專利名稱：：大豆種子和油的組成以及產(chǎn)生所述種子的方法大豆種子和油的組成以及產(chǎn)生所述種子的方法交叉引用相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明要求2006年3月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/781,519的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)通過(guò)引用方式將其全文合并入本文。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明不可應(yīng)用。附錄不可應(yīng)用。序列表的合并序列表的紙件拷貝和磁盤上的序列表的計(jì)算機(jī)可閱讀形式(包含命名為"38-77(54449)SEQLIST"，71，278個(gè)字節(jié)大小(于MS-DOS中測(cè)量)的文件)通過(guò)引用合并入本文。該序列表由SEQIDN0:1至63組成。
背景技術(shù)：
：1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地說(shuō)來(lái)涉及獲得產(chǎn)生具有改變的油的組成的大豆種子的大豆植物的方法，更特別地涉及其中產(chǎn)生具有中油酸、低亞麻酸表型的大豆種子或具有中油酸、低飽和脂肪酸、低亞麻酸表型的大豆種子的方法。2.相關(guān)技術(shù)植物油用于廣泛的用途。需要新型植物油組合物和改進(jìn)的方法以從生物合成或天然植物來(lái)源獲得油組合物。取決于希望的油用途，需要各種不同的脂肪酸組成。植物，特別是在種子中合成大量油的物種，是用于食品和工業(yè)用途的油的重要來(lái)源。種子油幾乎完全由三?；视徒M成，其中脂肪酸被酯化至甘油的三個(gè)羥基。大豆油典型地包含大約16-20%的飽和脂肪酸13-16%的棕櫚酸酯和3-4%硬脂酸酯。通常參見Gunstone等人，TheLipidHandbook,Chapman&Hall,London(1994)。已通過(guò)多種育種方法改變大豆油，以產(chǎn)生對(duì)于特定市場(chǎng)的有益方面。然而，對(duì)于主要的大豆油用戶例如色拉油、烹飪油和煎炸油的消費(fèi)者以及工業(yè)市場(chǎng)例如生物柴油和生物潤(rùn)滑油(biolube)市場(chǎng)廣泛有益的大豆是不可獲得的。先前的大豆油太昂貴或缺乏重要的食品質(zhì)量特性例如氧化穩(wěn)定性、優(yōu)良的油炸食品風(fēng)味或飽和脂肪含量，或缺乏重要的生物柴油特性例如適當(dāng)?shù)囊谎趸欧呕虻蜏啬褪苄曰虻蜏亓鲃?dòng)(coldflow)。高等植物通過(guò)共同的代謝途徑一脂肪酸合成酶(FAS)途徑合成脂肪酸，該合成途徑位于質(zhì)體內(nèi)。P-酮脂酰-ACP合酶是植物細(xì)胞的FAS中的重要的限速酶，其以幾種形式存在。p-酮脂酰-ACP合酶I催化棕櫚酰-ACP(C16:0)的鏈延伸，然而0-酮脂酰-ACP合酶II催化硬脂酰-ACP(C18:0)的鏈延伸。P-酮脂酰-ACP合酶IV是^-酮脂酰-ACP合酶II的變體，其也可催化.18:O-ACP的鏈延伸。在大豆中，F(xiàn)AS的主要產(chǎn)物是16:O-ACP和18:O-ACP。18:O-ACP的去飽和形成18:1-ACP由位于質(zhì)體的可溶性A-9去飽和酶(也稱為"硬脂酰-ACP去飽和酶")催化。參見Voelker等人，52A廳.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.335-61(2001)。質(zhì)體FAS(plastidialFAS)和A-9去飽和酶的產(chǎn)物16:O-ACP、18:0-ACP和18:1-ACP被特定的硫酯酶(FAT)水解?；谛蛄型葱院偷孜锲珢坌?，植物硫酯酶可分成兩個(gè)基因家族。第一個(gè)家族FATA包括具有主要對(duì)于18:1-ACP的活性的長(zhǎng)鏈酰-ACP疏酯酶。第二個(gè)家族FATB的酶通常利用16:0-ACP(棕櫚酰-ACP)、18:0-ACP(硬脂酰-ACP)和18:1-ACP(油酰-ACP)。植物中，此類硫酯酶在植物中的從頭的脂肪酸生物合成期間在確定鏈的長(zhǎng)度中具有重要的作用，因此這些酶用于提供脂肪?；M成的各種變化，特別地有關(guān)存在于種子貯存油中的各種的脂肪酰基基團(tuán)的相對(duì)比例的變化。FATA和FATB的反應(yīng)產(chǎn)物游離脂肪酸離開質(zhì)體并且被轉(zhuǎn)化成它們的各自的酰基輔酶A酯。酰基輔酶A是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的脂質(zhì)生物合成途徑(肯尼迪途徑(KennedyPathway))的底物。該途徑負(fù)責(zé)膜脂質(zhì)的形成以及組成種子油的三酰基甘油的生物合成。在ER中，存在可進(jìn)一步使18:1去飽和成多不飽和脂肪酸的另外的膜結(jié)合去飽和酶。A-12去飽和酶(FAD2)催化雙鍵插入18:1(油酸)，從而形成亞油酸(18:2)。A-15去飽和酶(FAD3)催化雙鍵插入18:2，從而形成亞麻酸(18:3)。予了希望的中油酸(18:l)表型(即包含按重量計(jì)算大約50%和75%油酸的大豆種子)。在美國(guó)專利7，067，722中公開了提供對(duì)內(nèi)源性FAD2基因表達(dá)的抑制和中油酸表型的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植物。相反地，缺乏FAD2抑制性轉(zhuǎn)基因的野生型大豆植物通常產(chǎn)生具有低于20%的油酸組成的種子。大豆油通常包含大約8%的導(dǎo)致減少的穩(wěn)定性和風(fēng)味的亞麻酸(18:3)?？赏ㄟ^(guò)氬化減少大豆油中亞麻酸(18:3)的水平以提高穩(wěn)定性和風(fēng)味(Dutton等人，1951;LuiandWhite,1992)。不幸的是，氫化導(dǎo)致產(chǎn)生增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)的反式脂肪酸(當(dāng)消費(fèi)時(shí))(Hu等人，1997)。也已使用常規(guī)育種產(chǎn)生具有1%至6°/。范圍內(nèi)的亞麻酸水平的大豆品系(Ross等人CropScience,40:383;2000;Wilson等人J.OleoScL，50:5，87，2001;WilsonLipidtechnologySept.1999)。通過(guò)突變、篩選和育種已產(chǎn)生多種低亞麻酸大豆(Fehr等人，1992;Rahman和Takagi，1997;Ross等人，2000;Byrum等人，1997;Stoisin等人，1998)。已獲得具有大約1%的或更低的亞麻酸含量的某些大豆品種(美國(guó)專利5,534,425和5,714,670)。最近，已公開了用于獲得具有低水平的亞麻酸水平以及農(nóng)藝學(xué)上優(yōu)良的大豆品種的產(chǎn)量和生長(zhǎng)特征的大豆植物的方法(美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0107348)。油酸具有一個(gè)雙鍵，但在高溫下仍然相對(duì)穩(wěn)定，具有高水平的油酸的油對(duì)于其中需要加熱的烹飪和其他過(guò)程是合適的。最近，已建議增加高油酸的消費(fèi)，因?yàn)橛退崴坪踅档偷兔芏戎鞍?"LDL")的血液水平而不影響高密度脂蛋白("HDL")的水平。然而，對(duì)油酸水平的一些限制是希望的，因?yàn)楫?dāng)油酸在高溫下降解時(shí)，其產(chǎn)生負(fù)面的(negetive)風(fēng)味化合物，且消除了通過(guò)亞油酸的氧化產(chǎn)生的正面(positive)風(fēng)味。Neff等人，JA0CS，77:1303-1313(2000);Warner等人，J，Agric.FoodChem.49:899-905(2001)。因此優(yōu)選使用具有按重量計(jì)算65-85°/。或更少的油酸水平的油，以限制食品應(yīng)用例如煎炸油和油炸食品中的異味。其他優(yōu)選油具有按重量計(jì)算高于55%的油酸水平以提高氧化穩(wěn)定性。對(duì)于許多油的應(yīng)用，低于按重量計(jì)算8%或甚至低于按重量計(jì)算大約2-3%的飽和脂肪酸是希望的。飽和脂肪酸具有在許多應(yīng)用中是不希望的高熔點(diǎn)。當(dāng)用作原料或燃料時(shí)，飽和脂肪酸在低溫下引起混濁(clouding)，且賦予燃料較差的冷流動(dòng)性例如流點(diǎn)和低溫過(guò)濾阻塞點(diǎn)。消費(fèi)者和食品工業(yè)可能偏愛包含低飽和脂肪酸水平的油產(chǎn)品，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為更健康和/或可按照FDA指導(dǎo)將其標(biāo)記為"不含飽和脂肪"。此外，低飽和油減少或消除了使食品應(yīng)用的油例如色拉油成為冬天不凝固的油的需要。在生物柴油和潤(rùn)滑油應(yīng)用中，具有低飽和脂肪酸水平的油賦予提高的冷流動(dòng)性且在低溫下不混濁。產(chǎn)生具有中油酸、低亞油酸含量的種子的大豆品系是非常希望的。不幸的是，通過(guò)基因工程方法將中油酸和低亞麻酸性狀組合的嘗試已碰到了問題。其中A-12去飽和酶(FAD2)和厶-15去飽和酶(FAD3)基因已被抑制的轉(zhuǎn)基因品系具有低亞麻酸水平的種子，但油酸水平通常高于對(duì)于中油酸所確定的范圍。然而，本文公開的方法使得能夠產(chǎn)生也具有在55至80°/。的中油酸范圍內(nèi)的油酸水平的低亞麻酸大豆種子。而且，此類方法不使氬化步驟成為必需，從而避免產(chǎn)生不希望的反式脂肪。產(chǎn)生具有中油酸、低飽和、低亞油酸含量的種子的大豆品系也是非常希望的。本文^^開的方法使得能夠產(chǎn)生也具有在55至80%的中油酸范圍內(nèi)的油酸水平和低于8°/。的飽和脂肪酸水平的低亞麻酸大豆種子。發(fā)明概述考慮到上述問題，開發(fā)了本發(fā)明。本發(fā)明首先涉及產(chǎn)生包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80°/。的總種子脂肪酸的油酸含量的大豆植物的方法。通過(guò)產(chǎn)生一種或多種包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物的第一步驟，獲得至少一粒來(lái)自從第一步驟獲得的所述大豆植物的種子的第二步驟，對(duì)于來(lái)自第二步驟的種子確定按重量計(jì)算的亞麻酸和油酸占總種子脂肪酸含量的百分?jǐn)?shù)的第三步驟，然后鑒定產(chǎn)生具有種子脂肪酸組成(所述種子脂肪酸組成包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量)的種子的大豆植物來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。在該方法的其他實(shí)施方案中，第一步驟中產(chǎn)生的大豆植物包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變。這些功能損失性突變可位于內(nèi)源性大豆FAD3-1B和FAD3-1C基因中。在所述方法的該實(shí)施方案中，該方法的第三步驟中鑒定的大豆植物包含低于按重量計(jì)算大約3%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量。在該方法的某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因還可包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因。除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因可能賦予對(duì)草甘膦的耐受性。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含位于整合入所述植物的染色體的pM0扁504、pCGN5469、pCGN5471或pCGN5485的T-DNA邊界序列之間的序列。在該方法的第三步驟中，通過(guò)脂質(zhì)分析技術(shù)確定按重量計(jì)算的亞麻酸和油酸占總種子脂肪酸含量的百分?jǐn)?shù)。該脂質(zhì)分析技術(shù)包括一種或多種選自氣相色譜/火焰離子化檢測(cè)、氣相色謙/質(zhì)i脊、薄層層析/火焰離子化檢測(cè)、液相色譜/質(zhì)譜、液相色譜/電噴霧電離-質(zhì)鐠和液相色譜/電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)?？蛇@樣產(chǎn)生包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物，即通過(guò)將包含轉(zhuǎn)基因的第一大豆植物親本品系與包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的第二大豆親本品系雜交，以獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的和對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl大豆植物，然后使來(lái)自雜交的Fl后代植物自交以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2大豆植物來(lái)產(chǎn)生。在該方法的某些實(shí)施方案中，第二大豆親本品系包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變。兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因可以是FAD3-1B和FAD3-1C。在該方法中，在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)Fl植物經(jīng)歷至少一種DNA分析技術(shù)(該技術(shù)允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因和FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl植物)來(lái)獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因和FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl大豆植物。類似地，通過(guò)在步驟(ii)中將多個(gè)F2植物經(jīng)歷至少一種DNA分析技術(shù)(所述技術(shù)允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2植物)來(lái)獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2大豆植物。所述DNA分析技術(shù)包括一種或多種選自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD分析的技術(shù)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，DNA分析技術(shù)包括FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的至少一個(gè)單核普酸多態(tài)性的檢測(cè)、SEQIDNO:62的FAD3-1C基因中的缺失的檢測(cè)或大豆FAD3-1C啟動(dòng)子序列中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334上的鳥嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的烏嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，DNA分析技術(shù)包括大豆FAD3-1B基因中的單核苷酸多態(tài)性(包括FAD3-1b基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的胸腺嘧啶殘基對(duì)胞嘧啶殘基的置換)的檢測(cè)。在該方法中，轉(zhuǎn)基因還可包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因，在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)Fl植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的Fl大豆植物。類似地，當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因時(shí)，在步驟(ii)中通過(guò)將所述多個(gè)F2植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得就對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的F2大豆植物而富集的多個(gè)F2植物。該方法還可包括將來(lái)自步驟(ii)的對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2后代植物自交以獲得F3大豆植物的步驟iii)。產(chǎn)生包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物的可選擇方法包括用轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化包含突變的大豆植物或細(xì)胞。因此這樣產(chǎn)生該大豆植物，即在本發(fā)明的第一步驟中通過(guò)用減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物或植物細(xì)胞，以獲得具有FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的、對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的R0大豆植物，將來(lái)自之前步驟的R0后代植物自交以獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的Rl大豆植物，從而獲得包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物。在該方法的某些實(shí)施文案中，轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性狀的序列。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因還包括賦予草甘膦耐受性的序列。發(fā)明的方法產(chǎn)生的大豆植物的植物部分:產(chǎn)生的大豆植物部分可以是花粉、胚珠、分生組織、葉、莖、根或細(xì)胞。本發(fā)明也包括來(lái)自通過(guò)這些方法產(chǎn)生的大豆植物的后代大豆植物。本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，其中該種子具有包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。本發(fā)明還包括通過(guò)方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，在所述方法中使用包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變的大豆植物，所迷種子具有包含低于按重量計(jì)算大約3°/。的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。本發(fā)明還提供了獲得具有改變的種子油的脂肪酸組成的大豆植物的方法，該方法包括步驟a)將具有包含低于按重量計(jì)算大約3%的總脂肪酸的亞麻酸含量的種子油的脂肪酸組成的第一大豆親本品系與具有種子油的脂肪酸組成(其中至少一種除了亞油酸外的脂肪酸的含量，當(dāng)與商品大豆油的相應(yīng)脂肪酸的含量相比時(shí)，改變至少50%)的第二大豆親本品系雜交，所迷第二大豆親本品系包含改變至少一種除了亞油酸外的脂肪酸的含量的轉(zhuǎn)基因；和b)獲得展示包含低于按重量計(jì)算3%的總脂肪酸的亞麻酸含量和至少一種除了亞油酸外的脂肪酸的含量(該含量，當(dāng)與商品大豆油的相應(yīng)脂肪酸含量相比時(shí)，改變了至少50%)的種子油的脂肪酸組成的后代植物，從而獲得具有改變的種子油的脂肪酸組成的大豆植物。在該方法中，除了亞麻酸外的脂肪酸選自月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、十八碳四烯酸、油酸、亞油酸、Y-亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的大豆植物的方法。這樣實(shí)施本發(fā)明的該方法，即通過(guò)產(chǎn)生一種或多種包含至少一個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和內(nèi)源性FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物的第一步驟，獲得至少一粒來(lái)自從第一步驟獲得的所述大豆植物的種子的第二步驟，確定來(lái)自第二步驟的種子的按重量計(jì)算的亞麻酸、飽和脂肪酸和油酸占總種子脂肪酸含量的百分?jǐn)?shù)的第三步驟，然后鑒定產(chǎn)生具有種子脂肪酸組成的種子的大豆植物，所述種子脂肪酸組成包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量。在該方法的其他實(shí)施方案中，在第一步驟中產(chǎn)生的大豆植物包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變。這些功能損失性突變可位于內(nèi)源性大豆FAD3-1B和FAD3-1C基因中。在該方法的該實(shí)施方案中，在該方法的第三步驟中鑒定的大豆植物可包含低于按重量計(jì)算大約3%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量。在該方法的某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因還可包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因可賦予對(duì)草甘膦的耐受性。賦予對(duì)草甘膦的耐受性的轉(zhuǎn)基因可編碼CP4EPSPS基因。在該方法的第三步驟中，通過(guò)脂質(zhì)分析技術(shù)確定按重量計(jì)算的亞麻酸、飽和脂肪酸和油酸占總種子脂肪酸含量的百分?jǐn)?shù)。該脂質(zhì)分析技術(shù)包括一種或多種選自氣相色譜/火焰離子化檢測(cè)、氣相色譜/質(zhì)語(yǔ)、薄層層析/火焰離子化檢測(cè)、液相色譜/質(zhì)譜、液相色譜/電噴霧電離-質(zhì)謙和液相色譜/電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)。可這樣產(chǎn)生包含至少一個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和內(nèi)源性FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物，即通過(guò)將包含轉(zhuǎn)基因的笫一大豆植物親本品系與包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的第二大豆親本品系雜交，以獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的且對(duì)于內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl大豆植物，然后使來(lái)自雜交的Fl后代植物自交以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2大豆植物來(lái)產(chǎn)生。在該方法的某些實(shí)施方案中，笫二大豆親本品系包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變。兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因可以是FAD3-1B和FAD3-1C。在該方法中，在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)Fl植物經(jīng)歷至少一種DM分析技術(shù)(該技術(shù)允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因和FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的F1植物)來(lái)獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因和FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的F1大豆植物。