專利名稱：：腫瘤壞死因子α相關(guān)狀況的RNAi介導(dǎo)的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請涉及干擾RNA組合物領(lǐng)域，所述組合物通過沉默TNFa細(xì)胞表面受體TNF受體-l(TNFRl)mRNA或者TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17)mRNA,用于沉默肺瘤壞死因子a(TNFa)。沉默此類TNFa靶標(biāo)用于治療患有TNFa相關(guān)狀況或者處于發(fā)生這種狀況的危險中的患者。
背景技術(shù)：
：通常用標(biāo)準(zhǔn)抗炎方案治療炎癥，所述方案包括類固醇和/或非類固醇抗炎藥物(NSAIDS)。在歷史上，除了口服或鼻內(nèi)類固醇外，還用口服、鼻內(nèi)或者局部抗組胺劑治療變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼的炎癥、皮炎、鼻炎和哞喘。系統(tǒng)性治療通常需要施用更高濃度的藥物化合物以提供有效濃度來到達(dá)必要的治療部位。已知抗組胺化合物具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性；嗜睡和粘膜干燥是抗組胺劑使用的常見副作用。類固醇和NSAIDS具有潛在的副作用，包括眼內(nèi)壓升高、白內(nèi)障、青光眼或角膜溶解。干眼，也稱作干性結(jié)膜炎或干燥性角結(jié)膜炎，是常見的眼科病癥，涉及眼前淚膜的破裂，導(dǎo)致眼的暴露的外表面脫水。迄今為止，已經(jīng)用局部施用人工淚液治療干眼。這些溶液的一些含有偽私膜物質(zhì)來暫時代替或者補(bǔ)充粘蛋白不足患者中的粘蛋白層。已經(jīng)提出在短期"脈沖"治療中使用甲強(qiáng)龍來治療干眼的惡化。所提出的"脈沖"療法需要避免與用于炎性狀況的常規(guī)類固醇療法相關(guān)的并發(fā)癥，如增加的眼內(nèi)壓和白內(nèi)障形成。細(xì)胞因子TNFa是干眼和眼色素層炎的抗炎療法靶標(biāo)。在淚腺炎癥誘導(dǎo)的干眼的兔;f莫型中，通過眼表面TNFa水平的特定調(diào)節(jié)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了角膜染色的抑制和淚液結(jié)束時間的恢復(fù)。通過抑制TNFa合成(RDP58)或通過使用單克隆抗體(REMICADE)或可溶性受體(ENBREL)特異中和TNFa導(dǎo)致干眼療法。這些針對TNFa的治療每一種都導(dǎo)致用局部眼抗炎類固醇得到的功效水平。McSwiggen等人的美國專利公開2005/0227935(2005年10月13日公布)涉及TNF和TNF受體基因表達(dá)的RNA干擾介導(dǎo)的抑制。然而，所述公開沒有教導(dǎo)如本文提供的用于RNA抑制的具體靶序列。本發(fā)明的實(shí)施方案解決本領(lǐng)域中對干眼和炎癥的其他治療劑和治療方法的需要并提供了備選的療法。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案提供了對TNFa相關(guān)狀況的高度有效和靈驗(yàn)的治療、預(yù)防或干預(yù)，而沒有與類固醇或NSAIDS相關(guān)的副作用。一方面，本發(fā)明的方法包括治療患有TNFa相關(guān)狀況或者處于發(fā)生TNFa相關(guān)狀況的危險中的受試者，通過施用沉默TACEmRNA或TNFR1mRNA表達(dá)的干擾RNA,從而分別干擾前體蛋白酶解加工成TNFa，或者干擾TNFa與它的細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而減弱TNFa的活性和防止與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)的事件級聯(lián)來實(shí)現(xiàn)治療。TNFa相關(guān)的狀況包括諸如干眼和TNFa相關(guān)炎性狀況的狀況。TNFa相關(guān)炎性狀況包括如下狀況，如眼炎癥、變應(yīng)性結(jié)膜炎、皮炎、鼻炎和哮喘，并且包括TNFa活性引起的那些細(xì)胞改變，TNFa活性直接或間接導(dǎo)致TNFa相關(guān)的炎性狀況。TNFa相關(guān)狀況尤其包括TNFa相關(guān)的眼狀況，如干眼、變應(yīng)性結(jié)膜炎和眼炎癥。本文提供的干擾RNA提供了沉默TNFa耙標(biāo)TACEmRNA或TNFRlmRNA而避免由于非特異活性劑引起的不希望的副作用。減弱受試者的TACEmRNA表達(dá)的方法是本發(fā)明的實(shí)施方案。該方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含至少13個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域與對應(yīng)于SEQIDNO:3、SEQIDNO:14-SEQIDNO:58、和SEQIDNO:155-SEQIDNO:201任一個的mRNA的3，末端倒數(shù)笫二位的13個核苷酸有至少90%序列互補(bǔ)性，或者至少90%序列同一性。從而減弱TACEmRNA的表達(dá)。治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)狀況的方法是本發(fā)明的一個實(shí)施方案。該方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含至少13個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域與對應(yīng)于SEQIDNO:3、SEQIDNO:14-SEQIDNO:58、和SEQIDNO:155-SEQIDNO:201任一個的mRNA的3'末端倒數(shù)第二位的13個核苷酸有至少卯％序列互補(bǔ)性，或者至少90%序列同一性。從而治療TNFa相關(guān)的狀況。在本發(fā)明的再一個實(shí)施方案中，通過減弱受試者中TACEmRNA或TNFR1mRNA的表達(dá)減弱受試者的TNFa活性的方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域，其中反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、卯0、卯9、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、122595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337,或其中反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交，所述部分在核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091、2092或2098處開始。TACEmRNA的表達(dá)在那些實(shí)施方案中減弱，在所述實(shí)施方案中，反義鏈與對應(yīng)于如上述的SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交。TNFR1mRNA的表達(dá)在那些實(shí)施方案中減弱，在所述實(shí)施方案中，反義鏈與對應(yīng)于如上述的SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交。治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)狀況的方法是本發(fā)明的一個實(shí)施方案，該方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、■、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332、或333713從而治療TNFa相關(guān)的狀況。治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)的眼狀況的方法是本發(fā)明的一個實(shí)施方案，該方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、20卯、2091、2092或2098。從而治療TNFa相關(guān)的狀況。在另一實(shí)施方案中，也可以對受試者施用具有19到49個核苷酸長度的笫二種干擾RNA;該第二種干擾RNA包含有義核普酸鏈、反義核苷酸鏈和至少19個核苷酸的至少接近完全互補(bǔ)的區(qū)域；其中反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含如上引用的核苷酸，或者其中反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交，所述部分在核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091、2092、或2098處開始。當(dāng)?shù)谝环N干擾RNA靶定SEQIDNO:1時，第二種干擾RNA可以革巴定SEQIDNO:1或SEQIDNO:2，并且相反地，當(dāng)?shù)谝环N干擾RNA單巴定SEQIDNO:2時，第二種干擾RNA可以靶定SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以施用第三種、第四種或更多種干擾RNA。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案是治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)狀況的方法，其中該方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含通過RNA干擾下調(diào)TACE基因表達(dá)的雙鏈siRNA分子，其中該siRNA分子的每條鏈獨(dú)立地為約19到約27個核苷酸長度；siRNA分子的一條鏈包含與對應(yīng)于TACE基因的mRNA具有實(shí)質(zhì)互補(bǔ)性的核苷酸序列，從而siRNA分子通過RNA干擾指導(dǎo)mRNA的切割。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)的眼狀況的方法，其中該方法包括對受試者施用組合物，該組合物包含通過RNA干擾下調(diào)TNFR1基因表達(dá)的雙鏈siRNA，其中該siRNA分子的每條鏈獨(dú)立地為約19到約27個核苷酸長度；siRNA分子的一條鏈包含與對應(yīng)于TNFR1基因的mRNA具有實(shí)質(zhì)互補(bǔ)性的核苷酸序列，從而siRNA分子通過RNA干擾指導(dǎo)mRNA的切割。