專利名稱：腎源干細胞繁殖、鑒別及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細胞及其用途。
背景技術(shù)：
已知許多成人組織含有多能干細胞，這些干細胞涉及維持組織完整性以及修復(fù)過程。損傷后再生腎臟組織的能力使得腎臟干細胞的可用性對于保護和治療任何類型 的腎損傷的前景而言非常重要。事實上，急性和慢性腎病已經(jīng)成為公眾健康危機，這是因為 其流行病學(xué)相關(guān)性以及替代療法(例如透析和移植)的高費用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明使得在其表面上共表達⑶133和⑶24標記的腎臟干細胞可用。


圖1顯示在成人腎臟腎小囊(即鮑曼氏囊)中⑶24和⑶133干細胞標記的共表 達以及識別細胞亞群。圖2涉及分離和表征⑶24+⑶133+細胞。圖3顯示⑶24+⑶133+細胞增殖能力與⑶24-⑶133-細胞的對比。圖4顯示源自腎小囊的⑶24+⑶133+細胞所得克隆分化為小管上皮細胞。圖5顯示源自腎小囊⑶24+⑶133+細胞所得克隆分化為成骨細胞和脂肪細胞。圖6顯示源自腎小囊的⑶24+⑶133+細胞所得克隆的神經(jīng)元表型和功能特性。圖7顯示注入急性腎衰竭(ARF)的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)鼠的人類腎臟 ⑶24+⑶133+細胞以及不同類型管狀細胞世代。圖8顯示⑶24+⑶133+細胞保護甘油處理的鼠的腎臟結(jié)構(gòu)和功能退化。具體實施方案本發(fā)明通過多能腎臟干細胞克服前述問題。事實上，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)可以在其表面共表達⑶133和⑶24標記(⑶24+⑶133+) 的腎臟細胞擁有干細胞能力。鑒別和分離腎臟干細胞。20個正常人腎臟已經(jīng)通過使用抗-⑶24和抗-⑶133單克隆抗體的共聚焦顯微鏡 檢查過。CD24(腎臟胚祖細胞標記)被發(fā)現(xiàn)選擇性地表達在腎小囊壁層上皮細胞上和小管 上皮細胞亞群內(nèi)?？?CD133單克隆抗體(選擇性識別源自各種人類組織的干細胞)檢測腎 小囊細胞亞群和少量小管結(jié)構(gòu)(圖1)。⑶24和⑶133的雙重免疫熒光顯示兩個標記識別的 腎小囊細胞亞群主要位于腎小球的尿極并且經(jīng)常延伸到最接近尿極的小管部分(圖1)。同 樣的細胞也被抗-CD106單克隆抗體所標記。總的說，這些結(jié)果意味著在成人腎臟中在腎小 囊上皮水平的細胞群和少量小管上皮細胞存在，在其中不同的干細胞標記被共表達，如圖1所示，各圖詳述如下a)雙重免疫熒光著色，顯示⑶24(紅)和⑶133(綠)在源自成人的腎小囊細胞 中的表達。兩個疊加的著色圖案(黃)顯示⑶24和⑶133共表達在位于尿極的細胞亞群 (標尺(Bar) 50um)o To-pro-3染色劑復(fù)染細胞核(藍)。b)雙重免疫熒光著色，在更高的放大率下發(fā)現(xiàn)，顯示⑶24(紅)和⑶133 (綠)在 腎小囊細胞中表達。兩個著色圖案的疊加顯示CD24和CD133共定位在細胞質(zhì)中以及面對 腎小球(G)的細胞膜上，而只有⑶24表達在基底膜(黃色，BarlOym)。To-pro-3染色劑 復(fù)染細胞核(藍)。c)用兩種不同抗-⑶133單克隆抗體檢測⑶133?？贵w293C3 (紅)和抗體 AC133(綠)著色同一腎小囊中的細胞亞群。顯示所有著色圖案的疊加圖像顯示同一細胞的 共染色(黃，Bar50 u m)。To-pro-3染色劑復(fù)染細胞核(藍)。 d)在腎小球?qū)蛹墮z測CD24 (紅)、⑶133 (綠)和CD29 (藍)。CD29著色使得識別 入球微動脈(AA)。疊加的圖像顯示⑶24和⑶133選擇性共表達在位于血管極對側(cè)的細胞 亞群(黃，Bar50iim)。