類似地，可通過(guò)在步驟(ii)中將多個(gè)F2植物經(jīng)歷至少一種DNA分析技術(shù)(所述技術(shù)允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2植物)來(lái)獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2大豆植物。所述DNA分析技術(shù)包括一種或多種選自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD分析的技術(shù)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，DNA分析技術(shù)包括FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、SEQIDNO:62的FAD3-1C基因中的缺失的檢測(cè)或大豆FAD3-1C啟動(dòng)子序列中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334上的鳥嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鳥嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，DM分析技術(shù)包括大豆FAD3-1B基因中的單核苷酸多態(tài)性(包括FAD3-1b基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的胸腺嘧啶殘基對(duì)胞嘧啶殘基的置換)的檢測(cè)。在該方法中，轉(zhuǎn)基因還可包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因，在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)Fl植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的Fl大豆植物。類似地，當(dāng)轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因時(shí)，在步驟(ii)中通過(guò)將所述多個(gè)F2植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得就對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的F2大豆植物而富集的多個(gè)F2植物。該方法還可包括將來(lái)自步驟(H)的對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2后植物自交以獲得F3代大豆植物的步驟iU)。產(chǎn)生大豆植物(所迷植物包含至少一個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1;源性大iFAD3基因中"至少一i功能損失,性突變)的可選;方法包括用轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化包含突變的大豆植物或細(xì)胞。因此這樣產(chǎn)生該大豆植物，即在本發(fā)明的第一步驟中通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和內(nèi)源性大豆FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物或植物細(xì)胞，以獲得具有FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變、對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的R0大豆植物，將來(lái)自之前步驟的RO后代植物自交以獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的Rl大豆植物，從而獲得包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物。在該方法的某些實(shí)施文案中，轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性狀的序列。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因還包括賦予草甘膦耐受性的序列。發(fā)明的方法產(chǎn)生的大豆植物的植物部分。產(chǎn)生的大豆植物部分可以是花粉、胚珠、分生組織、葉、莖、根或細(xì)胞。本發(fā)明也包括來(lái)自通過(guò)這些方法產(chǎn)生的大豆植物的后代大豆植物。本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，其中該種子具有包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和低于按重量計(jì)算8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55°/。至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。本發(fā)明還包括通過(guò)方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，在所述方法中使用包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變的大豆植物，所述種子具有包含低于按重量計(jì)算大約3%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。下面，參照附圖詳細(xì)地描述本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)以及本發(fā)明的不同實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和操作。附圖簡(jiǎn)述以說(shuō)明書的部分的形式包含的附圖舉例說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案，其與說(shuō)明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。在附圖中圖1舉例說(shuō)明pCGN5469，用于減少大豆FAD2-1基因的表達(dá)的植物載體；圖2舉例說(shuō)明pCGN5471，用于減少大豆FAD2-1基因的表達(dá)的植物載體；圖3舉例說(shuō)明pCGN5485，用于減少大豆FAD2-1基因的表達(dá)的植物載體；和圖4舉例說(shuō)明用于通過(guò)使用來(lái)自表1中所列的大豆基因的DNA序列元件減少一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的示例性植物栽體的結(jié)構(gòu)。圖5舉例說(shuō)明用于通過(guò)使用來(lái)自表2中所列的大豆FAD2-1基因和/或大豆FATB基因的DM序列元件減少一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的示例性植物載體的結(jié)構(gòu)。圖6舉例說(shuō)明用于減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和FATB基因的表達(dá)的示例性植物載體。發(fā)明詳述核酸序列的描述SEQIDNO:1是FAD2-1A內(nèi)舍子l的核酸序列。SEQIDNO:2是FAD2-1B內(nèi)含子l的核酸序列。SEQIDNO:3是FAD2-1B啟動(dòng)子的核酸序列。SEQIDNO:4是FAD2-1A基因組克隆的核酸序列。SEQIDNOs:5和6分別是FAD2-1AUTR和5'UTR的核酸序列。SEQIDNOs:7-13分別是FAD3-1A內(nèi)含子1、2、3A、4、5、3B和3C的核酸序列。SEQIDNO:14是FAD3-1C內(nèi)含子4的核酸序列。SEQIDNO:15是部分FAD3-1A基因組克隆的核酸序列。SEQIDNOs:16和17分別是FAD3-1AUTR和5'UTR的核酸序列SEQIDNO:18是部分FAD3-1B基因組克隆的核酸序列。SEQIDNO:19-25分別是FAD3-1B內(nèi)含子1、2、3A、3B、3C、4和5的核酸序列。SEQIDNO:26和27分別是FAD3-1B3'UTR和5'UTR的核酸序列。SEQIDNO:28是FATB-1基因組克隆的核酸序列。SEQIDNO:29-35分別是FATB-1內(nèi)含子I、II、III、IV、V、VI和VII的核酸序列。SEQIDNOs:36和37分別是FATB-13'UTR和5'UTR的核酸序列。SEQIDNO:38是金鳳花(Cupheapulcherrima)KASI基因的核酸序列oSEQIDNO:39是金鳳花KASIV基因的核酸序列。SEQIDNOs:40和41分另'J是蓖麻(Ricinuscommunis)和西蒙得木(Simmondsiachinensis)的△-9去飽和酶基因的核酸序列。SEQIDNO:42是FATB-2cDNA的核酸序列。SEQIDNO:43是FATB-2基因組克隆的核酸序列。SEQIDNOs:44-47分別是FATB-2內(nèi)含子I、II、III和IV的核酸序列。SEQIDNOs:48-60是PCR引物的核酸序列。SEQIDNO:61是相應(yīng)于來(lái)自美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/176，149的SEQIDNO:1的FAD3-1B基因序列。SEQIDNO:62是相應(yīng)于來(lái)自美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/176，149的SEQIDN0:2的FAD3-1C基因序列。SEQIDNO:63是相應(yīng)于來(lái)自美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/176,149的SEQIDNO:3的FAD3-1C啟動(dòng)子序列。定義"ACP"是指酰基栽體蛋白質(zhì)部分。"改變的種子油的組成"是指來(lái)自本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化的植物的種子油的組成，所述種子油，與來(lái)自具有相似的遺傳背景但未被轉(zhuǎn)化的植物的種子油相比，在其中具有改變的或變化的脂肪酸水平。"反義抑制"是指通過(guò)導(dǎo)入反義RNA分子誘導(dǎo)的基因特異性沉默。本文使用的"農(nóng)藝學(xué)上優(yōu)良的(Agronomicallyelite)"是指具有最佳的許多可區(qū)別的性狀例如出芽(emergence)、活力、營(yíng)養(yǎng)勢(shì)、疾病抗性、結(jié)實(shí)率(Seedset)、站立能力(standabi1ity)和允許生產(chǎn)者收獲具有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)物的脫粒能力(threshability)的基因型。本文使用的"等位基因"是指基因座的一個(gè)或多個(gè)可選擇形式的任一形式，所有所述等位基因都與性狀或特征相關(guān)。在二倍體細(xì)胞或生物中，給定的基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對(duì)同源染色體上的相應(yīng)基因座。本文所使用的"回交"是指其中育種者反復(fù)地將雜交后代例如第一代雜種(F1)往回與雜交后代的親本之一雜交的方法。回交可用于將來(lái)自一個(gè)遺傳背景的一個(gè)或多個(gè)單基因座轉(zhuǎn)換(locusconversion)導(dǎo)入另一個(gè)遺傳背景中。"一種以上試劑例如mRNA或蛋白質(zhì)的共表達(dá)"是指在重疊的時(shí)間范圍中和在相同細(xì)胞或組織中一種試劑與另一種試劑的同時(shí)表達(dá)。"一種以上試劑的協(xié)同表達(dá)"是指當(dāng)從此類試劑產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)時(shí)使用共有的或相同的啟動(dòng)子進(jìn)行的一種以上試劑的共表達(dá)。核酸序列的"互補(bǔ)"是指序列沿著其全長(zhǎng)的互補(bǔ)。"共抑制"是通過(guò)表達(dá)同源有義構(gòu)建體導(dǎo)致的特定內(nèi)源性基因和基因家族的表達(dá)水平(通常在RNA的水平上)的減少，所述構(gòu)建體能夠轉(zhuǎn)錄與內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄物相同的鏈型(strandedness)的mRNA。Napoli等人，PlantCell2:279-289(1990);vanderKrol等人，PlantCell2:291-299(1990)。"CP4EPSPS"或"CP45-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶"基因編碼能夠賦予植物細(xì)胞和從其產(chǎn)生的植物充分程度的草甘膦抗性。CP4EPSPS序列可以是來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacienssp.)CP4的CP4EPSPS序列或其變體或合成形式，如美國(guó)專利號(hào)5,633,435中所描述的。代表性CP4EPSPS序列包括，但不限于，美國(guó)專利號(hào)5，627,061和5，633，435中所示的序列。本文所使用的"雜交"是指兩個(gè)親本植物的交配。本文所使用的"異花傳粉"是指通過(guò)使來(lái)自不同植物的兩個(gè)配子結(jié)合而進(jìn)行的受精。本文所使用的"F/'或"F1"是指兩個(gè)植物雜交的第一代后代。本文所使用的"Fi雜種"或"F1雜種"是指兩個(gè)非相同基因的(廳-isogenic)植物雜交的第一代后代。本文所使用的"F2"或"F2"是指兩個(gè)植物雜交的第二代后代。本文所使用的"F3，，或"F3"是指兩個(gè)植物雜交的第三代后代。"粗制大豆油，，是指已從大豆種子提取的但未進(jìn)行精煉、加工或混合(盡管可能對(duì)其進(jìn)行了脫膠)的大豆油。"CTP，，是指由"葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(chloroplastictransitpeptide)編碼序列"編碼的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。當(dāng)指本文的蛋白質(zhì)和核酸時(shí)，"衍生的"是指直接(例如，通過(guò)著眼于已知蛋白質(zhì)或核酸的序列，制備具有與已知的蛋白質(zhì)或核酸的序列相似(至少部分相似)的序列的蛋白質(zhì)或核酸)或間接(例如，通過(guò)從生物獲得與已知的蛋白質(zhì)或核酸相關(guān)的蛋白質(zhì)或核酸)從已知的蛋白質(zhì)或核酸獲得蛋白質(zhì)或核酸。從已知的蛋白質(zhì)或核酸"衍生"蛋白質(zhì)或核酸的其他方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。雙鏈RNA("dsRNA，，)、雙鏈RNA干擾("dsRNAi，，)和RNA千擾("RNAi")全都是指通過(guò)導(dǎo)入能夠轉(zhuǎn)錄至少部分雙鏈RNA分子的構(gòu)建體而誘導(dǎo)的基因特異性沉默。"dsRNA分子，，和"RNAi分子，，都是指包含具有互補(bǔ)核苷酸序列的片段的RNA分子的區(qū)域，從而其可相互雜交和形成雙鏈RNA。當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞或生物時(shí)，此類雙鏈RNA分子能夠至少部分地減少存在于細(xì)胞或生物的細(xì)胞中的同類mRNA的水平。此外，可通過(guò)2005年2月11日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CR/US2005/004681(其通過(guò)引用方式將其全文合并入本文)中描述的非常規(guī)重組(illegitimaterecombination)和位,臬特異'性重纟且在體內(nèi)裝酉己合適的DNA片段后產(chǎn)生dsRNA。"外顯子"是指該術(shù)語(yǔ)的常規(guī)意思，如表示編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的部分或全部的核酸分子(通常為DNA)的片段。"FAD2"是指能夠催化雙鍵在從羧基端開始計(jì)數(shù)的第12個(gè)位點(diǎn)上插入脂肪?；糠值幕蚧蚓幋a的蛋白質(zhì)。FAD2蛋白也稱為"A12去飽和酶"或"co-6去飽和酶，，。術(shù)語(yǔ)"FAD2-1"用于表示以特異方式在種子組織中天然表達(dá)的FAD2基因或蛋白質(zhì)，術(shù)語(yǔ)"FAD2-2，，用于表示(a)與FAD2-1基因或蛋白質(zhì)不同的和(b)在多種組織(包括種子)中天然表達(dá)的FAD2基因或蛋白質(zhì)。代表性FAD2序列包括但不限于2002年6月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/176，149和SEQIDNO:l-6中所示的序列。"FAD3"、"A15去飽和酶"或"co-3去飽和酶"基因編碼能夠催化雙鍵在從羧基端開始計(jì)數(shù)的第15個(gè)位點(diǎn)上插入脂肪?；糠值拿?FAD3)。術(shù)語(yǔ)"FAD3-1、FAD3-A、FAD3-B和FAD3-C"用于表示在多種組織(包括種子)中天然表達(dá)的FAD3基因家族成員。代表性FAD3序列包括但不限于2002年6月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/176，149和SEQIDNO:7-27中所示的序列。"FATB，，或"棕櫚酰-ACP硫酯酶，，是指編碼能夠在棕櫚酰-ACP的panthotheneprosthetic基團(tuán)中催化碳-硫硫酉旨鍵(carbon-sulfurthioesterbond)的水解斷裂(作為其優(yōu)選反應(yīng))的酶(FATB)的基因。還可用該酶催化其他脂肪酸-ACP硫酯的水解。代表性FATB-1序列包括但不限于2002年6月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/390，185、美國(guó)專利號(hào)5,955,329、5,723,761、5，955，650和6，331，664以及SEQIDNO:28-37中所示的序列。代表性FATB-2序列包括但不限于SEQIDNO:42-47中所示的序列。"脂肪酸"是指游離脂肪酸和脂肪酰基。"基因"是指包括與基因產(chǎn)物的表達(dá)相關(guān)的5'啟動(dòng)子區(qū)域、任何內(nèi)含子和外顯子區(qū)域以及與基因產(chǎn)物的表達(dá)相關(guān)的3'或5'非翻譯區(qū)的核酸序列。"基因沉默"是指對(duì)基因表達(dá)的抑制或基因表達(dá)的下調(diào)。"基因家族"是指在生物中編碼展示相似的功能屬性的蛋白質(zhì)的兩個(gè)或更多個(gè)基因，"基因家族成員"是在植物的遺傳材料中發(fā)現(xiàn)的基因家族的任何基因，例如"FAD2基因家族成員"是植物的遺傳材料中發(fā)現(xiàn)的任何FAD2基因?；蚣易宓膬蓚€(gè)成員的實(shí)例是FAD2-1和FAD2-2?？赏ㄟ^(guò)核酸序列的相似性額外地對(duì)基因家族進(jìn)行分類。例如，基因FAD2包括在該基因座上的等位基因。優(yōu)選，基因家族成員在基因的編碼序列部分中展示至少60%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%的核酸序列同一性。本文所使用的"基因型"是指細(xì)胞或生物的基因組成。如本文所使用的，"異源"是指非天然地發(fā)生在一起。如果作為人工操作的結(jié)果將核酸分子插入細(xì)胞或生物，那么無(wú)論如何間接，該核酸分子被認(rèn)為是"導(dǎo)入的"。導(dǎo)入的核酸分子的實(shí)例包括但不限于已通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、注射和投射導(dǎo)入細(xì)胞的核酸，和通過(guò)包括但不限于綴合、內(nèi)吞和吞噬的方法導(dǎo)入生物的核酸。"內(nèi)含子，，是指該術(shù)語(yǔ)的常規(guī)意思，如表示核酸分子(通常為DNA)的不編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的部分或全部的片段，該片段在內(nèi)源性條件下轉(zhuǎn)錄至RNA分子內(nèi)，但在RNA轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)之前被剪接出內(nèi)源性RNA。"內(nèi)含子dsRNA分子"和"內(nèi)含子RNAi分子"都是指當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞或生物時(shí)能夠至少部分地減少存在于細(xì)胞或生物的細(xì)胞中的同類mRNA的水平的雙鏈RNA分子，其中雙鏈RNA分子展示與存在于細(xì)胞或生物中的基因的內(nèi)含子的充分同一性，以減少包含該內(nèi)含子序列的mRNA的水平。"低飽和"大豆種子油的組成包含按重量計(jì)算3.6%至8%的飽和脂肪酸。"低亞麻酸"油的組成包含低于按重量計(jì)算總脂肪酸的大約3%的亞麻酸。"中油酸大豆種子"是具有按重量計(jì)算在55%至85°/。之間的存在于種子油組合物中的油酸的種子。術(shù)語(yǔ)"非編碼"是指核酸分子的不編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的部分或全部的序列。非編碼序列包括但不限于內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域、3'非翻譯區(qū)(3'UTR)和非翻譯區(qū)(5'UTR)。術(shù)語(yǔ)"油的組成"是指脂肪酸的水平。本文所使用的"表型"是指細(xì)胞或生物的可檢測(cè)的特征，該特征是基因表達(dá)的表現(xiàn)。與一個(gè)或多個(gè)核酸序列"有效連接的"的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)核酸序列(包括多順反子結(jié)構(gòu)中排列的多個(gè)編碼或非編碼核酸序列)表達(dá)。"物理連接的，，核酸序列是在單個(gè)核酸分子中發(fā)現(xiàn)的核酸序列。"植物"包括完整的植物、植物器官(例如，葉、芽、根等)、種子和所述植物的植物細(xì)胞和后代。術(shù)語(yǔ)"植物細(xì)胞"包括但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、莖、配子體、孢子體、花粉和小胞子。"植物啟動(dòng)子"包括但不限于能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能以促進(jìn)mRM的表達(dá)的植物病毒啟動(dòng)子、來(lái)源于植物的啟動(dòng)子和合成的啟動(dòng)子。"多順反子基因"或"多順反子mRNA"是包含轉(zhuǎn)錄的核酸序列的任何基因或mRNA,所述核酸序列相應(yīng)于一個(gè)以上被靶向抑制的基因的核酸序列。應(yīng)理解，這樣的多順反子基因或mRNA可包含相應(yīng)于內(nèi)含子、5'UTR、3'UTR、轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列、外顯子或其組合的序列和應(yīng)理解，重組多順反子基因或mRNA可以(例如不限于)包含相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)來(lái)自一個(gè)基因的UTR和一個(gè)或多個(gè)來(lái)自第二基因的內(nèi)含子的序列。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"R。"、"R0"、'%代"、"RO代"是指通過(guò)再生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化的植物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)、"R1"、'％代"、"R1代"是指從自交的轉(zhuǎn)基因R。植物獲得的種子。K植物是從K種子生長(zhǎng)起來(lái)的植物。"種子特異性啟動(dòng)子"是指優(yōu)先或只在種子中具有活性的啟動(dòng)子。"優(yōu)先活性"是指在種子中顯著大于在植物的其他組織、器官或細(xì)胞器中的啟動(dòng)子活性。"種子特異性，，包括但不限于在種子的糊粉層、胚乳和/或胚中的活性。"有義內(nèi)含子抑制"是指通過(guò)導(dǎo)入有義內(nèi)含子或其片段誘導(dǎo)的基因沉默。例如由Fillatti在PCTW001/14538A2中描述了有義內(nèi)含子抑制。一種以上試劑例如mRNA或蛋白質(zhì)的"同時(shí)表達(dá)"是指試劑與另一種試劑在相同的時(shí)間表達(dá)。