專利名稱：：用于純化雙特異性抗體的抗體修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于純化雙特異性抗體的抗體修飾方法、該雙特異性抗體的分離方法、以及含有該雙特異性抗體作為有效成分的藥物組合物等。
背景技術(shù)：
：抗體在血液中的穩(wěn)定性高、副作用小，因此作為藥物受到人們的關(guān)注。其中有可同時識別兩種抗原(抗原A和抗原B)的雙特異性抗體(非專利文獻(xiàn)1)。目前，正在進(jìn)行臨床實驗的MDX-210是將表達(dá)FcyRI的單核細(xì)胞等對表達(dá)HER-2/neu的癌細(xì)胞重構(gòu)的IgG型雙特異性抗體(非專利文獻(xiàn)2)。抗體的制備通常大多采用基因重組技術(shù)。具體來說，是從雜交瘤、生成抗體的致敏淋巴細(xì)胞等抗體生成細(xì)胞或呈遞抗體基因的噬菌體文庫中克隆編碼抗體的蛋白質(zhì)的DNA,整合到適當(dāng)?shù)妮d體中，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞而生成的技術(shù)。使用基因重組技術(shù)的IgG型雙特異性抗體的制備是將作為目標(biāo)的兩種構(gòu)成IgG的H鏈和L鏈的基因、共四種基因?qū)氲郊?xì)胞中，通過共表達(dá)來分泌。上述表達(dá)中，在表達(dá)野生型H鏈和L鏈的構(gòu)成基因時，隨機(jī)發(fā)生兩種H鏈的締合或H鏈與L鏈的締合，因此，目標(biāo)雙特異性抗體的比例極少。具體來說，目標(biāo)雙特異性抗體只是十種中的一種，生產(chǎn)效率降低。目標(biāo)抗體的生成效率低下不僅成為目標(biāo)抗體純化的障礙，也使批次之間的差異等的不均勻性增大，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增大。作為用于開發(fā)雙特異性抗體的有效的雙特異性抗體的制備方法，有報道報告了用于獲得兩個H鏈中共通的L鏈的共通L鏈獲得技術(shù)、以及用于使H鏈異種締合化的Knobs-into-holes技術(shù)。具體來說，從噬菌體文庫(Phagelibrary)等中找出可對識別抗原A和抗原B的各H鏈保持兩種抗原結(jié)合活性的共通的L鏈，再將存在于一種H鏈的CH3區(qū)域的氨基酸支鏈置換為更大的支鏈(knob,突起)，將存在于另一個H鏈的CH3區(qū)域的氨基酸支鏈置換為更小的支鏈(hole,空隙)，由此使突起配置在空隙內(nèi)，促進(jìn)H鏈雜合二聚體的形成，可有效地獲得目標(biāo)雙特異性抗體(專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)。但是，為了獲得H鏈雜合二聚體而使用Knobs-into-holes技術(shù)時，如非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4所示，通過Knobs-into-holes技術(shù)可以將目標(biāo)A鏈B鏈雜合二聚體的含有率提高至最大95%程度左右，其余的5y。是A鏈均二聚體、B鏈均二聚體，成為雜質(zhì)。為了開發(fā)雙特異性抗體作為藥物，必需從使用共通L鏈(非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)時所生成的三種分子種類(A鏈均二聚體、B鏈均二聚體、A鏈B鏈雜合二聚體)中盡可能地高純度純化A鏈B鏈雜合二聚體。因此，必需要除去殘留的5%的雜質(zhì)一A鏈均二聚體、B鏈均二聚體，將A鏈B鏈雜合二聚體純化為可以作為藥物開發(fā)的高純度。使用共通L鏈而不采用Knobs-into-holes技術(shù)時，理論上A鏈均二聚體、A鏈B鏈雜合二聚體、B鏈均二聚體以1:2:1生成，必須除去50%的雜質(zhì)一A鏈均二聚體、B鏈均二聚體。在藥物制造水平的色譜分離中，目前已經(jīng)有幾種分離A鏈B鏈雜合二聚體和A鏈均二聚體、B鏈均二聚體的方法。作為選擇性地純化A鏈B鏈雜合二聚體的方法，非專利文獻(xiàn)5中報道了以下方法A鏈?zhǔn)褂眯∈驣gG2a、B鏈?zhǔn)褂么笫驣gG2b,利用蛋白A與小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的各H鏈的親和性的不同，控制蛋白A的洗脫pH，由此純化A鏈B鏈雜合二聚體，但是由于是使用小鼠和大鼠的恒定區(qū)，因此從抗原性的觀點來考慮，該方法難以應(yīng)用于對人的藥物。該方法無法分離含有相同亞類的H鏈的A鏈B鏈雜合二聚體，因此其利用受到限制。非專利文獻(xiàn)6中報道了利用疏水相互作用色譜的A鏈B鏈雜合二聚體的純化方法，但是含有抗CD3小鼠IgG2a和抗CD19小鼠IgGl的目標(biāo)A鏈B鏈雜合二聚體難以充分進(jìn)行峰的分離，另外，考慮到是使用不同的亞類的H鏈、利用其疏水性的不同進(jìn)行分離，因此，未必可以分離含有相同亞類的H鏈的A鏈B鏈雜合二聚體。非專利文獻(xiàn)7中報道了利用嗜硫性親和色譜純化A鏈B鏈雜合二聚體的方法，由于是使用小鼠IgGl和大鼠IgG2a、利用該鉸鏈區(qū)的游離半胱氨酸(硫醇基)，因此難以用作分離含有相同亞類的H鏈的A鏈B鏈雜合二聚體，另外游離的半胱氨酸與保存中的聚集有關(guān)，因此不適合于穩(wěn)定的藥物制劑的開發(fā)。非專利文獻(xiàn)8中報道了使用抗原的親和色譜。但是，使用蛋白質(zhì)或肽抗原的親和色鐠存在柱的成本或穩(wěn)定性的課題，因此使用親和色譜制備藥物并不是常規(guī)方法。另外，為了純化與兩種抗原結(jié)合的A鏈B鏈雜合二聚體，必須實施兩次親和色語，可以預(yù)見成本升高。還報道了只識別抗原的立體結(jié)構(gòu)的抗體或低親和性、具有目標(biāo)功能的抗體，具有上述性質(zhì)的抗體難以采用利用抗原的親和色譜。因此，使用親和色語的雙特異性抗體的純化并不通用。如上所述，雙特異性抗體的A鏈B鏈雜合二聚體的純化只能在有限的范圍內(nèi)進(jìn)行，對于將含有相同H鏈亞類、恒定區(qū)序列的雙特異性抗體的A鏈B鏈雜合體純化至可作為藥物接受的高純度的方法尚未見報道。構(gòu)成雙特異性抗體的兩種抗體具有相同恒定區(qū)序列時，必須只根據(jù)可變區(qū)序列的不同來分離A鏈B鏈雜合二聚體，但抗體的可變區(qū)的氨基酸序列在抗體之間的同源性非常高(非專利文獻(xiàn)9)，只憑可變區(qū)序列的不同來將A鏈B鏈雜合二聚體純化至可藥用的高純度是困難的。專利文獻(xiàn)l:國際公開第96/27011號。非專利文獻(xiàn)1:MarvinJS和ZhuZ,"RecombinantapproachestoIgG-likebispecificantibodies.",Acta.Pharmacol.Sin.，June2005,Vol.26(6),p.649-58.非專利文獻(xiàn)2:SegalD.M.等人.，CurrentOpinioninImmunology,1999,Vol.ll，p.558-562.非專利文獻(xiàn)3:MerchantAM等7人.，"AnefficientroutetohumanbispecificIgG",NatBiotechnol.,Jul1998,Vol.16(7)，p.677-81.非專利文獻(xiàn)4:CarterP,"BispecifichumanIgGbydesign",J.Immunol.Methods.,Feb2001,Vol.248(1-2),p.7-15.非專利文獻(xiàn)5:LindhoferH等4人.，"Preferentialspecies-restrictedheavy/lightchainpairinginrat/mousequadromas.Implicationsforasingle-steppurificationofbispecificantibodies.",J.Immunol.,Jul1,1995,Vol.155(1),p.219-25.非專利文獻(xiàn)6:ManzkeO等4人.，"Single-steppurificationofbispecificmonoclonalantibodiesforimmunotherapeuticusebyhydrophobicinteractionchromatography.",J.Immunol.Methods.,Oct13，1997,Vol.208(1),p.65-73.非專利文獻(xiàn)7:KreutzFT等3人.，"Efficientbispecificmonoclonalantibodypurificationusinggradientthiophilicaffinitychromatography.",J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.,Sep4,1998,Vol.714(2)，p.161-70.非專利文獻(xiàn)8:GuptaS和SureshM,"Affinitychromatographyandco-chromatographyofbispecificmonoclonalantibodyimmunoconjugates."，J.Biochem.Biophys.Methods.,May31,2002，Vol.51(3),p.203-16.Review.非專利文獻(xiàn)9:CarlBranden,IntroductiontoProteinStructure2ndedition,NewtonPress.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對上述狀況而設(shè)，其目的在于提供用于高效地純化雙特異性抗體的抗體可變區(qū)的氨基酸修飾的方法、含有修飾的雙特異性抗體的藥物組合物、以及雙特異性抗體藥物組合物的制備方法。本發(fā)明還提供重鏈恒定區(qū)發(fā)生修飾的雙特異性抗體、含有修飾的雙特異性抗體的藥物組合物、以及雙特異性抗體藥物組合物的制備方法。作為可通過使用常用的色"i普柱高效地純化以往難以進(jìn)行目標(biāo)物純化的雙特異性抗體的方法，本發(fā)明人對于抗體可變區(qū)的氨基酸置換的方法進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于構(gòu)成雙特異性抗體的兩種抗體，通過修飾存在于抗體可變區(qū)表面的氨基酸、在兩種抗體的H鏈之間導(dǎo)入等電點差異、利用等電點的差異來用色謙柱高效率地純化雙特異性抗體的方法。具體來說，在抗體的H鏈中發(fā)現(xiàn)了不會使抗體的功能(活性)降低而可只控制等電點的修飾位置。本發(fā)明人還確認(rèn)了通過本發(fā)明的方法獲得的雙特異性抗體實際保持有功能。如上所述，作為使用常用的色語柱高效率地純化任意的雙特異性抗體的方法，本發(fā)明人成功地開發(fā)了通過抗體可變區(qū)氨基酸置換進(jìn)行的方法，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，對于構(gòu)成雙特異性抗體的兩種H鏈的恒定區(qū)，通過在各個H鏈中使用原本等電點有差異的不同的亞類的恒定區(qū)、利用等電點的不同、可以通過色譜柱高效地純化雙特異性抗體的方法。本發(fā)明本發(fā)明涉及為了使用色譜柱^行高效率純化阮體可變區(qū)的氨基酸置換方法、以及含有修飾的雙特異性抗體的藥物組合物、以及雙特異性抗體藥物組合物的制備方法，進(jìn)一步涉及重鏈恒定區(qū)發(fā)生修飾的雙特異性抗體、以及含有修飾的雙特異性抗體的藥物組合物、以及雙特異性抗體藥物組合物的制備方法，更具體地說，涉及以下內(nèi)容多特異性抗體的制備方法，所述多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，該制備方法包含以下步驟(a)修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中之一，使第1多肽與第2多肽的等電點產(chǎn)生差異；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其表達(dá)該核酸；(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多特異性抗體。[l]所述的方法，其中，步驟(a)的修飾是修飾核酸，使第l多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色語法進(jìn)行分析而形成分離的峰。[l]所述的方法，其中，上述笫1多肽和上述第2多肽含有重鏈可變區(qū)。[3]所述的方法，其中，上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體。[1]-[4]中任一項所述的方法，其中，上述笫1多肽和上述第2多肽含有重鏈恒定區(qū)。[習(xí)所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重鏈恒定區(qū)是等電點互不相同的重鏈恒定區(qū)。[6]所述的方法，其中，上述等電點不同的重鏈恒定區(qū)是IgGl和IgG4、或IgGl和IgG2。[1]所述的方法，其中，上述多特異性抗體是雙特異性抗體。多特異性抗體，該多特異性抗體通過[l]所述的方法制備。多特異性抗體的純化方法，該多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，其純化方法如下(a)修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中之一，使第1多肽與第2多肽的等電點產(chǎn)生差異；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其表達(dá)該核酸；[11][IO]所述的方法，其中，步驟(a)的修飾是修飾核酸，使第1多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色語法進(jìn)行分析而形成分離的峰。[IO]所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重鏈可變區(qū)。[12]所述的方法，其中，上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體。[10]-[13]中任一項所述的方法，其中，上迷第1多肽和上迷第2多肽含有重鏈恒定區(qū)。[14]所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重鏈恒定區(qū)是等電點互不相同的重鏈恒定區(qū)。[15]所述的方法，其中，上述等電點不同的重鏈恒定區(qū)是IgGl和lgG4、或lgGl和IgG2。[IO]所述的方法，其中，上述多特異性抗體是雙特異性抗體。多特異性抗體的制備方法，該方法包含通過[10]所述的方法進(jìn)行純化的步驟。多特異性抗體，該抗體通過[18]所述的方法制備。多特異性抗體，該多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，第1多肽含有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)，選自該重鏈可變區(qū)的按照Kabat編號的第10號、12號、23號、39號、43號和105號氨基酸殘基、或者該重鏈恒定區(qū)的按照EU編號的第137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基具有電荷，第1多肽與第2多肽的等電點互不相同。[20]所述的多特異性抗體，其中，第2多肽含有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)，選自該重鏈可變區(qū)的按照Kabat編號的第IO號、12號、23號、39號、43號和105號氨基酸殘基、或者該重鏈恒定區(qū)的按照EU編號的第137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基，具有與選自上述第1多肽中所含的重鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的具有電荷的氨基酸殘基相反的電荷、或者不具有電荷。[20]所述的多特異性抗體，其中，上述具有電荷的氨基酸殘基和與該氨基酸殘基具有相反電荷的氨基酸殘基的組合分別選自下述(a)或(b)的任意組中所含的氨基酸殘基(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D);(b)賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)多特異性抗體，該多特異性抗體中的第1多肽和第2多肽的等電點有差異，第l多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色語法進(jìn)行分析而形成分離的峰。[23]所述的多特異性抗體，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重鏈可變區(qū)。[24]所述的多特異性抗體，其中，上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽，上述第1多肽和上述第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體。[23]-[25]中任一項所述的多特異性抗體，其中，上述第l多肽和上述第2多肽含有重鏈恒定區(qū)。[26]所述的多特異性抗體，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重鏈恒定區(qū)是等電點互不相同的重鏈恒定區(qū)。[27]所述的多特異性抗體，其中，上述等電點不同的重鏈恒定區(qū)是IgGl和IgG4、或IgGl和IgG2。[23]所述的多特異性抗體，其中，上述多特異性抗體是雙特異性抗體。組合物，該組合物含有[23]-[29]中任一項所述的多特異性抗體和可藥用的載體。核酸，該核酸編碼構(gòu)成[23]-[29]中任一項所述的多特異性抗體的多肽。宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞具有[31]中所述的核酸。[33][23]-[29]中任一項所述的多特異性抗體的制備方法，該制備方法包含培養(yǎng)[32]所述的宿主細(xì)胞的步驟；從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽的步驟。[25]所述的多特異性抗體，其中，第l多肽的可變區(qū)含有以下(al)-(a)中任一項所述的氨基酸序列，第2多肽的可變區(qū)含有以下(bl)-(b3)中任一項所述的氨基酸序列，第3多肽的可變區(qū)含有以下(cl)或(c2)中所述的氨基酸序列(al)SEQIDN0.7(a2)SEQIDNO.8(a3)SEQIDNO.9(a4)SEQIDNO.10(a5)SEQIDNO.11(a6)SEQIDNO.12(a7)SEQIDNO:13(bl)SEQIDNO.14(b2)SEQIDNO.15(b3)SEQIDNO.16(cl)SEQIDNO.17(c2)SEQIDNO.18。[34]所述的多特異性抗體，其中，第1多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.ll的氨基酸序列，第2多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.16的氨基酸序列，第3多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.17的氨基酸序列。[34]所述的多特異性抗體，其中，第1多肽的可變區(qū)含有SEQIDN0.12所述的氨基酸序列，笫2多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.16的氨基酸序列，第3多肽的可變區(qū)含有SEQIDN0.18的氨基酸序列。