專(zhuān)利名稱(chēng)：三維細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及用 于培養(yǎng)脂肪細(xì)胞和用于在細(xì)胞培養(yǎng)中從前脂肪細(xì)胞獲得脂肪細(xì)胞的方法。 本發(fā)明的方面還涉及用于評(píng)估脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型之間的相互作用 的方法，和用于評(píng)估脂肪細(xì)胞對(duì)環(huán)境剌激的響應(yīng)的方法。這能夠更好地理 解參與細(xì)胞和組織相互作用的機(jī)制，并且在肥胖癥、糖尿病、炎癥及相關(guān) 疾病領(lǐng)域中具有暗示。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，主要認(rèn)為脂肪組織是在其他方面惰性的儲(chǔ)存物質(zhì)。近年來(lái)， 它的功能重要性才引起注意?，F(xiàn)已知脂肪細(xì)胞參與一定范圍的與其他細(xì)胞 類(lèi)型的相互作用，以及不同因子的產(chǎn)生和分泌。脂肪與不同的組織，包括 心臟、心包、血管周?chē)湍I臟周?chē)慕M織、和骨髓相關(guān)。它還與淋巴組織 相關(guān)，并且己知脂肪細(xì)胞與淋巴細(xì)胞相互作用。它們分泌多種細(xì)胞因子和 趨化因子，并且被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)重量，以及在糖尿病和炎癥中起作用。
脂肪細(xì)胞是大且易碎的細(xì)胞，并且在分析過(guò)程中很難維持它們的完整。 如果它們破裂，它們釋放它們的脂肪內(nèi)容物，所述脂肪內(nèi)容物能夠干擾基 于水的生物化學(xué)測(cè)定。為了最小化破裂，在脂肪細(xì)胞處理中需要相當(dāng)多的 專(zhuān)門(mén)技術(shù)。
培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的較早期工作集中在組織碎片的外植體培養(yǎng)或創(chuàng)建無(wú)限 增殖化的細(xì)胞系上。這兩種方法均具有缺點(diǎn)外植體迅速變得壞死，從而 限制能夠進(jìn)行分析的時(shí)間，并且細(xì)胞系失去體內(nèi)脂肪細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特 征。還離體(exvivo)地分離了脂肪細(xì)胞，并以單層生長(zhǎng)。此外，由于這 些細(xì)胞以二維方式增殖，所以它們失去了它們的"正常"結(jié)構(gòu)和功能，并 且此外，當(dāng)脂肪細(xì)胞變得完全成熟(含有大脂肪滴)時(shí)，它們的密度使得
5它們浮起脫離該單層，并逐漸失去，從而阻礙分析。低浮力密度意指它們 不能按照常規(guī)過(guò)程如離心法處理。更近期，報(bào)告了這樣的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，
其中成熟的離體脂肪細(xì)胞在膠原凝膠中與內(nèi)皮細(xì)胞一起共-培養(yǎng)(Aoki等, 2003,細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能(Cell Struct Funct) 28， 55)。該論文沒(méi)有報(bào)告它們的培 養(yǎng)物的壽命，也沒(méi)有報(bào)告所培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞用于生物化學(xué)分析的適宜性。 而且，所述共-培養(yǎng)包括不同數(shù)量的前脂肪細(xì)胞，該作者將其認(rèn)為是缺點(diǎn)。 此外，Aoki等報(bào)告了認(rèn)為在培養(yǎng)物中存在內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)，和 對(duì)從前脂肪細(xì)胞發(fā)育為所述細(xì)胞是必需的。
WO 2005/121316描述了在支持物基質(zhì)表面上培養(yǎng)脂肪細(xì)胞或前脂肪 細(xì)胞；有效地，該基質(zhì)起到二維培養(yǎng)基底的作用。沒(méi)有公開(kāi)在該基質(zhì)中前 脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。