另一實(shí)施方案是減弱受試者中TACEmRNA的表達(dá)的方法，其包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的單鏈干擾RNA和可藥用載體。所述單鏈干擾RNA具有19到49個核苷酸的長度并且在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、卯O、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、152595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337，并且該干擾RNA具有與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。從而減弱TACEmRNA的表達(dá)。作為進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明包括包含干擾RNA和可藥用載體的組合物，該干擾RNA具有19到49個核苷酸長度，并且包含對應(yīng)于SEQIDNO:3、SEQIDNO:14-SEQIDNO:58和SEQIDNO:155-SEQIDNO:201的任一個或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。作為進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明包括包含干擾RNA和可藥用載體的組合物，該干擾RNA基本上由對應(yīng)于SEQIDNO:59-SEQIDNO:69、SEQIDNO:71-SEQIDNO:92和SEQIDNO:94國SEQIDNO:154任一個的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。如本文所述的任一實(shí)施方案在制備減弱TACEmRNA或者TNFR1mRNA表達(dá)的藥物中的用途作為減弱TNFa活性和從而治療如本文所述的TNFa相關(guān)狀況的方法也是本發(fā)明的實(shí)施方案。附圖簡述為了得到本發(fā)明的上面引用的和其他優(yōu)點(diǎn)和目標(biāo)的方式，通過參考本發(fā)明的特定實(shí)施方案將使得可以更具體地描述上面簡述的本發(fā)明，所述實(shí)施方案在附圖中闡明。理解這些附圖僅僅簡述了本發(fā)明的典型實(shí)施方案并且因此不被認(rèn)為是限制其范圍，將通過使用附圖以額外的特異性和細(xì)節(jié)描述本發(fā)明，其中圖l提供了用TNFR1siRNAs弁l、弁2、弁3和弁4、和無RISC的對照siRNA(每種10nM、lnM，和0.1nM);10nM的非尋恕對照siRNA(NTC2);和緩沖液對照(-siRNA)轉(zhuǎn)染的GTM-3細(xì)胞的TNFR1蛋白質(zhì)印跡。箭頭指出55-kDaTNFR1和42-kDa肌動蛋白帶的位置。發(fā)明詳述些提供示例性步驟或其他補(bǔ)充細(xì)節(jié)的程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員按照本公開將明白可以做出本文公開的實(shí)施方案的明顯修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。按照本公開，可以不用過度實(shí)驗(yàn)就做出和實(shí)施本文公開的所有實(shí)施方案。本發(fā)明的完整范圍在本公開和其等同實(shí)施方案中給出。不應(yīng)將說明書理解為過度限制本發(fā)明應(yīng)有的完整保護(hù)范圍。施方案并且被給出是為了提供據(jù)認(rèn)為對于本發(fā)明的多種實(shí)施方案的原理和概念方面的描述是最有用和容易理解的。在這方面，不試圖顯示除了本發(fā)明的基本理解所必要的之外的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，說明書以及附圖和/或?qū)嵭问绞秋@而易見的下面的定義和解釋意在控制任何將來的構(gòu)造，除非在下面的實(shí)施例中清楚而明確地纟務(wù)飾或者當(dāng)含義的應(yīng)用使得任何構(gòu)造無意義或者基本上無意義時。在術(shù)語的構(gòu)造將使得它無意義或者基本上無意義的情況下，該定義應(yīng)該來自Webster'sDictionary(第三版)。如本文所用，除非另外指出，所有百分比都按重量百分比計(jì)。如本文所用和除非另外指出，術(shù)語"一個"意指"一個"、"至少一個"或"一個或多個"。術(shù)語"干眼"，也稱作干性結(jié)膜炎或干燥性角結(jié)膜炎，是常見的眼科病癥，涉及眼前淚膜的破裂，導(dǎo)致眼的暴露的外表面脫水。如本文所用，術(shù)語"眼炎癥"包括例如虹膜炎、眼色素層炎、鞏膜外層炎、鞏膜炎、角膜炎、眼內(nèi)炎、眼瞼炎和醫(yī)源性炎性狀況。如本文所用，術(shù)語"變應(yīng)性結(jié)膜炎"指結(jié)膜的炎癥，結(jié)膜是沿著眼瞼排列并覆蓋鞏膜的暴露表面的精細(xì)的膜。術(shù)語"變應(yīng)性結(jié)膜炎"包括例如特應(yīng)性角結(jié)膜炎、巨乳頭狀結(jié)膜炎、枯草熱性結(jié)膜炎、常年性變應(yīng)性結(jié)膜炎和春季角結(jié)膜炎。如本文所用，術(shù)語"皮炎"指皮膚的炎癥并且包括例如變應(yīng)性接觸性皮炎、蕁麻疹、皮脂缺乏性皮炎(小腿上干性皮膚)、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎(包括刺激性接觸性皮炎和漆酚誘導(dǎo)的接觸性皮炎)、濕滲、重力性皮炎、錢幣狀皮炎、外耳炎、口周皮炎和脂溢性皮炎。如本文所用，術(shù)語"鼻炎"指鼻粘膜的炎癥并且包括例如變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性鼻炎、刺激性鼻炎、嗜酸細(xì)胞性非變應(yīng)性鼻炎、藥物性鼻炎和嗜中性粒細(xì)胞鼻鼻竇炎。如本文所用，術(shù)語"譯喘"指呼吸道炎癥，導(dǎo)致將空氣從鼻子和嘴向肺運(yùn)輸?shù)暮粑廓M窄并且包括例如，變應(yīng)性哞喘、特應(yīng)性譯喘、特應(yīng)性支氣管IgE介導(dǎo)的哞喘、支氣管哮喘、bronchiolytis、肺氣腫性哞喘、特發(fā)性嗜喘、運(yùn)動性哮喘、環(huán)境因子引起的外源性哮喘、初期哮喘、病例生理紊亂引起的內(nèi)源性津喘、非變應(yīng)性哮喘、非特應(yīng)性哞喘、和喘鳴嬰兒綜合征。短語"與對應(yīng)于(序列標(biāo)識符)任一個的mRNA的3，末端的倒數(shù)第二位13個核苷酸有至少卯％序列互補(bǔ)性或至少90%序列同一性的至少13個連續(xù)核香酸的區(qū)域"允許一個核苷酸替代。在該短語中不包括兩個核苷酸替代(即,11/13=85%同一性/互補(bǔ)性)。術(shù)語"百分比同一性，，描述第一個核酸分子中與第二個核酸分子中相同長度的一組連續(xù)核苷酸相同的連續(xù)核苷酸的百分比。術(shù)語"百分比互補(bǔ)性，，描述第一個核酸分子中可以與第二個核酸分子中一組連續(xù)核苷酸在沃森-克里克意義上堿基配對的連續(xù)核苷酸的百分比。如本文所用，術(shù)語"雜交"指具有互補(bǔ)或接近互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸相互作用形成稱作雜交分子的氫鍵結(jié)合的復(fù)合體的過程。雜交反應(yīng)是靈敏的和選擇性的。在體外，雜交的特異性(即，嚴(yán)格性)通過例如預(yù)雜交或雜交溶液中鹽或甲酰胺的濃度，和通過雜交溫度控制；此類步驟是本領(lǐng)域公知的。具體地，通過降低鹽濃度、增加甲酰胺濃度或者升高雜交溫度增加嚴(yán)格性。例如，可以在約50%甲酰胺、37。C到42。C下發(fā)生高嚴(yán)格條件。可以在約35%到25%甲酰胺、3(TC到35。C的條件下發(fā)生降低的嚴(yán)格性條件。雜交的嚴(yán)格性條件的實(shí)例在Sambrook，J.，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y中提供。嚴(yán)格雜交條件的其他實(shí)例包括400mMNaCl，40mMPIPESpH6.4，1mMEDTA，50C或70C下12-16小時接著洗滌，或者在70。C下1XSSC中或者50。C下1XSSC，50%甲酰胺中雜交，接著在0.3XSSC中70。C下洗滌，或者在4XSSC中70。C下或者4XSSC，50%甲酰胺中50。C下雜交，接著在67。C下1XSSC中洗滌。雜交溫度比雜交分子的解鏈溫度(Tm)低5-l(TC，其中對于長度為19到49個堿基對的雜交分子，使用下面的計(jì)算確定Tm:Tm°C=81.5+16.6(log10[Na+l)+0.41(%G+C)-(600/N)，其中N是雜交分子中堿基數(shù)目，[Na+I是雜交緩沖液中鈉離子濃度。除非另外指出，本文引用的核酸序列以5，到3，的方向書寫。如本文所用的術(shù)語"核酸"指DNA或RNA或其修飾形式，其包含DNA中存在的嘌呤或嘧啶(腺噪呤"A"、胞嘧啶"C"、鳥噤呤"G"、胸腺嘧啶"T")或者RNA中的噪呤或嘧啶(腺噤呤"A"、胞嘧啶"C"、鳥噪呤"G"、尿嘧啶"U")。本文提供的干擾RNA可以包含"T"堿基，尤其在3，末端，盡管"T"堿基通常不在RNA中存在。"核酸"包括術(shù)語"寡核苷酸，，和"多核苷酸"并且可以指單鏈分子或雙鏈分子。雙鏈分子通過A和T堿基、C和G堿基，和A和U堿基之間的沃森-克里克堿基配對形成。雙鏈分子的鏈可以相互部分、基本上或者完全互補(bǔ)并且將形成雙鏈體雜交分子，其成鍵強(qiáng)度取決于堿基序列互補(bǔ)性的性質(zhì)和程度。mRNA序列可以從對應(yīng)DNA序列的序列容易地推導(dǎo)。例如，SEQIDNO:l提供了對應(yīng)于TACE的mRNA的DNA的有義鏈序列。mRNA序列與DNA有義鏈相同，只是以"U"堿基代替"T，，堿基。因此，TACE的mRNA從SEQIDNO:1知道并且TNFR1的mRNA從SEQIDNO:2知道。RNA干擾(RNAi)是用雙鏈RNA(dsRNA)沉默基因表達(dá)的一種過程。不希望^皮理論束縳，RNAi以RNA酶III樣酶切丁酶將較長dsRNA切割成小的干擾RNA(siRNA)開始。siRNA是dsRNA,其長度通常為約19到28個核苷酸，或者20到25個核苷酸，或者21到22個核苷酸，并且通常含有2個核苷酸的3，突出端，和5，磷酸和3，羥基末端。