專利名稱：：利用輔酶合成強化進行的羥基羧酸類的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)以乙醇酸為代表的羥基羧酸的微生物和使用微生物的生產(chǎn)以乙醇酸為代表的羥基羧酸的方法。
背景技術(shù)：
：羥基羧酸類作為聚合物原料或藥物中間體有用，故人們謀求其高效的生產(chǎn)方法。作為其一例，可以舉出乙醇酸(a-羥基乙酸)。乙醇酸已逐)新用作洗滌劑或化妝品原料，但近年作為用作氣體隔離性聚合物或醫(yī)療用聚合物的聚乙醇酸原料受到關(guān)注。作為氣體隔離性材料受到關(guān)注的原因在于，聚乙醇酸層具有較高的氧氣隔離性，具有作為用于包裝在目前市場上銷售的化學合成品的乙醇酸含有很多雜質(zhì)，作為聚合物原料存在純度方面的問題。其原因在于，上述雜質(zhì)不僅阻礙乙醇酸的脫水縮合反應(yīng)，而且作為雜質(zhì)之一的甲氧基乙酸是懷疑具有致癌性的化合物，故不希望包含在食品或飲料的包裝材料中。當然從技術(shù)上講可以通過精制除去雜質(zhì)，但實際上，上述精制品的價格升高，作為廉價的包裝材料原料并不現(xiàn)實。為了避免化學合成品的乙醇酸中出現(xiàn)的上述問題，人們正在嘗試通過以乙二醇作為原料的生物學方法來制造乙醇酸。專利文獻1及專利文獻2中公開了通過微生物生產(chǎn)乙醇酸的方法，其特征在于，在含有乙二醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于畢赤酵母(Pichia)屬、紅酵母(Rhodotomla)屬、擲孢酵母(Sporobolomyces)屬、克魯維酵母(Kluyveromyces)屬、球擬酵母(Tomlopsis)屬的酵母、屬于"i若卡氏菌(Nocardia)屬的菌才朱、屬于紅5求菌(Rhodococcus)屬的菌4朱、或大腸桿菌B(EscherichiacoliB)^朱，從培養(yǎng)液中分離，采集乙醇酸。專利文獻1及專利文獻2的實施例記載的乙醇酸生產(chǎn)方法中，乙醇酸蓄積濃度最高的是使用內(nèi)西畢赤酵母(Pichianaganishii)的方法，經(jīng)30小時的反應(yīng)可以得到35.3g/L的乙醇酸。非專利文獻l中指出，對于使用內(nèi)西畢赤酵母(Pichianaganishii)的乙醇酸生產(chǎn)，進一步改善反應(yīng)條件，經(jīng)120小時的反應(yīng)可以得到105g/L的乙醇酸。專利文獻3中公開了將編碼乳醛還原酶(lactaldehydereductase)的基因和編碼乳醛脫氫酶(lactaldehydedehydrogenase)的基因以質(zhì)粒的形態(tài)導入微生物，由此賦予或強化它們的酶活性，通過使用上述微生物，將以乙二醇為代表的末端具有羥基的脂肪族多元醇作為原料，可以生產(chǎn)以乙醇酸為代表的羥基羧酸，進而通過石皮壞樣i生物具有的編碼乙醇酸氧化酶的基因、使該酶活性鈍化，由此提高乙醇酸的生產(chǎn)率。在利用上述現(xiàn)有方法生產(chǎn)以乙醇酸為代表的羥基羧酸的反應(yīng)中，由于供給到反應(yīng)中的菌體量多，所以存在以下問題，即，隨著菌體量多而導致制造成本升高或夾雜來自菌體的雜質(zhì)，進而在羥基羧酸類制造后為了廢棄菌體而耗費大量勞力和成本。在孩i生物中的煙酰胺腺噪呤二核苷酸的生物合成路徑，已知存在由天冬氨酸經(jīng)喹啉酸進行生物合成的路徑(從頭(denovo)^各徑)、和將通過煙酰胺腺噪呤二核苷酸等的代謝生成的煙酰胺再循環(huán)的^各徑(再循環(huán)路徑)，以埃希氏菌(Escherichia)屬、志賀氏菌(Shigella)屬、沙門氏菌(Salmonella)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、耶爾森氏菌(Yersinia)屬、光桿狀菌(Photorhabdus)屬為代表的腸內(nèi)細菌科中的上述生物合成路徑，已知被nadR(因文獻不同有時也稱為nadl)基因編碼的蛋白質(zhì)(以下寫成NadR)所控制。即，已知NadR抑制由天冬氨酸開始的從頭(denovo)路徑中的L-天冬氨酸氧化酶基因和p查啉酸合成酶基因、及再循環(huán)路徑中的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinicacidphosphoribosyltransferase)基因(以下稱為pncB)的5表達。另一方面，NadR為多功能蛋白質(zhì)，對于煙酰胺腺。票呤二核苦酸生物合成也具有以下重要的功能。即，已知也具有轉(zhuǎn)運成為煙酰胺腺噤呤二核苷酸前體的煙酰胺單核苷酸的功能，并且具有作為催化由ATP和煙酸核糖核苦酸生產(chǎn)作為煙酰胺腺。票呤二核苦酸前體的脫酰胺(Deamido)煙酰胺腺。票呤二核苷酸的反應(yīng)的酶的功能、作為煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的功能。非專利文獻2中已經(jīng)報道了破壞基因nadR的微生物，但尚未報道利用上述微生物生產(chǎn)羥基羧酸。非專利文獻3中報道了通過向大腸桿菌中導入pncB的表達載體，提高煙酰胺腺噪呤二核苷酸的含量。專利文獻l:特開平10-174593號/>沖艮專利文獻2:特開平10-174594號公寺艮專利文獻3:國際公開第2005/106005號說明書非專利文南史1:Biosci.Biotechnol.Biochem.,Vol.65(10),pp.2265-2270,(2001)非專利文獻2:J.Bacteriol.,Vol.187(8)，pp.2774-2784，(2005)非專利文南大3:MetabolicEngineering,Vol.4,pp.238—247,(2002)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種能夠用少量菌體高效地生產(chǎn)羥基羧酸類的、利用微生物進行的羥基羧酸類的生產(chǎn)方法、及適用于該生產(chǎn)方法的微生物。為了解決上述課題，本發(fā)明人等進行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用微生物由末端具有羥基的脂肪族多元醇生產(chǎn)羥基羧酸的方法中，通過使用強化了煙酰胺腺噤呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物能夠高效地生產(chǎn)羥基羧酸類。即，本發(fā)明如以下〔1〕至〔19〕所述。〔1〕一種羥基羧酸的生產(chǎn)方法，所述方法使用微生物由末端具有羥基的脂肪族多元醇制造羥基羧酸，其特征在于，使用強化了煙酰胺腺噤呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物?！?〕如〔1〕的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是通過進行下述(1)及(2)中的至少一個基因操作而強化了煙酰胺腺噤呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物，(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代；(2)向微生物中導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒?！?〕如〔1〕所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是強化了氧化型煙酰胺腺噤呤二核苦酸再生能力的微生物?！?〕如〔3〕所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是通過導入質(zhì)粒而強化了氧化型煙酰胺腺噤呤二核苷酸再生能力的微生物，所述質(zhì)粒是組入了NADH脫氫酶基因的質(zhì)粒?！?〕如〔1〕所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是強化了乳醛還原酶及乳醛脫氫酶中至少一個的酶活性的孩￡生物。〔6〕如〔3〕所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是強化了乳醛還原酶及乳醛脫氫酶中至少一個的酶活性的樣i生物。〔7〕如〔1〕、〔3〕、〔5〕或〔6〕所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是將乙醇酸氧化酶活性鈍化或比微生物本來活性降低了的微生物?！?〕如〔1〕~〔7〕中任一項所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，末端具有羥基的脂肪族多元醇為乙二醇，羥基羧酸為乙醇酸?！?