專(zhuān)利名稱(chēng)：調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)施方案提供了在體外、體內(nèi)和先體外后體內(nèi)增加或減少造血干 細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)劑。
北旦
3 '7、
干細(xì)胞研究擁有于開(kāi)發(fā)療法的非凡潛力，所述療法可以改變患有諸 如白血病、糖尿病和貧血的疾病的那些人的未來(lái)。許多研究集中于干細(xì) 胞生物學(xué)作為關(guān)于疾病治療的關(guān)鍵的探究。通過(guò)干細(xì)胞在正常發(fā)育中的 作用的了解，研究者尋求捕獲且指導(dǎo)干細(xì)胞的先天能力以治療許多狀
況。研究在許多區(qū)域中同時(shí)進(jìn)行檢查驅(qū)動(dòng)胚胎干細(xì)胞在各種組織中發(fā) 育的遺傳和分子觸發(fā)物；學(xué)習(xí)如何推動(dòng)那些細(xì)胞分裂且形成特化組織； 培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞且開(kāi)發(fā)起作用的新系；尋找通過(guò)消除供體需要來(lái)消除或 控制移植物抗宿主病的方法；和產(chǎn)生可普遍移植的細(xì)胞系。
造血干細(xì)胞(HSCs)在胚胎發(fā)生期間在不同區(qū)域中衍生，其中特異 性誘導(dǎo)事件使中胚層轉(zhuǎn)變成血液干細(xì)胞和祖先。仍需要闡明特定生物分 子、化學(xué)試劑和其他因子之間在這些誘導(dǎo)事件中的關(guān)聯(lián)。例如，仍需要 鑒定何種生物分子或化學(xué)試劑有希望用于處理HSC群體用于所需目的， 例如增加HCS群體用于研究或治療。概述
本實(shí)施方案的組合物和方法提供了 HCS調(diào)節(jié)劑，其是根據(jù)具體適 應(yīng)癥所需增加HSC數(shù)目或減少HSC數(shù)目的試劑。例如，發(fā)現(xiàn)增加HSC 數(shù)目的HSC調(diào)節(jié)劑包括前列腺素E2 ( PGE2 )和刺激PGE2途徑的試劑。 相反，阻止PGE2合成的HSC調(diào)節(jié)劑減少HSC數(shù)目。
一個(gè)實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)受試者中的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法， 其包括施用至少一種造血干細(xì)胞(HSC )調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)增加 HSCs。通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)增強(qiáng)HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選 自下述的至少一種化合物PGE2、dmPGE2、PGI2、亞油酸、13( s)-HODE、 LY171883、 Mead酸(Mead Acid ) 、 二十石友三烯酸、環(huán)氧二十石灰三烯酸、 ONO-259、 Cayl039、 PGE2受體激動(dòng)劑、以及這些試劑中的任何一種的 衍生物。在更具體的實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑是選自下述的PGE2衍生 物16,16-二甲基PGE2、 19 ( R )-羥基PGE2、 16,16匿二甲基PGE2 p-( p-乙酰氨基苯甲酰氨基)苯酯、11-脫氧-16,16-二甲基PGE2、 9-脫氧-9-亞 甲基-16,16-二甲基PGE2、 9-脫氧-9-亞甲基PGE2、 丁環(huán)前列素、硫前列 酮、PGE2絲氨醇酰胺、PGE2曱酯、16-苯基四去曱(tetranor) PGE2 、 15 (S) -15-甲基PGE2和15 (R) -15-曱基PGE2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)增加HSCs。 通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)增強(qiáng)HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下迷的至 少一種化合物PGE2、 dmPGE2、 BIO、 LiCl、以及這些化合物的衍生 物。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾cAMP/P13K/AKT第 二信使來(lái)增加HSCs。