siRNA的一條鏈摻入到稱作RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)的核糖核蛋白復(fù)合物。RISC使用該siRNA鏈鑒定與摻入的siRNA鏈至少部分互補(bǔ)的mRNA分子，然后切割這些耙mRNA或者抑制它們的翻譯。因此，摻入RISC的siRNA鏈被稱作引導(dǎo)鏈或者反義鏈。另一siRNA鏈稱作過客鏈或者有義鏈，被從siRNA清除并且與靶標(biāo)mRNA至少部分同源。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到siRNA的任一鏈可以摻入到RISC中并且作為引導(dǎo)鏈發(fā)揮功能。然而，siRNA設(shè)計(jì)(例如，在希望的引導(dǎo)鏈的5'末端的降低的siRNA雙鏈體穩(wěn)定性)可以有利于希望的引導(dǎo)鏈摻入到RISC中。具有與引導(dǎo)鏈至少部分互補(bǔ)的序列的mRNA的RISC介導(dǎo)的切割導(dǎo)致該mRNA和該mRNA編碼的對應(yīng)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平的降低。備選地，RISC也可以通過翻譯阻抑降低對應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)而不切割乾標(biāo)mRNA。其他RNA分子和RNA樣分子也可以與RISC和沉默基因表達(dá)相互作用。單鏈siRNA、微小RNA(miRNA)和切丁酶底物27聚體雙鏈體。除非另外指出，如本文所用的術(shù)語"siRNA"指雙鏈干擾RNA。可以與RISC相互作用的RNA樣分子的實(shí)例包括含有一個或多個化學(xué)修飾的核苷酸、一個或多個脫氧核糖核苷酸，和/或一個或多個非磷酸二酯鍵的RNA分子。為了本討論的目的，將可以與RISC相互作用并且參與基因表達(dá)中RISC介導(dǎo)的改變的所有RNA和RNA樣分子都稱作"干擾RNA"。因此，siRNA、shRNA、miRNA和切丁酶底物27聚體雙鏈體是"干擾RNA，，的子集。本發(fā)明實(shí)施方案的干擾RNA對于靶標(biāo)mRNA的切割似乎以催化的方式作用，即，干擾RNA能夠以亞化學(xué)計(jì)量的量實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)mRNA的抑制。與反義療法相比，需要顯著較少的干擾RNA來在此類切割條件下提供治療效果。本發(fā)明涉及干擾RNA用于抑制TNFa細(xì)月包表面受體TNF受體-20l(TNFRl)或TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17，在這里稱作"TACE")的表達(dá)的用途，所述酶的抑制降低了腫瘤壞死因子a(TNFa)的活性。TNFa與其細(xì)胞表面受體TNF受體-1(TNFR1)的結(jié)合激活了信號級聯(lián)，該信號級聯(lián)影響多種細(xì)胞應(yīng)答，包括細(xì)胞凋亡和炎癥。TNFa自身最初作為無活性的膜結(jié)合的前體表達(dá)?；钚孕问降腡NFa從細(xì)胞表面的釋放需要TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17)對該前體的蛋白酶解加工，TNFa轉(zhuǎn)化酶是"A解聚素和金屬蛋白酶"(ADAM)家族的成員。根據(jù)本發(fā)明，抑制TNFR1mRNA、TACEmRNA或TNFR1和TACEmRNA兩者的表達(dá)有效降低了TNFa的作用。此外，外源性提供或內(nèi)源表達(dá)的如本文給出的干擾RNA在沉默TNFR1mRNA或TACEmRNA中尤其有效。肺瘤壞死因子a轉(zhuǎn)化酶mRNA(TACE/ADAM17):GenBank數(shù)據(jù)庫以檢索號NM—003183提供了TACE的DNA序列，在"序列表"中以SEQIDNO:l提供。SEQIDNO:l提供了對應(yīng)于編碼TACE的mRNA的DNA的有義鏈序列(只是用"T"堿基代替"U"堿基)。TACE的編碼序列來自核苦酸184-2658。上面引用的TACEmRNA的等同方案是其選棒性剪接形式、等位基因形式、同工酶或者同源物(cognate)。同源物是來自另一哺乳動物物種的腫瘤壞死因子a轉(zhuǎn)化酶，其與SEQIDNO:l同源(即，直向同源物)。肺瘤壞死因子受體-1mRNA(TNFRl):GenBank數(shù)據(jù)庫以檢索號NM—001065提供了TNFRl的DNA序歹'J，在"序列表"中以SEQIDNO:2提供。SEQIDNO:2提供了對應(yīng)于編碼TNFRl的mRNA的DNA的有義鏈序列(只是用"T"堿基代替"U"堿基)。TNFRl的編碼序列來自核苷酸282-1649。上面引用的TNFRlmRNA序列的等同方案是其選擇性剪接形式、等位基因形式、同工酶或者同源物(cognate)。同源物是來自另一哺乳動物物種的腫瘤壞死因子受體-1mRNA，其與SEQIDNO:2同源(即，直向同源物)。減弱mRNA的表達(dá)如本文所用的術(shù)語"減弱mRNA的表達(dá)"指施用或表達(dá)一定量的干擾RNA(例如，siRNA)以減少耙標(biāo)mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯，盡管通過mRNA切割或者通過翻譯的直接抑制。靶標(biāo)mRNA或者對應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)的減少通常被稱作"擊倒"并且相對于施用或表達(dá)非尋靶對照RNA(即，非尋靶對照siRNA)后存在的水平報告。本文的實(shí)施方案設(shè)想包括和50%到100%之間的量的表達(dá)擊倒(knockdown)。然而，不必為了本發(fā)明的目的實(shí)現(xiàn)此類擊倒水平。在一個實(shí)施方案中，施用靶定TACEmRNA或TNFRlmRNA的單一干擾RNA。在其他實(shí)施方案中，施用革巴定TACEmRNA或TNFR1mRNA的兩種或多種干擾RNA。在其他實(shí)施方案中，組合或以一定的時間間隔施用草巴定TACEmRNA和TNFR1mRNA每一種的干擾RNA以具有重疊效果。通常通過用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)擴(kuò)增測量mRNA水平或者通過蛋白質(zhì)印跡或者酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測量蛋白質(zhì)水平來評估擊倒。分析蛋白質(zhì)水平提供了mRNA切割以及翻譯抑制的評估。用于測量擊倒的其他技術(shù)包括RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、northern雜交、用微陣列進(jìn)行基因表達(dá)監(jiān)測、抗體結(jié)合、放射免疫測定法，和熒光激活的細(xì)胞分析。例如，如下文所述轉(zhuǎn)染TACE或TNFR1干擾RNA后，通過在體外評估人角膜上皮細(xì)胞中的目標(biāo)mRNA水平或者目標(biāo)蛋白水平，也可以確定TACE或TNFR1的抑制。通過觀察TNFa相關(guān)狀況癥狀的改善，如與干眼、變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼炎癥、皮炎、鼻炎或津喘的癥狀的改善，也在人或者哺乳動物中推斷出由于TACEmRNA表達(dá)或者TNFR1mRNA表達(dá)的抑制引起的TNFa活性的抑制。例如，干眼癥狀、水腫、瘙癢、炎癥或者對環(huán)境^t兆戰(zhàn)的耐受性的任一種的改善表明TNFa活性的抑制。干擾RNA:在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，干擾RNA(例如，siRNA)具有有義鏈和反義鏈，并且有義鏈和反義鏈包含至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，干擾RNA(例如，siRNA)具有有義鏈和反義鏈，并且反義鏈包含與TACEmRNA或TNFR1mRNA的^序列的至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域，有義鏈包含與TACEmRNA或TNFR1mRNA的靼序列具有至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)同一性的區(qū)域。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，干擾RNA包含分別與mRNA內(nèi)的對應(yīng)的靶序列的3，末端倒數(shù)第二位的13、14、15、16、17或18個核苷酸具有一定百分比的序列互補(bǔ)性或者一定百分比的序列同一性的至少13、14、15、16、17或18個連續(xù)核苷酸的區(qū)域。干擾RNA的每條鏈的長度包含19到49個核普酸，并且可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸長度。siRNA的反義鏈?zhǔn)莝iRNA的活性引導(dǎo)劑，因?yàn)榉戳x鏈摻入到RISC中，從而允許RISC鑒定與該反義siRNA至少部分互補(bǔ)的革巴標(biāo)mRNA用于切割或翻譯抑制。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用可利用的設(shè)計(jì)工具選擇靶標(biāo)mRNA序列內(nèi)的干擾RNA靶序列(例如，siRNA靶序列)。然后通過轉(zhuǎn)染表達(dá)耙mRNA的細(xì)胞，接著如上述評估擊倒，來測試對應(yīng)于TACE或TNFR1耙序列的千擾RNA。選擇siRNA的耙序列的技術(shù)由Tuschl，T.等人，"ThesiRNAUserGuide,"(2004年5月6日修訂，可以在RockefellerUniversity網(wǎng)站獲取)；技術(shù)/>才艮#506，"siRNADesignGuidelines,"AmbionInc(Ambion的網(wǎng)站)；和其4也基于網(wǎng)頁的^殳計(jì)工具，例長口在Invitrogen、Dharmacon、IntegratedDNATechnologies,Genscript或Proligo提供。最初的搜索參數(shù)可以包括35%到55%之間的G/C含量和19到27個核苷酸的siRNA長度。靶序列可以位于mRNA的編碼區(qū)或者5，或3'非翻譯區(qū)中。