專利名稱：靶核酸序列電化學檢測方法
靶核酸序列電化學檢測方法
組件(collection)。
已知的方法借助電化學檢測，已經(jīng)為鑒定給定的生物樣品中靶核酸序 列的存在與否提供了可能。
這些方法尤其為檢測核酸中的靶序列，例如給定的病毒的部分基因型 (patrimoine g6n6tique)的相應序列提供了可能。
根據(jù)已知的技術(shù)， 一旦鑒定了該核苦酸序列，隨即制備由含有所述序 列的寡核苷酸形成的探針，然后將這些探針連接到固相支持物上。探針包 含給定數(shù)目的、具有可氧化的核苷酸堿基的核苷酸。然后將給定的生物學 樣品與接枝(graft)了所述探針的固相支持物相接觸，使得在合適的條件下， 包含靶序列的核酸與探針雜交。隨后使雜交的核酸與能夠氧化探針中核苷 酸堿基的過渡金屬絡(luò)合物(complex)發(fā)生反應，然后通過對樣品施加可變電 場，同時測量樣品中傳播的電流，來確定雜交的存在與否如果生物學樣 品中含有包含所述靶序列的核酸，則會發(fā)生雜交。所述電流繼而依賴于所 述能夠被氧化的給定堿基的數(shù)目。事實上，當進行電位掃描(potential scan) 并同時記錄樣品中傳播的電流時，取決于探針是否與包含靶序列的核酸雜 交，以電流表示的響應會有所不同。在任何情況下，發(fā)生雜交的探針的核 普酸堿基氧化的電流值高于與未雜交的核苷酸堿基的氧化相關(guān)的電流值。
具體地，可以參考文件US 2002/106 683，其中描述了 一種這樣的4全測 方法。
然而，這樣的方法實施起來相對復雜，因為需要特別制備寡核苷酸探 針以接枝到固相支持物上，此過程時間長而且費用高。
因此，這樣一個問題被擺在了人們面前提供一種不僅易于操作而且 更加經(jīng)濟的方法。本發(fā)明旨在解決這個問題。
為了解決該問題，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提出了一種電化學檢測靶核 酸序列的方法，所述方法是屬于這樣的類型，根據(jù)該類型提供可含有至 少一種核酸分子的生物學樣品，所述核酸可以含有給定的靶序列，將所述生物學樣品與氧化劑混合，所述靶序列含有可以被所述氧化劑氧化的堿基；
提供可以與所述給定的耙序列偶聯(lián)的互補裝置(complementary means );向 所述樣品施加電場，所述電場能夠引起所述氧化劑與所述核芬酸堿基的反 應，并測量通過所述樣品的電流以確定所述靶序列的存在；根據(jù)本發(fā)明， 所述互補裝置包含適合于復制所述靶序列的可活化的擴增裝置，所述擴增 裝置包含至少這樣的核苷酸，所述核苷酸屬于包含所述核普酸堿基的類型， 其中所述類型的所述核苷酸能夠在復制中被消耗從而構(gòu)成復制的核酸 (replicated nucleic acids)，如果當所述擴增裝置被活化時電流有所降低，則 確定所述給定的靶序列的存在。
因此，本發(fā)明的一個特點在于實施一種用于擴增核酸以及同時測量電 流的方法，該電流的測定證明或不證明在所述擴增期間擴增裝置的元件之 一(具體地說，游離核苷酸之一)的消耗。這樣，如果靶核酸序列與可活化的 擴增裝置很好地對應，則該靶序列將在擴增過程中被復制，在該復制期間 用作底物的游離核苷酸(其濃度在開始時被確定)的數(shù)目將會減少。因此，如 果游離的核苷酸數(shù)目發(fā)生有利于摻入擴增中合成之核酸的核苷酸數(shù)目的降 低，則能夠與氧化劑反應的、與游離核苷酸對應的核苷酸堿基的量將可能 越來越有限，結(jié)果電子轉(zhuǎn)移將減少，最終所測得的電流將會減少。不過， 在下面的詳述中，我們將更詳細地說明以下幾點氧化劑還可以氧化起初 存在的核酸中摻入的核苷酸的堿基，和通過復制而合成的核酸中摻入的核 香酸的堿基，但是另一方面，由此產(chǎn)生的電流弱于由游離核苷酸堿基氧化 而產(chǎn)生的電 流。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別有利的實施方案，尋求在其上鑒定靶序列的核 酸是單鏈或雙鏈的DNA或RNA分子。因此，可活化擴增裝置包含適合于 雜交靶序列上游(hybridizing upstream of)的裝置和實現(xiàn)所述序列復制的裝 置。該復制所產(chǎn)生的核酸數(shù)目隨時間呈指數(shù)增加，從而顯示可氧化的核苷 酸堿基的游離核苷酸的數(shù)目也隨時間呈指數(shù)降低，與此同時，能夠很快地 發(fā)現(xiàn)到通過樣品的電流的降低。