〕一種微生物，是強化了乳醛還原酶及乳醛脫氫酶中至少一個的酶活性且通過進行下述(1)及(2)中的至少一個基因操作而強化了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物，(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代；(2)向微生物中導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒?！?0〕如〔9〕所述的微生物，其特征在于，強化了氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力。〔11〕一種微生物，是強化了NADH脫氫酶的活性且通過進行下述(1)及(2)中的至少一個基因操作強化了煙酰胺腺噤呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物，(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代；(2)向微生物內(nèi)導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒?！?2〕如〔9〕或〔10〕所述的微生物，其特征在于，將乙醇酸氧化酶活性鈍化或比微生物本來的活性降低了?！?3〕如〔11〕所述的微生物，其特征在于，將乙醇酸氧化酶活〔14〕如〔1〕~〔8〕中任一項所述的生產(chǎn)方法，其中，^鼓生物為i矣希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬中的任一種?！?5〕如〔14〕所述的生產(chǎn)方法，其中，微生物為大腸桿菌?！?6〕如〔9〕、〔10〕、〔12〕中任一項所述的微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬中的任一種?！?7〕如〔11〕或〔13〕所述的微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬中的任一種?！?8〕如〔16〕所述的微生物，其中，微生物為大腸桿菌?！?9〕如〔17〕所述的微生物，其中，微生物為大腸桿菌。根據(jù)本發(fā)明能夠以較少的菌體量高效地生產(chǎn)羥基羧酸類。另外，根據(jù)本發(fā)明能夠提供適于羥基羧酸類生產(chǎn)的微生物。8根據(jù)下述優(yōu)選實施方案及附帶的以下附圖進一步詳細說明上述目的及其他目的、特征及優(yōu)點。為表示參考例3中細胞內(nèi)的NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)的經(jīng)時變化的曲線圖。圖中的口表示AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的NADH/NAD比。圖中的O表示AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA抹的NADH/NAD比。為表示實施例9中的乙醇酸蓄積量的經(jīng)時變化的曲線圖。圖中的〇表示在30。C下的反應(yīng)結(jié)果。圖中的口表示在35。C下的反應(yīng)結(jié)果。圖中的A表示在37。C下的反應(yīng)結(jié)果。圖中的x表示在4(TC下的反應(yīng)結(jié)果。為表示實施例10中的乙醇酸蓄積量的經(jīng)時變化的曲線圖。圖中〇表示在pH7.7下的反應(yīng)結(jié)果。圖中A表示在pH7.2下的反應(yīng)結(jié)果。圖中口表示在pH6.5下的反應(yīng)結(jié)果。圖中x表示在pH6.0下的反應(yīng)結(jié)果。圖中0表示在pH4.3下的反應(yīng)結(jié)果。以下，詳細地^兌明本發(fā)明。本實施方案是羥基羧酸的生產(chǎn)方法。此方法在使用微生物由末端具有羥基的脂肪族多元醇制造羥基羧酸的方法中使用強化了煙酰胺腺噤呤二核普酸生產(chǎn)能力的微生物。所謂微生物，是指無論本來是否具有由末端具有羥基的脂肪族多元醇生產(chǎn)羥基羧酸的能力，只要通過使用某些方法可以獲得由末端具有羥基的脂肪族多元醇生產(chǎn)羥基羧酸的能力的微生物即可，可以為任意微生物。優(yōu)選舉出屬于埃希氏菌(Escherichia)屬、志賀氏菌(Shigella)屬、沙、門氏菌(Salmonella)屬、g欠文氏菌(Erwinia)屬、耶爾森氏菌(Yersinia)屬、光桿狀菌(Photorhabdus)屬的微生物等，專交優(yōu)選舉出大腸桿菌(Escherichiacoli)。另外，所謂末端具有羥基的脂肪族多元醇，只要是在碳鏈末端具有羥基、且分子內(nèi)具有2個以上羥基的脂肪族化合物即可，對其結(jié)構(gòu)9沒有特殊限制，但作為上述化合物，可以舉出乙二醇、二甘醇、丙三醇、1，3-丙二醇、1,2-丁二醇、1，3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,2，4-丁三醇等。另外，所謂羥基羧酸，是指上述末端具有羥基的脂肪族多元醇分子內(nèi)的一個具有羥基的末端碳被氧化形成羧酸的化合物。作為上述化合物，可以舉出乙醇酸、羥基乙氧基乙酸、甘油酸、3-羥基丙酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、4-羥基丁酸、2,4-二鞋基丁酸等。本實施方案中，作為末端具有羥基的脂肪族多元醇，可以優(yōu)選使用乙二醇。另外，作為羥基羧酸，可以優(yōu)選使用乙醇酸。本實施方案涉及的微生物，通過進行下述(1)及(2)中至少一個基因操作，強化煙酰胺腺噤呤二核普酸生產(chǎn)能力。(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代。(2)向微生物中導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒。此處，所謂煙酰胺腺。票呤二核香酸，只要沒有標明氧化型及還原型，則指二者中任意一個。所謂強化了煙酰胺腺噤呤二核苦酸生產(chǎn)能力，是指微生物內(nèi)的氧化型煙酰胺腺噤呤二核苷酸(以下有時簡稱為NAD)及還原型煙酰胺腺。票呤二核普酸(以下有時簡稱為NADH)的含量的總和相對于微生物的野生林(或重組前的微生物)顯著提高的狀態(tài)，優(yōu)選NAD、NADH的總含量是強化前的微生物的1.2倍至10倍。另外，所謂nadR基因，如果以大腸桿菌MG1655抹為例，則在大腸桿菌MG16554朱的基因組DNA的全部^咸基序列(GenBank登錄號U00096)中從第4625317個堿基至第4626570個石成基中nadR基因被編碼。另夕卜，鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)的nadR基因如GenBank登錄號M85181所示。除上述樣i生物以外，在以志賀氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬為代表的腸內(nèi)細菌科中也存在nadR基因(Gerasimova,AV.,et.al.，JournalofBioinformaticsandComputationalBiology,Vol,3,pp.1007-1019(2005))。使nadR基因缺失或變異、或取代的微生物，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常法獲得。作為使nadR基因缺失或變異、或取代的微生物的一例，例如可以舉出大腸桿菌MT-11032才朱。羥基羧酸的生產(chǎn)方法中，可以使用大腸桿菌MT-11032抹。大腸桿菌MT-11032林中，nadR基因被取代為卡那霉素耐性基因，且作為編碼下述乙醇酸氧化酶的基因的glcDEF被取代為四環(huán)素耐性基因，由此使乙醇酸氧化酶活性鈍化。本菌抹基于國際承認的用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，保藏于茨城縣筑波市東1段1番1號的中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERMBP-10773。需要說明的是，本保藏是從平成18年(2006年)2月14日保藏的FERMP-20797移管的。此處，所謂煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，是指屬于以國際生物化學聯(lián)合(以下稱為"I.U.B.")酶委員會報告為基準的酶編號2.4.2.11,可逆地催化由煙酸和5-磷酸核糖基-la-二磷酸生成煙酸單核普酸的反應(yīng)的酶的總稱。可以使用導入了質(zhì)粒的微生物，由末端具有羥基的脂肪族多元醇生產(chǎn)羥基羧酸，所述質(zhì)粒組入了煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因(以下，有時簡稱為pncB)。