TACEmRNA的19個核苦酸的DNA粑序列的實(shí)施方案在SEQIDNO:l的核苷酸297到315中給出5'-GCTCTCAGACTACGATATT-3'SEQIDNO:3本發(fā)明的靶定SEQIDNO:3的對應(yīng)的mRNA序列并且具有21個核苷酸鏈和2個核苷酸的3，突出端的siRNA是5，-GCUCUCAGACUACGAUAUUNN-3'SEQIDNO:43'-NNCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5'SEQIDNO:5。每個"N"可以是任何核苷酸(A、C、G、U、T)或者纟務(wù)飾的核苷酸。3，末端可以具有許多"N"殘基，包括l、2、3、4、5和6個。在任一鏈上的"N"殘基可以是相同的殘基(例如，UU、AA、CC、GG或TT)或它們可以是不同的(例如，AC、AG、AU、CA、CG、CU、GA、GC、GU、UA、UC或UG)。3，突出端可以是相同的或者它們可以是不同的。在一個實(shí)施方案中，兩條鏈都具有3，UU突出端。本發(fā)明的靶定SEQIDNO:3的對應(yīng)的mRNA序列并且具有21個核苷酸鏈和3'UU突出端的siRNA是5'-GCUOJCAGACUACGAUAUUUU-3'SEQIDNO:63'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5'SEQIDNO:7干擾RNA也可以具有5'突出端核苷酸或者它可以具有平末端。本發(fā)明的靶定SEQIDNO:3的對應(yīng)的mRNA序列并且具有19個核普酸鏈和平末端的siRNA是5'-GCUCUCAGACUACGAUAUU-3'SEQ工DNO:83'-CGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5'SEQ工DNO:9雙鏈干擾RNA(例如，siRNA)的鏈可以連接以形成發(fā)夾或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，shRNA)。本發(fā)明的革S定SEQIDNO:3的對應(yīng)的mRNA序列并且具有19bp雙鏈莖環(huán)區(qū)和3，UU突出端的shRNA是說明書第16/36頁SEQIDNO:10N是核苷酸A、T、C、G、U，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修飾形式。環(huán)中核苷酸N的數(shù)目是3到23、或5到15、或7到13、或4到9、或9到ll之間并且包括端點(diǎn)的數(shù)字，或者核苷酸的數(shù)目是9。環(huán)中一些核苷酸可以參與與環(huán)中其他核苷酸的堿基對相互作用。可以用于形成環(huán)的寡核苦酸序列的實(shí)例包括5，-UUCAAGAGA-3，(Brummelkamp，T.R等人(2002)Science296:550)和5，-UUUGUGUAG-3，(Castanotto,D.等人(2002)RNA8:1454)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到所得的單鏈寡核苷酸形成莖環(huán)或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其包含能夠與RNAi機(jī)器相互作用的雙鏈區(qū)。上面鑒定的siRNA靶序列可以在3，末端延伸以方便切丁酶底物27聚體雙鏈體的設(shè)計(jì)。在TACEDNA序列(SEQIDNO:l)中鑒定的19個核苷酸的DNA靶序列(SEQIDNO:3)延伸6個核苷酸產(chǎn)生了存在于SEQIDNO:l的核普酸297到321的25個核苷酸的DNA靶序列5'-GCTCTCAGACTACGATATTCTCTCT-3'SEQIDNO:11用于靶定SEQIDNO:ll的對應(yīng)的mRNA序列的本發(fā)明的切丁酶底物27聚體雙鏈體為5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUCUCUCU-3，SEQIDNO:123'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAAGAGAGA-5'SEQIDNO:13有義鏈的3'末端的兩個核苷酸(即，SEQIDNO:12的CU核苷酸)可以是用于增強(qiáng)的加工的脫氧核苷酸。如本文提供的切丁酶底物27聚體雙鏈體從19-21個核香酸靶序列的"i殳計(jì)由IntegratedDNATechnologies(IDT)網(wǎng)站和Kim,D,H.等人(February，2005)NatureBiotechnology23:2;222-226進(jìn)一步討論。當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生干擾RNA時，在一條或兩條鏈的5'末端核苷酸的5'位的磷酸化(當(dāng)存在時)可以增強(qiáng)siRNA功效和結(jié)合的RISC復(fù)合體的特異性，但是不是所需的，因?yàn)榭梢栽诩?xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化。表1列出了SEQIDNO:l的TACEDNA靶序列的實(shí)例，從所述耙序列以上述方式設(shè)計(jì)本發(fā)明的siRNA。TACE編碼如上面提到的腫瘤壞死因子a轉(zhuǎn)化酶。表1.用于siRNA的TACE革巴序列<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表2列出了SEQIDNO:2的TNFRlDNA靶序列的實(shí)例，從所述耙序列以上述方式設(shè)計(jì)本發(fā)明的siRNA。TNFRl編碼如上面提到的腫瘤壞死因子a受體-l。表2.用于siRNA的TNFRl粑序列<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>如上面實(shí)施例中引用的，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用表1或2中提供的革巴序列信息并且通過參考SEQIDNO:l或SEQIDNO:2中的序列位置和加入或缺失分別與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2互補(bǔ)或者接近互補(bǔ)的核普酸序列能夠設(shè)計(jì)具有比表中提供的序列更長或更短長度的干擾RNA。通過siRNA和其他形式的千擾RNA引導(dǎo)的靶標(biāo)RNA切割反應(yīng)是高度序列特異性的。通常，含有序列與靶標(biāo)mRNA的部分相同的有義核苷酸鏈和與靶標(biāo)mRNA的部分精確互補(bǔ)的反義核苷酸鏈的siRNA是用于抑制本文引用的mRNA的siRNA實(shí)施方案。然而，反義siRNA鏈和耙標(biāo)mRNA之間或者反義siRNA鏈和有義siRNA鏈之間100%序列互補(bǔ)性不是實(shí)施本發(fā)明所需的。從而，例如，本發(fā)明允許序列變異，其可以預(yù)期是由于遺傳突變、菌林多態(tài)性或者進(jìn)化趨異。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，siRNA的反義鏈具有與靶標(biāo)mRNA至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的至少19個核苷酸。如本文所用的，"接近完全"指siRNA的反義鏈與靶標(biāo)mRNA的至少部分"基本上互補(bǔ)"并且siRNA的有義鏈與靶標(biāo)mRNA的至少部分"基本上同一"。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的"同一性"是如通過匹配序列之間核苷酸的順序和同一性確定的核苷酸序列之間的序列相關(guān)性程度。在一個實(shí)施方案中，與靶標(biāo)mRNA序列具有80%和80到100%互補(bǔ)性，例如85%、90%或95%互補(bǔ)性的siRNA的反義鏈^i人為是接近完全互補(bǔ)并且可以用于本發(fā)明中。"完全"連續(xù)互補(bǔ)性是相鄰堿基對的標(biāo)準(zhǔn)沃森-克里克堿基配對。"至少接近完全，，連續(xù)互補(bǔ)性包括如本文所用的"完全"互補(bǔ)性。設(shè)計(jì)用于確定同一性或互補(bǔ)性的計(jì)算機(jī)方法以鑒定核苷酸序列的最大的匹配程度，例如，BLASTN(Altschul,S.F"等人(19卯)J.Mol.Bio1.215:403-410)。靶標(biāo)mRNA(有義鏈)和siRNA的一條鏈(有義鏈)之間的關(guān)系是同一性關(guān)系。將siRNA的有義鏈也稱作過客鏈(如果存在)。靶標(biāo)mRNA(有義鏈)和siRNA的另一條鏈(反義鏈)之間的關(guān)系是互補(bǔ)性關(guān)系。將siRNA的反義鏈也稱作引導(dǎo)鏈。以5，到3，方向書寫的核酸序列中倒數(shù)第二位堿基是與最后一個堿基相鄰的堿基，即3，堿基相鄰的堿基。以5，到3，方向書寫的核酸序列的倒數(shù)第二位13個堿基是與3'堿基相鄰的最后13個堿基的序列并且不包括3，堿基。類似地，以5，到3，方向書寫的核酸序列的倒數(shù)第二位的14、15、16、17、或18個堿基是分別與3'堿基相鄰的最后14、15、16、17、或18個堿基并且不包括3，堿基。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，連續(xù)核苷酸區(qū)是至少13個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，其與對應(yīng)于每種序列標(biāo)識符標(biāo)識的序列的mRNA的3，末端的倒數(shù)第二位13個核苷酸有至少90%序列互補(bǔ)性或者至少90%序列同一性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，連續(xù)核苷酸區(qū)域是與對應(yīng)于每個所述序列標(biāo)識符鑒定的序列的mRNA的3，末端倒數(shù)第二位14個核苷酸具有至少85%序列互補(bǔ)性或者至少85%序列同一性的至少14個連續(xù)核苷酸的區(qū)域。在這種短語中包括兩個核苷酸替代(即，12/14=86%同一性/互補(bǔ)性)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，連續(xù)核苦酸的區(qū)域是與對應(yīng)于序列標(biāo)識符鑒定的序列的mRNA的3，末端倒數(shù)第二位14個核苷酸具有至少80%序列互補(bǔ)性或者至少80%序列同一性的至少15、16、17或18個連續(xù)核苷酸的區(qū)域。