-[36]中任一項所迷的多特異性抗體，其中，第1多肽和第2多肽含有人IgG4恒定區(qū)，笫3多肽含有人k恒定區(qū)。圖1是表示對于人源化雙特異性抗體(人源化A69(hA69a)/人源化B26(hB26-F123e4)/人源化BBA(hAL-F123j4))的凝固活性進(jìn)行評價的結(jié)果的圖。評價結(jié)果顯示了與嵌合雙特異性抗體具有同等以上的凝固活性。圖2是表示使用人源化A69-H鏈可變區(qū)(hA69a)和人源化BBA(hAL-F123j4)、以及人源化hB26-H鏈可變區(qū)(hB26-F123e4)和人源化BBA(hAL-F123j4)實施抗體建模的結(jié)果的圖。對于可以使表面電荷變化的氨基酸著重表示支鏈。編號采用Kabat數(shù)據(jù)庫的序列編號(KabatEA等人.1991.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.NIH)。圖3是表示使用未修飾的和使可變區(qū)修飾的人源化A69抗體均二聚體、以及未修飾的和使可變區(qū)修飾的人源化B26抗體均二聚體實施等電聚焦電泳分析的結(jié)果的照片。分析結(jié)果確認(rèn)通過修飾，等電點發(fā)生變化。圖4是表示使用使可變區(qū)修飾的人源化A69抗體均二聚體實施陽離子交換色譜分析的結(jié)果的圖。分析結(jié)果確認(rèn)與未修飾的抗體相比，峰發(fā)生移動。圖5是表示使用使可變區(qū)修飾的人源化B26抗體均二聚體實施陽離子交換色譜分析的結(jié)果的圖。分析結(jié)果確認(rèn)與未修飾的抗體相比，峰發(fā)生移動。圖6是表示使用使可變區(qū)修飾的人源化雙特異性抗體(H鏈恒定區(qū)利用knobs-into-holes技術(shù))評價凝固活性的結(jié)果的圖。評價結(jié)果顯示了與未修飾的抗體同等的凝固活性。圖7是表示使用使可變區(qū)(CDR)修飾的人源化A69抗體均二聚體實施等電聚焦電泳分析的結(jié)果的照片。分析結(jié)果確認(rèn)與未修飾的抗體比較，條帶，生移動。p,、，o、；東.，/、"價與作為抗原的因子IXa的結(jié)合活性的結(jié)果的圖。評價結(jié)果顯示，與未修飾的抗體保有同等的結(jié)合活性。圖9是表示使用人源化A69-H鏈一hA69a、人源化B26_H鏈一hB26-F123e4和人源化BBA-L鏈一hAL-F123j4作為未修飾抗體制備的未修飾的人源化雙特異性抗體實施陽離子交換色語分析的結(jié)果的圖。分析結(jié)果中，兩種均二聚體與雙特異性抗體不分離，以一個峰的形式洗脫。圖10是表示使用人源化A69-H鏈^f'務(wù)飾體一hA69-PF、和人源化B26-H鏈的修飾體一hA26-PF、和人源化BBA-L鏈一hAL-s8制備的人源化雙特異性PF抗體實施陽離子交換色譜分析的結(jié)果的圖。分析結(jié)果中，兩種均二聚體與雙特異性抗體分別分離，依次按照hA69-PF均二聚體、人源化雙特異性PF抗體、hB26-PF均二聚體的順序、以三個峰的形式洗脫。圖11是表示使用純化的人源化A69抗體-PF均二聚體和人源化B26-PF抗體均二聚體、人源化雙特異性PF抗體實施等電聚焦電泳分析的結(jié)果的照片。分析結(jié)果確認(rèn)可純化目標(biāo)雙特異性抗體。圖12是表示使用純化的人源化雙特異性PF抗體(H鏈恒定區(qū)為野生型)評價凝固活性的結(jié)果的圖。評價結(jié)果顯示了與在H鏈恒定區(qū)利用konds-into-holes技術(shù)得到的雙特異性抗體(KiH)同等的凝固活性。圖13表示使用制備中常用的柱、從含有人源化A69抗體均二聚體和人源化B26抗體均二聚體、人源化雙特異性抗體三種抗體的培養(yǎng)上清中純化雙特異性抗體時的色語圖。鏈恒定區(qū)為野生型)評價凝固活性的結(jié)果的圖。評價;吉果顯示了與人源化雙特異性PF抗體同等的凝固活性。圖15是表示使用未修飾、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗體實施等電聚焦電泳分析的結(jié)果的照片。分析結(jié)果中確認(rèn)通過修飾使等電點發(fā)生了變化。A表示未修飾人源化PM-1抗體、B表示IgG2化人源化PM-1抗體，C表示IgG4化人源化PM-1抗體。圖16是表示^f吏用未修飾、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗體的各個共表達(dá)抗體實施等電聚焦電泳分析的結(jié)果的照片。分析結(jié)果顯示，各亞類抗體和亞類雜合抗體可通過pl差分離。A表示未修飾人源化PM-1抗體/IgG2化人源化PM-1抗體共表達(dá)抗體，B表示未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-1抗體共表達(dá)抗體，C表示人源化PM-1抗體純化品(批量)。圖17是表示使用單獨表達(dá)的未修飾、IgG2化、IgG4化人源化PM-l抗體實施陽離子交換色譜分析的結(jié)果的圖。分析結(jié)果確認(rèn)與未修飾的抗體相比，峰發(fā)生移動。圖18是表示實施未修飾、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗體的各個共表達(dá)抗體的陽離子交換色譜分析的結(jié)果的圖。分析結(jié)果中，在未修飾人源化PM-1抗體/IgG2化人源化PM-1抗體的組合、以及未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-1抗體的組合中，主要可觀察到各亞類的均二聚體、雜合二聚體的三個主峰。A表示未修飾人源化PM-1抗體/IgG2化人源化PM-1抗體共表達(dá)抗體，B表示未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-1抗體共表達(dá)抗體。圖19是表示通過陽離子交換色譜，從共表達(dá)未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-l抗體的抗體中純化均二聚體、雜合二聚體的結(jié)果的圖。結(jié)杲，依次以三個峰的形式洗脫了IgG4化人源化PM-l抗體均二聚體、未修飾人源化PM-l/IgG4化人源化PM-l雜合抗體、未修飾人源化PM-1抗體均二聚體，因此可將它們分離。箭頭表示大致的組分范圍。圖20是表示使用通過陽離子交換色譜純化的未修飾人源化PM-1抗體均二聚體、未修飾人源化PM-l/IgG4化人源化PM-l雜合抗體、IgG4化人源化PM-1抗體均二聚體進(jìn)行二次色譜的結(jié)果的圖。結(jié)果確認(rèn)可以純化目標(biāo)亞類雜合抗體。圖21是表示使用通過陽離子交換色譜純化的未修飾人源化PM-1抗體均二聚體、未修飾/IgG4化人源化PM-1雜合抗體、IgG4化人源化PM-1抗體均二聚體實施等電聚焦電泳分析的結(jié)果的照片。分析結(jié)果確認(rèn)可以純化目標(biāo)亞類雜合抗體。A表示未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-1抗體共表達(dá)抗體，B表示未修飾人源化PM-1抗體分離組分，C表示未修飾人源化PM-l/IgG4化人源化PM-l雜合抗體分離組分，D表示IgG4化人源化PM-1抗體分離組分。圖22是使用通過陽離子交換色譜純化的未修飾人源化PM-1抗體均二聚體、未修飾人源化PM-l/IgG4化人源化PM-l雜合抗體、IgG4化人源化PM-1抗體均二聚體評價人IL-6中和活性的結(jié)果的圖。評價結(jié)果顯示了任何抗體均與人源化PM-1純化抗體同等的中和活性。A和B表示表達(dá)人gpl30的BaF3細(xì)胞抹，C和D表示共表達(dá)人gpD0/人IL-6受體的BaF3細(xì)胞抹。黑色圓圈(參)表示人源化PM-1抗體純化品(批量)，白色方框(口)表示未修飾人源化PM-1抗體，白色三角(A)表示IgG4化人源化PM-1抗體，x表示未修飾人源化PM-l/IgG4化人源化PM-1雜合抗體。具體實施例方式首先，本發(fā)明提供用于制備多特異性抗體的抗體修飾方法。本發(fā)明的制備方法的優(yōu)選方案是包含修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中一方，使第1多肽與第2多肽的等電點產(chǎn)生差異的方法。即，可以通過改變第1多肽和第2多肽的氨基酸殘基的電荷，向多肽中導(dǎo)入等電點(pl)的差異，利用該等電點的差異制備多特異性抗體。具體來說是包含以下的(a)-(c)的步驟的制備方法。(a)修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中一方，使第1多肽和笫2多肽的等電點產(chǎn)生差異；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，4吏其表達(dá)該核酸；(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多特異性抗體。本發(fā)明中的多肽通常是指具有10個氨基酸左右以上的長度的多肽以及蛋白質(zhì)。通常是來自生物的多肽，但沒有特別限定，例如也可以是含有人工設(shè)計的序列的多肽。還可以是天然多肽、或合成多肽、重組多肽等任意形式。并且，上述多肽的片段也包含在本發(fā)明的多肽中。本發(fā)明中，"多肽的等電點產(chǎn)生差異"是指在兩種以上的多肽中，通過進(jìn)行表面氨基酸電荷的改變，使它們等電點互相不相等。等電點的差異例如可通過使用等電聚焦電泳等方法觀察。本發(fā)明中，優(yōu)選不改變該多肽的結(jié)構(gòu)或功能(活性)地控制等電點。即，本發(fā)明提供多特異性抗體的制備方法，該多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，所述多特異性抗體的制備方法包含以下步驟(a)修飾編碼笫1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中一方，使第1多肽與第2多肽的等電點的差為0.5以上，優(yōu)選0.7或以上，進(jìn)一步優(yōu)選0.9或以上；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其表達(dá)該核酸；(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多特異性抗體。本發(fā)明還提供用于純化多特異性抗體的抗體修飾方法。本發(fā)明的純化方法的優(yōu)選方案是包含修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中一方進(jìn)行，使第1多肽和第2多肽的等電點產(chǎn)生差異的方法。即，通過改變笫1多肽和第2多肽的氨基酸殘基的電荷，向多肽中導(dǎo)入等電點(pl)的差異，可利用該等電點的差異純化多特異性抗體。具體來說是含有以下的(a)-(c)的步驟的純化方法。(a)修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中一方，使第1多肽和第2多肽的等電點產(chǎn)生差異；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其表達(dá)該核酸；(c)通過標(biāo)準(zhǔn)的色譜法，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中純化該多特異性抗體。包含通過上述純化方法進(jìn)行純化的步驟的多特異性抗體的制備方法也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明的核酸通常是被克隆(插入)到適當(dāng)?shù)妮d體中，導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。該載體只要可穩(wěn)定保有插入的核酸即可，沒有特別限定，例如，宿主如杲4吏用大腸桿菌則克隆用的載體優(yōu)選pBluescript載體(Stratagene制備)等，還可利用市場銷售的各種載體。為了生產(chǎn)本發(fā)明的多特異性抗體(多肽)，使用載體時表達(dá)載體特別有效。表達(dá)載體只要是在試管內(nèi)、大腸桿菌內(nèi)、培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)、生物個體內(nèi)表達(dá)多肽的載體即可，沒有特別限定，例如，如果在試管內(nèi)表達(dá)則優(yōu)選pBEST載體(:/口乂方、制備)，如果在大腸桿菌中表達(dá)則優(yōu)選pEP載體(Invitrogen制備)，如果在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)則優(yōu)選pME18S-SL3載體(GenBank登記號No.AB009864),如果在生物個體中表達(dá)則優(yōu)選pME18S載體(MolCellBiol.8:466-472(1988))等。本發(fā)明的DNA向載體中的插入可通過常規(guī)方法，例如可通過使用卩艮制酶+刀^f立點的連接酶反應(yīng)進(jìn)4亍(CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit.Ausubel等人.(1987)Publish.JohnWiley&Sons.Section11.4-11.11)。上述宿主細(xì)胞沒有特別限定，可以根據(jù)目的使用各種宿主細(xì)胞。用于表達(dá)多肽的細(xì)胞例如有細(xì)菌細(xì)胞(例如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、枯草桿菌)、真菌細(xì)胞(例如酵母、曲霉)、昆蟲細(xì)胞(例如黑腹果蠅S2、夜蛾SF9)、動物細(xì)胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤細(xì)胞)和植物細(xì)胞。載體對宿主細(xì)胞的導(dǎo)入例如可通過磷酸4丐沉淀法、電脈沖穿孑L法(CurrentprotocolsinMolecularBiologyeditAusubel等人.(1987)Publish.JohnWiley&Sons.Section9.1-9.9)、脂轉(zhuǎn)染法、顯微注射法等公知的方法進(jìn)行。為了使在宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中、周質(zhì)中、或者細(xì)胞外的環(huán)境中分泌，可以將適當(dāng)?shù)姆置谛盘栒系侥繕?biāo)多肽中。這些信號對于目標(biāo)多肽可以是內(nèi)源性，也可以是不同種的信號。上述制備方法中，對于多特異性抗體(多肽)的回收，當(dāng)本發(fā)明的多肽分泌到培養(yǎng)基中時則回收培養(yǎng)基。本發(fā)明的多肽在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時，首先溶解該細(xì)胞，然后回收多肽。從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的多肽并純化時，可以采用包含磷酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水性相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜等公知的方法。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多特異性抗體以及可藥用的載體的組合物(藥物)。本發(fā)明中，藥物組合物通常是指用于疾病的治療或預(yù)防、或者檢查、診斷的藥物。本發(fā)明的藥物組合物可以按照本領(lǐng)域所公知的方法制成制劑。例如，可以以與水或除此之外的可藥用的液體形成的無菌性溶液或混懸劑的注射劑形式非口服使用。例如，可以與可藥用的載體或介質(zhì)、具體來說滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味劑、賦形劑、載體、防腐劑、粘結(jié)劑等適當(dāng)組合，以通常認(rèn)可的制藥實施所要求的單元用量形式混合，制成制劑。這些制劑中的有效成分量設(shè)定為可獲得所指示的范圍的適當(dāng)?shù)娜萘?。用于注射的滅菌組合物可使用如注射用蒸餾水的載體，按照通常的制劑實施進(jìn)行處方。注射用的水溶液例如有含有生理鹽水、葡萄糖或含有其它輔助試劑(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉)的等滲液。也可以結(jié)合使用適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦├绱?乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性表面活性劑(聚山梨醇80(TM)、HCO-50等)。油性液體有芝麻油、大豆油，溶解助劑可以結(jié)合使用苯甲酸節(jié)酯和/或千醇。還可以配合緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液)、止痛劑(例如鹽酸普魯卡因)、穩(wěn)定劑(例如千醇和苯酚)、抗氧化劑。制備的注射液通常填充在適當(dāng)?shù)陌碴称恐小１景l(fā)明的藥物組合物優(yōu)選非口服給予。例如可以制成注射劑型、經(jīng)鼻給予劑型、經(jīng)肺給予劑型、透皮給予型的組合物。例如通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等可以全身或局部給予。給予方法可根據(jù)患者的年齡、癥狀適當(dāng)選擇。含有抗體或編碼抗體的多核苦酸的藥物組合物的給予量例如可設(shè)定為每次按照1公斤體重為0.0001mg-1000mg的范圍?；蛘呃缑课换颊呖梢允?.001-100000mg的給予量，本發(fā)明并不限于這些數(shù)值。給予量和給予方法根據(jù)患者的體重、年齡、癥狀等變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員可考慮這些條件適當(dāng)設(shè)定給予量和給予方法。還可以根據(jù)需要將本發(fā)明的多特異性抗體與其它藥物成分組合，制成制劑。本發(fā)明還提供編碼構(gòu)成本發(fā)明的多特異性抗體的多肽的核酸。并且，擔(dān)載有該核酸的載體也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明進(jìn)一步提供具有上述核酸的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞沒有特別限定，例如有大腸桿菌或各種動物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞例如可以以用于本發(fā)明的抗體或多肽的制備或表達(dá)的生產(chǎn)體系的形式使用。用于制備多肽的生產(chǎn)體系中有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)體系。體外的生產(chǎn)體系有使用真核細(xì)胞的生產(chǎn)體系和使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)體系?？勺鳛樗拗骷?xì)胞使用的真核細(xì)胞例如有動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞。動物細(xì)胞例如有哺乳類細(xì)胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108,945)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(babyhamsterkidney,幼鼠腎細(xì)胞)、HeLa、Vero等、兩棲類細(xì)胞例如非洲爪蟾卵細(xì)胞(Valle,等人.，Nature(1981)291:338-340)、以及昆蟲細(xì)胞例如Sf9、Sf21、Tn5。本發(fā)明的抗體的表達(dá)中，優(yōu)選采用CHO-DD44、CH0-DX11B、COS7細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞。動物細(xì)胞中，為了大量表達(dá)，特別優(yōu)選CHO細(xì)胞。載體對宿主細(xì)胞的導(dǎo)入例如可通過磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用陽離子性脂質(zhì)體DOTAP(BoehringerMannheim制備)的方法、電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染等方法進(jìn)行。植物細(xì)胞例如已知有來自煙草(Nicotianatabacum)的細(xì)胞和浮萍(Lemmaminor)作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系，通過將該細(xì)胞進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)可以生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。公知有使用酵母例如糖酵母(Saccharomyces)屬的細(xì)胞(啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomycespombe)等);和絲狀菌例如曲霉(Aspergillus)屬的細(xì)胞(黑曲霉(Aspergillusniger)等)的蛋白質(zhì)表達(dá)體系，可用作本發(fā)明的抗體生成的宿主。使用原核細(xì)胞時，有使用細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)體系。細(xì)菌細(xì)胞除上述大腸桿菌(E.coli)之外，還已知使用枯草桿菌的生產(chǎn)體系，也可用于本發(fā)明的抗體生成。使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)抗體時，可以進(jìn)行宿主細(xì)胞的培養(yǎng)，使多核苷酸表達(dá)，其中，所述宿主細(xì)胞用含有編碼本發(fā)明抗體的多核苦酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。例如以動物細(xì)胞為宿主時，培養(yǎng)液例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時，可以結(jié)合使用FBS、胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液，通過無血清培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)時的pH優(yōu)選約6-8。培養(yǎng)通常在約30-40。C下進(jìn)行約15-200小時，可以根據(jù)需要進(jìn)行培養(yǎng)基的更換、通氣、攪拌。體內(nèi)生產(chǎn)多肽的體系中例如有使用動物的生產(chǎn)系統(tǒng)或使用植物的生產(chǎn)系統(tǒng)。向這些動物或植物中導(dǎo)入目標(biāo)多核苦酸，在動物或植物的體內(nèi)生成多肽并回收。本發(fā)明的"宿主"包含這些動物、植物。使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲的生產(chǎn)體系。哺乳類動物可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(VickiGlaser，SPECTRUMBiotechnologyApplications(1993))。使用哺乳類動物時，可以使用轉(zhuǎn)基因動物。例如將編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸和編碼如山羊p酪蛋白等乳汁中特有生產(chǎn)的多肽的基因以融合基因的形式制備。接著，將含有該融合基因的多核苷酸片段注入到山羊的胚胎中，將該胚胎移植到雌山羊體內(nèi)。從接受了胚胎的山羊所生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因山羊、或其子孫所生產(chǎn)的乳汁中可以獲得目標(biāo)抗體。為了使含有由轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的抗體的乳汁量增加，可以對轉(zhuǎn)基因山羊適當(dāng)給予激素(Ebert等人.，Bio/Technology(l"4)12:699-702)。生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的昆蟲例如可以使用蠶。使用蠶時，將插入了編碼目標(biāo)抗體的多核苷酸的桿狀病毒感染蠶，由此可從蠶的體液中獲得目標(biāo)抗體(Susumu等人.，Nature(1985)315:592-594)。將植物用于本發(fā)明的抗體生產(chǎn)時，例如可以使用煙草。使用煙草時，將編碼目標(biāo)抗體的多核普酸插入到植物表達(dá)用的載體例如pMON530中，將該載體導(dǎo)入到根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)等的細(xì)菌中。將該細(xì)菌感染煙草、例如煙草(Nicotianatabacum),可由該煙葉獲得所需抗體(Ma等人.，Eur.J.Immunol.(1994)24:131-138)。將同樣的細(xì)菌感染浮萍，進(jìn)行克隆后可由浮萍的細(xì)胞中獲得所需抗體(CoxK.M.等人.，Nat.Biotechnol.2006Dec;24(12):1591-1597)。上述得到的抗體可從宿主細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(培養(yǎng)基、乳汁等)中分離，純化為實質(zhì)上純粹、均勻的抗體。抗體的分離、純化可以使用通常在多肽的純化中使用的分離、純化方法，并沒有任何限定。例如可以將色譜柱、過濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳法、透析、重結(jié)晶等適當(dāng)選擇、組合，分離并純化抗體。色鐠例如有親和色語、離子交換色譜、疏水性色語、凝膠過濾、反相色i普、吸附色i普等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshak等人.，(1996)ColdSpringHarborLaboratoryPress)。這些色i普可以使用液相色譜例如HPLC、FPLC等液相色語進(jìn)行。親和色鐠中使用的柱有蛋白A柱、蛋白G柱。例如使用蛋白A的柱有HyperD、POROS、SepharoseF.F.OPharmacia)等。還可以根據(jù)需要，在抗體的純化前或純化后使適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)改性酶作用，由此可以施加任意的改性，或可部分地除去肽。蛋白質(zhì)改性酶例如可使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。如上所述，包含培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞、由該培養(yǎng)物中回收多肽的步驟的本發(fā)明的多特異性抗體的制備方法也是本發(fā)明的優(yōu)選方案之一。本發(fā)明的"多特異性抗體"是可以與至少兩種不同的抗原特異性結(jié)合的抗體。通過本發(fā)明的制備方法或純化方法得到的優(yōu)選的多特異性抗體有可與兩種抗原特異性結(jié)合的雙特異性抗體(BsAb)(也可稱為兩種類特異性抗體)。本發(fā)明中，"不同的抗原，，不必是抗原本身不同，抗原決定基不同的情況等也包含在本發(fā)明的"不同的抗原"中。因此，例如單一分子內(nèi)的不同的抗原決定基團(tuán)包含在本發(fā)明的不同的抗原中，分別識別上述單一分子內(nèi)的不同的抗原決定基的兩種抗體在本發(fā)明中可作為識別不同的抗原的抗體使用。的抗體或抗體片段的分子。本發(fā)明的上述方法中，"核酸的修飾，，包含修飾核酸，以得到通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色譜法進(jìn)行分析，將第1多肽和第2多肽分離形成的峰。本發(fā)明的方法中，"修飾核酸"是指修飾核酸，與通過本發(fā)明的"修飾"而導(dǎo)入的氨基酸殘基對應(yīng)。更具體地說，對于編碼原有的(修飾前)氨基酸殘基的核酸，修飾為編碼通過修飾導(dǎo)入的氨基酸殘基的核酸。通常是指對于原有的核酸進(jìn)行至少一個堿基的插入、缺失或置換等基因操作或突變處理，形成編碼目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子。即，編碼原有氨基酸殘基的密碼子被編碼通過修飾導(dǎo)入的氨基酸殘基的密碼子置換。上述核酸的修飾可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)、例如位點專一誘變法、PCR突變導(dǎo)入法等適當(dāng)實施。本發(fā)明中的修飾位置例如有(l)位于多肽的表面的氨基酸殘基、(2)位于可變區(qū)、優(yōu)選FR區(qū)的氨基酸殘基、(3)位于恒定區(qū)的氨基酸殘基。"位于多肽的表面的氨基酸"是其支鏈可以與溶劑分子(通常為水分子)相接觸的氨基酸，不一定是整個支鏈都與溶劑分子接觸，支鏈的一部分與溶劑分子接觸時，該氨基酸是位于表面的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用市售的軟件進(jìn)行的同源性建模等，可以制備多肽或抗體的同源模型，由此可以選擇使適當(dāng)?shù)臍埢挥诒砻娴陌被?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過由同源性建模等制備的同源性模型，適當(dāng)選擇抗體可變區(qū)中的表面氨基酸，例如在H鏈FR區(qū)，可例舉H1、H3、H5、H8、HIO、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、H26、H39、H42、H43、H46、H68、H71、H72、H73、H75、H76、H81、H82b、H83、H85、H86、H105、H108、HllO、H112為表面氨基酸，但本發(fā)明并不限于此。H鏈的CDR區(qū)同樣可通過同源性模型選擇表面氨基酸，例如H97幾乎整個抗體暴露在表面。在L鏈的FR區(qū)可以例舉L1、L3、L7、L8、L9、Ul、1J2、IJ6、U7、U8、L20、L22、L38、U9、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L57、L60、L63、L65、L66、L68、L69、L70、L74、U76、L77、L79、L80、L81、L85、UOO、L103、L105、L106、U07、L108作為表面氨基酸，但本發(fā)明并不限于此。L鏈的CDR區(qū)同樣可通過同源模型選擇表面氨基酸。本發(fā)明中，位于可變區(qū)的氨基酸殘基包含位于重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸殘基，優(yōu)選位于支架區(qū)(FR)的氨基酸殘基。本發(fā)明中，在CDR以外的FR區(qū)，暴露在表面的氨基酸例如有HIO、H12、H23、H39、H43、H105,但并不限于此。本發(fā)明中，修飾核酸得到的多肽優(yōu)選為第1多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體。例如如下述實施例所述，第1多肽的均多聚體有人源化A69-H鏈與人源化BBA-L鏈的均二聚體，第2多肽的均多聚體有人源化B26-H鏈與人源化BBA-L鏈的均二聚體，第l多肽和第2多肽的雜合多聚體有人源化A69-H鏈以及人源化B26-H鏈與人源化BBA-L鏈的雜合二聚體，但并不限于此。本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)的色傳法有陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、疏水色譜、羥基磷灰石色譜、疏水電荷相互作用色譜、色譜聚焦等。本發(fā)明的上述方法中，第1多肽和第2多肽優(yōu)選含有重鏈可變區(qū)(VH)。該可變區(qū)可含有例如互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、支架區(qū)(FR)。本發(fā)明的方法中，供給修飾的氨基酸殘基的數(shù)目沒有特別限定，例如，使抗體的可變區(qū)修飾時，為了不使與抗原的結(jié)合活性降低、為了不提高抗原性，優(yōu)選使實現(xiàn)目標(biāo)多肽分離所必須的最低限度的氨基酸殘基修飾。為了不提高抗原性，還優(yōu)選修飾后氨基酸序列為人序列，但本發(fā)明并不限于此。并且，還可以將突變導(dǎo)入到可使修飾后的FR(FR1、FR2、FR3、FR4)作為FR分別為人序列、使等電點發(fā)生變化而導(dǎo)入的修飾以外的位置。上述將各FR置換為人序列的方法在非專利文獻(xiàn)(OnoK.等人.,Mol.Immunol.1999Apr;36(6):387-395)中有報道。為了使各FR的等電點變化，也可以修飾為等電點變化之外的人的FR(例如將FR3與等電點低的以外的人FR交換)。上述人源化方法在非專利文獻(xiàn)(Dall，AcquaWF.,Methods.2005May;36(1):43-60)中有報道。如果較少的表面電荷改變無法實現(xiàn)目標(biāo)多肽的分離，則通過反復(fù)進(jìn)行表面電荷的改變和多肽的分離的評價，可以獲得所需多特異性抗體。本發(fā)明的上述方法中，多特異性抗體優(yōu)選含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽。優(yōu)選第1多肽和第2多肽分別與第3多肽形成多聚體。本發(fā)明的上述方法中，優(yōu)選第1多肽和笫2多肽含有重鏈恒定區(qū)。更優(yōu)選重鏈恒定區(qū)中，第1多肽與第2多肽產(chǎn)生pl差。上述重鏈恒定區(qū)有具有pl差的抗體的重鏈恒定區(qū)，可以使用原來具有pl差的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈恒定區(qū)，向第l和第2多肽導(dǎo)入pl差；還可以通過只將引起第l和第2多肽的重鏈恒定區(qū)中這些亞類間的等電點差異的氨基酸、或者對這些等電點沒有影響的相鄰氨基酸同時進(jìn)行修飾，制備非野生型人恒定區(qū)，向兩個恒定區(qū)導(dǎo)入pl差。根據(jù)H鏈恒定區(qū)的EU編號，用于向恒定區(qū)導(dǎo)入pl差的修飾位置例如有H鏈的第137號、第196號、第203號、第214號、第217號、第233號、第268號、第274號、第276號、第297號、第355號、第392號、第419號、第435號。通過除去重鏈恒定區(qū)的糖鏈可以產(chǎn)生pl差。因此糖鏈?zhǔn)┘硬课坏牡?97號也作為用于導(dǎo)入pl鏈的修飾位置。本發(fā)明中，對于上述第1多肽和第2多肽含有重鏈恒定區(qū)的方法，也包含上述第1多肽和第2多肽含有重鏈可變區(qū)的方法，和/或與將上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽、上述第1多肽和上述第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體的方法組合而成的方法。通過上述方法制備的多特異性抗體也包含在本發(fā)明中。由本發(fā)明提供的多特異性抗體中，第1多肽含有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)時，為了實現(xiàn)上述的"等電點產(chǎn)生差異"，例如可以是使該重鏈可變區(qū)的Kabat編號的10號、12號、23號、39號、43號和105號的氨基酸殘基，或者該重鏈恒定區(qū)的EU編號的137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基具有電荷。上述編號中所示的第1多肽的氨基酸殘基中，只要第1多肽和第2多肽的等電點有差異，具有該電荷的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基可以是與具有該電荷的氨基酸殘基為同種電荷，也可以不具有電荷，還可以具有相反的電荷。本發(fā)明的上述多特異性抗體優(yōu)選的特征在于第2多肽具有與第1多肽的具有電荷的氨基酸殘基為相反的電荷，或者不具有電荷。具體有以下的多特異性抗體第2多肽含有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)，選自該重鏈可變區(qū)的Kabat編號的IO號、12號、23號、39號、43號和105號的氨基酸殘基、或該重鏈恒定區(qū)的EU編號的137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基與上述第1多肽中所含的重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)中的具有電荷的氨基酸殘基具有相反的電荷，或不具有電荷。上述編號所示的第2多肽的氨基酸殘基中，只要第1多肽和第2多肽有等電點差異，則具有該電荷的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基可以與具有該電荷的氨基酸殘基為同種電荷，也可以不具有電荷，或具有相反的電荷。為了使等電點降低，例如優(yōu)選137號采用IgG2或IgG4序列、196號采用IgGl或IgG2或IgG4的序列、203號采用IgG2或IgG4的序列、214號采用IgG2的序列、217號采用IgGl或IgG3或IgG4的序列、233號采用IgGl或IgG3或IgG4的序列、268號采用IgG4的序列、274號采用IgG2或IgG3或IgG4的序列、276號采用IgGl或IgG2或IgG4的序列、355號采用IgG4的序列、392號采用IgG3的序列、419號采用IgG4的序列、435號采用IgGl或IgG2或IgG4的序列。為了使等電點升高，例如優(yōu)選137號采用IgGl或IgG3的序列、196號采用IgG3的序列、203號釆用IgGl或IgG3的序列、214號采用IgGl或IgG3或IgG4的序列、217號采用IgG2的序列、233號采用IgG2的序列、268號采用IgGl或IgG2或IgG3的序列、274號采用IgGl的序列、276號采用IgG3的序列、355號采用IgGl或IgG2或IgG3的序列、392號采用IgGl或IgG2或IgG4的序列、419號采用IgGl或IgG2或IgG3的序列、435號采用IgG3的序列。這些序列的應(yīng)用只要可以使兩個H鏈產(chǎn)生足夠的等電點差異即可，未必采用所有的序列。氨基酸中已知有帶有電荷的氨基酸。通常帶有正電荷的氨基酸(正電荷氨基酸)有賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)。