e)三重免疫熒光著色，在更高放大率下發(fā)現(xiàn)，顯示⑶24(紅)、⑶133(綠)和 ⑶106(藍)在囊細胞的表達。疊加圖像顯示⑶24和⑶133(黃)在細胞質(zhì)中以及在面對腎 小球(G)的細胞膜上共定位，而⑶24和⑶106 (紫色)共表達在基底膜上。⑶24、⑶133和 ⑶106共表達的可見區(qū)域被染成白色(BarlOiim)。⑶24+⑶133+細胞然后被分離以便評估它們的形態(tài)和功能特征。為了這個目的， 腎臟組織的皮質(zhì)部分從髓質(zhì)部分分離出并被壓碎。通過使用不同孔目篩網(wǎng)的標準分離工 藝分離腎小球。為避免破壞腎小囊CD24+CD133+細胞，腎小球懸濁液沒有被消化而是直接 在塑料盤中培養(yǎng)，所述塑料盤中含有添加有20%胎牛血清(FBS)的微血管上皮細胞培養(yǎng)基 (EGM-MV)。來自培養(yǎng)的腎小球的細胞被檢查其形成類似神經(jīng)干細胞的細胞聚集的能力，它 們的干細胞顯型由共聚焦顯微鏡評估并用流式細胞儀分析，如圖2所示，下面對各圖進行 詳細描述a)左側(cè)第一個圖顯示增殖細胞，這些細胞來自培養(yǎng)的腎小球小囊(x40)。隨后的 圖像是通過激光共焦顯微鏡而得，其顯示增殖細胞群表達⑶24(綠)。To-pro-3染色劑復(fù) 染細胞核(藍)。疊加圖像顯示增殖細胞表達大量⑶24 (Bar 100 iim)。a)雙重免疫熒光著色檢測⑶24 (紅)和⑶133 (綠)表達，顯示兩個標記在源自增 殖腎小球細胞的群體中的選擇性共定位。To-pro-3染色劑復(fù)染細胞核(藍)。疊加的圖像 強烈地顯示⑶24和⑶133在同一細胞中著色(黃，BarlOO u m)。c)原代培養(yǎng)的腎小囊細胞表現(xiàn)為同質(zhì)群，其包括100%表達⑶24、⑶133、⑶106、 ⑶105和⑶44的細胞，并且對⑶31和⑶34內(nèi)皮細胞標記測試成陰性。流式細胞儀分析也
被顯示出來。d)源自⑶24+⑶133+腎小囊細胞的原代培養(yǎng)沒有表達腎系標記，例如⑶35或 EMA-1，如在頭兩個圖中流式細胞儀分析所示。通過共聚焦顯微鏡顯示同一細胞沒有表達 THG(第三個圖)和LTA(第四個圖)(BarlOOym).陰性組織化學(xué)著色堿性磷酸酶(最后一 個圖)。所表現(xiàn)的培養(yǎng)被顯示。e)通過“實時定量RT-PCR”測量在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞、腎臟小管上皮細胞、系膜細胞、足細胞和平滑肌細胞、⑶24+⑶133+細胞和人胚腎細胞(HEK)中0ct_4mRNA的水平。結(jié) 果表達為5個不同捐贈者的原代培養(yǎng)的三次測量平均士SD。e)通過“實時定量RT-PCR”測量在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞、腎臟小管上皮細胞、系膜細 胞、足細胞、平滑肌細胞，⑶24+⑶133+細胞和HEK細胞中Bml-lmRNA水平。結(jié)果表達為5個 不同捐贈者的原代培養(yǎng)的三次測量平均士SD。被分離細胞表達⑶24和⑶133而不表達造血(⑶34，⑶45)、內(nèi)皮(⑶31，⑶34)，足 細胞或小管上皮(EMA-1，荊豆凝集素，雙花扁豆凝集素(DBA)、堿性磷酸酶)標記(圖2)。為了更好定義分離出來的干細胞特性，0ct_4( —種典型胚干細胞標記)的表達與 Bml-l (另一種轉(zhuǎn)錄因子，其對于維持干細胞的自我更新能力以及防止細胞老化是決定性 的)的表達被一起評估，因此證實⑶24+⑶133+細胞的干細胞本性(圖2)。這也是第一次 描述培養(yǎng)的表達干細胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4和Bml-l的腎源細胞。為了評估是否⑶24+⑶133+細胞也具有干細胞的功能特性，所述培養(yǎng)的細胞也被 羧基熒光素乙酰乙酸(CFDA-SE)標記，并涂在有20%FBS的EGM-MV中。