在這種短語中包括三個核苷酸替代。對應(yīng)于SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的mRNA中的輩巴序列可以在mRNA的5，或3'非翻譯區(qū)中或者mRNA的編碼區(qū)中。雙鏈干擾RNA的一條或兩條鏈可以具有1到6個核苷酸的3，突出端，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸或者其混合物。突出端的核苷酸不是堿基配對的。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，干擾RNA包含TT或UU的3，突出端。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，干擾RNA包含至少一個平末端。末端通常具有5，磷酸基團(tuán)或者3，羥基基團(tuán)。在其他實(shí)施方案中，反義鏈具有5，磷酸基團(tuán)，有義鏈具有5，羥基基團(tuán)。在其他實(shí)施方案中，通過共價加入其他分子或官能團(tuán)進(jìn)一步修飾末端。雙鏈siRNA的有義和反義鏈可以為如上述的兩個單鏈的雙鏈體形式或者可以是單個分子，其中互補(bǔ)性區(qū)域是堿基配對的并且通過發(fā)夾環(huán)共價連接，從而形成單鏈。認(rèn)為發(fā)夾通過稱作切丁酶的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)切割，形成兩個單獨(dú)堿基配對的RNA分子的干擾RNA。干擾RNA可以通過加入、缺失、替代或〗務(wù)飾一個或多個核苷酸而與天然存在的RNA不同。非核苷酸材料可以結(jié)合到干擾RNA的5，末端、3，末端或者內(nèi)部。通常設(shè)計(jì)此類修飾以增加干擾RNA的核酸酶抗性，提高細(xì)胞攝入，增強(qiáng)細(xì)胞尋靶，幫助示蹤千擾RNA，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性，或者降低干擾素途徑活化的潛力。例如，干擾RNA可以在突出端的末端包含嘌呤核苷酸。通過例如吡咯烷接頭將膽固醇綴合到siRNA分子的有義鏈的3'末端為siRNA提供了穩(wěn)定性。其他修飾包括例如3，末端生物素分子、已知具有細(xì)胞穿透性質(zhì)的肽、納米顆粒、肽模擬物、熒光染料，或者樹狀聚體。核苷酸可以在它們的堿基部分、在它們的糖部分、或者在該分子的磷酸部分被修飾并且在本發(fā)明的實(shí)施方案中發(fā)揮功能。修飾包括例如用烷基、烷氧基、氨基、脫氮雜、囟素、羥基、硫羥基或者其組合取代。核苷酸可以用具有更大穩(wěn)定性的類似物取代，如用脫氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸，或者具有糖修飾，如用2，氨基、2'0-曱基、2，曱氧基乙基，或者2，-0，4，-C亞曱基橋取代2'OH基團(tuán)。核苷酸的嘌呤或嘧啶類似物的實(shí)例包括黃噤呤、次黃噤呤、氮雜噤呤、甲基^5充代腺嘌呤、7-脫氮雜-腺苷和O-和N-〗務(wù)飾的核苷酸。可以用氮或者疏(硫代磷酸酯)取代磷酸基團(tuán)的一個或多個氧來修飾核普酸的磷酸基團(tuán)。修飾可用于例如增強(qiáng)功能、提高穩(wěn)定性或通透性，或者指導(dǎo)定位或?qū)ぐ小？梢源嬖诓慌cSEQIDNO:l或SEQIDNO:2的部分互補(bǔ)的反義干擾RNA鏈的一個或多個區(qū)域。非互補(bǔ)區(qū)可以在互補(bǔ)區(qū)的3，或5，端或兩端或者在兩個互補(bǔ)區(qū)之間。干擾RNA可以通過化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或用切丁酶或具有相似活性的另一合適的核酸酶切割較長的雙鏈RNA外源地產(chǎn)生。使用常規(guī)的DNA/RNA合成儀從受保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺產(chǎn)生的化學(xué)合成的干擾RNA可以從供應(yīng)商如AmbionInc.(Austin,TX)、Invitrogen(Carlsbad,CA)，或Dharmacon(Lafayette,CO)得到。通過例如用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、層析或者其組合純化干擾RNA。備選地，干擾RNA可以進(jìn)行很少的純化(如果使用)以避免由于樣品處理導(dǎo)致的損失。干擾RNA也可以從質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體或者從最小的表達(dá)盒內(nèi)源地表達(dá)，所述表達(dá)盒為例如，PCR產(chǎn)生的片段，其包含一個或多個啟動子和干擾RNA的一個或多個合適的模板。用于shRNA的通過商業(yè)途徑可獲得的基于質(zhì)粒的表達(dá)載體的實(shí)例包括pSilencer系列的成員(Ambion，Austin,TX)和pCpG-siRNA(InvivoGen，SanDiego，CA)。用于表達(dá)干擾RNA的病毒載體可以從多種病毒得到，包括腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒(例如，HIV、FIV和EIAV)，和泡滲病毒。用于shRNA表達(dá)的通過商業(yè)途徑可獲得的病毒載體的實(shí)例包括pSilenceradeno(Ambion，Austin,TX)和pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST(Invitrogen，Carlsbad,CA)。病毒載體的選擇、從載體表達(dá)干擾RNA的方法和遞送病毒載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)的。用于產(chǎn)生PCR產(chǎn)生的shRNA表達(dá)盒的試劑盒的實(shí)例包括SilencerExpress(Ambion,Austin,TX)和siXpress(Minis,Madison,WI)?？梢酝ㄟ^從能夠表達(dá)第一種干擾RNA的第一種表達(dá)載體體內(nèi)表達(dá)施用第一種干擾RNA，并且可以通過從能夠表達(dá)第二種干擾RNA的第二種表達(dá)載體體內(nèi)表達(dá)施用第二種干擾RNA，或者可以通過從能夠表達(dá)兩種干擾RNA的單個表達(dá)載體體內(nèi)表達(dá)施用兩種干擾RNA。動子包4舌po1III啟動子，如U6或H1啟動子，或者polII啟動子，如巨細(xì)胞病毒啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以改造這些啟動子以允許可誘導(dǎo)地表達(dá)干擾RNA。在生理?xiàng)l件下雜交在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，干擾RNA的反義鏈作為RISC復(fù)合體的部分在體內(nèi)與mRNA雜交。例如，可以在約50%甲酰胺、37。C到42。C下發(fā)生高嚴(yán)格條件。可以在約35%到25%甲酰胺、30。C到35。C的條件下發(fā)生降低的嚴(yán)格性條件。雜交的嚴(yán)格性條件的實(shí)例在Sambrook，J.，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y中提供。嚴(yán)格雜交條件的其他實(shí)例包括400mMNaCl,40mMPIPESpH6.4，1mMEDTA,50。C或70。C下12一16小時接著洗滌，或者在70。C下1XSSC中或者50。C下1XSSC,50%曱酰胺中雜交，接著在0.3XSSC中70。C下洗滌，或者在4XSSC中70。C下或者4XSSC,50%甲酰胺中50。C下雜交，接著在67。C下1XSSC中洗滌。雜交溫度比雜交分子的解鏈溫度(Tm)低5-10°C，其中對于長度為19到49個堿基對的雜交分子，使用下面的計(jì)算確定Tm:Tm°C=81.5+16.6(log1()[Na+)+0.41(%G+C)-(600/N)，其中N是雜交分子中堿基數(shù)目，[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子濃度。上述體外雜交測定法提供了預(yù)測候選siRNA和耙標(biāo)之間的結(jié)合是否將具有特異性的方法。然而，在RISC復(fù)合物的背景中，用在體外雜交不表現(xiàn)出高嚴(yán)格性的反義鏈也可以發(fā)生對靶標(biāo)的特異切割。單鏈干擾RNA:如上面引用的，干擾RNA最終作為單鏈發(fā)揮功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單鏈(ss)千擾RNA實(shí)現(xiàn)mRNA沉默，盡管效率比雙鏈siRNA的低。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案也提供了ss干擾RNA的施用，所述ss干擾RNA在生理?xiàng)l件下與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的一部分雜交并且具有分別與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的至少19個核普酸的區(qū)域。與上面引用的ds干擾RNA—樣，表l或表2的ss干擾RNA具有19到49個核苷酸的長度。ss千擾RNA具有5，磷酸或者在5'位置原位或體內(nèi)磷酸化。術(shù)語"5，磷酸化的"用于描述例如多核苷酸或寡核苷酸，其具有通過酯鍵連接到該多核苷酸或寡核苷酸的5，末端的糖(例如，核糖、脫氧核糖或者它們的類似物)的C5羥基。與ds干擾RNA—樣，ss干擾RNA通過化學(xué)合成或者通過體外轉(zhuǎn)錄或者從載體或表達(dá)盒內(nèi)源表達(dá)。5'磷酸基團(tuán)可以通過激酶加入，或者5，磷酸可以是RNA的核酸酶切割的結(jié)果。遞送與ds干擾RNA—樣。在一個實(shí)施方案中，施用具有受保護(hù)的末端和核酸酶抗性修飾的ss干擾RNA用于沉默?？梢詫s干擾RNA干燥用于保存或者溶解在水性溶液中。溶液可以含有緩沖劑或鹽以抑制退火或用于穩(wěn)定。與ds千擾RNA—樣，ss干擾RNA通過化學(xué)合成或者通過體外轉(zhuǎn)錄或者從載體或表達(dá)盒內(nèi)源表達(dá)。5，磷酸基團(tuán)可以通過激酶加入，或者5，磷酸可以是RNA的核酸酶切割的結(jié)果。遞送與ds干擾RNA—樣。在一個實(shí)施方案中，施用具有受保護(hù)的末端和核酸酶抗性修飾的ss干擾RNA用于沉默?？