專利名稱：用于治療病理性失調(diào)的病毒衣殼蛋白及其任意肽或者組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療與參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白失活有關(guān)的失調(diào)的組合
物和方法。更特別的，本發(fā)明涉及病毒衣殼蛋白，優(yōu)選的SV40VP1或者其 任意肽、片段、突變體和混合物在治療這類病理性失調(diào)的組合物和方法中的 用途。
背景技術(shù)：
本申請?zhí)峒暗乃谐霭嫖锞暾胱鳛閰⒖?，包括其中引用的所有?考文獻(xiàn)。
病毒(最終的寄生蟲)奪取了許多細(xì)胞功能進(jìn)行它們自己的增殖[Munther etal., Science's STKE 335:1-13 (2006)]。 一旦它們結(jié)合細(xì)胞，在它們開始利用 細(xì)胞機器表達(dá)和復(fù)制之前，它們就觸發(fā)多個級聯(lián)事件，以便進(jìn)行細(xì)胞侵入、 運輸和分解。被感染病毒激活的一些因子參與關(guān)鍵過程諸如炎性應(yīng)答和細(xì)胞 死亡。
在病毒基因組分解和表達(dá)前發(fā)生的非常早期的事件很可能是被病毒外殼 觸發(fā)的。因此病毒衣殼可以被用于激活可能具有治療作用的細(xì)胞機理。
SV40(以及多瘤病毒和乳頭瘤病毒家族的其他成員)在感染后誘導(dǎo)伴侶蛋 白(chaperones)[Ioannis et al., FEBS Letters 355:282-286 (1994); Cripe et al., J. Virol. 69:7807-7813 (1995); Chromy et al., PNAS 100:10477-10482 (2006)和其 中的參考文獻(xiàn)]，可能因為它們利用宿主伴侶蛋白進(jìn)行分解(和組裝)。本發(fā)明 令人驚訝地顯示，伴侶蛋白是被衣殼蛋白或者病毒結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)的，而不是 被病毒調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)。伴侶蛋白被提議用于改善嚴(yán)重的疾病諸如AEDS (急性 呼吸窘迫綜合征)和AKI (急性腎損傷)，其先前被稱為ATN (急性腎小管壞 死)。尤其是，通過對模型ARDS大鼠的基因治療實現(xiàn)的HSP70的異位表達(dá) 顯示改善效果[Weiss et al.， the J. Clin. Invest 110:801-806 (2002)]。因此，本發(fā) 明人檢測了通過SV40誘導(dǎo)伴侶蛋白來治療這些疾病的可能性。本發(fā)明清楚 的顯示，在AKI小鼠模型中SV40衣殼(VLP)顯著地改善病理癥狀，因此適用 于治療急性腎功能衰竭(ARF)。這個特殊實例(ARF)清楚確定了在各種器官中利用病毒衣殼蛋白，特別是SV40 VP1治療與細(xì)胞質(zhì)量控制機制功能失常有
關(guān)的任意其他失調(diào)的可行性。
因此本發(fā)明的一個目的是提供病毒衣殼蛋白VP1、 VP2和VP3，優(yōu)選的 SV40VP1或者其任意肽、突變體、片段和混合物作為組合物的活性成分，用 于治療病理性失調(diào)，優(yōu)選的是與細(xì)胞蛋白失活有關(guān)的失調(diào)。這類細(xì)胞蛋白優(yōu) 選的是參與質(zhì)量控制過程的蛋白，諸如伴侶蛋白。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療與細(xì)胞蛋白失活有關(guān)的失調(diào)的方法，所 述細(xì)胞蛋白優(yōu)選的是參與質(zhì)量控制過程的蛋白，諸如伴侶蛋白。
本發(fā)明的另 一個目的是通過增加參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白(諸如伴 侶蛋白)，提供增強所述細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)的改善作用的方法。