增殖數(shù)據(jù)顯示所述 細胞與不共表達CD133和CD24標記的其它腎臟細胞相比具有明顯高的增殖能力。事實上，⑶24-⑶133-細胞(即，不表達⑶133和⑶24)是從成人腎臟皮質(zhì)組織制 得的，所述組織通過酶法(例如膠原酶)消化以降解結(jié)締組織，然后通過免疫方法(特別是 免疫磁分法)進行分離的。這些細胞然后被涂在相同基質(zhì)上，粘附后，由流式細胞儀分析評 估。⑶24+⑶133+細胞與⑶24-⑶133-細胞以1:1比例涂在同一培養(yǎng)皿的不同培養(yǎng)基上，經(jīng) 過10天培養(yǎng)后，⑶24+⑶133+和⑶24-⑶133-細胞比例變?yōu)榇蠹s9 1 (圖3)。為了進一步證 實培養(yǎng)的CD24+CD133+細胞具有干細胞功能特性，所述來自培養(yǎng)的腎小球的細胞被分離， 單細胞在涂覆有纖維連接蛋白的多孔板中通過有限稀釋法克隆。由免疫磁分法分離并在涂 覆有纖維連接蛋白的多孔板中通過有限稀釋法克隆的CD24-CD133-細胞被用作對照；只有 含有單個細胞的孔被評估?？寺撃転?1.3 士 14% (源自培養(yǎng)的腎小球的⑶24+⑶133+細 胞)以及2. 1 士 1.9 (⑶24-⑶133-細胞)。同樣注意到極少量源自⑶24-⑶133-細胞克隆是 因為小區(qū)域污染⑶24+⑶133+細胞。為了評估培養(yǎng)的CD24+CD133+細胞分化不同類型細胞的能力，源自不同供體的單 個CD24+CD133+細胞克隆被培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件為有利于成管、成脂、成骨和神經(jīng)源性分化。成管分化是通過在商用腎臟商品細胞培養(yǎng)基(REBM)中孵育⑶24+⑶133+細胞30 天得到的，所述的培養(yǎng)基中含有SingleQuoteM商品名)(氫化可的松、人表皮生長因子 (hEGF)、FBS、腎上腺素、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸、運鐵蛋白和慶大霉素/兩性霉素-B) (Cambrex Bio Science 公司出品)，以及 50ng/ml 肝細胞生長因子(HGF) (Peprotech, Rocky Hill，NJ公司出品)。⑶24+⑶133+細胞克隆的成骨、成脂和神經(jīng)源性分化是通過如前述所誘導(dǎo)。對于 成骨誘導(dǎo)，PEC⑶24+⑶133+細胞被培養(yǎng)在a-MEM基質(zhì)中，該基質(zhì)中添加有10%馬血清、 100nM地塞米松、50iiM抗壞血酸和2mM雙甘油磷酸鹽(所有這些試劑由Sigma-Aldrich 公司出品)。培養(yǎng)基在3周時間內(nèi)每周更換2次。對于成脂分化，CD24+CD133+細胞在高糖 DMEM 中孵育(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA 出品)，其添加有 10%雙 FBS、1 ii M 雙地塞米 松、0.5 ii Ml-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)、10iig/ml胰島素和100yM吲哚美辛(所有 試劑由Sigma-Aldrich公司出品)。72小時后，基質(zhì)被換為DMEM高糖(添加有10% FBS、10iig/ml胰島素)，24小時。這些處理被重復(fù)3次。細胞然后保持在添加有10% FBS和 10 u g/ml胰島素的高糖DMEM中再一個星期。對于神經(jīng)源性分化，⑶24+⑶133+細胞被涂在 高糖DMEM (含10 % FBS)。24小時后，培養(yǎng)基由DMEM高糖(添加有10 % FBS、B27 (Invitrogen 公司出品)、10ng/ml 雙 EGF (Peprotech 公司出品)和 20ng/ml bFGF (Peprotech 公司出品)) 替換。