梢詫s干擾RNA干燥用于保存或者溶解在水性溶液中。溶液可以含有緩沖劑或鹽以抑制退火或用于穩(wěn)定。發(fā)夾干擾RNA:發(fā)夾干擾RNA是單個分子(例如，單個寡核苷酸鏈)，其在莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(例如，shRNA)中包含干擾RNA的有義鏈和反義鏈。例如，shRNA可以從DNA載體表達(dá)，所述載體中，編碼有義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸通過短的間隔區(qū)連接到編碼反向互補(bǔ)的反義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸。如果選擇的表達(dá)載體需要，那么可以加入3，末端T和形成限制性位點(diǎn)的核苷酸。所得的RNA轉(zhuǎn)錄物自身向后折疊形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。施用方式例如，可以通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)鼻、眼、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或者經(jīng)皮施用遞送干擾RNA?？梢酝ㄟ^眼組織施用，如眼周、結(jié)膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房內(nèi)(intracameral)、玻璃體內(nèi)、目艮內(nèi)、視網(wǎng)膜下、結(jié)膜下、眼球后、小管內(nèi)或脈絡(luò)膜上；通過注射直接施用于眼；或者使用導(dǎo)管或者其他放置裝置，如視網(wǎng)膜彈丸劑、眼內(nèi)插入物、栓劑或者包含多孔的、非多孔的或者凝膠狀材料的植入物直接應(yīng)用于眼；通過局部眼滴劑或者軟膏劑；或者通過盲路中的緩釋裝置或者植入鞏膜附近(經(jīng)鞏膜)或者眼中進(jìn)行遞送。前眼房注射可以通過角膜注射到前房中以允許活性劑到達(dá)小梁網(wǎng)。小管內(nèi)注射可以注射到靜脈集合管引流輸淋管或者注射到輸淋管中?？梢灾苯邮┯糜诙?，例如，通過局部耳滴劑或軟膏劑、耳中的緩釋裝置或者植入耳附近。局部施用包括耳的肌內(nèi)、鼓室內(nèi)腔和耳堝內(nèi)注射施用途徑。此外，通過將用干擾RNA浸泡的明膠海綿或者類似的吸收和附著產(chǎn)品對著中耳/內(nèi)耳膜或鄰近結(jié)構(gòu)的窗口膜(windowmembrane)放置，可以施用活性劑。可以直接施用于肺，例如，通過氣霧劑化的制劑，和通過吸入器或者霧化器吸入。此外，施用方式包括片劑、丸劑和膠嚢劑，它們都能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員配制。受試者需要治療TNFa相關(guān)狀況或者處于發(fā)生TNFa相關(guān)狀況的受試者是患有TNFa相關(guān)炎性狀況或者患有干眼或者處于患TNFa相關(guān)炎性狀況或干眼的人或其他哺乳動物。TNFa相關(guān)炎性狀況包括例如與如本文引用的不希望的或者不合適的TNFa活性相關(guān)的變應(yīng)性結(jié)膜炎、眼炎癥、皮炎、鼻炎或者哮喘。與TNFa相關(guān)狀況相關(guān)的眼結(jié)構(gòu)包括例如眼、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、晶狀體、角膜、小梁網(wǎng)、虹膜、視神經(jīng)、視神經(jīng)頭、鞏膜、眼房、玻璃體房、睫狀體或者后段。與此類病癥相關(guān)的耳結(jié)構(gòu)可以包括例如內(nèi)耳、中耳、外耳、鼓室腔或膜、耳蝸或者咽鼓管。與此類病癥相關(guān)的肺結(jié)構(gòu)可以包括鼻、嘴、咽、喉、小支氣管、氣管、峰板(分隔右和左主支氣管的開口的隆起物)，和肺，尤其是下部肺，如細(xì)支氣管和肺泡。受試者也可以是耳細(xì)胞、肺細(xì)胞、眼細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、器官或離體(exvivo)器官或組織。制劑和劑量藥物制劑包含按重量計(jì)高達(dá)99%的本發(fā)明的干擾RNA或其鹽，其與生理學(xué)上可接受的載體介質(zhì)如水、緩沖劑、鹽水、甘氨酸、透明質(zhì)酸、甘露醇等等混合。本發(fā)明的干擾RNA作為溶液劑、混懸劑或乳劑施用。下面是本發(fā)明體現(xiàn)的可能的制劑的實(shí)例以重量％表示的量千擾RNA高達(dá)99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0羥丙基甲基纖維素0.5氯化鈉0.8苯扎氯銨0.01EDTA0.01NaOH/HCl至pH7.4純化的7JC(無RNA酶)至100mL以重量％表示的量干擾RNA高達(dá)99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0磷酸緩沖鹽水1.0苯扎氯銨0.01聚山梨酯800.5純化的水(無RNA酶)至100%以重量％表示的量干擾RNA高達(dá)99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0磷酸二氫鈉0.05磷酸氫二鈉(無水)0.15氯化鈉0.75<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>通常，本發(fā)明實(shí)施方案的有效量的干擾RNA導(dǎo)致靶細(xì)胞表面的細(xì)胞外濃度為100pM到1000nM，或1nM到400nM，或5nM到約100nM或到約10nM。實(shí)現(xiàn)該局部濃度所需的劑量將隨著許多因素而變，所述因素包4舌遞送方法、遞送位點(diǎn)、遞送位點(diǎn)和耙細(xì);9包或組織之間細(xì);^包層^t目，和遞送是局部還是全身的，等等。遞送位點(diǎn)的濃度可以比靶細(xì)胞或組織表面的顯著更高。根據(jù)臨床醫(yī)生的常規(guī)考慮，將局部組合物每天四次或以延長的遞送時間表，如每天、每周、每兩周、每月或更長時間一次遞送到靼器官表面。制劑的pH為約pH4-9,或pH4.5到pH7.4。預(yù)期用針對TACEmRNA或TNFR1mRNA的siRNA治療性治療患者與小分子治療相比具有益處，干擾RNA治療性治療通過增加作用持續(xù)時間從而允許較低頻率給藥和更大的患者依從性。制劑的有效量可以取決于如下因素，如受試者的年齡、種族、性別、TNFa相關(guān)狀況的嚴(yán)重性、靶基因轉(zhuǎn)錄/蛋白質(zhì)更新的速率、干擾RNA效力、和干擾RNA穩(wěn)定性。在一個實(shí)施方案中，將干擾RNA局部遞送到耙器官并且以治療劑量到達(dá)含有TACEmRNA或TNFR1mRNA的組織，從而減輕TNFa相關(guān)的過程。可接受的載體可接受的栽體指這樣的載體，其最多引起、很少引起或不引起眼刺激、如果需要，提供合適的防腐作用，和以均勻劑量遞送本發(fā)明的一種或多種干擾RNA。用于施用本發(fā)明實(shí)施方案的干擾RNA的可接受的載體包括基于陽離子脂類的轉(zhuǎn)染試劑TranSIT-TKO(MinisCorporation,Madison,WI)、LIPOFECTIN、Lipofectamine、OLIGOFECTAMINETM(Invitrogen，Carlsbad,CA)或DHARMAFECTTM(Dharmacon，Lafayette,CO);聚陽離子，如聚乙烯亞胺；陽離子肽，如Tat、聚精氨酸或者Penetratin(Antp肽);或者脂質(zhì)體。脂質(zhì)體從標(biāo)準(zhǔn)的形成小泡的脂類和固醇，如膽固醇形成，并且可以包括尋靶分子，如對內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原具有結(jié)合親和力的單克隆抗體。此外，脂質(zhì)體可以是加入聚乙二醇的脂質(zhì)體?？梢砸匀芤?、懸浮液、或者生物蝕解的或非生物蝕解的遞送裝置遞送干擾RNA。干擾RNA可以單獨(dú)遞送或者作為確定的共價綴合物的組分遞送。干擾RNA也可以與陽離子脂類、陽離子肽、或者陽離子聚合物絡(luò)合；與具有核酸結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)、融合蛋白或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如，魚精蛋白)絡(luò)合；或者包嚢在納米顆粒中。通過包括合適的尋靶部分如抗體或者抗體片段可以完成組織或細(xì)胞特異性遞送。對于經(jīng)眼、耳或肺遞送，干擾RNA可以與眼科、眼或肺可接受的防腐劑、共溶劑、表面活性劑、粘性增強(qiáng)劑、滲透增強(qiáng)劑、緩沖劑、氯化鈉或者水組合以形成水性的無菌混懸液或溶液。通過將干擾RNA溶解在生理學(xué)上可接受的等滲水性緩沖液中可以制備溶液制劑。此外，溶液可以包括可接受的表面活性劑以幫助溶解抑制劑。粘性助劑，如羥曱基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等可以加入到本發(fā)明的組合物中用于提高化合物的保留。為了制備無菌軟膏制劑，將干擾RNA與防腐劑在合適的栽體，如礦物油、液體羊毛脂或者白礦脂中組合。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法，通過將干擾RNA懸浮在從例如CARBOPOL-940(BFGoodrich,Charlotte,NC)等的組合制備的親水基質(zhì)中制備無菌凝膠制劑。VISCOAT(AlconLaboratories,Inc.,FortWorth,TX)可以用于例如眼內(nèi)注射。在干擾RNA在目的器官或組織中的滲透性較弱的情況下，本發(fā)明的其他組合物可以含有滲透增強(qiáng)劑，如cremephor和TWEEN80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，SigmaAldrich，St.Louis，MO)。試劑盒本發(fā)明的實(shí)施方案提供了試劑盒，其包括用于減弱如本文應(yīng)用的mRNA在細(xì)胞中表達(dá)的試劑。該試劑盒含有siRNA或shRNA表達(dá)載體。對于siRNA和非病毒shRNA表達(dá)載體，試劑盒也可以含有轉(zhuǎn)染試劑或者其他合適的遞送載體。對于病毒shRNA表達(dá)載體，試劑盒可以含有病毒載體和/或病毒載體的產(chǎn)生所必須的組分(例如，包裝細(xì)胞系以及包含病毒載體模板的載體和用于包裝的額外輔助載體)。