示了這些 序列中的9個(gè)性別特異性多態(tài)性6個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)和3個(gè)插入/ 缺失(INDEL)多態(tài)性。其中一個(gè)INDEL導(dǎo)致雄性中存在額外的Msel限 制位點(diǎn)。這是最可能導(dǎo)致在雄性中不存在EcoRI+ATTA/Msel+GCAT-347.0 AFLP片段的多態(tài)性。為了獲得AFLP片段部分側(cè)翼區(qū)的序列信 息，使用引物ATTGCA-1和相應(yīng)的Msel-特異性AFLP引物(對(duì)于雌性為 M+GCA，對(duì)于雄性為M+AAA)以及使用引物ATTGCA-2和相應(yīng)的 EcoRI-特異性AFLP引物(對(duì)于雌性和雄性均為EcoRI+ATT)進(jìn)行了 PCR(見(jiàn)圖2)。對(duì)所得PCR片段進(jìn)行測(cè)序，使用這個(gè)額外的序列信息校 正先前獲得的序列(SEQ ID N。 3和4)。結(jié)果，檢測(cè)到雄性與雌性序列之 間的額外的序列多態(tài)性(INDEL)，該多態(tài)性在先前未被鑒別，因?yàn)槠湮?于引物ATTGCA-1耙向的序列中。
實(shí)施例3: AFLP標(biāo)記E+ATTA/M+GCAT-347.0轉(zhuǎn)化為基于PCR 的共顯性INDEL-標(biāo)記
為了將E+ATTA/M+GCAT-347.0 AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的單基因座 標(biāo)記，我們?cè)O(shè)計(jì)了引物以特異性擴(kuò)增攜帶被鑒別為性別特異性的INDEL多態(tài)性的基因組基因座。使用引物INDEL-4和INDEL-5，在來(lái)自群體A 的5個(gè)雄性和5個(gè)雌性動(dòng)物中擴(kuò)增了 76bp的等位基因片段，并僅在5個(gè) 雌性動(dòng)物中擴(kuò)增了 82bp的等位基因片段。這個(gè)結(jié)果證實(shí)在斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下中 (尸e"^w "w"oA")雌性是異配性別。針對(duì)一組52個(gè)不相關(guān)的親奸動(dòng)物 獲得相似結(jié)果，表明INDEL多態(tài)性與性別呈完全LD(見(jiàn)圖1)。用這個(gè) 標(biāo)記對(duì)另一組33個(gè)不相關(guān)的親蝦動(dòng)物進(jìn)行了基因分型，再次發(fā)現(xiàn)該 INDEL多態(tài)性與性別呈完全LD。
本文描述的PCR擴(kuò)增的標(biāo)記等位基因在斑節(jié)對(duì)蝦CPe"flew mo朋&") 中與與性二態(tài)性呈完全LD。這個(gè)標(biāo)記使得可以確定任何斑節(jié)對(duì)蝦個(gè)體 的遺傳性別，而不管其發(fā)育階段如何。
實(shí)施例4:針對(duì)斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下(尸.w緒o^")性別的基于RT-PCR的SNP
基因分型測(cè)定法的開(kāi)發(fā)
為了便于篩選大量的蝦，我們開(kāi)發(fā)了針對(duì)性別標(biāo)記的基于RT-PCR 的SNP基因分型測(cè)定法。針對(duì)雄性和雌性等位基因設(shè)計(jì)特異性正向引 物，并與通用的反向引物組合用于PCR中。在擴(kuò)增后，進(jìn)行解鏈曲線分 析。在雄性中僅觀測(cè)到一個(gè)峰，而在雌性中觀測(cè)到相應(yīng)于兩個(gè)等位基因 的兩個(gè)峰(圖3)。參考文獻(xiàn)
Hansford, S.W. and Hewitt, D.R. (1994). Growth and nutrient digestibility by male and female Penaus monodon: evidence of sexual dimorphism. Aquaculture 125， 147-154.
Hulata, G. (2001). Genetic manipulations in aquaculture: a review of stock improvement by classical and modern technologies. Genetica, 111, 155-173.
Khamnamtong, B., Thumrungtanakit, S., Klibunga, S. Aoki, T. Hirono, I. and Menasveta, P. (2006). Identification of Sex-specific expression markers in the giant tiger shrimp (Penaeus monodon). Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 39:1， 37-45.
Li, Y.， Byrne， K,, Miggiano, E., Whan， V.， Moore, S., Keys, S.， Croos, P., Preston, N. and Lehnert, S. (2003). Genetic mapping of the kuruma prawn Penaeus japonicus using AFLP markers. Aquaculture 219， 143-156.