有利的是，游離核苷酸的含氮堿基是嘌呤核苷酸堿基，例如鳥嘌呤或 鳥噤呤的化學類似物(例如疏基鳥嘌呤或氧代鳥嘌呤(oxoguanine)型)，使用 的氧化劑是釕絡(luò)合物。后者具有還原形式和氧化形式，后者不可逆地催化 鳥嘌呤的氧化。當對混合物施加電場時，由此產(chǎn)生的電流的測量值顯著地依賴于具有鳥嘌呤的游離核苷酸的濃度，這是因為，盡管氧化劑也氧化摻 入復制產(chǎn)生的核酸中的核苷酸的鳥噤呤，游離核苷酸的氧化動力學以及擴 散系數(shù)比所述復制產(chǎn)生的核酸大得多。
此外，由于從所述靶序列的復制而產(chǎn)生的核酸數(shù)目依賴于時間，通過 樣品的電流的降低也依賴于時間。因此，如果起始樣品具有高濃度的核酸， 并且如果這些類型相同的核酸全都具有靶序列，核普酸的消耗將越發(fā)大。 因此，將會更快的發(fā)現(xiàn)測得的電流變化。相反，如果核酸濃度較低，觀察 到電流的變化則需要較長的時間。因此，所述發(fā)明可以應用于對把序列的 定量測定。
因此，在實踐中，將施加電場并測量由此產(chǎn)生的電流(例如在零時間點)， 然后定期地進行測量，以便記錄電流在整個擴增過程中的降低?？蛇x擇地， 在經(jīng)過一段確定的時間之后記錄電流。
事實上，從因果關(guān)系上看，具有鳥。票呤殘基的游離核苷酸的濃度在擴 增開始前為最大值，因而，能夠通過樣品的電流也為最大值。隨后，將擴 增期間的或擴增后的電流測量結(jié)果，與在擴增過程中已實施的測量結(jié)果相 比較，可以評估出差異。如果在這些測量的過程中，觀察到電流的顯著降 低，這意味著具有鳥嘌呤殘基的游離核苷酸已被消耗，由此可知樣品中確 實存在具有靶序列的核酸。在詳述部分中，將更詳細地說明在作出靶序列 存在的結(jié)論之前，還要進行哪些進一步的驗證工作。
此外，該電流是在預先設(shè)定的時間內(nèi)施加對同 一擴增而言相對恒定的 電場之后測量的。這是因為，在施加電場的時刻與由此通過樣品的電流處 于最大值的時刻之間，有一個瞬時期，在此期間樣品中存在的離子化化學 物種的運動性將增加到最大。因此，為了提供最大的靈敏度，優(yōu)選在電流 處于最大值時(即經(jīng)過一段預先設(shè)定的時間后)對其加以測量，對此在下文將 具體說明。無論在什么情況下，電流的測量都是通過已知的電化學技術(shù)來 進行的，所述電化學技術(shù)是電勢掃描伏安法型，可以是線性伏安法、循環(huán)
伏安法、或脈沖掃描伏安法；或者是電勢階躍型，如計時電流分析法。
此外，優(yōu)選地，將所述電場施加于適合浸入所述樣品中的電極之間。 例如，將電場施加到一個基于金屬氧化物、或基于碳、或基于貴金屬的電 極，與一個參考電極之間，二者都浸沒在樣品中，注意在同一次擴增的每 次電流測量中確保電極有恒定的活性表面，以確保電流的變化是由電荷載體的減少而非表面的變化所導致的?？梢赃x擇例如用金或鉑等貴金屬制成 的電才及。
根據(jù)本發(fā)明的另 一 個特別有利的實施方案，將所述氧化劑限制于其中 一個所述電極的表面上，這可以利用施加于電才及上的、將氧化劑精確地加
以封禁(trap)的凝膠、膜(membrane)或薄膜(film)來實現(xiàn)；或者通過將偶聯(lián) 有氧化劑的聚合物整個吸附或接枝(grafted )到其中 一個電極的表面上來實現(xiàn)。
