專利名稱：抑制Eg5基因表達的組合物和方法
相關申請
本申請要求2006年3月31日提交的60/787,762號美國臨時申請和2006年12月15日提交的60/870,259號美國臨時申請的權益。這兩個在先申請都通過引用整體結合入本文。
發(fā)明領域 本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及它們在介導抑制Eg5基因表達的RNA干擾中的應用和所述dsRNA單獨或與靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的dsRNA聯(lián)合治療由Eg5表達介導的病理過程如癌癥中的應用。

背景技術：
生物體中細胞群的維持是由細胞分裂和程序性細胞死亡的細胞過程控制的。在正常細胞中，與每個過程的起始和完成相關的細胞事件是受到高度調(diào)控的。在增殖性疾病如癌癥中，這些過程中的一個或兩者都可以被打斷。例如，癌細胞可以通過正調(diào)控因子的過量表達或負調(diào)控因子的缺失，很可能是由于突變，而失去對細胞分裂周期的調(diào)控(檢驗點控制)。
可選擇地，癌細胞可以通過負調(diào)控因子的過量表達而失去進行程序性細胞死亡的能力。因此，需要開發(fā)新的化學治療藥物，該藥物將使癌細胞恢復檢驗點控制和程序性細胞死亡的過程。
治療人類癌癥的一種方法是靶向對細胞周期進程至關重要的蛋白。為了使細胞周期從一個階段進入下一個階段，必須完成某些先決事件。在細胞周期中有加強事件和階段的正確順序的檢驗點。這種檢驗點中的一個是在有絲分裂中期階段出現(xiàn)的紡錘體檢驗點。靶向在有絲分裂中具有重要功能的蛋白的小分子可以觸發(fā)紡錘體檢驗點以將細胞阻滯在有絲分裂中。在將細胞阻滯在有絲分裂中的小分子中，那些在臨床上顯示有抗腫瘤活性的小分子也誘導細胞凋亡，即與程序性細胞死亡相關的形態(tài)變化。因此，用于癌癥治療的有效的化學治療可以是誘導檢驗點控制和程序性細胞死亡的治療。不幸的是，很少有控制細胞中這些過程的化合物。多數(shù)已知的引起有絲分裂阻滯和細胞凋亡的化合物都作為微管蛋白結合劑起作用。這些化合物改變微管的動力學不穩(wěn)定性，并間接地改變有絲分裂紡錘體的功能/結構從而引起有絲分裂阻滯。因為這些化合物中的大多數(shù)都特異地靶向所有微管的成份——微管蛋白，所以它們也可以影響微管在其中起作用的眾多正常細胞過程中的一個或多個過程。因此，也需要更特異地靶向與增殖細胞相關的蛋白的小分子。
Eg5是數(shù)個驅動蛋白樣運動蛋白(kinesin-like motor protein)中的一種，該蛋白定位于有絲分裂的紡錘體上并且已知是兩極有絲分裂紡錘體的形成和/或功能所必需的。最近，有打斷有絲分裂紡錘體的兩極性的小分子的報道(Mayer，T.U.等.1999.Science 286(5441)971-4，通過引用結合入本文)。更具體地，所述小分子誘導異常有絲分裂紡錘體的形成，在所述異常有絲分裂紡錘體中微管的單星排列(monoastral array)從中間的一對中心體發(fā)散出來，染色體附著在微管的遠端。所述小分子被根據(jù)單星排列被命名為“monastrol”。以前已經(jīng)在Eg5運動蛋白免疫耗竭的有絲分裂細胞中觀察到了這種單星排列現(xiàn)象。這種與眾不同的單星排列現(xiàn)象促進了將monastrol鑒定為Eg5的潛在抑制劑。確實，在體外試驗中monastrol進一步顯示了抑制由Eg5運動蛋白驅動的微管的運動性。Eg5抑制劑monastrol對細胞中相關的驅動運動蛋白或負責高爾基體運動的運動蛋白沒有明顯的作用。通過Eg5的免疫耗竭或者Eg5的monastrol抑制將具有單星排列現(xiàn)象的細胞阻滯在細胞周期的M期。然而，由Eg5的免疫耗竭或抑制誘導的有絲分裂阻滯是瞬時的(Kapoor，T.M.，2000.J Cell Biol 150(5)975-80)。有絲分裂中由monastrol誘導的單星排列現(xiàn)象和細胞周期阻滯都是可逆的。細胞恢復形成正常的兩極有絲分裂紡錘體，完成有絲分裂并通過細胞周期進行正常的細胞增殖。這些數(shù)據(jù)表明誘導瞬時的有絲分裂阻滯的Eg5的小分子抑制劑可能對癌細胞增殖的治療無效。雖然如此，monastrol引起有絲分裂阻滯的發(fā)現(xiàn)引起了人們的興趣，并由此需要進一步的研究并鑒定能夠以一種對人類癌癥治療有效的方式調(diào)節(jié)Eg5運動蛋白的化合物。還需要研究這些化合物與其他抗腫瘤藥物的聯(lián)合用藥。
VEGF(也即血管滲透因子，VPF)是多功能細胞因子，其刺激血管形成、上皮細胞增殖和內(nèi)皮細胞存活。VEGF可以由多種組織產(chǎn)生，并且它的過量表達或異常表達能夠引起多種病癥，包括癌癥和視網(wǎng)膜疾病如年齡相關的黃斑退行性疾病和其它血管形成性疾病。
最近，雙鏈RNA分子(dsRNA)已經(jīng)顯示以一種稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)控機制阻止基因表達。WO99/32619(Fire等人)公開了在線蟲(C.elegans)中使用至少25個核苷酸長度的dsRNA抑制基因的表達。dsRNA也已經(jīng)顯示在包括植物(參見，如WO 99/53050，Waterhouse等人和WO 99/61631，Heifetz等人)，果蠅(參見Yang，D.等，Curr.Biol.(2000)101191-1200)和哺乳動物(參見WO 00/44895，Limmer和DE 101 00 586.5，Kreutzer等人)在內(nèi)的其它生物體中降解靶標RNA。這種天然機制目前已經(jīng)成為焦點，用于開發(fā)治療由基因的異?；虿幌Ｍ牡恼{(diào)控引起的病癥的新型藥物試劑。
盡管在RNAi領域取得顯著進展，在由Eg5表達介導的病理過程的治療中也取得進展，仍然需要一種試劑，其能夠利用具有高生物活性和體內(nèi)穩(wěn)定性的細胞自身的RNAi機制選擇地且有效地沉默Eg5基因，并能夠有效抑制靶標Eg5基因的表達用于治療由Eg5表達介導的病理過程。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及單獨利用這種dsRNA或與靶向VEGF的dsRNA聯(lián)合用于抑制細胞或哺乳動物中Eg5基因表達的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于治療由Eg5基因的表達引起的病理狀況和疾病如癌癥的組合物和方法。本發(fā)明的dsRNA包括具有這樣一個區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，該區(qū)域小于30個核苷酸長度，通常為19-24個核苷酸長度，且與Eg5基因的mRNA轉錄物中的至少一部分基本互補。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子用于抑制Eg5基因的表達。所述dsRNA包含至少兩個互相互補的序列。所述dsRNA包括含第一序列的正義鏈和含第二序列的反義鏈。所述反義鏈包含與編碼Eg5的mRNA的至少一部分基本互補的核苷酸序列，并且互補區(qū)域小于30個核苷酸長度，通常為19-24個核苷酸長度。dsRNA一旦與表達Eg5的細胞接觸就抑制Eg5基因的表達至少40％。
例如，本發(fā)明的dsRNA分子可以包含選自由表1-3的正義序列組成的組的dsRNA的第一序列，和選自由表1-3的反義序列組成的組的第二序列。本發(fā)明的dsRNA分子可以包含天然存在的核苷酸或者可以包含至少一個修飾核苷酸，如2’-O-甲基修飾核苷酸、含5’-硫代磷酸酯基的核苷酸和連接至膽固醇衍生物(cholesteryl derivative)的末端核苷酸?？蛇x擇地，修飾核苷酸可以選自以下組2’-脫氧-2’-氟修飾核苷酸，2’-脫氧-修飾核苷酸，鎖核苷酸(locked nucleotide)，無堿基核苷酸(abasic nucleotide)，2’-氨基-修飾核苷酸，2’-烷基修飾核酸，嗎啉核苷酸，氨基磷酸酯和含非天然堿基的核苷酸。通常，這種修飾序列基于選自由表1-3的正義序列組成的組的所述dsRNA的第一序列和選自由表1-3的反義序列組成的組的第二序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了含本發(fā)明的一個dsRNA的細胞。所述細胞通常為哺乳動物細胞，如人細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制生物體通常為人受試者中Eg5基因表達的藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的一種或多種dsRNA和藥學上可接受的載體或遞送媒介。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種抑制細胞中Eg5基因表達的方法，該方法包括以下步驟 (a)將雙鏈核糖核酸(dsRNA)引入至所述細胞中，其中所述dsRNA包含至少兩個相互互補的序列。所述dsRNA包含含第一序列的正義鏈和含第二序列的反義鏈。反義鏈包含與編碼Eg5的mRNA的至少一部分基本互補的區(qū)域，并且其中所述互補區(qū)域小于30個核苷酸長度，通常為19-24個核苷酸長度，并且其中所述dsRNA一旦與表達Eg5的細胞接觸就抑制Eg5基因的表達至少40％；和 (b)將步驟(a)所產(chǎn)生的細胞保持足夠的時間以使Eg5基因的mRNA轉錄物降解，由此抑制細胞中Eg5基因的表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療、預防或控制由Eg5的表達介導的病理過程如癌癥的方法，其包括給需要這種治療、預防或控制的患者施用治療或預防有效量的本發(fā)明的一種或多種dsRNA。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細胞中Eg5基因表達的載體，其包含可操作地連接在編碼本發(fā)明的一個dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列上的調(diào)控序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了含抑制細胞中Eg5基因表達的載體的細胞。所述載體包含可操作地連接在編碼本發(fā)明的一個dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列上的調(diào)控序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了Eg5dsRNA以及其如上所述與靶向VEGF mRNA的第二dsRNA聯(lián)合的用途。靶向Eg5的dsRNA和靶向VEGF的第二dsRNA聯(lián)合產(chǎn)生互補和協(xié)同作用用于治療高增殖性病癥，尤其是肝癌。
附圖
簡述 無圖。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及利用所述dsRNA用于抑制細胞中或哺乳動物中Eg5基因表達的組合物和方法。本發(fā)明還提供了利用dsRNA治療哺乳動物中由Eg5基因的表達引起的病理狀況和疾病的組合物和方法。dsRNA通過稱為RNA干擾(RNAi)的過程指導mRNA的序列特異性降解。本發(fā)明還提供了這種dsRNA與抑制VEGF基團表達的第二dsRNA的組合。
本發(fā)明的dsRNA包含具有這樣的區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，所述區(qū)域小于30個核苷酸長度通常為19-24個核苷酸長度，并且與Eg5基因的mRNA轉錄物的至少一部分基本互補。使用這些dsRNA能夠使哺乳動物中參與癌細胞復制或維持的基因的mRNA靶向性降解。利用基于細胞的或動物試驗，本發(fā)明人證明極低劑量的這些dsRNA就能夠特異且有效地介導RNAi，引起Eg5基因表達的顯著抑制。因此，本發(fā)明的方法和含這些dsRNA的組合物通過靶向參與有絲分裂的基因用于治療由Eg5表達介導的病理過程，如癌癥是利的。
以下詳述公開了如何制備和使用dsRNA和含dsRNA的組合物抑制Eg5基因的表達，以及所述dsRNA單獨或與靶向VEGF基因的第二dsRNA聯(lián)合用于治療由Eg5的表達引起的疾病和病癥如癌癥的組合物和方法。本發(fā)明的藥物組合物包含具有含互補區(qū)域的反義鏈的dsRNA和藥學上可接受的載體，該互補區(qū)域小于30個核苷酸長度，通常為19-24個核苷酸長度，并且與Eg5基因的RNA轉錄物的至少一部分基本互補。如上所討論的，這種組合物還可以包含靶向VEGF的第二dsRNA。
因此，本發(fā)明的某些方面提供了含本發(fā)明的dsRNA和藥學上可接受的載體的藥物組合物，利用所述組合物抑制Eg5基因表達的方法，和利用所述藥物組合物治療由Eg5基因的表達引起的疾病的方法。本發(fā)明還提供了還包含設計用來抑制VEGF表達的第二dsRNA的上述藥物組合物。
I.定義 為了方便，下面提供了在說明書、實施例和所附權利要求中使用的某些術語和短語的含義。如果在這個說明書的其它部分中術語的使用和本部分所提供的它的定義之間有明顯差異，以本部分的定義為準。
“G”、“C”、“A”和“U”通常每個分別代表含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，可以理解術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修飾核苷酸，如下面進一步詳述的，或代用替換部分。技術人員熟知鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分替換，而基本上不改變包含含這種替換部分的核苷酸的寡核苷酸的堿基配對特性。例如，但不受限制，含次黃嘌呤作為其堿基的核苷酸可以與含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成堿基對。因此，在本發(fā)明的核苷酸序列中含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含例如次黃嘌呤的核苷酸替代。含這種替代部分的序列為本發(fā)明的實施方案。
如本文所使用的，“Eg5”指人驅動蛋白家族成員11，也稱為KIF11、Eg5、HKSP、KNSL1或TRIP5?？梢园l(fā)現(xiàn)Eg5序列為NCBI GeneID3832、HGNCIDHGNC6388和RefSeq ID numberNM_004523。
如本文所使用的，“靶標序列”指在Eg5基因的轉錄過程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續(xù)部分，包括作為最初轉錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的mRNA。
如本文所使用的，VEGF，也即血管滲透因子，是血管生成生長因子(angiogenic growth factor)。VEGF是以至少三種不同的亞型存在的45kDa同源二聚體糖蛋白。VEGF亞型在內(nèi)皮細胞中表達。VEGF基因含表達189個氨基酸的蛋白亞型的8個外顯子。165個氨基酸的亞型缺少由第6外顯子編碼的殘基，而121個氨基酸的亞型缺少由第6和第7外顯子編碼的殘基。VEGF145是預測含145個氨基酸且缺失第7外顯子的亞型。VEGF可以通過與內(nèi)皮酪氨酸激酶受體如Flt-1(VEGFR-1)或KDR/flk-1(VEGFR-2)結合來作用于內(nèi)皮細胞。VEGFR-2在內(nèi)皮細胞中表達并參與內(nèi)皮細胞分化和血管生成。第三受體，VEGFR-3參與淋巴生成。
各種亞型具有不同的生物學活性和臨床意義。例如，VEGF145誘導血管生成，并且與VEGF189相同(不同于VEGF165)VEGF145通過不依賴于與細胞外基質(zhì)相關的肝磷脂硫酸鹽的機制與細胞外基質(zhì)有效結合。VEGF在體外呈現(xiàn)內(nèi)皮細胞有絲分裂原和化學引誘物的活性并在體內(nèi)誘導血管滲透和血管生成。VEGF由多種類型的癌細胞分泌并通過誘導癌相關脈管體系的發(fā)育促進腫瘤的生長。已經(jīng)表明VEGF功能的抑制限制原發(fā)性試驗瘤的生長和免疫功能低下小鼠中轉移的發(fā)生。同時待審的美國申請?zhí)?1/078,073和11/340,080中闡述了各種指向VEGF的dsRNA(通過引用結合入本文)。
如本文所使用的，術語“含有序列的鏈”指含有核苷酸鏈的寡核苷酸，該寡核苷酸鏈通過利用標準核苷酸命名法表示的序列進行闡述。
如本文所使用的，且除非另有表示，術語“互補”，如技術人員所理解的，當用于描述與第二核苷酸序列相關的第一核苷酸序列時，表示含第一核苷酸序列的寡核苷酸或聚核苷酸在某種條件下與含第二核苷酸序列的寡核苷酸或聚核苷酸雜交并形成二倍體結構的能力。所述條件可以是，例如嚴謹條件，在此嚴謹條件可以包括400mM NaCl、40mM pH 6.4的PIPES、1mM EDTA，50℃或70℃持續(xù)12-16小時，之后洗滌?？梢詰闷渌鼦l件，如生物體內(nèi)能夠遇到的生理相關條件。技術人員能夠確定與雜交核苷酸的最終應用一致的、最適合兩個序列互補試驗的一套條件。
這包括含第一核苷酸序列的寡核苷酸或聚核苷酸與含第二核苷酸序列的寡核苷酸或聚核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長上的堿基配對。在此，這種序列可以表示為彼此“完全互補”。然而，當?shù)谝恍蛄斜硎緸榕c本文的第二序列“基本互補”時，所述兩個序列可以為完全互補，或一旦雜交它們可以形成一個或多個但通常不超過4、3、或2個錯配堿基對，同時保留與它們的最終應用最相關條件下的雜交能力。然而，當將兩個寡核苷酸設計成一旦雜交就形成一個或多個單鏈懸端，考慮到互補的定義這種懸端不應該被認做是錯配。例如，根據(jù)本發(fā)明的目的，含一個21個核苷酸長度的寡核苷酸和另一個23個核苷酸長度的寡核苷酸的dsRNA，其中所述較長的寡核苷酸包含與所述較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸，可以稱為“完全互補”。
如本文所使用的，只要滿足以上與它們的雜交能力有關的要求，“互補”序列也可以包括非Watson-Crick堿基對和/或由非天然核苷酸和修飾核苷酸形成的堿基對，或完全由這些堿基對形成。
如從它們的使用語境里所理解的，對于dsRNA的正義鏈和反義鏈之間或dsRNA的反義鏈和靶標序列之間的堿基匹配，可以使用本文的術語“互補”、“完全互補”和“基本互補”。