通過(guò)修飾cAMP/P13K/AKT第二信使來(lái)增強(qiáng)HCS 群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物8-溴-cAMP、毛 喉素、以及這些試劑的衍生物。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Ca2+第二信使來(lái)增 加HCS群體。通過(guò)修飾Ca2+第二信使來(lái)增強(qiáng)HCS群體的HCS調(diào)節(jié)劑 可以是選自下述的至少一種試劑Bapta-AM、芬地林、尼卡地平、以及 這些化合物的衍生物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳 導(dǎo)來(lái)增加HSCs。通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)HCS群體的HCS調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物L(fēng)-Arg、硝普鈉、釩酸 鈉、緩激肽、及其衍生物。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自 下述的至少一種試劑美貝維林、丙酮縮氟氬羥龍、阿替洛爾、吲哚洛 爾、加波沙朵(Gaboxadol)、犬尿烯酸、肼屈。秦、噻苯達(dá)唑、比枯枯 靈石成(BicucUme) 、 Vesamicol、黃夾次普、丙。米。泰、氯石黃丙脲、1,5-
亞戊基四唑、4-氨基吡啶、二氮噪、苯磷硫胺、12-甲氧基十二碳烯酸、
N-甲?；?Met-Leu-Phe、加拉碘按、IAA94、氯烯雌醚、以及這些化合 物的衍生物。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了通過(guò)使新生干細(xì)胞群體與選自下述的至少 一種化合物接觸來(lái)促進(jìn)HSC生長(zhǎng)的方法PGE2、 PGI2、亞油酸、13(s) -HODE、 LY171883、 Mead酸、二十碳三烯酸、環(huán)氧二十碳三烯酸、 ONO-259、 Cayl039、 PGE2受體激動(dòng)劑、16,16-二甲基PGE2、 19(R) -羥基PGE2 、 16,16-二曱基PGE2 p-( p-乙酰氨基苯曱酰氨基)苯酯、11 _脫 氧-16,16-二甲基PGE2、9-脫氧-9-亞曱基-16,16-二曱基PGE2、9-脫氧-9-亞 甲基PGE2、 丁環(huán)前列素、硫前列酮、PGE2絲氨醇酰胺、PGE2甲酯、 6響苯基四去曱PGE2、 15 (S) '15-甲基PGE2、 15 ( R ) -15-曱基PGE2、 BIO、 8-溴-cAMP、毛喉素、Bapta-AM、芬地林、尼卡地平、硝苯地平、 匹莫齊特、毒毛旋花子苷原、毛花苷、L-Arg、硝普鈉、釩酸鈉、緩激 肽、美貝維林、丙酮縮氟氳羥龍、阿替洛爾、吲哚洛爾、加波沙朵、犬 尿烯酸、肼屈。秦、噻苯達(dá)唑、比枯枯靈堿、Vesamicol、黃夾次苷、丙咪 嗪、氯磺丙脲、1,5-亞戊基四唑、4-氨基吡啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12-甲氧基十二碳烯酸、N-甲?；?Met-Leu-Phe、加拉碘銨、IAA 94、氯烯 雌醚、及其衍生物。新生干細(xì)胞群體可以從外周血、臍帶血、絨毛膜絨 毛、羊膜液、胎盤(pán)血或骨髓中收集。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)HSC先體外后體內(nèi)擴(kuò)增 的方法，其包括在至少一種HSC調(diào)節(jié)劑的存在下溫育HSC。本發(fā)明的 另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)HSC先體外后體內(nèi)擴(kuò)增的方法，其包 括收集HSC來(lái)源樣品(例如，外周血、臍帶血、羊膜液、胎盤(pán)血、骨 髓、絨毛膜絨毛)且在至少 一種HSC調(diào)節(jié)劑例如PGE2的存在下貯藏其。 具體實(shí)施方案提供了包含適合于HCS來(lái)源樣品貯藏的容器的試劑盒， 其中所述容器預(yù)裝入增加HCSs的至少一種HSC調(diào)節(jié)劑。另外的實(shí)施方案提供了試劑盒，其包含適命于HCS來(lái)源樣品貯藏的容器和包含合適