根據(jù)另 一個方面，本發(fā)明提出了 一種用于靶核酸序列電化學檢測的組 件，所述組件包含用于容納可能含至少一種核酸的生物學樣品的裝置，所 述核酸可包含給定的耙序列，所述生物學樣品與氧化劑混合，所述靶序列 包含能夠被所述氧化劑氧化的核苷酸堿基；能夠偶聯(lián)所述給定的靶序列的 互補裝置；用于向所述樣品施加電場的裝置，所述電場能夠引起所述氧化 劑與所述核苷酸石威基的反應，以及測量通過所述樣品的電流以確定所述靶 序列的存在的裝置；根據(jù)本發(fā)明，所述互補裝置包含適合于復制所述靶序 列的可活化擴增裝置，所述擴增裝置包含至少這樣的核苷酸，所述核苷酸 屬于包含所述核苷酸堿基的類型，其中所述類型的所述核苷酸能夠在復制 中被消耗從而構(gòu)成復制的核酸；并且，如果所述核酸含有所述給定的靶序 列，則當活化所述擴增裝置時，所述測量裝置給出逐漸降低的電流值。
參照附圖閱讀下文以非限定性說明的方式給出的本發(fā)明具體實施方 案，將明了本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點。在附圖中
-

圖1:示意性顯示在實施本發(fā)明方法過程中發(fā)生的化學和電化學反應 的反應圖解；
-圖2:根據(jù)本發(fā)明第一個實施方案的本發(fā)明方法的第一個組件的示意
-圖3根據(jù)本發(fā)明第二個實施方案的本發(fā)明方法的第二個組件的示意
-圖4電流變化的曲線與所施加的電位的函數(shù)關(guān)系的圖，該圖說明本發(fā) 明的方法；
-圖5表示電流的降低作為擴增過程的函數(shù)的圖； -圖6用于實施本發(fā)明方法的第二組件的示意圖； -圖7表示電壓測量曲線的圖。根據(jù)本發(fā)明電化學檢測靶核酸序列的方法，致力于將擴增核酸方法的 的實施，和電化學方法的實施結(jié)合起來，從而能夠追蹤某一特定化學物種 的減少，這種減少反應所述靶核酸序列的存在。這種擴增方法(下面將描述 之)是"PCR類型"，代表聚合酶鏈式反應。但是，也可以使用任何其他擴增
方法達到同樣的效果。特別列舉下面的方法"LCR，，型方法，代表連接酶鏈 式反應；"SDA，，，代表鏈置換擴增；"RCA"，代表滾環(huán)擴增；"NASBA，，代 表基于核酸序列的測定或擴增；或"HDA",代表解旋酶依賴性等溫DNA擴增。
"PCR"型方法的原理在于反復地利用DNA聚合酶的一種屬性，使用 組成DNA的兩條互補雙鏈和一對引物進行復制，來合成兩條起始鏈的兩條 新鏈拷貝；其中引物是大約20個堿基的小核酸鏈，能夠借助堿基互補性與 各自要復制的DNA鏈特異雜交。當然，引物是根據(jù)要在核酸上找出的靶序
列而選擇的。
除了 DNA聚合酶一一它們使得在引物結(jié)合到鏈上后，從該引物合成互 補鏈成為可能——之外，還要提供核苷酸，具體地說是組成DNA的四種核 苦酸dGTP、 dATP、 dTTP和dCTP (分別為脫氧鳥嘌呤三磷酸，脫氧腺嘌呤 三磷酸，脫氧胸腺嗜啶三磷酸和脫氧胞嘧啶三磷酸)，聚合酶將它們組裝以 形成復制的互補鏈。
而且，反應基質(zhì)——其中加入了可能含有靶核酸序列的檢測樣品、DNA 聚合酶、引物及四種核苷酸，形成反應混合物——當然是液態(tài)的并被緩沖 的。此外，根據(jù)該方法，在同一循環(huán)的整個過程中，該反應混合物將交替 地承受溫度變化，這些溫度變化對應于不同階段核酸的變性、雜交、延 伸。常^見地，反應混合物可以連續(xù)地經(jīng)歷大約30個循環(huán)。
此外，作為本發(fā)明的一個主題，將上面已經(jīng)描述過原理的擴增方法與 電化學裝置偶聯(lián)起來，用于在擴增循環(huán)過程中，在適當?shù)臅r候，顯示四種 核苷酸中 一種的消失，屬于四種類型中 一種的所述核苷酸通過DNA聚合酶 的作用纟參入互補DNA鏈。
為做到這一點，使用氧化劑[尤其是釕絡(luò)合物，例如三(2,2，-二吡啶基) 釕(II)]，氧化劑在它的氧化態(tài)能夠氧化含有鳥嘌呤的核苷酸上的鳥嘌呤 dGTP。當然，任何其他的能夠氧化鳥嘌呤的氧化劑都可以使用，例如IrC1,。 如圖1所示，電極10浸沒在液態(tài)反應基質(zhì)12中，氧化劑4參入上述反應混合物中，當對該混合物施加電場時，氧化劑首先從其還原態(tài)14變化為氧化