WO 2004/035102描述了在具有細(xì)小泡狀結(jié)構(gòu)的顆粒中培養(yǎng)前脂肪細(xì) 胞，并將這些顆粒注射到體內(nèi)。沒(méi)有公開(kāi)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化， 并且沒(méi)有提及在三維支持物基質(zhì)中的體外培養(yǎng)。
Hemmrich等，分化(Differentiation)第73巻，2005，第28-35頁(yè)描 述了在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中前脂肪細(xì)胞的體外分化。
Patel等,組織工程(Tissue Engineer),第11巻，2005,第1498-1505頁(yè) 描述了細(xì)胞支架系統(tǒng)中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞。沒(méi)有觀察到向脂肪細(xì)胞的分化， 而只有細(xì)胞死亡或細(xì)胞增殖。
Hilliou等，試驗(yàn)細(xì)胞研究(Exp Cell Res)，第177巻，1988，第372-381 頁(yè)討論了 3T3前脂肪細(xì)胞細(xì)胞系的培養(yǎng)。
Von Heimburg等，生物材料(Biomaterials)，第22巻，2001，第429-438 頁(yè)描述了在由定向固化和凍干膠原產(chǎn)生的膠原海綿中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞。該 公布中沒(méi)有公開(kāi)在支持物基質(zhì)中體外培養(yǎng)和分化前脂肪細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。
Kuberka等，國(guó)際人造器官雜志(InU Artificial Organs),第25巻，2002, 第67-73頁(yè)描述了創(chuàng)建類(lèi)似于vonHeimburg使用的膠原海綿，但是沒(méi)有描 述在海綿中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞。
因此，這些文獻(xiàn)均沒(méi)有公開(kāi)在三維支持物基質(zhì)中培養(yǎng)離體的前脂肪細(xì) 胞，以及它們隨后在體外分化為脂肪細(xì)胞。本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了意欲避免，至 少部分地避免現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題的新型培養(yǎng)系統(tǒng)和方法。我們提供了這樣的系200780018180.4
統(tǒng)，其中具有與體內(nèi)脂肪細(xì)胞類(lèi)似的生物特征的脂肪細(xì)胞能夠在穩(wěn)定基底 中體外生長(zhǎng)，所述基底使得它們能夠進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子分析。 能夠使該培養(yǎng)系統(tǒng)接近地模仿內(nèi)環(huán)境。這容許以從前不可能的方法，在體 外研究脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型之間的相互作用。例如，這可能在干細(xì)胞 研究中的具有應(yīng)用。體內(nèi)的干細(xì)胞通常在包括脂肪細(xì)胞的微環(huán)境中存在并 增殖。然而，因?yàn)榘凑粘Ｒ?guī)非常難于培養(yǎng)它們，所以常常將脂肪細(xì)胞排除 在干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)之外。我們的3D模型能夠用于提供具有與體內(nèi)環(huán)境更 接近類(lèi)似的環(huán)境的脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞，并由此為干細(xì)胞增殖和分化提供 更好的條件。
發(fā)明概述
按照本發(fā)明的第一方面，提供了體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的方法，所述方法 包括.-
將前脂肪細(xì)胞引入到三維支持物基質(zhì)中；和 .