量的增加HSCs的至少 一種HSC調(diào)節(jié)劑的小瓶。本發(fā)明的進(jìn)一 步實(shí)施方 案提供了用于促進(jìn)HSC先體外后體內(nèi)擴(kuò)增的方法，其中使新生HSC來(lái) 源在最初收集時(shí)、在加工期間、在貯藏時(shí)、在解凍后、或在輸液期間與 PGE2或其衍生物接觸。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾前列腺素途徑 來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)抑制HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可 以是選自下述的至少一種化合物吲哚美辛、芬布芬、NS398、 SC560、 舒林酸、琥丁唑酮、阿司匹林、萘普生、布洛芬、塞來(lái)昔布、PGJ2、馬 兜鈴酸、AH6809、 AH23848、以及這些的衍生物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)抑制HSCs。 通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)抑制HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至 少一種試劑前列腺素抑制劑、Kenpaullone、丙戊酸、或其衍生物。
在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾 cAMP/P13K/AKT第二信使來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾cAMP/P13K/AKT第 二信使來(lái)抑制HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的一種或多種化 合物PD98059、 KT5720、 H89、 U0126、渥曼青霉素、及其衍生物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Ca^第二信使來(lái)抑制 HSCs。通過(guò)修飾Ca^第二信使來(lái)抑制HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選 自下述的至少一種試劑BayK 8644、石危利。達(dá)。秦、以及這些試劑的書(shū)亍生 物。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào) 傳導(dǎo)來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制HCS群體 的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物L(fēng)-NAME、依那普利、 卡托普利、AcSDKP、氯沙坦、AcSDKP、氯沙坦、Telimasartan、組胺、 氨溴索、白楊黃素、環(huán)己酰亞胺、亞曱藍(lán)、腎上腺素、地塞米松 (Dexamethazone)、普羅地芬、異硫氰酸千酯、麻黃堿、及其衍生物。
在本發(fā)明的一個(gè)另外實(shí)施方案中，抑制HCS群體的HSC調(diào)節(jié)劑是 選自下迷的至少 一種化合物Paragyline、普萘洛爾、依他硝唑、曱巰 咪唑、西諾沙星、青霉胺、呋塞米、Eburnaminmone、阿柔比星、華法 林、y-氨基丁酸、炔諾酮、鷹爪豆堿、二氬奎尼丁、乙肼苯噠嗪、曱氧 明、羥基脲、雙氫麥角胺、安他唑林、3-硝基丙酸、N-苯氨茴酸、非那
8吡啶、二氯犬尿烯酸、3-雌二醇、L-Leu、酚千明、美芬丁胺、四氫煙酸、 愈創(chuàng)蘭油烴、咪唑、p-胡蘿卜素、氯苯丁酯、以及這些化合物的衍生物。 另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于抑制受試者中的HSC生長(zhǎng)的方法，其 包括施用至少一種HSC調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施方 案中，HSC調(diào)節(jié)劑是選自下述的一種或多種化合物吲哚美辛、塞來(lái)昔 布、芬布芬、前列腺素(Prosteglandm) J2、琥丁唑酮、舒林酸、及其 衍生物。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了通過(guò)使新生干細(xì)胞群體與選自下述的至少 一種化合物接觸用于減少HSC生長(zhǎng)的方法巧1咮美辛、芬布芬、NS398、 SC560、舒林酸、琥丁唑酮、阿司匹林、萘普生、布洛芬、塞來(lái)昔布、 PGJ2、馬兜鈴酸、AH6809、 AH23848、 Kenpaullone、丙戊酸、PD98059、 KT5720、 H89、 U0126、渥曼青霉素、BayK 8644、硫利噠。泰(Thiridazine )、 L-NAME、依那普利、卡托普利、AcSDKP、氯沙坦、AcSDKP、氯沙坦、 Telimasartan、組胺、氨溴索、白楊黃素、環(huán)己酰亞胺、亞甲藍(lán)、腎上腺 素、地塞米松、普羅地芬、異硫氰酸節(jié)酯、麻黃堿、Paragylme、普萘洛 爾、依他硝唑、曱巰咪唑、西諾沙星、青霉胺、呋塞米、Eburnamininone、 阿柔比星、華法林、Y-氨基丁酸、炔諾酮、鷹爪豆堿、二氫奎尼丁、乙 肼苯噠溱、甲氧明、羥基脲、雙氫麥角胺、安他唑林、3-硝基丙酸、N-苯氨茴酸、非那吡啶、二氯犬尿烯酸、3-雌二醇、L-Leu、酚千明、美芬 丁胺、四氫煙酸、愈創(chuàng)蘭油烴、咪唑、|3-胡蘿卜素、氯笨丁酯、PGE2受 體拮抗劑、以及這些化合物的衍生物。