如本文所使用的，與信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互補”的聚核苷酸指與感興趣的mRNA(如編碼Eg5的mRNA)的連續(xù)片段基本互補的聚核苷酸。例如，如果聚核苷酸與編碼Eg5的mRNA的非間斷部分基本互補，則該序列與Eg5mRNA的至少一部分互補。
如本文所使用的，術語“雙鏈RNA”或“dsRNA”指核糖核酸分子復合體，其具有含如上所定義的兩個反向平行且基本互補的核酸鏈的二倍體結構。形成二倍體結構的兩條鏈可以是一個較大RNA分子的不同部分，或者它們可以是單獨的RNA分子。當兩條鏈為較大分子的一部分，并且由此通過形成二倍體結構的一條鏈的3’末端和相應另一條鏈的5’末端之間無間斷的核苷酸鏈連接時，所述連接RNA鏈被稱為“發(fā)夾環(huán)”。當兩條鏈通過除形成二倍體結構的一條鏈的3’末端和相應另一條鏈的5’末端之間無間斷的核苷酸鏈之外的其它方式共價連接時，此連接結構稱為“接頭(linker)”。RNA鏈可以有相同或不同數(shù)量的核苷酸。堿基對的最大數(shù)量為dsRNA的最短鏈的核苷酸的數(shù)量減去二倍體中存在的任意懸端。除了二倍體結構，dsRNA還可以包含一個或多個核苷酸懸端。
如本文所使用的，“核苷酸懸端”指不配對的核苷酸或當dsRNA的一條鏈的3’末端超過另一條鏈的5’末端或反之時從dsRNA的二倍體結構突出的核苷酸。“平端”或“平末端”表示在dsRNA的末端沒有不配對核苷酸，即沒有核苷酸懸端?！捌侥┒说摹眃sRNA在其整個長度上都是雙鏈的dsRNA，即分子的兩個末端沒有核苷酸懸端。
術語“反義鏈”指含與靶標序列基本互補的區(qū)域的dsRNA鏈。如本文所使用的，術語“互補區(qū)域”指反義鏈上與本文所定義的序列如靶標序列基本互補的區(qū)域。當互補區(qū)域不與靶標列完全互補時，末端區(qū)域內(nèi)的錯配如果存在，則所容許的錯配發(fā)生在末端區(qū)域，在通常在末端區(qū)域，比如5’和/或3’末端的6、5、4、3或2個核苷酸之內(nèi)。
如本文所使用的，術語“正義鏈”指含與反義鏈區(qū)域基本互補的區(qū)域的dsRNA鏈。
如本領域的技術人員所理解的，“引入細胞”當描述dsRNA被的引入細胞時，其表示便于攝取或吸收進入細胞。dsRNA的吸收或攝取可以通過非協(xié)助性擴散或主動的細胞過程或通過輔助試劑或設備進行。這個術語的意思并不限定于體外的細胞；dsRNA還可以“被引入到細胞中”，其中所述細胞是活生物體的一部分。在這種情況下，引入至細胞中包括向生物體的遞送。例如，對于體內(nèi)遞送而言，dsRNA可以被注射到組織位點或全身地施用。體外引入至細胞包括本領域已知的方法如電穿孔和脂質(zhì)體轉染。
當術語“沉默”和“抑制表達”指Eg5基因的表達時，它們在本文指至少部分抑制Eg5基因的表達，通過與第二細胞或細胞群相比可以從第一細胞或細胞群中分離的轉錄自Eg5基因的mRNA數(shù)量的減少來表示，其中所述第一細胞或細胞群中Eg5基因被轉錄且其已經(jīng)被處理以至Eg5基因的表達被抑制，所述第二細胞或細胞群與所述第一細胞或細胞群基本相當?shù)錄]有作此處理(對照細胞)。抑制程度通常用以下方式表示
或者，抑制程度可以以參數(shù)減少的方式給出，所述參數(shù)功能地與Eg5基因轉錄相聯(lián)系，如細胞所分泌的由Eg5基因編碼的蛋白的數(shù)量，或呈現(xiàn)某種表型如細胞凋亡的細胞的數(shù)量。理論上，Eg5基因沉默可以在任意表達靶標的細胞中確定，或者組成性地或通過基因工程和通過任意合適的試驗來實現(xiàn)。然而，當需要參考以確定給定dsRNA是否某種程度地抑制Eg5基因的表達并由此包括在本發(fā)明內(nèi)，以下實施例中所提供的試驗將作為這種參考。
例如，在某些情況下，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸，Eg5基因(或VEGF基因)的表達至少被抑制約20％、25％、35％或50％。在一些實施方案中，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸，Eg5基因至少被抑制約60％、70％或80％。在一些實施方案中，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸，Eg5基因至少被抑制約85％、90％或95％。表1-3提供了利用不同濃度的不同Eg5dsRNA分子的表達抑制的數(shù)值。
如本文在Eg5表達的上下文中所使用的，術語“治療(“treat”)、“治療”(“treatment”)等指由Eg5表達介導的生理過程的減輕或緩和。在本發(fā)明的上下文中只要它涉及本文以下所列舉的其它任意狀況(而非由Eg5表達介導的生理過程)，術語“治療(“treat”)、“治療”(“treatment”)等表示減輕或緩和至少一種與這種狀況相關的癥狀，或減緩或逆轉這種狀況的發(fā)展，如肝癌的減緩和發(fā)展。
如本文所使用的，短語“治療有效量”和“預防有效量”指在由Eg5表達介導的病理過程或由Eg5表達(單獨或與VEGF表達聯(lián)合)介導的病理過程的明顯癥狀的治療、抑制或控制中產(chǎn)生治療效益的量。治療有效的特定量可以由一般的從醫(yī)人員很容易地得到確定，并且可以根據(jù)本領域已知的因素變化，如由Eg5表達介導的病理過程的類型、患者的歷史和年齡、由Eg5表達介導的病理過程的階段和施用其它抗由Eg5表達介導的病理過程的試劑。
如本文所使用的，“藥物組合物”含藥學有效量的dsRNA和藥學上可接受的載體。如本文所使用的，“藥學有效量”、“治療有效量”或“有效量”指對產(chǎn)生期望的藥理、治療或抑制結果有效的RNA的量。例如，如果當與疾病或病癥相關的可計算參數(shù)有至少25％的減少時給定的臨床治療被認為是有效的，那么用于那個疾病或病癥治療的藥物的治療有效量是影響那個參數(shù)至少25％減少所必需的量。
術語“藥學上可接受的載體”指用于施用治療劑的載體。這種載體包括但不限于鹽、緩沖鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它們的組合。術語特異地排除細胞培養(yǎng)液。對于口服給藥的藥物而言，藥學上可接受的載體包括但不限于藥學上可接受的賦形劑如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、芳香劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖，玉米淀粉和褐藻酸是合適的崩解劑。粘合劑可以包括淀粉和明膠，如果存在潤滑劑將通常為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果需要，片劑可以用如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的物質(zhì)進行包被以延遲胃腸道中的吸收。
如本文所使用的，“轉化的細胞”是在其中已經(jīng)引入可以表達dsRNA分子的載體的細胞。
II.雙鏈核糖核酸(dsRNA) 在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于抑制細胞或哺乳動物中Eg5基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子(單獨使用或與抑制VEGF表達的第二dsRNA聯(lián)合使用)，其中所述dsRNA包含具有與Eg5基因表達中形成的mRNA的至少一部分互補的互補區(qū)域的反義鏈，并且其中所述互補區(qū)域小于30個核苷酸長度通常為19-24個核苷酸長度，并且其中所述dsRNA一旦與表達所述Eg5基因的細胞接觸就抑制所述Eg5基因的表達至少40％。dsRNA含兩個RNA鏈，它們充分地互補以雜交形成二倍體結構。dsRNA的一條鏈(反義鏈)包含與衍生自Eg5基因表達過程中形成的mRNA序列的靶標序列基本互補且通常為完全互補的互補區(qū)域，另外一條鏈(正義鏈)含與反義序列互補的區(qū)域，這樣當在合適的條件下結合時兩條鏈就會雜交并形成二倍體結構。通常，二倍體結構在15和30之間，更通常地在18和25之間，然而更通常地在19和24之間，并且最通常地在19和21個堿基對長度之間。類似地，與靶標序列互補的區(qū)域在15個30之間，更通常地在18和25之間，然而更通常地在19和24之間，并且最通常地在19和21個核苷酸長度之間。本發(fā)明的dsRNA還可以包含一個或多個單鏈核苷酸懸端。如以下進一步討論的，dsRNA可以通過本領域已知的標準方法合成，如使用可以來自例如Biosearch、Applied Biosystems，Inc的商業(yè)可得的自動DNA合成儀。在優(yōu)選實施方案中，Eg5基因為人的Eg5基因。在特定的實施方案中，dsRNA的反義鏈包含表1-3的正義序列并且第二序列選自由表1-3的反義序列組成的組。表1-3中提供的靶向靶標序列的其它位置的可選擇的反義物質(zhì)可以利用靶標序列和Eg5側面序列容易地確定。在利用靶向VEGF的第二dsRNA的實施方案中，在實施例和通過引用結合入本文的同時待審的美國申請?zhí)?1/078,073和11/340,080中例證了這種物質(zhì)。
dsRNA將含選自由表1-3所提供的序列組成的組的至少兩個核苷酸序列。兩個序列中的一個與兩個序列中的另一個互補，其中一個序列與Eg5基因表達中產(chǎn)生的mRNA序列基本互補。這樣，dsRNA將包含兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸被描述為表1-3中的正義鏈且第二寡核苷酸被描述為表1-3中的反義鏈。
本領域的技術人員很清楚，已經(jīng)認定含20-23間，但特別是21個堿基對的二倍體結構的dsRNA在誘導RNA干擾中尤其有效(Elbashir等人，EMBO2001，206877-6888)。然而，其它人發(fā)現(xiàn)更短或更長的dsRNA也可以是有效的。在以上闡述的實施方案中，利用表1-3所提供的寡核苷酸序列的特質(zhì)，本發(fā)明的dsRNA可以包含至少一條最少為21nt長度的一條鏈?？梢赃m當?shù)仄谕?，與以上所闡述的dsRNA相比，含表1-3的一條序列的較短dsRNA僅在一端或兩末端減去一些核苷酸就能同樣地有效。因此，本發(fā)明關注以下所描述的dsRNA，其包含來自表1-3的一條序列的至少15、16、17、18、19、20或更多連續(xù)的核苷酸的部分序列，且其在如本文隨后所闡述的在FACS試驗中與含全序列的dsRNA的區(qū)別在于抑制Eg5基因表達的能力不大于5、10、15、20、25或30％。利用Eg5序列和所提供的靶標序列可以容易地制備在表1-3所提供的在靶標序列內(nèi)切割的dsRNA。
另外，表1-3所提供的RNAi物質(zhì)在Eg5mRNA中識別一個易于基于RNAi的切割的位點。針對此，本發(fā)明還包括靶向序列內(nèi)部的RNAi物質(zhì)，所述序列通過一個所述本發(fā)明的物質(zhì)靶向。如本文所使用的，如果第二RNAi物質(zhì)在與第一RNAi物質(zhì)的反義鏈互補的mRNA的內(nèi)部任意位置切割信使，就說第二RNAi物質(zhì)靶向第一RNAi物質(zhì)的序列內(nèi)部。這種第二物質(zhì)通常由來自表1-3提供的一個序列的至少15個連續(xù)寡核苷酸和來自緊鄰所選擇的Eg5基因的序列的區(qū)域的其它核苷酸序列偶聯(lián)而成。例如，SEQ ID NO1的最后15個核苷酸與來自靶標Eg5基因的隨后6個核苷酸結合產(chǎn)生一個21核苷酸的單鏈物質(zhì)，該物質(zhì)基于表1-3所提供的一個序列。
本發(fā)明的dsRNA能夠包含與靶標序列的一個或多個錯配。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的dsRNA包含不大于3個錯配。如果dsRNA的反義鏈含與靶標序列的錯配，優(yōu)選錯配區(qū)域不位于互補區(qū)域的中心。如果dsRNA的反義鏈含與靶標序列的錯配，優(yōu)選所述錯配被限制在從任意末端的5個核苷酸，例如從互補區(qū)域的5’或3’末端的5、4、3、2或1個核苷酸。例如，對于與Eg5基因的一個區(qū)域互補的23個核苷酸dsRNA鏈來說，dsRNA通常在中心的13個核苷酸內(nèi)不包含任意錯配。本發(fā)明中所闡述的方法可以用于確定包含與靶標序列錯配的dsRNA在抑制Eg5基因表達中是否有效。考慮帶有錯配的dsRNA在抑制Eg5基因表達中的效率是重要的，尤其如果已知Eg5基因中的特定互補區(qū)域在群體中具有多態(tài)序列變化。
在一個實施方案中，至少dsRNA的一個末端具有1至4、通常為1或2個核苷酸的單鏈核苷酸懸端。具有至少一個核苷酸懸端的dsRNA與它們的平末端的對應物相比具有意想不到的較高的抑制性能。另外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅一個核苷酸懸端的存在會增強dsRNA的干擾活性，而不影響它的整體穩(wěn)定性。已經(jīng)證明僅具有一個懸端的dsRNA在體內(nèi)和各種細胞、細胞培養(yǎng)液、血液和血清中尤其穩(wěn)定和有效。通常，單鏈懸端位于反義鏈的3’終端或者，可選擇地，位于正義鏈的3’終端。dsRNA也可以有平末端，通常位于反義鏈的5’末端。已經(jīng)證明這種dsRNA的穩(wěn)定性和抑制活性，因此允許低劑量施用，即每天少于5mg/kg受試者體重。通常，dsRNA的反義鏈在3’末端有核苷酸懸端，5’末端為平端。在另一個實施方案中，懸端中的一個或多個核苷酸用核苷硫代磷酸酯代替。
然而在另一個實施方案中，對dsRNA進行化學修飾以增強穩(wěn)定性。本發(fā)明的核酸可以通過本領域建立好的方法合成和/或修飾，如“Current protocolsin nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等人.(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中所闡述的那些方法，其通過引用結合入本文。本發(fā)明中有用的優(yōu)選的dsRNA化合物的特定示例包括含修飾骨架的或沒有天然的核苷間連接的dsRNA。如在這個說明書中所定義的，有修飾骨架的dsRNA包括那些在骨架中保留磷原子的dsRNA和那些在在骨架中不保留磷原子的dsRNA。出于本說明書的目的，并且如有時在本領域中所指的，在它們的核苷間骨架中不含磷原子的修飾dsRNA也能被認為是寡核苷。
優(yōu)選的修飾dsRNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亞烷基膦酸酯)和手性膦酸酯的、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯，以及具有正常的3’-5’連接的硼烷磷酸酯、這些的2’-5’連接的類似物和反向結構，其中相鄰的核苷單元是3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’連接。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。
教導以上含磷連接的代表性美國專利包括但不限于美國專利No.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，每一個通過引用結合入本文。
優(yōu)選其內(nèi)不含磷原子的修飾dsRNA骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接、或一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接形成的骨架。這些包括那些具有嗎啉連接(部分由核苷的糖部分形成)的骨架，硅氧烷骨架，硫化物、亞砜和砜骨架，formacetyl和thioformacetyl骨架，methyleneformacetyl和thioformacetyl骨架，含烯的骨架，氨基磺酸酯骨架，亞甲基亞胺和亞甲基肼基骨架，磺酸酯和氨磺酰骨架，酰胺骨架，和其它具有混合的N、O、S和CH2組成部分的骨架。
教導制備以上寡核苷制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利No.5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，每一個通過引用結合入本文。
在另一個優(yōu)選的dsRNA模擬物中，的糖和核苷間連接即核苷酸單元的骨架被新基團取代。保持堿基單元以與適當?shù)暮怂岚袠嘶衔镫s交。一種這樣的寡聚合物，即已經(jīng)顯示具有優(yōu)異的雜交特性的dsRNA模擬物，指的是肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，dsRNA的糖骨架被含酰胺的骨架，尤其氨乙基甘氨酸骨架取代。核堿基被保留并直接或間接地結合骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。教導制備以上PNA化合物的代表性美國專利包括但不限于美國專利No.5,539,082、5,714,331和5,719,262，每一個都通過引用結合入本文。PNA化合物的進一步教導見于Nielsen等人.，Science，1991，254，1497-1500。本發(fā)明的最優(yōu)選實施方案為具有硫代磷酸酯骨架的dsRNA和具有雜原子骨架的寡核苷，尤其是上述參考的美國專利No.5,489,677的-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然的磷酸二酯骨架由-O-P-O-CH2-代表]，以及上述參考的美國專利No.5,602,240的酰胺骨架。還優(yōu)選上述參考的美國專利No.5,034,506的含有嗎啉基骨架結構的dsRNA。修飾的dsRNA還可以含一個或多個取代的糖部分。優(yōu)選的dsRNA在2’位置包含下述之一OH、F、O-、S-或N-烷基、O-、S-或N-鏈烯基、O-、S-或N-炔基或O-烷基-O-烷基，其中烷基、鏈烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10鏈烯基和炔基。尤其優(yōu)選的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m為1至大約10。其它優(yōu)選的dsRNA在2’位置含下述之一C1至C10低級烷基、取代的低級烷基、芳香基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報告基團、嵌入劑、提高dsRNA藥代動力學特性的基團或提高dsRNA藥效學特性的基團、以及其它具有類似特性的取代基。優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也即2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧基-烷氧基基團。另一個優(yōu)選的修飾包括如以下示例中闡述的2’-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團，也即2’-DMAOE，以及如以下示例中闡述的2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領域中也即2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其它優(yōu)選修飾包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。類似的修飾也可以在dsRNA的其它位置完成，尤其是3’末端核苷酸上或在2’-5’連接的dsRNA中的糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。dsRNA還可以具有糖模擬物如取代呋喃戊糖的環(huán)丁基部分。教導這種修飾糖結構的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利Nos.4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，其中某些是本申請通常所擁有的，并且每一個通過引用整體結合入本文。