向微生物中導入基因時使用的基因組DNA的配制、質(zhì)粒的配制、DNA的切斷及連接、轉(zhuǎn)化、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計、合成等的方法，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常法進4亍。上述方法記載于Sambrook,J.，et.al.，"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)等。另外，本實施方案涉及的微生物強化了氧化型煙酰胺腺。票呤二核苷酸再生能力。此處，所謂強化NAD再生能力，是指催化將NADH變?yōu)镹AD的反應(yīng)的酶的活性，與強化前相比顯著提高的狀態(tài)，所述NADH是通過末端具有羥基的脂肪族多元醇的氧化反應(yīng)生產(chǎn)鞋基羧酸時生成的。作為上述酶，可以舉出谷氨酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、NADH氧化酶、NADH脫氫酶。強化NAD再生能力時，在之后的精制等工序中成為負荷的化合物不增加，較為理想。作為催化將NADH變?yōu)镹AD的反應(yīng)的酶，優(yōu)選NADH脫氬酶。以催化將NADH變?yōu)镹AD的反應(yīng)的酶為來自大腸桿菌的NADH脫氫酶的情況為例，其活性與野生抹(或重組前的微生物)相比提高2倍以上，較理想。提高了上述酶活性的微生物，可以采用下述方法制作，例如，使用基因重組技術(shù)向野生型的微生物(或重組前的微生物)中導入編碼該酶的基因的方法，或在基因組內(nèi)，向編碼該酶的基因的啟動子中導入變異等的方法。作為向野生型微生物(或重組前的微生物)中導入該基因的方法，可以舉出以質(zhì)粒的形態(tài)將該基因?qū)胛⑸?。在向微生物中導入基因時使用的基因組DNA的配制、質(zhì)粒的配制、DNA的切斷及連接、轉(zhuǎn)化、PCR、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計、合成等的方法，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常法進行。上述方法記載于上述Sambrook,J.等的文南大中。另外，本實施方案涉及的微生物，通過導入組入了NADH脫氫酶基因的質(zhì)粒，強化了氧化型煙酰胺腺噤呤二核苷酸再生能力。此處，所謂NADH脫氫酶，是指屬于以I.U.B.酶委員會報告為基準的酶編號1.6.5.3、1.6.99.3、或1.6.99.5,可逆地催化以泛醌、二曱基維生素K2類(dimethylmenaquinone)、纟*生素K2類等酉昆類4乍為電子受體，由NADH生成NAD的反應(yīng)的酶的總稱。優(yōu)選為屬于以I.U,B.酶委員會才艮告為基準的酶編號1.6.99.3的NADH脫氫酶，以大腸桿菌為例時，可以舉出由GenBank登錄號V00306報道的ndh基因編碼的NADH本實施方案中，可以使用導入了質(zhì)粒的微生物，由末端具有羥基的脂肪族多元醇生產(chǎn)羥基羧酸，所述質(zhì)粒組入了NADH脫氫酶基因。必要的質(zhì)粒的構(gòu)建或向微生物中的導入可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常法進行。另外，本實施方案涉及的微生物強化了乳醛還原酶及乳醛脫氫酶中的至少一個的酶活性。此處，所謂乳醛還原酶，是指屬于以I.U.B.酶委員會報告為基準的酶編號1.1.1.77，可逆地催化在作為輔酶的NAD的存在下由1，2-丙二醇生成乳醛的反應(yīng)的酶的總稱。另外，所謂乳醛脫氫酶，是指屬于以I.U.B.酶委員會報告為基準的酶編號1.2.1.22,催化在作為輔酶的NAD的存在下由乳醛生成乳酸的反應(yīng)的酶的總稱，且也指屬于以I.U.B.酶委員會報告為基準的酶編號1.2.1.21，催化在作為輔酶的NAD的存在下由乙醇醛生成乙醇酸的反應(yīng)的酶乙醇醛脫氳酶(Glycolaldehydedehydrogenase)的總稱。其原因在于，在使用大腸桿菌的在先文獻中已經(jīng)報道了乳醛脫氫酶和乙醇醛脫氫酶為相同的酶(Caballero,E.,et.al.,J.Biol.Chem.，Vol.258,pp.7788-7792(1983))。另外，所謂強化了乳醛還原酶及乳醛脫氫酶中至少一個的酶活性，以大腸桿菌為例時，優(yōu)選上述酶中至少一個的酶活性為野生抹(或重組前的微生物)的20倍以上，較優(yōu)選為100倍以上。上述酶活性提高的微生物，可以使用下述方法制作，例如，使用基因重組技術(shù)將編碼該酶的基因?qū)胍吧偷奈⑸?或重組前的微生物)中的方法，或在基因組內(nèi)向編碼該酶的基因的啟動子中導入變異等方法。作為向野生型微生物(或重組前的微生物)中導入該基因的方法，可以舉出以質(zhì)粒的形態(tài)將該基因?qū)胛⑸铩Ｔ谙蛭⑸镏袑牖驎r所用的基因組DNA的配制、質(zhì)粒的配制、DNA的切斷及連接、轉(zhuǎn)化、PCR、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計、合成等的方法，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常法進行。上述方法記載于上述Sambrook，J.等的文獻中。例如，乳醛還原酶及乳醛脫氫酶的酶活性提高的大腸桿菌，可以如下制作。大腸桿菌的乳醛還原酶的基因(以下有時簡稱為fucO)的堿基序列已經(jīng)被報道(GenBank登錄號M31059)。另夕卜，大腸桿菌的乳醛脫氫酶的基因(以下，有時筒稱為aldA)的堿基序列也已經(jīng)被報道(GenBank登錄號M64541)。為了獲取fucO,以大腸桿菌的基因組DNA為模板，使用成為引物的寡核苷酸采用PCR法擴增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到fucO片段。13另外，為了獲得aldA,以大腸桿菌的基因組DNA為模板，使用成為引物的寡核香酸采用PCR法擴增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到aldA片段。進而，為了獲耳又甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，使用成為引物的寡核苷酸采用PCR法擴增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到編碼GAPDH啟動子的DNA片l殳。將上述3個DNA片段和通過用限制酶消化質(zhì)粒得到的片段結(jié)合后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到生長在LB瓊脂培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)化體。在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得菌落，從所得菌體中回收質(zhì)粒。通過將本質(zhì)粒導入任意的宿主大腸桿菌中，能夠制作乳醛還原酶及乳醛脫氫酶的酶活性提高的大腸桿菌。本實施方案涉及的微生物也將乙醇酸氧化酶活性鈍化或比微生物本來的活性降低。此處，所謂乙醇酸氧化酶，是指屬于以I.U.B.酶委員會報告為基準的酶編號1.1.3.15,可逆地催化由乙醇酸生成乙醛酸的反應(yīng)的酶的總稱。所謂乙醇酸氧化酶活性的鈍化，是指其酶活性完全消失。另外，所謂乙醇酸氧化酶活性的降低，是指其酶活性的一部分消失，優(yōu)選相對于野生林(或重組前的微生物)具有的微生物本來的乙醇酸氧化酶活性為2分之1以下，較優(yōu)選為10分之1以下。為了使乙醇酸氧化酶活性鈍化、或減低，有下述方法向編碼其蛋白質(zhì)的基因(以下有時簡稱為glcDEF基因)中導入變異或使其缺失、或者添加使其蛋白質(zhì)特異地鈍化的試劑、照射紫外線等方法。對于向基因中導入變異或缺失之類的基因操作，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常法進行。具體而言，可以舉出大腸桿菌MT-11032林作為通過將glcDEF基因取代為四環(huán)素耐性基因，使其乙醇酸氧化酶活性鈍化的微生物。本實施方案中，所謂向微生物中導入編碼某耙酶的基因時的"以質(zhì)粒的形態(tài)"，是指將該基因與載體連接，制成重組質(zhì)粒，采用轉(zhuǎn)化等方法將其導入該微生物。另外，將在微生物內(nèi)恒久地發(fā)揮功能的強啟動子和靶基因功能性地連接時，根據(jù)質(zhì)粒具有的復(fù)制子的性質(zhì)，即使使用據(jù)說是每個微生物細胞的拷貝數(shù)通常較少的質(zhì)粒，也能實現(xiàn)本發(fā)明的目的。作為上述具有復(fù)制子的質(zhì)粒，可以舉出pACYC184(GenBank登錄號X06403)等。實施本實施方案的生產(chǎn)方法時，通常情況下使用培養(yǎng)基，培養(yǎng)微生物使其增殖，得到必要量的微生物菌體。