這樣的表達(dá)可以只是部分重疊，還可以在不同的組織中或以不同的水平發(fā)生。"總的油水平，，是指在不管脂肪酸的種類的情況下的脂肪酸的總累計(jì)量。如本文所用的，總的油水平不包括甘油主鏈(glycerolbackbone)。"轉(zhuǎn)基因"是指與被導(dǎo)入生物的基因的表達(dá)相關(guān)的核酸序列。轉(zhuǎn)因。"轉(zhuǎn)基因植物，，是以通過(guò)任何有性或無(wú)性方法幫助來(lái)自植物的轉(zhuǎn)基因的傳遞的方式穩(wěn)定地整合該轉(zhuǎn)基因的任何植物。"零飽和"大豆種子油的組成包含低于按重量計(jì)算3.6%的飽和脂肪酸。"功能損失性突變"是在基因的編碼序列中的突變，該突變引起基因產(chǎn)物(通常為蛋白質(zhì))的功能降低或完全消失。功能損失性突變可以例如由基因產(chǎn)物的截短(因?yàn)橐拼a或無(wú)義突變導(dǎo)致的)引起。與具有功能損失性突變的等位基因相關(guān)的表型可以是隱性的或是顯性的。細(xì)胞或生物可具有一個(gè)以上編碼特定酶的基因的家族，基因命名后面的大寫字母(A、B、C)用于命名家族成員，即，F(xiàn)AD2-1A是與FAD2-1B不同的基因家族成員。類似地，F(xiàn)AD3-U、FAD3-1B和FAD3-1C表示FAD3-1基因家族的不同成員。不同基因的功能損失性等位基因以后面跟隨有減號(hào)的小寫字母表示(即fad3-lb-和fad3-lc-分別表示FAD3-1B和FAD3-1C基因的功能損失性等位基因)。如本文所使用的，除非另外指出，任何所述的范圍包含范圍的端點(diǎn)。A.減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的各種轉(zhuǎn)基因可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。通過(guò)抑制，至少部分減少、減少、顯著減少或有效消除內(nèi)源性FAD2基因的表達(dá)，植物細(xì)胞中可獲得的FAD2蛋白的量減少，即FAD2蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)水平降低。因此，大豆細(xì)胞中FAD2蛋白的表達(dá)的減少可導(dǎo)致增加的單不飽和脂肪酸例如油酸(C18:1)的比例。在美國(guó)專利號(hào)7，067，722中描述了包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因且產(chǎn)生具有增加的油酸的種子的大豆植物。減少內(nèi)源性大豆FAD2-1和內(nèi)源性大豆FATB基因的表達(dá)的各種轉(zhuǎn)基因可用于實(shí)施用于產(chǎn)生具有低亞麻酸、低飽和、中油酸表型的大豆植物的本發(fā)明的方法。通過(guò)抑制，至少部分地減少、減少、顯著減少或有效消除內(nèi)源性FATB基因的表達(dá)，植物細(xì)胞中可獲得的FATB蛋白的量減少，即FATB蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)水平降低。當(dāng)植物細(xì)胞中FATB的量減少時(shí)，可提供減少的飽和脂肪酸例如棕櫚酸和硬脂酸的量。因此，F(xiàn)ATB的減少可導(dǎo)致增加的不飽和脂肪酸例如油酸(18:1)的比例。本發(fā)明涉及用于減少1)內(nèi)源性大豆FAD2-1基因或2)內(nèi)源性大豆FAD2-1和FATB基因兩者在大豆植物和種子中的表達(dá)的各種方法，包括，但不限于反義抑制、共抑制、核酶、有義和反義(雙鏈RNAi)的組合、啟動(dòng)子沉默以及DNA結(jié)合蛋白例如鋅指蛋白的使用。在WO98/53083、WO01/14538和美國(guó)專利5,759,829中描述了關(guān)于不同內(nèi)源性植物基因的這些方法的一般實(shí)施。植物中對(duì)基因表達(dá)的抑制(也稱為基因沉默)在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)生。這些基因沉默機(jī)制中的某些機(jī)制在DNA或RNA水平上與核酸的同源性相關(guān)。此類同源性是指相同種內(nèi)或不同種間DNA或蛋白質(zhì)序列的相似性。如果導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA序列與內(nèi)源性基因充分同源，那么基因沉默發(fā)生，即導(dǎo)入的DNA序列的轉(zhuǎn)錄將誘導(dǎo)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默。為了實(shí)施本發(fā)明，在大豆FAD2-1或FATB編碼區(qū)或非編碼區(qū)的DNA序列的整個(gè)長(zhǎng)度上或與大豆FAD2-1或FATB編碼區(qū)或非編碼區(qū)的互補(bǔ)的核酸序列具有至少50%、大約60%或大約70%的同一性的DNA序列，當(dāng)作為轉(zhuǎn)基因?qū)氪蠖怪参镏袝r(shí)，具有用于抑制FAD2-1或FATB的穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)水平的充分同源性。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因更優(yōu)選包括在它們的整個(gè)長(zhǎng)度上與大豆FAD2-1或FATB編碼區(qū)或非編碼區(qū)或與大豆FAD2-1或FATB編碼區(qū)或非編碼區(qū)的互補(bǔ)的核酸序列至少80%同一的、至少85°/。同一的、至少90%同一的、至少95%同一的、至少97%同一的、至少98%同一的、至少99°/。同一的或100%同一的的DNA序列。具有上面指出的對(duì)大豆FAD2-1或FAT基因同一的水平的DNA序列可以是編碼序列、內(nèi)含子序列、3'UTR序列、5'UTR序列、啟動(dòng)子序列、其他非編碼序列或上述序列的任何組合。內(nèi)含子可位于外顯子之間或位于植物基因的5'或3'UTR內(nèi)。編碼序列優(yōu)選是不編碼具有FAD2酶促活性的蛋白的蛋白質(zhì)編碼框的部分。然而，應(yīng)認(rèn)識(shí)到在某些情況下，例如在共抑制的情況下，編碼具有酶促活性的FAD2或FATB蛋白的DNA序列可用于減少內(nèi)源性大豆FAD2-1或FATB基因的表達(dá)。還應(yīng)理解，具有上面指定的對(duì)大豆FAD2-1基因的同一性水平的用于本發(fā)明的方法的DNA序列可來(lái)源于任何大豆FAD2基因、大豆FAD2-1A基因(SEQIDNO:4)、大豆FAD2-1A內(nèi)含子(SEQIDNO:1)、大豆FAD2-1B內(nèi)含子(SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)、大豆FAD2-2基因、大豆FAD2-1基因的等位基因、大豆FAD2-2基因的等位基因和來(lái)源于得自其他豆科植物例如苜蓿屬的種(#ed/c^o".J、豌豆屬的種(,/;y"邁s;7)、蠶豆屬的種(P7"'a)、菜豆屬的種CP^seo7ws5力)和豌豆的FAD2基因。因此很清楚，具有指定的對(duì)大豆FAD2-1序列的同一性水平的DNA序列可得自多個(gè)來(lái)源。還可通過(guò)合成獲得具有指定的序列同一性水平的DNA序列。類似地，也應(yīng)理解具有上述指定的對(duì)大豆FATB基因的同一性水FATB-1基因(SEQIDNO:28)、大豆FATB-1內(nèi)含子(SEQIDNO:29-35)、大豆FATB-15'UTR(SEQIDNO:36)、大豆FATB-1UTR(SEQIDNO:37)、大豆FATB-2基因(SEQIDN0:43)、大豆FATB-1的等位基因、大豆FATB-2基因的等位基因和來(lái)源于得自其他豆科植物例如苜蓿屬的種、豌豆屬的種、蠶豆屬的種、菜豆屬的種和豌豆屬的種的FATB基因。因此很清楚，具有指定的對(duì)大豆FAD2-1序列的同一性水平的DNA序列可得自多個(gè)來(lái)源。還可通過(guò)合成獲得具有指定的序列同一性水平的DNA序列。在本發(fā)明的方法中，經(jīng)特定設(shè)計(jì)以產(chǎn)生與FAD2-l基因具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)分子的轉(zhuǎn)基因還可誘導(dǎo)FAD2-1序列特異性沉默和用于減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)間隔區(qū)序列，優(yōu)選促進(jìn)dsRNA分子形成的間隔區(qū)序列將dsRNA的有義鏈序列與反義鏈序列分開。這樣的間隔區(qū)序列的實(shí)例包括Wesley等人，PlantJ.，27(6):581-90(2001)，和Hamilton等人，PlantJ.，15:737-746(1988)中所示的間隔區(qū)序列。在優(yōu)選方面，間隔區(qū)序列能夠形成Wesley等人(同上)中舉例說(shuō)明的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本說(shuō)明書中的特別優(yōu)選間隔區(qū)序列是植物內(nèi)含子或其部分。特別優(yōu)選的植物內(nèi)含子是可剪接的內(nèi)含子?？杉艚?Spliceable)的內(nèi)含子包括但不限于選自PDK內(nèi)含子、FAD3-1A或FAD3-1B內(nèi)含子#5、FAD3內(nèi)含子#1、FAD3內(nèi)含子#3A、FAD3內(nèi)含子并3B、FAD3內(nèi)含子井3C、FAD3內(nèi)含子#4、FAD3內(nèi)含子#5、FAD2內(nèi)含子井l和FAD2-2內(nèi)舍子的內(nèi)含子。任選地，可通過(guò)DNA開。間隔區(qū)片段可以是基因片段或人造DNA?？墒归g隔區(qū)片段變短以促進(jìn)形成發(fā)夾dsRNA或使之變長(zhǎng)以促進(jìn)不具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA。如US2005/0176670Al中所公開的，可通過(guò)延長(zhǎng)有義或反義分子中的一個(gè)分子的長(zhǎng)度來(lái)提供間隔區(qū)?？蛇x擇地，如美國(guó)專利申請(qǐng)2005/0183170中所公開，可在插入植物基因組后產(chǎn)生右邊界-右邊界("RB-RB，，)序列。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因通常包含與上述減少內(nèi)源性大豆FAD2-1或FATB植物啟動(dòng)子。這樣的載體的設(shè)計(jì)通常在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)(參見,例如，PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,Clark(ed.)，Springer,NewYork(1997))。然而，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，構(gòu)建體或載體還可包含可在插入后利用內(nèi)源性啟動(dòng)子的無(wú)啟動(dòng)子基因。在文獻(xiàn)中描述了許多在植物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子，例如CaMV35S和FMV啟動(dòng)子。CaMV35S和FMV35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)的或加倍的(duplicated)形式還可用于表達(dá)上述減少內(nèi)源性FAD2-1基因的表達(dá)的DNA序列(Odell等人，Nature313:810-812(1985);美國(guó)專利號(hào)5，378，619)。在例如美國(guó)專利5,378,619、5,391,725、5,428,147、5,447,858、5，608，144、5,608,144、5,614,399、5,633,441、5,633,435和4,633,436中描述了可使用的另外的啟動(dòng)子。此外，可將組織特異性增強(qiáng)子與基礎(chǔ)植物啟動(dòng)子一起使用?；A(chǔ)啟動(dòng)子通常包含"TATA"盒和mRNA加帽位點(diǎn)但缺少高水平表達(dá)所必需的增強(qiáng)子。減少內(nèi)源性大豆FAD2-1或FATB基因的表達(dá)的DNA序列的啟動(dòng)子。事實(shí)上，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用的啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。此類種子特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括來(lái)自基因例如油菜籽蛋白(Kridl等人，SeedSci.Res.1:209-219(1991))、菜豆蛋白、硬脂酰-ACP去飽和酶、7Sa、7Sa'(Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，83:8560-8564(1986))、USP、arcelin和油質(zhì)蛋白的5'調(diào)控區(qū)。用于在種子中表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是7Sct、7SoT、油菜籽蛋白和FAD2-1A啟動(dòng)子。構(gòu)建體和載體通常還包括與減少內(nèi)源性大豆FAD2-1和FATB基因的表達(dá)的上述DNA序列有效連接的3'轉(zhuǎn)錄終止子或3'多腺苷酸化信號(hào)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以是在植物中具有功能的任何轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)或任何植物轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。優(yōu)選轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包括但不限于豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'序列、油菜(5ra^ica)油菜籽蛋白3'序列、tml3'序列和農(nóng)桿菌(/^ro6ac/^r/w邁)肺瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒胭脂堿合酶(N0S)基因3'序列。應(yīng)理解，該組示例性多腺苷酸化區(qū)域是非限定性多腺苷酸化區(qū)域。最后，還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因插入還包含編碼選擇標(biāo)記或可評(píng)分(scoreable)標(biāo)記的基團(tuán)的植物轉(zhuǎn)化載體。選擇標(biāo)記基因可以是編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferase)蛋白、抗草甘膦的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白、二氫蝶酸合酶蛋白、對(duì)磺酰脲類不敏感的乙酰乳酸合成酶蛋白、對(duì)阿特拉津不敏感的Q蛋白、能夠降解溴苯腈的腈水解酶蛋白、能夠降解茅草枯的脫面酶蛋白、2，4-二氯苯氧乙酯單氧合酶蛋白、對(duì)氨甲碟呤不敏感的二氫葉酸還原酶蛋白和對(duì)氨乙基半胱氨酸不敏感的章魚堿合酶蛋白的基因。與各基因結(jié)合使用的相應(yīng)的選擇試劑可以是新霉素(用于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白選擇)、膦絲菌素(用于膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白選擇)、草甘膦(用于抗草甘膦的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白選擇)、潮霉素(用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白選擇)、磺胺嗜啶(用于二氫蝶酸合酶蛋白選擇)、氯磺隆(用于對(duì)磺酰脲類不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白選擇)、阿特拉津(用于對(duì)阿特拉津不敏感的Q蛋白選擇)、溴苯腈(用于腈水解酶蛋白選擇)、茅草枯(用于脫鹵素酶蛋白選擇)、2，4-二氯苯氧乙酸(用于2，4-二氯苯氧乙酯一氧化物酶蛋白選擇)、氨甲蝶呤(用于對(duì)氨甲蝶呤不敏感的二氫葉酸還原酶蛋白選擇)或氨乙基半胱氨酸(用于對(duì)氨乙基半胱氨酸不敏感的章魚堿合酶蛋白選擇)。優(yōu)選選擇標(biāo)記基因是賦予對(duì)除草劑草甘膦的抗性的CP4EPSPS基因?？稍u(píng)分標(biāo)記基因可以是編碼p-葡糖苷酸酶蛋白、綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、P-半乳糖苷酶蛋白、來(lái)源于luc基因的熒光素酶蛋白、來(lái)源于lux基因的熒光素酶蛋白、唾液酸酶蛋白、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白、胭脂堿合酶蛋白、章魚堿合酶蛋白或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的基因。上述核酸分子是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)的實(shí)施方案。本發(fā)明不意欲限定于舉例說(shuō)明的實(shí)施方案。第一和第二組DNA序列在核酸分子內(nèi)的序列排列不限定于舉例說(shuō)明和描述的排列，可以以本文描述的和在附圖中舉例說(shuō)明的適合于達(dá)到本發(fā)明的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)的任何方式對(duì)其進(jìn)行改變。B.轉(zhuǎn)基因生物和用于產(chǎn)生所述生物的方法可將本發(fā)明的任何核酸分子和構(gòu)建體以永久性和短暫性的方式導(dǎo)入大豆植物或植物細(xì)胞。用于將DNA導(dǎo)入大豆植物細(xì)胞的方法和技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的，事實(shí)上可通過(guò)其將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的任何方法適合用于本發(fā)明。合適的方法的非限定性實(shí)例包括化學(xué)方法；物理方法例如顯微注射、電穿孔、基因槍、微粒轟擊以及真空浸滲；病毒載體；和受體介導(dǎo)的機(jī)制。還可使用細(xì)胞轉(zhuǎn)化的其他方法，其包括但不限于通過(guò)直接將DNA轉(zhuǎn)移入花粉、通過(guò)直接將DNA注射入植物的生殖器官或通過(guò)將DNA直接注射入未成熟的胚的細(xì)胞中然后再水化干燥的胚從而將DNA導(dǎo)入植物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是用于將基因?qū)胫参锛?xì)胞的廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)。參見，例如，F(xiàn)raley等人，Bio/Technology3:629-635(1985);Rogers等人，MethodsEnzymol.153:253-277(1987)。通過(guò)邊界序列確定待轉(zhuǎn)移的DM的區(qū)域，通常將間插DM插入植物基因組。Spielmann等人，Mol.Gen.Genet.205:34(1986)?，F(xiàn)代農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化栽體能夠在大腸桿菌(E.coli)和農(nóng)桿菌中復(fù)制，從而允許進(jìn)行方便的操作。Klee等人，In:PlantDNAInfectiousAgents,Hohn和Schell(eds.)，Sphnger-Verlag，NewYork,pp.179-203(1985)。在美國(guó)專利號(hào)7，002，058中明確描述了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆的轉(zhuǎn)化。通常可這樣獲得轉(zhuǎn)基因植物，即通過(guò)將目的基因(即，在這種情況下為減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因或減少FAD2-1基因和FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因)與選擇標(biāo)記基因連接，通過(guò)上述方法中的任一方法將連接的轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锛?xì)胞、植物組織或植物，然后在需要所述選擇標(biāo)記基因表達(dá)以便植物生長(zhǎng)的條件下再生或恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明說(shuō)明書的前面部分已描述了示例性選擇標(biāo)記基因和相應(yīng)的選擇試劑。還可這樣獲得轉(zhuǎn)基因植物，即通過(guò)將目的基因(即在這種情況下為減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因或減少FAD2-1基因和FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因)與可評(píng)分標(biāo)記基因連接，通過(guò)上述方法中的任一種方法將連接的轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锛?xì)胞，然后從就可評(píng)分標(biāo)記基因的表達(dá)檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明說(shuō)明書的前面部分已描述了示例性可評(píng)分標(biāo)記基因。發(fā)育和培養(yǎng)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。通常參見，Maliga等人，MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborPress(1995);Weissbach和Weissbach，In:MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,SanDiego，CA(1988)。本發(fā)明的植物可以是植物的部分或從育種程序產(chǎn)生的，還可使用無(wú)融合生殖對(duì)其進(jìn)行再生。用于產(chǎn)生無(wú)性生殖的植物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見，例如，美國(guó)專利5，811，636。本文涉及的獲得低亞麻酸/中油酸大豆植物的特定方法使得必需用減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆品種。包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆品種的實(shí)例包括A5、C1640、6P248、N98-44、T27111、T27190、T26767、T26830和Soyola大豆(參見美國(guó)專利申請(qǐng)20060107348和Burton等人，CropSci.44:687-688，2004)。也涉及，可用減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化其他大豆品系，所述大豆品系包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變和具有通過(guò)美國(guó)專利申請(qǐng)20060107348中公開的標(biāo)記輔助育種方法產(chǎn)生的農(nóng)藝上優(yōu)良的生長(zhǎng)和/或生產(chǎn)特征。可選擇地，還涉及，可通過(guò)美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中公開的標(biāo)記輔助育種方法產(chǎn)生大豆品系，所述大豆品系包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變且易于轉(zhuǎn)化。還可用減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化大豆植物，所述大豆植物含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變且易于轉(zhuǎn)化?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法直接轉(zhuǎn)化的三種其他的低亞麻酸大豆包括BARC12(其為決定子成熟(determinantmaturity)組#3品系)、VistiveTM大豆品系(Monsanto,St.Louis，M0.，USA)或?yàn)辄S色種臍L2NUL品系的0137648/01A證-38。