dsRNA也還以包括核堿基(在本領域中通常簡稱為“堿基”)修飾物或取代物。如本文所使用的，“非修飾”或“天然”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核堿基包括其它合成的和天然的核堿基如5’-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代尤其是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。其它核堿基包括公開于美國專利號3,687,808的；在The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering(聚合物科學和工程的簡明百科全書)，第858-859頁，Kroschwitz，J.L，ed.John Wiley & Sons，1990中公開的；由Englisch等人.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613中公開的；以及由Sanghvi，Y S.，第15章，DsRNA Research and Applications(dsRNA研究與應用)，第289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，Ed.，CRC出版社，1993公開的。這些核堿基中的某些對提高本發(fā)明的寡聚化合物的結合親和力是特別有利的。這些核堿基包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶和N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，其包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸二倍體的穩(wěn)定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，Eds.，DsRNA Research and Applications(dsRNA研究和應用)，CRC出版社，Boca Raton，1993，第276-278頁)，并是目前的優(yōu)選堿基取代基，甚至更加特別地當與2’-O-甲氧基乙基糖修飾物組合時。
教導以上所提到的某些修飾的核堿基和其它修飾的核堿基的制備的代表性美國專利包括但不限于以上提到的美國專利號3,687,808，還有美國專利號4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617和5,681,941，每一個都通過引用結合入本文，以及美國專利號5,750,692，也通過引用結合入本文。
本發(fā)明的dsRNA的另一種修飾包括化學性連接至dsRNA的一個或多個部分或共軛物，其能增強dsRNA的活性、細胞分布和細胞攝取。這種部分包括但不限于脂部分如膽固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，199，86，6553-6556)，膽酸(Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.，199441053-1060)，硫醚如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)，硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，和脂肪鏈如十二烷基二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J，1991，10，1111-1118；Kabanov等人，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75，49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969-973)或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)，十六烷基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或十八胺或己胺-羰基羥膽固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。
教導這種dsRNA共軛物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利No.4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，每一個都通過引用結合入本文。
沒有必要對給定化合物中的所有位置進行一致地修飾，并且事實上前述修飾中多于一個修飾可以引入到單個化合物中或者甚至是dsRNA內(nèi)的單個核苷上。本發(fā)明還包括是嵌合化合物的dsRNA化合物。在本發(fā)明的正文中，“嵌合的”dsRNA化合物或“嵌合體”為dsRNA化合物，尤其是含兩個或多個化學分離區(qū)的dsRNA，每一個所述區(qū)域由至少一個單體單元即dsRNA化合物的核苷酸構成。典型地這些dsRNA包含至少一個區(qū)域，其中對所述dsRNA進行修飾以便賦予dsRNA提高的核酸酶降解的抗性、提高的細胞攝取、和/或提高的與靶標核酸的結合親和力。dsRNA的一個附加區(qū)域可以作為能夠剪切RNADNA或RNARNA雜合體的酶的底物。例如，RNase H是一種胞內(nèi)的能剪切RNADNA二倍體的RNA鏈的內(nèi)切酶。因此，RNase H的激活引起RNA靶標的剪切，由此極大地增強基因表達的dsRNA抑制的效率。因此，與雜交至同一靶標區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧dsRNA相比，當使用嵌合dsRNA時用較短的dsRNA通常就能夠獲得可比較的結果。RNA靶標的剪切可以通過凝膠電泳檢測，而且如果需要用本領域已知的相關核酸雜交技術進行常規(guī)檢測。在某些情況下，dsRNA可以通過非配體基團進行修飾。一些非配體分子已經(jīng)被共軛結合至dsRNA上以增強dsRNA的活性、細胞分布或細胞攝取，并且進行這種共軛結合的過程可在科學文獻中獲取。這種非配體部分包括脂部分如膽固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，866553)，膽酸(Manoharan等人.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，41053)，硫醚如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，32765)，硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20533)，脂肪鏈如十二烷基二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10111；Kabanov等人，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，7549)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，183777)，聚胺或聚乙烯乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14969)，或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651)，十六烷基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264229)，或十八胺或己胺-羰基氧膽固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277923)。教導這種dsRNA共軛物的制備的代表性美國專利已經(jīng)在上面列出。典型的共扼方案包括合成在序列的一個或多個位置帶有氨接頭的dsRNA。然后利用合適的偶合或活化劑使氨基團與將要被共扼結合的分子反應。共扼反應可以用仍然結合在固體支持物上的dsRNA進行或者在將dsRNA剪切至液相中之后進行。用HPLC純化dsRNA共軛物通常可以獲得純共軛物。
編碼RNAi物質(zhì)的載體 本發(fā)明的dsRNA還可以表達自體內(nèi)的細胞內(nèi)的重組病毒載體。本發(fā)明的重組病毒載體含編碼本發(fā)明的dsRNA的序列和用于表達該dsRNA序列的任意合適的啟動子。合適的啟動子包括，例如U6或H1RNApol III啟動子序列和巨細胞病毒啟動子。其它合適的啟動子的選擇在本領域的技術范圍內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載體還可以包含可誘導的或可調(diào)控的啟動子用于在特定組織或特定細胞內(nèi)環(huán)境中表達dsRNA。重組病毒載體將本發(fā)明的dsRNA遞送至體內(nèi)的細胞中的用途將在以下更詳細地進行討論。
本發(fā)明的dsRNA可以以兩個單獨的互補RNA分子或具有兩個互補區(qū)域的單個RNA分子形式表達自重組病毒載體。
可以使用能夠接受要表達的dsRNA分子的編碼序列的任意病毒載體，如衍生自腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉錄病毒(如慢病毒(LV)、棒狀病毒、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體。病毒載體的向性可以適當?shù)赝ㄟ^用來自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原對載體進行假構型化或者通過取代不同的病毒衣殼蛋白而進行修飾。
例如，本發(fā)明的慢病毒載體可以用來自皰疹性口腔炎病毒(VSV)、狂犬病毒、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白進行假構型化?？梢酝ㄟ^對載體進行基因改造以表達不同的衣殼蛋白血清型而使本發(fā)明的AAV載體靶向不同的細胞。例如，表達2號血清型基因組上的2號血清型衣殼的AAV載體稱作AAV 2/2。AAV 2/2載體中的這種2號血清型衣殼基因可以由5號血清型衣殼基因取代以產(chǎn)生AAV2/5載體。用于構建AAV載體以表達不同衣殼蛋白血清型的技術是本領域的技術，參見如Rabinowitz J E等人(2002)，JVirol 76791-801，其整體公開通過引用結合入本文。
適合本發(fā)明使用的重組病毒載體的選擇、將表達dsRNA的核酸序列插入載體內(nèi)的方法和將病毒載體遞送至感興趣細胞的方法都是本領域的技術，參見如Dornburg R(1995)，Gene Therap.2301-310；Eglitis M A(1988)，Biotechniques6608-614；Miller A D(1990)，Hum Gene Therap.15-14；Anderson W F(1998)，Nature 39225-30和Rubinson D A等人，Nat.Genet.33401-406，其整體公開通過引用結合入本文。
優(yōu)選的病毒載體是那些衍生自AV和AAV的載體。在特定的優(yōu)選實施方案中，重組的AAV載體將本發(fā)明的dsRNA表達為兩個單獨的互補的單鏈RNA分子，所述AAV載體含例如U6或H1RNA啟動子或巨細胞病毒(CMV)啟動子。
適合用于表達本發(fā)明的dsRNA的AV載體、構建重組AV載體的方法和將所述載體遞送至靶標細胞的方法在Xia H等人(2002)，Nat.Biotech.201006-1010中進行了闡述。
適合用于表達本發(fā)明的dsRNA的AAV載體、構建重組AV載體的方法和將所述載體遞送至靶標細胞的方法在Samulski R等人(1987)，J.Virol.613096-3101；Fisher K J等人.(1996)，J.Virol，70520-532；Samulski R等人(1989)，J.Virol.633822-3826；美國專利號5,252,479；美國專利號5,139,941；國際專利申請?zhí)朩O94/13788和國際專利申請?zhí)朩O93/24641中進行了闡述，其整體公開通過引用結合入本文。
III.含dsRNA的藥物組合物 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了含如本文所闡述的dsRNA和藥學上可接受的載體的藥物組合物。含dsRNA的藥物組合物用于治療與Eg5基因的表達或活性相關的疾病或病癥，如對由Eg5表達介導的病理過程是有用的。這種藥物組合物根據(jù)遞送方式配制。一個示例是將組合物配成適合通過非腸道遞送的全身性施用。
在另一個實施方案中，這種組合物還將包含抑制VEGF表達的第二dsRNA。指向VEGF的dsRNA在實施例以及同時待審的美國申請?zhí)?1/078,073和11/340,080中進行了闡述。
本發(fā)明的藥物組合物以足以抑制Eg5基因表達(和當包括第二dsRNA時抑制VEGF表達)的劑量給藥。通常，dsRNA的合適劑量是0.01至5.0毫克/千克受試者體重/天，通常為1微克至1mg/千克體重/天。藥物組合物可以每天給藥一次或者dsRNA可以在一天內(nèi)以適當?shù)拈g隔2、3或多次亞劑量給藥，或者甚至通過控釋制劑使用連續(xù)輸送或遞送給藥。在這種情況下，每個亞劑量中所含的dsRNA必須相對較少以達到每天的總劑量。也可以整合劑量單位用于每隔數(shù)天的遞送，如使用常規(guī)的緩釋制劑，從而在每隔數(shù)天的周期內(nèi)提供緩慢釋放的dsRNA。緩釋制劑是本領域所熟知的，并且尤其對于將物質(zhì)遞送到特定位置是有利的，比如可以與本發(fā)明的物質(zhì)一起使用。在這個實施方案中，劑量單位含相應倍數(shù)的日劑量。
熟練的技術人員可以理解某些因素可能影響有效治療受試者所需要的劑量和時間的選擇，所述因素包括但不限于疾病或病癥的嚴重度、以往的治療、受試者的綜合健康度和/或年齡以及其它疾病的存在。另外，受試者利用治療有效量的組合物的治療可以包括單個治療或系列治療。如本文其它地方所闡述的，可以利用常規(guī)的方法學或者在利用合適的動物模型進行體內(nèi)檢測的基礎上估計本發(fā)明所涵蓋的單個dsRNA的有效量和體內(nèi)半衰期。
小鼠遺傳學的發(fā)展已知產(chǎn)生了多個用于各種人類疾病研究的小鼠模型，如由Eg5表達介導的病理過程。這種模型用于體內(nèi)檢測dsRNA，并用于確定治療有效量。
本發(fā)明還包括藥物組合物和包含本發(fā)明的dsRNA化合物的制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)是否需要局部或全身治療和要治療的區(qū)域以多種方式給藥。施用可以是局部的、肺部的，如通過吸入或噴射粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮，經(jīng)口或非腸道。非腸道施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注，或者顱內(nèi)如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。
用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗液、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體和粉末。常規(guī)藥物載體、水、粉末或油基料、增稠劑等也是可能需要的或想要的。還可以使用有涂層的避孕套、手套等。優(yōu)選的局部用制劑包括這樣的，其中本發(fā)明的dsRNA是與局部遞送試劑如脂、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑混合的制劑。優(yōu)選的脂和脂質(zhì)體包括中性的(如二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性的(如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子的(如四甲基氨基丙基二油酰DOTAP和二油?；字；掖及稤OTMA)?？梢詫⒈景l(fā)明的dsRNA包封在脂質(zhì)體內(nèi)或者與其形成復合物，尤其是與陽離子脂質(zhì)體?？蛇x擇地，dsRNA可以與脂質(zhì)復合，尤其是與陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸酯、二月桂精、甘油1-單癸酸酯、1-正十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、?；舛緣A、酰基膽堿、或C1-10烷酯(如肉豆蔻酸異丙酯IPM)、甘油單酯、甘油二酯或它們的藥學上可接受的鹽。局部用制劑在1999年5月20日提交的美國專利申請09/315,298中詳細闡述，通過引用整體結合入本文。