容許所述前脂肪細(xì)胞在所述支持物基質(zhì)中分化為脂肪細(xì)胞。 本方法由此容許脂肪細(xì)胞在基質(zhì)中生長(zhǎng)，由此減少了在處理和操作易 碎脂肪細(xì)胞中的問(wèn)題。此外，三維基質(zhì)將成熟的脂肪細(xì)胞保持在該基質(zhì)中， 以使成熟的細(xì)胞不浮起脫離單層。三維基質(zhì)還為脂肪細(xì)胞提供更接近地類(lèi) 似于它們自然環(huán)境的環(huán)境，以使所述細(xì)胞的形式和功能更加接近地類(lèi)似于 "正常"細(xì)胞。
所述基質(zhì)優(yōu)選地包括膠原基質(zhì)。I型膠原是優(yōu)選的，且可以以明膠(變
性的i型膠原)的形式提供。備選地，可以使用n型膠原。i型膠原是最
優(yōu)選的物質(zhì)，盡管我們相信可以替代地使用其他物質(zhì)。然而，這些物質(zhì)可 能提供不如使用膠原滿(mǎn)意的結(jié)果。所述基質(zhì)的目的是為培養(yǎng)的細(xì)胞提供三 維支持物基質(zhì)，所述基質(zhì)允許更小細(xì)胞的遷移，但其阻止更大的成熟脂肪 細(xì)胞的遷移，同時(shí)還允許培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子、和其他小分子擴(kuò)散遍及該基 質(zhì)。任何合適的物質(zhì)可以用于所述基質(zhì)，盡管本文中指出的物質(zhì)是優(yōu)選的。 我們相信可以使用的實(shí)例物質(zhì)包括水凝膠類(lèi)型的物質(zhì)，諸如藻酸鹽或瓊脂
糖。其他合適的基質(zhì)物質(zhì)可以包括Matrigel (RTM)、或從脂肪組織中提取 的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)物質(zhì)。
7將前脂肪細(xì)胞引入基質(zhì)中的步驟可以包括將前脂肪細(xì)胞接種到處于流 體形式的基質(zhì)前體中，和容許所述基質(zhì)前體固化形成基質(zhì)。固化可以包括 基質(zhì)前體等的聚合。
本方法還可以包括從脂肪組織中分離前脂肪細(xì)胞，從而引入到所述基 質(zhì)中的步驟。用于這樣的分離的技術(shù)是己知的，并且可以包括，例如，用 例如膠原酶消化脂肪組織，和通過(guò)利用例如過(guò)濾或離心分離前脂肪細(xì)胞和 脂肪組織的其他成分。
本方法還可以包括向所述基質(zhì)中引入一種或多種分化因子的步驟，從 而引起前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞?？梢栽谝肭爸炯?xì)胞的同時(shí)，或之 前或之后，引入所述分化因子?？梢詫⑺鲆蜃右氲教幱诹黧w形式的基 質(zhì)前體中，并且容許所述前體固化形成所述基質(zhì)。備選地，可以通過(guò)例如 使所述基質(zhì)與包括所述因子的液體溶液接觸而將所述因子引入到基質(zhì)中。
合適的分化因子是本領(lǐng)域己知的，且可以包括，例如，美國(guó)專(zhuān)利
6,153,432中詳述的那些，將其內(nèi)容引入本文作為參考。特別優(yōu)選的分化因 子包括葡萄糖、環(huán)化AMP誘導(dǎo)物、糖皮質(zhì)素或糖皮質(zhì)素類(lèi)似物、胰島素 或胰島素類(lèi)似物、和PPARy激動(dòng)劑或RXR激動(dòng)劑之一。最優(yōu)選的分化因 子是異丁基甲基黃嘌吟、地塞米松、和胰島素之一。
本方法還可以包括用另一種培養(yǎng)基替換基質(zhì)中的分化因子的步驟。例 如，在前脂肪細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行分化后，可以在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，MEMa 培養(yǎng)基)中洗滌所述基質(zhì)。
可以將另外的細(xì)胞類(lèi)型引入到所述基質(zhì)中；可以在與前脂肪細(xì)胞同時(shí)， 在分化為脂肪細(xì)胞之后，或在引入前脂肪細(xì)胞之前，引入這些細(xì)胞。優(yōu)選 地，另外的細(xì)胞類(lèi)型不包括內(nèi)皮細(xì)胞。
本方法可以包括從所述基質(zhì)中釋放分化的脂肪細(xì)胞的步驟。這可以通 過(guò)例如消化所述基質(zhì)(例如，如果所述基質(zhì)是膠原，則利用膠原酶)和隨 后回收脂肪細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了其中存在前脂肪細(xì)胞的三維支持物基 質(zhì)，其中所述基質(zhì)不包含內(nèi)皮細(xì)胞。所述基質(zhì)還可以包括一種或多種分化 因子，從而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。
本發(fā)明還提供了其中存在脂肪細(xì)胞的三維支持物基質(zhì)，所述脂肪細(xì)胞
8是通過(guò)前脂肪細(xì)胞在所述基質(zhì)中的分化而獲得的。優(yōu)選地，所述基質(zhì)也不 包括內(nèi)皮細(xì)胞。