Moore, S.S., Whan, V., Davis, G.P., Byrne, K., Hetzel, D丄S. and Preston, N. (1999) The development and application of genetic markers for the Kuruma prawn Penaeus japonicus, Aquaculture 173， 19-32.
P&ez, F.， Erazo, C., Zhi應(yīng)la, M.， Volckaert, F. and Calderon, J, (2004). A sex-specific linkage map of the white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei based on AFLP markers. Aquaculture 242, 105-118.
Vos; P., Hogers， R., Bleeker， M., Reijans, M.， van de Lee, T., Homes, M,, Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. And Zabeau， M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23, 4407-4414.
Wilson, K., Li， Y" Whan, V., Lehnert, S.， B畫(huà)e， K., Moore, S.， Pongsomboon, S.， Tassanakajon, A., Rosenberg, G., Bailment, E.， Fayazi， Z., Swan， J.， Kenway, M. and Benzie, J. (2002). Genetic mapping of the blacktiger shrimp Penaeus monodon with amplified fragment length polymorphism. Aquaculture 204， 297-309.
Zhang, L.， Kong， X.， Yu, Z.， Kong, J. And Chen， L. (2004). A survey of genetic changes and search for sex-specific markers by AFLP and SAMPL in a breeding program of Chinese shrimp (Penaeus chiniensis). J Shellfish Res 23, 897-901.
Zhang, L., C. Yang, Y. Zhang, L Li， X. Zhang, Q. Zhang and Z.J. Xiang. (2006) A genetic linkage map of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei): sex-linked microsatelHte markers and high recombination rates. Genetica [ePub ahead of print].
權(quán)利要求
1. 對(duì)蝦或蝦性別特異性序列。
2. 對(duì)蟲(chóng)下或奸性別特異性序列，其包含SEQ ID N°3或SEQ ID N。 4或其功能片段。
3. 權(quán)利要求2的對(duì)蝦或蝦性別特異性序列的功能片段，其包含SEQ IDN。 1禾口/或SEQ IDN。2。
4. 前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的對(duì)蝦或蝦性別特異性序列或其功能片段， 其中所述對(duì)蟲(chóng)下或蝦屬于對(duì)奸科(尸e"ae/^^)。
5. 權(quán)利要求4的對(duì)蝦或蝦性別特異性序列或其功能片段，其中所述 對(duì)蟲(chóng)下或蟲(chóng)下是斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下(尸醒醋w畫(huà)fifo")。
6. 基于PCR的標(biāo)記在確定對(duì)蟲(chóng)下和蝦的性別中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求6的基于PCR的標(biāo)記的應(yīng)用，其中擴(kuò)增的序列選自 SEQ ID N°3-SEQ ID N°4或其功能片段。
8. 權(quán)利要求6或7的基于PCR的標(biāo)記的應(yīng)用，其中使用選自SEQ ID N° 1至SEQ ID N° 2的引物擴(kuò)增所述標(biāo)記。
9. 權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的基于PCR的標(biāo)記的應(yīng)用，其中所述對(duì)奸或 蝦是對(duì)蝦種(Pe"aeiw w.)。
10. 權(quán)利要求9的基于PCR的標(biāo)記的應(yīng)用，其中所述對(duì)蝦或奸是斑 節(jié)X寸蟲(chóng)下(尸ewaews附owocfo")。
11. 在對(duì)奸或蝦中建立單性培養(yǎng)物的方法，包括基于PCR的性別確定。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述基于PCR的性別確定包括使用選 自SEQIDN。1至SEQIDN。2的引物。
13. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述基于PCR的性別確定包括 使用選自SEQ ID N°3至SEQ ID N°4或其功能片段的序列。
14. 權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)蝦或蝦是對(duì)蝦種
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述對(duì)蝦或蝦是斑節(jié)對(duì)蝦(尸e"ae附
全文摘要
本發(fā)明涉及蝦和對(duì)蝦的性別特異性標(biāo)記。更特別地，本發(fā)明涉及衍生自斑節(jié)對(duì)蝦的性別特異性的基于PCR的分子標(biāo)記，其可用于確定蝦和對(duì)蝦的性別，并可用于需要確定蝦和對(duì)蝦的遺傳性別的任何及所有需求中，包括但不限于非常幼小的動(dòng)物的性別確定、任何動(dòng)物遺傳性別的確定及單性培養(yǎng)物建立。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101432442SQ200780015173
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者F·范布羅賽格姆, J·斯塔埃郎, M·維爾斯特克 申請(qǐng)人:福拉姆斯大學(xué)生物技術(shù)研究所;根特大學(xué);比利時(shí)穆阿納股份有限公司