態(tài)16,如箭頭F,給出一個電子到電極IO。此外，在它的氧化態(tài)形式16， 氧化劑能夠接著氧化正好具有一個鳥噪呤殘基的核苷酸18的一個鳥噪呤， 其中所述核苷酸18或者是游離的，或者插入核酸中。如箭頭R,在氧化該 鳥嘌呤時，氧化劑同時被還原，而確定地被氧化的鳥噤呤再不參與反應。 在電極上測得的電流，即電子流，實質(zhì)上是由于含有一個鳥噤呤殘基的游 離核苦酸的氧化而來的電流，而基本上不是由于插入到DNA鏈中的核香酸 引起的。擴散系數(shù)的差異可能是一種解釋，那些含有鳥噤呤殘基的游離核 苷酸與那些含有摻入核酸中的鳥。票呤殘基的核苷酸之間鳥。票呤氧化動力學 的差異也可能是一種解釋。
因此，如果在擴增循環(huán)期間中，包含鳥。票呤的核芬酸以與其他核苦酸 同樣的程度被消耗，來合成復制的核酸(從統(tǒng)計學上說其包含的上述四類核 苷酸中每一類的數(shù)目幾乎是相同的)，電子流自身也將相應降低，從而電極 上測得的電流也將相應降低。
為了說明本發(fā)明的方法，在下文中將描述一個示例性的實施方案。
圖2顯示根據(jù)第一個實施方案的管30,它可安裝在熱循環(huán)儀32中，熱 循環(huán)儀32可以使管30達到預設(shè)的各個溫度，這些溫度代表根據(jù)"PCR"型擴 增方法的各個步驟。常規(guī)地，在循環(huán)的第一個步驟，將管在94。C加熱數(shù)秒 以使核酸變性，在此處核酸為DNA。接著，在歷時約一分鐘的第二步中， 將溫度迅速降低到58。C以使引物雜交。然后，將管升溫至72°C也保持一 分鐘，活化DNA聚合酶，以使互補鏈延伸。接著，開始新的一輪循環(huán)。
反應混合物34在管30的沉淀36中，引入管30的兩個電極38、 40浸 沒在反應混合物34中。其中的一個電極，38,是例如碳電極，而另一個電 極40是參比電極。這些電極38、 40各自連接于恒電位器42,這樣可以根 據(jù)給定的曲線變更兩電極之間的電位，同時記錄通過它們的電流。
根據(jù)第二個實施方案(在圖3中再現(xiàn)了其中主要的部件)，擴增方法在全 部方面均與上述的方法相同。然而，測量不再在擴增期間進行，而是在擴 增結(jié)束時進行。此處，沒有將電極直接引入管30，而是將反應混合物34本 身引入一個或多個微量容器44，如在圖3中所示。將這些微量容器44無漏 密封在"集成電路，，型的板46上，該板上面絲網(wǎng)印刷了電極48、 50。這些電 極48、 50各自有一個活性端52、 54，它們位于微量容器44的底部并分別向著接觸端56、 58伸出。用與上面提到的第一個實施方案相同的方式，接
觸端56、 58能夠連接到恒電位器上以將電場施加于微量容器44中的反應 混合物。
要注意的是這些微量容器44同樣適合于上面提到的"NASBA"、 "RCA,, 或"HDA"類型的擴增方法。
應用實例1
在下文中將詳細描述所述方法的 一個應用實例，用于檢測生物學樣品 中巨細胞病毒(CMV)的存在。該病毒的基因組具有明確鑒定的由406個堿基 對組成的序列，使用兩個允許特異擴增該序列的商業(yè)引物AC1和AC2 (Argene公司索引60-003和60-004 )。反應混合物的全部體積等于50|il, 含有濃度為0.8 |amol/l的兩種引物，100 pmol/1濃度的四種核苷酸，每nl0.02 單位的濃度的聚合酶，20(imol/l濃度的釕絡(luò)合物，以及十倍稀釋的10X緩 沖液。當然，反應混合物含有的生物學樣品，在此處為4參入了巨細胞病毒 的細胞提取物。
電化學測量使用恒電位器42,應用伏安法技術(shù)，在兩個電極38、 40 或52、 54之間施加電位變化，例如，從相對于甘汞電極0.5V的初始電位， 升至1.3V (相對于同一甘汞電極)的終末電位，掃描速率可在每秒O.Ol到 IOOV之間。同時，在電位掃描期間記錄由此產(chǎn)生的電流。