5天后，細胞被清洗并在DMEM(添加有5 u g/ml胰島素、200 u M吲哚美辛和0. 5mM IBMX，無FBS)中孵育5小時。以已經(jīng)描述過的方法進行茜素紅、油紅0或堿性磷酸酶著色 [#jALRomagnani P.等:CD14+CD341ow cells with stem cell phenotypic andfunctional features are the major source of circulating endothelial progenitors. Circ Res97 314-322,2005 ；Boquest AC 等.Isolation and transcriptionprofiling of purified uncultured human stromal stem cells -alteration of geneexpression after in vitro cell culture. Mol Biol Celll6 :1131-1141,2005 ；Pittenger MF 等 Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science284 143-147，1999]。成管分化的被證實是基于完全分化的腎臟小管內(nèi)皮細胞的標記特征的采集的評 估，例如堿性磷酸酶、氨基肽酶A(由近端小管內(nèi)皮細胞主要表達)，噻嗪類_敏感的Na-Cl 協(xié)同轉(zhuǎn)運子(由遠端小管內(nèi)皮細胞主要表達)，EMA_1，荊豆凝集素、雙花扁豆凝集素和水孔 蛋白1、3)。這些標記由共聚焦顯微鏡檢測，流式細胞儀分析，mRNA由定量RT-PCR確定(圖 4)。結(jié)果顯示在圖4，下面對各個圖進行詳細描述a)典型的堿性磷酸酶組織化學(xué)著色的⑶24+⑶133+細胞顯微照片，在利于成管分 化的培養(yǎng)基中孵育之前(第0日)和之后(第30日)。原始放大率分別為x65，x80和 x320。b) LTA著色，在利于成管分化培養(yǎng)基中孵育之前(第0日)和之后(第30日)，共 聚焦顯微鏡評估(綠)。To-pro-3藍復(fù)染細胞核(BarlOO u m)。c)THG表達，在利于成管分化培養(yǎng)基中孵育之前(第0日)和之后(第30日)，共 聚焦顯微鏡評估(綠)。To-pro-3藍復(fù)染細胞核(BarlOO u m)。d)LTA(綠)和THG(紅)雙重著色，顯示同一共表達不同小管片段標記的細胞的克 隆上的共存在(疊加圖像，黃)，以及表達近端或遠端小管標記的細胞(BarlOOym)。e) RT-PCR測量在利于成管分化培養(yǎng)基中30天后小管標記的mRNA增長水平，該水 平是與相同細胞分化前的值相比的。柱圖顯示分化后所得50個克隆的平均士SD值。f)左顯微圖像顯示共焦熒光染色圖。圖像記錄在488nm激勵波長，添加血管緊 張素II (1 P M)之前和之后(Bar20 y m)。右每10個不同被檢克隆中5個單獨細胞中熒光 染色密度變化時間動力學(xué)圖。成脂分化的證實是通過評估所得表征細胞形態(tài)學(xué)以及油紅0液泡陽性著色。另 外，定量RT-PCR顯示脂連素mRNA水平的急劇升高(圖5)。細胞克隆形成堿性磷酸酶陽性 克隆的能力來評估成骨分化；在分化期，這些克隆進入礦化結(jié)節(jié)，如茜素紅著色所示，檢查 到細胞鈣富集沉淀。成骨被進一步通過分析Rimx2mRNA表達證實。成脂和成骨分化結(jié)果顯 示在圖5，下面對各圖進行詳細描述a)左表示茜素和堿性磷酸酶組織化學(xué)著色顯微照片，在利于成骨分化的培養(yǎng)基中孵育CD24+CD133+細胞(xlOO)之前(第0日)和之后(day21)。右測量Runx2mRNA水 平，在同一培養(yǎng)基中孵育之前(第0日)和之后(第21天)。柱圖顯示所得50個不同克隆 的平均士 SD。