圖1表示關(guān)于使用斑馬魚(yú)胚胎影響AGM中的干細(xì)胞的化學(xué)藥品的
篩選示意。
圖2A和2B涉及前列腺素激動(dòng)劑和拮抗劑，其改變r(jià)unxl/cmyb表 達(dá)而不影響血管發(fā)育。圖2A顯示在原始(gatal和lmo2 )和永久(lmo2 和cd41 )血細(xì)胞生成期間分離的FACS分選細(xì)胞群體的微陣列表達(dá)概況。 顯示了與GFP-細(xì)胞相比較，每個(gè)GFP+分選級(jí)分中的coxl (淡灰色) 和cox-2 (深灰色)的相對(duì)表達(dá)。圖2B顯示與對(duì)照相比較(每個(gè)三重峰 中的第1條)，在暴露于長(zhǎng)效dmPGE2 (10pM,每個(gè)三重峰中的第2 條，深灰色)或非特異性cox抑制劑吲哚美辛(10pM,每個(gè)三重峰中的第3條)后的內(nèi)皮和HSC特異性基因表達(dá)的qPCR概況。2種處理都 導(dǎo)致與關(guān)于檢查的每種基因的對(duì)照相比較統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異 (ANOVA, p<0.05, n=8)。
圖3描述了指出前列腺素激動(dòng)劑和拮抗劑改變r(jià)unxl/cmyb表達(dá)的數(shù) 據(jù)，其通過(guò)經(jīng)由共焦顯微鏡術(shù)檢測(cè)到的雙基因(bigemc)斑馬魚(yú)胚胎中的 HSC數(shù)目的定量分析DMS0 23.3土5.0(平均值土SD) , dmPGE2 ( 10pM ) 38.0±2.2, 口引咮美辛(lOjaM) (ANOVA, pO.OOOOl， n-10/處理)。
圖4A和4B顯示用dmPGE2處理增強(qiáng)亞致死照射的成年斑馬魚(yú)中 的造血恢復(fù)。執(zhí)行斑馬魚(yú)全KM照射恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。星號(hào)(*)指示統(tǒng)計(jì)學(xué) 上顯著的差異* = 50|^1對(duì)對(duì)照，** = 50|!]^對(duì)10(iM和50pM對(duì)對(duì)照， *** =所有顯著的變量(ANOVA, p0.05, n二15/變量)。圖4A顯示了 在DMSO和dmPGE2處理的(50pM )斑馬魚(yú)中照射恢復(fù)的第0、 4、 7、 10和14天時(shí)在KM中的造血細(xì)胞語(yǔ)系的代表性FSC/SSC FACS概況。 圖4B顯示在對(duì)照魚(yú)(三角形)和dmPGE2處理的魚(yú)(正方形，10fiM; 圓圈，50pM)中前體細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的KM重構(gòu)的動(dòng)力 學(xué)。
圖5A和5B描述了改變亞致死照射的成年斑馬魚(yú)中的HSC相關(guān)基 因表達(dá)和恢復(fù)的PG途徑的調(diào)節(jié)。圖5A顯示如通過(guò)對(duì)于照射后第3天 分離的全KM的qPCR測(cè)量的，dmPGE2處理對(duì)干細(xì)胞和內(nèi)皮標(biāo)記的作 用。星號(hào)(*)指出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(雙尾t檢驗(yàn)，n=15， runx
p=0.0001; lmo2: p=0.014; fill: p=0.049)。圖5B描述了 coxl ( SC560, 10pM)和cox2 (NS398, IOjliM)抑制對(duì)于照射恢復(fù)(n-5/處理)的作 用。對(duì)于用SC560或NS398處理的魚(yú)，由于在這些處理組中的過(guò)量死 亡，在第14天時(shí)無(wú)法獲得分析。
