專利名稱：用于在分析檢測方法中校正樣品基體效應的樣品對照的制作方法
用于在分析檢測方法中校正樣品基體效應的樣品對照
本發(fā)明涉及對標記檢測發(fā)生樣品基體效應的確定方法以及根據(jù)所述方 法的設備操作，所述方法使得在包括應用該標記或類似標記的分析技術中 這些樣品基體效應得以校正。
盡管在醫(yī)療診斷學、病理學、毒理學、流行病學、生物戰(zhàn)、環(huán)境取樣、 法醫(yī)學和諸如比較蛋白質組學和基因表達研究的許多其它領域中具有廣泛 的潛在應用，生物分子諸如蛋白質、肽、寡核苷酸、核酸、脂質、多糖、 激素、神經(jīng)遞質、代謝物等的靈敏準確檢測——定性或定量——已經(jīng)證明 是一個令人困惑的目標。
涉及DNA檢測的具體例子是例如在醫(yī)療診斷學中諸如傳染原如病原 菌和病毒的檢測、先天性和獲得性遺傳病的診斷等等，在法醫(yī)試驗中作為 犯罪調查的一部分、在親子關系糾紛中、在全基因組測序中等等。
盡管純化的生物分析物樣品的鑒定和/或定量有時可以基于分析物本 身的物理化學性質進行，但是能夠鑒定和/或定量非純化樣品中的分析物的 大多數(shù)檢測方法利用了 "探針"，其是具有強親和性的已知分子，并對于 該分析物還優(yōu)選具有高度特異性。在分析物是蛋白質或肽的情況下，這些 確定被稱為配體-結合確定(例如，免疫確定)。DNA的檢測通常利用特異于 革巴DNA的核苷酸序列的雜交。
在這些基于探針的檢測確定中，分析物特異性的探針(或分析物)或直 接或間接用可追蹤的物質標記。通過探針結合分析物的可追蹤物質(下文稱 為"標記")的檢測是試驗樣品中分析物含量的指示。取決于所采用標記的 性質，標記的檢測可利用各種不同的技術加以保證。
一種生物技術分析技術是拉曼光譜確定法。在拉曼光譜確定法中，由 樣品中的分子進行的光的非彈性散射(稱為拉曼散射)被檢測。所得到的拉曼 光譜是樣品中光吸收分子的化學組成和結構上的特征，而拉曼散射的強度 取決于這些分子的濃度。當分子被吸附在粗糙的金屬表面例如金、銀、銅和某些其它金屬的納
米顆粒之上時發(fā)射譜得以增強若干個數(shù)量級——可達1014倍——這一觀測 結果已經(jīng)產(chǎn)生了高度靈敏的表面增強光譜術(例如，表面增強熒光術(SEF) 和表面增強(共振)拉曼光譜術(SE(R)RS))
在表面增強拉曼共振光譜術(SERRS)中，利用了連接于分析物的 "SERRS-活性"物質或染料(當進行適當照射時能夠產(chǎn)生SERRS譜)，并在染 料的共振頻率下操作。
在應用表面增強光譜術中的關鍵步驟是粗糙金屬表面的可再現(xiàn)性產(chǎn)生 以及待檢測的標記有效吸附/結合在該金屬表面上。當粗糙金屬表面由膠體 金屬納米顆粒組成時，最佳的信號增強在它們以可控的方式聚集時得以實 現(xiàn)。通過例如用還原劑諸如檸檬酸鹽還原金屬鹽(例如，硝酸銀)，制備未聚 集的膠體，以形成穩(wěn)定的微晶懸液。然后，該膠體懸液在使用之前即刻進 行聚集。理想地，聚集的膠體在樣品中原位形成，而SE(R)RS譜在之后不 久獲得，以便防止沉淀。
已經(jīng)觀察到，在應用要求在樣品內進行檢測的標記的任何檢測技術中， 樣品基體效應可影響分析結果。樣品基體效應在復雜的介質諸如其中干擾 物質的性質和量通常未知并且不容易控制的生物、礦物和環(huán)境樣品中特別 嚴重，但由于可影響檢測的不同方面的鹽和/或其它成分的存在，樣品基體 效應在通過(半)純化技術得到的樣品中也可以是有關系的。在生物樣品中， 樣品基體效應可以由過量的體液成分例如脂血癥、膽紅素血癥、血紅蛋白 血癥、溶血、脂質、蛋白質、血紅蛋白、免疫球蛋白、激素、藥物、抗原、 變應原、毒素、腫瘤標記、可溶性細胞分子以及核酸造成。在DNA提取物 中，樣品基體效應可以由僅僅主體DNA的存在而導致。這些成分可能增加 或降低測量信號，導致不準確的結果。樣品基體效應可以用例如熒光猝滅 或發(fā)光猝滅加以證明。
表面增強光譜術帶來了額外的復雜性，原因在于樣品基體可以干擾膠 體聚集以及干擾分析物或標記吸附/結合到膠體上。金屬膠體的不同聚集度 產(chǎn)生可變的信號。這些膠體聚集上的變化可以由樣品pH的差異或由誘導導
致聚集體沉淀的過度聚集的離子的存在而導致。樣品基體化合物還可以吸 附到金屬顆粒上，從而與信號待被增強的分子競爭納米顆粒的表面。例如，在中性或生理pH下往往帶正電的許多蛋白質被吸引至顆粒的凈負電荷?？?br> 體特別易于強烈吸附至膠體金顆粒。樣品基體化合物還可能促進標記非特 異性吸附至納米顆粒上。 .
影響檢測的因素的校正是分析化學領域的一般性問題。在該領域中， 消除樣品基體效應的方法包括稀釋、樣品基體的去除(例如，通過將分析物 共價結合至固定的表面并洗去背景而不影響分析物)以及加入標準物并隨 后校正干擾的程度。
對于SE(R)RS方法，基于直接檢測樣品中的樣品基體效應，已經(jīng)研究 出補償樣品基體效應的方法。這些方法包括應用內標，所述內標是預定量 的分子，其比得上待檢測的分子(例如，分析物或標記)，但產(chǎn)生不同的信號。 然而，這些技術受到所述效應是對非同一化合物進行測量從而樣品基體的 光譜發(fā)信號效率和對檢測的干擾可能不同這一事實的限制。
本發(fā)明的一個目標是提供在分析技術中校正樣品基體效應的可選方法 以及根據(jù)所述方法進行操作的系統(tǒng)。本發(fā)明的優(yōu)勢是對樣品中標記檢測的 不利效應被允許確定樣品基體效應的標記對照所降低。
在第一方面，本發(fā)明提供了確定樣品對標記檢測的樣品基體效應的方 法，所述方法包括步驟(a)使預定量的相同標記或不同標記與包含樣品基體 或樣品樣基體的背景樣品接觸；(b)使預定量的相同標記或不同標記與無背 景樣品接觸，所述無背景樣品不含樣品基體或樣品樣基體或能夠干擾所述 標記的檢測的任何其它化合物；(c)檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中 的所述相同或不同標記；和(d)確定在所述背景樣品和所述無背景樣品中所 述相同或不同標記的檢測之間的差異，從而獲得樣品基體效應。在優(yōu)選的 實施方式中，所有預定量是相同的，這使得校正更易于進行，僅包括簡單 的差異。
本發(fā)明的第二方面提供了確定對樣品中的分析物的樣品基體效應的方 法，所述方法包括步驟(a)提供來自含有待檢測的分析物的所述樣品的試驗 樣品、包含樣品基體或樣品樣基體的背景樣品、以及不含樣品基體或樣品 樣基體的無背景樣品；(b)使用標記，檢測和/或定量所述試驗樣品中的分 析物；(c)通過包括下列步驟的方法檢測所述樣品基體效應-使所述背景樣品與預定量的標記接觸，其可以是相同的或不同的標
記，
-使所述無背景樣品與預定量的所述相同的或不同的標記接觸，由此 所述相同的標記被加入到所述背景樣品和無背景樣品中，
-檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述相同或不同的標記， -通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述(相同或不同的) 標記的檢測間的差異而確定所述樣品基體效應；和
(d)用如上所述確定的樣品基體效應校正如步驟(b)中獲得的所述試驗樣品 中的分析物的檢測和/或定量。
在優(yōu)選的實施方式中，所有預定量是相同的，這使得校正更易于進行， 僅包括簡單的差異。
通常，在所述試驗樣品中的分析物的檢測通過能夠結合至所述分析物 的標記的檢測來進行，而所述校正通過采用對于樣品基體效應獲得的值校 正該結合的標記的檢測值來進行。
根據(jù)本發(fā)明的該方面的一個實施方式，背景樣品是其中分析物待檢測 的樣品的一部分。另外或可選地，所述背景樣品包含樣品基體或樣品樣基 體。
在一個實施方式中，擬通過本發(fā)明的方法檢測的分析物選自核酸、蛋 白質、糖類、脂質、化學物質、抗體、微生物和真核細胞。
根據(jù)一個實施方式，使用光學檢測方法，進行本發(fā)明的方法中的檢測 步驟。更具體而言，所述檢測方法是SE(R)RS，而在樣品基體效應的確定 和分析物的檢測和/或定量中所用的標記都是SE(R)RS-活性標記。通常，這 類方法包括額外的步驟，由此，在不同的樣品中的標記檢測之前，所述標 記與SE(R)RS-活性表面接觸。根據(jù)具體的實施方式，SE(R)RS-活性表面是 銀或金納米顆粒的膠體懸浮液、或它們的聚集膠體。
根據(jù)一個實施方式，在包括分析物的檢測和/或定量的方法中，該檢測 和/或定量是采用標記分析物-特異性探針進行的。根據(jù)一個具體實施方式
， 該分析物特異性探針被提供為結合-敏感性標記，即其檢測信號在結合至分 析物之后得到改變的標記。根據(jù)一個實施方式，待檢測的分析物是核苷酸序列，并利用標記分析 物特異性探針，該探針是核苷酸或具有與分析物中的序列互補的序列的核 苷酸。