還涉及，在本發(fā)明的方法中用轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化的低亞麻酸大豆植物可來(lái)源于包含含有賦予減少的亞麻酸含量的/a^-M-、/a^J-k-或/^W-M卡/a^-Jt等位基因的大豆植物基因組區(qū)域的大豆種質(zhì)。與低亞麻酸大豆表型相關(guān)的此類單核普酸多態(tài)性描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239，676中。在某些實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征在于FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核香酸2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量的表型的大豆基因區(qū)域的特征在于FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量的表型的大豆基因區(qū)域的特征在于FAD3-1C啟動(dòng)子中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征在于FAD3-1C基因中的缺失。賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征還可在于FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性和FAD3-1c基因序列中的缺失。賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征還可在于FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核普酸2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性和FAD3-1C啟動(dòng)子中的多態(tài)性，例如相應(yīng)于SEQIDNO:63的334、364、385、387、393、729或747的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。包含大豆FAD3-1C基因中的缺失的大豆種質(zhì)用于這些方法的實(shí)施中，并且可從包括但不限于大豆品系6P248、T27111、T27190、T26767、T26830和A5的大豆品系獲得所述大豆種質(zhì)，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中所描述的。通過(guò)任何方法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，所述方法包括美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中所描述的PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳法、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和/或DNA測(cè)序?？蛇x擇地，可通過(guò)選自單堿基延伸反應(yīng)(SBE)、等位基因特異性引物延伸測(cè)序(ASPE)、測(cè)序、通用PCR、等位基因特異性延伸、雜交、質(zhì)語(yǔ)、連接、延伸連接和游離核酸內(nèi)切酶(FlapEndonuclease)介導(dǎo)的測(cè)定的任一個(gè)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中描述了用于檢測(cè)上述FAD3-1B和MD3-7C的遺傳多態(tài)性的引物和方法?？赏ㄟ^(guò)方法(包括但不限于PCR、雜交、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和/或基于DNA測(cè)序的方法)檢測(cè)缺失例如FAD3-1C基因中的缺失。上述直接轉(zhuǎn)化法還可用于獲得低亞麻酸/低飽和/中油酸大豆植物。在這些方法中，用減少內(nèi)源性大豆FAD2-1和內(nèi)源性大豆FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因直接轉(zhuǎn)化上述低亞麻酸大豆植物，以產(chǎn)生具有低亞麻酸、低飽和、中油酸表型的大豆植物?？捎糜谥参镛D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因可以是減少l)內(nèi)源性大豆FAD2-1基因或2)內(nèi)源性大豆FAD2-1和FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因中的任何基因。還涉及，包含減少1)內(nèi)源性大豆FAD2-1基因或2)內(nèi)源性大豆FAD2-1和FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的載體還可包含額外的轉(zhuǎn)基因或?qū)⑵渑c額外的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行遺傳組合。例如，在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239，676中描述了表達(dá)影響油的組成、病原抗性、產(chǎn)量、形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)組成、氨基酸組成、淀粉組成和植酸鹽水平的其他基因的額外的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因可與本文描述的轉(zhuǎn)基因和低亞麻酸突變體組合。本發(fā)明不意欲限定于舉例說(shuō)明的實(shí)施方案。在詳述的部分A中已描述了示例性核酸分子，下面進(jìn)一步描述非限定性示例性核酸分子并且在圖1-4中和實(shí)施例中對(duì)其進(jìn)行舉例說(shuō)明。C.包含轉(zhuǎn)基因的大豆植物的雜交在另一個(gè)方面，可將本發(fā)明的植物與另一種轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因植物雜交。可將植物與另一種植物雜交，所述另一種植物具有包含改變的水平的脂肪酸的油的組成，例如但不限于，具有擁有更低水平的亞麻酸的油的組成的品種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明的植物與具有低于按重量計(jì)算3%的亞麻酸的品種雜交。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的植物與具有高于按重量計(jì)算20%的硬脂酸的另一種植物雜交。此類具有改變的水平的脂肪酸的植物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，且描述于例如Hawkins和Kridl(1998)PlantJournal13(6):743-752和美國(guó)專利號(hào)6，365，802中。特別地，本發(fā)明的方法涉及大豆植物(其包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)或減少內(nèi)源性大豆FAD2-1和FATB基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因)與包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆品種的雜交。包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆品種的實(shí)例包括A5、C1640、6P248、N98-44、T27111、T27190、T26767、T26830和Soyola大豆(參見美國(guó)專利申請(qǐng)20060107348和Burton等人，CropSci.44:687-688，2004)。還涉及，可將其他大豆品系(其包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變和具有通過(guò)美國(guó)專利申請(qǐng)20060107348中/>開的標(biāo)記輔助育種方法產(chǎn)生的農(nóng)藝學(xué)上優(yōu)良的生長(zhǎng)和/或生產(chǎn)特征)與包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的大豆植物雜交?？捎糜诒景l(fā)明的方法的三種其他低亞麻酸雜交親本包括BARC12(其為決定子成熟組H品系)、VistiveTM大豆品系或0137648/01AHKW-38(其為黃色種臍L2NUL品系)。還涉及，用于與轉(zhuǎn)基因雜交的低亞麻酸大豆植物可來(lái)源于包含含有尸a^-76-、尸a^/J-"-或尸<2^-^+A^-k"^位基因(所述基因賦予減少的亞麻酸含量)的大豆植物基因組區(qū)域的大豆種質(zhì)。在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中描述了與低亞麻酸大豆表型相關(guān)的此類單核苷酸多態(tài)性。在某些實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征在于FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征在于FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量的表型的大豆基因區(qū)域的特征在于FAD3-1C啟動(dòng)子中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苦酸334、364、385、387、393、729或747的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征在于FAD3-1C基因中的缺失。賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征還可在于FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性和FAD3-1C基因序列中的缺失。賦予低亞麻酸含量表型的大豆基因組區(qū)域的特征還可在于FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核香酸2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性和FAD3-1C啟動(dòng)子中的多態(tài)性，例如相應(yīng)于SEQIDNO:63的334、364、385、387、393、729或747的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性。包含大豆FAD3-1C基因中的缺失的大豆種質(zhì)用于這些方法的實(shí)施中，并且可從包括但不限于大豆品系6P248、T27111、T27190、T26767、T26830和A5的大豆品系獲得所述大豆種質(zhì)，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中所描述的。實(shí)施例的表3和4描述了特異的多態(tài)性與展示低亞麻酸表型的特異大豆種質(zhì)或大豆品系的關(guān)系。不受限于理論，進(jìn)一步指出，某些FAD3-1C基因中的某些多態(tài)性和缺失潛在地部分促成由攜帶這些多態(tài)性或缺失的大豆植物展示的低亞麻酸表型。SEQIDNO:61中的2021位點(diǎn)上的SNP是將氨基酸殘基從組氨酸改變成酪氨酸的有義突變(sensemutation)。已發(fā)現(xiàn)組氨酸殘基在許多參與去飽和的基因中是至關(guān)重要的。發(fā)現(xiàn)的該特定的SNP在低亞麻酸品系中引起基序His-Val-Ile-His-His突變?yōu)镠is-Val-Ile-His-Tyr?；蚺c低亞麻酸表型相關(guān)且是在具有該多態(tài)性的大豆中觀察到的減少的亞麻酸表型的可能原因?？赏ㄟ^(guò)任何方法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，所述方法包括美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中所描述的PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳法、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和/或DNA測(cè)序?？蛇x擇地，可通過(guò)選自單堿基延伸反應(yīng)(SBE)、等位基因特異性引物延伸測(cè)序(ASPE)、測(cè)序、通用PCR、等位基因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜、連接、延伸連接和游離核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的測(cè)定的任一測(cè)定法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/239,676中描述了用于檢測(cè)上述FAD3-1B和MD3-7的C遺傳多態(tài)性的引物和方法。可通過(guò)方法(包括但不限于PCR、雜交、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和/或基于DNA測(cè)序的方法)檢測(cè)缺失例如FAD3-1C基因中的缺失。上述雜交方法還可用于獲得低亞麻酸/低飽和/中油酸大豆植物。在這些方法中，將上述低亞麻酸大豆植物與包含轉(zhuǎn)基因的大豆植物雜交以產(chǎn)生具有低亞麻酸、低飽和脂肪酸、中油酸表型的大豆植物，所述轉(zhuǎn)基因減少內(nèi)源性大豆FAD2-1和內(nèi)源性大豆FATB基因的表達(dá)。還涉及，可通過(guò)連接賦予對(duì)除草劑的抗性的選擇標(biāo)記來(lái)幫助轉(zhuǎn)基因與低亞麻酸大豆品系的雜交。例如，在對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的大豆植中，可通過(guò)除草劑處理選擇對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的Fl后代。此外，可通過(guò)將所述多個(gè)F2植物經(jīng)歷針對(duì)轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)就對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的F2大豆植物而富集從對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的Fl植物產(chǎn)生的F2植物。還可將可區(qū)分對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的或純合的大豆植物的分子標(biāo)記用于鑒定對(duì)于轉(zhuǎn)基因插入是純合的大豆植物?？赏ㄟ^(guò)天然或才幾械4支術(shù)雜交大豆植物(GlycinemaxL.)。通過(guò)自粉。在天然或人工雜交中，開花和開花時(shí)間是重要的考慮因素。大豆是短日照植物，但就對(duì)光周期的敏感性存在相當(dāng)多的遺傳變異。開花的臨界晝長(zhǎng)的范圍從對(duì)于適合于熱帶煒度的基因型的大約13小時(shí)至對(duì)于在更高綷度生長(zhǎng)的對(duì)光周期不敏感的基因型的24小時(shí)。大豆似乎在出芽后連續(xù)9天對(duì)晝長(zhǎng)不敏感。比臨界晝長(zhǎng)更短的光周期需要7至26天來(lái)完成開花誘導(dǎo)。大豆的花通常在花冠開放的當(dāng)天自花傳粉。柱頭在開花前大約1天接受花粉，如果沒有除去花瓣在開花后2天內(nèi)保持接受花粉。9個(gè)雄蕊的絲融合在一起，離旗瓣最近的那個(gè)是游離的。雄蕊在開花前大約1天在柱頭下面形成環(huán)，然后它們的絲開始快速延長(zhǎng)并且將花藥升高至柱頭周圍?；ㄋ幵陂_花的當(dāng)天裂開，花粉粒落在柱頭上，在10個(gè)小時(shí)內(nèi)花粉管到達(dá)子房并且完成受精。自花傳粉在沒有操作花的情況下在大豆中天然發(fā)生。對(duì)于兩種大豆植物的雜交，通常優(yōu)選(盡管不是必需的)使用人工雜交。在人工雜交中，在來(lái)自花的花粉成熟之前對(duì)在雜交中用作雌性的花進(jìn)行人工雜交傳粉，從而防止了自花傳粉，或可選擇地，使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)除去花的雄性部分。用于除去大豆花的雄性部分的技術(shù)包括，例如，雄性部分的物理去除、賦予雄性不育的遺偉因子的使用和對(duì)雄性部分使用化學(xué)殺配子劑。在對(duì)雌花去雄和不去雄的情況下，通過(guò)用鑷子從雄性親本的花取下雄蕊和雌蕊，然后用花藥輕輕地刷雌花的柱頭來(lái)進(jìn)行人工傳粉。可通過(guò)除去前萼(frontsepal)和龍骨瓣(keelpetal)，或用閉合的攝子刺穿龍骨，從而允許它們開放，以推開花瓣來(lái)接近雄蕊。用花藥在柱頭上粉刷使它們破裂，當(dāng)柱頭上清晰可見花粉時(shí)，獲得最高百分比的成功雜交?？赏ㄟ^(guò)在粉刷柱頭之前輕拍花藥來(lái)檢查花粉脫落。當(dāng)條件不利時(shí)，可能必須使用幾個(gè)雄花以獲得合適的花粉脫落，或可使用相同雄花給幾個(gè)具有良好的花粉脫落的花傳粉。遺傳上的雄性不育在大豆中是可獲得的，其可在本發(fā)明的上下文中用于幫助雜交，特別地用于輪回選擇程序。雜交封閉(crossingblock)的完全隔離所需要的距離不清楚；然而，當(dāng)雄性不育植物離外源花粉源12m或更長(zhǎng)距離時(shí)異型雜交(out-crossing)低于0.5%(Boerma和Moradshahi，CropScL，15:858-861，1975)。雜交封閉的邊界上的植物可能與外源花粉保持最高的異型雜交，可在收獲時(shí)除去其以使污染減少至最少。在收獲后，通常在不高于38X:的溫度下風(fēng)千豆莢直至種子包含13%或更少的水份，然后用手取出種子。如果相對(duì)濕度為50%或更低可將種子在大約25X:下滿意地貯存直至一年。在潮濕氣候中，如果不將種子干燥至7%的水分且在室溫下貯存在密閉的容器中，萌發(fā)百分率將快速降低。通過(guò)將種子干燥至7%的含水量和在l(TC或更低的溫度下將其貯存在保持5oy。的相對(duì)濕度的房間中或貯存在密閉的容器中來(lái)最佳地進(jìn)行在任何氣候下的長(zhǎng)期貯存。F.本發(fā)明的產(chǎn)品本發(fā)明的植物可以以完整或部分的形式使用。優(yōu)選植物部分包括生殖部分或貯藏部分。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"植物部分"包括但不限于種子、胚乳、胚珠、花粉、根、塊莖、莖、葉、柄(stalk)、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、樹皮、豆莢、種子和花。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，植物部分是種子?？杉庸け景l(fā)明的任何植物或其部分以產(chǎn)生飼料、粗粉、蛋白質(zhì)或油制品。用于該目的的特別優(yōu)選植物部分是種子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，飼料、粗粉、蛋白質(zhì)或油制品經(jīng)設(shè)計(jì)用于家畜類動(dòng)物、魚或人或任何組合。產(chǎn)生飼料、粗粉、蛋白質(zhì)和油制品的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。參見，例如美國(guó)專利4，957,748、5，100，679、5，219，596、5，936，069、6，005，076、6，146，669和6，156，227。在優(yōu)選實(shí)施文案中，蛋白質(zhì)制品是高蛋白制品。這樣的高蛋白制品優(yōu)選具有高于5%w/v，更優(yōu)選高于10%w/v和甚至更優(yōu)選高于15%w/v的蛋白質(zhì)含量。在優(yōu)選油制品中，油制品是具有來(lái)源于本發(fā)明的植物或其部分的高于5%w/v、更優(yōu)選高于10%w/v和甚至更優(yōu)選高于15%w/v的油含量的高油制品。在優(yōu)選實(shí)施方案中，油制品是液體且體積大于1、5、10或50升。本發(fā)明提供從本發(fā)明的植物產(chǎn)生的油或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的油。這樣的油可展示增強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性。此外，這樣的油可以是任何所得產(chǎn)品的少量或主要組分。此外，可將這樣的油與其他油混合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從本發(fā)明的植物產(chǎn)生的油或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的油按體積或重量計(jì)算構(gòu)成了大于0.5%、1%、5%、10°/。、25%、50%、75%或90%的任何產(chǎn)品的油組分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將油制品混合，所述油制品按體積計(jì)算可構(gòu)成大于10%、25%、35%、50%或75°/。的混合物?？蓪谋景l(fā)明的植物產(chǎn)生的油與一種或多種有機(jī)溶劑或石油餾出物混合?？蓪⒅参锏姆N子置于容器中。如本文所使用的，容器是能夠盛裝此類種子的任何物體。容器優(yōu)選盛裝超過(guò)大約500、l，OOO、5，000或25，000粒種子，其中至少大約10%、25%、50%、75%或100°/。的種子來(lái)源于本發(fā)明的植物。本發(fā)明還提供了盛裝超過(guò)大約10，000粒，更優(yōu)選大約20，000粒和甚至更優(yōu)選大約40，000種子的容器，其中超過(guò)大約10%，更優(yōu)選大約25%,更優(yōu)選大約50%和甚至，更優(yōu)選大約75%或90%的種子是來(lái)源于本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明還提供了盛裝超過(guò)大約10kg，更優(yōu)選大約25kg和甚至，更優(yōu)選大約50kg的種子的容器，其中超過(guò)大約10%,更優(yōu)選大約25%，更優(yōu)選大約50%和甚至，更優(yōu)選大約75%或90%的種子是來(lái)源于本發(fā)明的植物的種子。通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的大豆種子可包含不同的油組成。由通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的大豆種子產(chǎn)生的油在下面稱為"本發(fā)明的油"。本發(fā)明的優(yōu)選油具有低飽和油組成，或零飽和油組成。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有增加的油酸水平、減少的飽和脂肪酸水平和減少的多不飽和脂肪酸水平。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有增加的油酸水平和減少的飽和脂肪酸水平。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述油是大豆油。本文使用的脂肪酸含量或脂肪酸水平的百分?jǐn)?shù)指的是按重量計(jì)算的百分?jǐn)?shù)。在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明的油優(yōu)選具有為55至80%的油酸、大約12至43%的多不飽和脂肪酸和2至8%的飽和脂肪酸的油組成；更優(yōu)選具有為55至80%的油酸、大約14至42%的多不飽和脂肪酸和3至6%飽和脂肪酸的油組成；和甚至更優(yōu)選具有為55至80%的油酸、大約16.5至43%的多不飽和脂肪酸和2至3.6°/。的飽和脂肪酸的油組成。在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明的油優(yōu)選具有為65至80%的油酸、大約12至33%的多不飽和脂肪酸和2至8%的飽和脂肪酸的油組成；更優(yōu)選具有為65至80%的油酸、大約14至32%的多不飽和脂肪酸和3至6%飽和脂肪酸的油組成；和甚至更優(yōu)選具有為65至80°/。的油酸、大約16.5至33%的多不飽和脂肪酸和2至3.6°/。的飽和脂肪酸的油組成。在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明的油優(yōu)選具有為大約42至大約85%的油酸和大約8%至1.5°/。的飽和脂肪酸的油組成。在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有為大約42至大約85%的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸、按重量計(jì)算大約6°/。