圖6A和6B顯示dmPGE2調(diào)節(jié)小鼠ES細(xì)胞中的集落數(shù)目和造血分 化。進(jìn)行M3434和OP9 ES細(xì)胞集落形成測(cè)定；計(jì)數(shù)是鋪平板的每 100,000個(gè)細(xì)胞。條指出對(duì)照處理的ES細(xì)胞和用漸增劑量的dmPGE2 (10pM、 20|liM、 lOOpM)的處理或。引咮美辛處理的U0pM、 100pM) ES細(xì)胞。星號(hào)("指出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(雙尾t檢驗(yàn)，『5/變量)。 圖6A,顯示了漸增劑量的dmPGE2和經(jīng)由。引咪美辛抑制環(huán)加氧酶活性 對(duì)曱基纖維素中的造血分化的作用；終末類(lèi)紅細(xì)胞(E)、混合粒細(xì)胞/ 單核細(xì)胞(GM)和多能(GEMM)祖先集落的數(shù)目(10|iMdmPGE2:GMp-0.005, GEMMp=0.017; 20pMdmPGE2: dEp=0.04, GMp=0.007，GEMM 0.016; 100iuM吲咪美辛:GM p=0.024 )。圖6B, dmPGE2和口引咮美辛對(duì)OP9造血集落數(shù)目的作用(20pM: p=0.047)。
圖7A和7B描述了 PGE2對(duì)集落數(shù)目的影響。更具體而言，圖7A和7B舉例說(shuō)明了在(A)甲基纖維素和(B) OP9測(cè)定中集落形成的。引哚美辛(100|uM)抑制的dmPGE2介導(dǎo)的(10pM)援救。
圖8A-圖8F指出鼠BM暴露于dmPGE2增加CFU-S和再增殖HSCs的數(shù)目。星號(hào)(*)指出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。圖8A和8B, WBM(在冰上2小時(shí))用EtOH對(duì)照或dmPGE2 ( lpM/106個(gè)細(xì)胞)的先體外后體內(nèi)處理對(duì)CFU-S8和CFU-S12 ( 60,000個(gè)細(xì)胞/受體；CFU-S12:雙尾t檢驗(yàn)，n=10, pO.OOOl)的作用。圖8C,在用巧l咮美辛UpM/106個(gè)細(xì)胞)先體外后體內(nèi)處理后對(duì)CFU-S12的作用(100,000個(gè)細(xì)胞/受體，雙尾t檢驗(yàn)，n-10,p:0.0002 )。圖8D,ckit+scal+譜系-干細(xì)胞在用dmPGE2或EtOH對(duì)照處理后的CFU-S12評(píng)估(雙尾t檢-驗(yàn)，100個(gè)細(xì)胞n=10，p=0.013; 300個(gè)細(xì)胞p=0.0003 )。圖8E和8F,有限稀釋竟?fàn)幵僭鲋硿y(cè)定。顯示了在12周時(shí)如通過(guò)FACS分析(e)測(cè)定的，與對(duì)照(正方形)或dmPGE2處理的(圓圈)細(xì)胞樣品移植的細(xì)胞總數(shù)目相關(guān)的陰性受體數(shù)目。在移植后6、 12和24周時(shí)通過(guò)Poisson統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的，在EtOH對(duì)dmPGE2處理的WBM的受體中的移入頻率(小圖F ) ( ANOVA,11=10/變量,6周p=0.005; 12周:p=0.002; 24周:p=0.05);在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)分析存活的受體數(shù)目顯示于表6-表8中。
圖9A-9N描述了顯示鼠BM暴露于dmPGE2增加脾重量和1次HSC移入的數(shù)據(jù)。圖9A和9B,在第(a) 8和(b) 12天時(shí)用EtOH對(duì)照或dmPGE2先體外后體內(nèi)處理WBM和分離的HSCs對(duì)脾重量的作用(雙尾t檢驗(yàn)，CFU-S8: n=5, p=0.339; CFU-S12: n=9， pO.00001 )。圖9C,與對(duì)照比較，在。引咮美辛處理(綠色)后的脾重量(雙尾t檢驗(yàn)n=10，p=0.00026 )。圖9D,在KSL細(xì)胞的dmPGE2處理后的脾集落數(shù)目(雙尾t才企,險(xiǎn)，IOO個(gè)細(xì)月包n=4, p=0.0013; 300個(gè)細(xì)月包n=5, p=0.009 )。圖9E,舉例說(shuō)明在對(duì)照和dmPGE2暴露的BM細(xì)胞的受體中的CD45.1移入水平(左上象限)的代表性FACS圖。圖9F-9J,在dmPGE2處理的WBM(圓圈)對(duì)對(duì)照(正方形)的受體中的平均嵌合狀態(tài)(F、 H、I)和計(jì)算的移入頻率(圖9G和9J)。圖9K和9L,在CFU-Su測(cè)定中用coxl (SC560, 10pM)和cox2 (NS398, lO^M)抑制劑先體外后體內(nèi)處理WBM對(duì)集落數(shù)目(配對(duì)t檢驗(yàn)，n=10, SC560 p=0.00016, NS398p<0.00001和脾重量(配對(duì)t檢驗(yàn)，n=10, SC560 p=0.025, NS398p=0.00075 )的作用。圖9M和9N，在5-FU骨髓損傷后的外周血(處理后第14天)和骨髓(處理后第16天)WBC計(jì)數(shù)；體內(nèi)暴露于SC560或NS398顯著抑制WBC恢復(fù)，而dmPGE2增強(qiáng)WBC計(jì)數(shù)。圖10呈現(xiàn)了 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的圖解。