b)左油紅0組織化學(xué)著色顯微照片，在利于成脂分化的培養(yǎng)基中孵育 ⑶24+⑶133+細胞(x200)之前(第0日)和之后(第21天)。插入少量分化的細胞在更 高放大率U320)下檢測。右測量脂連素mRNA水平，在同樣培養(yǎng)基中孵育的第0日和第21 天。柱圖顯示所得50個不同克隆的平均士SD。神經(jīng)源性分化的證實是基于采集的tau蛋白、微管相關(guān)蛋白(MAP-2)、神經(jīng)元特異 性烯醇化酶、巢蛋白、膽固醇-酰基轉(zhuǎn)運酶、微管蛋白III和神經(jīng)絲蛋白200等神經(jīng)元 類形態(tài)學(xué)和高表達(在mRNA和蛋白質(zhì)水平)。另外，電生理學(xué)研究使得可以證實所得神經(jīng) 元細胞顯示的電位依賴于鈣和鈉通道有完整神經(jīng)類特征，如圖6所示，下面詳述各圖a)在利于神經(jīng)源性分化的培養(yǎng)基中孵育⑶24+⑶133+細胞前沒有NF200，NFM， ChAT和MAP-2神經(jīng)元標記，由共聚焦顯微鏡所評估，To-pro-3復(fù)染細胞核(BarlOO y m)。典 型實驗被顯示。b)在同樣培養(yǎng)基下細胞質(zhì)分化后強烈表達NF200、NFM、ChAT和MAP-2神經(jīng)元標記 (綠)。To-pro-3復(fù)染細胞核(BarlOO iim)。典型實驗被顯示。c)更高放大率的典型實驗顯示采集的典型神經(jīng)形態(tài)學(xué)，以及ChAT著色(綠)在利 于神經(jīng)源性分化的條件下孵育CD24+CD133+細胞(BarlOO u m)。d) “實時定量RT-PCR”測量與同樣細胞在神經(jīng)源性分化前相比在利用神經(jīng)源性分 化條件下孵育細胞后神經(jīng)元標記mRNA水平增加的區(qū)別。柱圖顯示50個不同克隆的平均 士 SD。e-h)源自CD24+CD133+細胞的神經(jīng)元中Ca2+和Na+電流。記錄在電勢為_90mV脈沖為l_s的電流被施用在-80_50mV范圍(10_mV增加)。數(shù) 據(jù)在不同的取樣時間(在測試開始的100ms為50 ys，在剩余時間為1ms)獲得以檢測L型 Ca2+電流1&快速和慢速現(xiàn)象和時間動力學(xué)；為了清楚，只有記錄在-60，-40，-20，0，20，30 和40mV的電流跟蹤被顯示。f為Iea_V曲線，其被確定在電流峰值(n = 26)。g為Na+電流 INa時間動力學(xué)；只有記錄在-60，-40，-30，-20，-10，0，20和30mV的電流跟蹤被顯示；紅線 顯示INa在OmV以及存在TTX(1 u M)時被誘導(dǎo)。h為INa_V曲線，其被確定在電流峰值(n = 26)。f，h數(shù)值疊加的連續(xù)線表示活化函數(shù):Ia(V) =Gmax(V-Vrev)/{l+eXp[(Va-V)/kJ}，其中 G_是最大電導(dǎo)系數(shù)，是電勢的表觀倒置(apparent inversion)，Va是使得電導(dǎo)系數(shù)升 高到最大值一半的電勢，ka是斜率因子。i為在-90mV電勢下引起的INa失活；只有沒有預(yù) 脈沖(_90mV)以及有-70，-60，-30，-40e-30mV預(yù)脈沖的跟蹤被顯示。j為規(guī)格化的INa失 活曲線，數(shù)值疊加的連續(xù)線表示失活函數(shù)Ih(V)=丨/！^+^？卜作^力/！^丨，其中乂！^是觸發(fā) 一半最大電流值的電勢，kh是失活斜率因子。作為對比，這個曲線位于激活曲線右側(cè)。根據(jù)本發(fā)明，⑶24+⑶133+細胞也通過免疫磁分法從膠原酶消化的腎臟組織中提 純分離出來，同樣分離出⑶24-⑶133-細胞。在這個情況下，所要的細胞通過提純前述所得細胞懸濁液得到，先CD133然后 ⑶24或者反過來。這樣可以事實上得到所有⑶24+⑶133+細胞。這樣所得的群體是混 合有腎小囊細胞群和源自少量表達CD133和CD24的腎臟小管上皮細胞的細胞?？傮w，