至大約15%的亞麻酸的油組成；更優(yōu)選具有為大約42至大約85%的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸、按重量計(jì)算低于35%的亞麻酸的油組成；甚至更優(yōu)選具有為大約42至大約85%的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸、按重量計(jì)算大約9%的亞麻酸的油組成。在笫五實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有為大約50%至大約85°/。的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸的油組成；更優(yōu)選大約50%至大約85%的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸、按重量計(jì)算大約4%至大約14%的亞麻酸的油組成；更優(yōu)選具有為大約50%至大約85%的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸、按重量計(jì)算低于35%的亞麻酸的油組成；和甚至更優(yōu)選具有為大約42%至大約85°/。的油酸、大約8%至大約1.5%的飽和脂肪酸、按重量計(jì)算大約2%至大約45%的亞麻酸的油組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有為大約65-80%的油酸、大約3-8%的飽和脂肪酸和大約12-32°/。的多不飽和脂肪酸的油組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有為大約65-80%的油酸、大約2-3.5%的飽和脂肪酸和大約16.5-33%的多不飽和脂肪酸的油組成。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的油具有為大約47-83%的油酸和大約5%的飽和脂肪酸；大約60-80%的油酸和大約5%的飽和脂肪酸；大約50-85%的油酸和大約2-7%的飽和脂肪酸；大約55-85°/。的油酸和大約2.5-7%的飽和脂肪酸；大約47-88%的油酸和大約3-7%的飽和脂肪酸；大約43-85%的油酸和大約5-7%的飽和脂肪酸；大約81-85%的油酸和大約5%的飽和脂肪酸；大約74-83%的油酸和大約6%的飽和脂肪酸；大約65-87%的油酸和大約6%的飽和脂肪酸；大約66-80%的油酸和大約6%的飽和脂肪酸；大約42-77%的油酸和大約5-8%的飽和脂肪酸；大約60-77%的油酸和大約6%的飽和脂肪酸；大約70-81%的油酸和大約5-7%的飽和脂肪酸；大約52-71%的油酸和大約5-7%的飽和脂肪酸；大約44-71%的油酸和大約6%的飽和脂肪酸；大約61-71%的油酸和大約8%的飽和脂肪酸；大約57-71%的油酸和大約7%的飽和脂肪酸；大約23-58%的油酸和大約8-14%的飽和脂肪酸；大約20-70%的油酸和大約6%的飽和脂肪酸；大約21-35%的油酸和大約5-6%的飽和脂肪酸；或大約19-28%的油酸和大約5%的飽和脂肪酸的油組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，油酸的百分?jǐn)?shù)是50%或更大、55%或更大、60%或更大、65%或更大、70%或更大、75%或更大、或80%或更大、或在50至80%、55至80%、55至75%、55至65°/。、60至85%、60至80%、60至75%、60至70%、65至85%、65至80%、65至75%、65至70%或69至73%的范圍內(nèi)。本發(fā)明的油中油酸含量的適合的百分?jǐn)?shù)范圍還可包括其中下限選自下列百分?jǐn)?shù)百分之50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80和上限選自下列百分?jǐn)?shù)百分之60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90的范圍。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的油中的亞麻酸的百分?jǐn)?shù)是10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少、5%或更少、4.5%或更少、4%或更少、3.5%或更少、3%或更少、3.0%或更少、2.5%或更少或2%或更少；或在O.5至2%、0.5至3%、0.5至4.5%、0.5°/。至6°/。、3至5%、3至6%、3至8%、1至2%、1至3%或1至4%的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的油組成中的飽和脂肪酸的百分?jǐn)?shù)為15%或更少、14%或更少、13°/?；蚋?、12%或更少，11°/。或更少、10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6°/?；蚋?、5%或更少、4°/?；蚋倩?.6%或更少；或在2至3%、2至3.6%、2至4%、2至8°/。、3至15%、3至10%、3至8%、3至6%、3.6至7%、5至8%、7至10%或10至15°/。的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的油中的飽和脂肪酸包括棕櫚酸和硬脂酸的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，飽和脂肪酸的百分?jǐn)?shù)在大約10%或更少、大約9%或更少、大約8%或更少、大約7%或更少、大約6%或更少、大約5°/?；蚋?、大約4.5%或更少、大約4%或更少、大約3.5%或更少、大約3%或更少、大約3.0°/?；蚋?、大約2.5%或更少或大約2%或更少的范圍內(nèi)；或在0.5至2%、0.5至3%、0.5至4.5%、0.5至6%、0.5至7%、0.5至8%、0.5至9。/。、1至4%、1至5%、1至6%、1至7%、1至8%、1至9%、1.5至5%、1.5至6%、1.5至7%、1.5至8%、1.5至9%、2至5%、2至6%、2至7%、2至8%、2至9%、3至5%、3至6%、3至7%、3至8%、3至9%、4至7%、4至8%、4至9%、5至7%、5至8%和5至9°/。的范圍內(nèi)。在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明的油中的飽和脂肪酸含量的適合的百分?jǐn)?shù)范圍還包括其中下限選自下列百分?jǐn)?shù)百分之0.5、1、1.5、2.、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5和上限選自百分?jǐn)?shù)百分之ll、10、9、8、7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1或0.5的范圍。G.抑制的調(diào)控本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及調(diào)控基因抑制水平的方法?；蛞种频恼{(diào)控可導(dǎo)致或更多或更少的基因抑制。可通過(guò)將本發(fā)明的構(gòu)建體插入植物基因組引起對(duì)基因產(chǎn)物的抑制。類似地，可通過(guò)將本發(fā)明的構(gòu)建體插入植物基因組來(lái)產(chǎn)生基因抑制的調(diào)控。調(diào)控基因抑制的方法的其他實(shí)例包括，但不限于，反義技術(shù)、共抑制、RNA干擾(dsRNAi)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、雜交和使用本發(fā)明的構(gòu)建體的核酶。以舉例說(shuō)明的方式提供下列實(shí)施例，所述實(shí)施例不意欲限定本發(fā)明?？赏ㄟ^(guò)改變用于抑制的可轉(zhuǎn)錄DNA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)控對(duì)基因的抑制，所述序列來(lái)源于被靶向抑制的基因。通過(guò)使用轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，許多方法可用于抑制基因。不受限于理論，這些方法據(jù)認(rèn)為共同具有與另一個(gè)RNA分子雜交的RNA分子的表達(dá)。令人驚奇地，可有利地使用特定長(zhǎng)度的RNA分子以調(diào)控或減輕對(duì)被靼向的內(nèi)源性基因的穩(wěn)定狀態(tài)的表達(dá)水平的抑制。FAD2-1的基因抑制導(dǎo)致提高的油酸水平和減少的亞油酸水平。當(dāng)FAD2-1被嚴(yán)重抑制時(shí)，油酸的水平可高于65%，這導(dǎo)致棕櫚酸和亞麻酸水平減少。例如，當(dāng)抑制FAD2-1時(shí)，油酸水平可達(dá)到85%,混合的棕櫚酸和硬脂酸水平減少至大約10%。類似地，F(xiàn)ATB的下調(diào)導(dǎo)致飽和脂肪酸(主要是棕櫚酸)的水平減少。當(dāng)抑制FAD2和FATB以使油酸水平為大約85%時(shí)，飽和脂肪酸水平為大約10%。當(dāng)抑制FAD2和FATB以使油酸水平高于85%時(shí)，飽和脂肪酸水平可下降低于10°/。。在本發(fā)明的指導(dǎo)下，飽和脂肪酸水平可減少至低于10%而不使油酸增加至超過(guò)85。/。。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)減少導(dǎo)入植物的FAD2-1內(nèi)含子的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)控對(duì)FAD2的抑制。對(duì)FAD2的較少抑制導(dǎo)致中等水平的油酸，大約40-85%的油酸。對(duì)FAD2的抑制隨著導(dǎo)入的FAD2-1內(nèi)含子片段的長(zhǎng)度減小而減小。例如，長(zhǎng)度減少至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的FAD2-1內(nèi)含子可減小對(duì)FAD2的抑制和油酸水平的相應(yīng)增加以及亞油酸水平的相應(yīng)減小。少與同源DNA的長(zhǎng)度的減少之間的關(guān)系。例如，可通過(guò)缺失、增加被導(dǎo)入的同源DNA的部分，然后就被靶向的基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定來(lái)確定可通過(guò)減少同源的導(dǎo)入的DNA的長(zhǎng)度可獲得的對(duì)抑制的減少量。本發(fā)明包括用于減輕對(duì)FAD2的抑制同時(shí)在植物中仍然具有飽和脂肪酸水平的強(qiáng)烈減少的方法。在此類植物中，油酸水平可在40-85%的范圍內(nèi)。類似地，當(dāng)將組合的3'和5'非翻譯區(qū)導(dǎo)入時(shí)，與當(dāng)將全長(zhǎng)FATB基因?qū)胨拗骷?xì)胞時(shí)相比，低于對(duì)FATB的完全抑制的抑制發(fā)生。以類似的方式，當(dāng)將通常編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的開放閱讀框架的5'部分導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，對(duì)FATB的抑制水平減少。在具有通過(guò)使用本發(fā)明的方法抑制的FAD2和FATB的細(xì)胞中，油酸水平可以為40-85°/。，而飽和脂肪酸水平可在1%至9%之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)控基因抑制以減少抑制(相對(duì)于來(lái)自完整的基因元件的抑制，其中所述完整的基因元件可以是完整的基因、完整的外顯子、完整的內(nèi)含子、完整的信號(hào)序列或完整的UTR)，然后構(gòu)建包含來(lái)自基因元件的內(nèi)源性序列的片段的重組核酸分子；在宿主細(xì)胞中起始所述重組核酸分子的表達(dá)；然后用重組核酸分子抑制內(nèi)源性基因的方法。被抑制的基因可以是任何基因，包括FAD2和FATB。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)控對(duì)FAD2或FATB的抑制的方法，該方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)部分FAD2或FATB基因元件序列(其中FAD2或FATB基因元件來(lái)自宿主細(xì)胞中的內(nèi)源性FAD2或FATB基因，F(xiàn)AD2或FATB基因元件序列可以是FAD2或FATB基因、FAD2或FATB外顯子、FAD2或FATB內(nèi)含子、FAD2或FATB轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)或FAD2或FATBUTR;部分FAD2或FATB基因元件序列少于完整的FAD2或FATB基因元件序列)；用部分FAD2或FATB基因元件序列抑制內(nèi)源性FAD2或FATB，其中宿主細(xì)胞中的對(duì)FAD2或FATB內(nèi)源性基因的抑制水平低于宿主細(xì)胞(所述宿主細(xì)胞具有相似的遺傳背景和包含F(xiàn)AD2或FATB基因元件的完整FAD2或FATB基因元件序列的第二FAD2或FATB核酸序列)中的對(duì)FAD2或FATB內(nèi)源性基因的抑制水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及方法，所述方法通過(guò)用重組核酸分子(該重組核酸分子包含抑制FAD2、FATB或FAD2及FATB的內(nèi)源性表達(dá)的DM序列，其中所述DM序列包含比完整的基因元件的全序列更短的FAD2、FATB或FAD2及FATB的核酸序列，所述完整的基因元件選自基因、外顯子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)、3'-UTR、5'-UTR和開放閱讀框架)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和在其中起始所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞來(lái)改變植物細(xì)胞的油組成，借此，與具有相似遺傳背景但缺乏所述重組核酸分子的植物細(xì)胞相比，油組成發(fā)生了改變。FAD2或FATB的基因元件在長(zhǎng)度上可縮短50、75、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、2000、3000或4000個(gè)核苷酸。FAD2或FATB的基因元件的長(zhǎng)度可以是50、75、100、150、175、200、220、250、300、320、350、400、420、450、500、550、6GG、800或1000個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在植物種子中增加油酸含量和減少飽和脂肪酸含量的方法，該方法通過(guò)i)縮短外源性FAD2DNA序列在宿主細(xì)胞中的長(zhǎng)度直至來(lái)自轉(zhuǎn)化的植物的對(duì)FAD2表達(dá)的抑制量，與具有相似遺傳背景和完整的外源性FAD2基因DNA序列的宿主細(xì)胞中的對(duì)FAD2表達(dá)的抑制相比，至少部分減少；和U)培育具有包含縮短的FAD2DNA序列的核酸分子的植物，其中縮短的FAD2DNA序列至少部分抑制FAD2的內(nèi)源性表達(dá)；和iii)栽培產(chǎn)生種子(所述種子與來(lái)自具有相似的遺傳背景但缺乏縮短的FAD2DNA序列的植物的種子相比，具有減少的飽和脂肪酸含量)的植物來(lái)實(shí)現(xiàn)在植物種子中增加油酸含量和減少飽和脂肪酸含量?？赏ㄟ^(guò)導(dǎo)入不同長(zhǎng)度的DM在經(jīng)驗(yàn)上確定外源性FAD2DNA序列縮短至至少部分減少對(duì)內(nèi)源性FAD2的抑制的量。例如，可通過(guò)缺失、增加被導(dǎo)入的同源DNA的部分，然后就被粑向的基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定來(lái)確定可通過(guò)減少同源的導(dǎo)入的DNA的長(zhǎng)度獲得的抑制減少的量。對(duì)FAD2表達(dá)的抑制量可獲得為3?；蚋嗔?、6?；蚋嗔?、IO?；蚋嗔?、15?；蚋嗔；?0粒或更多粒的來(lái)自植物的種子的平均數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及方法，所述方法通過(guò)用重組核酸分子(其包含抑制FAD2和FATB的內(nèi)源性表達(dá)的DNA序列，其中所述DNA序列包含比完整的基因元件的完整序列更短的FAD2的核酸序列，所述完整的基因元件選自基因、外顯子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)和UTR)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和培育轉(zhuǎn)化的植物(其中轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生與來(lái)自具有相似遺傳背景但缺乏所述重組核酸分子的植物的種子相比，具有減少的飽和脂肪酸含量的種子)產(chǎn)生具有擁有減少的飽和脂肪酸含量的種子的轉(zhuǎn)化的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及方法，所述方法通過(guò)分離長(zhǎng)度至少為40個(gè)核苷酸、能夠在脂肪酸合成途徑中抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的基因元件；產(chǎn)生一個(gè)以上縮短的基因元件片段；將一個(gè)以上個(gè)縮短的片段中的每一個(gè)導(dǎo)入溫帶油料種子作物的細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；然后選擇包含縮短的確定長(zhǎng)度和序列的、實(shí)現(xiàn)希望的種子油的脂肪酸組成的改變的片段的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)調(diào)控來(lái)自溫帶油料種子作物的種子油的脂肪酸組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上述方法還包括構(gòu)建重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有兩個(gè)不同的內(nèi)源性基因的至少兩個(gè)縮短的片段，所述片段實(shí)現(xiàn)不同的希望的種子油的脂肪酸組成的改變；將重組DM構(gòu)建體導(dǎo)入溫帶油料種子作物的植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；選擇包含至少兩個(gè)縮短的片段和具有一個(gè)以上希望的改變(通過(guò)至少兩個(gè)縮短的片段實(shí)現(xiàn)的)的來(lái)自種子油的脂肪酸組成的轉(zhuǎn)基因植物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及展示具有強(qiáng)烈減少的飽和脂肪酸含量和適度增加的油酸含量、具有在宿主細(xì)胞中抑制FAD2的內(nèi)源性表達(dá)的DNA序列的大豆種子，其中所述DNA序列具有比完整的基因元件的完整序列更短的FAD2的核酸序列，所述完整的基因元件選自基因、外顯子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)和UTR。實(shí)施例下列實(shí)施例用于示范本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，遵循本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)施中良好地發(fā)揮作用，因此可被認(rèn)為組成了用于其實(shí)施的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本公開內(nèi)容的教導(dǎo)下應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可在公開的特定的實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變，但仍然獲得相同的或相似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更特別地，很明顯某相同的或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很顯然的所有此類神、范圍和概念之內(nèi)。實(shí)施例1FATB-2序列的分離從Asgrow大豆品種A3244獲得葉組織，將其在液氮中研磨，然后在80。C下貯存直至使用。向2ml水凍/研磨的葉組織中加入6mlSDS提取緩沖液(650ml無(wú)菌ddH20，100ml1MTris-ClpH8，100ml0.25MEDTA，50ml20%SDS，100ml5MNaCl，4ju10-巰基乙醇)，將混合物在65。C下溫育"分鐘。每隔15分鐘搖動(dòng)樣品。向樣品中加入2ml冰冷卻的5M醋酸鉀，搖動(dòng)樣品，然后在冰上溫育20分鐘。向樣品中加入3mlCHC13，搖動(dòng)樣品10分鐘。將樣品以10,000rpm離心20分鐘，收集上清液。向上清液加入2ml異丙醇并將其混合。然后將樣品以IO，OOOrpm離心20分^l中，除去上清液。將沉淀重懸浮于200|ulRNA酶中并在65C下溫育20分鐘。加入300jil醋酸銨/異丙醇(l:7)并進(jìn)行混合。然后將樣品以10，000rpm離心15分鐘，棄去上清液。用500ja180%的乙醇漂洗沉淀，讓其風(fēng)千。然后將基因組DNA的沉淀重懸浮于200iilTlOEl(10mMTris:1mMEDTA)中。將大豆FATB-2cDNA田比連群序歹'J(contigsequence)(SEQIDNO:42)用于設(shè)計(jì)13個(gè)橫跨基因的寡核苷酸Fl(SEQIDNO:48)、F2(SEQIDNO:49)、F3(SEQIDNO:50)、F4(SEQIDNO:51)、F5(SEQIDNO:52)、F6(SEQIDNO:53)、F7(SEQIDNO:54)、Rl(SEQIDNO:55)、R2(SEQIDNO:56)、R3(SEQIDNO:57)、R4(SEQIDNO:58)、R5(SEQIDNO:59)和R6(SEQIDNO:60)。將寡核苷酸成對(duì)地用于對(duì)分離的大豆基因DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增對(duì)1(Fl+Rl)、對(duì)2(F2+Rl)、對(duì)3(F3+R2)、對(duì)4(F4+R3)、對(duì)5(F5+R4)、對(duì)6(F6+R5)和對(duì)7(F7+R6)。如下進(jìn)行對(duì)5的PCR擴(kuò)增1個(gè)循環(huán)，95C下進(jìn)行10分鐘；30個(gè)循環(huán)95匸下進(jìn)行15秒、43'C下進(jìn)行30秒、72^C下進(jìn)行45秒；l個(gè)循環(huán)，72C下進(jìn)行7分鐘。對(duì)于所有其他寡核普酸對(duì)，如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增l個(gè)循環(huán)，95'C下進(jìn)行10分鐘；30個(gè)循環(huán)95'C下進(jìn)行15秒、48'C下進(jìn)行30秒、72TC下進(jìn)行45秒；1個(gè)循環(huán)，72。C下進(jìn)行7分鐘。從引物對(duì)l、2、4、5、6和7獲得陽(yáng)性片段。將各片段克隆入載體pCR2.1(Invitrogen)。確認(rèn)片段2、4、5和6并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。將這四個(gè)序列進(jìn)行排列以形成FATB-2基因的基因組序列(SEQIDNO:43)。通過(guò)基因組序列與cDNA序列的比較在大豆FATB-2基因中鑒定了4個(gè)內(nèi)含子內(nèi)含子I(SEQIDNO:44)橫跨基因組序列(SEQIDNO:43)的堿基119至堿基1333，其長(zhǎng)度為1215bp;內(nèi)含子II(SEQIDNO:45)橫跨基因組序列(SEQIDNO:43)的堿基2231至堿基2568,其長(zhǎng)度為338bp;內(nèi)含子III(SEQIDNO:46)橫跨基因組序列(SEQIDNO:43)的堿基2702至堿基3342，其長(zhǎng)度為641bp;和內(nèi)含子IV(SEQIDNO:47)橫跨基因組序列(SEQIDNO:43)的堿基3457至堿基3823，其長(zhǎng)度為367bp。實(shí)施例2抑制構(gòu)建體2A.FAD2-1構(gòu)建體將FAD2-1A內(nèi)含子#1(SEQIDNO:1)以有義和反義方向克隆入表達(dá)盒pCGN3892。載體pCGN3892包含大豆7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS。然后將兩個(gè)基因融合物分別連接入pCGN9372(包含由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因的載體)。所得的表達(dá)構(gòu)建體(圖1和2中分別描述的pCGN5469(有義方向)和pCGN5471(反義方向))用于大豆的轉(zhuǎn)化。將FAD2-1B內(nèi)含子(SEQIDNO:2)在質(zhì)粒pCGN5468(包含融合至FAD2-1A內(nèi)含子(有義)的7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS3')或pCGN5470(包含融合至FAD2~1A內(nèi)含子(反義)的7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS3')中分別以有義和反義方向融合至FAD2-1A內(nèi)含子#1的3'末端。然后將所得的內(nèi)含子組合融合物分別連接入pCGN9372(包含受FMV啟動(dòng)調(diào)控的CP4EPSPS基因的載體)。所得的表達(dá)構(gòu)建體(pCGN5485、FAD2-1A和FAD2-1B內(nèi)含子(有義方向)和pCGN5486、FAD2-1A和FAD2-1B內(nèi)含子(反義方向))用于大豆的轉(zhuǎn)化。2B.FAD3-1構(gòu)建體將FAD3-1A內(nèi)含子#1、#2、#4和#5(分別為SEQIDNO:7、8、lO和ll)、FAD3-1B內(nèi)含子并3C(SEQIDNO:23)和#4(SEQIDNO:24)全都以有義或反義方向分別連接入pCGN3892。pCGN3892包含大豆7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS3'。將這些融合物連接入pCGN9372(包含受FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因的栽體)以用于轉(zhuǎn)化入大豆。所得的表達(dá)載體(pCGN5455、FAD3-U內(nèi)含子#4(有義方向)；pCGN5459、FAD3-1A內(nèi)含子#4(反義方向)；pCGN5456、FAD3內(nèi)含子#5(有義方向)；pCGN5460、FAD3-1A內(nèi)含子#5(反義方向);pCGN5466、FAD3-1A內(nèi)含子#2(反義方向)；pCGN5473、FAD3-1A內(nèi)含子#1(反義方向))用于大豆的轉(zhuǎn)化。2C.FatB構(gòu)建體使用FATB-1部分基因組克隆作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增大豆FATB-1內(nèi)含子II序列(SEQIDNO:30)。如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增1個(gè)循環(huán)，95'C下進(jìn)行10分鐘；25個(gè)循環(huán)95C下進(jìn)行30秒、62'C下進(jìn)行30秒、72。C下進(jìn)行30秒；l個(gè)循環(huán)，72C下進(jìn)行7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生為854bp長(zhǎng)的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩端包含重新進(jìn)行基因工程改造產(chǎn)生的限制性位點(diǎn)。通過(guò)經(jīng)基因工程加在PCR引物的5，末端上的Xhol位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物以有義方向直接克隆入表達(dá)盒pCGN3892，從而形成pMON70674。載體pCGN3892包含大豆7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS3'。然后用Notl切割pM0N70674，將其連接入pM0N41164(包含受FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因的載體)。使用農(nóng)桿菌方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體pMON70678用于大豆的轉(zhuǎn)化。2D組合構(gòu)建體制備表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包含不同排列的l)單獨(dú)的FAD2-1序列(用于低亞麻酸、中油酸大豆生產(chǎn)方法)和2)FAD2-1和FATBDNA序列的組合。所述DNA序列是表2中描述或舉例說(shuō)明的任何序列，或包含有義、反義或有義和反義FAD2和/或FATB非編碼或編碼區(qū)的不同組合的任何其它的DNA序列組，從而以使它們能夠形成dsRNA構(gòu)建體、有義共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體或上述構(gòu)建體的不同組合。圖4描述了能夠表達(dá)本發(fā)明的有義共抑制或反義構(gòu)建體的DNA序列，其非編碼序列描述于下面的表1和2中。非編碼序列可以是單個(gè)序列、序列的組合(例如與3'UTR連接的5'UTR)或上述序列的任何組合。為了表達(dá)有義共抑制構(gòu)建體，所有非編碼序列是有義序列，為了表達(dá)反義構(gòu)建體，所有非編碼序列是反義序列。為了表達(dá)有義和反義構(gòu)建體，提供有義和反義非編碼序列。圖5描述了幾個(gè)能夠表達(dá)本發(fā)明的dsRNA構(gòu)建體的第一組DNA序列，其非編碼序列描述于下面的表1和2中。圖5中描述的第一組DNA序列包含成對(duì)相關(guān)有義和反義序列，所述相關(guān)有義和反義序列進(jìn)行排列以使例如由第一有義序列表達(dá)的RNA能夠與由第一反義序列表達(dá)的反義RNA形成雙鏈RNA。例如，參考圖5的最上面的載體和說(shuō)明性組合1號(hào)(表1的)，第一組DNA序列包含有義FAD2-1序列、有義FAD3-1序列、反義FAD2-1序列和反義FAD3-1序列。兩個(gè)反義序列相應(yīng)于有義序列以使第一組DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物能夠相互形成雙鏈RNA?？捎瞄g隔區(qū)序列(優(yōu)選促進(jìn)dsRNA分子形成的間隔區(qū)序列)將有義序列與反義序列隔開。此類間隔區(qū)序列的實(shí)例包括Wesley等人，同上和Hamilton等人，PlantJ.,15:737-746(1988)中所示的間隔區(qū)序列。啟動(dòng)子是在植物中具有功能的任何啟動(dòng)子或任何植物啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子的非限定性實(shí)例描述于詳述的部分A中。使用多種DNA操作技術(shù)將第一組DNA序列以有義或反義方向插入表達(dá)構(gòu)建體。如果DNA序列中存在方便的限制性位點(diǎn)，則可通過(guò)用限制性核酸內(nèi)切酶消化它們，然后將它們連接入已在一個(gè)或多個(gè)可獲得的克隆位點(diǎn)上被消化的構(gòu)建體來(lái)將它們插入表達(dá)構(gòu)建體。如果DNA序列中沒有可獲得的方便限制性位點(diǎn)，則以多種方法改造構(gòu)建體或DM序列的DNA以幫助DNA序列克隆入構(gòu)建體。改造DNA的方法的實(shí)例包括通過(guò)PCR、合成的連接體或接頭連接(adapterligation)、體外定點(diǎn)誘變、突出的5'或3'末端的填充或短截(cuttingback)等。這些和其他操作DNA的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例33A.反義構(gòu)建體現(xiàn)參考圖7,通過(guò)PCR擴(kuò)增大豆FATB-2非編碼序列(SEQIDNO:44-47)、FATB-1非編碼序列(SEQIDNO:29-37)和FAD2-1非編碼序列(SEQIDNO:1和5-6)，從而產(chǎn)生在兩端包含通過(guò)重新進(jìn)行基因工程改造產(chǎn)生的限制性位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。以有義和反義方向?qū)CR產(chǎn)物直接克隆入包含大豆7Sct，啟動(dòng)子和tml3'終止序列的栽體。然后用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體，并將其連接入pM0N80612(包含受FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列調(diào)控的CP4EPSPS基因的載體)。所得的基因表達(dá)構(gòu)建體描述于圖7的最下面的構(gòu)建體中，其用于使用本文描述的方法進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。3B.體內(nèi)裝配本發(fā)明的一個(gè)方面包括DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體在植物中裝配入植物染色體上的能夠形成雙鏈RM的重組轉(zhuǎn)錄單元。此類構(gòu)建體的裝配和用于體內(nèi)裝配用于基因抑制的重組轉(zhuǎn)錄單元的方法描述于國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2005/00681，通過(guò)引用方式將其全文合并入本文。pMON95829是用于體內(nèi)裝配的具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件(即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB))的T-DNA片段的構(gòu)建體。第一T-DNA包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少100個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-laUTR的42個(gè)連續(xù)核苷酸，之后是FATB-1A葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū))有效連接的大豆7Scc'啟動(dòng)子以及與增強(qiáng)的FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件即右邊界DM(RB)和左邊界DNA(LB)。在相同的載體上，在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DM片段中的是與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少100個(gè)連續(xù)核香酸且連接至FATB-la5'UTR的42個(gè)連續(xù)核苷酸，之后是FATB-1A葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū))有效連接的H63'終止序列。使用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化。pMON97595是用于體內(nèi)裝配的具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件(即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB))的T-DNA片段的構(gòu)建體。第一T-DNA片段包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la5'UTR的42個(gè)連續(xù)核苷酸，之后是FATB-la葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū))有效連接的7Sot'啟動(dòng)子以及與增強(qiáng)的FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB)。在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DNA片段中的是與大豆FAD2-1A內(nèi)含子l(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la5'UTR的42個(gè)連續(xù)核苷酸，之后是FATB-1ACTP編碼區(qū))有效連接的H63'終止序列。使用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化。pMON97581是用于體內(nèi)裝配的具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件(即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB))的T-DNA片段的構(gòu)建體。第一T-DNA片段包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū))有效連接的7Soc'啟動(dòng)子以及與增強(qiáng)的FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件即右邊界DM(RB)和左邊界DNA(LB)。在相同的載體上，在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DNA片段中的是與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-laCTP編碼區(qū))有效連接的H63'終止序列。使用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化。pMON97596是用于體內(nèi)裝配的具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件(即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB))的T-DM片段的構(gòu)建體。第一T-DNA片段包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū)的5，180bp)有效連接的7Soc'啟動(dòng)子以及與增強(qiáng)的FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB)。在相同的栽體上，在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DNA片段中的是與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-laCTP編碼區(qū)的5，180bp)有效連接的H63'終止序列。使用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化。pMON97597是用于體內(nèi)裝配的具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件(即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB))的T-DNA片段的構(gòu)建體。第一T-DNA片段包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū)的5，120bp)有效連接的7Sa'啟動(dòng)子以及與增強(qiáng)的FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB)。在相同的載體上，在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DNA片段中的是與大豆FAD^IA內(nèi)舍子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少320個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-laCTP編碼區(qū)的5，120bp)有效連接的H63'終止序列。4吏用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化。pM0N97598是用于體內(nèi)裝配的具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件(即右邊界DM(RB)和左邊界DNA(LB))的T-DNA片段的構(gòu)建體。第一T-DNA片段包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少340個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽("CTP")編碼區(qū))有效連接的7Soc'啟動(dòng)子以及與增強(qiáng)的FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DM邊界元件即右邊界DM(RB)和左邊界DNA(LB)。在相同的載體上，在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DNA片段中的是與大豆FAD2-IA內(nèi)含子I(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少340個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-laCTP編碼區(qū))有效連接的H63'終止序列。使用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化。當(dāng)將上述構(gòu)建體(即pM0N95829、pMON97595、pMON97581、pM0N97597、pM0N97598)中的任一個(gè)構(gòu)建體的兩個(gè)T-DNA片段以RB至RB方向插入宿主生物的染色體的單個(gè)基因座時(shí)，這些裝配的轉(zhuǎn)錄單元具有與有義和反義方向的大豆FAD2-1A內(nèi)含子1和FATB-laDNA片段有效連接的7Sa，啟動(dòng)子。當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，有效連接的有義和反義方向的RNA序列能夠形成有效地用于抑制FAD2-1A和FATB的雙鏈RNA。實(shí)施例4植物轉(zhuǎn)化和分析通過(guò)之前描述的方法(包括McCabe等人，Bio/Technology，6:923-926(1988)的方法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)將實(shí)施例2和3的構(gòu)建體穩(wěn)定地導(dǎo)入大豆(例如，Asgrow品種A4922或Asgrow品種A3244或Asgrow品種A3525)。通過(guò)在包含選擇試劑或除草劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化的大豆植物。當(dāng)使用賦予對(duì)草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因時(shí)，除草劑可以是草甘膦。使用氣相色鐠分析來(lái)自用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成。對(duì)于一些應(yīng)用，檢測(cè)正在發(fā)育的種子中的改變的脂肪酸組成，然而在其他情況下例如對(duì)于油傳的分析、在FAS途徑后期中發(fā)生的脂肪酸的變化的檢測(cè)或?qū)τ谥舅峤M成的少量變化的檢測(cè)，則分析來(lái)自成熟種子的脂肪酸或油。此外，個(gè)體種子油和/或脂肪酸含量的分析，特別地在分離的Rl代種子群體中檢測(cè)油的變化是希望的。如本文所使用的，RO代表示由本文描述的轉(zhuǎn)化/再生方案產(chǎn)生的植物，Rl代表示在自交的轉(zhuǎn)基因RO植物上生產(chǎn)的種子。R1植物長(zhǎng)自R1種子。確定用實(shí)施例3的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成。使用組織勻漿器(ProScientific)單獨(dú)地研磨各個(gè)轉(zhuǎn)基因和對(duì)照大豆品系的1至IO粒種子以用于油的提取。在1.5ml含有十七烷酸甘油三酯(0.5Qmg/ml)的庚烷中從研磨的大豆種子提取油，進(jìn)行過(guò)夜。通過(guò)加入500n1無(wú)水乙醇中的甲醇鈉使200nl的提取的油的等分衍生成甲酯。使衍生反應(yīng)在50C下進(jìn)行20分鐘。通過(guò)同時(shí)加入500ju110%(w/v)氯化鈉和400lal庚烷終止反應(yīng)。在Hewlett-Packardmodel6890GC(PaloAUo，CA)上通過(guò)氣相色鐠(GC)解析所得的庚烷中提取的脂肪酸甲基酯。GC適配有Supelcowax250柱(30m，0.25mmid,0.25微米的膜厚度)(Supelco，Bellefonte，PA)。注射時(shí)柱溫度是175°C，溫度按照程序以40匸/分鐘從175匸至245X:至175T。注射器和探測(cè)器溫度分別為250t:和270C。實(shí)施例5物轉(zhuǎn)化載體pM0N68537用于將形成內(nèi)含子/3'UTR雙鏈RM的構(gòu)建體導(dǎo)入大豆以抑制A12去飽和酶、A15去飽和酶和FATB基因。栽體pMON68537還可包含厶9去飽和酶(FAB2)和CP4基因。pMON68537栽體經(jīng)設(shè)計(jì)用于植物轉(zhuǎn)化，從而在大豆中抑制FAD2、FAD3和FATB基因并過(guò)表達(dá)A9去飽和酶。特別地，所述構(gòu)建體包含與大豆有義方向的內(nèi)含子和3'UTR(即，F(xiàn)AD2-1A內(nèi)含子#1、FAD3-1A3'UTR、FATB-13'UTR)、形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)的可剪接內(nèi)含子以及大豆反義方向的內(nèi)含子和3'UTR'(即FATB-13'UTR、FAD3-1A3'UTR和FAD2-1A內(nèi)含子井l)的互補(bǔ)序列有效連接的7Soc啟動(dòng)子和驅(qū)動(dòng)A9去飽和酶的大豆FAD2啟動(dòng)子。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌林系A(chǔ)BI(Martinell，美國(guó)專利號(hào)6，384，301)將載體穩(wěn)定地導(dǎo)入大豆(Asgrow品種A4922)。CP4選擇標(biāo)的大豆植物。使用氣相色譜分析來(lái)自用內(nèi)含子/3'UTRdsRMi表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成。Rl混合種子和Rl單個(gè)種子油的組成顯示，與來(lái)自未轉(zhuǎn)化的大豆的種子油相比，來(lái)自轉(zhuǎn)基因大豆品系的種子油中的單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的組成發(fā)生了改變，(參見表3)。例如，對(duì)FAD2的抑制提供了具有增加量的油酸酯化合物的植物；對(duì)FAD3的抑制提供了具有減少的亞麻酸酯化合物的植物；以及對(duì)FATB的抑制提供了具有減少的飽和脂肪酸酯化合物例如棕櫚酸酯和硬脂酸酯的植物。取決于希望的相對(duì)脂肪酸組成對(duì)此類品系進(jìn)行選擇。使用氣相色i普分析來(lái)自用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成。表3.來(lái)自pMON68537事件的Rl單個(gè)種子的脂肪酸組成構(gòu)建體亊件18:118:316:0細(xì)化:2剛ON鄉(xiāng)37GM—A36娜74,924.422,9310,24PMON68537GM一A3630574.84,336.572.9310,23PMON68537GM—A3630574.433鄰5鄰2,8211.81PMON68537GM—A3630573,323鄰6.793,24",48PMON68537GM—A3630572.874.337.063.0811,7剛ON68537A36305訓(xùn)313,5楊5531PMON68537GM—A3530516.529.6113.924,2454,79PMON68537GM—A3630515,679.6613.64《1955,89PMO,537GM—A3630677,453,936.762.478,4PMON68537GM—A3630674,51《386.582.4710.94PMON68537GM_A3630673,214.647.043.0811,04OM—雄3C672J84,46,9712,21PMON68537(3M一A3630671,674.766.94■3,2512.2PMON68537GM—A363Q671.01楊7.643.0512.41PMO,537GM—A3630669724.767.662.9513,75PMON68537GM一A3630617,418,8813.353-8555,63PMON68537GMJ\3630777,223.716,8"J8,5PMON68537GM一A3630776.793.656—76838,75構(gòu)建體亊件網(wǎng)化:3猶18:018:2PMO鵬537GM—A3630771.444'547.23,5812.17PMO,537GM一A36307化838,6213.944.0253.61PMON68537GM一A3630718,81認(rèn)13,273.754,97PMO,537GM一A3630715'689,9714064.55PMON68537GM—A3630715,2810,641穆4.4353,97PMONS8537GM—A3630714,089.3614.394,3156.89PMON68537GIVtA3630978,673.536,092,58,18PMO,537GM—A3630975,433鄰6,72.5310.3PMONS8537GM—A3630971,414,196.922.7413.67PM函8537GM—A3630970,514.146,853.1614.33PMON68537GM一A3630967.515.017.453,1515,69PMON68537GM—A3630966.994.927.153.915.79剛ONS8537GM一A3630920.098.4612-41552.97PMON68537GM—A3630915,159.73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14.143.8154.02PMON68537GM一A36411175210.113.14.0354,36PM。