帶有負(fù)電荷的氨基酸(負(fù)電荷氨基酸)已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。上述"具有電荷的氨基酸殘基"優(yōu)選從以下的(a)或(b)的任意一組中所含的氨基酸殘基中適當(dāng)選擇，沒有特別限定。(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)(b)賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)上述抗體中，"具有同種電荷"是指例如重鏈可變區(qū)的上述Kabat編號的氨基酸殘基、或重鏈恒定區(qū)的上述EU編號的氨基酸殘基的任意一種具有上迷(a)或(b)中任意一組所含的氨基酸殘基。"具有相反的電荷"是指例如具有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)的第2多肽中，上述Kabat編號或上述EU編號的氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基是第1多肽中所含的重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)的對應(yīng)位置的氨基酸殘基，具有上迷(a)或(b)中任一組所含的氨基酸殘基時，其余的氨基酸殘基具有不同組中所含的氨基酸殘基。即，本發(fā)明提供多特異性抗體，其中，上述具有同種電荷的氨基酸殘基選自上述(a)或(b)中任意一組所含的氨基酸殘基。原有的(修飾前的)氨基酸殘基已經(jīng)具有電荷時，修飾為不具有電荷的氨基酸殘基，這也是本發(fā)明的優(yōu)選方案之一。本發(fā)明中，優(yōu)選氨基酸殘基進(jìn)行修飾，以使第1多肽和第2多肽的等電點(pl)產(chǎn)生差異，通過修飾導(dǎo)入的氨基酸殘基為多個時，這些氨基酸殘基中可以以少數(shù)含有不具有電荷的氨基酸殘基。本發(fā)明還提供多特異性抗體，其中，第1多肽的可變區(qū)含有下述(al)-(a7)中任一項所述的氨基酸序列，第2多肽的可變區(qū)含有以下(bl)-(b3)中任一項所述的氨基酸序列，第3多肽的可變區(qū)含有以下(cl)或(c2)所述的氨基酸序列。(al)SEQIDN0.7(a2)SEQIDNO.8(a3)SEQIDNO.9(a4)SEQIDNO.10(a5)SEQIDNO.11(a6)SEQIDNO.12(a7)SEQIDNO.13(bl)SEQIDNO.14(b2)SEQIDNO.15(b3)SEQIDNO.16(cl)SEQIDNO,17(c2)SEQIDNO.18上述氨基酸序列是為了更具體地例舉本發(fā)明中可用于修飾的氨基酸，并不限定為可變區(qū)為這些氨基酸的情形。上述多特異性抗體的優(yōu)選方案之一有以下多特異性抗體第l多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.11的氨基酸序列、第2多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.16的氨基酸序列、第3多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.17的氨基酸序列。另外一個優(yōu)選的方案之一例如有以下多特異性抗體第1多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.12的氨基酸序列、第2多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.16的氨基酸序列、第3多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.18的氨基酸序列。上述多特異性抗體的又一優(yōu)選方案之一有以下多特異性抗體第1多肽和第2多肽含有人IgG4恒定區(qū)、第3多肽含有人K恒定區(qū)。本發(fā)明中，"抗體"的術(shù)語以最廣泛意義使用，只要顯示所需生物學(xué)活性即可，包含單克隆抗體、多克隆抗體、抗體突變體(嵌合抗體、人源化抗體、低分子化抗體(也包含抗體片段)、多特異性抗體等)。本發(fā)明中，在獲得這些抗體時，優(yōu)選采用本發(fā)明的抗體修飾方法。如上所述，本發(fā)明中的"抗體"包含對使氨基酸殘基的電荷改變的抗體進(jìn)一步通過氨基酸的置換、缺失、附加和/或插入等使氨基酸序列發(fā)生改變的抗體。還包含對于通過氨基酸的置換、缺失、附加和/或插入，或者嵌合化或人源化等使氨基酸序列發(fā)生了改變的抗體進(jìn)一步發(fā)生氨基酸殘基的電荷改變的抗體。即，可以與使小鼠抗體人源化的步驟同時修飾，或者將人源化抗體進(jìn)一步修飾。氨基酸的置換、缺失、附加和/或插入，以及人源化、嵌合化等氨基酸序列的改變可按照本領(lǐng)域所公知的方法進(jìn)行。同樣，以重組抗體的形式制備本發(fā)明的抗體時所利用的抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)也可通過氨基酸的置換、缺失、附加和/或插入，或嵌合化或人源化等來改變其氨基酸序列。本發(fā)明的抗體可以是小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等來自任何動物的抗體。并且，例如可以是將嵌合抗體、其中的人源化抗體等氨基酸序列進(jìn)行置換的修飾抗體。還可以是結(jié)合有各種分子的抗體修飾物、抗體片段、低分子抗體等任何抗體。"嵌合抗體，，是指將來自不同的動物的序列組合制備的抗體。例如，可以是含有小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變(V)區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定(C)區(qū)的抗體。嵌合抗體的制備是公知的，例如可以將編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，將其整合到表達(dá)載體中，導(dǎo)入宿主并生成，由此可獲得嵌合抗體。"人源化抗體，，也稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體，是將來自人以外的哺乳動物的抗體、例如小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的CDR所得。鑒定CDR的方法是公知的(Kabat等人.，S叫uenceofProteinsofImmunologicalInterest(1987),NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.;Chothia等人.，Nature(1989)342:877)。另外，其常規(guī)的基因重組方法也是公知的(歐洲專利申請公開編號EP125023號公報、WO96/02576號公報)。因此，通過公知的方法，可以確定例如小鼠抗體的CDR,獲得編碼該CDR與人抗體的支架區(qū)(FR)連接而得的抗體，通過使用通常的表達(dá)載體所得的系統(tǒng)生產(chǎn)人源化抗體。上述DNA可以使用制備的在CDR和FR兩者的末端區(qū)具有重疊部分的多個寡核苷酸作為引物，通過PCR法合成(參照W098/13388號公報所述方法)。經(jīng)由CDR連接而成的人抗體的FR可以進(jìn)行選擇，使CDR形成良好的抗原結(jié)合部分。還可根據(jù)需要使抗體可變區(qū)中的FR的氨基酸修飾，以使重構(gòu)人抗體的CDR形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato,K.等人.,CancerRes.(1993)53:851-856)?？尚揎椀腇R中的氨基酸殘基包含與抗原直接、或以非共價鍵結(jié)合的部分(Amit等人.，Science(1986)233:747-53)、對于CDR的結(jié)構(gòu)有影響或作用的部分(Chothia等人.，J.Mol.Biol.(1987)196:901-17)以及與VH-VL相互作用相關(guān)的部分(EP239400號專利公報)。本發(fā)明的抗體為嵌合抗體或人源化抗體時，這些抗體的C區(qū)優(yōu)選使用來自人抗體的區(qū)。例如，H鏈可以使用Oyl、Cy2、Qy3、C"、L鏈可以使用Ck、CX。為了改善抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性，可以根據(jù)需要修抗體的可變區(qū)和來自人抗體;恒定區(qū)。人源化抗體優(yōu)選含有來自人以外的哺乳動物的抗體的CDR、以及來自人抗體的FR和C區(qū)。來自人抗體的恒定區(qū)是每種IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等同型中具有特有的氨基酸序列。本發(fā)明的人源化抗體中使用的恒定區(qū)可以是屬于任意同型的抗體的恒定區(qū)。優(yōu)選使用人IgG的恒定區(qū)，但并不限于此。另外，在人源化抗體中所利用的來自人抗體的FR也沒有特別限定，可以是屬于任意同型的抗體。本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)在可顯示原有抗體的結(jié)合特異性的范圍內(nèi)，可以通過缺失、置換、插入和/或附加等進(jìn)行修飾。利用來自人的序列得到的嵌合抗體和人源化抗體中，在人體內(nèi)的抗原性降低，因此可根據(jù)治療目的等給予人。低分子化抗體從體內(nèi)動力學(xué)的性質(zhì)角度考慮，以及從可使用大腸桿菌、植物細(xì)胞等以低成本制備考慮，可用作抗體?？贵w片段是低分子化抗體的一種。低分子化抗體包含將抗體片段作為其結(jié)構(gòu)的一部分的抗體。本發(fā)明中的低分子化抗體只要具有與抗原的結(jié)合能力即可，對其結(jié)構(gòu)、制備方法等沒有特別限定。低分子化抗體中也存在比全長抗體具有更高活性的抗體(Orita等人.，Blood(2005)105:562-566)。本說明書中，"抗體片段，，只要是全長抗體(例如全長IgG等)的一部分即可，沒有特別限定，優(yōu)選含有重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)。優(yōu)選的抗體片段的例子例如有Fab、F(ab')2、Fab'、Fv等?？贵w片段中的VH或VL的氨基酸序列可以通過置換、缺失、附加和/或插入進(jìn)行修飾。并且只要保持與抗原的結(jié)合能力即可，可以使VH和VL的一部分缺損。例如，上述抗體片段中的"Fv"是含有完全的抗原識別部位和結(jié)合部位的最小抗體片段。"Fv"是一個VH和一個VL通過非共價鍵強(qiáng)力結(jié)合的二聚體(VH-VL二聚體)。根據(jù)各可變區(qū)的三個互補(bǔ)鏈決定區(qū)(CDR),可以在VH-VL二聚體的表面形成抗原結(jié)合部位。六個CDR使抗體具有抗原結(jié)合部位。但是，一個可變區(qū)(或者為只含有抗原特異性的三個CDR的Fv的一半)，其親和性比與全部結(jié)合部位j氐，但仍具有識別抗原并結(jié)合的能力。因此，上述比Fv小的分子也包含在本發(fā)明的抗體片段中?？贵w片段的可變區(qū)可以進(jìn)行嵌合化或人源化。低分子化抗體優(yōu)選含有VH和VL兩者。低分子化抗體的例子有利用Fab、Fab'、F(ab')2和Fv等抗體片段、以及可利用抗體片段制備的scFv(信號鏈Fv)等(Huston等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85:5879-83;Pluckthun"ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies"Vol.113,ResenburgandMoore(eds.),SpringerVerlag,NewYork,pp.269-315,(1994》；diabodies(Holliger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:6444-8;EP404097;W093/11161;Johnson等人.，MethodinEnzymology(1991)203:88-98;Holliger等人.，ProteinEngineering(1996)9:299-305;Perisic等人.，Structure(1994)2:1217-26;John等人.，ProteinEngineering(1999)12(7):597-604;Atwell等人.，MoUmmunol.(1996)33:1301-12);sc(Fv)2(Hudson等人，JImmunol.Methods(1999)231:177-89;Orita等人.，Blood(2005)105:562-566);triabodies(JournalofImmunologicalMethods(1999)231:177-89);tandemdiabodies(CancerResearch(2000)60:4336-41)?？贵w片段可通過酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶蛋白酶等對抗體進(jìn)行處理獲得(參照Morimoto等人.，J.Biochem.Biophys.Methods(1992)24:107-17;Brennanetal.,Science(1985)229:81)。可以以該抗體片段的氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過基因重組制備。具有使抗體片段修飾的結(jié)構(gòu)的低分子化抗體可以利用由酶處理或基因重組得到的抗體片段進(jìn)行構(gòu)建?；蛘呖梢詷?gòu)建編碼低分子化抗體全體的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)載體中，然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)(例如參照Co等人.，J.Immunol.(1994)152:2968-76;Better和Horwitz，MethodsEnzymol.(1989)178:476-96;Pluckthun和Skerra,MethodsEnzymol.(1989)178:497-515;Lamoyi,MethodsEnzymol.(1986)121:652-63;Rousseaux等人.，MethodsEnzymol.(1986)121:663-9;Bird和Walker,TrendsBiotechnol.(1991)9:132-7)。上述"scFv"是將兩個可變區(qū)根據(jù)需要經(jīng)由接頭等結(jié)合而成的單鏈多肽。scFv中所含的兩個可變區(qū)通常是一個VH和一個VL,也可以是兩個VH或兩個VL。通常，scFv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間含有接頭，由此可以形成為了結(jié)合抗原而必須的VH和VL的成對的部分。通常，在同一分子內(nèi)，為了在VH和VL之間形成成對的部分，通常是將連接VH和VL的接頭制成10個氨基酸以上長度的肽接頭。只要不妨礙scFv的形成，本發(fā)明的scFv的接頭并不限于上述多肽接頭。scFv的總論可參考Pluckthun"ThePharmacologyofMonoclonalAntibody",Vol.113(RosenburgandMooreed.,SpringerVerlag,NY,pp.269-315(1994》。另外，"雙價小抗體(diabody，Db)"是指通過基因融合構(gòu)建的雙價的抗體片段(P.Holliger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993);EP404,097號；W093/11161號等)。雙價小抗體是由兩根多肽鏈構(gòu)成的二聚體，多肽鏈?zhǔn)窃趥€自、相同的鏈中，輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)經(jīng)由短的、例如5個殘基左右的接頭結(jié)合在互相不能結(jié)合的位置上。被編碼在同一多肽鏈上的VL和VH，由于它們之間的接頭短，因此無法形成單鏈V區(qū)片段，而形成二聚體，因此雙價小抗體具有兩個抗原結(jié)合部位。此時，如果同時表達(dá)將兩個不同的表位(a、b)所對應(yīng)的VL和Vh以VLa-VHb和VLb-VHa的組合、以5個殘基左右的接頭連接所得，則以雙特異性Db的形式分泌。雙價小抗體含有兩個分子的scFv，因此含四個可變區(qū)。結(jié)果具有兩個抗原結(jié)合部位。與未形成二聚體的scFv的情形不同，為了形成雙價小抗體，如果通常各scFv分子內(nèi)的連接VH和VL之間的接頭制成多肽接頭，則可以制成5個氨基酸左右。但是，形成雙價小抗體的scFv的接頭只要不妨礙scFv的表達(dá)、不妨礙雙價小抗體的形成即可，并不限于上述肽接頭。本發(fā)明中進(jìn)一步優(yōu)選雙特異性抗體作為多特異性抗體。上述"雙特異性抗體，，是指重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接成一條鏈的結(jié)構(gòu)的抗體(例如可以是sc(Fv)2)。還可以是重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)連接成scFv(或sc(Fv)2)、將其與Fc區(qū)(欠缺CH1結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū))結(jié)合而成的抗體樣分子(例如scFv-Fc)。含有scFv-Fc的多特異性抗體具有(scFv)2-Fc型的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由以下形成第1多肽為VHl-接頭-VLl-Fc、第2多肽為VH2-接頭-VL2-Fc。還可以是單結(jié)構(gòu)域抗體與Fc區(qū)結(jié)合而成的抗體樣分子(Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.2006，9(2),184-93)。本發(fā)明的方法中，編碼導(dǎo)入突變前的抗體(本說明書中可簡稱為"本發(fā)明的抗體")的H鏈或L鏈的基因可使用已知的序列，還可以按照本領(lǐng)域公知的方法獲得。例如可以從抗體文庫中獲得，還可以從生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤中克隆編碼抗體的基因來獲得。關(guān)于抗體文庫，已公知^f艮多抗體文庫，還公知抗體文庫的制備方法，因此，本領(lǐng)域人員可以獲得適當(dāng)?shù)目贵w文庫。例如對于抗體噬菌體文庫可以參照Clackson等人.，Nature1991,352:624-8;Marks等人.，J.Mol.Biol.1991,222:581-97;Waterhouses等人.，NucleicAcidsRes.1993,21:2265-6;Griffiths等人.，EMBOJ.1994,13:3245-60;Vaughan等人.，NatureBiotechnology1996,14:309-14;以及日本特表平20-504970號公報等文或核糖體展示法等公知的方法。并且還已知由使用人抗體文庫、通過淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，可以將人抗體的可變區(qū)制成單鏈抗體(scFv),通過噬菌體展示法在噬菌體的表面表達(dá)，選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。