用于口服給藥-的組合物和制劑包括粉末或顆粒、微粒、納米顆粒、在水中或非水媒介中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、片劑或微片劑?？赡苄枰龀韯?、芳香劑、稀釋液、乳化劑、分散劑或粘合劑。優(yōu)選的經(jīng)口制劑是其中本發(fā)明的dsRNA與一個或多個滲透增強劑、表面活性劑和螯合劑一起施用的制劑。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽酸/鹽包括鵝脫氧膽酸(CDCA)和烏索脫氧膽酸(ursodeoxychenodeoxycholic acid，UDCA)、膽酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、葡糖膽酸、甘油膽酸、甘油脫氧膽酸、?；悄懰?、牛磺脫氧膽酸、牛磺-24，25-二氫-梭鏈孢酸鈉和甘油二氫梭鏈孢酸鈉。優(yōu)選的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酯、三癸酯、單油酸酯、二月桂精、甘油1-單癸酸酯、1-正十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、酰基肉毒堿、?；憠A、或甘油單酯、甘油二酯或它們的藥學上可接受的鹽(如鈉鹽)。優(yōu)選的還有滲透增強劑的組合，如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。尤其優(yōu)選的組合是月桂酸、辛酸和UDCA的鈉鹽。其它滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂烷基醚、聚氧乙烯-20-十八烷基醚。本發(fā)明的dsRNA可以以包括噴射干燥顆?；蚓酆闲纬晌㈩w?；蚣{米顆粒的粒狀形式經(jīng)口遞送。dsRNA復合劑包括聚氨基酸，聚亞胺，聚丙烯酸酯，聚丙烯酸烷酯、聚氧乙烷、聚氰基丙烯酸烷酯，陽離子化的明膠、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉，聚氰基丙烯酸烷酯，DEAE衍生的聚亞胺、短梗霉多糖、纖維素和淀粉。尤其優(yōu)選的復合劑(complexing agent)包括殼聚糖、N-三甲基殼聚糖、聚L賴氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯嘧啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(如對氨基)、聚(氰基丙烯酸甲基酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-丙烯酸甲酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D，L-乳酸)、聚D，L-乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)、藻酸鹽和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制劑以及它們的制備在美國申請No.08/886,829(1997年7月1日提交)、09/108,673(1998年7月1日提交)、09/256,515(1999年2月23日提交)、09/082,624(1998年5月21日提交)和09/315,298(1999年5月20日提交)中進行了詳細闡述，在本文每一個都通過參考整體并入。
用于非腸道、鞘內(nèi)、顱內(nèi)或肝內(nèi)施用的組合物和制劑可以包括無菌的水溶液，所述水溶液還可以包含緩沖液、稀釋液和其它合適的添加劑，例如但不限于滲透增強劑、載體化合物和其它藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從多種組分生成，所述組分包括但不限于預制的液體、自乳化的固體和自乳化的半固體。當治療肝臟病如肝癌時，尤其優(yōu)選的是靶向肝臟的制劑。
本發(fā)明的藥物制劑可以是便利的單位劑量形式，其可以根據(jù)制藥業(yè)中熟知的常規(guī)技術進行制備。這種技術包括使活性成分與藥物載體或賦形劑相結合的步驟。通常，制劑通過均勻地且緊密地將活性成分與液體載體或者精細研磨的固體載體或兩者組合，然后必要時將產(chǎn)品制成型。
本發(fā)明的組合物可以配制成任意多個可能的劑型，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠囊、液體糖漿、軟膠囊、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以制成水、非水或混合媒介的懸浮液。水懸浮液還可以包含提高懸浮液粘度的物質(zhì)，包括但不限于甲基纖維素碳酸鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮液還可以含穩(wěn)定劑。
乳劑 本發(fā)明的制劑和組合物可以制備并配制成乳劑。乳劑是典型地一種液體以直徑通常超過0.1μm的微滴形式分散在另一種液體中的異源體系(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199頁；Rosoff，inPharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245頁；BlockinPharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第2卷，第335頁；Higuchi等人，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，第301頁)。乳劑經(jīng)常是雙相系統(tǒng)，其包含互不混溶的2個彼此緊密混合并分散的液相。通常，乳劑可以為油包水(w/o)或水包油(o/w)兩種。當水相作為微小液滴細碎并分散到本體油相中時，所產(chǎn)生的組合物被稱為油包水(w/o)乳劑?？蛇x擇地，當油相作為微小液滴細碎并分散到本體水相中時，所產(chǎn)生的組合物被稱為水包油(o/w)乳劑。除了分散相和活性藥物外，乳劑還可以含其它組分，其可以作為在水相、油相中的溶液，或者其自身作為獨立相。如果需要，也可以存在藥物賦形劑如乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑。藥物乳劑也可以為含多于兩種相的多重乳劑，如油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情況。這種復雜的制劑通常具有某些簡單的二相乳劑所不具有的優(yōu)勢。當多重乳劑中的o/w乳劑的各油滴還包有小水滴時，該多重乳劑形成w/o/w乳劑。同樣地，在油連續(xù)相中穩(wěn)定化的水滴中包封油滴的系統(tǒng)，構成o/w/o乳劑。乳劑具有較小或沒有熱力學穩(wěn)定性的特點。通常，乳劑的分散相或不連續(xù)相很好地分散在外相或連續(xù)相中并通過乳化劑或制劑的粘性保持這種形式。在乳劑狀軟膏基料或膏劑的情況下，乳劑的每個相都可以為半固體或固體。其它穩(wěn)定乳劑的方式需要使用乳化劑，該乳化劑可以引入到乳劑的任意相中。乳化劑可以寬泛地分成四種類型合成的表面活性劑、天然存在的乳化劑、吸收基料和細分散的固體(Idson，inPharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第1卷，第199頁)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)合成的表面活性劑，也即表面活性試劑，在乳劑配制中有廣泛應用，并且已經(jīng)在文獻中進行了綜述(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第285頁；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第1卷，第199頁)。表面活性劑是典型的兩性分子，包含親水部分和疏水部分。表面活性劑的親水和疏水性的比值定義為親水性/疏水性比(HLB)，它是制劑制備過程中分類和選擇表面活性劑的評價工具。表面活性劑可以根據(jù)親水基團的性質(zhì)被分成不同的類型非離子型、陰離子型、陽離子型和兩性型(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第285頁)。
乳劑配制中使用的自然存在的乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂和阿拉伯樹膠。吸收基料具有親水特性，所以它們能夠吸收水，形成w/o乳劑并仍然保持它們的半固體稠度，如無水羊毛脂和親水凡士林。細碎的固體也已經(jīng)被用做優(yōu)良的乳化劑，尤其是與表面活性劑組合和在粘性制品中使用。它們包括極性無機固體如重金屬氫氧化物，不溶脹的粘土如斑脫土、綠坡縷石、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠狀硅酸鋁和膠狀硅酸鎂鋁，色素和非極性固體如碳或三硬脂酸甘油酯。
在乳劑制劑中還包含多種非乳化物，它們對乳劑的性質(zhì)有幫助。這些非乳化物包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、濕潤劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第335頁；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199頁)。
親水膠體或水狀膠體包括天然存在的樹膠和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯樹膠、瓊脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳膠、刺梧桐樹膠和皇蓍膠)，纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)和合成的聚合物(如碳聚物、纖維素醚和羰基乙烯基聚合物)。這些物質(zhì)在水中分散或膨脹形成膠狀溶液，其通過在分散相小滴的周圍形成強的界面膜層并通過增強外相的粘度來穩(wěn)定乳劑。由于乳劑通常包含一些可以容易地支持微生物生長的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以這些制劑通常含有防腐劑。乳劑制劑中通常使用的防腐劑包括甲基對羥基苯甲酸酯、丙基對羥基苯甲酸酯、季銨鹽、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸酯和硼酸。通常也將抗氧劑加入到乳劑制劑中，以預防制劑的變質(zhì)。所使用的抗氧化劑可以為自由基清除劑如生育酚、棓酸烷酯、丁基化的羥基茴香醚，丁基化的羥基甲苯，或還原劑如抗壞血酸和偏亞硫酸氫鈉，以及抗氧化劑協(xié)同劑如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂。乳劑制劑通過皮膚的、經(jīng)口的和非腸道途徑的應用和它們的生產(chǎn)方法已經(jīng)在文獻(Idson，inPharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199頁)中綜述。因為制劑簡單并且在吸收和生物利用率方面的功效，經(jīng)口遞送的乳劑制劑已經(jīng)被廣泛使用(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245頁；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199頁)?；诘V物油的緩瀉藥、油溶性的維生素和高脂肪營養(yǎng)制品屬于經(jīng)常作為o/w乳劑經(jīng)口施用的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，dsRNA與核酸的組合物是制成微乳劑。微乳劑可以定義為水、油和兩親物的體系，它是單一的光學各向同性的和熱力學穩(wěn)定的液體溶液(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245頁)。典型地，微乳劑是通過如下方法制備的體系，首先將油分散到表面活性劑水溶液中，然后加入足量的通常為中等鏈長度的醇的第四組分而形成透明體系。因此，微乳劑也被描述成由表面活性分子的界面膜層穩(wěn)定化的兩種不能混合的液體的熱力學穩(wěn)定的各向同性的澄清分散系(Leung和Shah，藥物的受控釋放聚合物和聚集體體系，Rosoff，M.，Ed.，1989，VCH出版社，New York，第185-215頁)。通常微乳劑通過組合包括油、水、表面活性劑、輔助表面活性劑和電解液的3至5種組分來制備。微乳劑是為油包水(w/o)還是水包油(o/w)類型依賴于所使用的油和表面活性劑的性質(zhì)以及表面活性劑分子的極性頭部和烴基尾的結構和幾何包裝(Schott，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學)，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1985，第271頁)。已經(jīng)廣泛地研究了利用相圖的現(xiàn)象學方法，并且可以產(chǎn)生關于本領域技術人員如何制備微乳的全面理論(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245頁；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1冊，第335頁)。與常規(guī)乳劑相比，微乳劑的優(yōu)點是能將水溶性藥物溶解到同時形成的熱力學穩(wěn)定的液滴制劑中。
微乳劑制備中所使用的表面活性劑包括但不限于單獨的或與輔助表面活性劑組合使用的離子表面活性劑、非離子表面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)。所述輔助表面活性劑通常是短鏈醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通過滲透到表面活性劑膜層中并在表面活性劑分子間產(chǎn)生空余空間從而產(chǎn)生無序膜，而提高界面流動性。然而，微乳劑可以不用輔助表面活性劑進行制備，并且無醇的自乳化微乳劑體系是本領域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、藥物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙烯乙二醇和乙烯乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如Captex 300，Captex 500，Capmul MCM，脂肪酸酯，中等鏈(C8-C12)的單、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯，飽和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
從藥物溶解和增強的藥物吸收方面看，微乳劑是特別令人感興趣的。已經(jīng)提議使用基于脂質(zhì)的微乳劑(o/w和w/o兩者)以增強經(jīng)口的包括肽在內(nèi)的藥物的生物利用度(Constantinides等人，Pharmaceutical Research(藥物研究)，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳劑具有以下優(yōu)勢提高藥物溶解度，防止藥物不受酶的水解，由于表面活性劑導致的膜流動性和滲透性的改變可能增強藥物的吸收，制備簡單，容易以固體劑型口服施用，提高臨床效能和降低毒性(Constantinides等人.，Pharmaceutical Research(藥物研究)，1994，11，1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。通常，微乳劑的成份在環(huán)境溫度下混合在一起時，它們可以自然形成微乳劑。當制備熱不穩(wěn)定的藥物、肽或dsRNA時，這可能尤其有益。在化妝品和藥物應用領域，還已經(jīng)將微乳劑有效地用于透皮遞送活性組分。我們期望本發(fā)明的微乳劑組合物和制劑將會有利于提高dsRNA和核酸從胃腸道的全身吸收，并提高dsRNA和核酸的局部的細胞攝取。
本發(fā)明的微乳劑還可以包含其它成份和添加劑如山梨醇單硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol和滲透增強劑，以提高制劑的性質(zhì)并增強本發(fā)明的dsRNA和核酸的吸收。本發(fā)明的微乳劑中使用的滲透增強劑可以分成五大類中的一種表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合的非表面活性劑(Lee等人.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92頁)。每個類型都已經(jīng)在以上進行了討論。
脂質(zhì)體 除了微乳以外，還有許多有組織的表面活性劑結構，人們已經(jīng)對它們進行了研究并用于藥物制劑。這些結構包括單分子層、膠束、雙分子層和囊泡。囊泡如脂質(zhì)體由于它們的特異性和在藥物遞送方面提供的作用的持久性已經(jīng)引起廣泛關注。如本發(fā)明中所使用的，術語“脂質(zhì)體”是指由排列成一個或多個球形雙分子層的兩性脂質(zhì)組成的泡囊。脂質(zhì)體是單層的或多層的囊泡，它具有從親脂性物質(zhì)和水性內(nèi)部形成的膜。水性部分含待遞送的組合物。陽離子脂質(zhì)體具有能夠與細胞壁融合的優(yōu)點。非陽離子脂質(zhì)體雖然不能與細胞壁進行如此有效地融合，但在體內(nèi)通過巨噬細胞被攝取。
為了穿越完整的哺乳動物皮膚，脂囊泡必須在受合適的透皮梯度的影響下穿過一系列的每個直徑小于50nm的小孔。因此，理想的是使用脂質(zhì)體，其是高度可變形的并能夠穿過這種小孔。