參考圖4,其中兩條伏安測量曲線通過恒電位器以0.1 V.s-'的速率記錄， 作為施加于上述電極間的電位差的函數(shù)，在此表示為電流密度。第一條曲 線60代表根據(jù)上面提到的實驗在第二個擴增循環(huán)所測得的電流變化。生物 學樣品初始含有100, 000拷貝的靶序列。該曲線到達第一個極值62,約 68 nA/cm2,第二條曲線64代表根據(jù)上面提到的實驗在第三十個擴增循環(huán)所 測得的電流變化。該曲線到達第一個極值66,約56 ^A/cm2。該極值66比 第一個極值62低約12 ^A/cm2。
此外，預先明確地證實，用上面提到的擴增裝置對不含巨細胞病毒的 生物學樣品實施上面提到的方案的兩個步驟，結(jié)果獲得兩條基本相同的曲
線。因此，當病毒不存在于生物學樣品中時，則不發(fā)生擴增。
因此，比較兩條曲線60、 64顯然可見，在30個擴增循環(huán)后，電流強 度相對于其擴增前的初始值有所下降。因而，纟艮顯然生物學樣品的核酸中巨細胞病毒的存在被相應引物AC1和AC2所識別，明顯地發(fā)生了互補鏈的
延伸，同時消耗核苷酸，尤其是dGTP型的含有鳥噤呤殘基的核苷酸，因為
釕絡(luò)合物氧化劑只能夠氧化這種核苷酸的堿基。此時，電流的測量值，實
質(zhì)上就是對應于釕絡(luò)合物的還原，同時對應于含有dGTP的鳥嘌呤核苷酸的 氧化的電子流的測量結(jié)果。因此，當后者核苷酸部分消失時(由于它們摻入 到互補核酸中)，它們游離態(tài)的量降低，并且隨之由此產(chǎn)生的氧化電流也降低。
進一步，現(xiàn)在參考圖5中所示的圖，對在給定樣品中對核酸靶序列定 量的原理進行說明。
沿圖x軸80是復制的循環(huán)數(shù)目，沿y軸82呈現(xiàn)的是根據(jù)圖2所述實 施方案在給定的電位下每個循環(huán)所記泉的電流經(jīng)標準化后的值。這些標準 化的電流值對應于電流測量值除以擴增開始前進行的電流測量的測量值。
所示的5條曲線84、 86、 88、 90、 92，代表分別從含有下列拷貝數(shù) 的CMV靶序列的生物學樣品開始而作得的曲線0拷貝的CMV靶序列， 84; 1,000拷貝的所述靶序列，86; 10,000拷貝的所述靶序列，88; 100,000 拷貝的所述靶序列，90;以及1 ，000,000拷貝的所述靶序列，92 。
因此，應注意的是，在生物學樣品中包含靶序列的核酸的含量越高， 通過樣品的電流作為循環(huán)數(shù)目函數(shù)的降低就越迅速。這是因為，在樣品中 最初時包含靶序列的核酸的含量越高，復制就會越多地消耗dGTP類型的核 苷酸，因此，電流就越早作為循環(huán)數(shù)目的函數(shù)而下降。這樣可以理解，有 可能通過確定通過樣品的電流的量開始變向(infl&hir)時的循環(huán)數(shù)，來測量 摻入耙序列的核酸的量。此外，該圖5還顯示，即使初始存在于樣品中的 靶序列只有1，000個拷貝，所述靶序列的存在仍是可以檢測到的。
因此，對可能含有經(jīng)鑒定的病毒的生物學樣品應用根據(jù)本發(fā)明的方法， 不僅可以通過實施擴增方法以及電化學測量來顯示所述病毒的存在與否， 還可以對其加以定量。因此，相比于待才全材料制備復雜的先前技術(shù)所用方 法，根據(jù)本發(fā)明，只需要進行常規(guī)的擴增方法，然后在擴增期間，使生物 學樣品—接觸電場并測量由此產(chǎn)生的電流。該方法使用常M4廣增方法絕不4吏
用的氧化劑來顯示某一種類(在此處是在含有鳥嘌呤殘基或與鳥嘌呤相同功 能的化合物的核苷酸類型)的消失。此外，氧化劑的選擇將依賴于希望測量 其消失的核苷酸類型的性質(zhì)。上文的示例性實施方案涉及雙鏈核酸，即DNA分子。然而，通過使用
合適的擴增裝置，其絕對能夠應用于RNA或DNA類型的單鏈核酸。在這 兩種情況中，這些核酸的擴增導致含有鳥噪呤的核苦酸的消耗，從而導致 基質(zhì)中隨著擴增過程的發(fā)生該種化合物減少。