在另一個目的中，本發(fā)明提供SV40衣殼蛋白或者包括所述衣殼蛋白的 SV40 VLP在制備治療病理性失調(diào)的組合物中的用途，所述失調(diào)優(yōu)選的是免疫 相關(guān)失調(diào)或者神經(jīng)變性失調(diào)。
隨著說明的進(jìn)行本發(fā)明的這些和其他目的將逐漸清楚。
發(fā)明概述
在第一個方面，本發(fā)明涉及治療病理性失調(diào)的藥物組合物。本發(fā)明的組 合物包括治療有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片 段，或者包括至少一種衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的任意VLP 作為活性成分。
應(yīng)當(dāng)注意到盡管本發(fā)明的組合物預(yù)期用于治療病理性失調(diào)，但它不是預(yù) 期用作抗產(chǎn)生所述衣殼蛋白的病毒的疫苗。
根據(jù)一個實施方式，病毒衣殼蛋白可以是乳頭瘤病毒或者多瘤病毒的任 意衣殼蛋白或者其任意片段、肽、突變體、任意混合物和組合。
根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1、 VP2、 VP3 和其任意肽、突變體、.片段、任意混合物和任意組合中的至少一種，或者包 括所述SV40衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段中至少一種的任意 VLP。最優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1或者其任意肽、突變體或者 片段。突變SV40VP1分子的特定實例可以是VP1AC突變體，優(yōu)選的，所述 突變分子包括基本上由SEQ ID N0.4表示的氨基酸序列。
理性失調(diào)諸如神經(jīng)變性失調(diào)或者免疫相關(guān)失調(diào)。應(yīng)當(dāng)注意到本發(fā)明組合物治療的病理性失調(diào)優(yōu)選的是與細(xì)胞蛋白失活有關(guān)的失調(diào)，優(yōu)選的是與伴侶蛋白 失活有關(guān)的失調(diào)，所述細(xì)胞蛋白參與細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量控制過程。
在第二個方面，本發(fā)明涉及在有需要的患者中治療病理性失調(diào)的方法。
該方法包括給被治療的患者施用治療有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其 任意肽、突變體或者片段或者包括相同物質(zhì)的任意VLP，或者包括相同物質(zhì) 的組合物的步驟。
在第三個方面，本發(fā)明涉及增強細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)的改善作用的方 法，所述細(xì)胞蛋白參與質(zhì)量控制過程。該方法包括將從患有病理性失調(diào)的患 者獲得的細(xì)胞與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者 片段，或者有效量的包括相同物質(zhì)的VLP接觸的步驟。
在第四個方面，本發(fā)明涉及至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變
的用途。
利用下列附圖和實施例進(jìn)一 步描述本發(fā)明。 附圖簡述


圖1A-1C在昆蟲細(xì)胞中制備重組VLP
(A)VLP和(B)野生型SV40，用1%磷鴒酸鹽，pH 7染色后在電子顯微鏡下 觀察。(C)純化VLP的PAGE分析，考馬斯染色。縮寫Prot.(蛋白)。
圖2A-2B.在培養(yǎng)的CV1細(xì)胞中SV40 VLP上調(diào)Hsp/c70
按照50 ng和500 ng每106個細(xì)胞用SV40 VLP處理CV1細(xì)胞。(A)按 照圖上方顯示的不同時間點收集細(xì)胞總蛋白，并利用抗hsp/hsc70蛋白的單克 隆抗體的Western印跡進(jìn)行分析。對照HS-CV1細(xì)胞，在45。C熱休克90分 鐘，C-未處理的對照。(B)用50 ng VLP處理的CV1細(xì)胞，抗Hsp/c70抗體 免疫染色，并在共焦顯微鏡下觀察?？s寫moc.(模擬)。