按照本發(fā)明還提供了研究脂肪細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)的方法，該方法包括 按照本文所述的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞；將刺激引入到所述基質(zhì)中的脂肪
細(xì)胞中；和確定所述脂肪細(xì)胞對(duì)所述剌激的響應(yīng)。
合適的刺激包括藥物、藥物候選物、小分子、生物活性分子、肽、肽 片段、脂肪酸、核酸、生長(zhǎng)因子、分化因子、等。確定脂肪細(xì)胞響應(yīng)的步 驟可以包括將暴露于剌激的脂肪細(xì)胞與以相同方式培養(yǎng)但沒(méi)有暴露于剌 激的脂肪細(xì)胞進(jìn)行比較。
本發(fā)明還提供研究脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型之間相互作用的方法，該 方法包括按照本文所述的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞；將另一種細(xì)胞類(lèi)型引入 到所述基質(zhì)中；和確定所述脂肪細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型的相互作用。備選地， 本方法可以包括按照本文所述的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，其中所述基質(zhì)包 含另一種細(xì)胞類(lèi)型；和確定所述脂肪細(xì)胞與所述其他細(xì)胞類(lèi)型的相互作 用。對(duì)于這些方法之一或二者，所述其他細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)選地不是內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明的又一方面提供了研究干細(xì)胞發(fā)育的方法，該方法包括將一種 或多種干細(xì)胞引入到其中存在脂肪細(xì)胞的三維支持物基質(zhì)中；和容許干細(xì) 胞生長(zhǎng)和分化。本方法可以替代地包括按照本文所述的方法體外培養(yǎng)脂肪 細(xì)胞，其中所述基質(zhì)包括一種或多種干細(xì)胞。在另一種變化中，本方法可 以包括將一種或多種干細(xì)胞引入到其中存在前脂肪細(xì)胞的三維支持物基 質(zhì)中；容許所述前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞；和容許干細(xì)胞生長(zhǎng)或分化。 另外的細(xì)胞類(lèi)型，無(wú)論是干細(xì)胞或其他細(xì)胞，還可以存在于所述基質(zhì)中。 這可以幫助更加接近地模擬體內(nèi)環(huán)境；例如，骨細(xì)胞可以用于模擬骨髓。
對(duì)于本文中所述的任何或所有方法，可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)監(jiān)測(cè) 脂肪細(xì)胞的活性或相互作用；例如，通過(guò)免疫染色、檢測(cè)基質(zhì)中的生物分 子、或檢測(cè)從所述基質(zhì)分泌到周?chē)囵B(yǎng)基中的分子。
附圖簡(jiǎn)述
現(xiàn)將通過(guò)僅參考附圖的實(shí)施例描述本發(fā)明的這些和其他方面，其中

圖1顯示開(kāi)始分化后第0、 7和14天時(shí)3D培養(yǎng)物的相差圖像。分化是通過(guò)細(xì)胞中脂質(zhì)小滴的累積來(lái)標(biāo)記的。 發(fā)明詳述
開(kāi)發(fā)了這樣的三維組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其中從大鼠分離而來(lái)的前脂肪細(xì)胞 能夠生長(zhǎng)和分化。以該方式產(chǎn)生的成熟脂肪細(xì)胞顯示出這樣的形態(tài)學(xué)和生 物化學(xué)特征，所述特征與由體內(nèi)的和離體的脂肪細(xì)胞顯示的那些相似，而 且與由在二維培養(yǎng)中生長(zhǎng)的脂肪細(xì)胞所表現(xiàn)的那些不同。在我們的3D系 統(tǒng)中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞保持生存力數(shù)周，從而容許研究短期和長(zhǎng)期功能。
該系統(tǒng)提供了比傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)與活動(dòng)物更相關(guān)的微環(huán)境。
它具有若干應(yīng)用范圍，包括但不僅限于
1. 它能夠用于單獨(dú)培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，并研究它們對(duì)環(huán)境刺激的響應(yīng)，所 述環(huán)境刺激包括生物活性分子和治療藥物；
2. 它能夠用于研究脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型之間的相互作用；
3. 它能夠用于模擬干細(xì)胞在其中發(fā)育的微環(huán)境；