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要是含有碳源、氮源、無機離子及根據(jù)需要的其他有機微量成分的培養(yǎng)基即可，沒有特殊的限制。作為碳源，可以適當使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類，富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸，甲醇、乙醇、丙三醇等醇類及其他。作為氮源，可以適當使用有機銨鹽、無機銨鹽、氨氣、氨水、蛋白質(zhì)水解物等無機及有機的氮源及其他。作為無機離子，可以根據(jù)需要適當使用鎂離子、磷酸根離子、鉀離子、鐵離子、錳離子、硫酸根離子及其他。作為有機微量成分，可以適當?shù)厥褂镁S生素、氨基酸等及含有它們的酵母浸膏、蛋白胨、玉米漿、酪蛋白分解物及其他。作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，從供給工業(yè)生產(chǎn)方面考慮時，優(yōu)選液體培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)基組成優(yōu)選為聚胨0.5g/L以上10g/L以下、Fe2S040.02g/L以上0.3g/L以下、K2HP〇40.5g/L以上5g/L以下、KH2P040.5g/L以上5g/L以下、MgS04'7H200.5g/L以上5g/L以下、(NH4)2S040.3g/L以上15g/以下(溶劑為水)。在本實施方案涉及的微生物的培養(yǎng)時，培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，一邊適當?shù)乜刂苝H和溫度，一邊進行培養(yǎng)。可以為需氧條件、也可以為厭氧條件，但優(yōu)選為需氧條件。通氣量優(yōu)選每IL培養(yǎng)基為0.2L/min以上3L/min以下，4交優(yōu)選為0.5L/min以上2L/min以下。另外，攪拌速度優(yōu)選為200rpm以上lOOOrpm以下，較優(yōu)選為500rpm以上800rpm以下。由此，能夠得到每單位菌體重量的羥基羧酸生產(chǎn)量多的菌體。另外，也可以使用能夠?qū)崿F(xiàn)與上述通氣、攪拌條件相當?shù)娜艽嫜豕┙o的氣泡塔等進行培養(yǎng)。pH優(yōu)選為5以上8以下，較優(yōu)選pH為7.0以上7.4以下，最優(yōu)選pH為7.2。由此，能夠得到每單位菌體重量的羥基羧酸生產(chǎn)量多的菌體。另夕卜，溫度優(yōu)選為25。C以上4(TC以下，較優(yōu)選為33。C以上37°C以下，最優(yōu)選為35°C。由此，能夠得到每單位菌體重量的羥基羧酸生產(chǎn)量多的菌體。培養(yǎng)所需時間為12小時以上50小時以下。由此，能夠得到每單位菌體重量的羥基羧酸生產(chǎn)量多的菌體。作為本實施方案的生產(chǎn)方法中使用的溶劑，可以舉出磷酸鉀緩沖液等緩沖液、或上述微生物培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基、及純水。另外，可以使作為原料的脂肪族多元醇和溶劑的混合液與事先培養(yǎng)得到的微生物菌體接觸，進行反應(yīng)。對于微生物菌體，可以舉出直接使用培養(yǎng)結(jié)束的培養(yǎng)液的方法，或從培養(yǎng)液中只回收菌體進行使用的方法。在本實施方案的生產(chǎn)方法的反應(yīng)時，反應(yīng)條件沒有特殊限制，一邊適當?shù)乜刂苝H和溫度，一邊反應(yīng)。例如，優(yōu)選pH為6以上9以下，較優(yōu)選pH為7.0以上8.0以下，最優(yōu)選pH為7.2。由此，能夠得到添加到反應(yīng)液中的每單位菌體量的羥基羧酸生產(chǎn)量提高的效果。另外，溫度優(yōu)選為2(TC以上45。C以下的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選為30。C以上40。C以下，最優(yōu)選為35°C。由此能夠得到添加到反應(yīng)液中的每單位菌體量的羥基羧酸生產(chǎn)量提高的效果。另外，反應(yīng)優(yōu)選為需氧條件。通氣量優(yōu)選每1L反應(yīng)液為0.1L/min以上2.0L/min以下，較優(yōu)選為0.2L/min以上1,OL/min以下。另夕卜，攪拌速度優(yōu)選為200rpm以上1000rpm以下，專交優(yōu)選為400rpm以上8OOrpm以下。由此，能夠得到添加到反應(yīng)液中的每單位菌體量的羥基羧酸生產(chǎn)量提高的效果。另外，也可以使用能夠?qū)崿F(xiàn)與上述通氣、攪拌條件相當?shù)娜艽嫜豕┙o的氣泡塔等進行反應(yīng)。另夕卜，通過J吏反應(yīng)時間為12小時以上96小時以下，能夠以80%以上的收率得到羥基羧酸。作為回收如上所述得到的反應(yīng)液中蓄積的作為產(chǎn)物的羥基羧酸的方法，沒有特殊的限制，但是例如可以采用經(jīng)離心等從反應(yīng)液中除去菌體后使用合成吸附樹脂的方法或使用沉淀劑的方法，采用其他常用收集分離方法進行分離的方法。(制造例1)大腸桿菌MG1655nadR缺失抹的制作大腸桿菌MG1655林的基因組DNA的全部堿基序列在GenBank登錄號U00096中為公知，該堿基序列中，在從第4625317個堿基至第4626570個堿基中nadR基因被編碼。根據(jù)大腸桿菌MG1655林的基因組DNA的nadR基因附近區(qū)域的基因信息制作下述序列號所示的寡核香酸序列號1(AGGAAGTGCCATTCTGATTGG)及序列號2(GGAATTCGTATATCTCATTATAAGTCGTCG)及序歹ll號3(GGAATTCGTGATGAAACTGCTCAAAGG)及序列號4(TTGGTACCTGATGACCTGAGCTTCTCG),使用上述寡核苷酸，以大腸桿菌MG1655抹的基因組DNA為模板進行PCR。通過將所得DNA片段分別用限制酶NdeI和EcoRI、EcoRI和Kpnl消化，分別得到約850bp、970bp的片段。將此DNA片段與用Ndel、Kpnl消化溫度敏感性克隆載體pTHl8csl(GenBank登錄號AB019610)(Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,241,185-191(2000))得到的片段混合，使用連接酶結(jié)合后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a才朱(東洋紡織社制)中，得到于30。C在含有10pg/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落于3(TC下在含有10(ig/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚，從所得的菌體中回收質(zhì)粒。將回收的質(zhì)粒用EcoRI消化，^吏用連4妄酶與用EcoRI消化pUC4K質(zhì)粒(GenBank登錄號X06404)(Pharmacia)得到的卡那霉素耐性基因連接。于30。C下將上述所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655抹中，于30。C下在含有10嗎/ml氯霉素和50|ig/ml卡那霉素的丄B瓊脂培養(yǎng)板中17培養(yǎng)一晚，得到轉(zhuǎn)化體。將所得轉(zhuǎn)化體接種到含有50嗎/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在3(TC下培養(yǎng)一晚。然后，為了得到上述培養(yǎng)菌體，涂布在含有50嗎/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，得到于42。C下生長的菌落。將所得菌落在含有50嗎/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于30。C下培養(yǎng)一晚，進而涂布在含有50fig/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，得到于42。C生長的菌落。從出現(xiàn)的菌落中隨機挑取100個菌落，使各菌落在含有50嗎/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板和含有10|ig/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長，選取只在含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的氯霉素敏感性的克隆體。