使用標記分析物特異性探針進行的分析物檢測可以基于結合至所述分 析物的標記分析物特異性探針的直接檢測，或者可以基于所述分析物的競
爭結合。根據(jù)該在后實施方式的具體實施方式
，使用能夠結合至SE(R)RS-
活性表面的分析物特異性探針和標記的替代探針進行所述分析物的檢測，
從而所述分析物與標記的替代探針競爭與分析物特異性探針的結合。
本發(fā)明的又一方面提供了設備或系統(tǒng)，用于補償對樣品中的分析物或 標記的檢測的樣品基體效應。
本發(fā)明提供了確定樣品對標記檢測的樣品基體效應的系統(tǒng)，其包括
(a) 裝置，用于使預定量的所述標記或不同標記與包含樣品基體或樣 品樣基體的背景樣品接觸，
(b) 裝置，用于使預定量的所述標記或所述不同標記與無背景樣品接 觸，所述無背景樣品不含樣品基體或樣品樣基體或能夠干擾所述標記的檢 測的任何其它化合物，
(c) 裝置，用于檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或 所述不同標記，和
(d) 裝置，用于確定在所述背景樣品和所述無背景樣品中所述標記或 所述不同標記的檢測之間的差異，對應于所述樣品基體效應。
本發(fā)明還提供了確定對樣品中分析物檢測的樣品基體效應的系統(tǒng)，其
包括
(a) 裝置，用于提供來自含有待檢測的分析物的所述樣品的試驗樣品、
包含樣品基體或樣品樣基體的背景樣品、以及不含樣品基體或樣品樣基體 的無背景樣品，
(b) 裝置，用于使用標記檢測和/或定量所述試驗樣品中的所述分析物，
(c) 裝置，用于使所述背景樣品與預定量的所述標記或不同標記接觸，
(d) 裝置，用于使所述無背景樣品與預定量的所述標記或所述不同標 記接觸，(e) 裝置，用于檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或 所述不同標記，
(f) 裝置，用于通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記 或所述不同標記的檢測之間的差異，確定所述樣品基體效應，
(g) 裝置，用于應答于確定樣品基體效應的裝置而校正所述試驗樣品 中的所述分析物的檢測和/或定量。
在優(yōu)選的實施方式中，所有預定量是相同的，這使得校正更易于進行， 僅包括簡單的差異。
所述系統(tǒng)可以包括
-選自含有分析物的試驗樣品、背景樣品和無背景樣品的一種或多種 樣品的第一源， 一種或多種標記的第二源，以及任選地，添加劑的第三源，
-裝置，用于提供第一至第三源的樣品、標記和添加劑，以便它們可 以被接觸。
根據(jù)具體實施方式
，第一源(101，圖3)包括分別用于含有分析物的試 驗樣品、背景樣品和無背景樣品的室。用于接觸的裝置可包括用于使含有 分析物的試驗樣品、背景樣品和無背景樣品分別與相關標記接觸的室。
在進一步的具體實施方式
中，第二源(102,圖3)包括用于分析物特異 性標記的室和用于至少一種標記的室。
本發(fā)明還提供了一次性盒，其在確定對樣品中分析物檢測的樣品基體 效應的系統(tǒng)中使用，包括
-選自含有分析物的試驗樣品、背景樣品和無背景樣品的一種或多種 樣品的第一源， 一種或多種標記的第二源，以及任選地，添加劑的第三源， 禾口
-裝置，用于使背景樣品和預定量的相同或不同標記接觸，用于使無 背景樣品和預定量的相同或不同標記接觸，以及用于使試驗樣品和預定量 的相同或不同標記接觸，和
-窗，以允許在試驗樣品、背景樣品和無背景樣品中該相同或不同標記的 檢測。待測試樣品的源可以是PCR反應室。通過下文詳細的描述，連同以例子的方式闡述本發(fā)明原理的附圖，本 發(fā)明的上述和其它特點、特征和優(yōu)勢將變得明顯。該描述僅以例子的方式 給出，而不限制本發(fā)明的范圍。
現(xiàn)參考下列附圖描述本發(fā)明。


圖1是檢測試驗樣品中分析物的本發(fā)明方法的實施方式的示意圖，所 述方法包括通過檢測背景基體和無背景基體中的標記而檢測標記對照，如
應用于試驗樣品中DNA的SE(R)RS檢測。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式在無背景樣品(l)中的SERRS-活性 標記和在增強SERRS效應的樣品基體(2)中的SERRS-活性標記的SERRS 譜的例子。這兩個光譜的比較給出了可能干擾試驗樣品中分析物檢測的樣 品基體效應方面的信息。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的實施方式的系統(tǒng)的圖示。
本發(fā)明就具體實施方式
并參考某些附圖進行了描述，但本發(fā)明不限于 此，而是由權利要求書限定。權利要求書中的任何參考標記不被解釋為限 制范圍。所描述的附圖僅僅是示例性的，并且是非限制性的。在附圖中， 一些元件的大小可以被放大，并且為了說明的目的而不按比例繪制。在術 語"包括"被用于本說明書和權利要求書的情況下，它不排除其它元件或 步驟。在提到單數(shù)名詞使用不定冠詞或定冠詞的情況下，例如"一(a)"或 "一(an)"、"該(the)"，這包括多個該名詞，除非特別描述其它意思。
而且，說明書和權利要求書的書術語第一、第二、第三等等被用來區(qū) 分相似元件，并不必須被用來描述連續(xù)順序或時間順序。應當理解，如此 使用的術語在合適的環(huán)境下是可互換的，并且本文所描述的本發(fā)明的實施 方式能夠以不同于本文所描述或闡述的其它次序進行操作。
下列術語或定義只被提供來幫助理解本發(fā)明。這些定義不應當被解釋 成具有比本領域普通技術人員所理解的更小的范圍。
如本文所使用，術語"分析物"是指將在本發(fā)明的方法中檢測和/或量 化的物質。如本文所使用，術語"標記"是指能夠產(chǎn)生可檢測信號的分子或材料。 除非指明，這是指這樣的分子，其未共價連接于探針。標記可被連接于探 針，連接于分析物，或者它可以是單獨的本體，結合于分析物和/或探針。 如本文所使用，"分析物特異性探針"是這樣的探針，其包含特異于待檢 測分析物的結構或序列。這既包括能夠特異性結合分析物的化合物("互補 型靶探針")，也包括至少類似于分析物的特異性部分的化合物("替代型耙 探針")?；パa型靶探針與分析物的結合可以基于任何類型的相互作用，包 括但不限于互補核苷酸序列、抗原/抗體相互作用、配體/受體結合、酶/底 物相互作用等等。替代型靶探針被用在競爭性分析中，其中分析物基于與 替代型探針的競爭進行確定，例如在競爭結合分析物4寺異性探針中。最具 體地，替代型耙探針結合分析物-特異性探針，相比于分析物與分析物-特異 性探針的結合，其結合強度較小。
如本文所使用，"(SE(R)RS-活性)表面"是指能夠增強SE(R)RS-活性 標記的信號的材料。
如本文所使用，"捕獲探針"是指能夠將分子或分子的復合物結合至 基底的分子。分析物-特異性捕獲探針是能夠特異地將分析物結合至基底的 探針。
如本文所使用，"基底"是指這樣的材料，分子或分子復合物可以被 直接或通過捕獲探針的方式結合至其上，并且其可被操作?；椎牡湫屠?子包括但不限于微量滴定板、珠、芯片等。
同樣如本文所使用，術語"樣品"涉及組合物，其包含基體("樣品基 體")和在其中的目標分析物。
術語"試驗樣品"被理解為意指樣品或其一部分，包含基體("樣品基 體")和在其中的目標分析物，對該目標分析物進行分析物檢測。
術語"樣品基體"被理解為意指在試驗樣品中存在的、不是分析物的 化合物。
術語"樣品樣基體"被理解為意指與樣品基體具有大致相同的全部組 成、和/或相同理化性質的基體。
術語"樣品基體效應"被理解為意指樣品基體對本發(fā)明的方法中比較 或替代標記的檢測的效應，因而影響分析物的檢測。術語"背景樣品"被理解為意指用于確定樣品基體效應的組合物，并 包含樣品基體或樣品樣基體。在樣品本身被用于確定樣品基體效應的情況 下，它被稱為"原始背景樣品"。當原始背景樣品具有與試驗樣品相同的 組成時，它也含有分析物?？蛇x地，原始背景樣品是包含樣品基體或樣品 樣基體而不含有分析物的組合物，分析物己任選地加入到其中。
術語"無背景樣品"被理解為意指不包含樣品基體、樣品樣基體、分 析物、或能夠干擾標記檢測的任何其它化合物的組合物。在樣品基體的具 體成分的影響將被確定的情況下，無背景樣品是指包含基體的組合物，所 述基體除了這些具體的成分之外與樣品基體類似。
術語"校正樣品基體效應"被理解為意指()基于樣品基體效應的值(直 接或間接地)調節(jié)通過試驗樣品的測量確定的值。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了使用分析物4寺異性探針以及標記檢測和 /或定量樣品中的分析物的分析技術，由此樣品基體對所述檢測的影響被確 定，允許校正對所述檢測的樣品基體效應。
根據(jù)第一實施方式，本發(fā)明的方法包括步驟