4. 它起到減少在包括脂肪細(xì)胞領(lǐng)域中的研究和開(kāi)發(fā)所需要?jiǎng)游飻?shù)量 的作用。
按照從Cabrero等，2001改進(jìn)而來(lái)的方法從脂肪庫(kù)中分離前脂肪細(xì)胞 (糖尿病(Diabetes). 2001年8月;50(8): 1883-90)。該程序包括膠原酶處理 和過(guò)濾，并且每克起始組織產(chǎn)生3-4xl()S數(shù)量級(jí)的細(xì)胞。將前脂肪細(xì)胞接 種到24-孔組織培養(yǎng)平板中的由培養(yǎng)基中的I型膠原制成的三維凝膠中。 在這些條件下，該膠原凝膠逐漸與容器壁粘連，從而最小化收縮。當(dāng)所述 凝膠固定時(shí)，前脂肪細(xì)胞混懸在該3D凝膠基質(zhì)中。利用由Cabrero等(20(H) 所述的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)它們分化為成熟脂肪細(xì)胞。 一旦所述細(xì)胞進(jìn)行分 化，就能夠?yàn)榱俗罴丫S持條件而改變培養(yǎng)基，并且如果需要，將其他細(xì)胞 類(lèi)型引入到所述凝膠中。小細(xì)胞能夠在所述凝膠周?chē)w移(成熟脂肪細(xì)胞 由于它們的大尺寸而不能)，并且能夠建立起彼此間和與脂肪細(xì)胞間的結(jié) 構(gòu)和功能關(guān)系。
能夠通過(guò)免疫化學(xué)和顯微鏡方法，或通過(guò)生物化學(xué)分析與或不與其他 細(xì)胞一起的脂肪細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的分子，而對(duì)它們進(jìn)行原位研究。備 選地，能夠通過(guò)膠原酶處理從所述凝膠中釋放、收集細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行分
10子分析。 方法
前脂肪細(xì)胞的分離
按照動(dòng)物(科學(xué)程序)法(Animal (ScientificProcedure) Act), 1986
內(nèi)部繁殖和撫養(yǎng)動(dòng)物。通過(guò)時(shí)間表1的方法處死成年(7-9個(gè)月大)雌性 SpragueDawley大鼠(200-350g)。將左側(cè)和右側(cè)胭脂肪庫(kù)切割下來(lái)。改進(jìn) 了由Cabrero和同事(Cabrero等，2001)描述的方法，從而從脂肪組織中 分離和分化前脂肪細(xì)胞。方法的改進(jìn)包括利用5ml II型膠原酶(在具有10% 牛血清清蛋白的Hanks平衡鹽溶液中，4mg/ml)(西格瑪-奧德里奇有限公 司(Sigma-Aldrich Company Ltd),英國(guó))在37。C消化30分鐘，并且使用 200pm的細(xì)胞滲濾器去除碎片，并從包含前脂肪細(xì)胞的脂肪組織中分離混 合的細(xì)胞。用無(wú)核糖核苷或脫氧核糖核苷并且具有g(shù)lutaMAX-I (Gibco, Invitrogen有限公司，英國(guó))的極限基本培養(yǎng)基-a (Minimal Essential Medium-a， MEM-a)培養(yǎng)分離的細(xì)胞，所述極限基本培養(yǎng)基-a增補(bǔ)了 5% 熱-失活胎牛血清(HI-FBS) (Gibco， Invitrogen有限公司，英國(guó))和140U/ml 青霉素和鏈霉素(P/S)，通過(guò)在2D培養(yǎng)中的分化(通過(guò)油紅O染色評(píng)估 的)判定，分離的細(xì)胞中的60-70%是前脂肪細(xì)胞。
分離后的細(xì)胞生存力
如通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或錐蟲(chóng)藍(lán)排除所評(píng)估地，分離的細(xì)胞中的大約 80%是能存活的。
三維膠原凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)
膠原凝膠由在冰上的1.8mg/ml大鼠尾部I型膠原(第一鏈接有限公司 (First Link Ltd),英國(guó))、5% MEM x 10 (Gibco, Invitrogen有限公司，英國(guó)) 和5% MEM-a (含有5% FBS和140U/ml P/S)組成。將無(wú)菌過(guò)濾的1 mol 1" NaOH溶液的增加量加入到凝膠混合物中，直到觀察到指示pH變化的 顏色變化(從黃色到深粉色)。將含有l(wèi)xl()S個(gè)能存活細(xì)胞的等分試樣接 種到1 ml膠原中，并且為了容易去除膠原凝膠而將其涂布到包含13mm蓋玻片的24孔板(AlanaEcology,英國(guó))的孔底部。容許所述凝膠在37。C靜置 于具有5% (302和95%空氣的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中15-20分鐘。當(dāng)凝膠固定時(shí)， 在每個(gè)孔中覆蓋lml MEM-a培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物保持在培養(yǎng)箱中。在接 種的3小時(shí)內(nèi)，如下文所述地誘導(dǎo)了分化。