脂質(zhì)體的其它優(yōu)勢包括由天然磷脂形成的脂質(zhì)體是生物相容的和生物可降解的；脂質(zhì)體可以包括廣范圍的水和脂溶的藥物；脂質(zhì)體能夠防止包裹在其內(nèi)腔中的藥物代謝和降解(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第1卷，第245頁)。在脂質(zhì)體制劑制備中需要重要考慮的是脂表面電荷、囊泡大小和脂質(zhì)體中的水體積。脂質(zhì)體可用于將活性成份轉移和遞送至活性位點。因為脂質(zhì)體膜與生物膜在結構上相似，當將脂質(zhì)體應用于組織時，脂質(zhì)體就會開始和細胞膜融合并且在進行脂質(zhì)體和細胞的融合時，脂質(zhì)體的內(nèi)容物就會全部送入細胞中，在此活性物質(zhì)可以發(fā)揮作用。
很多研究的焦點是脂質(zhì)體制劑用于遞送各種藥物的模式。越來越多的證據(jù)表明對于局部施藥，脂質(zhì)體與其它制劑相比具有很多優(yōu)勢。這種優(yōu)勢包括降低與所施用藥物的高度全身吸收相關的副作用，提高所施用的藥物在預期靶標處的積累，和向皮膚施用廣范圍的親水性和疏水性藥物的能力。
一些報告已經(jīng)詳細敘述了脂質(zhì)體向皮膚遞送包括大分子量DNA在內(nèi)的物質(zhì)的能力。已經(jīng)將包括止痛劑、抗體、激素和大分子量DNA在內(nèi)的化合物施用給皮膚。大多數(shù)應用會導致靶向表皮。
脂質(zhì)體分成兩大類。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其與帶負電子的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復合物。帶正電荷的DNA/脂質(zhì)體復合物能結合至帶負電荷的細胞表面，并內(nèi)含在內(nèi)體中。由于內(nèi)體中的酸性pH，脂質(zhì)體破裂，釋放出它們的內(nèi)容物至細胞質(zhì)中(Wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。pH敏感的或帶負電荷的脂質(zhì)體捕獲DNA，而不是與其復合。由于DNA和脂質(zhì)兩者帶有類似的電荷，它們發(fā)生排斥而不是形成復合物。因而，一些DNA被捕獲至這些脂質(zhì)體的水性內(nèi)部。pH敏感性脂質(zhì)體已經(jīng)用于向培養(yǎng)物中的細胞單層中遞送編碼胸苷激酶基因的DNA。在靶細胞中檢測到外源基因的表達(Zhou等人，Journal of ControlledRelease，1992，19，269-274)。脂質(zhì)體組合物的一個重要類型包括磷脂，除了天然衍生的卵磷脂之外。中性脂質(zhì)體組合物例如可以從二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)形成。陰離子脂質(zhì)體組合物通常從二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而陰離子融合脂質(zhì)體從二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一種類型的脂質(zhì)體組合物是從卵磷脂(PC)形成，如大豆PC、和蛋PC。另一類是從磷脂和/或卵磷脂和/或膽固醇的混合物形成。
有一些研究評價了脂質(zhì)體藥物制劑向皮膚的局部遞送。含干擾素的脂質(zhì)體應用于豚鼠皮膚上，會減輕皮膚皰疹潰瘍，然而通過其它方式(如作為溶液或乳劑)遞送干擾素則是無效的(Weiner等人，Journal of Drug Targeting，1992，2，405-410)。另外，另一項研究檢驗了作為脂質(zhì)體制劑的一部分施用的干擾素對利用水性系統(tǒng)干擾素施用的效率，并得出結論脂質(zhì)體制劑優(yōu)于水性施用(du Plessis等人，Antiviral Research，1992，18，259-265)。還檢驗了非離子脂質(zhì)體系統(tǒng)，尤其是含非離子表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)，以確定它們在藥物向皮膚遞送中的功用。使用含Novasome.TM.I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome.TM.II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非離子脂質(zhì)體制劑來向小鼠真皮內(nèi)遞送環(huán)孢素A。結果表明，這種非離子脂質(zhì)體系統(tǒng)在促進環(huán)孢素A向不同皮膚層中的沉積方面是有效的(Hu等人，S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。脂質(zhì)體還包括“空間穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，本文使用的該術語是指含一個或多個特殊脂質(zhì)的脂質(zhì)體，當混入脂質(zhì)體中時，其會導致與沒有這種特殊脂質(zhì)的脂質(zhì)體相比提高的循環(huán)壽命?？臻g穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實例是這樣的，其中脂質(zhì)體的形成囊泡的脂質(zhì)部分的一部分(A)包含一個或多個糖脂如單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂G.M1，或(B)源自一個或多個親水聚合物如聚乙二醇(PEG)部分。不受任何具體理論的限制，在本領域中認為至少對于含神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂或源自PEG的脂質(zhì)的空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體來說，這些空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體的循環(huán)半衰期的增加是由于減少了向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細胞中的攝取(Allen等人，F(xiàn)EBS Letters，1987，223，42；Wu等人.，Cancer Research，1993，53，3765)。含一種或多種糖脂的各種脂質(zhì)體是本領域已知的。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64)報告了單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、半乳糖腦苷硫酸脂和磷脂酰肌醇提高脂質(zhì)體血液半衰期的能力。Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85，6949)對這些發(fā)現(xiàn)進行了詳細說明。Allen等人的美國專利號4,837,028和WO 88/04924公開了含(1)鞘磷脂和(2)神經(jīng)節(jié)苷脂M1或半乳糖腦苷硫酸酯的脂質(zhì)體。美國專利號5,543,152(Webb等人)公開了含鞘磷脂的脂質(zhì)體。WO 97/13499(Lim等人)中公開了含1，2-sn-二肉豆蔻酰磷酸-基膽堿的脂質(zhì)體。本領域內(nèi)已知一些含可用一個或多個親水聚合物衍生的脂質(zhì)的脂質(zhì)體和它們的制備方法。Sunamoto等人(Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2778)闡述了含非離子去垢劑2C1215G的脂質(zhì)體，其包含PEG部分。Illum等人(FEBS Lett.，1984，167，79)指出含有聚乙二醇的聚苯乙烯顆粒的親水涂層會引起血液半衰期的顯著增長。Sears(美國專利號4,426,330和4,534,899)闡述了通過與聚亞烷基二醇(如PEG)的羧基基團結合進行修飾的合成磷脂。Klibanov等人(FEBS Lett.，1990，268,235)描述的試驗表明含可用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂質(zhì)體在血液循環(huán)中具有顯著提高的半衰期。Blume等人(Biochimica et BiophysicaActa，1990，1029，91)將這種發(fā)現(xiàn)延伸至其它PEG衍生的磷脂如DSPE-PEG，其從二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG組合形成。在其外表面與PEG部分共價結合的脂質(zhì)體在Fisher的歐洲專利號EP 0 445 131 B1和WO 90/04384中進行了闡述。Woodle(美國專利號5,013,556和5,356,633)和Martin等人(美國專利號5,213,804和歐洲專利號EP 0 496 813 B1)闡述了含可用PEG衍生的1-20摩爾百分比的PE的脂質(zhì)體組合物以及它們的使用方法。含一些其它脂質(zhì)聚合物螯合物的脂質(zhì)體在WO 91/05545和美國專利號5,225,212(兩者都屬于Martin等人)和WO 94/20073(Zalipsky等人)中進行了闡述。在WO96/10391(Choi等人)中闡述了含PEG修飾的神經(jīng)酰胺脂的脂質(zhì)體。美國專利號5,540,935(Miyazaki等人)和美國專利號5,556,948(Tagawa等人)闡述了含PEG的脂質(zhì)體，其還能進一步用在它們表面的功能部分進行衍生。
本領域已知有限數(shù)量的含核酸的脂質(zhì)體。Thierry等人的WO 96/40062公開了將高分子量核酸包裹到脂質(zhì)體中的方法。Tagawa等人的美國專利5,264,221公開了結合蛋白的脂質(zhì)體并聲稱這種脂質(zhì)體的內(nèi)容物可以包括dsRNA RNA。Rahman等人的美國專利號5,665,710闡述了某些將寡聚脫氧核苷酸包封入脂質(zhì)體的方法。Love等人的WO 97/04787公開了含靶向raf基因的dsRNA dsRNA的脂質(zhì)體。傳遞體(transfersome)是另一種類型的脂質(zhì)體，是高度可變形的脂質(zhì)聚合體，它是有吸引力的藥物遞送媒介的候選物。傳遞體可以被描述成脂質(zhì)液滴，其可高度變形，以至于它們可以容易地滲透比該液滴還要小的小孔。傳遞體可以適應它們所使用的環(huán)境，例如它們自優(yōu)化(適應皮膚小孔的形狀)，自修復，通常不需要片段化就能到達它們的靶標并且常為自動裝載。為了制備傳遞體，可能要在標準的脂質(zhì)體組合物中加入表面邊界活化劑，通常為表面活性劑。已經(jīng)將傳遞體用于向皮膚遞送血清白蛋白。已經(jīng)顯示傳遞體介導的血清白蛋白的遞送與含血清白蛋白的溶液的皮下注射一樣有效。
表面活性劑在制劑如乳劑(包括微乳劑)和脂質(zhì)體中有廣泛應用。對這些包括合成的和天然的不同類型的表面活性劑的特性進行分類和排列的最常見的方式是使用親水性/親脂性比(HLB)。親水基團(即“頭”)的性質(zhì)提供了為在制劑中所使用的不同表面活性劑進行分類的最有用的方式(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第285頁)。
如果表面活性劑分子不是離子化的，將其歸類為非離子表面活性劑。非離子表面活性劑在藥物和化妝產(chǎn)品中有廣泛的應用，并可以在寬范圍的pH值范圍內(nèi)使用。通常，根據(jù)它們的結構，它們的HLB值在2至大約18間變化。非離子表面活性劑包括非離子酯如乙烯乙二醇酯、丙烯乙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非離子的烷醇酰胺和醚如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在這一類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子表面活性劑類中最常用的成員。如果表面活性劑分子在溶于水或分散在水中時帶有負電荷，所述表面活性劑被歸類為陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑包括羧酸酯如肥皂、酰基乳酰酯、氨基酸的?；被衔铩⒘蛩狨ト缤榛蛩狨ズ鸵已趸榛蛩狨?、磺酸酯如烷基苯磺酸酯、烷基羥乙磺酸酯、烷基?；撬狨ズ突腔晁狨ヒ约傲姿狨?。陰離子表面活性劑的最重要的成員為烷基硫酸酯和肥皂。
如果表面活性劑分子在溶于水或分散在水中時帶有正電荷，所述表面活性劑被歸類為陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑包括季銨鹽和乙氧基化胺。季銨鹽是這個類別中最常使用的成員。
如果表面活性劑分子能夠帶有正電荷或者負電荷，所述表面活性劑被歸類為兩性表面活性劑。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的烷基氨基化合物、N-烷基甜菜堿和磷脂。
已經(jīng)綜述了表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑中和乳劑中的應用(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms(藥物劑型)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第285頁)。
滲透增強劑 在一個實施方案中，本發(fā)明使用了各種滲透增強劑以實現(xiàn)核酸尤其是dsRNA至動物皮膚的有效遞送。多數(shù)藥物以離子化和非離子化的形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或親脂的藥物可容易地穿過細胞膜。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果用滲透增強劑處理要穿過的膜，甚至連非親脂藥物都可以穿過細胞膜。除了幫助非親脂藥物擴散穿過細胞膜外，滲透增強劑還能增強親脂藥物的滲透性。
滲透增強劑可以歸類為5大類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合的非表面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems，1991，第92頁)。在下面對每類以上提及的滲透增強劑都詳細進行了闡述。
表面活性劑在本發(fā)明的上下文中，表面活性劑(或“表面活性試劑”)為化學實體，當其溶解在水溶液中時，它能降低溶液的表面張力或者水溶液和另一個脂之間的界面間張力，結果是dsRNA通過黏膜的吸收得到增強。除了膽汁鹽和脂肪酸之外，這些滲透增強劑還包括例如月桂醇硫酸鈉、聚氧乙烯基-9-月桂醇醚和聚氧乙烯基-20-鯨蠟醇醚(Lee等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92頁)，以及全氟化合物乳劑如FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)。脂肪酸作為滲透增強劑的各種脂肪酸和它們的衍生物包括，例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸酯(1-單油酰-rac-甘油，)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-單癸酸酯、1-正十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、?；舛緣A、?；憠A，它們的C1-10烷基酯(如甲基、異丙基和叔丁基)，和它們的甘油單酯和甘油二酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等)(Lee等人.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems，1991，第92頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。膽汁鹽膽汁鹽的生理作用包括促進脂質(zhì)和脂可溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Goodman &Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版第38章，Hardman等人Eds.，McGraw-Hill，New York，1996，第934-935頁)。各種天然膽汁鹽和它們的合成衍生物作為滲透增強劑起作用。因此術語“膽汁鹽”包括膽汁中天然存在的任意成分和它們的任意合成衍生物。本發(fā)明的膽汁鹽包括例如膽酸(或其藥學上可接受的鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、葡糖膽酸(葡糖膽酸鈉)、甘油膽酸(甘油膽酸鈉)、甘油脫氧膽酸(甘油脫氧膽酸鈉)、?；悄懰?牛磺膽酸鈉)、?；敲撗跄懰??；敲撗跄懰徕c)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、烏索脫氧膽酸(UDCA)、?；?24，25-二氫-梭鏈孢酸鈉(STDHF)、甘油二氫梭鏈孢酸鈉和聚氧乙烯-9-月桂烷基醚(POE)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92頁；Swinyard，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版第39章，Gennaro，ed.，Mack Co.，Easton，Pa.出版，1990，第782-783頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita等人，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。
螯合劑所使用的與本發(fā)明有關的螯合劑可以定義為通過與金屬形成復合物將其從溶液中除去的化合物，結果是通過黏膜的dsRNA的吸收得到加強。關于它們在本發(fā)明中作為滲透增強劑的應用，因為多數(shù)DNA核酸酶的特征是需要二價金屬離子用于催化并且因此可以被螯合試劑抑制，螯合試劑還具有作為DNase抑制劑的附加優(yōu)勢(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。本發(fā)明的螯合試劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(如水楊酸鈉、5-甲氧水楊酸酯和高香草酸酯)、膠原質(zhì)的N-酰基衍生物、聚氧乙烯-9-月桂醇醚和β-二酮的N-氨基?；苌?烯胺)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur等人，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。