7⑶24+⑶133+細胞群為大約全部腎臟細胞的0. 5-9%，因個體而不同。所有上述實驗也重復(fù) 于上述免疫磁選法分離所得的CD24+CD133+群，并證實腎臟含有具有再生和放大能力成人 干細胞群，其表征在于共表達CD133和CD24標記，其大部分來自腎小囊尿極的極少部分來 自于腎臟小管上皮細胞。另外，本發(fā)明還涉及治療用途的組合物，其含有如上述的具有共表達⑶133+和 CD24+標記的能力并具有成管、成脂、成骨和神經(jīng)源性再生能力的腎臟干細胞。另外，本發(fā)明涉及上述細胞用于制備用于修復(fù)腎臟損傷的組合物的用途。急性腎小管壞死的SCID鼠模型被用于測試本申請所鑒別的分離自成人腎臟的干 細胞，其可以再生受損腎臟組織。這個模型肌肉注射高滲甘油，這導(dǎo)致大規(guī)模肌溶解和溶 血，結(jié)果為嚴重小管損傷和急性腎臟衰竭。小管損傷的峰值出現(xiàn)在注射后第三天，然后10 天后自然恢復(fù)。損傷區(qū)域評估是通過蘇木精/伊紅著色，顯示廣泛的小管上皮細胞壞疽，形 成透明小管柱，從近端管小管上皮細胞失去細胞邊緣刷和扁平化。在第三和第四天，經(jīng)由相同程序，一組8個鼠在尾部靜脈注射1. 5xl06⑶24+⑶133+ 細胞，而另一組8個鼠被注射生理鹽水，第三組8個鼠注射1. 5xl06⑶24-⑶133-腎臟細胞。 ⑶24+⑶133+干細胞在受損腎小管中的整合通過使用標記有熒光染料PKH26(紅)并同時分 別用LTA和雙花扁豆素標記小管近端和遠端來證實。另外，干細胞群在小管結(jié)構(gòu)中整合通 過免疫組織化學(xué)方法證實，該方法使用對人細胞特效的HLA-I抗原以及角蛋白作為常規(guī)上 皮細胞標記。最后，用于Y染色體的熒光原位雜交(FISH)方法被用來檢測注射在雌性SCID 鼠中的源自男性人類供體的腎臟細胞。三種方法結(jié)果顯示CD24+CD133+細胞質(zhì)腎小管被注 射的SCID鼠的腎小管中選擇性整合。而在注射生理鹽水或⑶24-⑶133-人腎臟細胞的鼠 中沒有融合，如圖7所示，下面對各圖進行詳述a)經(jīng)典顯微鏡顯示，由蘇木精/伊紅(左)鬼筆環(huán)肽(綠，右)染色的正常鼠腎臟 組織(Bar50 u m)。b)小管壞疽在肌肉注射甘油后被觀測到，通過蘇木精和伊紅(左)或鬼筆環(huán)肽 (右)著色，后者顯示上皮細胞失去邊緣刷和扁平化(綠，Bar50 u m)。c)顯微照片顯示注射有人⑶24-⑶133-腎臟細胞的急性腎衰竭的SCID鼠腎臟片 段；通過共聚焦顯微鏡(Bar20 u m)，LTA著色顯示沒有紅色染色細胞。d)顯示注射CD24+CD133+細胞(PKH26-標記(紅)處理過，LTA (綠)染色)的急 性腎衰竭鼠腎臟片段，共聚焦顯微鏡顯示。小箭頭指示存在許多紅色細胞。大箭頭顯示近 端小管(Bar20 u m) e)更大放大率的腎片段在d)顯示近端小管結(jié)構(gòu)再生(Bar20 u m)。f)更大放大率的另一腎臟片段，其獲得于急性腎衰竭SCID鼠，注射有PEC ⑶24+⑶133+細胞(PKH26-標記(紅)處理過，且DBA染色在兩個小管結(jié)構(gòu)的基底面(綠))， 顯示小管結(jié)構(gòu)再生(箭頭)。另一小管結(jié)構(gòu)由PKH26染色，但是沒有采集管標記DBA，可見 (Bar20u m)。g)雙重免疫組織化學(xué)著色角蛋白(藍)和人I型HLA抗原(紅)在甘油誘導(dǎo)急性 腎衰竭SCID鼠的腎臟中。左注射⑶24-⑶133-細胞的鼠的腎片段的小管中缺乏紅色信號； 中間和右側(cè)在角蛋白中人I型HLA抗體陽性細胞著色(紅，箭頭)從注射PEC CD24+CD133+ 細胞后的急性腎衰竭SCID鼠中顯示小管(藍)。