試劑盒也可以含有陽性和陰性對照siRNA或者shRNA表達(dá)載體(例如，非尋耙對照siRNA或者靶定不相關(guān)mRNA的siRNA)。試劑盒還可以含有用于評估預(yù)期靶基因的擊倒的試劑(例如，用于檢測靶標(biāo)mRNA的定量PCR的引物和探針和/或用于蛋白質(zhì)印跡的抗對應(yīng)蛋白質(zhì)的抗體)。備選地，試劑盒可以包含siRNA序列或者shRNA序列和使用說明書和通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA或者構(gòu)建shRNA表達(dá)栽體必須的材料。還提供了藥盒形式的藥物組合，其在包裝的組合中包括載體工具，其適于接受與之密切限制的容器工具，和第一個容器工具，其包括干擾RNA組合物和可接受的載體。如果需要，此類藥盒可以還包括多種常規(guī)的藥物藥盒組分的一種或多種，如具有一種或多種藥學(xué)上可接受的栽體的容器、額外容器，等等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。藥盒中也可以包括作為插頁或標(biāo)簽的印刷的說明書，其指出待施用的組分的量，施用指導(dǎo)，和/或用于混合組分的指導(dǎo)。如下在體外評估TACE或TNFRl干擾RNA擊倒例如人角膜上皮細(xì)胞中內(nèi)源TACE或TNFRl表達(dá)水平的能力。在KGM角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(Cambrex，EastRutherford,NJ)中轉(zhuǎn)染前24小時，將轉(zhuǎn)化的人角膜上皮細(xì)胞例如CEPI-17細(xì)胞系(Offord等人(1999)InvestOphthalmolVisSci40:1091國1101)平板接種。使用DharmaFECT1(Dharmacon,Lafayette,CO)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書以0.1nM-100nM的TACE-或TNFRl干擾RNA濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將非尋靶對照干擾RNA和核纖層蛋白A/C干擾RNA(Dharmacon)用作對照。轉(zhuǎn)染后24小時使用例如TAQMAN⑧正向和反向引物和包含草巴位點(diǎn)的才笨4十組(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)通過qPCR評估目標(biāo)mRNA水平?？梢栽谵D(zhuǎn)染后72小時(實(shí)際的時間取決于蛋白質(zhì)更新率)通過例如蛋白質(zhì)印跡評估目標(biāo)蛋白質(zhì)水平。用于從培養(yǎng)的細(xì)胞分離RNA和/或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。為了減小非特異性脫靶效應(yīng)的機(jī)會，使用最低可能濃度的TACE-或TNFR1干擾RNA，其在靶基因表達(dá)中產(chǎn)生希望水平的擊倒。顯修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。根據(jù)本公開，不用過度實(shí)驗(yàn)就可以做出和執(zhí)行本文公開的所有實(shí)施方案。本發(fā)明的完整范圍在本公開和其等同實(shí)施方案中給出。說明書不應(yīng)被理解為過度地限制本發(fā)明應(yīng)有的完整保護(hù)范圍。盡管已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到許多變型和備選實(shí)施方案。因此，本發(fā)明預(yù)期將僅僅受到所附權(quán)利要求的限制。本發(fā)明可以以其他特定形式體現(xiàn)而不背離其精神或基本特征。所述的實(shí)施方案將在所有方面僅僅被認(rèn)為是說明性而非限制性的。因此，本發(fā)明的范圍通過所附權(quán)利要求而不是前面的說明書指出。在權(quán)利要求等同的含義和范圍內(nèi)出現(xiàn)的權(quán)利要求的所有改變都被包括在它們的范圍內(nèi)。此外，將本文提到的所有出版的文獻(xiàn)、專利和專利申請都引入本文作為參考，就好像將它們完整給出一樣。實(shí)施例1用于在GTM-3細(xì)胞中特異沉默TNFR1的干擾RNA本研究檢查TNFR1干擾RNA擊倒在培養(yǎng)的GTM-3細(xì)胞中內(nèi)源TNFR1蛋白質(zhì)表達(dá)水平的能力。使用TNFR1siRNAs、siCONTROL無RISC的-siRNA#1，或siCONTROL非尋草巴siRNA#2(NTC2)和DHARMAFECT#1轉(zhuǎn)染試劑(Dharmacon,Lafayette,CO)的標(biāo)準(zhǔn)體外濃度(0.1-10nM)完成GTM-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(Pang，I.H.等人，1994.Curr.EyeRes.13:51-63)。將所有siRNA溶解在1XsiRNA緩沖液中，該緩沖液為20mMKCl，6mMHEPES(pH7.5)，0.2mMMgCh的水溶液。對照樣品包括緩沖液對照，其中將siRNA的體積用等體積的IXsiRNA緩沖液(-siRNA)置換。使用抗TNFR抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以評估TNFR1蛋白質(zhì)表達(dá)。TNFR1siRNA是對下面的靶標(biāo)具有特異性的雙鏈干擾RNA:siTNFRl#1草巴定序列CAAAGGAACCUACUUGUAC(SEQIDNO:202)，從其得到SEQIDNO:96;siTNFRl#2革巴定序列GAGCUUGAAGGAACUACUA(SEQIDNO:203)，從其得到SEQIDNO:97;siTNFRl#3乾定序列CACAGAGCCUAGACACUGA(SEQIDNO:204)，從其得到序列SEQIDNO:98;siTNFRl#4靼定序列UCCAAGCUCUACUCCAUUG(SEQIDNO:205),從其得到序列SEQIDNO:99。如圖1中數(shù)據(jù)所示，siTNFRl#l、siTNFRl#2和siTNFRl#3siRNA在10nM和InM濃度下相對于對照siRNA顯著降低TNFR1蛋白質(zhì)表達(dá)，但是在0.1nM顯示出降低的功效。siTNFRl#2和siTNFRl#3siRNA尤其有效。如所預(yù)期的，siTNFRl#4siRNA也顯示出TNFRl蛋白質(zhì)表達(dá)的濃度依賴性降低。權(quán)利要求1.化合物用于生產(chǎn)減弱受試者中TACEmRNA表達(dá)的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含與對應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO14-SEQIDNO58和SEQIDNO155-SEQIDNO201任一個的mRNA的3’末端的倒數(shù)第二位13個核苷酸有至少80％序列互補(bǔ)性或至少90％序列同一性的至少13、14、15、16、17或18個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，其中從而減弱TACEmRNA的表達(dá)。2.權(quán)利要求1的用途，其中所述干擾RNA是shRNA、miRNA或siRNA之一。3.權(quán)利要求l的用途，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、目艮、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經(jīng)皮途徑施用所述組合物。4.權(quán)利要求1的用途，其中通過從能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá)載體在體內(nèi)表達(dá)施用所述干擾RNA。5.化合物用于生產(chǎn)治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)狀況的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，其中所述干擾RNA包含與對應(yīng)于SEQIDNO:3、SEQIDNO:14-SEQIDNO:58和SEQIDNO:155-SEQIDNO:201任一個的mRNA的3，末端的倒數(shù)第二位13個核苷酸有至少80%序列互補(bǔ)性或至少90%序列同一性的至少13、14、15、16、17或18個連續(xù)核普酸的區(qū)域；其中從而治療所述TNFa相關(guān)的狀況。6.權(quán)利要求5的用途，其中所述干擾RNA是shRNA、miRNA或siRNA之一。7.權(quán)利要求5的用途，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、目艮內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、目艮、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經(jīng)皮途徑施用所述組合物。8.權(quán)利要求5的用途，其中通過從能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá)載體在體內(nèi)表達(dá)施用所述干擾RNA。9.權(quán)利要求5的用途，其中所述受試者是人并且該人患有干眼或者處于患干眼的危險中。10.權(quán)利要求5的用途，其中所述受試者是人并且該人患有TNFa相關(guān)的炎性狀況或處于患TNFa相關(guān)的炎性狀況的危險中。11.化合物用于生產(chǎn)減弱受試者的TACEmRNA表達(dá)的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈，和至少19個核苦酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、,755、842、844、846、860、878、894、卯0、卯9、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337;其中從而減弱TACEmRNA的表達(dá)。12.