非螯合的非表面活性劑如本文所使用的，非螯合的非表面活性劑滲透增強化合物可以定義為具有不顯著的螯合劑或表面活性劑的活性，但是仍可增強dsRNA穿過消化道黏膜的吸收(Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。這類的滲透增強劑包括例如不飽和環(huán)脲、1-烷基烷酮衍生物和1-鏈烯基氮雜環(huán)烷基烷酮衍生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92頁)，以及非甾族抗炎劑如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和苯丁唑啉(Yamashit等人，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
增強dsRNA在細胞水平上的攝取的試劑也可以加入到本發(fā)明的藥物組合物和其它組合物中。例如，已知陽離子脂質(zhì)如lipofectin(Junichi等人，美國專利號5,705,188)、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子如聚賴氨酸(Lollo等人，PCT申請WO 97/30731)也增強dsRNA的細胞攝取。
其它試劑也可以用于增強所施用的核酸的滲透，包括乙二醇如乙烯乙二醇和丙烯乙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮(azones)和萜類如苧烯和薄荷酮。
載體 本發(fā)明的某些組合物還向制劑中引入了載體化合物。如本文所使用的，“載體化合物”或“載體”可以指核酸或其類似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但卻在體內(nèi)過程中被認為是核酸，其能降低具有生物活性的核酸的生物利用度，例如通過降解生物活性的核酸或促進其從循環(huán)中的除去而實現(xiàn)。核酸和載體化合物的共同施用，典型的是后一種物質(zhì)過量，實質(zhì)上能夠引起肝、腎或其它循環(huán)外臟器中回收的核酸的量大幅度減少，推測原因是載體化合物和核酸之間競爭共有受體。例如，當與聚次黃嘌呤核苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞嘧啶核苷酸或4-乙酰胺基-4’異氰硫基-芪-2，2′-二磺酸共同施用時，可以減少部分地硫代磷酸酯的dsRNA在肝組織中的回收(Miyao等人，DsRNA Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura等人，DsRNA & Nucl.Acid DrugDev.，1996，6，177-183)。
賦形劑 與載體化合物相比，“藥物載體”或“賦形劑”是向動物遞送一種或多種核酸的藥學上可接受的溶劑、懸浮試劑或其它任意藥學上惰性的媒介。所述賦形劑可以是液體或固體，當與核酸和特定藥物組合物的其它組分組合時，參考意欲的給藥方式，對賦形劑進行選擇以提供理想的容積、稠度等。典型的藥物載體包括但不限于粘合劑(如預膠凝的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥基丙烷基甲基纖維素等)，填料(如乳糖和其它糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)，潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石、二氧化硅、膠狀二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、還原的植物油、玉米淀粉、聚乙烯乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)，崩解劑(如淀粉、淀粉乙醇酸鈉等)，和濕潤劑(如月桂醇基硫酸鈉等)。
適合于非腸道施用的、不與核酸發(fā)生有毒反應的、藥學上可接受的有機或無機賦形劑也可以用來制備本發(fā)明的組合物。合適的藥學上可接受的載體包括但不限于水、鹽、溶液、醇、聚乙烯乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯酮烷等。
用于局部施用核酸的制劑可以包括在普通溶劑如醇中的無菌或非無菌的水溶液、非水溶液，或在液體或固體油基質(zhì)中的核酸溶液。溶液還可以包含緩沖液、稀釋液和其它合適的添加劑?？梢允褂眠m合于非腸道外施用的、且不與核酸發(fā)生有毒反應的、藥學上可接受的有機或無機賦形劑。
合適的藥學上可接受的賦形劑包括但不限于是水、鹽溶液、醇、聚乙烯乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯酮烷等。
其它成份 本發(fā)明的組合物另外可以包含其它本領域熟知用量的在藥物組合物中常用的附加組分。因此，例如組合物可以包含另外的、可相容的藥學上有活性的物質(zhì)如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以包含對本發(fā)明的組合物的各種劑型的物理配制有幫助的其它物質(zhì)，如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，當加入這種物質(zhì)時，它們不應當過度干擾本發(fā)明的組合物的成份的生物活性。制劑如果需要可以進行滅菌并與助劑如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、鹽混合，用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖液、著色物質(zhì)、芳香物質(zhì)和/或芬芳物質(zhì)等，它們不與制劑中的核酸發(fā)生有害的相互作用。水懸浮液可以包含提高懸浮液粘性的物質(zhì)，包括如羰基甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖?；鞈乙哼€可以包含穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的某些實施方案提供了含(a)一種或多種反義物質(zhì)和(b)一種或多種其它的通過非反義機制發(fā)揮作用的化療劑的藥物組合物。這種化療劑的示例包括但不限于道諾紅菌素、道諾霉素、放線菌素、阿霉素、表阿霉素、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、雙氯乙基硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放射菌素D、光神霉素、潑尼松、羥基孕酮、睪酮、它莫西芬、達卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲三聚氰胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基硝基脲、氮芥類藥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧助間型霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、紫杉醇、長春新堿、長春堿、依托泊甙(VP-16)、三甲曲沙、依立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉑和二乙基乙烯雌酚(DES)。通常參見The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版.1987，第1206-1228頁，Berkow等人，eds.，Rahway，N.J.。當與本發(fā)明的化合物一起使用時，這種化療劑可以單獨使用(如5-FU和寡核苷酸)，連續(xù)使用(如5-FU和寡核苷酸使用一段時間后接著使用MTX和寡核苷酸)，或者與一種或多種其它這樣的化療劑(如5-FU、MTX和寡核苷酸或者5-FU、放療和寡核苷酸)聯(lián)合使用?？寡姿幬锇ǖ幌抻诜晴揞惪寡姿幬锖推べ|(zhì)甾類藥物，和抗病毒藥物，包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋，兩者也可以組合在本發(fā)明的組合物中。通常分別參見The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第15版，Berkow等人，eds.，1987，Rahway，N.J.，第2499-2506頁和第46-49頁。其它非反義化療劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢砸黄鹗褂没蜻B續(xù)使用兩種或更多組合的化合物。
這種化合物的毒性和治療功效可以在細胞培養(yǎng)或試驗動物中由標準的藥學過程確定，例如確定LD50(半數(shù)致死劑量)和ED50(半數(shù)治療有效劑量)。毒性效果和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，它可以表示為LD50/ED50比。優(yōu)選具有高治療指數(shù)的化合物。
由細胞培養(yǎng)試驗和動物研究獲取的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的一定范圍的劑量。本發(fā)明的組合物的劑量范圍通常在包括少有毒性或無毒性的ED50在內(nèi)的循環(huán)濃度內(nèi)。根據(jù)所采用的劑型和所使用的施用途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明的方法中所使用的任意化合物，起初可以根據(jù)細胞培養(yǎng)試驗估算治療有效量。劑量可以按照動物模型配制以獲取化合物的循環(huán)血藥濃度范圍，或適當時刻靶標序列的多肽產(chǎn)物的循環(huán)血藥濃度范圍(如獲取多肽的濃度降低)，所述范圍包括如在細胞培養(yǎng)物中所確定的IC50(即達到癥狀的半最大抑制時試驗化合物的濃度)。這種信息可以用于在人中更準確地確定有用劑量。可以通過例如高效液相層析法測定血漿中的濃度。
如上所討論的，除了它們的單個施用或作為多個施用，本發(fā)明的dsRNA可以與其它已知的對治療由Eg5表達介導的病理過程有效的試劑聯(lián)合施用。無論如何，施藥醫(yī)師可以根據(jù)本領域已知的或本文所闡述的利用常規(guī)測量效力的方法所觀察的結果來調(diào)整dsRNA施用的量和時間。
治療由Eg5基因表達引起的疾病的方法 本發(fā)明尤其涉及dsRNA或由此制備的藥物組合物用于治療癌癥的用途，例如抑制腫瘤生長和腫瘤轉移。例如，dsRNA或由此制備的藥物組合物可以用于治療實體瘤，如乳癌、肺癌、頭部和頸部癌、腦癌、腹癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、威爾姆氏腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤以及用于治療皮膚癌如黑色素瘤、用于治療淋巴瘤和血癌。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的dsRNA或由此制備的藥物組合物的用于抑制eg5表達和/或用于抑制不同類型癌癥中腹水液體和胸腔積液的聚積的用途，所述癌癥如乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、腦癌、腹癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、威爾姆氏腫瘤、皮膚癌、黑色素瘤、淋巴瘤和血癌。由于eg5表達的抑制作用，本發(fā)明的dsRNA或由此制備的藥物組合物可以提高生命的質(zhì)量。
本發(fā)明還涉及dsRNA或其藥物組合物的用途，例如用于治療癌癥或用于抑制腫瘤的轉移，所述dsRNA或其藥物組合物與其它藥物和/或其它治療方法聯(lián)合，如與已知的藥物和/或已知的治療方法如那些目前所應用的用于治療癌癥和/或用于抑制腫瘤的轉移的方法聯(lián)合。優(yōu)選的是與放射治療和化療劑如順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、道諾紅菌素或它莫西芬組合。其它實施方案包括第二dsRNA用于抑制VEGF表達的用途。
本發(fā)明還可以通過包括用特異的RNAi試劑與另一個抗腫瘤化療劑，如任意常規(guī)化療劑或另一個用于抑制VEGF表達的dsRNA組合實現(xiàn)。特異結合試劑與這種其它試劑的組合可以加強化學治療方法方案。許多化學治療方法都留在熟練操作者的腦海中，因此能引入到本發(fā)明的方法中?？梢允褂萌我饣焺ㄍ榛噭?、抗代謝物、激素和拮抗劑、放射性同位素和天然物質(zhì)。例如，本發(fā)明的化合物可以與抗生素如阿霉素和其它蒽環(huán)霉素類似物、氮芥類如環(huán)磷酰胺，嘧啶類似物如5-氟尿嘧啶、順鉑、羥基脲、紫杉醇以及它的天然的和合成衍生物等一起施用。在另一個示例中，在混合腫瘤如乳房的腺癌的情況下，其中該腫瘤包括依賴于促性腺素的細胞和不依賴于促性腺素的細胞，化合物可以與亮丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成的肽類似物)聯(lián)合施用。其它抗腫瘤方法包括四環(huán)素化合物與另一種治療方式如手術、放射等一起使用，本文也稱為“聯(lián)合抗腫瘤方式”。因此，本發(fā)明的方法可以與常規(guī)療法一起應用，從而具有降低副作用并增強功效的效果。
抑制Eg5基因表達的方法 在另一方面，本發(fā)明提供了抑制哺乳動物中Eg5基因表達的方法。該方法包括向哺乳動物施用本發(fā)明的組合物，以此沉默靶標Eg5基因的表達。由于它們的高度特異性，本發(fā)明的dsRNA特異地靶向靶標Eg5基因的RNA(原始的或加工后的)。利用dsRNA抑制這些Eg5基因表達的組合物和方法可以根據(jù)本文其它地方的闡述進行。
在一個實施方案中，所述方法包括施用含dsRNA的組合物，其中dsRNA含與要治療的哺乳動物的Eg5基因的RNA轉錄物的至少一部分互補的核苷酸序列。當要治療的生物體為哺乳動物如人時，組合物可以通過本領域已知的任意方式施用包括但不限于經(jīng)口或非腸道途徑，包括靜脈、肌肉、皮下、透皮、空氣、氣溶膠、鼻、直腸和外部(包括口含和舌下)施用。在優(yōu)選的實施方案中，組合物通過靜脈輸注或注射給藥。
除非另有定義，本文所使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬的技術領域中的一個普通技術人員通常所理解的意思相同。雖然在本發(fā)明的實施或檢驗中可以使用與本文所闡述的類似或相同的方法和物質(zhì)，但是以下闡述了合適的方法和物質(zhì)。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它引用，包括定義都通過引用整體結合入本文。在沖突的情況下，包括定義的本說明書將支配全局。另外，物質(zhì)、方法和實例僅為說明性的并不受限。
實施方案 Eg5基因的基因步移(gene walking) 初始篩選組 進行siRNA設計以確定siRNA靶向于Eg5(也稱為KIF11、HSKP、KNSL1和TRIP5)。使用靶向Eg5的人mRNA序列RefSeq ID numberNM_004523。
設計可與人和小鼠Eg5交叉反應的siRNA二倍體。合成24個二倍體用于篩選(表1)。
擴大的篩選組 第二篩選組用266個靶向人的EG5和它的恒河猴直向同源的EG5的siRNA(表2)定義。擴大的篩選組利用328個靶向人EG5的siRNA進行選擇，沒有必要比對上其它種屬的任意EG5 mRNA(表3)。
從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中下載人和部分恒河猴EG5 mRNA的序列，并且人的序列還將用作參考序列(人EG5NM_004523.2，4908bp；和恒河猴EG5XM_001087644.1，878bp，僅是人EG5的5’部分)。
為了確認更多的恒河猴EG5序列，在NCBI上進行了人序列和恒河猴參考基因組的大比對。所下載的恒河猴序列和比對命中中比對上的區(qū)域組合成恒河猴一致認可的序列，該序列在全長上與人EG5具有92％的同一性。
從人mRNA序列中提取所有可能的19mer，產(chǎn)生與4890個可與人反應的EG5 siRNA的序列(正義鏈)對應的候選靶標位點庫。
人-恒河猴交叉反應是從這個候選庫電腦模擬(in silico)選擇出起始篩選組的siRNA的先決條件。為了確定與恒河猴反應的siRNA，對每一個候選siRNA靶位點都進行搜索以確定是否在組合的恒河猴序列中存在。另外通過靶向人EG5 mRNA序列而非其它人mRNA證明，siRNA預測的特異性作為從可與人-恒河猴交叉反應的siRNA庫中選擇的標準。
siRNA的特異性可以表示為其靶向其它基因的潛能，也稱“脫靶基因”。
為了預測siRNA的脫靶潛能，進行以下假設 1)鏈的脫靶潛能可以從與脫靶錯配的數(shù)目和分布推出 2)最相關的脫靶，即由于對錯配的容忍而預測該基因具有最能被沉默的可能性，決定所述鏈的脫靶潛能 3)與其余序列相比(非種子和切割位點區(qū)域)，鏈的2至9位(從5’數(shù)到3’，種子區(qū)域)可能對脫靶潛能的貢獻更大 4)與非種子區(qū)域(12至18位，從5’數(shù)到3’)相比，鏈的10和11位(從5’數(shù)到3’)(切割位點區(qū)域)可能對脫靶潛力的貢獻更大 5)每個鏈的1和19位與和脫靶相互作用無關 6)脫靶潛能可以通過最相關的脫靶的脫靶分數(shù)表示，所述脫靶分數(shù)考慮假設3—5，根據(jù)與脫靶基因的最同源區(qū)域相比所述鏈的錯配的數(shù)量和位置來進行計算 7)反義鏈和正義鏈的脫靶潛能是有關系的，而通過引入內(nèi)部修飾很可能將正義鏈活性潛在中止 具有低脫靶潛能的siRNA是優(yōu)選的并假定是特異性較高的。
為了鑒定人EG5特異性siRNA，搜索所有其它認為都會潛在脫靶的人轉錄物，以找到可與人-恒河猴交叉反應的19mer正義鏈序列和互補的反義鏈的潛在靶標區(qū)域。為此，使用fastA算法確定人RefSeq數(shù)據(jù)庫各序列中的最同源的擊中區(qū)域，我們假定所述數(shù)據(jù)庫代表廣泛的人轉錄組。