因此，本發(fā)明主題的方法的任何實施方案，無論是上文所述支持圖2 的第一種方法，或由參考圖3所描述的第二種方法，都通過實施貫穿擴增 全過程的測量來評估電流值發(fā)生顯著降低的時刻。這樣可以不僅揭示靶 DNA序列的存在，還能間接推出包含待測靶序列的核酸的初始濃度。這是 因為，包含耙序列的核酸的初始拷貝數(shù)目越高，電流將越早降低，相反地， 拷貝數(shù)目越低，將越晚觀察到電流的降低。
而且，根據(jù)在圖6中表示的另一方面，本發(fā)明還涉及特別適合于電化 學檢測耙核酸序列的組件(collection )。該組件包含至少一個如圖3所示的 微量容器94，用于容納生物學樣品95，但是此情況下其裝備有熱絕緣。該 微量容器94底部具有絲網(wǎng)印刷的電極96，所述電極連接到恒電位器P。而 且，該微量容器94置于兩個Peltier-effect模塊98、 100之間，所述模塊通 過適于調(diào)節(jié)微量容器94內(nèi)部溫度的發(fā)電機連接。以這種方式，可以使生物 學樣品95的溫度突變(according to abrupt variations)到最高達94°C的范圍內(nèi) 的溫度，就像上面提到的PCR類型的方法一樣。此外，將可活化的擴增材 料，尤其是含有可氧化的核苷酸堿基的核苷酸，添加到生物學樣品中。
因此，圖6中示出的可由計算機控制的組件，適合于自動地提供"靶 序列確實包含在置于微量容器94中的樣品中，，的信息，并且，如果確實如 此，還可以提供包含該靶序列的核酸的濃度的信息。
因此計算機加載有計算機程序，該程序能夠根據(jù)預先確定的循環(huán)同時 運行復制裝置(即Peltier-effect模塊98、 100)并在循環(huán)之間運行恒電位器， 以測量給定的電位值條件下通過樣品95的電流量。
此外，當使用擴增裝置時，對所述電極的表面條件進行修飾。而且， 進行擴增循環(huán)時，反應混合物的溶劑(在此處為水)在所施加的溫度易于蒸 發(fā)。溶劑的任何蒸發(fā)就本身而言均會導致溶質(zhì)濃度的升高。
因此，電流的測量值(其與消耗的核苷酸堿基的濃度成比例)可能并不完
全與擴增的核酸的量相關(guān)。
因此，由此帶來的潛在問題是，如何能夠克服電極干擾和溶劑蒸發(fā)。要做到這一點，根據(jù)本發(fā)明的另一個特別有利的實施方案，檢測方法
還包含下面步驟提供氧化還原化合物，其能夠在移位(shifted)的電場值條 件下反應，該移位的電場值與所述氧化劑和所述核苷酸堿基反應時的電場 值不同；測量在所述移位的電場下的氧化還原電流值；如果當所述擴增裝 置被活化時，氧化還原電流和所述氧化劑與所述核苷酸堿基反應的電流之 間的電流差異有所減少，則證實所述給定的靶序列的存在。
因此，通過選擇氧化還原化合物，或內(nèi)標，例如二茂鐵，紫羅堿或鋨 絡(luò)合物(其氧化電位相對于所述氧化劑和所述核苷酸堿基的氧化電位已移
位，例如800mV)，氧化還原化合物的氧化不會干擾對氧化劑和石咸基的氧化 電流的測量。此外，該氧化劑不會干擾可活化擴增裝置。
根據(jù)與該實施方案一致的第一個實施方案(可參考圖7),在同一實驗中 對單獨樣品進行電流測量值的標準化。
因此，在這樣的反應混合物中使用樣品，所述反應混合物除了下述幾 點之外與上面提到的應用實例的反應混合物是相同的以50)aM的濃度摻入 二茂鐵曱醇，并且在兩個電極間施加電位變化，從50mV開始到1300mV 終止。因此在圖7中呈現(xiàn)的伏安測量曲線是對第一個擴增循環(huán)獲得的。
這條曲線不再具有單一極值，而是有兩個極值。第一個極值210位于 相對于飽和甘汞電極1100mV左右，與在圖4所示的曲線的極值相應，第二 個極值220位于200mV左右，與二茂鐵曱醇的氧化相應。第一個極值是由 氧化劑釕絡(luò)合物的氧化所導致的，相應的電流測量值是約32pA，而第二個 極值是由氧化還原化合物的氧化所導致的，約2|iA。