圖3A-3C.人胚胎腎(HEK)細(xì)胞
在感染VLP的時候，利用終濃度20 |ag/ml的依托泊甙(etoposide)處理細(xì) 胞。VLP的濃度是50ng每l(^個細(xì)胞。(A)顯示對照；(B)顯示用依托泊戒處 理和(C)顯示用依托泊戒和SV40VPl's處理?？s寫cont.(對照)。
圖4A-4B.在小鼠中SV40靶向于腎
通過尾靜脈注射100 jil體積的108感染性單位(pfb)的SVluc載體[Arad， U. Virology 304:155-159 (2002)]后48小時的小鼠腎縱切面。利用作為一抗的抗
SV40 VP1 [Sandalon and Oppenheim, Virology 237:414-421(1997)]和HRP標(biāo)記的抗兔二抗對腎組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)法。褐色的染色表示腎小管上皮細(xì)胞
的VP1攝取。PBS注射的對照沒有顯示染色。(A)顯示10 x放大，和(B)顯示 40 x放大。
圖5.腎毒性的小鼠模型
給BALB/C雌性小鼠腹腔內(nèi)(IP)施用指定濃度的HgCl2,在指定天數(shù)從尾 靜脈取血，并利用Reflotron尿素試驗(Roche)測量尿素水平。每組動物的數(shù)量 顯示在括號中。條形(bars)表示標(biāo)準(zhǔn)差?？s寫bl.Ur.(血尿素)，sh. (sham)。
圖6.保護培養(yǎng)的小鼠腎小管細(xì)胞(tubularkidneycells)免受HgCl2損傷
用HgCl2 (A)或者HgCl2和SV40 VLP(B)處理培養(yǎng)的小鼠腎小管細(xì)胞，在 顯微鏡下觀察。
圖7A-7C. SV40 VLP治療小鼠的存活率
(A)該圖顯示VLP治療增加了 AKI模型小鼠的存活率(No vec.-只有 HgCl2; VLP=VLP+ HgCl2); (B)顯示VLP治療相對未治療AKI動物的存活 率；(C)顯示劑量反應(yīng)。注釋VLP劑量的對數(shù)等級。點下面的數(shù)字表述特定 劑量的動物數(shù)量?？s寫sur.(存活)，D(注射HgCl2后天數(shù))，sh.(sham)。 圖8A-8B.突變的SV40VP1衣殼蛋白VP1AC保護AKI小鼠 (A)突變蛋白(a), (b)的制備-來自兩批不同的VP1 △ C樣品被注射給小鼠。 在MES緩沖液中進(jìn)行PAGE,并通過銀染檢測蛋白。M-SeeBlue分子標(biāo)記物 (Invitrogen)。 (B)存活實驗。縮寫Prot,(蛋白)，Sur.(存活)，sh. (sham)。 圖9A-9C.不同臨床指征(disease parameters)中的SV40 VLP保護作用 (A)注射HgCl2 3天后拍攝的腎大體形態(tài)。(B)第4天利用針對尿素的 Reflotron試劑盒和肌酸酐試驗(Roche)分別測量血清尿素(左)和肌酸酐(右)水 平。注意到sham組和只接受VLP治療的組的血清肌酸酐低于檢測水平。單 尾Student's t-檢驗的結(jié)果對于血尿素是PK).0008，對于肌酸肝是P=0.035。每 組動物的數(shù)量標(biāo)示在下方。(C) VLP治療的AKI和未治療AKI小鼠的血清尿 素。每組動物的數(shù)量顯示在括號中。條形表示標(biāo)準(zhǔn)誤差?？s寫N. an (動物 的數(shù)量)，D.(天數(shù))，sh.(sham)。 圖10.汞-誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激
利用TBARS分析測量硫代巴比土酸反應(yīng)物的水平[Esterbauer， H. and Cheeseman, KH. Methods Enzymol. 186:407-421 (1990)]。給小鼠注射6.5 mg/kg HgCl2,用或者不用0.3 mg/kg VLP治療。在每個柱圖下顯示每組的數(shù)量?？s 寫N.an(動物的數(shù)量)，sh.(sham)。
9發(fā)明詳述
在第一個方面，本發(fā)明涉及治療病理性失調(diào)的藥物組合物。本發(fā)明的組 合物包括治療有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其的肽、突變體或者片段， 或者包括至少一種衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP作為活性 成分。