對所選擇的噬菌體的基因進(jìn)行分析，則可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果了解了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，則可以以該序列為基礎(chǔ)制備適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，獲得人抗體。這些方法是已知的，可以參考W092扁47、W092脂91、WO93/06213、W093/11236、W093/19172、WO95/01438、W095/15388。由雜交瘤獲得編碼抗體的基因的方法基本上可以使用公知技術(shù)，可如下獲得使用所需抗原或表達(dá)所需抗原的細(xì)胞作為致敏抗原，將其按照常規(guī)的免疫方法進(jìn)行免疫，將所得免疫細(xì)胞通過通常的細(xì)胞融合與公知的母細(xì)胞融合，通過通常的篩選法篩選單克隆的抗體生成細(xì)胞(雜交瘤)，使用反轉(zhuǎn)錄酶，從所得雜交瘤的mRNA中合成抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA,將其與編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接。更具體地說，用于獲得編碼上述H鏈和L鏈的抗體基因的致敏抗原完全抗原兩者，但并不限于該例舉。例如可以使用目標(biāo)蛋白質(zhì)的全長蛋白或部分肽等。除此之外還已知由多糖類、核酸、脂質(zhì)等構(gòu)成的物質(zhì)可以作為抗原，本發(fā)明的抗體的抗原沒有特別限定?？乖闹苽淇砂凑毡绢I(lǐng)域公知的方法進(jìn)行，例如可按照使用桿狀病毒的方法(例如WO卯MW"等)進(jìn)行。雜交瘤的制備例如可按照Milstein等人.(G.Kohler和C.Milstein,MethodsEnzymol.1981,73:3-46)的方法等進(jìn)行?？乖拿庖咴缘蜁r，可以與白蛋白等具有免疫原性的巨大分子結(jié)合，進(jìn)行免疫。還可根據(jù)需要使抗原與其它分子結(jié)合，制成可溶性抗原。使用受體等的跨膜分子作為抗原時，可以使用受體胞外區(qū)部分作為片段，或使用在細(xì)胞表面上表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞作為免疫原。抗體生成細(xì)胞可使用上述適當(dāng)?shù)闹旅艨乖庖邉游铽@得。或者將可生成抗體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外免疫，制成抗體生成細(xì)胞。纟皮免疫的動物可使用各種哺乳動物，通常使用嚙齒目、兔目、靈長目動物。可例舉小鼠、大鼠、倉鼠等嚙齒目。兔等兔目。食蟹猴、獼猴、狒狒、黑猩猩等的靈長目動物。除此之外還已知具有人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物，使用上述動物也可以獲得人抗體(參照WO96/34096;Mendez等人.，Nat.Genet.1997,15:146-56)。例如體外用所需抗原或表達(dá)所需抗原的細(xì)胞對人淋巴細(xì)胞致敏，將致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞例如U266融合，以此代替上述轉(zhuǎn)基因動物的使用，可以獲得與抗原具有結(jié)合活性的所需的人抗體(參照日本特公平1-59878號)。另外，具有人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物用所需抗原免疫，則可以獲得所需的人抗體(參照W093/1227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096和W096/33735)。動物的免疫例如可如下進(jìn)行用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水等將致敏抗原稀釋并懸浮，根據(jù)需要混合佐劑進(jìn)行乳化，然后注射到動物的腹腔內(nèi)或皮下。然后優(yōu)選每隔4-21天給予數(shù)次混合在氟氏不完全佐劑中的致敏抗原?？贵w生成的確認(rèn)可通過常用的方法測定動物血清中的目標(biāo)抗體效價來進(jìn)行。雜交瘤可以用常用的融合劑(例如聚乙二醇)，將從用所需抗原免疫了的動物或由淋巴細(xì)胞中得到的抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制備(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,1986,59-103)。還可根據(jù)需要培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，使其增殖，通過免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法測定由該雜交瘤生成的抗體的結(jié)合特異性。然后根據(jù)需要將生產(chǎn)測定了目標(biāo)特異性、親和性或活性的生成抗體的雜交瘤通過極限稀釋法等方法進(jìn)行亞克隆。接著，使用可與抗體特異性結(jié)合的探針(例如與編碼抗體恒定區(qū)的序列互補(bǔ)的寡核苷酸等)，從雜交瘤或抗體生成細(xì)胞(致敏淋巴細(xì)胞等)中克隆編碼被選擇的抗體的基因。還可以通過RT-PCR從mRNA中克隆。免疫球蛋白分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五個不同的類。并且這些類又分為幾種亞類(同型)(例如IgG-l、IgG-2、IgG-3和IgG-4;IgA-l和IgA-2等)。本發(fā)明中，在抗體的制備中使用的H鏈和L鏈可以來自屬于這些任意的類和亞類的抗體，沒有特別限定，特別優(yōu)選IgG。這里，可以通過基因工程的方法將使編碼H鏈和L鏈的基因修飾。例如對于小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉鼠抗體、綿羊抗體、駱駝抗體等抗體，為了降低與人的異種抗原性等，可以適當(dāng)制備人工修飾的基因重組型抗體、例如嵌合抗體、人源化抗體等。嵌合抗體是含有人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的H鏈、L鏈的可變區(qū)和人抗體的H鏈、L鏈的恒定區(qū)的抗體，可如下獲得將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其整合到表達(dá)載體中，導(dǎo)入宿主并生產(chǎn)。人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體，如下合成通過PCR法，由制備的末端部具有重疊部分的多個寡核苷酸合成設(shè)計成連接有人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的DNA序列由。將所得DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，接著整合到表達(dá)載體中，將其導(dǎo)入宿主并生成(參照EP239400,WO96/02576)。經(jīng)由CDR連接的人抗體的FR選擇互補(bǔ)決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。還可以根據(jù)需要，置換抗體的可變區(qū)的支架區(qū)的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(K.Sato等人.，CancerRes.1993,53:851-856)。除上述人源化之外，還可以為了改善與抗原的結(jié)合性等抗體的生物學(xué)特性而進(jìn)行修飾。本發(fā)明的修飾可通過位點專一性突變(例如參照Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488)、PCR突變、盒突變法等方法進(jìn)行。通常，生物學(xué)特性得到改善的抗體突變體與原有的抗體的可變區(qū)的氨基酸序列具有70%或以上、更優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)的氨基酸序列同源性和/或以類似性。本說明書中，序列的同源性和/或類似性是根據(jù)需要使序列重整以及導(dǎo)入缺口，使序列同源性獲得最大值，然后以與原有的抗體殘基相同(相同殘基)或類似(通常根據(jù)氨基酸支鏈的特性被分類為同一組的氨基酸殘基)的氨基酸殘基的比例定義。通常，天然的氨基酸殘基根據(jù)其支鏈的性質(zhì)被分類為(l)疏水性丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、曱硫氨酸和亮氨酸；(2)中性親水性天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、蘇氨酸和絲氨酸；(3)酸性天冬氨酸和谷氨酸；(4)堿性精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(5)對鏈的取向有影響的殘基甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。通常，存在于H鏈和L鏈可變區(qū)中的全部中，六個互補(bǔ)決定區(qū)(超可變部；CDR)相互作用，形成抗體的抗原結(jié)合部位。已知其中的一個可變區(qū)的親和性比含有全部結(jié)合部位的低，但是仍具有識別抗原并結(jié)合的能力。因此，對于本發(fā)明的編碼H鏈和L鏈的抗體基因，只要由該基因所編碼的多肽可以保持與所需抗原的結(jié)合性即可，可以編碼含有H鏈和L鏈各抗原結(jié)合部位的片段部分。根據(jù)本發(fā)明的方法，如上所述，例如可以保持實際活性，有效地獲得雙特異性抗體。重鏈可變區(qū)如上所述，通常由3個CDR區(qū)和4個FR區(qū)構(gòu)成。本發(fā)明的優(yōu)選方案中，進(jìn)行"修飾"的氨基酸殘基可以從位于CDR區(qū)或FR區(qū)的氨基酸殘基中適當(dāng)選擇。通常CDR區(qū)的氨基酸殘基的修飾可以使其與抗原的結(jié)合能力降低。因此，本發(fā)明中，進(jìn)行"修飾"的氨基酸殘基并沒有特別限定，優(yōu)選從位于FR區(qū)的氨基酸殘基中適當(dāng)選擇。在人或小鼠等生物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用公共數(shù)據(jù)庫等適當(dāng)獲得可用作抗體的可變區(qū)的FR的序列。更具體地說，通過后述實施例的方法，可以獲得FR區(qū)的氨基酸序列信息。本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)均作為參照原引到本說明書中。實施例以下通過實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限定。具有雜合L鏈的雙特異性抗體的人源化在曰本特愿2005-112514中，對于含有凝血時間縮短效果最高的抗FactorIXa抗體A69-VH、抗FactorX抗體B26-VH、雜合L鏈(BBA)的組合的雙特異性抗體如下進(jìn)行人源化。1-1人抗體的同源性檢索由一般公開的Kabat數(shù)據(jù)庫(ftp:〃ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT數(shù)據(jù)庫(http:〃imgt.cines.fr/)獲得人抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)，使用構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫，分成小鼠A69-H鏈可變區(qū)(氨基酸序列SEQIDNO,19)、小鼠B26-H鏈可變區(qū)(氨基酸序列SEQIDN0.20)、小鼠BBA-L鏈可變區(qū)(氨基酸序列SEQIDN0.21)進(jìn)行同源性檢索。結(jié)果可以確認(rèn)與以下所示人抗體序列具有較高的同源性，由此決定在人源化抗體的支架區(qū)C以下稱為FR)使用。(1)A69-H鏈可變區(qū)KABATID-000064(Kabat數(shù)據(jù)庫)(Kipps等人.，J.Clin.Invest1991;87:2087-2096)(2)B26-H鏈可變區(qū)EMBL登記號AB063872(IMGT數(shù)據(jù)庫)(未公開數(shù)據(jù))(3)BBA-L鏈可變區(qū)KABATID-024300(Kabat數(shù)據(jù)庫)(Welschof等人.,J.Immunol.Method.1995;179:203-214)將各小鼠抗體的互補(bǔ)性抗原決定區(qū)(以下稱為CDR)移植到(l)-(3)的人抗體的FR,制備人源化抗體。使用NCBI中一般公開的同源性檢索網(wǎng)站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),檢索與(4)-(6)的人抗體的同源性高的人抗體分泌信號序列。使用檢索得到的、以下所示的分泌信號序列。(4)A69-H鏈可變區(qū)Genbank登記號AF062257。(5)B69-H鏈可變區(qū)Genbank登記號AAC18248。(6)BBA-L鏈可變區(qū)Genbank登記號AAA59100。1-2人源化抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建在編碼由分泌信號序列至抗體可變區(qū)的氨基酸序列的堿基序列中，交互制備12條50個堿基左右的寡DNA,使3'末端一側(cè)有約20個堿基左右雜合。合成寡DNA設(shè)計成在5'末端一側(cè)編碼人序列，在3'末端一側(cè)編碼小鼠序列，或者全部堿基編碼人序列。并且，在抗體可變區(qū)基因的5'末端退火，與具有Xhol切斷序列的引物一起在抗體可變區(qū)基因的3'末端退火，制備具有Sfil切斷序列且編碼內(nèi)含子序列的5'末端序列的引物。將各1pL制備成2.5iliM的合成寡DNA混合，加入lxTaKaRaExTaq緩沖液、0.4mMdNTPs、0.5單位TaKaRaExTaq(均為寶酒造制備)，制備成48inL反應(yīng)液。在94。C下保溫5分鐘后，將含有94°C2分鐘、55。C2分鐘、72。C2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行2個循環(huán)，實施各合成寡DNA的裝配和鏈延伸反應(yīng)。接著，添加1^L在抗體基因的5'末端和3'末端退火的引物(各10pM),將含有94。C30秒、5(TC30秒、72°C1分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)，在72。C反應(yīng)5分鐘，擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因。PCR后，將反應(yīng)液總量供給1%瓊脂糖凝膠電泳。使用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN),按照所附說明書的方法純化目標(biāo)大小(約400dp)的擴(kuò)增片段，用30(iL滅菌水洗脫。使用pGEM-TEasy載體系統(tǒng)(Promega),按照所附說明書的方法對該片段進(jìn)行克隆。各DNA片段的堿基序列是使用BigDye終止子循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems)，通過DNA測序儀ABIPRISM3730xLDNA測序儀或ABIPRISM3700DNA測序儀(AppliedBiosystems),按照所附說明書的方法確定各DNA片段的堿基序列。將插入了確認(rèn)為正確的人源化抗體可變區(qū)基因序列的H鏈可變區(qū)片段的質(zhì)粒用Xhol和Sfil、將插入了L鏈可變區(qū)片段的質(zhì)粒用EcoRI消化，然后將反應(yīng)液供給1%瓊脂糖凝膠電泳。使用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN),按照所附說明書的方法純化目標(biāo)尺寸(約400bp)的DNA片段，用30pL滅菌水洗脫。然后如下制備動物細(xì)胞用表達(dá)載體。為了使H鏈為雜合組合的IgG4優(yōu)先表達(dá)，參考IgGl的knobs-into-hole技術(shù)(MerchantAM等人.，NatureBiotechnology,1998年，Vol.16，p.677-681)，使用IgG4的CH3部分的氨基酸置換體。并為了促進(jìn)H鏈的二聚體形成，向鉸鏈導(dǎo)入氨基酸置換(卞？0口30口-—-ppcpPcp-)。在具有雞P肌動蛋白啟動子的pCAGGS(Niwa等人.，Gene,1991年，Vol.108,193-199頁)中整合置換為Y39C、T366W的恒定區(qū)基因，向所得表達(dá)載體中插入人源化A69H鏈可變區(qū)抗體基因片段，制備人源化A69H鏈表達(dá)載體。另夕卜，在pCAGGS中整合置換為E356C、T366S、L368A、Y407V的恒定區(qū)基因，向所得表達(dá)載體中插入人源化B26H鏈可變區(qū)抗體基因片段，制備人源化B26H鏈表達(dá)載體。另外，在pCAGGS中插入了野生型抗體L鏈恒定區(qū)得到的質(zhì)粒(pCAG-gKDNA)用EcoII消化，制備插入了人源化BBAL鏈可變區(qū)抗體基因片段的表達(dá)載體。連接反應(yīng)是使用R叩idDNA連接試劑盒(RocheDiagnostics),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a抹(東洋紡績制備)。1-3人源化雙特異性抗體的表達(dá)采用以下方法進(jìn)行人源化雙特異性抗體的表達(dá)。來自人胎腎癌細(xì)胞的人源化雙特異性抗體的表達(dá)使用實施例1-2所述方法或以下方法進(jìn)行。將來自人胎腎癌細(xì)胞的HEK293H抹(Invitrogen)懸浮于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中，以5-6xl(^個/mL的細(xì)胞密度、以10mL接種于粘著細(xì)胞用培養(yǎng)皿(直徑10cm,CORNING)的各皿中，在C02培養(yǎng)箱(37。C、5%(302)內(nèi)培養(yǎng)一晝夜，然后吸引除去培養(yǎng)基，添加6.9mL含有1。/。胎牛血清(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養(yǎng)基。將在1-2中制備的質(zhì)粒DNA混合液(合計13.8昭)與20.7pL1pg/mL聚乙烯亞胺(PolysciencesInc.)和690pLCHO-S-SFM-II培養(yǎng)基混合，在室溫下靜置10分鐘，將其加入到各培養(yǎng)皿的細(xì)胞中，在C02培養(yǎng)箱(37°C,5。/oC02)內(nèi)培養(yǎng)4-5小時。然后添加6.9mL含有1%胎牛血清(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養(yǎng)基，在C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天。回收培養(yǎng)上清，然后離心(約2000g,5分鐘，室溫)除去細(xì)胞，進(jìn)一步過0.22pm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)進(jìn)行滅菌，該樣品在使用之前在4。C下保存。