化合物用于生產(chǎn)減弱受試者的TNFR1mRNA表達(dá)的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的千擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核普酸鏈，和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交，所述部分在核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>2091或2092處開始；其中從而減弱TNFR1mRNA的表達(dá)。13.權(quán)利要求12的用途，其中所述受試者是人并且該人患有干眼或者處于患干眼的危險中。14.權(quán)利要求12的用途，其中所述受試者是人并且該人患有TNFa相關(guān)狀況或處于患TNFa相關(guān)狀況的危險中。15.權(quán)利要求12的用途，其中所述有義核苷酸鏈和反義核苷酸鏈通過環(huán)狀核苦酸鏈連接。16.權(quán)利要求12的用途，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、目艮、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經(jīng)皮途徑施用所述組合物。17.權(quán)利要求12的用途，其中通過從能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá)載體在體內(nèi)表達(dá)施用所述干擾RNA。18.化合物用于生產(chǎn)治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)狀況的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈，和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核普酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>或3337;其中從而治療所述TNFa相關(guān)狀況。19.化合物用于生產(chǎn)治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)的眼狀況的藥物的用途，包括對受試者的眼睛施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苷酸長度的干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈，和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中所述反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>或2092;其中從而治療所述TNFa相關(guān)的眼狀況。20.權(quán)利要求19的用途，其中所述受試者是人并且該人患有干眼或者處于患干眼的危險中。21.權(quán)利要求19的用途，其中所述受試者是人并且該人患有變應(yīng)性結(jié)膜炎或眼炎癥或處于患有變應(yīng)性結(jié)膜炎或眼炎癥的危險中。22.權(quán)利要求18的用途，其還包括對受試者施用第二種干擾RNA,該第二種干擾RNA具有19到49個核苷酸的長度并且包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈，和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中所述第二種干擾RNA的反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:2的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091或2092。23.權(quán)利要求19的用途，還包括對受試者的眼施用第二種干擾RNA，該第二種千擾RNA具有19到49個核苷酸的長度并且包含有義核苷酸鏈、反義核苷酸鏈，和至少19個核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中所述第二種干擾RNA的反義鏈在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核普酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、24.權(quán)利要求18的用途，其中所述有義核苷酸鏈和反義核苷酸鏈通過環(huán)狀核苷酸鏈連接。25.權(quán)利要求18的用途，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、目艮、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經(jīng)皮途徑施用所述組合物。26.權(quán)利要求18的用途，其中通過從能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá)栽體在體內(nèi)表達(dá)施用所述千擾RNA。27.權(quán)利要求19的用途，其中所述有義核苷酸鏈和反義核苷酸鏈通過環(huán)狀核苷酸鏈連接。28.權(quán)利要求19的用途，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、目艮、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經(jīng)皮途徑施用所述組合物。29.權(quán)利要求19的用途，其中通過從能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá)載體在體內(nèi)表達(dá)施用所述干擾RNA。30.化合物用于生產(chǎn)治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)狀況的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含雙鏈siRNA分子，其通過RNA干擾下調(diào)TACE基因的表達(dá)，其中siRNA分子的每條鏈獨(dú)立地為約19到約27個核普酸長度；并且siRNA分子的一條鏈包含與對應(yīng)于TACE基因的mRNA具有實(shí)質(zhì)互補(bǔ)性的核苷酸序列，使得該siRNA分子通過RNA干擾指導(dǎo)mRNA的切割。31.化合物用于生產(chǎn)治療需要其的受試者中TNFa相關(guān)的眼狀況的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含雙鏈siRNA分子，其通過RNA干擾下調(diào)TNFR1基因的表達(dá)，其中siRNA分子的每條鏈獨(dú)立地為約19到約27個核苷酸長度；并且siRNA分子的一條鏈包含與對應(yīng)于TNFR1基因的mRNA具有實(shí)質(zhì)互補(bǔ)性的核苷酸序列，使得該siRNA分子通過RNA干擾指導(dǎo)所述mRNA的切割。32.化合物用于生產(chǎn)減弱受試者的TACEmRNA表達(dá)的藥物的用途，包括對受試者施用組合物，該組合物包含有效量的具有19到49個核苦酸長度的單鏈干擾RNA和可藥用載體，其中所述單鏈干擾RNA在生理?xiàng)l件下與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的部分雜交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337，并且該干擾RNA具有與對應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域，其中從而減弱TACEmRNA的表達(dá)。33.權(quán)利要求31的用途，其中所述受試者是人并且該受試者患有TNFa相關(guān)的眼狀況。34.權(quán)利要求31的用途，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、目艮、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經(jīng)皮途徑施用所述組合物。35.權(quán)利要求31的用途，其中通過從能夠表達(dá)所述干擾RNA的表達(dá)載體在體內(nèi)表達(dá)施用所述干擾RNA。36.權(quán)利要求31的用途，其中所述干擾RNA是miRNA或siRNA。37.權(quán)利要求29的用途，其中所述siRNA分子的每條鏈獨(dú)立地為約19個核苷酸到約25個核苷酸長度。38.權(quán)利要求29的用途，其中所述siRNA分子的每條鏈獨(dú)立地為約19個核苷酸到約21個核苷酸長度。39.組合物，其包含干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA具有19到49個核苷酸的長度，并且包含對應(yīng)于SEQIDNO:3、SEQIDNO:14-SEQIDNO:58和SEQIDNO:155-SEQIDNO:201的任一個的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。40.組合物，其包含干擾RNA和可藥用載體，所述干擾RNA基本上由對應(yīng)于SEQIDNO:59-SEQIDNO:69、SEQIDNO:71畫SEQIDNO:92和SEQIDNO:94-SEQIDNO:154任一個的核苦酸序列或其互補(bǔ)序列組成。41.權(quán)利要求39的組合物，其中所述干擾RNA是shRNA、siRNA或miRNA之一。42.權(quán)利要求40的組合物，其中所述干擾RNA是shRNA、siRNA或miRNA之一。全文摘要提供了RNA干擾用于通過沉默TNFα細(xì)胞表面受體TNF受體-1(TNFR1)mRNA表達(dá)，或通過沉默TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17)mRNA表達(dá)抑制腫瘤壞死因子α(TNFα)。沉默此類TNFα靶標(biāo)尤其可用于治療患有TNFα相關(guān)狀況或者處于患TNFα相關(guān)狀況的危險中的患者，所述狀況如眼的狀況干眼、變應(yīng)性結(jié)膜炎或眼炎癥，或者如皮炎、鼻炎或哮喘。文檔編號C12N15/113GK101448943SQ200780017777公開日2009年6月3日申請日期2007年5月17日優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日發(fā)明者D·A·蓋瑪徹,D·M·森基納,J·E·查特爾頓,J·M·亞恩,S·T·米勒申請人:愛爾康研究有限公司