應(yīng)當(dāng)注意到盡管本發(fā)明的組合物預(yù)期用于治療病理性失調(diào)，但它不是被 用作抗病毒的疫苗，其中所述衣殼蛋白來自于所述病毒。因此，考慮到該組 合物不是用作疫苗或者用于接種被治療的患者，本發(fā)明的組合物是用于病理 性失調(diào)的治療。
根據(jù)一個實施方式，包含的作為活性成分的病毒衣殼蛋白可以是乳頭瘤 病毒或者多瘤病毒衣殼蛋白，或者其任意片段、肽以及混合物和組合中的任 意一種。
乳頭瘤、多瘤和空泡因子(vacuolating agents)似乎形成一組天然的腫瘤病 毒，將它們稱為乳多空病毒組(papova virus group)。歷史上，乳多空病毒這一 名稱來源于兔乳頭瘤病毒，小鼠多瘤病毒，猴(simian)空泡病毒。該組的成員 都是具有雙鏈DNA基因組的無包膜病毒，它們在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行增殖。乳頭瘤 和多瘤病毒是相關(guān)的病毒家族，均具有共同的衣殼結(jié)構(gòu)。對于這兩種病毒來 說，72個殼粒(每個是該主要衣殼蛋白的五聚體)形成一個丁=7的二十面體 晶格。盡管多瘤病毒的主要衣殼蛋白(VP1)和乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白(L1) 完全缺乏序列同源性，但存在這種結(jié)構(gòu)相似性。
到目前為止已經(jīng)鑒定了人乳頭瘤病毒(HPV)的70個毒抹。已知這些病毒 在引發(fā)疣(尋常的疣和生殖器疣)中起作用，并且與癌癥有關(guān)。大多數(shù)人在一生 中都會被HPV的一些毒抹感染。兩種結(jié)構(gòu)蛋白形成乳頭瘤病毒的衣殼。主要 結(jié)構(gòu)蛋白Ll是衣殼的結(jié)構(gòu)決定簇，排列在72個五聚體的360拷貝中。估計 每個衣殼中存在12拷貝的次要結(jié)構(gòu)蛋白L2。已經(jīng)證明了 L2在與細(xì)胞表面受 體的相互作用以及病毒體攝取中的可能作用。L2定位于亞核結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu) 域被確定為核結(jié)構(gòu)域IO(NDIO)。
因此，根據(jù)一個具體實施方式
，乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll和L2可以被用 作本發(fā)明組合物的活性成分。多瘤病毒家族的小、無包膜、二十面體DNA病 毒的典型代表是小鼠多瘤病毒、猴病毒40(SV40)、人BK病毒和人JC病毒。 與大部分DNA病毒一樣，多瘤病毒衣殼蛋白在胞漿中合成，而病毒體的組裝 只在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生。多瘤病毒衣殼由主要衣殼病毒蛋白(VP1)的72個五聚體(殼粒)組成，其按照^50nm直徑的T-7二十面體晶格排列。 一種次要衣殼蛋 白VP2或者VP3在每個VP1的中央5倍體腔(5-fold cavity)結(jié)合，VP2或者 VP3在每個VP1五聚體的中央5倍體腔結(jié)合。病毒體的原子結(jié)構(gòu)顯示每個 VP1單體的C端結(jié)構(gòu)域"侵入"相鄰的五聚體形成重要的五聚體間接觸，這 類接觸被4丐離子穩(wěn)定。
根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1、 VP2、 VP3 和其任意肽、突變體、片段、混合物和組合中的至少一種，或者包括所述SV40 VP1、 VP2、 VP3或者其任意肽、突變體或者片段中至少一種的任意VLP。 最優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40VP1或者其任意肽、突變體或者片段。 應(yīng)當(dāng)注意到術(shù)語SV40 VP1蛋白優(yōu)選的是指具有GenBank登錄號NP—043126 GI: 96 28426所示氨基酸序列的VP1蛋白，其在此引入作為參考。根據(jù)特別 優(yōu)選的實施方式，SV40VP1衣殼蛋白包括SEQIDNO:l所示的氨基酸序歹'J。