在電位在50mV與1300mV之間電位掃描同時記錄電流強度之后，將 相應于第一個極值210的電流的值(在圖7所示的實施例中是32pA)除以相 應于第二個極值220的電流的值2)LiA,而使相對于第一個極值210的電流 標準化，從而得出16。
接下來，對于所述實驗的所有擴增循環(huán)都實施同樣的程序。這樣，兩 個極值210、 220的強度值之差的變化的測量值，僅僅因于核苦S臾堿基(此處 為dGTPs)濃度的降低，使得克服實驗條件成為可能。
因此，根據(jù)第二個實施方案，分別向一系列如圖3中所示類型的微量 容器引入一系列樣品，對這些樣品實施同樣的程序，來實施一系列實驗。 有利的是，這些生物學樣品來自同一來源，這里，問題是確證給定耙序列的存在。因此，對于每一個實驗，通過將相應于氧化劑氧化的強度值分別 標準化，則它們互相之間是可比較的，因為它們與電極的體積和表面條件 的變化無關(guān)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一另外的實施方案，核苷酸真實消耗的檢測得 到了改善，從而可以在進行少數(shù)擴增循環(huán)之后做出靶序列存在的結(jié)論。因 此，減少了確i貪所需的時間。
此外，如上面提到的第二個實施方案所表明的，可以不考慮操作條件 來進行測量值的比較。
應用實例2
此外，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法不僅適用于病毒，同時也適用于細菌。 因此，可以利用來檢測細菌的存在，尤其是氧化木糖無色桿菌
(爿c/zramo6ac/er x少/oso;aWa似)，它的可動遺傳因子，更具體地"i兌是整合子， 對于抗生素抗性基因的獲得起著關(guān)鍵作用。
因此，鑒定了該細菌菌抹的三個特征性DNA片段，并且通過PCR型 方法加以擴增。實施本發(fā)明的方法，使得通過鑒定含有約900個堿基對的 第一基因'^6-/"來檢測上面提到的細菌的存在成為可能。該基因編碼beta 內(nèi)酰胺酶，這種酶賦予對各種抗生素，尤其是對阿莫西林和替卡西林的高 水平抗性?？苫罨瘮U增裝置包括四種核苷酸、DNA聚合酶及一對該基因特 異性的引物"VEB-F"和"VEB-R"，將它們摻入到包含所述細菌的生物學樣品 中。
由此觀察到的伏安圖(voltamogram)與圖4所示的相似。根據(jù)實驗條件， 相應于擴增開始前的電流測量值的第一條曲線，在電位值約1.075 V處表現(xiàn) 出一個大約6pA的極值。在擴增后產(chǎn)生的第二條曲線表現(xiàn)出降低了約1 的極值。因此，電流的降低是擴增期間核苷酸的消耗，進一步說，是'VA-尸' 基因的有效存在的結(jié)果。
以同樣的方式鑒定并檢測到了上面提到的細菌的第二個特征性片段， 100個堿基對的"/w/尸基因。
所述細菌的第三個2500個堿基對的特征性片段，也可以用類似的方式 檢測到。該第三個片段的核苷酸序列相應于所述整合子的含有所有表達框 的可變區(qū)，包括"^6-/"基因。因此，作為本發(fā)明主題的方法可以應用于通過不同方案，利用不同的 可活化擴增裝置或生物學試劑盒，擴增不同大小的遺傳材料片段。
權(quán)利要求
1. 一種電化學檢測靶核酸序列的方法，所述方法是這樣類型的方法，根據(jù)該類型-提供可能含有至少一種核酸的生物學樣品，所述核酸能夠包含給定的靶序列，所述生物學樣品與氧化劑相混合，所述靶序列包含至少一種能夠被所述氧化劑氧化的核苷酸堿基；-提供能夠與所述給定靶序列偶聯(lián)的互補裝置；-對所述樣品施加電場，所述電場能夠引起所述氧化劑與所述核苷酸堿基的反應，并且測量通過所述樣品的電流以確定所述靶序列的存在；其特征在于，所述互補裝置包含適合于復制所述靶序列的可活化擴增裝置，所述擴增裝置至少包含屬于含有所述核苷酸堿基的類型的核苷酸，其中所述類型的所述核苷酸能夠在復制期間被消耗而構(gòu)成復制的核酸；還在于，依次-將所述生物學樣品和所述氧化劑與所述可活化擴增裝置相混合；和-活化所述可活化擴增裝置，以便如果電流降低，則確定所述給定的靶序列的存在。