進而由上述目標克隆體的染色體DNA通過PCR使野生才朱MG1655中含有nadR基因的nadR基因附近區(qū)域的約3.3kbp斷片擴增，對擴增后的斷片用在nadR基因中不存在其識別序列、在卡那霉素耐性基因中存在其識別序列的限制酶HindIII進行處理，由此選出nadR基因被取代為卡那霉素耐性基因的菌林，將所得菌抹命名為MG1655nadR基因缺失抹(以下有時簡稱為AnadR林)。需要說明的是，大腸桿菌MG1655株可以從美國典型菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。(制造例2)大腸桿菌MG1655glcDEF缺失林的制作大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列已公知(GenBanak登錄號U00096),大腸桿菌的乙醇酸氧化酶的基因(以下，有時簡稱為glcDEF)的堿基序列也已經(jīng)被報道(GenBank登錄號L43490)。根據(jù)大腸桿菌MG16554朱的基因組DNA的glcDEF附近區(qū)域的基因信息制成下述序列號所示的寡核普酸序列號5(TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG)及序列號6(TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG)及序列號7(GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG)及序列號8(AACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC)，使用上述寡核苷酸進行PCR。通過將所得DNA片段分別用限制酶Kpnl和Xbal、Xbal和Pstl消化，分別得到約670bp、790bp的片段。將此DNA片段與用Kpnl、Pstl消化溫度敏感性克隆載體pTH18csl(GenBank登錄號AB019610)(Hashimoto-Gotoh，T,,Gene,241,185-191(2000))所得的片段混合，使用連接酶結(jié)合后，于30。C下轉(zhuǎn)化至DH5ct抹中，得到在含有10叱/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落在含有10(ig/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中于3(TC.下培養(yǎng)一晚，A^所得菌體中回收質(zhì)粒。將回收的質(zhì)粒用Xbal消化，用T4DNA聚合酶進行末端平滑處理。以易位子Tn10(GenBank登錄號J01830)為模板，使用序列號9(CAGCTGACTCGACATCTTGGTTACCG)和序列號10(CAGCTGCAAGAGGGTCATTATATTTCG)的寡核苷酸，進行PCR得到四環(huán)素耐性基因，將此DNA斷片進行T4DNA多聚核苷酸激酶處理，與之前經(jīng)末端平滑處理的質(zhì)粒連接。在30。C下將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655株中，在含有10|lig/ml氯霉素和30|ig/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)板中于30°C下培養(yǎng)一晚，得到轉(zhuǎn)化體。將所得轉(zhuǎn)化體接種至含有30嗎/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，于30。C下培養(yǎng)一晚。然后，為了得到上述培養(yǎng)菌體，涂布在含有30嗎/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，得到于42。C下生長的菌落。將所得菌落在含有30嗎/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中于30。C下培養(yǎng)一晚，進而涂布在含有30嗎/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，得到于42。C下生長的菌落。從出現(xiàn)的菌落中隨機挑取100個菌落，將各菌落在含有30|ig/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)板和含有10嗎/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板中培養(yǎng)，選出只在含有四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)板上生長的氯霉素敏感性克隆體。進而由上述目標克隆體的染色體DNA通過PCR使含有g(shù)lcDEF的glcDEF附近區(qū)域擴增。通過進行該PCR,在以野生林MG1655林為代表的glcDEF未被取代為四環(huán)素耐性基因的菌抹中，約4.0kbp斷片被擴增，另一方面，在glcDEF區(qū)域被四環(huán)素耐性基因取代的菌林中，約2.2kbp斷片被擴增。選擇通過PCR擴增了約2.2kbp斷片的菌抹，命名為MG1655glcDEF缺失抹(以下有時簡稱為AglcDEF林)。(制造例3)大腸桿菌MG1655nadR&glcDEF缺失4朱的制作與制造例2相同地使制造例1所得的AnadR株缺失glcDEF。將所得菌林命名為MG1655nadR&glcDEF缺失抹(以下有時簡稱為AnadRAglcDEF抹)。(制造例4)乳醛還原酶、乳醛脫氫酶同時表達載體的構(gòu)建大腸桿菌的乳醛還原酶的基因(以下有時簡稱為fucO)的堿基序列已經(jīng)被才良道(GenBank登錄號M31059)。另外，大腸桿菌的乳醛脫氬酶的基因(以下有時簡稱為aldA)的堿基序列也已經(jīng)被報道(GenBank登錄號M64541)。為了獲得fucO，將大腸桿菌MG1655抹的基因組DNA用作模板，AGAATGATTCTG)和序列號12(GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG)所示的寡核苷酸，采用PCR法進行擴增，將所得DNA片段用限制酶Xbal及HindIII消化,由此得到約1.2kbp的fucO片段。為了得到aldA,使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板，4吏用序列號13(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC)和序列號14(GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG)所示的寡核苷酸，采用PCR法擴增，將所得DNA片段用限制酶EcoRI及Xbal消化，由此得到約1.5kbp的aldA片段。進而，為了得到甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子，使用大腸桿菌MG1655抹的基因組DNA作為模板，使用序列號15(AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC)和序列號16(ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG)所示的寡核苷酸，采用PCR法擴增，將所得DNA片段用限制酶EcoRI消化，由此得到約100bp的編碼GAPDH啟動子的DNA片段。使用連接酶將上述3個DNA片段和通過用限制酶EcoRI及HindIII消化質(zhì)粒pUC18(東洋紡織社制)得到的片段結(jié)合，然后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a株(東洋紡織社制)中，得到在含有50昭/mL氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落在含有50昭/mL氨千西林的LB液體培養(yǎng)基中于37。C下培養(yǎng)一晚。從所得菌體中回收質(zhì)粒，將此質(zhì)粒命名為pGAPfucO-aldA。(實施例1)利用乳醛還原酶、乳醛脫氫酶同時表達載體進行的AnadRAglcDEF4朱轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建將制造例4所得的質(zhì)粒pGAPfucO-aldA轉(zhuǎn)化至制造例3所得的AnadRAglcDEF抹中，通過在含有50昭/mL氨千西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中于37。C下培養(yǎng)一晚，得到AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA(制造例5)利用乳酪還原酶、乳醛脫氫酶同時表達載體進行的AglcDEF抹轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建將制造例4所得的質(zhì)粒pGAPfucO-aldA轉(zhuǎn)化至制造例2所得的AglcDEF抹中，通過于37。