N68537GM—A3641117,029.7113.454.0254.89A3244A324418.297.7913.694.1555,08A3244A324417.548.1913.324.3255.57A3244A324417.138.1313.214.4656.04A3244A324415.479,5613.044.4356,46A3244A324415.178鄰13.794.356.78構(gòu)建體亊件18:118:3咖18:018:2A3244A324415.059.0314.164.0156,8A3244A324413.5110.075,0757.3A3244A324413,499.9113.314.5657.67實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因大豆中的FAD2-1/FATBdsRNAi構(gòu)建體將實(shí)施例3D中描迷的構(gòu)建體pM0N95829用于將形成FAD2-l內(nèi)含子、FATB雙鏈RNA的構(gòu)建體導(dǎo)入大豆以抑制FAD2基因和FATB基因。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌林系A(chǔ)BI(Martinell，美國(guó)專利號(hào)6，384，301)將載體穩(wěn)定地導(dǎo)入大豆(Asgrow品種A4922)。CP4選擇標(biāo)記允許通過(guò)在包含草甘膦除草劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇來(lái)鑒定被轉(zhuǎn)化的大豆植物。隨后，針對(duì)第一T-DNA和第二T-DNA的同時(shí)串聯(lián)插入(即以"右邊界至右邊界"裝配)篩選轉(zhuǎn)化的植物的基因組。使用Southern雜交作圖法進(jìn)行篩選。將在它們的基因組中包含優(yōu)選構(gòu)型的轉(zhuǎn)化的大豆植物轉(zhuǎn)移至溫室中以進(jìn)行種子生產(chǎn)。例如，從用構(gòu)建體pMON95829轉(zhuǎn)化的R04直物摘取葉組織并且進(jìn)行Southern分析。選擇探針和限制性內(nèi)切酶消化以鑒定包含兩個(gè)T-DNA的右邊界-右邊界("RB-RB，，)裝配的事件。通常，大約25%的所有轉(zhuǎn)化體具有正確裝配的RB-RBT-DNA。使用實(shí)施例4中描述的氣相色譜分析來(lái)自用pMON95829構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成，從而鑒定從種子提取的脂肪酸化合物的甲酯。首先，收獲從用構(gòu)建體pM0N95829轉(zhuǎn)化的大豆植物釆集的6粒Rl種子，確定各單個(gè)種子的脂肪酸組成。由于各事件的Rl植物對(duì)于轉(zhuǎn)基因發(fā)生分離，因此產(chǎn)生具有常規(guī)大豆組成的種子以及改變的形式的種子。將陽(yáng)性種子混合在一起，對(duì)各事件計(jì)算平均數(shù)?；旌系年?yáng)性平均值表明，與來(lái)自非轉(zhuǎn)化的大豆的種子油相比，來(lái)自轉(zhuǎn)基因大豆品系的種子油中的單不飽和和多不飽和脂肪酸的組成發(fā)生改變(參見表4)。例如，對(duì)FAD2的抑制提供了具有增加量的油酸酯化合物的植物，對(duì)FATB的抑制提供了具有減少的飽和脂肪酸酯化合物例如棕櫚酸酯和硬脂酸酯的植物。表4來(lái)自pM0N95829事件的Rl單個(gè)種子的脂肪酸組成。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>實(shí)施例7pM0N93505是用于體內(nèi)裝配的構(gòu)建體，其具有兩個(gè)各自側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DM邊界元件(即右邊界DNA(RB)和左邊界DM(LB))的T-DNA片段。第一T-DNA片段包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)(其從3'末端減少100個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-la3，UTR,之后是FATB-la5，UTR)有效連接的7Sa'啟動(dòng)子，與油菜油菜籽蛋白啟動(dòng)子和油菜油菜籽蛋白終止序列有效連接的金鳳花(C.;^7c力erW則)KASIV基因(SEQIDNO:39)、與大豆7Sa啟動(dòng)子和nos3，終止序列有效連接的蓖麻(Ricinuscommunis)A9去飽和酶基因(美國(guó)專利申請(qǐng)2003/00229918Al)以及與FMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的C/V^P57V基因，其整體側(cè)翼連接農(nóng)桿菌T-DNA邊界元件即右邊界DNA(RB)和左邊界DNA(LB)。在相同的載體上，在側(cè)翼連接另一對(duì)RB和LB的第二T-DNA片段中的是與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDN0:1)(其從3'末端減少100個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FATB-1A3，UTR，之后是FATB-la5，UTR)有效連接的H63'終止序列。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌抹系A(chǔ)BI(Martinell，美國(guó)專利號(hào)6,384,301)將構(gòu)建體pMON93505穩(wěn)定地導(dǎo)入大豆(Asgrow品種A4922)。CP4選擇的大豆植物。隨后，針對(duì)第一T-DNA和第二T-DNA的同時(shí)串聯(lián)插入(即以"右邊界至右邊界"裝配)篩選轉(zhuǎn)化的植物的基因組。使用Southern雜交作圖法進(jìn)行篩選。將在它們的基因組中包含優(yōu)選構(gòu)型的轉(zhuǎn)化的大豆植物轉(zhuǎn)移至溫室中以進(jìn)行種子生產(chǎn)。例如，從用構(gòu)建體pMON93505轉(zhuǎn)化的R。植物釆集葉組織并且進(jìn)行Southern分析。選擇探針和限制性內(nèi)切酶消化以鑒定包含兩個(gè)T-DM的右邊界-右邊界("RB-RB")裝配的事件。通常，大約25%的所有轉(zhuǎn)化體具有正確裝配的RB-RBT-DNA。使用實(shí)施例4中描述的氣相色譜分析來(lái)自用pMON93505構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成，從而鑒定從種子提取的脂肪酸化合物的曱酯。首先，收獲從用構(gòu)建體pM0N93505轉(zhuǎn)化的大豆植物采集的6粒Ri種子，確定各單個(gè)種子的脂肪酸組成。由于各事件的Rl植物對(duì)于轉(zhuǎn)基因發(fā)生分離，因此產(chǎn)生具有常規(guī)大豆組成的種子以及改變的形式的種子。將陽(yáng)性種子混合在一起，計(jì)算各事件的平均數(shù)?；旌系年?yáng)性平均值表明，與來(lái)自非轉(zhuǎn)化的大豆的種子油相比，來(lái)自轉(zhuǎn)基因大豆品系的種子油中的單不飽和和多不飽和脂肪酸的組成發(fā)生改變(參見表10)。例如，對(duì)FAD2的抑制提供了具有增加量的油酸酯化合物的植物，對(duì)FAD3的抑制提供了具有減少的亞麻酸酯化合物的植物，以及對(duì)FATB的抑制提供了具有減少的飽和脂肪酸酯化合物例如棕櫚酸酯和硬脂酸酯的植物。表5.來(lái)自pMON93505事件的Rl單個(gè)種子的脂肪酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實(shí)施例8具有改變的脂肪酸組成的轉(zhuǎn)基因大豆pMON97563包含與大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:l)有效連接的7Sct'啟動(dòng)子，所述大豆FAD2-1A內(nèi)含子1從3'末端減少100個(gè)連續(xù)核苷酸且連接至FAD3-1A5，UTR，之后是與FAD3-1B5'UTR連接的FAD3-1A3，UTR,之后是與FAD3-1C5，UTR連接的FAD3-1B3，UTR，之后是FAD3-1C3，UTR，之后FATB-laCTP編碼區(qū)，之后與來(lái)自FAD3-1A內(nèi)含子4的70個(gè)核苷酸(與反義方向的FATB-2aCTP編碼區(qū)有效連接的)有效連接的FATB-2aCTP編碼區(qū)，之后是與反義方向的FAD3-1C3'UTR連接的反義方向的FATB-laCTP編碼區(qū)，之后是與反義方向的FAD3-1B3'UTR連接的反義方向的FAD3-1C5'UTR，之后是與以反義方向排列的FAD3-1A3'UTR連接的以反義方向排列的FAD3-1B5'UTR,之后是反義方向的FAD3-1A5'UTR，之后是與H63'多腺苷酸化片段有效連接的從3'末端減少400個(gè)連續(xù)核苷酸的且反義方向的大豆FAD2-1A內(nèi)含子1(SEQIDNO:1)，所述多腺苷酸化片段具有與eFMV啟動(dòng)子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93'終止序列有效連接的CP4EPSPS基因，在相同的DNA分子上其整體側(cè)翼連接RB和LB。使用本文描述的方法將所得的基因表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物。使用實(shí)施例4中描述的氣相色譜確定來(lái)自用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系的種子的脂肪酸組成。表26提供了代表性種子的組成。18:3的水平減少至大約1%。表6.來(lái)自pMON97563事件的Rl單個(gè)種子的脂肪酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>實(shí)施例9中油酸轉(zhuǎn)基因大豆與低亞麻酸大豆的雜交將具有在其油中具有中油酸水平的種子的品系的大豆植物與來(lái)自具有正常油酸水平但具有大約2.8%的亞麻酸(18:3)的品系的植物雜交。該雜交導(dǎo)致產(chǎn)生具有組合特性(中油酸和低亞麻酸)的油的大豆品系。簡(jiǎn)而言之，如下所述進(jìn)行植物育種。一個(gè)親本系(轉(zhuǎn)基因大豆品系，標(biāo)記事件GM-A22234)在染色體中包含質(zhì)粒pM畫8504。pM0固504是具有與有義方向的FAD2-1A內(nèi)含子#1(SEQIDNO:2;PCT申請(qǐng)WO2001014538)有效連接的7S啟動(dòng)子(以部分抑制內(nèi)源性FAD2基因)以及CP4選擇標(biāo)記基因的2T-DNA構(gòu)建體。從該品系的種子提取的油包含大約65%的油酸，比常規(guī)大豆油高20%(參見表25)。另一個(gè)親本是，與在正常大豆油中發(fā)現(xiàn)的常規(guī)8-9°/。的亞麻酸(參見表25)相比，在其種子中具有按總脂肪酸的重量計(jì)算大約3%的亞麻酸含量的非轉(zhuǎn)基因品種6p248-5(C1640品系)。亞麻酸的減少由/<9^-^-//*<2￡^-^-雙突變體引起的。(參見Wilcox，J.R.tJ.F.Cavins，InheritanceoflowlinolenicacidcontentoftheseedofamutantofGlycinemax.,TheoreticalandAppliedGenetics7174-78,1985)。將轉(zhuǎn)基因品系GM-A22234(用作雌性)和突變品系6p248-5(用作雄性)的植物雜交。產(chǎn)生30粒F1種子，將其種植，從而產(chǎn)生2.31bs的自交F2種子。通過(guò)種子芯片的單個(gè)種子的脂肪酸曱基酯(FAME)分析從200粒F2種子鑒定出推定的三純合型種子(triplehomozygousseed)。鑒定了27粒具有大約60%18:1、大約20%18:2和大約2-3%18:3的種子，種植所述種子以產(chǎn)生自交的F3種子。關(guān)于標(biāo)記分析，收集F2葉組織樣品，將關(guān)于FAD3突變等位基因的已建立的分子標(biāo)記用于鑒定雙陽(yáng)性植物(具有FAD3-1B和FAD3-1C突變的植物)。靶向三個(gè)基因型以從該實(shí)驗(yàn)回收1)尸aW-^-//aW"/c-雙純合型突變體；2)對(duì)于單獨(dú)的/aW-k-f位基因的單純合型植物；和3)對(duì)于單獨(dú)的尸aW-""^位基因的單純合型植物。以單林植物的方式收獲F2植物，分析10個(gè)F3種子子樣品。從27粒具有大約60%18:1(油酸)、大約20%18:2(亞油酸)和大約2-3%18:3(亞麻酸)的種子中，5林植物被鑒定為推定的雙FAD3突變體，將其混合在一起用于進(jìn)一步的生長(zhǎng)。表25概述了來(lái)自120林F2植物的F3種子組成的數(shù)據(jù)。表7.中油酸表型/fad3突變stack-F3種子的脂肪酸組成脂肪酸，相對(duì)摩爾°/。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>/^^7-M-,/a^J-h-,中油酸三聯(lián)品系(GM—AA22234)具有1.9%18:3亞麻酸和74.3°/。的油酸。尸s^-M"^尸acrj-7c-突變體與轉(zhuǎn)基因中油酸(GM-AA22234)基因座的組合導(dǎo)致與各自親本品系相比，亞麻酸的進(jìn)一步減少和油酸的進(jìn)一步增加。為了估計(jì)三尸fldJ-76-、尸fl^-k-、中油酸(GM-AA""々)三聯(lián)品系的田間效應(yīng),將breedingstackentries以groupblockdesign種植，在區(qū)組中對(duì)stacks和親本對(duì)照分組和隨機(jī)化，然后分析種子樣品。使用單種子FAME用F4田間生長(zhǎng)的種子產(chǎn)生fad3-lb-、fad3-lc-、中油酸(GM—AA22234)三聯(lián)stacks的脂肪酸鐠。F4脂肪酸譜顯示大約68%18:1、13%總飽和脂肪酸、16%18:2和2.3%18:3。油和蛋白質(zhì)水平與親本品系相似。實(shí)施例IO中油酸、低飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因大豆與低亞麻酸大豆的雜交將具有在其油中具有中油酸和低飽和脂肪酸水平的種子的品系的大豆植物與來(lái)自具有正常油酸和飽和脂肪酸水平但大約2.8%的亞麻酸(18:3)的品系的植物雜交。該雜交導(dǎo)致產(chǎn)生具有組合特征(中油酸、低飽和脂肪酸和低亞麻酸脂肪酸水平)的油的大豆品系。簡(jiǎn)而言之，如下所述進(jìn)行植物育種。一個(gè)親本品系是具有用于部分抑制內(nèi)源性基因FAD2-1和FATB的重組DNA和使植物耐受草甘膦的CP4選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因大豆品系。從該品系的種子提取的油包含大約55-85%的油酸，常規(guī)大豆油的為20%。其還包含低于8%的飽和脂肪酸(16:0+18:0),比常規(guī)大豆油的14-16%低。另一個(gè)親本系是與在正常大豆油中發(fā)現(xiàn)的常規(guī)8-9%的亞麻酸相比，在其種子中具有大約3%的亞麻酸水平的非轉(zhuǎn)基因品種6p248-5(C1640品系)。亞麻酸的減少由尸<2^^-^-//"<^>^-雙突變體引起。(參見Wilcox，J.R.和J.F.Cavins，InheritanceoflowlinolenicacidcontentoftheseedofamutantofGlycinemax"TheoreticalandAppliedGenetics71:74-78，1985,)。將轉(zhuǎn)基因中-高油酸/低飽和脂肪酸品系的植物與來(lái)自突變品系6p248-5的植物雜交。產(chǎn)生Fl種子，將其種植以產(chǎn)生自交的F2種子。通過(guò)種子芯片的單粒種子的脂肪酸甲基酯(FAME)分析從F2種子鑒定推定的三純合型種子。鑒定具有組合的油性狀的種子，將其進(jìn)行種植以產(chǎn)生自交的F3種子。對(duì)于標(biāo)記分析，收集F2葉組織樣品，將關(guān)于FAD3突變等位基因的已建立的分子標(biāo)記用于鑒定雙陽(yáng)性植物(具有兩個(gè)FAD3缺失的植物)。選擇對(duì)于轉(zhuǎn)基因座以及兩個(gè)FAD3突變表現(xiàn)出純合子性的F3種子批次，并將其用于品系建立。為了評(píng)價(jià)尸a(/J-W-、尸a^-Jc-、中油酸低飽和脂肪酸品系的田間效應(yīng)，將breedingstackentries以groupblockdesign種植，在區(qū)組中對(duì)stacks和親本對(duì)照分組和隨機(jī)化，然后分析種子樣品。使用單種子FAME用F4田間生長(zhǎng)的種子確定fflcTJ-"-、AdJ-Jc-、中油酸/低飽和脂肪酸三聯(lián)stack的脂肪酸譜。F4脂肪酸譜顯示大約55-85%的18:1、低于8%的飽和脂肪酸和2-3%的18:3。油和蛋白質(zhì)水平與親本品系相似。實(shí)施例11FAD3-1b上的多態(tài)性的用途為了實(shí)施本發(fā)明的方法，可將與大豆FAD3-1B基因相關(guān)的多態(tài)性用于鑒定與某些低亞麻酸表型相關(guān)的大豆基因組區(qū)域的存在。在所有品系當(dāng)中，在2683bp的全長(zhǎng)序列中檢測(cè)到相應(yīng)于SEQIDNO:61的位點(diǎn)2021的位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性(表3)，且該多態(tài)性與低亞麻酸表型相關(guān)。低亞麻酸品系6P248、T27111、T27190、T26767和T26830在該位點(diǎn)攜帶"C"等位基因，而所有其他品系攜帶"T"。因此，"C"等位基因的存在可用于鑒定其中使用來(lái)源于6P248、T27111、T27190、T26767和T26830的低亞麻酸種質(zhì)的雜種中低亞麻酸大豆基因組區(qū)域的存在。其他低亞麻酸品系例如A5、Soyola和N98-"45在該基因座上攜帶野生型等位基因，這表明一個(gè)或多個(gè)其他基因座促成了A5、Soyola和N98-4445品系中的低亞麻酸表型。表8.FAD3-1B基因座上的多態(tài)性品系SEQOrigseqc6P248TT27111T)T27190TT26767TT26咖TA5CC1640CSoyolaCN98"4445CA2247AG1701CAG1902CcAG2703cAG3201cAG3302cAG3702c雄謂2J0CcAJB2302raCcCSR2533cCSR2622NcCSR3922Nc,19-51cDKB23-95cWP25920c實(shí)施例12FAD3-1C基因中的多態(tài)性的鑒定為了實(shí)施本發(fā)明的方法，將與大豆FAD3-1C基因相關(guān)的多態(tài)性FAD3-1C上鑒定了與某些低亞麻酸表型相關(guān)的4個(gè)SNP和1個(gè)indel(插入/缺失)(表4)。相應(yīng)于SEQIDNO:62的位點(diǎn)687、2316、3743的SNP和SEQIDNO:62的位點(diǎn)1129上的indel與低亞麻酸表型相關(guān)。低亞麻酸品系Soyola和N98-4445在位點(diǎn)687和1129上攜帶與所有其他品系不同的等位基因。將不能使用某些FAD3-1C基因座特異性引物擴(kuò)增突變品系6P248、T27111、T27190、T26767、T26830和A5，因?yàn)樵谶@些品系中的FAD3-1C基因座上存在大的缺失。這些區(qū)域不能被擴(kuò)增，配以適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照反應(yīng)(即，使用包含完整的FAD3-1C基因的大豆基因組DNA和來(lái)自缺失區(qū)域的FAD3-1C引物以及使用針對(duì)其他非FAD3-1C基因的引物和來(lái)自FAD3-1C缺失的大豆基因組DNA)，用于診斷FAD3-1C的缺失。表9.FAD3-1C基因座上的多態(tài)性_序列位點(diǎn)6871129120323163292336037436P248NANANAT27111NANA隨T27柳NANANANANANA隨T26830NAMANAN/ANANATC1,T*ASoyol3C丁ATCAA,-4445CTAA2247TATAG1701丁*AGT*AG柳2AT由AG2402TAGAG2703TAAG3201TGAG3302TAAG3702TAAJB2102J0CT*AAJB2302KOCT*■CSR2533T*ACSR2622NT#GCSR3922NTADKB19-51TADKB23-95T*AW25鄉(xiāng)#ANote:l',NAmeansnoarnp朋caticm注釋1.NA表示沒有擴(kuò)增。實(shí)施例13.大豆FAD3-1C啟動(dòng)子多態(tài)性的鑒定為了實(shí)施本發(fā)明的方法，將與大豆FAD3-1C啟動(dòng)子相關(guān)的多態(tài)性用于鑒定與某些低亞麻酸表型相關(guān)的大豆基因組區(qū)域的存在。如表5中所指出的，低亞麻酸品系Soyola和N98-4445在所有7個(gè)位置上攜帶與其他野生型品系不同的等位基因。這些多態(tài)性的存在可用于在與野生型種質(zhì)的雜種中鑒定Soyola或N98-4445種質(zhì)的存在。表IO.FAD3-1C啟動(dòng)子區(qū)域上的多態(tài)性位點(diǎn)3343643肪387393729747SoyolaGCTACGC,-4445GCTACGC野生型(16品系)AGGTTTT在本公開內(nèi)容的教導(dǎo)下，可制備和實(shí)行本文公開的和所要求保護(hù)的所有組合物和/或方法而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。盡管借助優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然的是，可對(duì)組合物和/或方法和本文描述的方法的步驟中或步驟的順序進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更特別地，將明顯的是，化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑可用于替代本文描述的試劑，而同時(shí)獲得相同的或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的所有此類相圍和概念之內(nèi)。本說(shuō)明書中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)通過(guò)引用合并入本文，就如同將每一個(gè)別單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)囟ㄇ覇为?dú)地被標(biāo)識(shí)為通過(guò)引用合并入本文。權(quán)利要求1.產(chǎn)生大豆植物的方法，所述大豆植物包含總種子脂肪酸的低于按重量計(jì)算大約6％的亞麻酸含量和總種子脂肪酸的按重量計(jì)算大約55％至大約80％的油酸含量，該方法包括步驟a)產(chǎn)生一種或多種包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物；b)獲得至少一粒來(lái)自步驟(a)中獲得的所述大豆植物的種子；c)對(duì)于步驟(b)的所述種子，確定按重量計(jì)算的亞麻酸和油酸占總種子脂肪酸含量的百分?jǐn)?shù)；和d)鑒定產(chǎn)生具有如下種子脂肪酸組成的種子的大豆植物，所述種子脂肪酸組成包含總種子脂肪酸的低于按重量計(jì)算大約6％的亞麻酸含量和總種子脂肪酸的按重量計(jì)算大約55％至80％的油酸含量。