(a) 提供來自含有待檢測分析物的所述樣品的試驗樣品、包含樣品基體 或樣品樣基體的背景樣品以及不含樣品基體或樣品樣基體的無背景樣品
(b) 檢測和/或定量所述試驗樣品中的分析物
(C)通過包括下列步驟的方法檢測所述樣品基體效應
(i) 使所述背景樣品與預定量的標記接觸，
(ii) 使所述無背景樣品與相同預定量的標記接觸，
(iii) 檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記，
(h0通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記的 檢測之間的差異，確定所述樣品基體效應
(d)用在(iv)中確定的樣品基體效應校正步驟(b)的所述試驗樣品中的
分析物的檢測和/或定量。
任選地，步驟(i)至(iii)可以用兩種或更多種不同預定量的標記進行。
根據(jù)一個具體實施方式
，用于樣品基體效應檢測的背景樣品包含樣品 基體，更具體而言是在其中分析物將被檢測的樣品的一部分，從而其組成
與試驗樣品相同。根據(jù)該實施方式，所述方法包括步驟(a) 提供來自包含分析物的樣品的試驗樣品和背景樣品，并進一步提供
無背景樣品；
(b) 檢測和/或定量所述試驗樣品中的分析物
(C)通過包括下列步驟的方法檢測所述樣品基體效應
(i) 使所述背景樣品與預定量的標記接觸，
(ii) 使所述無背景樣品與相同預定量的標記接觸，
(iii) 檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記，
(iv) 通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記的 檢測之間的差異，確定所述樣品基體效應
(d)用在(iv)中確定的樣品基體效應校正步驟(b)的所述試驗樣品中的
分析物的檢測和/或定量。
任選地，步驟(i)至(iii)可以用兩種或更多種不同預定量的標記進行。 根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供對標記檢測的樣品基體效應的確定方法，
所述方法包括步驟
(a) 使預定量的標記、替代標記或不同標記與包含樣品基體或樣品樣基 體的背景樣品接觸，
(b) 使相同預定量的標記、替代標記或不同標記與無背景樣品接觸，所 述無背景樣品不含樣品基體或樣品樣基體或能夠干擾所述標記的檢測的任 何其它化合物，
(C)檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記、替代標記或不 同標記，
(d)確定在所述背景樣品和所述無背景樣品中所述標記、替代標記或不 同標記的檢測之間的差異，所述差異對應于所述樣品基體效應。
該方法提供了在特定背景下對標記檢測的樣品基體效應的測量，其可 用于校正在已知或認為包含相同基體的樣品中檢測和/或定量分析物所獲 得的值。
任選地，步驟(a)至(d)可以用兩種或更多種不同預定量的標記進行。 因此，本發(fā)明提供了方法和工具，由此，樣品基體效應的發(fā)生通過檢 測背景樣品和無背景樣品中的標記得到確定，以及提供了用于根據(jù)本發(fā)明的方法確定樣品基體效應的系統(tǒng)。這些基體效應潛在地干擾在樣品中用該 標記進行的分析物檢測。
本發(fā)明是基于如下觀察樣品基體的成分可影響標記的檢測并且該影 響可通過在樣品基體或樣品樣基體存在下或在無背景樣品中比較該同一標 記或與其類似的標記來加以確定。根據(jù)本發(fā)明的方法，在利用標記的檢測 方法中引入標記對照確保了樣品中分析物的更準確和可靠的檢測和/或定
通過本發(fā)明的方法確定的樣品基體效應的來源是可變的，并將取決于 樣品的特性。其中分析物的檢測考慮根據(jù)本發(fā)明進行的樣品包括來自生物 材料的樣品以及來源于或提取自這類生物材料的組合物。樣品可以是包含 待測分析物的任何制備物。例如，樣品可包括所有或許多機體組織或體液， 例如，但不限于血液(包括血漿和血小板部分)、脊髓液、粘液、痰、唾液、 精液、糞便或尿液或者它們的任何一部分。示例性樣品包括來自全血的材 料、紅細胞、白細胞、血沉棕黃層、毛發(fā)、指甲和角質層材料，拭子，包 括但不限于頰拭子、咽拭子、陰道拭子、尿道拭子、子宮頸拭子、咽拭子、 直腸拭子、損傷拭子、膿腫拭子、鼻咽拭子等，淋巴液、羊水、腦脊液、 腹水、胸腔積液、囊內液、滑液、玻璃體液、房水、囊液、洗眼液、眼吸 液、血漿、血清、肺灌洗液、肺吸液、基體內任何組織的活組織檢査材料。 普通技術人員將理解，從上述示例性生物樣品的任一種獲得的裂解物、提 取物或材料也被考慮作為樣品。組織培養(yǎng)細胞，包括移植的材料、原代細 胞、次生細胞系等以及從任何細胞、組織或器官獲得的裂解物、提取物、 上清液或材料也在如本文所使用的術語生物樣品的含義之內。在使用本發(fā) 明的方法進行分析物檢測中，也考慮包含微生物和病毒的樣品。從法醫(yī)環(huán) 境下獲得的材料也在術語"樣品"的意圖含義內。樣品還可包括食品和飲 料、環(huán)境樣品，例如水、土壤、沙等等。這些列舉不意圖是窮盡性的。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，樣品被預處理，以幫助用所述檢測方法 進行分析物的檢測。例如，通常，樣品的預處理產(chǎn)生半純化的部分，其僅 包含與分析物具有相同的總特性的那些化合物，例如，DNA、蛋白質的提 取等等。適合于樣品的預處理的方法和試劑盒在本領域中是可得的。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，分析物是核酸，例如基因組DNA
的序列或者來自病原體微生物的核酸。通常，為了檢測樣品中的基因組
DNA，樣品被加熱(例如，加熱至10(TC)，以確保dsDNA的變性并同時使 樣品中存在的大部分酶活性失活。此外或可選地，DNA可被(部分)純化。 多種方法可用于從樣品分離核酸。示例性的核酸分離技術包括(1)有機提取， 隨后乙醇沉淀，例如，采用苯酚/氯仿有機試劑(例如，Ausbel et al., eds., (1995: 包括截至2003年6月的增刊)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York),優(yōu)選采用自動DNA提取儀，例如Model 341 DNA 提取儀，可從Applied Biosystems (Foster City，Calif.)獲得，(2)固定相吸附 法(例如Boom et al.,美國專利5234809; Walsh et al., BioTechniques 10(4): 506-513 (1991),和(3)鹽誘導DNA沉淀法(例如Miller et al., (1988) NucL Acids Res., 16(3):9-10)，這類沉淀法通常被稱為"鹽析"法。商業(yè)可得的試 劑盒可用于加快這類方法，例如，基因組DNA純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)以及總DNA分離系統(tǒng)(TotaI RNA Isolation System)(都可從 Promega, Madison, Wis.獲得)。此外，這類方法已經(jīng)被自動化或半自動化， 采用諸如ABI PRISMTM 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)或ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation以及相關步驟，例如NucPrepTM Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue, Applied Biosystems Protocol 4333959 Rev. A (2002)， Isolation of Total RNA from Cultured Cells, Applied Biosystems Protocol 4330254 Rev. A (2002)，和ABI PRISM Cell Lysis Control Kit, Applied Biosystems Protocol 4316607 Rev. C (2001)。
上述預處理方法可進一步包括片段化步驟，例如通過酶消化、剪切或 超聲處理進行，和/或酶促擴增步驟，例如通過PCR進行。最特別地，當涉 及核酸的靈敏檢測時，耙DNA的PCR擴增可以在分析物的檢測之前進行。 在這種情況下，樣品由提取的DNA組成，該提取的DNA包含PCR產(chǎn)物。