C下在含有50昭/mL氨,西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中培養(yǎng)一晚，得到AglcDEF/pGAPfucO-aldA林。(實施例2)利用AnadRAglcDEF/pGAPfucO—aldA抹的乙醇酸生產(chǎn)作為前培養(yǎng)，將實施例1中所得的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-a1dA株植菌到加入三角燒瓶中的25mLLBBroth，Miller培養(yǎng)液(Difco244620)中，在培養(yǎng)溫度35。C、120rpm的條件下攪拌培養(yǎng)一晚。將全部前培養(yǎng)液移到加入475g具有如下組成的培養(yǎng)基的1L容量培養(yǎng)槽(ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)在大氣壓下、通氣量0.5L/min、攪拌速度800rpm、培養(yǎng)溫度35。C、pH7.2(用NH3水溶液調(diào)整)的條件下進行。在上述條件下最初的葡萄糖完全耗盡后，在剩余時間內(nèi)以培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低于0.1g/L的可變速度，供給總量40g的葡萄糖?！磁囵B(yǎng)基組成〉聚胨7g/L葡萄糖30g/LFe2S04:0.09g/LK2HP04:2g/LKH2P04:2g/LMgS047H20:2g/L(NH4)2S〇4:5g/L溶劑水將培養(yǎng)開始后24小時的菌體通過離心(8000rpm、20分鐘)集菌。秤量4.5g集菌后的濕菌體，與65g乙二醇一同懸浮于蒸餾水中，使最終液體量為500ml。將懸浮液移至ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-01的培養(yǎng)槽中，進行反應(yīng)70小時。反應(yīng)在大氣壓下、通氣量0.25L/min、攪拌速度550rpm、反應(yīng)溫度35。C、pH7.2(用NH3水溶液調(diào)整)的條件下進行。使用日立制作所制高效液相色譜，按照以下設(shè)定，對所得反應(yīng)液中的乙醇酸蓄積量進行定量。色譜柱ULTRONPS-80H(信和化工社制)洗脫液高氯酸水溶液(pH2.1)流速l.OmL/min檢測器UV檢測器測定波長280nm另外，根據(jù)在5(TC下使部分濕菌體干燥后的干燥重量求出用于反應(yīng)的菌體的干燥菌體重量。每lgAnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA才朱千燥菌體的乙醇酸生產(chǎn)量為27.1g。另外，確認AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA抹的生長速度與比較例1中AglcDEF/pGAPfucO-aldA林相同，不會引起由nadR基因破壞導致的生長延遲。(比較例1)利用AglcDEF/pGAPfucO-aldA林的乙醇酸生產(chǎn)對制造例5所得的AglcDEF/pGAPfucO-aldA抹，與實施例2相同地進行培養(yǎng)及生產(chǎn)乙醇酸。每lgAglcDEF/pGAPfucO-aid林干燥菌體的乙醇酸生產(chǎn)量為20.2g。(參考例1)AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA抹、AglcDEF/pGAPfucO-aldA抹中的細胞內(nèi)煙酰胺腺噤呤二核苷酸含量的測定將AnadRAglcDEF/pGAPfucO—aldA林、及AglcDEF/pGAPfucO-aldA株與實施例2相同地進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)開始后24小時的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA林及AglcDEF/pGAPfucO-aldA林各取lmL分別置于2個微量沉淀管中，于4。C下離心、集菌。2個沉淀管中1個用于NAD測定、1個用于NADH測定，分別進行下述處理。向NAD測定用樣品中，每1.5mg集菌后的濕菌體加入400(iL的0.04mol/L鹽酸水溶液，使其懸浮。將懸浮液在9(TC下加熱3分鐘后，于冰上驟冷。使用此處理液的上清液，制成具有如下所示組成的反應(yīng)液。需要說明的是，作為lmol/LTris-HC1使用pH為9.0的溶液。另外，作為醇脫氫酶，使用將SIGMA公司制醇脫氫酶(A3263)溶解于10mmol/L的Tris-HC1(pH8.8)中形成的400單位/mL(其中，1單位是在pH8.8、25。C的條件下、1分鐘內(nèi)將lpmol乙醇變?yōu)橐胰┧璧拿噶?溶液。根據(jù)TetraColorONE(生化學工業(yè)社制)的方案測定反應(yīng)液在450nm處的吸光度。需要說明的是，測定對SIGMA公司制NAD的溶液進行相同處理后的溶液，由此制作標準曲線，求出樣品的NAD濃度。向NADH測定用樣品中，每1.5mg集菌后的濕菌體加入400一L的0.04mol/L氫氧化鉀水:容液，4吏其懸浮。將懸浮液在90。C下加熱3分鐘后，在冰上驟冷。使用此處理液的上清液，制成如下所示組成的反應(yīng)液。需要說明的是，作為lmol/LTris-HC1,使用pH8.8的溶液。另外，作為醇脫氫酶，使用將SIGMA公司制醇脫氫酶(A3263)溶解于10mmol/L的Tris—HC1(pH8.8)中形成的400單位/mL(其中,1單位是在pH8.8、25。C的條件下、1分鐘內(nèi)將l(imol乙醇變?yōu)橐胰┧璧拿噶?溶液。根據(jù)TetraColorONE(生化學工業(yè)社制)的方案測定反應(yīng)液在450nm處的吸光度。需要說明的是，測定對SIGMA公司制NADH的溶液進4亍相同處理后的溶液，由此制作標準曲線，求出樣品的NADH濃度。其結(jié)果，AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA抹的NAD量、NADH量與AglcDEF/pGAPfucO-aldA抹相比，分別增加1.7倍、1.6倍。由此確認使nadR基因缺失的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA林中，NAD及NADH即煙酰胺腺噤呤二核苷酸的生產(chǎn)能力被強化?！捶磻?yīng)液組成〉樣品上清液25(iLlmol/LTris-HC1:2525%乙醇lOpL純水20|liLTetraColorONE(生化學工業(yè)社制)10—L醇脫氫酶10|iL(制造例6)乳醛還原酶、乳醛脫氫酶、NADH脫氫酶同時表達載體的構(gòu)建大腸桿菌的NADH脫氫酶的基因(以下有時簡稱為ndh)的堿基序列已經(jīng)一皮才艮道(GenBank登錄號V00306)。為了獲取ndh，使用大腸桿菌MG1655林的基因組DNA為模板，TGAAAAAGATTGTG)和序列號18(GGTCTAGACGATTAATGCAACTTCAAACG)所示的寡核苷酸，采用PCR法擴增，由此得到約l3kbp的ndh片段。將所得ndh片段進行T4DNA多聚核苦酸激酶處理。將此DNA片段與將制造例4制成的pGAPfucO-aldA質(zhì)粒用Hindlll消化進行末端平滑處理、脫磷酸化處理后的片段混合，用連接酶結(jié)合后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a林(東洋紡織社制)中，得到在含有50)ig/mL氨節(jié)西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落于37。C下在含有50(ig/mL氨節(jié)西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚，從所得菌體中回收質(zhì)粒，將所得質(zhì)粒命名為pGAPfucO-aldA-ndh。(實施例3)利用乳醛還原酶、乳酸脫氫酶、NADH脫氫酶同時表達載體構(gòu)建AnadRAglcDEF株轉(zhuǎn)化體將制造例6所得的質(zhì)粒pGAPfucO-aldA-ndh轉(zhuǎn)化至制造例324所得的AnadRAglcDEF林中，通過于37。C下在含有50嗎/mL氨節(jié)西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中培養(yǎng)一晚，得到AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aIdA-ndh林。