1-4人源化雙特異性抗體的純化向按照實施例1-2所述方法得到的培養(yǎng)上清中添加100|xL的rProteinASepharoseTMFastFlow(AmershamBiosciences),在4°C下J頁倒混合4小時以上。將該溶液轉(zhuǎn)移至0.22jim的濾器杯Ultrafree(R)-MC(Millipore),用500|liL含有0.01%吐溫恥20的TBS洗滌三次，將100含有0.01%吐溫恥20的50mM乙酸鈉溶液懸浮于rrProteinASepharoseTM樹脂中，使pH為3.3，靜置2分鐘，然后使抗體溶出。立即加入6.7juL的1.5MTris-HClpH7.8進(jìn)行中和。1-5人源化雙特異性抗體的濃度定量如下所示按照兩種方法進(jìn)行測定。用包被緩沖液將山羊Goat抗人IgG(BiosourceInternational)制備成1pg/mL，固定于Nunc-Immuno板上(Nunc)。用稀釋緩沖液(D.B.)進(jìn)行封閉，然后添加用D.B.適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)上清樣品。同樣地添加由2000ng/mL以3倍系列、用D.B.稀釋為11個梯度的人IgG4(人源化抗TF抗體，參照WO99/51743),作為用于計算抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。洗滌3次后，使其與山羊抗人IgG、堿性磷酸酶反應(yīng)(BiosourceInternational^洗滌5次后，以Sigma104間磷酸酶底物(Sigma-Aldrich)作為底物進(jìn)行顯色，通過吸光度讀數(shù)儀型號3550(Bio-RadLaboratories))、以665nm作為參照波長測定405nm的吸光度。使用微量板管理III(Bio-RadLaboratories)軟件，由標(biāo)準(zhǔn)品的校正曲線計算培養(yǎng)上清中人IgG的濃度。還使用Biacore1000(BIACORE),使用固定有蛋白A的傳感芯片CM5(BIACORE)進(jìn)行定量。具體來說，按照生產(chǎn)商的說明書，將用10mM乙酸鈉水溶液(pH4.0，BIACORE)稀釋為50jig/mL的蛋白A(SIGMA)溶液以5^L/分鐘在活化的傳感芯片反應(yīng)30分鐘，然后實施封閉操作，制備固定有蛋白A的傳感芯片。使用該傳感芯片、使用Biacore1000(BIACORE),測定培養(yǎng)上清和純化品的濃度。傳感芯片的固定和濃度測定是使用HBS-EP緩沖液(BIACORE)。濃度測定時的標(biāo)準(zhǔn)品使用由4000ng/mL按照2倍系列用HBS-EP緩沖液稀釋為6個梯度的人源化IgG4抗體(人源化抗TF抗體，參照W099/51743)。1-6人源化雙特異性抗體的凝血活性評價為了明確雙特異性抗體對血友病A血液的凝固能力是否有改變，研究該抗體對使用乏因子VIII血漿的活化部分凝血酶時間(APTT)的影響。將50|iL各種濃度的抗體溶液、50nL乏因子VIII血漿(Biomerieux)和50APTT試劑(DadeBehring)的混合液在37。C下加溫3分鐘。凝固反應(yīng)是通過將50pL20mM的CaCl2(DadeBehring)加入到該混合液中引發(fā)。通過連接有CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)測定至凝固所需時間。以乏因子VIII血漿的凝固時間為0%,以正常血漿的凝固時間為100%,制作校正曲線，使用該校正曲線，由添加了雙特異性抗體時的凝固時間計算雙特異性抗體的因子VIII樣活性(％)。1-7保持凝血活性的人源化雙特異性抗體的獲得在上述凝血活性評價中，對于凝血能力低的人源化雙特異性抗體，關(guān)注其活性的升高，使人源化抗體FR的氨基酸修飾。具體來說，使用QuikChange位點專一性突變試劑盒(Stratagene),按照所附說明書記載的方法向人源化抗體可變區(qū)導(dǎo)入突變。將插入了確認(rèn)為目標(biāo)人源化抗體可變區(qū)基因序列的H鏈可變區(qū)片段的質(zhì)粒用XhoI和SfiI、將插入了L鏈可變區(qū)片段的質(zhì)粒用EcoRI消化，然后將反應(yīng)液供給1%瓊脂糖凝膠電泳。使用QIAqmck凝膠純化試劑盒(QIAGEN),按照所附說明書記載的方法純化目標(biāo)大小(約400bp)的DNA片段，用30pL滅菌水洗脫。然后按照實施例l-2所示方法制備動物細(xì)胞用表達(dá)質(zhì)粒。按照實施例l-3、l-4、1-5所示方法制備人源化雙特異性抗體，按照實施例1-6所示方法評價凝血活性。將FR序列的氨基酸修飾和血液凝固能力的評價反復(fù)進(jìn)行，獲得與(人源化A69(hA69a)/人源化B26(hB26-F123e4)/人源化BBA(hAL-F123j4))(圖1)。將各抗體可變區(qū)序列表示為以下的SEQIDNO。(1)人源化A69抗體VH(hA69a)SEQIDNO.l(堿基序列)、SEQIDN0.2(氨基酸序列)(2)人源化B26抗體VH(hB26-F123e4)SEQIDN0.3(堿基序列)、SEQIDN0.4(氨基酸序列)(3)人源化BBA抗體VHL(hAL26-F123j4)SEQIDN0.5(堿基序列)、SEQIDN0.6(氨基酸序列)為了雙特異性抗體的分離而確定可變區(qū)氨基酸修飾位置在制備雙特異性抗體時的表達(dá)中，使用兩種H鏈和一種L鏈，則人源化A69-H鏈和人源化BBA-L鏈的均二聚體、人源化B26-H鏈和人源化BBA-L鏈的均二聚體、人源化A69-H鏈和人源化B26-H鏈與人源化BBA-L鏈的雜合二聚體三種抗體表達(dá)。將該三種抗體分離，為了只純化雙特異性抗體，使人源化A69H鏈可變區(qū)的等電點降低，使人源化B26H鏈可變區(qū)的等電點升高，進(jìn)行氨基酸修飾。首先，為了確認(rèn)暴露在人源化A69抗體和人源化B26抗體的可變區(qū)表面的氨基酸殘基，使用MOE軟件(ChemicalComputingGroupInc.),通過同源性建模制備人源化A69抗體和人源化B26抗體的抗體Fv區(qū)模型。模型如圖2所示，通過該模型的詳細(xì)分析，在CDR以外的FR序列中，在露出于表面的氨基酸中，H10、H12、H23、H39、H43、H105(Kabat編號,KabatEA等人.1991.SequencesofProteinsofImmunologicalInterestNIH)是不會使活性降低、而可以使等電點變化的候選氨基酸。人源化雙特異性抗體的可變區(qū)氨基酸的修飾在實施例2中所選定的位置，為了制備修飾抗體而進(jìn)行氨基酸修飾。具體來說，使用QuikChange位點專一性突變試劑盒(Stratagene)，按照所附說明書記載的方法制備人源化A69抗體H鏈可變區(qū)(hA69a,SEQIDNO,l)和人源化B26抗體H鏈可變區(qū)(hB26-F123e4，SEQIDNO.3)，向其中導(dǎo)入突變。將插入了確認(rèn)為目標(biāo)人源化抗體可變區(qū)基因序列的H鏈可變區(qū)的片段的質(zhì)粒用Xhol和Sfil消化，然后將反應(yīng)液供給1%瓊脂糖凝膠電泳。使用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN),按照所附說明書記載的方法純化目標(biāo)大小(約400bp)的DNA片段，用30滅菌水洗脫。按照實施例1-2所示的方法，參考konbs-into-hole技術(shù)，將制備的DNA片段插入到置換了恒定區(qū)氨基酸的表達(dá)質(zhì)粒和具有野生型恒定區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒中，制備H鏈表達(dá)載體。然后按照實施例1-3、1-4、1-5所示方法制備人源化雙特異性抗體。修飾的人源化抗體的可變區(qū)序列如以下表1所述SEQIDNO所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>4多飾的人源化抗體的等電聚焦電泳分一斤為了對可變區(qū)的氨基酸修飾導(dǎo)致的表面電荷變化進(jìn)行評價，實施修飾抗體的制備以及等電聚焦電泳的分析將人源化BBA-L鏈(hAL-F123j4)表達(dá)載體與使人源化A69-H鏈修飾得到的hA69-p18、hAW-p8、hAW-pl7、hAW-pl6和未修飾的hAWa的各H鏈表達(dá)載體組合，同時表達(dá)，由此制備由hA69、hA69a-pl8、hA69-p8、hA69-pl7、hA69-pl6五種均二聚體構(gòu)成的抗體。同樣，將人源化BBA-L鏈表達(dá)載體與使人源化B26-H鏈修飾得到的hB26-pl9、hB2&pl5和未修飾的hB26-F123e4的各H鏈表達(dá)載體組合，同時表達(dá)，由此制備由hB26-F123e4、hB26-pl9、hB26-pl5三種均二聚體構(gòu)成的抗體。等電聚焦電;永》口下進(jìn)4亍。4吏用PhastsystemCassette(AmerchamBioscience制備)，用以下的溶脹液用使Phast-GdDryIEF(AmerchamBioscience制備)凝膠溶脹約30分鐘。20%甘油0.95mLmilliQ水0.95mLBio國Lyte7/9(BioRad制備)10Bio-Lyte3/10(BioRad制備)10Pharmalyte8-10.5forIEF(AmerchamBioscience制備)80(xL4吏用溶月長的凝月交，通過Phastsystem(AmerchamBioscience制備)，按照以下程序進(jìn)行電泳。樣品是在步驟2添加到凝膠中。pl標(biāo)志使用pi才交正曲線"^式劑盒(AmershamBiosciences)。步驟1:2000V25mA35W15°C75Vh步驟2:200V25mA35W15°C15Vh步驟3:2000V25mA35W15°C410Vh電泳后的凝膠用20%TCA固定，然后用Silverstaining試劑盒、蛋白質(zhì)(AmershamBiosciences),按照試劑盒所附的說明書進(jìn)行銀染。染色后，由pl標(biāo)志的已知等電點計算樣品的等電點。未修飾和修飾的人源化A69抗體的均二聚體、人源化B26抗體的均二聚體的分析結(jié)果如圖3所示。通過表面電荷的改變，在等電聚焦電泳中觀察到條帶的移動。以pl標(biāo)志為參考推測的各抗體的等電點是相對于未修飾的hA69a均二聚體的8.8,修飾的hA69-pl8約為8.4,hA69-pl7約為8.2,hA69-p8約為8.1,通過修飾可以產(chǎn)生最大約0.7的等電點差。人源化B26均二聚體也同樣，相對于未修飾的hB26-F123e4的9.1，修飾的hB26-pl9約為9.3,hB26-pl5約為9.4,通過修飾產(chǎn)生了最大約0.3的等電點差。本研究顯示，將所選擇的可變區(qū)H12、H23、H39、H43、H105的表面氨基酸進(jìn)行電荷改變，可以使等電點發(fā)生變化。修飾的人源化抗體的陽離子交換色語分析使用在實施例4中制備的修飾抗體，按照以下方法進(jìn)行陽離子交換色譜的分析，評價修飾對兩種抗體分離帶來的影響。陽離子交換色譜分析條件如下，計算人源化A69抗體的均二聚體、人源化B26抗體的均二聚體的保留時間。柱ProPacWCX畫IO,4x250mm,(Dionex)流動相A:10mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4,pH6.25B:10mmol/LNaH2P04/Na2HP04,500mmol/LNaCl,pH6.25流速l.OmL/min梯度10%B(5分鐘)—(40分鐘)—60%B—(5分鐘)—100%B(5分鐘)檢測220nm未修飾和修飾的五種人源化A69抗體的均二聚體的分析結(jié)果如圖4所示，未修飾和修飾的三種人源化B26抗體的均二聚體的分析結(jié)果如圖5所示。未修飾人源化A69抗體的均二聚體和人源化B26抗體的均二聚體的保留時間均為25分鐘左右，無法進(jìn)行兩種均二聚體的分離、乃至目標(biāo)雙特異性抗體的分離。發(fā)生了使未修飾抗體等電點降低的改變所得的人源化A69抗體與未修飾的抗體相比，可觀察到峰的移動，伴隨著改變的數(shù)目，保留時間縮短為約22.4分鐘、約21.2分鐘、約20.2分鐘。進(jìn)行使可變區(qū)等電點升高的改變所得的人源化B26抗體與未改變的抗體比較可觀察到峰的移動，伴隨著改變的數(shù)目不同，保留時間延長至約28.4分鐘、約29.4分鐘。通過本研究中所選擇的可變區(qū)H12、H23、H39、H43、H105的表面氨基酸電荷的改變，兩種抗體表面電荷發(fā)生變化，由此可使保留時間改變。根據(jù)實施例4中所測定的等電點，未修飾的hA69a均二聚體和未修飾的hB26-F123e4均二聚體的pl有0.3的差異，但兩者的保留時間均為25分鐘左右，無法分離(圖9),而未修飾的h八69均二聚體與hB26-pl9的pi有0.5的差異，結(jié)果兩者以保留時間約2.6分鐘的差異分離，hA69-pl8和hB26均二聚體的pi有0.7的差異，結(jié)果兩者以保留時間約3.4分鐘的差異分離，最大的是hA69-pl6和hB26-pl5的pi有1.3的差異，結(jié)果保留時間以約9.2分鐘的差異分離。這樣，通過修飾使兩種均二聚體分離首次成為可能。修飾的人源化雙特異性抗體的凝固活性評價通過實施例4、實施例5的分析，我們可以觀察到表面電荷的變化，使修飾的兩種人源化抗體H鏈(hA69-p8、hB26-pl5)和人源化L鏈(hAL-F123j4)表達(dá)，制備人源化雙特異性抗體。為了有效地促進(jìn)雜合二聚體，H鏈載體使用整合了利用konbs-into-holes技術(shù)的IgG4恒定區(qū)的表達(dá)載體。使用制備的人源化雙特異性抗體，按照以下所示方法評價凝固活性。為了明確雙特異性抗體是否可改變血友病A血液的凝固能力，研究該抗體對使用乏因子VII血漿的活化部分凝血酶時間(APTT)的影響。將50nL各種濃度的抗體溶液、50乏因子VIII血漿(Biomeneux)和50APTT試劑(DadeBehring)的混合液在37。C下加溫3分鐘。凝固反應(yīng)是通過將50^L20mM的CaCl2(DadeBehring)加入到該混合液中引發(fā)。通過連接有CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)測定至凝固所需時間。以乏因子VIII血漿的凝固時間為0%,以正常血漿的凝固時間為100%,制作校正曲線，使用該校正曲線，由添加了雙特異性抗體時的凝固時間計算雙特異性抗體的因子VIII樣活性(％)?；钚栽u價結(jié)果如圖6所示。使可變區(qū)修飾的人源化雙特異性抗體與未修飾的人源化雙特異性抗體顯示同等的凝固活性，因此顯示本實施例的可變區(qū)的修飾對于抗體的活性沒有影響。使CDR修飾的人源化抗體的制備和評價對實施例2制備的人源化抗A69抗體的模型進(jìn)行分析，結(jié)果確認(rèn)H97是暴露于表面的氨基酸。表1所示的抗體中，人源化A69-H鏈的hA69-N97R具有將存在于CDR3的第97號天冬酰胺修飾為精氨酸的序列。按照實施例1-2的方法制備具有hA69-N97R的表達(dá)載體，與人源化BBA-L鏈一hAL-F123j4—起表達(dá)，制備修飾抗體。對該抗體的表面電荷的變化進(jìn)行評價，按照實施例4的方法進(jìn)行等電聚焦電泳。如圖7所示，未修飾的抗體(hA69a/hAL-F123j4)的等電點為8",而修飾抗體(hA69a-N97R/hAL-F123j4)為9.1,在CDR的氨基酸置換中觀察到表面電荷的變化。為了評價修飾抗體的功能，按照以下方法評價與抗原一因子IXa的結(jié)合活性。將用包被緩沖液(100mM二碳酸鈉，pH9.6,0.02%疊氮化鈉)稀釋為1pg/mL的因子Ixa卩(EnzymeResearchLabratories)以100iliL/孔分注到Nunc-Immuno板(Nunc-ImmunoTM96MicroWellTMMaxiSorpTM(NalgeNuncInterantional)),在4°C下溫育過夜。用含有吐溫(r)20的PBS(國)洗滌3次，然后用稀釋緩沖液(50mMTris-HCl、pH8.1,1%牛血清白蛋白，lmMMgCl2，0.15MNaCl，0.050/o吐溫⑧20,0.02%疊氮化鈉)將板在室溫下封閉2小時。除去緩沖液，然后添加100pL/孔用稀釋緩沖液稀釋的純化抗體，在室溫下溫育1小時。將板洗滌3次，然后添加100^L/孔用稀釋緩沖液稀釋為1/4000的石咸性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(BIOSOURCE),在室溫下溫育l小時。將板洗滌5次，添加100^L/孔顯色底物(Sigma),在室溫下溫育30分鐘。用微量板讀板儀型號3550(Bio-RadLabomtories)測定405nm(對照655nm)的吸光度。結(jié)果如圖8所示，由于改變電荷而使CDR修飾的抗體與修飾前的抗體顯示同等的結(jié)合活性。還顯示如上述改變表面電荷時，修飾的位置不只是實施例5所示的FR,也顯示可以是CDR。人源化雙重特異性PF抗體的制備和評價在表l所示的抗體中，使用人源化A69-H鏈hA69a、人源化B26-H飾的抗體，制備未修飾的人源化雙特異性抗體。在表l所示的抗體中，使用人源化A69-H鏈的修飾體hA69a-PFL、人源化B26-H鏈的修飾體hB26-PF和人源化BBA-L鏈hAL-s8(SEQIDN0.17)作為修飾抗體，制備人源化雙特異性PF抗體。H鏈?zhǔn)褂镁哂幸吧秃愣▍^(qū)的表達(dá)載體，按照實施例1-2所示構(gòu)建表達(dá)載體，按照實施例l-3、實施例1-4、實施例1-5的方法制備抗體。使用含有該兩種均二聚體和雙特異性抗體的混合溶液，按照實施例5所示的方法實施陽離子交換色譜分析。未修飾的人源化雙特異性抗體和人源化雙特異性PF抗體分析結(jié)果如圖9、圖IO所示。該結(jié)果中，在未修飾的人源化雙特異性抗體中，兩種均二聚體與雙特異性抗體不分離，以一個峰的形式洗脫，而人源化雙特異性PF抗體中，兩種均二聚體和目標(biāo)雙特異性抗體分別分離，依次以hA69-PF均二聚體、人源化雙特異性PF抗體、hB26-PF均二聚體的順序洗脫出三個峰。陽離子交換色語分析時獲得三種峰，由此可以純化兩種均二聚體和人源化雙特異性PF抗體。將該組分通過AmiconUltra,MWCO10000(Millipore)濃縮后，用20mM乙酸鈉、150mMNaCl、pH6.0在低溫處透析過夜，進(jìn)行濃度測定。將各抗體純化后，按照實施例4所示的方法進(jìn)行等電聚焦電泳。如圖l所示，進(jìn)行陽離子交換色譜分析之前的抗體存在三條條帶，通過陽離子交換色譜，確認(rèn)可以純化各抗體。人源化A69-PF抗體的均二聚體、人源化雙特異性PF抗體、人源化B26-PF抗體的均二聚體的等電點約為7.9、約8.6、約9.2,人源化A69-PF抗體的均二聚體與人源化雙重特異性PF抗體等電點的差約為0.7,人源化B26-PF抗體的均二聚體與人源化雙重特異性PF抗體等電點的差約為0.6。接著，按照實施例6所示的方法，對純化的雙特異性PF抗體的凝固活性進(jìn)行評價，與以下三種抗體進(jìn)行凝固活性的比較使用利用上述knobs-into-holes技術(shù)的IgG4恒定區(qū)進(jìn)行表達(dá)的雙特異性抗體；含有未使可變區(qū)修飾的hA69a(SEQIDN0.2)、hB26-F123e4(SEQIDN0.4)、hAL-F123j4(SEQIDN0.6)的雙特異性抗體；與純化的雙特異性PF抗體相同具有可變區(qū)、使用利用knobs-into-holes技術(shù)的IgG4恒定區(qū)的雙特異性抗體。評價結(jié)果如圖12所示。具有利用knobs-into-holes技術(shù)的IgG4恒定區(qū)的雙特異性PF抗體與具有野生型恒定區(qū)、通過離子交換色語純化的雙特異性PF抗體的凝固活性同等，顯示本實施例的H10、H12、H23、H39、H43、H105的可變區(qū)修飾對于活性沒有影響，可以以高純度純化雙特異性抗體。