能夠導致樣品基體效應、在樣品中或樣品的半純化部分中常見的化合 物和條件的典型例子包括但不限于離子、大的或主體蛋白質、主體DNA、 pH等等。然而，識別樣品基體效應的誘發(fā)因素對于本發(fā)明并不關鍵。本發(fā)明的方法原則上可被用于任何分析檢測技術，經(jīng)由所述分析檢測 技術，在樣品基體的存在下基于標記的檢測進行分析物的檢測。最特別地， 本發(fā)明可用于標記的檢測容易受到樣品中存在的因素影響的分析檢測方法
中。本發(fā)明的方法對于基于通過表面增強拉曼光譜術(SERRS)進行的標記檢
測的檢測方法特別有用。在SERRS中，利用了標記，其是SERRS-活性物
質或染料，當在染料的共振頻率下照射時，其產(chǎn)生共振拉曼光譜。檢測該
光譜的靈敏度通過將染料吸附在粗糙的金屬表面上而得到進一步增強，例
如在金、銀、銅和某些其它金屬的納米顆粒上(SERRS)。 SERRS中的關鍵
因素是染料有效吸附在該金屬表面上?？蛇x的方法涉及染料直接或間接結
合至金屬表面。當粗糙的金屬表面由膠體金屬納米顆粒組成時，在該膠體
納米顆粒以可控的方式聚集時實現(xiàn)最佳的信號增強。聚集劑包括酸(例如
HN03或抗壞血酸)、多胺(例如，精胺)和無機離子(例如，Cr、 r、 Na+或
Mg2+)。樣品中這類化合物的存在因此可影響膠體聚集。除了聚集之外，樣
品基體的成分還可以干擾染料吸附在膠體上，從而負面影響測量的SERRS /士 口
本發(fā)明的方法是包括分析物檢測的方法。待檢測的分析物的特性對于 本發(fā)明并本關鍵，并且可以是任何分子或者用來檢測的目標分子的聚集體。 分析物的非窮盡性列舉包括蛋白質、多肽、肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、 核苷酸、核苷、糖類、多糖、脂多糖、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、脂質、 激素、類固醇、生長因子、細胞因子、神經(jīng)遞質、受體、酶、抗原、變應 原、抗體、代謝物、輔因子、營養(yǎng)素、毒素、毒物、藥物、生物戰(zhàn)劑、生 物有害劑、傳染劑、阮病毒、維生素、免疫球蛋白、白蛋白、血紅蛋白、 凝固因子、白介素、干擾素、細胞因子、含腫瘤特異性表位的肽以及抗任 何一種上述物質的抗體。分析物可包括一種或多種復合聚集體，例如但不 限于病毒、細菌、微生物諸如沙門氏菌屬CSa/附o"e〃")、鏈球菌屬 (&re/ tococcw力、軍團桿菌屬(丄￡^0^//")、大腸桿菌(五.co//)、賈第蟲屬 (G7t ra^)、隱孢子蟲屬(Cr少; to5^or/c /MW)、立克次氏體(WcA;"加'a)，孢子、 霉菌、酵母菌、藻、變形蟲、甲藻、單細胞生物、病原體或細胞、以及細 胞表面分子、碎片、部分、成分、產(chǎn)物、小有機分子、核酸和寡核苷酸、 微生物的代謝物。根據(jù)具體實施方式
，分析物是DNA，例如基因、病毒DNA、細菌DNA、 真菌DNA、哺乳動物DNA、 DNA片段。分析物還可以是RNA，例如病毒 RNA、 mRNA、 rRNA。分析物還可以是cDNA、寡核苷酸、或合成的DNA、 RNA、 PNA、合成的寡核苷酸、修飾的寡核苷酸或其它核酸類似物。它可 包括單鏈核酸和雙鏈核酸。在檢測前，它還可以經(jīng)歷操作，諸如用限制酶 消化、利用核酸聚合物酶的復制、剪切或超聲處理，從而允許片段化發(fā)生。
如上所示，本發(fā)明提供了標記對照，用于包括利用標記進行檢測的檢 測方法。在本發(fā)明中，不同類型的標記被考慮，例如但不限于熒光染料、 顯色染料或化學發(fā)光染料、放射性的、金屬和/或磁納米顆粒等等。
因此，在本發(fā)明的方法中進行的檢測步驟將通過所用的標記進行確定， 包括但不限于熒光、比色、吸收、反射、偏振、折射、電化學、化學發(fā)光、 瑞利散射和拉曼散射、SE(R)RS、共振光散射、光柵連接表面等離振子共振、 閃爍計數(shù)、磁傳感器、電化學檢測(例如陽極溶出伏安法)等等。
用于不同檢測方法的合適標記很多并且在本領域中得到廣泛描述。熒 光標記包括但不限于異硫氰酸熒光素(FITC)，羧基熒光素諸如四甲基若丹 明(TMR)、羧基四甲基若丹明(TAMRA)、羧基-X-若丹明(ROX)、磺化若丹 明101 (Texas red )、 Atto染料(Sigma Aldrich)、熒光紅和熒光橙、藻紅蛋 白、藻藍蛋白和Crypto-FluorTM染料等等。最常見的放射性同位素包括(3射 線輻射體例如&和14C，以及Y射線輻射體例如碘-125 (1251)。在定量和定 性分析中使用的其它描述的標記包括但不限于樹狀聚合物、量子點、上轉 換磷光體和納米顆粒。
當本發(fā)明方法的分析物檢測是基于SE(R)RS時，標記是SE(R)RS-活 性的材料，即，當被適當照射時其能夠產(chǎn)生SERS或SERRS譜，在本文中 也稱為SE(R)RS-活性標記或染料。SE(R)RS-活性標記的非限制性例子包括 熒光素染料，例如5-(和6-)羧基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基熒光素、5-羧基 -2'，4'，5'，7'-四氯熒光素和5-羧基熒光素，若丹明染料例如5-(和6-)羧基若丹 明、6-羧基四甲基若丹明和6-羧基若丹明X，酞菁染料例如甲基、亞硝酰 基、磺?；桶被既玖希嫉玖?、偶氮甲堿、青色素和黃嘌呤例如 甲基、硝基、磺基(sulphano)和氨基衍生物，以及琥珀酰熒光素。根據(jù)具體實施方式
，SE(R)RS標記是羧基若丹明、FAM或TET。已經(jīng) 證明，用羧基若丹明R6G標記的寡核苷酸的校準曲線達到1.05 10"2M的 檢測極P艮，其考慮了稀釋效應，對應于以試驗樣品體積計0.5飛摩爾的標記 寡核苷酸的檢測。同時，R6G的(以及FAM和TET的)校準圖在從1(T7 M 至l(T11 M的范圍內表現(xiàn)出線性(LGC "Evaluation of the sensitivity of SERRS-based DNA detection", 2004年1 月，LGC/Mfb/2004/02，在 http:〃www.mfbprog.org.uk/themes/theme_publications—item.asp intThemeID= 10&intPublicationID=865可訪問)。
請注意，標記的選擇可受到諸如標記的共振頻率、試驗樣品中存在的 其它分子的共振頻率等因素的影響?？捎糜跈z測生物分子的SE(R)RS-活性 標記在本領域中進行了描述，例如在美國專利5306403、6002471和6174677 中。
根據(jù)本發(fā)明，使用標記對照確定樣品基體效應獨立于試驗樣品中分析 物的檢測(但任選地，與之同時)進行。根據(jù)一個具體實施方式
，使用與樣品 中分析物的檢測所用的標記相同的標記，確定樣品基體效應。然而，可選 地，考慮在標記對照中所用的標記是與分析物的檢測所用的標記不相同的 標記(即不同的標記)。在大多數(shù)情況下，標記檢測的樣品基體效應的至少一 部分獨立于所用標記的特性。例如，當在SE(R)RS檢測中涉及樣品基體效 應——其原因例如在于對用作SE(R)RS表面的膠體的聚集的效應——的情 況下，預期具有獨立于所用SE(R)RS染料的特性之外的相似效應。根據(jù)一 個具體實施方式
，考慮在樣品基體效應的確定中所用的標記——其不同于 分析物檢測中所用的標記，是這樣的標記，其性質比得上在分析物的檢測 中所用的標記(相似標記)。
如上所示出，根據(jù)本發(fā)明的標記對照的供應特別適合于其中已知標記 檢測受不同因素影響的方法。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，標記對照的供 應被應用于基于表面增強光譜術的分析檢測方法。通過表面增強光譜術諸 如表面增強(共振)拉曼光譜術(SE(R)RS)進行的檢測基于拉曼散射的強烈增 強，該增強是對于吸附到粗糙金屬表面上的分析物所觀察到的。因此，這 要求在合適的SE(R)RS-活性表面存在下進行標記的檢測。通常，所述表面 是貴金屬(Au、 Ag、 Cu)表面或堿金屬(Li、 Na、 K)表面。例如，金屬表面可以被蝕刻，或者另外是粗糙的金屬表面、金屬溶膠，或者根據(jù)一個具體實