為了根據(jù)假設3至5把所有的潛在脫靶分類，并通過這個確定最相關的脫靶基因和它的脫靶分數(shù)，通過perl腳本進一步分析fastA輸出文件。
針對每一個19mer輸入序列和每一個要計算脫靶分數(shù)的脫靶基因，腳本產(chǎn)生以下脫靶特性 非種子區(qū)域內(nèi)錯配的數(shù)量 種子區(qū)域內(nèi)錯配的數(shù)量 切割位點區(qū)域內(nèi)錯配的數(shù)量 通過考慮假設3至5計算脫靶分數(shù)如下 脫靶分數(shù)＝種子錯配數(shù)量×10+切割位點錯配數(shù)量×1.2+非種子錯配數(shù)量×1 每一個19mer序列的最相關的脫靶基因被定義為具有最低脫靶分數(shù)的基因。相應地，最低脫靶分數(shù)被定義代表鏈的脫靶潛能。
對于表2中的篩選組，選擇反義鏈的脫靶分數(shù)為3或更大，正義鏈的分數(shù)為2或更大作為選擇siRNA的先決條件，然而排除所有含4個或更多連續(xù)G(poly-G序列)的序列。根據(jù)這個截斷值(cut-off)選出266個通過特異性標準的可與人-恒河猴交叉作用的序列(見表2). 對于擴大篩選組的定義，不考慮對恒河猴的交叉反應性，根據(jù)最新獲取的人RefSeq數(shù)據(jù)庫重新計算所預測的特異性，對于反義和正義鏈僅選擇那些脫靶分數(shù)為2，2或更大的328個非poly-G siRNA(參見表3)。
表內(nèi)關鍵字A、G、C、U—核糖核苷酸；T—脫氧胸腺嘧啶核苷；u，c—2’-O-甲基核苷；s—硫代磷酸酯鍵 dsRNA合成 試劑來源 本文不特別給出試劑來源的地方，這種試劑可以從任意分子生物學試劑供貨商處獲取，具有分子生物學應用的質(zhì)量/純度標準。
siRNA合成 利用Expedite 8909合成儀(Applied Biosystems，Applera DeutschlandGmbH，Darmstadt，Germany)和作為固相支撐物的可控微孔玻璃珠(CPG，

Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany)通過1μmole規(guī)模的固相合成產(chǎn)生單鏈RNA。通過固相合成利用相應的亞磷酰胺和2′-O-甲基亞磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany)分別產(chǎn)生RNA和含2’-O-甲基核苷酸的RNA。利用標準的核苷亞磷酰胺化學試劑如在核酸化學的當前方法(Current protocols in nucleic acid chemistry)(Beaucage S.L.等人(Edrs.)，JohnWiley & Sons，Inc.，New York，NY)中所闡述的，在寡核苷酸鏈序列內(nèi)的選擇位點處引入這些構建塊(building block)。通過用Beaucage試劑(Chruachem Ltd，Glasgow，UK)的乙腈溶液(1％)替換碘氧化劑溶液引入硫代磷酸酯鍵。進一步的助劑獲自Mallinckrodt Baker(Griesheim，Germany)。
根據(jù)已知的方法，通過陰離子交換HPLC進行粗的寡核苷酸的脫保護和純化。利用分光光度計(DU640B，Beckman Coulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)通過各個RNA溶液在260nm波長的UV吸收確定產(chǎn)量和濃度。通過混合等摩爾互補鏈的退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8；100mM氯化鈉)、在85-90℃的水浴中加熱3分鐘并在3-4小時的時間內(nèi)冷卻至室溫以產(chǎn)生雙鏈RNA。退火的RNA溶液儲存在-20℃直至使用。
對于在3’耦聯(lián)膽固醇的siRNA(本文稱為Chol-3′)的合成，使用適當修飾的固體支撐物用于RNA合成。所述修飾固體支撐物的制備如下 2-氮雜丁烷-1，4-二羧酸二乙酯AA
將4.7M氫氧化鈉的水溶液(50mL)加入到攪拌的、用冰冷卻的甘氨酸乙酯鹽酸鹽(32.19g，0.23mole)的水(50mL)溶液中。然后加入丙烯酸乙酯(23.1g，0.23mole)并在室溫下攪拌混合物直至通過TLC確認反應完成。19小時后，用二氯甲烷(3 x 100mL)對溶液分層。有機層用無水硫酸鈉干燥、過濾并蒸干。蒸餾殘留物以得到AA(28.8g，61％)。
3-{乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己?；鵠-氨基}-丙酸乙酯AB
將芴甲氧羰基-6-氨基-己酸(9.12g，25.83mmol)溶解到二氯甲烷(50mL)中并用冰冷卻。向0℃的所述溶液中加入二異丙基碳二亞胺(3.25g，3.99mL，25.83mmol)。然后加入氮雜丁烷-1，4-二羧酸乙酯(5g，24.6mmol)和二甲基氨基嘧啶(0.305g，2.5mmol)。將所述溶液置于室溫并進一步攪拌6小時。通過TLC確定反應的結束。反應混合物在真空下濃縮并加入乙酸乙酯以使二異丙基脲沉淀。過濾懸浮液。濾過物用5％鹽酸水溶液、5％碳酸氫鈉和水進行洗滌。合并的有機層在硫酸鈉上干燥并濃縮以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，用柱層析(50％EtOAC/己烷)純化粗產(chǎn)物產(chǎn)生11.87gAB(88％)。
3-[(6-氨基-己?；?-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC
將3-{乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸酐乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解至0℃的含20％的哌啶的二甲基甲酰胺中。持續(xù)攪拌溶液1h。反應混合物在真空下濃縮，將水加入到殘留物中，并用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物。通過將粗產(chǎn)物轉化為它的鹽酸鹽進行純化。
3-({6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊基[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-己酰基}乙氧基羰甲基-氨基)-丙酸乙酯AD
將3-[(6-氨基-己?；?-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸酐乙酯AC的鹽酸鹽(4.7g，14.8mmol)吸收至二氯甲烷中。將懸浮液在冰上冷卻至0℃。向懸浮液中加入二異丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)。向所產(chǎn)生的溶液中加入氯甲酸膽固醇酯(6.675g，14.8mmol。將反應混合物攪拌過夜。用二氯甲烷稀釋反應混合物并用10％的鹽酸洗滌。產(chǎn)物通過快速層析純化(10.3g，92％)。
1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊烷[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-己?；鶀-4-氧代-吡咯-3-羧酸乙酯AE
將叔丁醇鉀(1.1g，9.8mmol)加入到30mL干甲苯中成漿?；旌衔镌诒侠鋮s至0℃并在20分鐘內(nèi)緩慢攪拌的同時加入5g(6.6mmol)AD二酯。在添加的過程中保持溫度在5℃以下。在0℃持續(xù)攪拌30分鐘并加入1mL冰醋酸，然后立即加入含4g NaH2PO4·H2O的40mL水。所產(chǎn)生的混合物用每次100mL的二氯甲烷萃取兩次，合并的有機萃取物用每次10mL的磷酸緩沖液洗滌、干燥、并蒸發(fā)至干燥。將殘留物溶解至60mL的甲苯中，冷卻至0℃并用三份50mL pH9.5的冷碳酸緩沖液萃取。水性萃取物用磷酸調(diào)整至pH3，并用5份40mL氯仿萃取，將萃取的氯仿液合并、干燥并蒸發(fā)至干燥。殘留物通過利用25％乙酸乙酯/己烷的柱層析純化產(chǎn)生1.9g b-酮酯(39％)。
[6-(3-羥基-4-羥甲基-吡咯-1-基)-6-氧代-己基]-氨甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊烷[a]菲-3-基酯AF
在1小時的時間內(nèi)向含b-酮酯AE(1.5g，2.2mmol)和硼氫化鈉(0.226g，6mmol)的四氫呋喃(10mL)回流混合物中逐滴加入甲烷(2mL)。在回流溫度下持續(xù)攪拌1h。冷卻至室溫后，加入1N HCl(12.5mL)，用乙酸乙酯(3 x 40mL)萃取混合物。合并的乙酸乙酯層在無水硫酸鈉上干燥并在真空下濃縮以產(chǎn)生產(chǎn)物，產(chǎn)物用柱層析(10％MeOH/CHCl3)純化(89％)。
(6-{3-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羥基-吡咯-1-基}-6-氧代-己基)-氨甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊烷[a]菲-3-基酯AG
在真空下用嘧啶(2 x 5mL)蒸發(fā)干燥AF二醇(1.25gm1.994mmol)。攪拌的同時加入無水嘧啶(10mL)和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g，2.13mmol)。反應在室溫下過夜。反應通過加入甲醇淬滅。反應混合物在真空下濃縮并向殘留物中加入二氯甲烷(50mL)。用1M碳酸鈉水溶液洗滌有機層。有機層在無水硫酸鈉上干燥、過濾并濃縮。殘留的嘧啶通過用甲苯蒸發(fā)除去。粗產(chǎn)物通過柱層析(2％ MeOH/氯仿，在5％ MeOH/CHCl3中，R f＝0.5)純化(1.75g，95％)。
琥珀酸單-(4-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H環(huán)戊烷[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-己?；鶀-吡咯-3-基)酯AH
化合物AG(1.0g，1.05mmol)與琥珀酸酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmol)混合并在真空中40℃干燥過夜?；旌衔锶芙獾綗o水二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，溶液在室溫下氬氣氛中攪拌16小時。然后用二氯甲烷(40mL)稀釋并用冰冷的檸檬酸水溶液(5wt％，30mL)和水(2 X 20mL)洗滌。有機相在無水硫酸鈉上干燥并濃縮至干燥。殘留物用于下一步驟。
膽固醇衍生的CPG AI
將琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶解到二氯甲烷/乙腈的混合物(0.254g，0.242mmol)中。向該溶液中連續(xù)加入含DMAP(0.0296g，0.242mmol)的乙腈(1.25mL)、含2，2’-二硫-雙(5-氮吡啶)(0.075g，0.242mmol)的乙腈/二氯乙烷(3:1，1.25mL)。向所產(chǎn)生的溶液中加入含三苯基膦(0.064g，0.242mmol)的乙腈(0.6ml)。反應混合物的顏色變?yōu)榱脸壬?。利用手動震蕩器簡單攪動溶?5min)。加入長鏈烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。攪動懸浮液2h。通過燒結漏斗將CPG過濾，并接著用乙腈、二氯甲烷和醚洗滌。利用乙酸酐/吡啶將未反應的氨基基團掩蔽。通過UV測量計算所獲取的CPG的載量(37mM/g)。
帶有5′-12-月桂酸雙癸酰胺基團((5′-12-dodecanoic acid bisdecylamidegroup，本文稱為“5′-C32-”)或5’-膽固醇基衍生基團9(本文稱為“5′-Chol-”)的siRNA的合成根據(jù)WO2004/065601的闡述進行，除了膽固醇基衍生物，氧化步驟利用Beaucage試劑進行，以在核酸共聚物的5’末端引入硫代磷酸酯鍵。
核酸序列在以下利用標準的命名法表示，并且尤其是表4的縮寫。
表4在核酸序列表示法中所使用的核苷酸單體的縮寫。可以理解當存在于寡核苷酸中時這些單體通過5’-3’-磷酸二酯鍵相互連接。
a大寫字母表示2′-脫氧核糖核苷酸(DNA)，小寫字母表示核糖核酸(RNA) dsRNA表達載體 在本發(fā)明的另一方面，調(diào)節(jié)Eg5基因表達活性的Eg5特異性dsRNA從插入到DNA或RNA載體中的轉錄單元表達(參見如Couture，A，等人，TIG.(1996)，125-10；Skillrn，A.，等人，國際PCT公布號WO 00/22113；Conrad，國際PCT公布號WO 00/22114；和Conrad，美國專利號6,054,299)。這些轉基因可以作為線性構建體、環(huán)形質(zhì)?；虿《据d體引入，它們可以被合并并作為整合入宿主基因組的轉基因進行遺傳。還可以構建轉基因使它作為染色體外質(zhì)粒進行遺傳(Gassmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)921292)。
dsRNA的單條鏈可以由啟動子在兩個單獨的表達載體上轉錄并共轉染至靶標細胞中?？蛇x擇地，dsRNA的的每條單鏈可以由兩個都位于同一表達質(zhì)粒上的啟動子轉錄。在優(yōu)選實施方案中，表達的dsRNA具有由接頭寡核苷酸序列連接的插入重復，這樣該dsRNA就具有莖和環(huán)結構。
重組dsRNA表達載體通常為DNA質(zhì)粒或病毒載體。dsRNA表達病毒載體可以根據(jù)但不限于腺相關病毒(綜述，參見Muzyczka，等人，Curr.TopicsMicro.Immunol.(1992)15897-129)、腺病毒(參見例如，Berkner等人，BioTechniques(1998)6616)；Rosenfeld等人，(1991，Science252431-434)；和Rosenfeld等人，(1992)，Cell 68143-155)或甲病毒以及其它本領域已知的病毒進行構建。逆轉錄病毒已經(jīng)用于向許多不同的細胞類型中引入多種基因，所述細胞類型包括上皮細胞、體外和/或體內(nèi)(參見，例如Eglitis，等人，Science(1985)2301395-1398；Danos和Mulligan，Proc.NatI.Acad.Sci.USA(1998)856460-6464；Wilson等人，1988，Proc.NatI.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等人，1990，Proc.NatI.Acad.Sci.USA 8761416145；Huber等人，1991，Proc.NatI.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry等人，1991，Proc.NatI.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury等人，1991，Science 2541802-1805；van Beusechem等人，1992，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 897640-19；Kay等人，1992，Human Gene Therapy 3641-647；Dai等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等人，1993，J.Immunol.1504104-4115；美國專利號4,868,116；美國專利號4,980,286；PCT申請WO 89/07136；PCT申請WO89/02468；PCT申請WO89/05345；和PCT申請WO 92/07573)。能夠轉化并表達插入到細胞基因組的基因的重組逆轉錄病毒載體可以通過將重組逆轉錄病毒基因組轉染到合適的包裝細胞系如PA317和Psi-CRIP中產(chǎn)生(Comette等人，1991，Human Gene Therapy 25-10；Cone等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816349)。重組腺病毒載體可以用于感染易感宿主(如大鼠、倉鼠、狗和黑猩猩)內(nèi)的許多細胞和組織(Hsu等人，1992，J.Infectious Disease，166769)，并且具有不需要用于感染的有絲分裂活性細胞的優(yōu)勢。
本發(fā)明的DNA質(zhì)?；虿《据d體中推動dsRNA表達的啟動子可以為真核RNA聚合酶I(如核糖體RNA啟動子)、RNA聚合酶II(如CMV早期啟動子或肌動蛋白啟動子或U1snRNA啟動子)或者通常為RNA聚合酶III啟動子(如U6snRNA或7SK RNA啟動子)或者原核啟動子如T7啟動子，前提是表達質(zhì)粒也編碼由T7啟動子轉錄所需要的T7RNA聚合酶。啟動子還可以引導轉基因在胰腺表達(參見，如the insulin regulatory sequence for pancreas(胰腺的胰島素調(diào)控序列)，Bucchini等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832511-2515)。
另外，轉基因的表達可以如通過利用可誘導的調(diào)控序列和表達系統(tǒng)得到準確調(diào)控，所述調(diào)控序列例如對某些生理調(diào)節(jié)劑如循環(huán)的葡萄糖濃度或激素敏感的調(diào)控序列(Docherty等人，1994，F(xiàn)ASEB J.820-24)。這種適合在細胞或在哺乳動物中控制轉基因表達的可誘導的表達系統(tǒng)包括通過蛻皮急速、通過雌激素、孕酮、四環(huán)素、二聚作用的化學誘導劑和異丙基-β-D1-硫代半乳糖吡喃糖苷(EPTG)的調(diào)控。本領域的技術人員能夠根據(jù)dsRNA轉基因的期望用途選擇適當?shù)恼{(diào)控/啟動子序列。