(實施例4)利用AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA—ndh抹的乙醇酸生產(chǎn)對實施例3所得的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh林，與實施例2相同地進行培養(yǎng)及乙醇酸生產(chǎn)。需要說明的是，與實施例2中培養(yǎng)的結(jié)果相比，此菌株未呈現(xiàn)出由強化ndh導致的生長延遲。每lgAnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh林的干燥菌體的乙醇酸生產(chǎn)量與比較例1及實施例2的結(jié)果一同示于表1。由比4交例1和實施例2的比較可知，煙酰胺腺噤p令二核苷酸生產(chǎn)能力的強化，使得乙醇酸的生產(chǎn)率提高至1.3倍。另外，由比4交例1和實施例4的比較可知，煙酰胺腺噪呤二核普酸生產(chǎn)能力的強化及氧化型煙酰胺腺。票呤二核苷酸再生能力的強化，使得乙醇酸的生產(chǎn)率提高至3.6倍。號20(CGCTCTAGATTAACTGGCTTTTTTAATATGCG)所示的寡核苷酸，采用PCR法擴增，由此得到約1.2kbp的pncB片段。進而，將所得pncB片段進行T4DNA多聚核苷酸激酶處理。將此DNA片段和將制造例4制成的pGAPfucO-aldA質(zhì)粒用HindIII消化，進行末端平滑處理，混合脫磷酸化處理后的片段，用連接酶結(jié)合后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a抹(東洋紡織社制)中，得到在含有50(ig/mL氨節(jié)西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落于37。C下在含有50昭/mL氨節(jié)西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚，從所得菌體中回收質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pGAPfucO-aldA-pncB。(實施例5)利用乳醛還原酶、乳醛脫氫酶、煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶同時表達載體構(gòu)建AglcDEF轉(zhuǎn)化體將制造例7所得的質(zhì)粒pGAPfucO-aldA-pncB轉(zhuǎn)化至制造例2所得的AglcDEF抹中，于37。C下在含有50(ig/mL氨節(jié)西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中培養(yǎng)一晚，由此得到AglcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB(實施例6)利用AglcDEF/pGAPfucO—aldA-pncB林的乙醇酸生產(chǎn)對于實施例5所得的AglcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB林，與實施例2相同地進行培養(yǎng)及乙醇酸生產(chǎn)。每lgAglcDEF/pGAPfucO-aWA-pncB抹的干燥菌體的乙醇酸生產(chǎn)量為26.7g。與比較例1的每1gAglcDEF/pGAPfucO-aldA才朱的干燥菌體的乙醇酸量(20.2g)相比，pncB的強化，使得生產(chǎn)率^是高至1.3倍。(參考例2)AglcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株中的細胞內(nèi)煙酰胺腺噪呤二核普酸含量的測定對于實施例5所得的AglcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB4朱及作為對照的AglcDEF/pGAPfucO-aldA，與參考例1相同地進行培養(yǎng)及測定細胞內(nèi)NAD量、NADH量。其結(jié)果，在AglcDEF/pGAPfucO-aidA-pncB林中，NAD量、NADH量分別為AglcDEF/pGAPfucO-aidA株的2.6倍、2.1倍。由此，確認強化了pncB的AglcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB抹中，NAD及NADH、即煙酰胺腺。票呤二核苦酸的生產(chǎn)能力被強化。(參考例3)AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA_ndh林、AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA抹中的細胞內(nèi)NAD及NADH含量測定對于AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA_ndh抹、及AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA抹，與實施例2相同地進行培養(yǎng)及乙二醇生產(chǎn)。對于乙醇酸生產(chǎn)時的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh抹、及AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA林，在一定時間內(nèi)取樣，與參考例1相同地測定細胞內(nèi)NAD量、NADH量。圖1表示此時NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)。橫軸表示反應(yīng)時間(hr),縱軸表示NAD畫AD比(NADH含量/NAD含量)。在AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh林中，通常情況下NADH/NAD比的值小，表示由NADH再生為NAD。(制造例8)NADH脫氫酶表達載體的構(gòu)建大腸桿菌的NADH脫氫酶的基因(以下有時簡稱為ndh)的堿基序列已經(jīng)被報道(GenBank登錄號V00306)。為了獲取ndh，用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，使用序列號17和序列號21酸，采用PCR法擴增，將所得的DNA片段用限制酶EcoRI及HindiII消化，由此得到約1.3kbp的ndh片段。將上述DNA片段、和將質(zhì)粒pUC18(東洋紡織社制)用限制酶EcoRI及HindIII消化而得到的片段用連接酶結(jié)合后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ct株(東洋紡織社制)中，得到在含有50昭/mL氨千西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落于37。C下在含有50|ig/mL氨千西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚。從所得菌體中回收質(zhì)粒，確認準確地插入ndh的DNA片l史后，用限制酶EcoRI處理，進而進行脫磷酸化處理。另外，為了獲取GAPDH啟動子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，使用序列號15和序列號16所示的寡核苷酸，采用PCR法擴增，將所得的DNA片段用限制酶EcoRI消化，由此得到約lOObp的編碼GAPDH啟動子的DNA片段。用連接酶將此DNA片段與上述經(jīng)EcoRI處理、脫磷酸化處理的質(zhì)粒結(jié)合后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5oc林(東洋紡織社制)中，得到在含有50嗎/mL氨千西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落于37。C下在含有50昭/mL氨千西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚。由所得菌體回收質(zhì)粒，確認準確地插入GAPDH啟動子的片段，將此質(zhì)粒命名為pGAPndh。(實施例7)利用NADH脫氫酶表達載體構(gòu)建AnadR才朱轉(zhuǎn)化體及AnadRAglcDEF株轉(zhuǎn)化體將制造例1所得的AnadR抹及制造例3所得的AnadRAglcDEF用制造例8所得的質(zhì)粒pGAPndh轉(zhuǎn)化，于37。C下在含有50嗎/mL氨千西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中培養(yǎng)一晚，由此得到AnadR/pGAPndh株及AnadRAglcDEFZpGAPndh林。(制造例9)利用NADH脫氫酶表達載體的MG1655抹轉(zhuǎn)化體構(gòu)建通過制造例8所得的質(zhì)粒pGAPndh轉(zhuǎn)化大腸桿菌野生抹MG1655株，于37。