施方式，是金屬膠體顆粒的聚集體，因為后者導致拉曼散射增強108-1014 以上(Nie和Emory (1997)， Science, 275, Kneipp (1999)， Chem Rev， 99)。在 本發(fā)明的檢測方法中，構成SE(R)RS-活性表面的金屬納米顆粒也可以以金 屬納米顆粒島膜、基于金屬鍍納米顆粒的基底、嵌入金屬納米顆粒的聚合 物膜等排列。金屬表面可以是裸露金屬或可以在金屬表面包括金屬氧化物 層。它可包括有機涂層，例如擰檬酸鹽的有機涂層或者合適的聚合物諸如 聚賴氨酸或多酚的有機涂層，以增加其吸附能力。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，構成SE(R)RS-活性表面的金屬膠體 顆粒是納米顆?；蛞钥煽胤绞骄奂哪z體納米顆粒，如US 2005/0130163 中所述。制備納米顆粒的可選方法是已知的(例如美國專利6054495、 6127120和6149868)。納米顆粒還可從商業(yè)來源獲得(例如Nanoprobes Inc.， Yaphank, N.Y.; Polysciences, Inc., Warrington, Pa.)。金屬顆?？删哂腥魏纬?寸，只有它們引起SE(R)RS效應。通常，它們具有約4-50 nm的直徑，最 特別地，在25-40 nm之間，取決于金屬的類型。
在利用SE(R)RS檢測法的本發(fā)明的檢測和/或定量方法中，SE(R)RS-活性標記與金屬表面的直接或間接共價或非共價結合是樣品中分析物的存 在和/或量的直接或間接指示。分子與SE(R)RS-活性表面結合的各種選擇和 模式在本領域中是已知的并描述于例如US 6127120和US 6972173中。
通常，在SE(R)RS-活性染料通過核苷酸探針結合于金屬表面的情況 下，通過加入單體多胺或聚合多胺，更特別是短鏈脂肪族多胺，例如精胺， 確保經(jīng)標記的探針吸附于金屬SE(R)RS-活性表面。因此，根據(jù)一個實施方 式，本發(fā)明的方法在檢測之前包括向將通過SE(R)RS檢測的試驗樣品加入 多胺。應該在獲得SE(R)RS譜之前，在允許多胺與分析物和/或標記和/或 經(jīng)標記的分析物特異性探針和/或經(jīng)標記的替代靶探針相互作用的時候，引 入多胺。多胺優(yōu)選是短鏈脂肪族多胺，例如精胺、亞精胺、1，4-二氨基哌嗪、 二亞乙基三胺、N-(2-氨基乙基)-l，3-丙二胺、三亞乙基四胺和四亞乙基五胺。 每重復單元具有四個NH2基團的精胺特別適合用于本發(fā)明。多胺優(yōu)選以其 酸式鹽例如其鹽酸鹽的形式引入。當SE(R)RS-活性表面是膠體狀時是最有 用的(參見上文)。所加入多胺的量優(yōu)選比獲得該表面的單層多胺覆蓋所需的量高100到1000倍的數(shù)量級。過量的多胺在表面上形成涂層，從而確保最
優(yōu)的膠體聚集以及分析物和域標記和域分析物-特異性標記的吸附。
多胺的加入將確保結合至金屬表面的DNA的總體增加?？蛇x地或另 外地，探針可以被修飾，以便促進或幫助探針化學吸附到SE(R)RS-活性表 面。通過至少部分降低分析物-特異性探針的總負電荷，這可得以保證。更 具體地，在分析物-特異性探針是核苷酸的情況下，這可通過將一個或多個 包含路易斯堿諸如氨基的官能團引入核酸或核酸單元而得到保證，如US 6127120中所述。
根據(jù)進一步的實施方式，官能團(例如路易斯堿)被提供在SE(R)RS-活 性標記上，以促進或幫助化學吸附至SE(R)RS-活性表面上。任選地， SE(R)RS-活性標記或染料和金屬顆粒被包埋于如US2005/0130163中所述 的聚合物珠中，其可任選地進一歩包含磁性顆粒，使得所述珠具有磁性， 這在分離中是令人感興趣的(見下文)。
本發(fā)明提供了檢測方法的標記對照，在所述檢測方法中，樣品基體可 干擾分析物的檢測。通常，這類方法包括不要求從未結合的標記和/或干擾 分析物的檢測和/或定量的其它經(jīng)標記的成分分離經(jīng)標記的分析物的方法， 和/或不包括洗滌步驟、從原始樣品基體分離分析物的方法。根據(jù)本發(fā)明的 一個實施方式，基于標記與分析物的特異性結合，確保分析物的檢測，由 此標記的信號在結合于分析物后被改變。這可例如通過分子信標的供應加 以實現(xiàn)，所述分子信標例如探針，其互補于靶序列，在其兩端各自用染料 和淬滅劑(例如Dabcyl)進行雙重標記。在其閉合態(tài)，染料的信號被淬滅劑 淬滅。當互補序列雜交于靶DNA時，信標打開，而信號可被檢測。能夠特 異結合于分析物從而使信號發(fā)生改變的標記的進一步的例子在 WO2005/019812中被提供用于SERRS。其中，SERRS信標被描述，其是
在其兩端各自用不同的染料進行雙重標記的探針。第二染料被特異設計， 以便它能夠將寡核苷酸探針固定在合適的金屬表面上。在不存在靶DNA的 情況下，該信標以"閉合態(tài)"固定在金屬表面上，導致對應于兩種染料的 SERRS譜的檢測。當互補序列雜交于靶DNA時，信標打開，并且染料之 一從表面除去。這導致SERRS信號改變。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，利用了熒光團標記的核苷酸探針，由此
所述標記的熒光的極化在結合于靶核酸后得以增強(Walker和Linn (1996), Clinical Chemistry, Vol 42， 1604-1608)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，標記對照的供應可被應用于競爭性 SE(R)RS法，其中基于分析物和經(jīng)標記的替代靶探針與分析物-特異性探針 的競爭結合確保分析物的檢測，后者與SE(R)RS表面有關。作為分析物-特異性探針對于分析物的親和性比對于特定探針更高的結果，經(jīng)標記的替 代探針從其與分析物-特異性探針的結合中被取代。這類方法確保了分析物 的反向檢測，因為存在的分析物越多，從表面被取代下來的經(jīng)標記的替代 靶探針越多，導致降低的SE(R)RS信號。
通常，本發(fā)明的方法的分析物檢測涉及經(jīng)標記的分析物-特異性探針， 其可以是互補型靶探針或替代型靶探針。這些探針——意圖特異性結合所 述分析物(用于結合至第二探針)或與之競爭，通過將能夠特異性結合至所述 分析物或對應于所述分析物的至少(特異性)一部分的化合物連接至標記而 獲得。分析物-特異性探針的特性通過待檢測的分析物的特性加以確定。最 常見地，基于與分析物的特異性相互作用，例如但不限于抗原-抗體結合、 互補核苷酸序列、糖-凝集素、互補肽序列、配體-受體、輔酶-酶、酶抑制 劑-酶等，開發(fā)所述探針。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，目標分析物是核苷酸，而本發(fā)明的 方法涉及使用至少一種經(jīng)標記的分析物-特異性探針，其是核苷酸探針，其 序列互補或類似于目標分析物的至少一部分，最特別地，是所述分析物的 序列，特異于所述分析物。該核苷酸探針結合于標記，允許所述分析物的 特異性檢測。
制備標記的核苷酸并將它們摻入核酸的方法在本領域中進行了描述 (例如美國專利4962037、 5405747、 6136543和6210896)。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，使用了 SE(R)RS-活性標記，其或者 直接連接于核苷酸探針，或通過接頭化合物連接。含有反應基的SE(R)RS-活性標記是商購可得的(例如Molecular Probes， Eugene, Oreg.)，該反應基被 設計來與其它分子諸如核苷酸或核酸共價反應。共價結合于核苷酸前體的 SE(R)RS-活性標記可購自標準的商業(yè)來源(例如Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, Ind.; Promega Corp.， Madison， Wis.; Ambion, Inc., Austin, Tex.; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N丄)。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，結合的標記探針的檢測包括在樣品 內從結合于分析物、經(jīng)標記的分析物-特異性探針物理分離未結合的經(jīng)標記 的分析物-特異性探針。未結合和結合的標記探針的分離可通過如下實現(xiàn) 提供所述分析物-特異性探針的標簽，或者提供包含標簽的二級分析物-特異 性分離探針，所述標簽可經(jīng)受物理和/或化學力。這類標簽的典型例子包括 磁珠(其可經(jīng)受磁力)、玻璃珠或聚苯乙烯珠(其可被光束捕獲并移動；Smith et al. (1995)， Science 271:795)或帶電基團(其可經(jīng)受電動力；Chou et al. (1999)， PNAS 96:11)。在分析物是核苷酸序列——其在檢測前使用PCR進 行擴增——的情況下，所述標簽可以被慘入PCR產(chǎn)物。分析物的標簽化使 得能夠分離未結合的和結合的經(jīng)標記的分析物4寺異性探針，以允許它們的 各自檢測。