h) FISH技術(shù)檢測Y染色體，注射生理鹽水的對照鼠(左側(cè))和注射源自男性人腎 臟的⑶24+⑶133+細胞的雌性鼠腎臟(紅，中間和右側(cè))(Bar20 u m)。在腎臟中鑒別這個群體，并證實他們的修復(fù)能力，具有重要的意義對于再生醫(yī)療， 以治療腎病。最后，⑶24+⑶133+多能腎臟干細胞群島體內(nèi)修復(fù)能力以及隨之而來的恢復(fù)腎臟 功能已經(jīng)通過兩個不同的實驗方法證實。事實上，注射甘油后在⑶24+⑶133+細胞處理的 以及注射生理鹽水的鼠中多次測量到氮血癥。對比注射生理鹽水的鼠和⑶24+⑶133+細胞 處理的鼠，顯示出，注射甘油14天后，明顯低的氮血癥值，這個值被充分對比于誘導(dǎo)腎損傷 前同一鼠所測量到的值。此外，纖維化區(qū)域通過“ a -SMA”著色來評估(同一鼠注射甘油14 后)。與注射生理鹽水的鼠群相比，注射⑶24+⑶133+細胞的鼠群顯示明顯低的纖維化區(qū) 域，如圖8所示，各圖詳述如下a.血氮水平(BUN)在不同的時間間隔下對接受生理鹽水(紅線)和⑶24+⑶133+ 細胞(黑線)的甘油處理鼠進行測量。柱圖表示平均士SD值，對于每個時間點n = 8;總 共80個鼠 *p<0. 01且**p<0. 001與甘油+生理鹽水以相同次數(shù)相比。b.在第14天比較健康鼠(白)、生理鹽水處理鼠(淺灰)和⑶24+⑶133+細胞處 理鼠(深灰)的血氮水平(BUN)。c.顯微照片生理鹽水處理鼠腎臟，a -SMA染色(綠)。細胞核由To-pro-3染色 (BarlOOum)。d.顯微照片，⑶24+⑶133+細胞處理鼠腎臟，a -SMA染色(綠)。細胞核由 To-pro-3 染色(Bar 100 u m)。
權(quán)利要求
腎臟干細胞，其特征在于其共表達CD133和CD24標記。
2.如權(quán)利要求1所述的細胞，其中所述標記是⑶133+和⑶24+。
3.如權(quán)利要求1和2所述的腎臟細胞源自腎小囊。
4.如權(quán)利要求1和2所述的腎臟細胞源自腎小囊尿極。
5.如權(quán)利要求1和2所述的腎臟細胞源自緊鄰腎小囊的腎小管部分。
6.組合物，其包括權(quán)利要求1-5所述的腎臟干細胞。
7.分離如權(quán)利要求1-5所述的腎臟細胞的工藝，其中-腎臟腎小球通過使用不同滲透性的篩網(wǎng)的標準分離技術(shù)被分離出來； -所得腎小球懸濁液被直接培養(yǎng)在塑料盤中，所述塑料盤中含添加有20%胎牛血清的 微血管上皮細胞培養(yǎng)基；-源自培養(yǎng)的腎小球并表達⑶133和⑶24標記的細胞被分離。
8.分離如權(quán)利要求1-5所述的細胞的工藝，通過使用CD133和CD24標記經(jīng)免疫磁選法 從膠原酶消化的整個腎臟組織中分離出來。
9.如權(quán)利要求1-5所述干細胞群在制備用于修復(fù)腎臟損傷的組合物中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細胞具有成管再生能力。
11.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細胞具有成脂再生能力。
12.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細胞具有成骨再生能力。
13.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細胞具有神經(jīng)源性再生能力。
全文摘要
新穎的源自腎臟的細胞群被描述，該細胞群表面共表達CD133和CD24標記；所述細胞具有干細胞能力可以進行成管、成脂、成骨和神經(jīng)源性分化。
文檔編號C12N5/071GK101868535SQ200780015410
公開日2010年10月20日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者保拉·洛馬納尼, 塞喬·洛馬納尼, 恩里克·馬奇 申請人:卡瑞奇大學(xué)醫(yī)院公司