通常，能夠表達dsRNA分子的重組載體通過如下闡述進行遞送，并保留在靶標細胞中?？蛇x擇地，可以使用用于dsRNA分子瞬時表達的病毒載體。如果需要，這種載體可以重復施用。一旦表達，該dsRNA就結合至靶標RNA上并調(diào)節(jié)它的功能或表達。dsRNA表達載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈或肌肉施用，通過施用外植自患者的靶標細胞然后重新引入至患者，或者通過任意其它允許引入至期望的靶標細胞的方式。
通常，將表達dsRNA的DNA質(zhì)粒與陽離子脂質(zhì)載體(如Oligofectamine)或基于脂質(zhì)的非陽離子載體(如Transit-TKOTM)一起作為復合體轉染到靶標細胞中。本發(fā)明也關注在一星期或更長的時間內(nèi)靶向單個Eg5基因或多個Eg5基因的不同區(qū)域的、用于dsRNA介導性敲除的多重脂質(zhì)轉染。可以利用各種已知的方法監(jiān)測本發(fā)明的載體向宿主細胞的成功引入。例如，瞬時轉染可以用報告子如熒光標記、如綠色熒光蛋白(GFP)發(fā)信號?？梢岳脴擞洿_保細胞的體外穩(wěn)定轉染，所述標記為所轉染的細胞提供對特定環(huán)境因子(如抗生素和藥物)的抗性，如潮霉素B抗性。
Eg5特異性dsRNA分子也可以插入到載體中并作為人類患者的基因治療載體。基因治療載體可以遞送至受試者中，例如通過如靜脈注射、局部施用(參見美國專利號5,328,470)或者通過立體定位注射(參見，例如Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)?；蛑委熭d體的藥物制備可以包括含基因治療載體的可接受稀釋液，或者可以包含包被該基因遞送媒介的緩釋基質(zhì)?？蛇x擇地，當完全的基因遞送載體如逆轉錄病毒載體可以完整地從重組細胞中產(chǎn)生時，藥物制劑可以包含一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細胞。
通過細胞增殖體外篩選Eg5 siRNA 由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Eg5的沉默會引起有絲分裂阻滯(Weil，D，等人[2002]Biotechniques331244-8)，所以使用細胞活力試驗進行siRNA活性篩選。將HeLa細胞(每孔14000個細胞[第1篩選和第3篩選]或每孔10000個細胞[第2篩選])種到96-孔板中并同時用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染，使每孔中siRNA的終濃度為30nM、50nM(第1篩選)和25nM(第2篩選)。二倍體的子集在第三篩選中以25nM濃度檢測(表5)。
轉染后72小時，通過向培養(yǎng)液中加入WST-1試劑(Roche)并接著計算450nm的吸收來分析細胞增殖。對照(未轉染)細胞的吸收值認為是100％，轉染siRNA的細胞的吸收值與對照值相比較。三個篩選的每一個試驗都重復進行六次。siRNA的子集以一定范圍的siRNA濃度進行進一步試驗。試驗在HeLa細胞中進行(每孔14000個細胞；方法如上，表5)。
表5
在HeLa細胞中以一定范圍的siRNA濃度檢測了在表5中顯示最大生長抑制的九個siRNA二倍體。所檢測的siRNA濃度為100nM、33.3nM、11.1nM、3.70nM、1.23nM、0.41nM、0.14nM和0.046nM。試驗以六個重復孔進行，并且計算每個siRNA產(chǎn)生50％的細胞增殖抑制的濃度(IC50)。對每個二倍體進行兩次和四次這種劑量應答分析。平均IC50值(nM)在表6中給出。
表6 通過細胞增殖體外篩選Eg5 siRNA 轉染前直接將HeLa S3(ATCC-號CCL-2.2，LCG Promochem GmbH，Wesel，Germany)細胞以1.5 x 104個細胞/孔種在96-孔板(Greiner Bio-OneGmbH，F(xiàn)rickenhausen，Germany)的75μl生長液中(Ham’s F12，10％胎牛血清，100u青霉素/100μg/ml鏈霉素，都來自Biochrom AG，Berlin，Germany)。轉染以四個重復孔進行。對于每孔，將0.5μl Lipofectamine2000(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，Germany)與12μl Opti-MEM(Invitrogen)混合并在室溫下孵育15min。為了達到在100μl轉染體積中siRNA的濃度為50nM，針對每孔將1μl 5μM的siRNA與11.5μl Opti-MEM混合，然后與Lipofectamine2000-Opti-MEM混合物合并再次在室溫下孵育15分鐘。將siRNA-Lipofectamine2000-復合體完全(每孔25μl)應用于細胞，并在37℃和5％ CO2的加濕培養(yǎng)箱(Heraeus GmbH，Hanau)中孵育24h。單劑量篩選分別在50nM和25nM進行一次。
細胞收集是通過向含100μl生長液的各孔中加入50μl裂解混合物(來自Genospectrade的QuantiGene bDNA試劑盒的內(nèi)容物，F(xiàn)remont，USA)并在53℃裂解30min。之后，將50μl裂解物與人Eg5和人GAPDH特異的探針集一起孵育并根據(jù)QuantiGene生產(chǎn)商的方法進行。最后，在Victor2-Light(PerkinElmer，Wiesbaden，Germany)中以RLU(相對光單位)測量化學發(fā)光，并且每個孔的用hEg5探針集獲得的值都用各自的GAPDH值進行標準化。用直接指向Eg5的siRNA所獲得的值與用非特異性siRNA(直接指向HCV)所獲得的被設定為100％的值相關(表1、2和3)。
篩選得到的有效的siRNA被進一步用劑量應答曲線表征。用于劑量應答曲線的轉染在以下濃度下進行100nM、16.7nM、2.8nM、0.46nM、77picoM、12.8picoM、2.1picoM、0.35picoM、59.5fM、9.9fM和陰性(無siRNA)并根據(jù)以上方法用OptiMEM稀釋成終濃度12.5μl。通過利用微軟Excel附加軟件XL-fit 4.2(IDBS，Guildford，Surrey，UK)并使用劑量應答模型數(shù)205進行數(shù)據(jù)分析(表1、2和3)。
通過使用來自Roche的WST-增殖試驗又分析了先導siRNAAD12115(如之前所闡述)。
通過以終濃度在100nM至10fM范圍內(nèi)轉染HeLa細胞，對表2中顯示最大活性的34個二倍體的子集進行試驗。轉染以四個重復孔進行。針對每個二倍體進行兩次劑量應答試驗。針對每個二倍體計算KSP mRNA產(chǎn)生20％(IC20)、50％(IC50)和80％(IC80)減少時的濃度(表7)。
表7濃度(pM)


(ND-不確定) 在單次注射施用LNP01配制的siRNA后幼年大鼠中肝臟Eg5/KSP的沉默 從出生至大約23天齡，可以檢測到生長的大鼠肝臟中Eg5/KSP的表達。在幼年大鼠中評估配制的Eg5/KSP siRNA的靶標沉默。
所試驗的KSP二倍體 二倍體 ID 靶標 正義 反義 AccGAAGuGuuGuuuGuccTsT GGAcAAAcAAcACUUCGGUTsT AD6248VEGF (SEQ ID NO1238) (SEQ ID NO1239) 方法 動物的給藥方案通過尾靜脈注射向雄性、幼年Sprague-Dawley大鼠(19天齡)施用單劑量的lipidoid(“LNP01”)配制的siRNA。十只動物的組接受每千克體重10毫克(mg/kg)劑量的AD6284或非特異性siRNA。劑量水平指制劑中施用的siRNA二倍體的量。第三組接受磷酸緩沖鹽。SiRNA給藥兩天后殺死動物。切開肝臟，迅速冷凍在液氮中并研磨成粉末。
mRNA測量測量來自所有處理組的肝臟中Eg5/KSP mRNA的水平。將每個肝臟粉末樣本(大約10毫克)均勻分布到含蛋白酶K的組織裂解緩沖液中。利用Quantigene branched DNA assay(GenoSpectra)計算每個樣本的三個重復樣中Eg5/KSP和GAPDH mRNA的水平。Eg5/KSP的平均值用各樣本GAPDH平均值標準化。針對每一次試驗確定組平均值并用PBS組進行標準化。
數(shù)據(jù)分析 通過ANOVA和隨后的Tukey post-hoc檢驗確定顯著性 結果 數(shù)據(jù)概括 給出Eg5/KSP mRNA的平均值(±標準偏差)。顯示相對于PBS組的統(tǒng)計學顯著性(p值)(ns，不顯著[p>0.05])。
試驗1VEGF/GAPDHp值 PBS 1.0±0.47 AD6248 10mg/kg 0.47±0.12<0.001 非特異 10mg/kg 1.0±0.26 ns 在用配制的10mg/kg劑量的AD6248治療后得到肝臟Eg5/KSP mRNA的統(tǒng)計學顯著減少。
在靜脈輸注LNP01配制的siRNA二倍體后大鼠肝臟VEGF的沉默 將含兩個siRNA的等摩爾混合物的“l(fā)ipidoid”制劑施予大鼠。一個siRNA(AD3133)指向VEGF。另一個(AD12115)指向Eg5/KSP。由于Eg5/KSP表達在成年大鼠肝臟中幾乎不能檢測到，所以在siRNA處理后僅測量VEGF濃度。
所施用的siRNA二倍體 二倍體 ID靶標 正義 反義 ucGAGAAucuAAAcuAAcuTsT AGUuAGUUuAGAUUCUCGATsT AD12115 Eg5/KSP (SEQ ID NO1240) (SEQ ID NO1241) GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG AD3133 VEGF (SEQ ID NO1242) (SEQ ID NO1243) 關鍵字A，G，C，U-核糖核苷酸；c，u-2′-O-Me核糖核苷酸；s-硫代磷酸酯. 方法 動物的給藥方案采用至股靜脈的2小時輸注向成年、雌性Sprague-Dawley大鼠施用lipidoid(“LNP01”)配制的siRNA。四只動物的組接受每千克體重5、10、和15毫克(mg/kg)的配制的siRNA。劑量水平指制劑中所施用的siRNA二倍體的總量。第四組接受磷酸緩沖鹽。在siRNA輸注結束72小時后處死動物。切開肝臟，迅速冷凍在液氮中并研磨成粉末。
制劑化過程 用lipidoid ND98·4HCl(MW1487)(化學式1)、膽固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-神經(jīng)酰胺C16(Avanti Polar Lipids)制備脂質(zhì)-siRNA納米顆粒。制備每個試劑的乙醇儲液ND98 133mg/mL，膽固醇25mg/mL，PEG-神經(jīng)酰胺C16100mg/mL。然后將ND98、膽固醇和PEG-神經(jīng)酰胺C16儲液以42:48:10的摩爾比例混合?；旌系闹|(zhì)溶液與siRNA水溶液(在醋酸鈉中，pH5)快速混合，這樣乙醇終濃度為35-45％，醋酸鈉終濃度為100-300mM。一旦混合就自然形成脂-siRNA納米顆粒。根據(jù)所期望的顆粒尺寸分布，在某些情況下利用熱桶擠出器(thermobarrel extruder)(Lipex Extruder，NorthernLipids，Inc)將所產(chǎn)生的納米顆粒混合物擠過聚碳酸酯膜(100nm截斷值)。在其它情況下，省略擠出步驟。通過透析或切向流動過濾同時完成乙醇的去除和緩沖液的更換。緩沖液被換成pH7.2的磷酸緩沖鹽(PBS)。

ND98異構體I 化學式1 制劑的特性 將通過標準或無擠出方法制備的制劑用相似的方式表征。制劑首先通過視覺觀察進行表征。它們應該是發(fā)白的透明溶液，沒有聚集或沉積。脂質(zhì)-納米顆粒的顆粒尺寸和顆粒尺寸分布利用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，USA)通過動態(tài)光散射計算。顆粒尺寸應該在20-300nm，且理想的為40-100nm。顆粒尺寸分布應為單峰分布。利用染料排斥試驗估算制劑中和誘捕部分中的siRNA總濃度。在存在或不存在破壞制劑的表面活性劑0.5％Triton-X100的情況下，將配制的siRNA樣本與RNA結合染料Ribogreen(Molecular Probes)一起進行孵育。通過來自于含該表面活性劑的信號來確定相對于標準曲線的制劑中的總siRNA。誘捕部分通過從總siRNA含量中減去“自由的”siRNA含量(通過沒有表面活性劑時的信號計算)確定。典型地，誘捕siRNA的百分數(shù)>85％。
MRNA測定將每一個肝臟粉末的樣本(大約10毫克)均勻分布到含蛋白酶K的組織裂解緩沖液中。利用Quantigene branched DNA assay(GenoSpectra)計算每個樣本的三個重復樣中VEGF和GAPDH mRNA的水平。每一個樣本的VEGF的平均值用GAPDH平均值進行標準化。針對每一次試驗確定組平均值并用PBS組進行標準化。
蛋白測定將每個肝臟粉末的樣本(大約60毫克)均勻分布到1ml RIPA緩沖液中。利用Micro BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce)確定總蛋白的濃度。利用VEGF ELISA assay(R&D systems)，用來自每個動物的總蛋白的樣本確定VEGF蛋白的水平。針對每一次試驗確定組平均值并用PBS組進行標準化。
數(shù)據(jù)分析通過ANOVA和隨后的Tukey post-hoc檢驗確定顯著性 結果 數(shù)據(jù)概述 顯示每一個治療組的mRNA(VEGF/GAPDH)和蛋白(相對VEGF)的平均值(±標準偏差)。顯示每個實驗相對于PBS組的統(tǒng)計學顯著性(p值)。
VEGF/GAPDH p值 相對VEGFp值 PBS 1.0±0.17 1.0±0.17 5mg/kg 0.74±0.12 <0.050.23±0.03 <0.001 10mg/kg 0.65±0.12 <0.005 0.22±0.03 <0.001 15mg/kg 0.49±0.17 <0.001 0.20±0.04 <0.001 在所有三個siRNA劑量水平上計算肝臟VEGF mRNA和蛋白的統(tǒng)計學顯著減少。










表權利要求
1.用于抑制細胞內(nèi)人Eg5基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個互相互補的序列，且其中的正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Eg5的mRNA的至少一部分基本互補的互補區(qū)域，其中所述互補區(qū)域小于30個核苷酸長度，且其中所述dsRNA一旦與表達所述Eg5的細胞接觸就抑制所述Eg5基因的表達。
2.如權利要求1的dsRNA，其中所述第一序列選自由表1-3的反義鏈序列組成的組，所述第二序列選自由表1-3的正義鏈序列組成的組。
3.如權利要求1的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個修飾核苷酸。
4.如權利要求2的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個修飾核苷酸。
5.如權利要求4的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自以下組2’-O-甲基修飾核苷酸、含5’-硫代磷酸酯基的核苷酸和連接至膽固醇衍生物或月桂酸雙癸酰胺基團的末端核苷酸。
6.如權利要求4的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自以下組2’-脫氧-2’-氟修飾核苷酸、2’-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、無堿基核苷酸、2’-氨基-修飾核苷酸、2’-烷基修飾核酸、嗎啉核苷酸、氨基磷酸酯和含非天然堿基的核苷酸。
7.如權利要求4的dsRNA，其中所述第一序列選自由表1-3組成的組，所述第二序列選自由表1-3組成的組。
8.細胞，其含權利要求1的dsRNA。
9.用于抑制Eg5基因表達的藥物組合物，其含權利要求2的dsRNA。
10.如權利要求9的藥物組合物，其中所述dsRNA的所述第一序列選自由表1-3的正義鏈序列組成的組，所述dsRNA的所述第二序列選自由表1-3的反義鏈序列組成的組。
11.如權利要求10的藥物組合物，其還包括抑制VEGF基因表達的dsRNA。
12.抑制細胞內(nèi)Eg5基因表達的方法，所述方法包括
(a)將權利要求2的dsRNA引入所述細胞中；和
(b)將步驟(a)產(chǎn)生的細胞維持足夠的時間以使Eg5基因的mRNA轉錄物降解，由此抑制所述細胞中Eg5基因的表達。
13.如權利要求12的方法，其中將抑制VEGF表達的第二dsRNA引入到所述細胞中。
14.治療、預防或控制由Eg5表達介導的病理過程的方法，其包括給所需患者施用治療或預防有效量的權利要求2的dsRNA。
15.如權利要求14的方法，其還包括施用抑制VEGF表達的第二dsRNA。
16.用于抑制細胞內(nèi)Eg5基因表達的載體，所述載體包含可操作地連接在編碼dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列上的調(diào)控序列，其中所述dsRNA的一條鏈與編碼Eg5的mRNA的至少一部分基本互補，且其中所述dsRNA小于30個堿基對長度并且所述dsRNA一旦與表達所述Eg5的細胞接觸就抑制所述Eg5基因的表達至少40％。
17.細胞，其含權利要求16的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制Eg5基因(Eg5基因)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，該dsRNA包含具有核酸序列的反義鏈，所述核酸序列小于30個核酸長度通常為19-25個核酸長度且與Eg5基因的至少一部分基本互補。本發(fā)明還涉及含所述dsRNA和藥學上可接受的載體的藥物組合物；利用所述藥物組合物治療由Eg5表達和Eg5基因的表達引起的疾病的方法；以及抑制細胞中Eg5基因表達的方法。
文檔編號C12N15/113GK101448849SQ200780018407
公開日2009年6月3日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權日2006年3月31日
發(fā)明者大衛(wèi)·邦克洛特, 帕梅拉·譚, 漢斯-彼得·沃爾洛赫爾, 安克·蓋克 申請人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司