本發(fā)明的某些方面涉及分析物更尤其是試驗樣品中的分析物的改良的 檢測和/或定量方法。盡管本文描述的方法一般提及"一種分析物"，但同 樣考慮的是，在使用不同的分析物-特異性標記同時檢測或定量若干種分析 物的情況下，本發(fā)明的方法也適用。最特別地，可利用不同的分析物-特異 性探針，其可使用同一檢測方法進行區(qū)分檢測，所述檢測方法包括但不限 于熒光素異硫氰酸酯(FITC)、羧基熒光素(例如四甲基若丹明(TMR)、羧基 四甲基-若丹明(TAMRA)、羧基-X-若丹明(ROX)、磺化若丹明101 (Texas red )、 Atto染料(SigmaAldrich)、熒光紅和熒光橙、藻紅蛋白、藻藍蛋白、 Crypto-FluorTM染料、量子點、SE(R)RS-活性染料、和它們的同位素。由于 可使每一種探針特異于不同的分析物，對于每一種經(jīng)標記的分析物-特異性 探針，測量其在試驗樣品中的檢測信號是可能的。而且，對于不同標記的 每一種，在一種標記對照下確定樣品基體效應(基于一種背景樣品和一種無 背景樣品，它們己被加入各自的標記)是可能的，以便允許補償潛在干擾每 一種標記的檢測的樣品基體效應。
如上所示，本發(fā)明的方法在基于表面增強(共振)拉曼光譜術或 SE(R)RS的檢測和/或定量方法方面是特別令人感興趣的。雖然本文一般提 及SE(R)RS，但可理解，基于其它類型的表面增強光譜術的檢測方法也被考慮在內，例如但不限于，表面增強熒光、普通(斯托克斯或反斯托克斯)
拉曼散射、共振拉曼散射、相干(斯托克斯或反斯托克斯)拉曼光譜術(CSRS 或CARS)、表面增強(共振)CARS、受激拉曼散射、反拉曼光譜術、受激增 益拉曼光譜術、超拉曼散射、表面增強超拉曼散射、分子光學激光檢驗器 (molecular optical laser examiner (MOLE))或拉曼微探針或拉曼顯微術或共 焦拉曼顯微光譜術、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜術、時間分辨共振拉 曼、拉曼去耦光譜術或UV-拉曼顯微術。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，本發(fā)明的檢測方法包括SERRS，因為在 標記的共振頻率下操作得到增強的靈敏度。在這種情況下，用于產(chǎn)生拉曼 光譜的光源是相干光源，例如，激光，基本上調整至所用標記的最大吸收 頻率。該頻率針對標記與SE(R)RS-活性表面和分析物和/或分析物結合物質 之間的關系，可發(fā)生輕微變化，但普通技術人員將完全能夠調整光源適應 這種情況。所述光源可被調整至所述標記的吸收最大值附加的頻率，或調 整至在所述標記的吸收光譜中次級峰的頻率或附近的頻率?？蛇x地， SE(R)RS可包括在活性表面或(聚集的)膠體上于等離子體的共振頻率下操 作。
在基于SE(R)RS檢測的本發(fā)明方法中，通常選擇一個峰，例如對應于 所述標記的吸收最大值，并僅在該峰的波長下進行激發(fā)。可選地，在例如 使用不同的SERRS標記同時檢測不同的分析物的情況下，檢測完整的"指 紋"光譜以鑒定每一標記可能是必需的。 一般而言，多元分析法(例如，偏 最小二乘回歸、主成分回歸等等)可被用于使用完整的指紋光譜——具有一 個以上拉曼帶的光譜范圍或使用單一拉曼帶進行定性和/或定量識別所存 在標記的每一個。
典型地，基于SE(R)RS的檢測方法中的檢測步驟將使用來自激光的入 射光進行，其具有可見光譜內的頻率。所選擇的確切頻率將取決于標記、 表面和分析物。對于貴金屬表面例如銀和金，在可見光譜的綠色區(qū)域或紅 色區(qū)域中的頻率總體上易于產(chǎn)生更好的表面增強效應。然而，考慮這樣的 情況也是可能的，其中其它頻率例如紫外區(qū)或近紅外區(qū)中的頻率能被使用。 具有合適的頻率和功率的合適光源的選擇以及——如果有必要——調整完全在本領域普通技術人員的能力之內，特別在參考可獲得的SE(R)RS文獻 的時候。
在基于SE(R)RS的檢測方法中使用的激發(fā)源包括但不限于氮激光器、 氦鎘激光器、氬離子激光器、氪離子激光器等等。多脈沖激光器可提供激 發(fā)線的多種選擇，這對于共振拉曼光譜是關鍵的。根據(jù)一個具體實施方式
， 氬離子激光器被用于LabRam集成儀器(Jobin Yvon)，激發(fā)波長為514.5 nm。
激發(fā)光束可以用帶通濾光片進行光譜純化，并可使用6倍物鏡聚焦于 基底。通過使用全息分束器以產(chǎn)生激發(fā)光束和發(fā)射的拉曼信號的直角幾何 形狀，該物鏡可用于激發(fā)樣品和收集拉曼信號。拉曼信號的強度需要對照 激發(fā)光束的強背景進行測量。該背景主要是瑞利散射光和鏡反射，其可用 高效濾光器選擇性地除去。例如，全息陷波濾波器可用于降低瑞利散射輻 射。
表面增強拉曼發(fā)射信號可以通過拉曼檢測器檢測。在拉曼光譜術中具 有潛在應用的各種檢測單元在本領域中是已知的并且任何已知的拉曼檢測 單元可被使用。拉曼檢測單元的例子被公開在例如美國專利US 6002471 中。其它類型的檢測器可被使用，例如電荷耦合器件(CCD)，其中紅增強電 荷耦合器件(red-enhanced intensified charge-coupled device (RE-ICCD))、硅光 電二極管或光電倍增管單獨排列或連續(xù)排列，用于信號的級聯(lián)放大。光子 計數(shù)電子器件可用于靈敏檢測。檢測器的選擇將主要取決于進行特定分析 所要求的靈敏度。幾種設備適于收集SE(R)RS信號，包括波長選擇鏡、用 于散射光檢測的全息光學元件、以及光纖波導。
用于獲得和/或分析SE(R)RS光譜的裝置可包括某些形式的數(shù)據(jù)處理 器，例如計算機。 一旦SE(R)RS信號被合適的檢測器捕獲，其頻率和強度 數(shù)據(jù)將通常被傳送到計算機，用于分析。指紋拉曼光譜將與參考光譜進行 比較來鑒別所檢測的拉曼活性化合物，或者在所測量的頻率下的信號強度 被用來計數(shù)所檢測的拉曼活性化合物的含量。
本發(fā)明提供了通過允許校正樣品基體效應改善樣品中分析物的檢測和 /或定量的方法。普通技術人員將理解，這可被應用于結合供給的檢測方法， 所述供給例如使用內標(諸如施加至試驗樣品的同位素改良的標記)，確保補償光激發(fā)/收集變化。這類內標的例子在現(xiàn)有技術(Zhang&"/. (2005), Anal. Chem. 77(11): 3563-3569)中被提供。
本發(fā)明提供了基于標記的分析物檢測的改良方法?？紤]開發(fā)適于本發(fā) 明方法的應用的試劑盒和試劑。
根據(jù)進一方面，本發(fā)明提供了系統(tǒng)，其中本文所述方法可被實行，所 述系統(tǒng)包括
(a) 裝置，用于提供來自含有待檢測分析物的所述樣品的試驗樣品、 包含樣品基體或樣品樣基體的背景樣品、以及不含樣品基體或樣品樣基體 的無背景樣品，
(b) 裝置，用于使所述樣品與預定量的標記合適地接觸，
(c) 裝置，用于檢測和/或定量所述標記(在所述試驗樣品、所述背景樣 品和所述無背景樣品中)
(d) 裝置，用于通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標 記的檢測之間的差異，確定樣品基體效應，并且用于相應校正所述試驗樣 品中所述標記的檢測和/或定量。
例如，本發(fā)明包括用于病原體檢測例如MRSA檢測、腦膜炎、HIV、
鳥流感、瘧疾等的集成設備。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的實施方式的系統(tǒng)100的示意圖。系統(tǒng)100適于檢 測并任選地定量樣品中分析物的存在，由此所述樣品對標記檢測的樣品基 體效應得以確定。它包括用于提供一種或多種樣品的源101,其可以被提供 為一個或多個源，例如疑似含有分析物的試驗樣品的專門源105、含背景基 體或背景樣基體的背景樣品的源I06、不含背景基體或背景樣基體的無背景 樣品的源107。此外，該系統(tǒng)可包括含有標記的源102，其可以是一個源或
者可被提供為分開的分析物-特異性標記(例如經(jīng)標記的分析物-特異性探針) 的源108以及標記的源109。任選地，該設備包括至少一個額外的在檢測中 起作用的添加劑的源IIO。該設備進一步包括裝置103，其中試驗樣品和背 景樣品與各自的標記接觸，并用于檢測。任選地，該裝置可被提供為一個 裝置1(B，或用于試驗樣品與相關標記的接觸和檢測的分開的室lll、用于 背景樣品與相關標記的接觸和檢測的分開的室112、和用于無背景樣品與相 關標記的接觸和檢測的分開的室113。該設備進一步包括裝置104，用于a) 將來自源IOI(或105)的包含分析物的樣品以及來自源102(或108) 的預定量的標記提供至使所述樣品與所述標記接觸的裝置103或提供至其 中試驗樣品與分析物-特異性標記接觸的專門裝置111，