前脂肪細(xì)胞的分化
通過(guò)添加增補(bǔ)了異丁基甲基黃嘌呤(0.5 mmo1/1)、地塞米松(0.25 pmol/l)和胰島素(10 pg/ml)的MEM-a而誘導(dǎo)分化。48小時(shí)后，除去誘導(dǎo) 培養(yǎng)基，并更換為增補(bǔ)了 10嗎/ml胰島素的MEM-a (含有5% FBS和 140U/mlP/S)。每?jī)商鞂?duì)培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)充，每次更換50%的培養(yǎng)基。如通 過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Bancroft， John和Stevens, 1990)對(duì)分化的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特 征和油紅O染色所評(píng)估地，認(rèn)為細(xì)胞在第14天分化。利用尼康 Microphot-FX顯微鏡(尼康英國(guó)有限公司(Nikon UK limited), Kingston upon Thames,英國(guó))觀察細(xì)胞。
試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果顯示在圖1中。這給出了開(kāi)始分化后第0、 7和14天時(shí)的3D培 養(yǎng)物的相差圖像。分化是通過(guò)細(xì)胞中脂質(zhì)小滴的累積來(lái)標(biāo)記的。能夠看到 該方案允許前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，其在所述三維培養(yǎng)中似乎在形態(tài) 學(xué)上是正常的。
權(quán)利要求
1. 用于在體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的方法，所述方法包括將離體的前脂肪細(xì)胞引入到三維支持物基質(zhì)中；和容許所述前脂肪細(xì)胞在所述支持物基質(zhì)中體外分化為脂肪細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)是膠原基質(zhì)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述基質(zhì)是I型膠原基質(zhì)。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)包括水凝膠型物質(zhì)。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述將前脂肪細(xì)胞引入到所述 基質(zhì)中的步驟包括將前脂肪細(xì)胞接種到處于流體形式的基質(zhì)前體中，和容 許所述基質(zhì)前體固化形成所述基質(zhì)。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，還包括從脂肪組織中分離前脂肪細(xì) 胞，從而引入到所述基質(zhì)中的步驟。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述分離步驟包括用膠原酶消化脂肪組織， 和將前脂肪細(xì)胞和脂肪組織中的其他成分分開(kāi)。
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其還包括將一種或多種分化因子引 入到所述基質(zhì)中的步驟，從而引起所述前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述分化因子是與引入所述前脂肪細(xì)胞同 時(shí)引入的。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中將所述分化因子引入到處于流體形式的 基質(zhì)前體中，并且容許所述前體固化形成所述基質(zhì)。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)使所述基質(zhì)與包含所述因子的液體 溶液相接觸，將所述分化因子引入到所述基質(zhì)中。
12. 權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述分化因子包括葡萄糖、 環(huán)化AMP誘導(dǎo)物、糖皮質(zhì)素或糖皮質(zhì)素類(lèi)似物、胰島素或胰島素類(lèi)似物、 和PPARy激動(dòng)劑或RXR激動(dòng)劑之一。
13. 權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述分化因子包括異丁基甲 基黃嘌呤、地塞米松、和胰島素之一。
14. 權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的方法，其還包括用另一種培養(yǎng)基更換所述基質(zhì)中的分化因子的步驟。
15. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中可以將另外的細(xì)胞類(lèi)型引入 到所述基質(zhì)中。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述另外的細(xì)胞類(lèi)型不包括內(nèi)皮細(xì)胞。
17. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其還包括從所述基質(zhì)中釋放所述 分化的脂肪細(xì)胞的步驟。
18. 其中存在脂肪細(xì)胞的三維支持物基質(zhì)，在所述基質(zhì)中，所述脂肪 細(xì)胞是通過(guò)離體的前脂肪細(xì)胞的體外分化而獲得的。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述基質(zhì)不包含內(nèi)皮細(xì)胞。
20. 研究脂肪細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求 1-17中任一項(xiàng)的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞；將刺激引入到在基質(zhì)中的脂肪細(xì) 胞中；和確定所述脂肪細(xì)胞對(duì)所述刺激的響應(yīng)。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述刺激是選自包括藥物、藥物候選物、 小分子、生物活性分子、肽、肽片段、脂肪酸、核酸、生長(zhǎng)因子、和分化 因子的組中的一項(xiàng)。
22. 權(quán)利要求20或21的方法，其中所述確定所述脂肪細(xì)胞響應(yīng)的步 驟包括將暴露于所述刺激的脂肪細(xì)胞與以相同方式培養(yǎng)但沒(méi)有暴露于所 述刺激的脂肪細(xì)胞進(jìn)行比較。
23. 研究脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型之間相互作用的方法，所述方法包 括按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞;將另一種細(xì)胞類(lèi) 型引入到所述基質(zhì)中；和確定所述脂肪細(xì)胞與所述其他細(xì)胞類(lèi)型的相互作 用。
24. 研究脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型之間相互作用的方法，所述方法包 括按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，其中所述基質(zhì)包 含另一種或另外數(shù)種細(xì)胞類(lèi)型；和確定所述脂肪細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型的相 互作用。
25. 權(quán)利要求23或24的方法，其中所述其他細(xì)胞類(lèi)型不是內(nèi)皮細(xì)胞。
26. 研究干細(xì)胞發(fā)育的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1-17中任一 項(xiàng)的方法體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，其中所述基質(zhì)包含一種或多種干細(xì)胞。
27. 研究干細(xì)胞發(fā)育的方法，所述方法包括將一種或多種干細(xì)胞引入到其中存在前脂肪細(xì)胞的三維支持物基質(zhì)中；容許所述前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞；和容許所述千細(xì)胞生長(zhǎng)或分化。
28.權(quán)利要求26或27中任一項(xiàng)的方法，其中所述基質(zhì)包含另一種或 另外數(shù)種細(xì)胞類(lèi)型。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于培養(yǎng)離體分離的前脂肪細(xì)胞的方法，所述方法包括將前脂肪細(xì)胞引入到三維支持物基質(zhì)中，和容許所述細(xì)胞在所述支持物基質(zhì)中體外分化為脂肪細(xì)胞。所述基質(zhì)可以是膠原基質(zhì)。本方法可以用于研究干細(xì)胞的發(fā)育，或用于研究脂肪細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)。本方法提供了這樣的系統(tǒng)，由此具有與體內(nèi)的那些類(lèi)似生物特征的脂肪細(xì)胞能夠在體外生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/077GK101448932SQ200780018180
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2007年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者希拉里·安妮·麥奎因, 桑迪普·達(dá)亞, 艾莉森·簡(jiǎn)·洛克林 申請(qǐng)人:英國(guó)開(kāi)放大學(xué)