2. 權(quán)利要求1中要求的檢測方法，其特征在于所述核酸是DNA或RNA 分子。
3. 權(quán)利要求1或2中要求的檢測方法，其特征在于所述核苷酸堿基是 嘌呤含氮堿基。
4. 權(quán)利要求3要求的檢測方法，其特征在于所述核苷酸堿基是鳥嘌呤 或鳥噤呤化學類似物。
5. 權(quán)利要求1至4中任一所要求的檢測方法，其特征在于所述氧化劑 是釕絡(luò)合物。
6. 權(quán)利要求1至5中任一所要求的檢測方法，其特征在于，由于所述 靶序列隨時間而#皮復制，在施加給定時間的所述電場之后測量所述電流。
7. 權(quán)利要求1至6中任一所要求的檢測方法，其特征在于所述靶序列 根據(jù)擴增循環(huán)而被復制，還在于在給定數(shù)目的循環(huán)之后測量所述電流。
8. 權(quán)利要求1至7中任一所要求的檢測方法，其特征在于將所述電場 施加于適合浸入所述樣品的電極之間。
9. 權(quán)利要求8中要求的檢測方法，其特征在于所述電極之一是基于金屬氧化物的電極。
10. 權(quán)利要求8中要求的檢測方法，其特征在于所述電極之一是基于 貴金屬的電極。
11. 權(quán)利要求8中要求的檢測方法，其特征在于所述電極之一是碳電極。
12. 權(quán)利要求8至11中任一項所要求的檢測方法，其特征在于將所述 氧化劑限制于所述電極之一的表面。
13. 權(quán)利要求1至12中任一項所要求的檢測方法，其特征在于其還包 含下列步驟-還提供氧化還原化合物，其能夠在移位的電場值發(fā)生反應，所述電場值不同于所述氧化劑與所述核苷酸堿基反應的電場值；-測量所述移位的電場值條件下的氧化還原電流值；和-如果當所述擴增裝置被活化時，氧化還原電流和所述氧化劑與所述核芬酸堿基反應的電流之間的電流差有所減少，則確定所述給定的靶序列的存在。
14. 用于靶核酸序列的電化學檢測的組件，所述組件包含 -用于容納可能包含至少一種核酸的生物學樣品(34, 95)的裝置(30, 44,94)，所述核酸能夠包含給定的靶序列，所述生物學樣品與氧化劑混合，所 述靶序列包含至少一種能夠被所述氧化劑氧化的核苷酸堿基； -能夠與所述給定靶序列偶聯(lián)的互補裝置；-用于向所述樣品施加電場的裝置(38, 42， 52, 54， 96),所述電場能夠引 起所述氧化劑與所述核苷酸^威基的反應，以及用于測量通過所述樣品電流 以確定所述靶序列之存在的裝置(42, P);其特征在于所述互補裝置包含適合于復制所述靶序列的可活化擴增 裝置，所述擴增裝置至少包含屬于含有所述核苷酸堿基的類型的核苷酸， 其中所述類型的所述核苷酸能夠在復制期間被消耗從而構(gòu)成復制的核酸；并且在于如果所述核酸包含所述給定的靶序列，所述測量裝置(42,P) 在所述擴增裝置被活化時給出遞減的電流值。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于靶核酸序列的電化學檢測的方法和組件。根據(jù)該方法，提供可能包含核酸的生物學樣品，所述核酸能夠包含靶序列，所述生物學樣品與氧化劑混合，所述靶序列至少包含一個能夠被所述氧化劑所氧化的核苷酸堿基；提供能夠與所述靶序列偶連的互補裝置；根據(jù)本發(fā)明，所述互補裝置包括適合復制所述靶序列的可活化的擴增裝置，所述擴增裝置至少包括包含所述核苷酸堿基的核苷酸，其中所述核苷酸能夠在擴增在復制期間被消耗從而構(gòu)成復制的核酸；通過對所述樣品施加電場并且記錄電流的降低從而確定所述靶序列的存在。
文檔編號C12Q1/68GK101437961SQ200780015917
公開日2009年5月20日 申請日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者繆里爾·德奎爾, 貝努瓦·利莫格斯, 達米恩·馬查爾 申請人:巴黎大學迪德羅特第七分校;勃艮第大學