b) 將來自源IOI(或106)的背景樣品以及來自源102(或109)的預定量 的標記提供至使所述樣品與各自的標記接觸的裝置103或提供至其中所述 背景樣品與預定量的標記接觸的專門裝置(112)，
c) 將來自源IOI(或107)的無背景樣品以及來自源102(或109)的預定 量的標記提供至使所述樣品與各自的標記接觸的裝置103或提供至其中所 述無背景樣品與相同預定量的標記接觸的專門裝置113。
裝置104可包括所述樣品和/或分析物和/或背景材料和/或無背景材料 的稱重式進料，并還可包括管/管道和閥(諸如可選和可控閥)的排列，以允 許流體從源105、 106、 107、 108、 109和IIO(或從源101和102)的供給至 接觸裝置111、 112和113 (或103)?？蛇x地，流體可從源105-110 (或101 和102)泵送至接觸裝置111-113 (或103)。
根據(jù)一個具體實施方式
，背景樣品包含樣品基體，更特別地是其中分
析物待檢測從而其組成與試驗樣品相同的樣品的一部分。
上述的組件排列可定位于盒117中，例如分子診斷學中使用的一次性
盒117。
控制和分析電路115，其可以至少部分在盒117中或可以任選地在盒 117的外部，并可以被任選地提供來控制裝置104的操作。該控制和分析電 路115可通過盒表面的合適接觸件被連接至裝置104，例如接線柱。
此外，用于檢測結合至分析物的標記并且還檢測背景樣品和無背景樣 品中的相關標記的裝置114被提供。裝置114可以與盒117整合在一起， 或可以在盒外部，并且可在盒117中提供窗，以便檢測裝置114可檢測樣 品等。裝置U4可以處于控制和分析電路115的控制之下。檢測裝置114 可以是能夠利用上述檢測方法的一種或多種或任何一種的檢測器。代表檢 測的信號可被提供至控制和分析電路115，該控制和分析電路115可適于進 行上文描述的本發(fā)明的分析算法的任何一種。具體而言，控制和分析電路 115可適于通過確定背景樣品中標記檢測與無背景樣品中標記檢測之間的 差異來確定樣品基體效應，并用于校正試驗樣品中標記的檢測，從而利用所確定的樣品基體效應校正所述試驗樣品中分析物的檢測和/或定量。結果 可被顯示在任何合適的顯示裝置116上，例如可視顯示單元、繪圖儀、打
印機等等?？刂坪头治鲭娐?15可連接至局域網(wǎng)或廣域網(wǎng)，用于將結果傳 輸至遠程?？刂坪头治鲭娐?15可以以任何合適的方式實現(xiàn)，例如專用硬 件或者合適程控的計算機、微控制器或嵌入式處理器諸如微處理器、可編 程門陣列例如PAL、 PLA或FPGA，或類似物。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，在源105中的樣品可以是含有生物 分子(例如上述生物分子的任何一種、特別是DNA分子的混合物)的溶液，。 具體而言，生物分子可以是從PCR反應得到的DNA。該實施方式對于在 分子診斷一次性盒中的應用是特別有用的，該分子診斷一次性盒可包括細 胞裂解站和PCR反應站，具體而言是多重PCR反應站。然后，PCR反應 站的輸出形成源105。在這種情況下，源108中的標記將是分析物-特異性 寡核苷酸探針，適合于上文所述任何應用的檢測方法的標記被連接于該探 針上。選擇該探針的核苷酸序列，使得它可與分析物雜交，例如與分析物 的序列互補。第二源108可含有預定量的同一標記或不同標記，其未結合 至核苷酸探針從而不能結合分析物。源106含有背景樣品例如PCR緩沖液 (例如Taq PCR緩沖液，50 mM KC1、 10 mM Tris HC1、 1.5 mM MgCl2、 0.1% 明膠)。源107含有無背景樣品，例如水或適于不受干擾地檢測所述標記的 緩沖溶液。當表面增強光譜法被用于所述標記的檢測時，額外的源110可 含有合適的金屬表面，例如用金屬表面涂覆的膠體顆?；蛑?。第二額外的 源110可包含聚集劑，例如精胺。
在該具體實施方式
中，從源105至110合適地提供試劑并使之接觸可 使得室111含有PCR反應輸出和預定量的經(jīng)標記的寡核苷酸探針、使得室 112含有PCR反應輸出和預定量的標記、使得室113含有水和預定量的標 記，此外使得所有三個室U1-113含有聚集的膠體顆粒，以能夠通過檢測 裝置114進行表面增強光譜檢測。
應當理解，盡管本文已經(jīng)就本發(fā)明的設備討論了優(yōu)選的實施方式、具 體的結構和構造以及材料，但是可以進行形式和細節(jié)上的各種變化或改變 而不背離本發(fā)明的范圍和精神。實施例
實施例1:確定緩沖液組成對SERRS-活性標記的SERRS檢測的效應
在其5'末端用若丹明6G標記的合成寡核苷酸(19 bp, TGCTTCTACACAGTCTCCT)被用于研究緩沖液組成對所檢測的SERRS強 度的效應。該寡核苷酸以2'10—SM的濃度溶解在無背景樣品即水中。為研 究該緩沖液組成對SERRS測量的效應，相同量的寡核苷酸被溶解在背景樣 品中，即含有10 mM NaCl的水。對于SERRS測量，10 pl的每一樣品與 10 pl精胺四氯化物(100mM水溶液，新制備)混合。向這些溶液加入250 pl 水和250 pl銀納米顆粒(如Munro et al. (1995)， Langmuir， 11:3712-3720所述 進行制備)。在混合后立刻使用LabRam系統(tǒng)(Jobin Yvon)從兩種樣品中采集 SERRS光譜，所述LabRam系統(tǒng)具有提供514.5 nm的激發(fā)的氬激光器。兩 個光譜的比較表明SERRS強度的顯著差異。這最可能是由于通過加入NaCl 聚集體量增加和/或聚集體大小改變所致。
實施例2:使用競爭性SERRS檢測和定量樣品中的特異基因并校正樣品基 體效應
由動物種群特別是雞中的流感A病毒的某些亞型產(chǎn)生的高致病性禽流 感持續(xù)威脅全球公共健康。人直接感染禽流感A亞型H5N1病毒已經(jīng)成為 最近相當大的人死亡率的原因，加大了對快速和準確診斷的需求。A型流 感病毒是基于外部糖蛋白、血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原差異進行 亞型分類的。本發(fā)明提供了通過使用病毒核酸的RT-PCR和SERRS進行病 毒亞型分類的新的、快速和準確的方法。
病毒RNA從臨床樣品中提取出來，并根據(jù)Wright "a/. (1995)， J. Clin. Microbiol.， 33:1180-1184使用病毒反轉錄酶和隨機引物產(chǎn)生與病毒RNA互 補的cDNA。用特異于流感病毒亞型H5Nl的HA和NA基因的兩套引物進 行多重PCR，如在"Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus m spscim6ns from humans", WHO Geneva, June 2005)中所描述，設計來 分別產(chǎn)生219和616 bp的PCR產(chǎn)物。隨后通過競爭SERRS檢測擴增產(chǎn)物。 因此，兩種分析物-特異性探針被設計成分別與HA和NA基因內的區(qū)域互 補，并具有尋表面基團炔丙胺，用于結合至銀納米顆粒。兩種另外的合成寡核苷酸——所謂的替代靶探針，分別用SERRS染料HEX和TET標記， 被設計成分別與HA-和NA-特異性探針的一部分互補，除了一個錯配(SNP) 之外。
制備兩種標記溶液。第一標記溶液含有用于檢測擴增的H5N1病毒HA 和NA基因的、預定量的HA-和NA-特異性探針以及相應替代靶探針。由 于SNP的存在，HA-和NA-特異性探針和它們的相應替代靶探針在第一標 記溶液中被松散退火。第二標記溶液， 一式兩份制備，僅含有預定量的 SERRS染料HEX和TET。
為確定各種樣品中HEX和TET的SERRS測量的參比點，10 pl的每 一標記溶液與10 pl精胺四氯化物(lOO mM水溶液，新制備)混合。向這些 溶液加入250 pi水和250 pl銀納米顆粒(如Munro et al. (1995)， Langmuir, 11:3712-3720所述進行制備)。在混合后立刻使用LabRam系統(tǒng)(Jobin Yvon) 從所制備的溶液中采集SERRS光譜，所述LabRam系統(tǒng)具有提供514.5 nm 的激發(fā)的氬激光器。
然后，PCR反應的輸出被分成兩個相同的部分，以提供試驗樣品和背 景樣品。水被提供為無背景樣品。為了檢測擴增的H5N1病毒HA和NA 基因，試驗樣品被加入到含有預定量的HA-和NA-特異性探針、替代靶探 針和聚集的銀膠體的第一標記溶液。為了確定樣品基體效應，所述背景樣 品和無背景樣品被各自加入到第二標記溶液，其含有預定量的SERRS染料 和聚集的銀膠體。