SV40是一種小的雙鏈DNA靈長類動物多瘤病毒，具有5.2 kb的微小染 色體。病毒衣殼由3種被病毒編碼的蛋白VP1、 VP2和VP3組成，這些蛋白 包繞所述微小染色體。通過在染色質(zhì)周圍逐漸加入并排列衣殼蛋白進(jìn)行包裝。 一般認(rèn)為病毒染色質(zhì)和VP1衣殼由病毒蛋白VP2和VP3連接。鄰近VP3羧 基端的結(jié)構(gòu)域在體外顯示與VP1相互作用。另一種病毒晚期蛋白是晚期16S mRNA前導(dǎo)區(qū)編碼的agnoprotein或者LP1 。發(fā)現(xiàn)這種小(61個氨基酸)蛋白介 導(dǎo)VP1有效的定位到核區(qū)，并且促進(jìn)成熟病毒從感染細(xì)胞的釋放。
應(yīng)當(dāng)理解任何突變的病毒衣殼蛋白，優(yōu)選的是VP1分子，只要它們能提 高伴侶蛋白水平、增強細(xì)胞存活機制并保護細(xì)胞抵抗凋亡或者氧化應(yīng)激，就 都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的組合物和方法可以使用的病毒衣殼蛋白突變體或者其衍生物可 以具有選自下列組的至少一種突變點突變、錯義突變、無義突變、插入、 缺失或者重排。應(yīng)當(dāng)理解本文使用的術(shù)語"插入"和"缺失"是指本發(fā)明的 病毒衣殼蛋白分別任意添加或者缺失1-100個氨基酸殘基，優(yōu)選的1-50個氨 基酸殘基，和最優(yōu)選的，l-20個氨基酸殘基。
根據(jù)一個具體實施方式
，突變的SV40 VP1分子可以是在其羧基端臂缺 失的VP1分子。這類特定的突變分子可以是突變體VP1AC。根據(jù)特別優(yōu)選 的實施方式，該突變的VP1分子包括基本上由SEQIDN0.4表示的氨基S吏序 列。應(yīng)當(dāng)理解其他突變，包括缺失或者插入，例如可以是位于連接P鏈的VPl 表面環(huán)上的那些，也屬于本發(fā)明的范圍。預(yù)期這類突變可以比野生型VP1更 有效的激活伴侶蛋白機制和/或存活途徑，以及保護細(xì)胞抵抗凋亡或者氧化應(yīng) 激。還應(yīng)當(dāng)注意影響VPl或者VPl衍生物結(jié)構(gòu)的任意其他突變，只要使它們 具有延長的體內(nèi)作用，也屬于本發(fā)明的范圍。
才艮據(jù)一個具體實施方式
，本發(fā)明的組合物可以包括野生型VPl、 VPl AC
突變體和任意上述其他突變體的任意組合。
應(yīng)當(dāng)注意到本發(fā)明的組合物和方法使用的病毒衣殼蛋白可以是天然或者 合成的、修飾或者未修飾的、完整的或者其片段。片段可以來源于片段的合
優(yōu)選的，可以重組制備病毒衣殼蛋白。重組衣殼蛋白的制備涉及使用本 領(lǐng)域公知的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)。這類技術(shù)包括例如，將編碼所需病毒衣殼
蛋白的基因克隆到合適的表達(dá)載體。優(yōu)選的重組SV40 VPl衣殼蛋白可以利 用原核表達(dá)系統(tǒng)制備，優(yōu)選的利用細(xì)菌或者真核表達(dá)系統(tǒng)。最優(yōu)選的在真核 表達(dá)系統(tǒng)中制備衣殼蛋白，諸如在實驗步驟中描述的桿狀病毒系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)注 意到Sandalon等[Sandalon(1997)出處同上]詳細(xì)描述了這些載體的構(gòu)建，這是 本發(fā)明人先前的出版物，在此引入作為參考。
還應(yīng)當(dāng)注意到本發(fā)明組合物使用的衣殼蛋白，特別是SV40 VPl ，可以是 解離的VPl五聚體或者包括VPl和其他SV40衣殼蛋白的病毒樣粒子(VLP， 如圖l所示)，或者可選的，只包含VP1。此外，應(yīng)當(dāng)理解病毒衣殼蛋白可以 與任意其他病毒蛋白諸如agn叩rotein或者任意其他能促進(jìn)它們的作用的蛋白 混合。此外，應(yīng)當(dāng)注意到為了制備所述SV40 VPl蛋白的解離五聚體或者片 段，可以使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明還包括任意融合蛋白在本發(fā)明任一組合物中作為 活性成分的用途，所述融合蛋白包括所述VP1或者VPl的任意突變體(例如， VPIAC)。