人源化雙特異性抗體表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建為了制備修飾的人源化雙特異性抗體，如下構(gòu)建抗體表達(dá)細(xì)胞抹。以人IgG4的野生型H鏈恒定區(qū)基因為模板，使用與設(shè)計成編碼H鏈恒定區(qū)的N末端一側(cè)的兩個氨基酸(Ala-Ser)的堿基序列為Nhel識別序列(GCTAGC)的5'末端一側(cè)引物，和設(shè)計成與3'末端一側(cè)退火、且具有Notl識別位點的引物，PCR擴(kuò)增H鏈恒定區(qū)，與將pBluescriptKS+載體(東洋紡)用Nhel、Notl(均為寶酒造制備)消化所得的載體連接，制備pBCH4(包含IgG4恒定區(qū)基因)。使用表1所示的與人源化A69-H鏈側(cè)堿基序列互補(bǔ)、^有Kozak序列(CCACC)和EcoII識另^序列的引物，以及具有Nhel識別序列的3'末端一側(cè)堿基序列的引物進(jìn)行PCR,將所得PCR產(chǎn)物用EcoRI、Nhel(均為寶酒造制備)消化，插入到同樣用EcoRI、Nhel消化的pBCH4中，連接可變區(qū)和恒定區(qū)。將制備的人源化A69-H鏈抗體載體用EcoRI、Notl(均為寶酒造制備)消化，克隆到同樣用EcoRI、Notl消化的動物細(xì)胞用表達(dá)載體pCXND3中。該載體pCXND3的構(gòu)建流程如下所示。為了將DHFR-AE-yVH-PMl-f(參照W092/19759)的抗體H鏈基因與載體分割，用限制酶EcoRI、Smal位點進(jìn)行消化，只回收載體一側(cè)，然后克隆EcoRI-NotI-BamHI適配子(寶酒造制備)。將該載體命名為pCHOI。將pCHOI的DHFR基因表達(dá)位點克隆到pCXN(Niwa等人，Gene1991,108:193-200)的限制酶HindlII位點上，將所得載體命名為pCXND3。將制備的人源化B26-H鏈抗體載體用EcoRI、Notl(均為寶酒造制備)消化，克隆到同樣用EcoRI、Notl消化的動物細(xì)胞用表達(dá)載體pCXZDl中。pCXZD1載體是將pCXND3載體的新霉素抗性基因置換為博來酶素抗性基因得到的表達(dá)載體。使用與人源化BBA-L鏈抗體(hAL-AQ,SEQIDN0.18)的L鏈可變區(qū)的5'末端一側(cè)堿基序列互補(bǔ)、具有Kozak序列的合成寡核苷酸，以及與BsiWI位點的3'末端側(cè)堿基序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸進(jìn)行PCR,將所得PCR產(chǎn)物克隆到人kappa恒定區(qū)插入到pBluescriptKS+載體中所得的pBCL載體中。通過BsiWI位點使人L鏈可變區(qū)與恒定區(qū)連接。將制備的L鏈基因片段克隆到表達(dá)載體pUCAG中。該載體pUCAG是將pCXN(Niwa等人.，Gene1991,108:193-200)用限制酶BamHI消化所得到的2.6kbp的片段與pUC19載體(東洋紡)的限制酶BamHI位點連接并克隆得到的載體。將L鏈克隆到pUCAG中，將所得的載體用限制酶Bamffl消化，克隆到含有潮霉素抗性基因的表達(dá)載體pHycDHFR-4b中。將制備的三種表達(dá)載體通過限制酶制成直鏈連接，然后基因?qū)隒HO-DG44細(xì)胞中，建立抗體表達(dá)細(xì)胞林。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞林的制備如下進(jìn)行。通過使用GenePulserII(Bio-Rad)的電穿孔法導(dǎo)入基因。將各抗體表達(dá)載體與0.75mL懸浮于PBS中的CHO細(xì)胞(lxl0"田胞/mL)混合，將混合物在水上冷卻10分鐘，轉(zhuǎn)移到樣品杯中，然后以1.5kV、25^FD的容量給予脈沖。在室溫下恢復(fù)10分鐘后，將電穿孔處理過的細(xì)胞懸浮于40mL以1倍濃度含有HTsupplement(Invitrogen)的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基(Invitrogen)中。用同樣的培養(yǎng)基制備10倍稀釋液，以100^L/孔分注到96孔培養(yǎng)板中。在C02培養(yǎng)箱(5°/。C02)中培養(yǎng)24小時，然后添加0.5mg/mL遺傳霉素(Invitrogen)、0.6mg/mL博來霉素(Invitrogen)、0.4mg/mL潮霉素B(Invitrogen)，培養(yǎng)2周。將顯示抗藥性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的集落依次放大培養(yǎng)，使用建立的高生產(chǎn)細(xì)胞株進(jìn)行大量的培養(yǎng)，得到培養(yǎng)上清。通過制備用的常用柱對人源化雙特異性抗體的分離純化按照以下方法，從實施例8得到的培養(yǎng)上清中純化雙特異性抗體。將培養(yǎng)上清添加到用平銜-緩沖液(20mmol/L磷酸鈉緩沖液、1mol/LNaCl)平衡的rProteinASepharoseFastFlow柱(AmershamBiosciences,50mml.D.x9.9cmH.=194.3mL-樹脂)中，用洗滌緩沖液1(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，1mol/LNaCl,pH7.0)、洗滌緩沖液2(50mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH6.0)洗滌，然后用100mmol/L乙酸洗脫。洗脫后立即用20mmol/L乙酸鈉緩沖液、pH6.0稀釋3倍。將所得純化溶液添加到用SolventA(20mmol/L乙酸鈉H沖液，pH6.0)平衡的制備用常用柱SPTOYOPERL650M柱(東V—、26mml.D.x22.3cmH.=118.3mL-樹脂)中。在以下所示的溶液和梯度中通過抗體表面電荷差進(jìn)行分離。溶劑A:20mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH6.0溶劑B:20mmol/L乙酸鈉緩沖液，1mol/LNaCl,pH6.0流速10mL/分鐘(113cm/小時)只在洗脫時為5.3mL/分鐘(60cm/小時)梯度0-15%B臺階梯度3柱容積(CV)沖洗液體15—22%B梯度2.5CV22—30%B梯度6CV30—100%B臺階梯度3CV沖洗液體洗脫的結(jié)果顯示，檢測出圖13所示的三個峰，在使用制備常用柱時也可以分離純化雙特異性抗體。修飾的人源化雙特異性抗體的活性評價對于實施例9制備的人源化雙特異性抗體，按照實施例6所示的方法評價凝固活性。評價結(jié)果如圖14所示。與實施例8中制備的人源化雙特異性PF抗體比較，與在實施例9中純化的人源化雙特異性抗體的凝固活性同等。如hA69-PFL和hA69-KQ，可變區(qū)的氨基酸序列即使有些不同，使用制備常用的柱純化的抗體對活性也沒有影響。以上表明，在制備雙特異性抗體時，通過H鏈可變區(qū)的修飾，無需改變結(jié)構(gòu)或抗體的功能(活性)，只改變表面電荷，即可以分離純化目標(biāo)人源化雙特異性抗體和形成兩種均二聚體的抗體。通過使用本方法，顯示制備用常用柱也可以分離純化雙特異性抗體，由此可用作含有雙特異性抗體的藥物的制備方法。亞類雜合抗體的制備11-1.人lgG2抗體H鏈恒定區(qū)基因的克隆為了克隆人IgG2抗體H鏈恒定區(qū)的基因，進(jìn)行以下操作。為了擴(kuò)增cDNA片段，制備50]liL的各反應(yīng)液(各1pL20pMK62引物(5'caccgtetcetcageetccaccaa3'/SEQIDN0.22)、K63引物(5'gtggcaetcatttacccggagaca3'/SEQIDNO.23)、5MTC多組織cDNA組(夕卜周血白細(xì)胞)(Clontech制備)、4jiL5xPrimeSTAR緩沖液、42.5mMdNTPs、1PrimeSTARHSDNA聚合酶(以上由TaKaRa制備))，進(jìn)行PCR。PCR是使用熱循環(huán)GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(ParkinElmer),在98。C下加熱2分鐘，然后將含有98。C10秒、60。C5秒、72°C2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72。C下加熱IO分鐘。PCR后，將反應(yīng)液供給1%瓊脂糖凝膠電泳。按照QIAqucick凝膠純化試劑盒(QIAGEN)、按照所附說明書的方法純化目標(biāo)大小(約1000bp)的擴(kuò)增片段，用50pL滅菌水洗脫，然后為了在擴(kuò)增片段的末端附加A(腺苷)而進(jìn)行"Taq處理。y-Taq處理是將所得擴(kuò)增片段的10jLiLyTaq反應(yīng)液(110xfTaq反應(yīng)溶液，1pL2.5mMdNTPs、1|liLrTaq、7|xL上述擴(kuò)增片段)在72°C下保溫30分鐘。將經(jīng)y-Taq處理的片段克隆到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)上，確定堿基序列。各DNA片段的堿基序列是使用BigDye終端3.1循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems),通過DNA測序儀ABIPRISM3730xLGenetic分析儀(AppliedBiosystems)、按照所附說明書記載的方法確定。將確定的堿基序列與Accession.No.BX640623比較，所翻譯的氨基酸序列不同的堿基可以認(rèn)為是在PCR擴(kuò)增時由于插入而發(fā)生的突變，使用QuickChange位點專一性突變試劑盒(Stratagene)進(jìn)行氨基酸置換，修飾為與BX640623的氨基酸序列相同的序列。QuickChange位點專一性突變試劑盒(Stratagene)按照所附說明書記載的方法進(jìn)行。并且，為了連接人IgG2-H鏈恒定區(qū)基因和目標(biāo)可變區(qū)基因，使其突變?yōu)槿薎gG2-H鏈恒定區(qū)的最初的兩個氨基酸(Ala-Ser)為限制酶Nhel識別序列(GCTAGC)。本實驗中使用的人IgG2-H鏈恒定區(qū)的堿基序列和氨基酸序列分別如SEQIDN0.24和SEQIDN0.25所示。11-2.亞類置換抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建將人源化PM-1抗體的H鏈可變區(qū)與人IgGl、人lgG2、人lgG4、的各種H鏈恒定區(qū)連接而成的抗體表達(dá)載體如下制備。使用與非專利文獻(xiàn)(SatoK等人，CancerResearch1993,53:851-856)所示的人源化抗人白細(xì)胞介素6受體抗體(人源化PM-1抗體)的H鏈可變區(qū)的5'末端一側(cè)堿基序列互補(bǔ)、具有Kozak序列的合成寡核苷酸，以及具有限制酶Nhel識別序列、與3'末端一側(cè)堿基序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸，進(jìn)行PCR,將所得PCR產(chǎn)物克隆到人IgGl-H鏈恒定區(qū)(參照SatoK等人，CancerResearch1993,53:851-856)插入到pBluescriptKS+載體(TOYOBO)所得的pB-CH載體上。將H鏈可變區(qū)和恒定區(qū)連接而成的H鏈基因片段插入到通過雞卩肌動蛋白啟動子控制表達(dá)的pCAGGS載體(Niwa等人.1991Gene,108:193-199)中。將PCR擴(kuò)增的人源化PM-1抗體的H鏈可變區(qū)基因與人IgG4恒定區(qū)基因(參照W099/51743)和實施例11-1中制備的人IgG2-H鏈基因的5'末端的Nhel連接，插入到pCAGGS載體中。各種H鏈表達(dá)載體是通過Nhel序列使人源化PM-1抗體的H鏈可變區(qū)與人H鏈恒定區(qū)連接，表達(dá)H鏈。同樣，使用與人源化PM-1抗體的L鏈可變區(qū)的5'末端側(cè)堿基序列互補(bǔ)、具有Kozak序列的合成寡核苷酸，以及具有與限制酶BsiWI識別序列的3'末端一側(cè)堿基序列互補(bǔ)的合成寡核香酸進(jìn)行PCR,將所得PCR產(chǎn)物克隆到人kappa恒定區(qū)插入到pBluescriptKS+載體(TOYOBO)中得到的pB-CL載體中。將L鏈可變區(qū)和恒定區(qū)連接而成的L鏈基因片段插入到通過雞卩肌動蛋白啟動子控制表達(dá)的pCAGGS載體中。通過BsiWI序列使人源化PM-1抗體的L可變區(qū)與人kappa鏈恒定區(qū)連接，表達(dá)L鏈。11-3.亞類雜合抗體的表達(dá)亞類雜合抗體可以分別將2種具有人IgGl、人lgG2、人lgG4的各種恒定區(qū)的人源化PM-1抗體H鏈表達(dá)載體組合，與人源化PM-1抗體L鏈表達(dá)載體一起在表達(dá)用細(xì)胞中共表達(dá)。各抗體的表達(dá)可使用實施例4-2的方法或以下方法進(jìn)行。將來自人胎腎癌細(xì)胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮于含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中，以各10mL、5-6xl05個/mL細(xì)胞密度接種于粘著細(xì)胞用培養(yǎng)皿(直徑iocm，CORNING)的各皿中，在C02培養(yǎng)箱(37。C,5%C02)內(nèi)培養(yǎng)一晝夜，然后吸引除去培養(yǎng)基，添力。6.9mLCHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養(yǎng)基。使用11-2中制備的質(zhì)粒DNA，如下制備各亞類抗體表達(dá)用混合液和雜合抗體表達(dá)用的混合液(共13.8pg)。(1)6.9ngL鏈表達(dá)載體、6.9)LiglgGl-H鏈表達(dá)載體(2)6.9pgL鏈表達(dá)載體、6.9|igIgG2-H鏈表達(dá)載體(3)6.9)xgL鏈表達(dá)載體、6.9pglgG4-H鏈表達(dá)載體(4)6.9嗎L鏈表達(dá)載體、3.45pgIgGl-H鏈表達(dá)載體、3.45pgIgG2-H鏈表達(dá)載體(5)6,9]LigL鏈表達(dá)載體、3.45嗎IgG2-H鏈表達(dá)載體、3.45)iigIgG4-H鏈表達(dá)載體(6)6.9iugL鏈表達(dá)載體、3.45|tigIgGl-H鏈表達(dá)載體、3.45)LigIgG4-H鏈表達(dá)載體將各混合液與20.7pL1)ig/mL聚乙烯亞胺(PolysciencesInc.)和690ILiLCHO-S-SFMn培養(yǎng)基混合，在室溫下靜置10分鐘，將所得加入到各培養(yǎng)皿的細(xì)胞中，在C02培養(yǎng)箱(37。C,5%032)內(nèi)培養(yǎng)4-5小時。然后添加6.9mLCHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養(yǎng)基，在002培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天。回收培養(yǎng)上清，然后離心(約2000g，5分鐘，室溫)除去細(xì)胞，再過0.22pm濾器MILLEX(R)-GV(Milhpore)進(jìn)行滅菌。該樣品在使用之前保存在4°。下。11-4.亞單元雜合抗體的純化在實施例11-3中所述的方法得到的培養(yǎng)上清中添加100pLrProteinASepharoseTMFastFlow(AmershamBiosciences),在4。C下J頁"f到'/'昆合4小時以上。將該溶液轉(zhuǎn)移至0.22jam的濾杯Ultrafree")-MC(Millipore)中，用500piLTBS洗滌3次，然后懸浮于rProteinASepharoseTM樹脂的100的50mM乙酸鈉水溶液、pH3.0中，靜置2分鐘，然后洗脫抗體。立即加入6.7pL1.5MTris-HCl、150mMNaCl，pH8.0,進(jìn)行中和。所得抗體溶液如果作為活性測定用則用PBS透析、如果作為DSC測定用則用含有150mMNaCl的20mM乙酸緩沖液pH6.0透析，置換緩沖液。以下，將具有純化的人IgGl的H鏈恒定區(qū)的抗體稱為"未修飾人源化抗PM-l抗體"，將具有人IgG2的H鏈恒定區(qū)的抗體稱為"IgG2化人源化抗PM-l抗體，，，將具有人IgG4的H鏈恒定區(qū)的抗體稱為"IgG4化人源化抗PM-1抗體"。11-5.亞類雜合抗體的濃度定量52將2PL含有實施例11-4所得抗體的溶液供給ND-1000光譜儀(NanoDr叩)，或?qū)?0供給分光光度計DU-600(BECKMAN)，測定280nm下的吸光度。用以下算式，由所得值計算抗體濃度?？瞻资鞘褂肞BS或含有150mMNaCl的20mM乙酸緩沖液，pH為6.0?？贵w濃度(mg/mL^吸光度x稀釋倍率+14.6x10亞類雜合抗體的分析12-1.亞類雜合抗體的等電聚焦電泳分析為了對恒定區(qū)置換導(dǎo)致的表面電荷的變化進(jìn)行評價，通過等電聚焦電泳進(jìn)4亍分沖斤。等電聚焦電泳如下進(jìn)4亍。<吏用PhastsystemCassette(AmerchamBioscience制備)，用以下的溶脹液用使Phast-GelDryIEF(AmerchamBioscience制備)凝膠溶脹約30分鐘。20%甘油1.5mLPharmalyte8-10.5forIEF(AmerchamBioscience制備)100|uL寸吏用溶月長的凝月交，通過Phastsystem(AmerchamBioscience制備)，按照以下程序進(jìn)行電泳。樣品是在步驟2添加到凝膠中。pl標(biāo)志使用pi才交正曲線試劑盒(AmershamBiosciences)。步驟1:2000V25mA35W15°C75Vh步驟2:200V25mA35W15°C15Vh步驟3:2000V25mA35W15°C410Vh電泳后的湊是膠用20。/oTCA固定，然后用Silverstaining試劑盒、蛋白質(zhì)(AmershamBiosciences),按照試劑盒所附的說明書進(jìn)行銀染。染色后，由pl標(biāo)志的已知等電點計算樣品的等電點。未修飾、IgG2化和IgG4化人源化PM-l抗體的分析結(jié)果如圖15所示。通過亞類的置換，在等電聚焦電泳中觀察到條帶的移動。以pl標(biāo)志為參考推測的各抗體的等電點是相對于未修飾人源化PM-1抗體的9.3,IgG2化人源化PM-l抗體約為8.9,IgG4化人源化PM-l抗體約為8.7,通過置換可以產(chǎn)生最大約0.7的等電點差。本研究顯示，通過置換抗體亞類的恒定區(qū)，可以使等電點發(fā)生變化。未修飾、IgG2化人源化PM-1抗體，以及未修飾、IgG4化人源化PM-1抗體的共表達(dá)抗體分析結(jié)果如圖16所示。由此，任何組合中，各亞類的均二聚體、雜合二聚體都可以3個主條帶的形式觀察到，以pi標(biāo)志為參考推測的各抗體的等電點是相對于未修飾人源化PM-1AgG2化人PM-l抗體的9.2，未修飾人源化PM-l/IgG2化人PM-l的雜合抗體為9.0。本研究中顯示，通過將各亞類抗體的表達(dá)載體組合共表達(dá)，可以制備亞類雜合抗體，它們通過等電點進(jìn)行分離。12-2.亞類雜合抗體的陽離子交換色譜分析使用在實施例11中制備的亞類雜合抗體，按照以下方法進(jìn)行陽離子交換色譜的分析，評價亞類置換對分離的影響。陽離子交換色譜分析條件如下，計算未修飾人源化PM-1抗體、IgG2化人源化PM-l抗體、IgG4化人源化PM-1抗體，以及未修飾人源化PM-1抗體/IgG2化人源化PM-1抗體的雜合抗體、未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-l抗體的雜合抗體的保留時間。