在合適的溫度下溫育允許試驗樣品中的分析物DNA與替代靶探針競 爭雜交至HA-和NA-特異性探針，后者已經(jīng)結合至聚集的銀膠體。由于替 代靶探針并非與HA-和NA-特異性探針完全互補，分析物DNA與HA-和 NA-特異性探針的雜交更加穩(wěn)定，替代靶探針從金屬表面被替換出來，導 致HEX和TET染料的SERRS強度的降低。
背景樣品和無背景樣品也被溫育，并且它們的SERRS光譜被比較， 以定量由PCR緩沖化合物、殘留DNA等產(chǎn)生的樣品基體效應。
通過補償樣品基體效應，使用競爭SERRS，補償擴增的病毒HA和 NA基因的準確檢測因此得以實現(xiàn)。
權利要求
1. 確定樣品對標記檢測的樣品基體效應的方法，所述方法包括步驟(a)使預定量的所述標記或不同標記與包含樣品基體或樣品樣基體的背景樣品接觸，(b)使預定量的所述標記或所述不同標記與無背景樣品接觸，所述無背景樣品不含樣品基體或樣品樣基體或能夠干擾所述標記的檢測的任何其它化合物，(c)檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或所述不同標記，和(d)確定在所述背景樣品和所述無背景樣品中所述標記或所述不同標記的檢測之間的差異，所述差異對應于所述樣品基體效應。
2. 確定對樣品中的分析物的樣品基體效應的方法，所述方法包括步驟(a) 提供來自含有待檢測分析物的所述樣品的試驗樣品、包含樣品基體 或樣品樣基體的背景樣品、以及不含樣品基體或樣品樣基體的無背景樣品，(b) 使用標記來檢測和/或定量所述試驗樣品中的分析物，(C)通過包括下列步驟的方法檢測所述樣品基體效應(i) 使所述背景樣品與預定量的所述標記或不同標記接觸，(ii) 使所述無背景樣品與預定量的標記或所述不同標記接觸，(iii) 檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或所述不同+示記，(iv) 通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或 所述不同標記的檢測之間的差異來確定所述樣品基體效應，(d)用在(W)中確定的所述樣品基體效應校正步驟(b)的所述試驗樣品中的所述分析物的檢測和/或定量。
3. 權利要求2所述的方法，其中所述背景樣品是其中所述分析物待 檢測的所述樣品的一部分。
4. 權利要求2所述的方法，其中所述背景樣品包含樣品基體或樣品 樣基體。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中使用兩種或更多種預定量 的標記進行所述樣品基體效應的校正。
6. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中所述分析物選自核酸、蛋 白質、糖類、脂質、化學物質、抗體、微生物和真核細胞。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中步驟(c)中的所述檢測步驟 或者步驟(b)和(c)中的所述檢測步驟分別是使用光學檢測法進行的。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述光學檢測法是SE(R)RS， 并且其中所述標記或所述不同標記是SE(R)RS-活性標記。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，在檢測之前進一步包括使所述標記 或所述不同標記與SE(R)RS-活性表面接觸。
10. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述SE(R)RS-活性表面是銀 或金納米顆粒的膠體懸浮液，或它們的聚集膠體。
11. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述分析物的所述檢測是使用 經(jīng)標記的分析物-特異性探針進行的。
12. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述分析物-特異性探針具有 結合-敏感性探針。
13. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述分析物是核苷酸序列，而 所述經(jīng)標記的分析物-特異性探針是核苷酸或核苷酸類似物序列，其具有與 所述分析物內的序列互補的序列。
14. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述分析物的所述檢測是使用 能夠結合至SE(R)RS-活性表面的分析物特異性探針以及經(jīng)標記的替代探針 進行的，并且由此所述分析物與所述經(jīng)標記的替代探針競爭結合所述分析 物-特異性探針。
15. 根據(jù)權利要求2至14任一項所述的方法，其中步驟(b)中的所述 分析物的所述檢測和/或定量基于經(jīng)標記的分析物-特異性探針或經(jīng)標記的 替代探針的檢測，并且其中所述校正步驟(d)通過用在(iv)中確定的所述樣品 基體效應校正所述經(jīng)標記的分析物-特異性探針或經(jīng)標記的替代探針的所 述檢測進行。
16. 確定樣品對標記檢測的樣品基體效應的系統(tǒng)，其包括(a) 裝置，用于使預定量的所述標記或不同標記與包含樣品基體或樣品 樣基體的背景樣品接觸，(b) 裝置，用于使預定量的所述標記或所述不同標記與無背景樣品接 觸，所述無背景樣品不含樣品基體或樣品樣基體或能夠干擾所述標記的檢 測的任何其它化合物，(c) 裝置，用于檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或所 述不同標記，和(d) 裝置，用于確定在所述背景樣品和所述無背景樣品中所述標記或所 述不同標記的檢測之間的差異，所述差異對應于所述樣品基體效應。
17. 確定對樣品中分析物檢測的樣品基體效應的系統(tǒng)，其包括(a)裝置，用于提供來自含有待檢測的分析物的所述樣品的試驗樣品、 包含樣品基體或樣品樣基體的背景樣品、以及不含樣品基體或樣品樣基體 的無背景樣品，(b) 裝置，用于使用標記檢測和/或定量所述試驗樣品中的所述分析物，(c) 裝置，用于使所述背景樣品與預定量的所述標記或不同標記接觸，(d) 裝置，用于使所述無背景樣品與預定量的所述標記或所述不同標記 接觸，(e) 裝置，用于檢測所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記或所 述不同才示i己，(f) 裝置，用于通過確定所述背景樣品和所述無背景樣品中的所述標記 或所述不同標記的檢測之間的差異而確定所述樣品基體效應，(g) 裝置，用于應答于確定所述樣品基體效應的裝置而校正所述試驗樣 品中的所述分析物的檢測和/或定量。
18. 根據(jù)權利要求16所述的系統(tǒng)，進一步包括一種或多種樣品的第 一源(IOI)，和一種或多種標記的第二源(102)，以及任選地，添加劑的第三 源(IIO)，所述一種或多種樣品選自含有所述分析物的試驗樣品、背景樣品 和無背景樣品。
19. 根據(jù)權利要求18所述的系統(tǒng)，其中所述第一源(101)包括分別用 于含有所述分析物的所述試驗樣品、背景樣品和無背景樣品的專門室。
20. 根據(jù)權利要求16-19任一項所述的系統(tǒng)，進一步包括用于使所述 含有所述分析物的所述試驗樣品、背景樣品和無背景樣品與所述標記接觸 的室。
21. 根據(jù)權利要求18至20任一項所述的系統(tǒng)，其中所述一種或多種 標記的所述第二源(102)包括用于分析物-特異性標記的室(108)和用于標記 的室(109)。
22. —次性盒(117)，其在確定對樣品中分析物檢測的樣品基體效應的 系統(tǒng)中使用，包括-選自含有分析物的試驗樣品、背景樣品和無背景樣品的一種或多種樣品的第一源(ioi)，和- 一種或多種標記的第二源(102)，以及任選地，添加劑的第三源(IIO)，和-裝置，用于使所述背景樣品和預定量的所述標記或不同標記接觸， 用于使所述無背景樣品和預定量的所述標記或不同標記接觸，以及用于使 所述試驗樣品和預定量的所述標記或不同標記接觸，和-窗，以允許在所述試驗樣品、所述背景樣品和所述無背景樣品中檢 測所述標記或所述不同標記。
全文摘要
本發(fā)明描述了適于確定樣品基體對標記檢測的效應的方法和系統(tǒng)，以便當在分析檢測技術中使用所述標記時允許校正這些樣品基體效應。該方法對于在一次性分子診斷盒中的應用是特別有利的。
文檔編號C12Q1/68GK101443459SQ200780017404
公開日2009年5月27日 申請日期2007年5月8日 優(yōu)先權日2006年5月16日
發(fā)明者G·W·呂卡森, K·A·施密特, S·內爾肯 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司