2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)中產(chǎn)生的所述大豆植物在至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中包含至少兩個(gè)功能損失性突變。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述內(nèi)源性大豆FAD3基因是FAD3-1B和FAD3-1C。4.權(quán)利要求2的方法，其中步驟3中鑒定的所述大豆植物包含總種子脂肪酸的低于按重量計(jì)算大約3%的亞麻酸含量和總種子脂肪酸的按重量計(jì)算大約55%至大約80%的油酸含量。5.權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)i)將包含所述轉(zhuǎn)基因的第一大豆親本品系與包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的第二大豆親本品系雜交以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl大豆植物；和ii)使來(lái)自(i)的Fl后代植物自交以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2大豆植物，從而荻得包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變這兩者的大豆植物在步驟(a)中產(chǎn)生所述大豆植物。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二大豆親本品系在至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中包含至少兩個(gè)功能損失性突變。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述內(nèi)源性大豆FAD3基因是FAD3-1B和FAD3-1C。8.權(quán)利要求5的方法，其中在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)Fl植物經(jīng)歷至少一種允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因和對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl植物的DNA分析技術(shù)來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因和對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的所述Fl大豆植物。9.權(quán)利要求5的方法，其中在步驟(ii)中通過(guò)將多個(gè)F2植物經(jīng)歷至少一種允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的和對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2植物的DNA分析技術(shù)來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的和對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的所述F2大豆植物。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括一種或多種選自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD分析的技術(shù)。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述DM分析技術(shù)包括一種或多種選自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD分析的技術(shù)。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDN0:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、SEQIDNO:62的FAD3-1C基因中的缺失的檢測(cè)或大豆FAD3-1C啟動(dòng)子序列中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334上的鳥噪呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鳥嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。13.權(quán)利要求9的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、SEQIDN0:62的FAD3-1C基因中的缺失的檢測(cè)或大豆FAD3-1C啟動(dòng)子序列中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334上的鳥噪呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺噪呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鳥嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一個(gè)單核香酸多態(tài)性的檢測(cè)。14.權(quán)利要求8的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括所述大豆FAD3-1B基因中的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，所述單核苷酸多態(tài)性包括FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的胸腺嘧啶殘基對(duì)胞嘧啶殘基的置換。15.權(quán)利要求9的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括所述大豆FAD3-1B基因中的突變的檢測(cè)，所述突變包括FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的胸腺嘧啶殘基對(duì)胞嘧啶殘基的置換。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因。17.權(quán)利要求5的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因且其中在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)F1植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的所述F1大豆植物。18.權(quán)利要求5的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因且其中在步驟(ii)中通過(guò)將所述多個(gè)F2植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得就對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的F2大豆植物而富集的多個(gè)F2植物。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述除草劑是草甘膦。20.權(quán)利要求16的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含位于被整合入所述植物的染色體中的pMON68504、pCGN5469、pCGN5471或pCGN5485的T-DNA邊界序列之間的序列。21.權(quán)利要求l的方法，在步驟(a)中通過(guò)a)用減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物或大豆植物細(xì)胞，以獲得具有FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變、對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的R。大豆植物；b)將來(lái)自步驟(i)的所述R。后代植物自交以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的Rl大豆植物，從而獲得包含減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物來(lái)產(chǎn)生所述大豆植物。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性狀的序列。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述除草劑是草甘膦。24.權(quán)利要求5的方法，其還包括將來(lái)自(ii)的對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的所述F2后代植物自交以獲得F3大豆植物的步驟iii)。25.權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)脂質(zhì)分析技術(shù)在步驟(c)中確定按重量計(jì)算的亞麻酸和油酸占總種子脂肪酸含量的所述百分?jǐn)?shù)。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述脂質(zhì)分析技術(shù)包括一種或多種選自氣相色譜/火焰離子化檢測(cè)、氣相色譜/質(zhì)譜、薄層層析/火焰離子化檢測(cè)、液相色譜/質(zhì)鐠、液相色譜/電噴霧電離-質(zhì)鐠和液相色譜/電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)。27.通過(guò)權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的大豆植物。28.權(quán)利要求27的大豆植物的植物部分。29.權(quán)利要求28的植物部分，其中所述植物部分是花粉、胚珠、分生組織、葉、莖、根或細(xì)胞。30.來(lái)自權(quán)利要求27的大豆植物的后代大豆植物。31.通過(guò)權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，所述種子具有包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。32.通過(guò)權(quán)利要求4的方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，所迷種子具有包含低于按重量計(jì)算大約3°/。的總種子脂肪酸的亞麻酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。33.獲得具有改變的種子油的脂肪酸組成的大豆植物的方法，該方法包括步驟a)將具有包含低于按重量計(jì)算大約3%的總脂肪酸的亞麻酸含量的種子油的脂肪酸組成的第一大豆親本品系與第二大豆親本品系雜交，所述第二大豆親本品系具有其中至少一種除了亞油酸外的脂肪酸的含量，當(dāng)與商品大豆油的相應(yīng)的脂肪酸含量相比時(shí)，改變至少50%的種子油的脂肪酸組成，所述第二大豆親本品系包含改變至少一種除了亞油酸外的脂肪酸的含量的轉(zhuǎn)基因；和b)獲得展示包含低于按重量計(jì)算3%的總脂肪酸的亞麻酸含量和至少一種除了亞油酸外的脂肪酸的含量的種子油的脂肪酸組成的后代植物，從而獲得具有改變的種子油的脂肪酸組成的大豆植物，當(dāng)與商品大豆油的相應(yīng)脂肪酸含量相比時(shí)，所述除了亞油酸外的脂肪酸的含量改變至少50%。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述除了亞麻酸外的脂肪酸選自月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、十八碳四烯酸、油酸、亞油酸、Y-亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。35.權(quán)利要求24的方法，其中所述除了亞麻酸外的脂肪酸選自月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、十八碳四烯酸、油酸、亞油酸、Y-亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。36.產(chǎn)生大豆植物的方法，所述大豆植物包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8%的飽和脂肪酸含量、按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量，該方法包括步驟a)產(chǎn)生一種或多種包含至少一個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和一^功能損^t生突變的大豆植物；A;、Ab)獲得至少一粒來(lái)自在步驟(a)荻得的所述大豆植物的種子；c)對(duì)于步驟(b)的所述種子，確定按重量計(jì)算的亞麻酸、飽和脂肪酸和油酸占總種子脂肪酸含量的百分?jǐn)?shù)；和d)鑒定產(chǎn)生具有如下種子脂肪酸組成的種子的大豆植物，所述種子脂肪酸組成包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55°/。至80%的總種子脂肪酸的油酸含量。37.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(a)中產(chǎn)生的所述大豆植物包含至少兩個(gè)內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少兩個(gè)功能損失性突變。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述內(nèi)源性大豆FAD3基因是FAD3-1B和FAD3-1C。39.權(quán)利要求38的方法，其中步驟3中鑒定的所迷大豆植物包含低于按重量計(jì)算大約3%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8°/。的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量。40.權(quán)利要求36的方法，其中通過(guò)i)將包含所述轉(zhuǎn)基因的第一大豆植物親本品系與包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的第二大豆親本品系雜交，以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl大豆植物；和ii)使來(lái)自(i)的Fl后代植物自交以獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2大豆植物，從而獲得包含至少一個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和內(nèi)源性FATB基因兩者的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物在步驟(a)中產(chǎn)生所述大豆植物。41.權(quán)利要求40的方法，其中在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)Fl植物經(jīng)歷至少一種DNA分析技術(shù)來(lái)獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是雜合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的所述Fl大豆植物，所述MA分析技術(shù)允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是雜合的Fl植物。42.權(quán)利要求40的方法，其中在步驟(ii)中通過(guò)將多個(gè)F2植物經(jīng)歷至少一種DNA分析技術(shù)來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的所述F2大豆植物，所述DNA分析技術(shù)允許鑒定對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的F2植物。43.權(quán)利要求41的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核普酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、SEQIDN0:62的FAD3-1C基因中的缺失的檢測(cè)或大豆FAD3-1C啟動(dòng)子序列中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334上的鳥嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鳥嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。44.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括FAD3-1C基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位點(diǎn)上的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、SEQIDNO:62的FAD3-1C基因中的缺失的檢測(cè)或大豆FAD3-1C啟動(dòng)子序列中相應(yīng)于SEQIDNO:63的核苷酸334上的鳥噪呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鳥嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。45.權(quán)利要求41的方法，其中所述DM分析技術(shù)包括所述大豆FAD3-1B基因中的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，所述單核苷酸多態(tài)性包括FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核苷酸2021的位點(diǎn)上的胸腺嘧啶殘基對(duì)胞嘧咬殘基的置換。46.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA分析技術(shù)包括所述大豆FAD3-1B基因中的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，所述單核苷酸多態(tài)性包括FAD3-1B基因序列中相應(yīng)于SEQIDNO:61的核普酸2021的位點(diǎn)上的胸腺嘧啶殘基對(duì)胞嘧咬殘基的置換。47.權(quán)利要求36的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因。48.權(quán)利要求40的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因且其中在步驟(i)中通過(guò)將多個(gè)F1植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的所述Fl大豆植物。49.權(quán)利要求40的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因且其中在步驟(ii)中通過(guò)將所述多個(gè)F2植物經(jīng)歷針對(duì)所述轉(zhuǎn)基因的除草劑選擇來(lái)獲得就對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的F2大豆植物而富集的多個(gè)F2植物。50.權(quán)利要求47的方法，其中所述除草劑是草甘膦。51.權(quán)利要求47的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含CP4EPSPS基因。52.權(quán)利要求36的方法，在步驟(a)中通過(guò)a)用至少一個(gè)減少內(nèi)源性大豆FAD2-1基因和內(nèi)源性大豆FATB基因兩者的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化包含內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物或大豆植物細(xì)胞，以獲得具有FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變、對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的R。大豆植物；b)將來(lái)自步驟(i)的所述R。后代植物自交以獲得對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的Rl大豆植物，從而獲得包含所述轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性大豆FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變的大豆植物來(lái)產(chǎn)生所述大豆植物。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因還包括賦予除草劑耐受性狀的序列。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述除草劑是草甘膦。55.權(quán)利要求40的方法，其還包括將來(lái)自(ii)的對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的且對(duì)于FAD3基因中的至少一個(gè)功能損失性突變是純合的所述F2后代植物自交以獲得F3大豆植物的步驟iii)。56.權(quán)利要求36的方法，其中通過(guò)脂質(zhì)分析技術(shù)在步驟(c)中確定按重量計(jì)算的亞麻酸、飽和脂肪酸和油酸占總種子脂肪酸含量的所述百分?jǐn)?shù)。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述脂質(zhì)分析技術(shù)包括一個(gè)或多個(gè)選自氣相色譜/火焰離子化檢測(cè)、氣相色鐠/質(zhì)i瞽、薄層層析/火焰離子化檢測(cè)、液相色鐠/質(zhì)鐠、液相色鐠/電噴霧電離-質(zhì)鐠和液相色語(yǔ)/電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)。58.通過(guò)權(quán)利要求36的方法產(chǎn)生的大豆植物。59.權(quán)利要求58的任一個(gè)的大豆植物的植物部分。60.權(quán)利要求59的植物部分，其中所述植物部分是花粉、胚珠、分生組織、葉、莖、根或細(xì)胞。61.來(lái)自權(quán)利要求58的大豆植物的后代大豆植物。62.通過(guò)權(quán)利要求36的方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，所述種子具有包含低于按重量計(jì)算大約6%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、按重量計(jì)算低于大約8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。63.通過(guò)權(quán)利要求39的方法產(chǎn)生的大豆植物的種子，所述種子具有包含低于按重量計(jì)算大約3%的總種子脂肪酸的亞麻酸含量、低于按重量計(jì)算大約8%的飽和脂肪酸含量和按重量計(jì)算大約55%至大約80%的總種子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸組成。全文摘要公開了用于獲得產(chǎn)生具有低亞麻酸水平和適度增加的油酸水平的種子的大豆植物的方法。還公開了用于產(chǎn)生具有低亞麻酸水平、適度增加的油酸水平和低飽和脂肪酸水平的種子的方法。這些方法使提供中油酸水平的轉(zhuǎn)基因與在賦予低亞麻酸表型的大豆基因中包含突變的大豆種質(zhì)的組合成為必需。這些方法還使提供中油酸水平和低飽和脂肪酸水平的轉(zhuǎn)基因與在賦予低亞麻酸表型的大豆基因中包含突變的大豆種質(zhì)的組合成為必需。還公開了通過(guò)這些方法產(chǎn)生的大豆植物和種子。文檔編號(hào)C12N15/82GK101500403SQ200780016763公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年3月9日優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日發(fā)明者G·E·基斯利,J·J·菲拉提,T·烏爾瑪索夫,T·沃克申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限責(zé)任公司