圖IIA和IIB描述了 wnt活性的調(diào)節(jié)影響成體穩(wěn)態(tài)的數(shù)據(jù)。圖11A顯示了照射測(cè)定的示意圖；圖llB呈現(xiàn)了在wt, hs: wnt8, hs: dkk和hs: dnTCF成體中在照射后第10天時(shí)整個(gè)腎髓的FACS分析。
圖12顯示了在體內(nèi)Top: dGFP測(cè)定中在由前列腺素信號(hào)傳導(dǎo)引起的發(fā)育胚胎中的wnt活性中的改變的qPCR定量。
圖13呈現(xiàn)了描述PG和wnt途徑的相互作用的潛在點(diǎn)的模型。(1)PGE2不能援救dkk、 axin、 dnTCF;吲哚美辛不能阻斷wnt8。 ( 2 ) PGE2援救dkk,但不援救axin和dnTCF; 口引味美辛可以阻斷wnt8; PGE2援救dkk和axin，但不援救dnTCF;。引咮美辛可以阻斷wnt8。 ( 4 ) PGE2援救dkk、 axin和dnTCF;吲咪美辛可以阻斷wnt8。
圖14顯示了在照射以及用dmPGE2或。引咮美辛處理后第3天時(shí)，在Top: dGFP成體的腎髓中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。
詳述
除非本文另有定義，與本申請(qǐng)結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、規(guī)程和試劑等，并且同樣可以改變。本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并且不意欲限制完全由權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。
除了在操作實(shí)施例中或另有說(shuō)明時(shí)，表示本文使用的成分或反應(yīng)條件的量的所有數(shù)目應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語(yǔ)"約"修飾。術(shù)語(yǔ)"約，，當(dāng)與百分比結(jié)合使用時(shí)可以意指±1 % 。
鑒定的所有專(zhuān)利和其他出版物為了描述和公開(kāi)例如此種出版物中描述的方法的目的特別引入本文作為參考，所述方法可以與本發(fā)明結(jié)合
12使用。這些出版物僅在本申請(qǐng)的提交日期前提供其公開(kāi)內(nèi)容。在這點(diǎn)上
無(wú)權(quán)在時(shí)間^先"于此種公開(kāi)內(nèi)容。關(guān)于日期的所有^聲明或關(guān);這些文件內(nèi)容的陳述基于對(duì)于申請(qǐng)人可用的信息，并且不構(gòu)成關(guān)于這些文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
造血千細(xì)胞(HSC)穩(wěn)態(tài)受生長(zhǎng)因子、信號(hào)傳導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子的緊密控制。在主動(dòng)脈-生殖腺-中腎(AGM)區(qū)中在胚胎發(fā)生期間衍生的終末HCSs隨后定居在胎兒和成體造血器官中的小生境。Dzierzak， 12Curr. Opm. Hematol. 197-202 ( 2004) ; Galloway & Zon, 53 Curr. Top.Devel. Biol. 139-58 ( 2003 )。
本發(fā)明提供了用于在體外、體內(nèi)或先體外后體內(nèi)調(diào)節(jié)HSC生長(zhǎng)和更新的方法。該方法包括使新生干細(xì)胞群體與至少一種HSC調(diào)節(jié)劑接觸。這種群體可以包含在外周血、臍帶血、骨髓、羊膜液、絨毛膜絨毛、胎盤(pán)或其他造血干細(xì)胞小生境內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)細(xì)胞群體中的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)和更新的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞群體中的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)和更新的方法。