柱ProPacWCX陽IO,4x250mm,(Dionex)流動相A:25mmol/LMES/NaOH,pH6.1B:25mmol/LMES/NaOH,250mmol/LNaCl,pH6.1流速0.5mL/min梯度10%B(5分鐘)—(105分鐘)—67%B—(1分鐘)—100%B(5分鐘)檢測280nm單獨表達(dá)的未修飾、IgG2化和IgG4化人源化PM-1抗體的分析結(jié)果如圖17所示。未修飾人源化PM-1抗體、IgG2化人源化PM-l抗體和IgG4化人源化PM-1抗體的保留時間分別約為60.2分鐘、30.5分鐘和30.3分鐘，通過亞類置換，保留時間變化了稍低于30分鐘。另一方面，等電聚焦電泳中，可見pl差異的IgG2化人源化PM-1抗體和IgG4化人源化PM-1抗體的保留時間大致相同。未修飾、IgG2化，以及未修飾、IgG4化人源化PM-1抗體共表達(dá)抗體分析結(jié)果如圖18所示。在未修飾人源化PM-1抗體/IgG2化人源化PM-1抗體的組合，以及未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-1抗體的組合中，觀察到了各亞類的均二聚體、雜合二聚體的三個主峰。關(guān)于保留時間，未修飾人源化PM-l/IgG2化人源化PM-1的雜合抗體約為43.8分鐘，未修飾人源化PM-l/IgG4化人源化PM-1的雜合抗體約為45.1分鐘，以10分鐘以上的保留時間差與各均二聚體分離。本研究顯示，通過將各亞類抗體的表達(dá)載體組合共表達(dá)，可以制備亞類雜合抗體，它們可以通過離子交換色語分離。亞類雜合抗體通過陽離子交換色譜的分離純化將實施例1所得的抗體溶液用Amicon-Ultra4(Amicon)濃縮，封裝到EasySep(卜；、一精工)中，用5mM檸檬酸緩沖液(pH6.5)進(jìn)行透析，置換緩沖液，按以下條件純化亞類雜合抗體。柱PolyGATA,4.6x100mm,粒徑3|nm,孔徑150nm(PolyLC)流動相A:25mmol/LMES/NaOH,pH6.1B:25mmol/LMES/NaOH,250mmol/L乙酸鈉，pH6.15充速1.0mL/min梯度35%B(5分鐘)—(54分鐘)—65%B—(1分鐘)—100%B(5分鐘)檢測280nm每次注入約100-200jig，制備未修飾人源化PM-1抗體、未修飾人源化PM-1抗體/IgG4化人源化PM-1亞類雜合抗體、IgG4化人源化PM-1抗體峰。制備時的色i普語如圖19所示。將多次的峰的制備組分分別混合，用Amicon-Ultra4(Amicon)濃縮后封裝到EasySep(卜;、一精工)中,如果是測定活性用則用PBS透析、如果是DSC測定用則用含有150mMNaCl的20mM乙酸緩沖液、pH6.0透析，置換緩沖液。制備峰在上述同樣的條件下進(jìn)行重分析，結(jié)果如圖20所示。由此顯示亞類雜合抗體可通過離子交換色譜法制備純化。本技術(shù)可利用pl值不同的亞類的恒定區(qū)分離具有共通的H鏈可變區(qū)的抗體，因此即使是沒有pl差的不同的H鏈可變區(qū)，通過與pl值不同的亞類的H鏈恒定區(qū)連接，也可以通過離子交換色語分離雙特異性抗體。另外，具有不同的H鏈可變區(qū)時，通過與實施例9所示的向可變區(qū)導(dǎo)入突變的技術(shù)組合，可以使分子間的pl差進(jìn)一步增大，可以更容易地分離純化。難以向H鏈可變區(qū)導(dǎo)入突變時，可以將它們變換為天然存在的IgG亞類序列，無需考慮抗原性而可以通過離子交換色譜分離純化雙特異性抗體。[實施例14]亞類雜合抗體制備純化品的等電聚焦電泳為了評價制備品的純度，通過等電聚焦電泳實施分析。等電聚焦電泳如下進(jìn)行。使用PhastsystemCassette(AmerchamBioscience制備)，用以下的溶脹液用使Phast-GelDryIEF(AmerchamBioscience制備)凝膠溶脹約30分鐘。MilliQ水1.5mLPharmalyte5-8forIEF(AmerchamBioscience制備)50jaLPharmalyte8-10.5forIEF(AmerchamBioscience制備)50|iiL4吏用溶月長的凝月交，通過Phastsystem(AmerchamBioscience制備)，按照以下程序進(jìn)行電泳。樣品是在步驟2添加到凝膠中。pl標(biāo)志使用pl校正曲線試劑盒(AmershamBiosciences)。步驟l:2000V2.5mA3.5W15°C75Vh步驟2:200V2.5mA3.5W15°C15Vh步驟3:2000V2.5mA3.5W15°C410Vh電泳后的凝膠用20°/。TCA固定，然后用Silverstaining試劑盒、蛋白質(zhì)(AmershamBiosciences),4妄照試劑盒所附的說明書進(jìn)行銀染。亞類雜合抗體制備純化品的分析結(jié)果如圖21所示。通過離子交換色譜，可以純化至幾乎不含有各亞類的均二聚體。亞類雜合抗體制備純化品的活性評價15-1.表達(dá)人gpl30的BaF3細(xì)胞抹、共表達(dá)人gpU0/人IL-6受體的BaF3細(xì)胞林的建立為了獲得顯示依賴IL-6的增殖性的細(xì)胞林，如下所示，建立表達(dá)人gpl30的BaF3細(xì)胞才朱。通過PCR擴(kuò)增全長人gpl30cDNA(Hibi等人，Cell1990,63:1149-1157(GenBank#NM—002184))，除去pCHOI的DHFR基因表達(dá)位點，克隆到插入了博來霉素抗性基因表達(dá)位點的表達(dá)載體pCOS2Zeo上，構(gòu)建pCOS2Zeo/gp130。將10昭pCOS2Zeo/gp130與懸浮在PBS中的BaF3細(xì)胞(0.8x107個細(xì)胞)混合，用GenePulser(Bio-Rad)、以0.33kV、950pFD的容量施加脈沖。通過電穿孔處理導(dǎo)入基因的BaF3細(xì)胞在含有0.2ng/mL小鼠白細(xì)胞介素-3(Peprotech)、10%胎牛血清(以下稱為FBS,HyClone)的RPMI16540培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)過夜，加入10ng/mL人白細(xì)胞介素-6(R&D)、100ng/mL人白細(xì)胞介素-6可溶性受體(R&D系統(tǒng))和含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，建立表達(dá)人gp130的BaF3細(xì)胞抹(以下稱為BaF3/gp130)。15-2.亞類雜合抗體制備純化品對人IL-6的中和活性的評價使用顯示IL-6依賴性增殖的BaF3/gp130，如下所示評價IL-6中和活性。將純化的未修飾人源化PM-1抗體、未修飾/IgG4化人源化PM-1亞類雜合抗體以及IgG4化人源化PM-1抗體用含有10%FBS的RPMI1640稀釋為10jiig/mL,使用該溶液，制備稀釋倍率3、共7個系列的稀釋液，以各50pL分注到96孔板(CORINIG)的各孔中。接著，將BaF3/gp130用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次，懸浮于60ng/mL人白細(xì)胞介素-6(TORAY)、60ng/mL可溶性人IL-6受體(本公司制備)和含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為5xl()4個細(xì)胞/mL,以各50^L在各孔中混合后分注抗體樣品。人可溶性IL-6受體按以下方法制備。將編碼人可溶性受體IL-6受體的第1號至笫344號氨基酸的基因?qū)氲紺HO細(xì)胞中，然后從培養(yǎng)上清中純化并制備。在3TC、5%C02條件下培養(yǎng)72小時，以20itiL/孔加入用PBS稀釋為2倍的WSTJ試劑(CellCountingKit-8、林式會社同仁化學(xué)研究所)，立即使用SUNRISECLASSIC(TECAN)測定450nm的吸光度(參照波長620nm)。培養(yǎng)2小時后再次測定450nm的吸光度(參照波長620nm),以2小時的吸光度變化作為指標(biāo)評價IL-6的中和活性。結(jié)果如圖22所示，制備純化的未修飾人源化PM-1抗體、未修飾/IgG4化人源化PM-1亞類雜合抗體、以及IgG4化人源化PM-1抗體與人源化PM-1抗體純化品(批量)的中和活性同等。以上顯示，亞類雜合抗體未喪失原來的抗原結(jié)合能力，并具有中和抗體的功能。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的方法中，氨基酸的置換數(shù)為少數(shù)即可不使其結(jié)構(gòu)、功能(活性)改變，可以控制等電點，由此，通過使用常用的色譜柱，可以高效地且達(dá)到作為藥物開發(fā)的高純度地純化雙特異性抗體，在開發(fā)雙特異性抗體作為藥物方面的有用性非常高。57通過使用本發(fā)明的方法，可以高效地獲得實際保持活性的雙特異性抗體。權(quán)利要求1.多特異性抗體的制備方法，所述多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，該制備方法包含以下步驟(a)修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中之一，使第1多肽與第2多肽的等電點產(chǎn)生差異；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其表達(dá)該核酸；(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多特異性抗體。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)的修飾是修飾核酸，使第1多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色譜法進(jìn)行分析而形成分離的峰。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述笫1多肽和上述第2多肽含有重鏈可變區(qū)。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中，上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體。5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重鏈恒定區(qū)。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重鏈恒定區(qū)是等電點互不相同的重鏈恒定區(qū)。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，上述等電點不同的重鏈恒定區(qū)是IgGl和IgG4、或IgGl和IgG2。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述多特異性抗體是雙特異性抗體。9.多特異性抗體，該多特異性抗體通過權(quán)利要求1所述的方法制備。10.多特異性抗體的純化方法，該多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，其純化方法如下(a)修飾編碼第1多肽的氨基酸殘基的核酸和編碼第2多肽的氨基酸殘基的核酸兩者或其中之一，使第1多肽與第2多肽的等電點產(chǎn)生差異；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其表達(dá)該核酸；(C)通過標(biāo)準(zhǔn)的色譜法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中純化該多特異性抗體。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，步驟(a)的修飾是修飾核酸，使第1多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色譜法進(jìn)行分析而形成分離的峰。12.權(quán)利要求10所述的方法，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重鏈可變區(qū)。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中，上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽，上述第1多肽和第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體。14.權(quán)利要求10-13中任一項所述的方法，其中，上述第l多肽和上述第2多肽含有重鏈恒定區(qū)。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述第1多肽和第2多肽中所含的重鏈恒定區(qū)是等電點互不相同的重鏈恒定區(qū)。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中，上述等電點不同的重鏈恒定區(qū)是IgGl禾口IgG4、3戈IgGl和IgG2。17.權(quán)利要求10所述的方法，其中，上述多特異性抗體是雙特異性抗體。18.多特異性抗體的制備方法，該方法包含通過權(quán)利要求10所迷的方法進(jìn)行純化的步驟。19.多特異性抗體，該抗體通過權(quán)利要求18所述的方法制備。20.多特異性抗體，該多特異性抗體含有第1多肽和第2多肽，第1多肽含有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)，選自該重鏈可變區(qū)的按照Kabat編號的第10號、12號、23號、39號、43號和105號氨基酸殘基、或者該重鏈恒定區(qū)的按照EU編號的第137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基具有電荷，第1多肽與第2多肽的等電點互不相同。21.權(quán)利要求20所述的多特異性抗體，其中，第2多肽含有重鏈可變區(qū)和/或重鏈恒定區(qū)，選自該重鏈可變區(qū)的按照Kabat編號的第10號、12號、23號、39號、43號和105號氨基酸殘基、或者該重鏈恒定區(qū)的按照EU編號的第137號、196號、203號、214號、217號、233號、268號、274號、276號、297號、355號、392號、419號、435號氨基酸殘基的至少一種氨基酸殘基，具有與選自上述第1多肽中所含的重鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)中的具有電荷的氨基酸殘基相反的電荷、或者不具有電荷。22.權(quán)利要求20所述的多特異性抗體，其中，具有上述電荷的氨基酸殘基和與該氨基酸殘基具有相反電荷的氨基酸殘基的組合分別選自下述(a)或(b)的任意組中所含的氨基酸殘基(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D);(b)賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)。23.多特異性抗體，該多特異性抗體中的第1多肽和第2多肽的等電點有差異，第1多肽的均多聚體、第2多肽的均多聚體、以及第1多肽與第2多肽的雜合多聚體通過使用標(biāo)準(zhǔn)的色譜法進(jìn)行分析而形成分離的峰。24.權(quán)利要求23所述的多特異性抗體，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重鏈可變區(qū)。25.權(quán)利要求24所述的多特異性抗體，其中，上述多特異性抗體含有含輕鏈可變區(qū)的第3多肽，上述第1多肽和上述第2多肽分別與該第3多肽形成多聚體。26.權(quán)利要求23-25中任一項所述的多特異性抗體，其中，上述第1多肽和上述第2多肽含有重鏈恒定區(qū)。27.權(quán)利要求26所述的多特異性抗體，其中，上述第l多肽和第2多肽中所含的重鏈恒定區(qū)是等電點互不相同的重鏈恒定區(qū)。28.權(quán)利要求27所述的多特異性抗體，其中，上述等電點不同的重鏈恒定區(qū)是IgGl和IgG4、或IgGl和IgG2。29.權(quán)利要求23所述的多特異性抗體，其中，上述多特異性抗體是雙特異性抗體。30.組合物，該組合物含有權(quán)利要求23-29中任一項所述的多特異性抗體和可藥用的載體。31.核酸，該核酸編碼構(gòu)成權(quán)利要求23-29中任一項所述的多特異性抗體的多肽。32.宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞具有權(quán)利要求31中所述的核酸。33.權(quán)利要求23-29中任一項所述的多特異性抗體的制備方法，該制備方法包含培養(yǎng)權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞的步驟；從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽的步驟。34.權(quán)利要求25所述的多特異性抗體，其中，第1多肽的可變區(qū)含有以下(al)-(a7)中任一項所述的氨基酸序列，第2多肽的可變區(qū)含有以下(bl)-(b3)中任一項所述的氨基酸序列，第3多肽的可變區(qū)含有以下(c1)或(c2)中所述的氨基酸序列(al)SEQIDN0.7(a2)SEQIDN0.8(a3)SEQIDN0.9(a4)SEQIDNO.10(a5)SEQIDNO.11(a6)SEQIDNO.12(a7)SEQIDNO:13(bl)SEQIDNO.14(b2)SEQIDNO.15(b3)SEQIDNO.16(cl)SEQIDNO.17(c2)SEQIDNO.18。35.權(quán)利要求34所述的多特異性抗體，其中，第1多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.11的氨基酸序列，第2多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.16的氨基酸序列，第3多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.n的氨基酸序列。36.權(quán)利要求34所述的多特異性抗體，其中，第l多肽的可變區(qū)含有SEQIDN0.12所述的氨基酸序列，第2多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.16的氨基酸序列，笫3多肽的可變區(qū)含有SEQIDNO.18的氨基酸序列。37.權(quán)利要求34-36中任一項所述的多特異性抗體，其中，第l多肽和第2多肽含有人IgG4恒定區(qū)，第3多肽含有人k恒定區(qū)。全文摘要本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了高效純化雙特異性抗體的方法對于構(gòu)成雙特異性抗體的2種抗體，通過修飾存在于抗體可變區(qū)表面的氨基酸，在2種抗體的H鏈之間導(dǎo)入等電點差異，利用等電點差異，用色譜柱高效純化雙特異性抗體。還發(fā)現(xiàn)向等電點有差異的抗體的恒定區(qū)整合各抗原結(jié)合部位(重鏈可變區(qū))，使它們共表達(dá)，用色譜柱高效純化雙特異性抗體。文檔編號C12N15/09GK101460622SQ20078002012公開日2009年6月17日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日發(fā)明者井川智之,角田浩行申請人:中外制藥株式會社