C下在含有50嗎/mL氨千西林的LB瓊脂培養(yǎng)板中培養(yǎng)一晚，由此得到MG1655ZpGAPndh林。(實施例8)利用AnadR/pGAPndh林、AnadRAglcDEF/pGAPndh才朱的乙醇酸生產(chǎn)在加入5mL培養(yǎng)基的試驗管中分別植菌實施例7所得的AnadR/pGAPndh林、AnadRAglcDEF/pGAPndh林及作為對照的AnadR林、MG1655/pGAPndh、野生抹MG1655林，所述培養(yǎng)基在LBBroth,Miller培養(yǎng)液(Difco244620)中添加葡萄糖使終濃度為0.2%,在培養(yǎng)溫度37。C、200rpm的條件下攪拌培養(yǎng)一晚。將全部培養(yǎng)液離心，測定所得濕菌體的重量后，制成lml如下所示的反應(yīng)液，使用試驗管在30°C、200rpm下攪拌，進行48小時的乙醇酸生產(chǎn)。<反應(yīng)液組成>lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0):250(iL乙二醇50pL菌體由培養(yǎng)液回收的全部菌體用純水調(diào)至lml各個菌株的每lg濕菌體的乙醇酸生產(chǎn)量如表2所示。表明AnadR/pGAPndh株、AnadRAglcDEF/pGAPndh抹中乙醇酸的生產(chǎn)率顯著地提高。[表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>(實施例9)探討利用AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh抹的乙醇酸生產(chǎn)反應(yīng)的溫度條件對于實施例3所得的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh抹，與實施例2相同地進行培養(yǎng)。其中，使培養(yǎng)基中聚胨的濃度為lg/L。對于所得的菌體，與實施例2相同地進行乙醇酸生產(chǎn)反應(yīng)。其中，使加入反應(yīng)中的濕菌體量為7g、攪拌速度為750rpm、反應(yīng)時間為24小時，分別在反應(yīng)溫度為30°C、35°C、37°C、及40。C的條件下實施。圖2表示此時的乙醇酸蓄積量。橫軸表示反應(yīng)時間(hr),縱軸表示乙醇酸蓄積量(g/L)。通過AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh林，在上述條件下也能生產(chǎn)充分量的乙醇酸。(實施例10)探討利用AnadRAglcDEF/pGAPfucO—aldA-ndh抹的乙醇酸生產(chǎn)反應(yīng)的pH條件對于實施例3所得的AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh抹，與實施例2相同地進行培養(yǎng)。其中，使培養(yǎng)基中聚胨的濃度為lg/L。對于所得菌體，與實施例2相同地實施乙醇酸生產(chǎn)反應(yīng)。其中，在將反應(yīng)液pH分別控制為pH7.7、pH7.2、pH6.5、pH6.0、pH4.3的條件下實施。圖3表示此時的乙醇酸蓄積量。橫軸表示反應(yīng)時間(hr),縱軸表示乙醇酸蓄積濃度(g/L)。利用AnadRAglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的乙醇酸生產(chǎn)在pH為6.0以上的條件可以實現(xiàn)。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的羥基羧酸的生產(chǎn)方法及微生物，可以用于作為聚合物原料或藥物中間體有用的乙醇酸等羥基羧酸類的制造。權(quán)利要求1、一種羥基羧酸的生產(chǎn)方法，所述方法使用微生物由末端具有羥基的脂肪族多元醇制造羥基羧酸，其特征在于，使用強化了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物。2、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是通過進行下述(1)及(2)中的至少一個基因操作而強化了煙酰胺腺。票呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物，(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代；(2)向微生物中導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒。3、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是強化了氧化型煙酰胺腺噤呤二核苦酸再生能力的微生物。4、如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是通過導入質(zhì)粒而強化了氧化型煙酰胺腺。票呤二核苷酸再生能力的微生物，所述質(zhì)粒是組入了NADH脫氫酶基因的質(zhì)粒。5、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是強化了乳趁還原酶及乳醛脫氫酶中至少一個的酶活性的樣￡生物。6、如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是強化了乳醛還原酶及乳醛脫氫酶中至少一個的酶活性的孩i生物。7、如權(quán)利要求1、3、5或6所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，微生物是將乙醇酸氧化酶活性鈍化或比微生物本來的活性降低了的微生物。8、如權(quán)利要求1~7中任一項所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，末端具有羥基的脂肪族多元醇為乙二醇，羥基羧酸為乙醇酸。9、一種微生物，是強化了乳醛還原酶及乳醛脫氬酶中至少一個的酶活性且通過進行下述(1)及(2)中的至少一個基因操作而強化了煙酰胺腺噤呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物，(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代；(2)向微生物中導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒。10、如權(quán)利要求9所述的微生物，其特征在于，強化了氧化型煙酰胺腺。票呤二核苷酸再生能力。11、一種樣么生物，是強化了NADH脫氫酶的活性且通過進行下述(1)及(2)中的至少一個基因操作強化了煙酰胺腺。票呤二核苷酸生產(chǎn)能力的微生物，(1)使微生物內(nèi)的nadR基因缺失、變異、或取代；(2)向微生物內(nèi)導入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是組入了微生物內(nèi)的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒。12、如權(quán)利要求9或10所述的微生物，其特征在于，將乙醇酸13、如權(quán)利要求11所述的微生物，其特征在于，將乙醇酸氧化14、如權(quán)利要求1~8中任一項所述的生產(chǎn)方法，其中，微生物為埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬中的任一種。15、如權(quán)利要求14所述的生產(chǎn)方法，其中，微生物為大腸桿菌。16、如權(quán)利要求9、10、12中任一項所述的微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬中的任一種。17、如權(quán)利要求11或13所述的微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、光桿狀菌屬中的任一種。18、如權(quán)利要求16所述的微生物，其中，微生物為大腸桿菌。19、如權(quán)利要求17所述的微生物，其中，微生物為大腸桿菌。全文摘要使用微生物生產(chǎn)羥基羧酸，所述微生物通過使微生物內(nèi)部的nadR基因缺失、變異、或取代、或者通過導入編碼煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸生產(chǎn)能力提高。文檔編號C12P7/42GK101535489SQ20078001622公開日2009年9月16日申請日期2007年4月27日優(yōu)先權(quán)日2006年5月9日發(fā)明者和田光史,德田淳子,望月大資,森重敬,高橋均申請人:三井化學株式會社