本發(fā)明部分基于PGE2和增強(qiáng)PGE2合成的試劑引起HSC數(shù)目中的增加的發(fā)現(xiàn)。相反，阻斷PGE2合成的試劑減少HSCs。在這點(diǎn)上，影響PGE2合成的試劑可以視為HSC調(diào)節(jié)劑。例如，負(fù)責(zé)PGE2合成的環(huán)加氧酶(cox)可能是HSC形成所需的。此外，血管舒張劑促進(jìn)HSC擴(kuò)增，相反，血管收縮劑減少HSC數(shù)目。例如，肼屈嗪——抗高血壓血管舒張劑增加HSCs,而芬布芬——非類(lèi)固醇類(lèi)抗炎藥血管收縮劑減少HSCs。這些試劑因此也視為HSC調(diào)節(jié)劑。
如本文所使用的，HSC調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)或抑制HSC生長(zhǎng)和更新。HSC調(diào)節(jié)劑影響細(xì)胞群體中的HSC數(shù)目。HSC調(diào)節(jié)劑影響培養(yǎng)中(在體外)、在短期溫育期間(先體外后體內(nèi))或在體內(nèi)的HSC擴(kuò)增。參見(jiàn)下表1。增加HSC數(shù)目的HSC調(diào)節(jié)劑包括上調(diào)PGE2合成的試劑。HSC數(shù)目中的增加可以是比治療前由受試者顯示出的HSC數(shù)目多約10% 、約20 % 、約30 % 、約40 % 、約50 % 、約60 % 、約70 % 、約80 % 、約90 % 、約100 % 、約150 % 、約200 %或更多的增加。
引起HSC數(shù)目中的減少的HSC調(diào)節(jié)劑下調(diào)PGE2合成和/或促進(jìn)血管收縮。參見(jiàn)例如下表2。 HSC數(shù)目中的減少可以是比治療前由受試者顯示出的HSC數(shù)目少約10%、約20%、約30%、約40%、約50 % 、約60 % 、約70 % 、約80 % 、約90 % 、約100 % 、約150 % 、約200 %或更多的減少。HSC數(shù)目可以通過(guò)疾病癥狀的減輕進(jìn)行評(píng)估，例如增加的血小板計(jì)數(shù)、增加的血細(xì)胞比容，其中血小板計(jì)數(shù)或血細(xì)胞比容增加約10 % 、約20 % 、約30 % 、約40 % 、約50 % 、約60 % 、約70 % 、約80%、約90%、約100%、約150%、約200%或更多。對(duì)HSC數(shù)目的作用可以通過(guò)疾病癥狀的減輕進(jìn)^f亍評(píng)估，例如增加的血小一反計(jì)^t、增加的血細(xì)胞比容，其中血小板計(jì)數(shù)或血細(xì)胞比容增加約10%、約20%、約30 % 、約40 % 、約50 % 、約60 % 、約70 % 、約80 % 、約90 % 、約100%、約150%、約200%或更多。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PGE2或dmPGE2用作HSC調(diào)節(jié)劑以增加HSC群體。
本發(fā)明的HCS調(diào)節(jié)劑還包括HCS調(diào)節(jié)劑的衍生物。如本文所使用的，衍生物包括化學(xué)修飾的化合物，其中所述修飾由熟練的化學(xué)家視為常規(guī)的，例如另外的化學(xué)部分(例如，酸的酯或酰胺，保護(hù)基團(tuán)，例如用于醇或硫醇的苯基、和用于胺的叔丁氧基羰基)。衍生物還包括放射性標(biāo)記的HSC調(diào)節(jié)劑，HSC調(diào)節(jié)劑的綴合物(例如，生物素或抗生物素蛋白、使用酶例如辣根過(guò)氧化物酶等、使用生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑或熒光劑)。此外，可以給HCS調(diào)節(jié)劑或其部分添加部分以增加體內(nèi)半衰期。如本文所使用的，衍生物還包含類(lèi)似物，例如包含化學(xué)4奮飾形式的特定化合物或其類(lèi)別的化合物，和維持所述化合物或類(lèi)別的藥學(xué)和/或藥理學(xué)活性特征的化合物，也包含在本發(fā)明中。如本文所使用的，衍生物還包含HCS調(diào)節(jié)劑的前體藥物，這已知增強(qiáng)藥物的所需性質(zhì)(例如，可溶性、生物利用率、制備等)。
HSC調(diào)節(jié)劑的直接先體外后體內(nèi)施用可以使造血干細(xì)胞能夠顯著體內(nèi)擴(kuò)增，從而使得甚至更小量的造血干細(xì)胞隨后在移植中可以是足夠的。因此，例如，臍帶血干細(xì)J包移植現(xiàn)在不僅可以應(yīng)用于兒童還可以應(yīng)用于成年人。此種干細(xì)胞可以從包括例如外周血、臍帶血、骨髓、羊膜液或胎盤(pán)血的來(lái)源進(jìn)行收集。可替代地，包含HSC的來(lái)源樣品可以進(jìn)^t收獲，然后立即在HSC調(diào)節(jié)劑例如PGE2的存在下進(jìn)行貯藏，并且在引入受試者內(nèi)之前在HSC調(diào)節(jié)劑的存在下進(jìn)行最初溫育(在分化前)。此外， 一種或多種HSC調(diào)節(jié)劑可以在體內(nèi)用于增加骨髓或其他來(lái)源(例如臍帶血)中的千細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)增加千細(xì)胞的數(shù)目，來(lái)自受試者的千細(xì)胞總收獲可以得到顯著改善。進(jìn)一步地，通過(guò)增加由受試者收獲的干細(xì)胞數(shù)目，可用于移植回該受試者內(nèi)或另一個(gè)受試者內(nèi)的干細(xì)胞數(shù)目也可以得到顯著改善，從而有效減少移入的時(shí)間，且隨后導(dǎo)致受試者在其間具有不足的嗜中性粒細(xì)胞和血小板的時(shí)間中的減少，從而防止
感染、出血或其4也并發(fā)癥。
此外，本發(fā)明可以減少其否則不能轉(zhuǎn)移足夠細(xì)胞用于千細(xì)胞收獲以繼續(xù)進(jìn)行關(guān)于其最初疾病的治療的受試者比例，所迷治療例如化學(xué)治療和其他骨髓切除治療。因此，還可以減少具有延遲的最初移入的受試者
數(shù)目的比例。此外，本發(fā)明還可以通過(guò)增加HSC數(shù)目促進(jìn)骨髓切除治療后的恢復(fù)。
HSC調(diào)節(jié)劑例如表1和本文公開(kāi)的那些可以在體內(nèi)用于增加HSC生產(chǎn)和先體外后體內(nèi)增加HSC數(shù)目。這通過(guò)將一種或多種化合物施用于受試者或干細(xì)胞來(lái)完成。
HSC調(diào)節(jié)劑還可以用于給受試者提供自體的HSCs。 一般地，這涉及下述步驟給有此需要的受試者施用HSC調(diào)節(jié)劑，以增強(qiáng)骨髓內(nèi)的干細(xì)胞群體擴(kuò)增和/或轉(zhuǎn)移外周循環(huán)中的干細(xì)胞；收獲一種或多種骨髓干細(xì)胞或外周循環(huán)中的 一種或多種干細(xì)胞；且將一種或多種收獲的干細(xì)胞移植回受試者內(nèi)。
此外，得自根據(jù)上文描述的本發(fā)明方法收獲的干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知用于干細(xì)胞深低溫保藏的技術(shù)進(jìn)行深低溫保藏。因此，使用深低溫保藏，干細(xì)胞可以這樣維持，從而使得一旦確定受試者需要干細(xì)胞移植，那么干細(xì)胞可以進(jìn)行解凍且移植回受試者內(nèi)。如前所述，在深低溫保藏技術(shù)期間一種或多種HSC調(diào)節(jié)劑例如PGE2的使用可以增強(qiáng)HSC群體。
更具體而言，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了從臍帶血或等價(jià)新生兒或胎兒干細(xì)胞來(lái)源收集的HSCs的增強(qiáng)，這可以進(jìn)行深低溫保藏用于此種干細(xì)胞在解凍后的治療用途。此種血液可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種方法進(jìn)行收集。例如，因?yàn)槟殠а荋SCs的豐富來(lái)源(參見(jiàn)Nakahata &Ogawa, 70丄Clin. Invest. 1324-28( 1982 ); Prindull等人，67 Acta. Paediatr.Scand. 413-16 ( 1978 ) ; Tchernia等人，97 ( 3 ) J. Lab. Clin. Med. 322-31(1981)),所以關(guān)于新生兒血液的極佳來(lái)源是臍帶和胎盤(pán)。新生兒血 液可以通過(guò)從臍帶中直接引流和/或通過(guò)在根和擴(kuò)張靜脈處從分娩胎盤(pán)
中針抽吸來(lái)獲得。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,160,714 ; 5,114,672; 5,004,681;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/076180,
發(fā)明者L·I·宗, T·E·諾思, W·戈斯林 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)療中心有限公司