根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，，利用本發(fā)明組合物治療的病理性失調(diào)可 與參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白的失活有關(guān)，因此可以通過激活這類蛋白得 到改善。
新合成的蛋白具有線樣結(jié)構(gòu)(string-like structure),所述線必須在空間上充 分折疊以便生成的蛋白正常起作用。因此，稱為"分子伴侶，，的分子存在于 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)幫助蛋白線(strings)的空間充分折疊。但是，有時甚至在分子伴倡的幫
12助下蛋白也沒有充分折疊。這類不正常的蛋白被排除出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，并在稱 為"蛋白酶體，，的蛋白降解工廠中分解。也就是說，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有從折疊蛋白 中區(qū)別未正確折疊的蛋白的功能，以便去除不正常的蛋白。這種功能機制被 稱作"內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)量控制機制"。如果這種機制被破壞，細(xì)胞將無法 區(qū)分何種蛋白是正確的"產(chǎn)物"，從而誘導(dǎo)嚴(yán)重的、危急生命的損害。
更特別的，在活細(xì)胞中，新制備和先前存在的多肽鏈一直有錯誤折疊和 聚集的風(fēng)險。根據(jù)錯誤折疊形式的廣泛多樣性，進(jìn)化出精密的質(zhì)量控制策略 來對抗這些不可避免的差錯。最近的報道描述了聚集物從胞漿的去除，揭示
了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)量控制機制，并提供對兩種類型的分子伴侶Hsp70系統(tǒng)和 AAA+ (HsplOO)解疊酶的新的了解。
如上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)負(fù)責(zé)橫貫分泌途徑的大約四分之一蛋白質(zhì)組的結(jié) 構(gòu)成熟。ER使用兩種獨特的機制對錯誤折疊形式的存在進(jìn)行應(yīng)答。第一種是 ER專有的應(yīng)激應(yīng)答，稱為解折疊(unfolded)蛋白應(yīng)答(UPR),其作用于重建 ER以便增加其折疊能力。在酵母中，ER的折疊能力由IRE1監(jiān)控，IRE1是 一種非常保守的跨膜激酶，其包含負(fù)責(zé)檢測錯誤折疊形式的lumenal結(jié)構(gòu)域 并包含細(xì)胞溶質(zhì)激酶和核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域。ER內(nèi)錯誤折疊蛋白的積聚導(dǎo)致 IRE激酶的激活。
第二種，稱為ER相關(guān)的降解(ERAD),其特異識別末端錯誤折疊的蛋白， 并將它們逆向轉(zhuǎn)移(retrotranslocates)穿過ER膜進(jìn)入胞漿，在那里它們可被泛 素蛋白酶體降解體系降解。與在ER中折疊的蛋白的多樣性對應(yīng)，最近的研 究證明ER相關(guān)的降解(ERAD)包括許多不同的系統(tǒng)，每個系統(tǒng)負(fù)責(zé)具有相同 物理性能的蛋白亞群的降解。這在酵母中表現(xiàn)的最明顯，在那里存在至少兩 種獨特的監(jiān)控機制用于識別末端錯誤折疊的ER蛋白。第一種，稱為ERAD-L， 檢查包含錯誤折疊的lumenal結(jié)構(gòu)域的蛋白。第二種，稱為ERAD-C,檢測跨 膜蛋白的錯誤折疊的細(xì)胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域。盡管這兩種途徑最終匯集到泛素-蛋白 酶體降解系統(tǒng)，但它們依賴于不同組的ER-相關(guān)組分檢測錯誤折疊的蛋白并 將其輸送到胞漿。就ERAD-C (但不是ERAD-L)而言，降解通常依賴于細(xì)胞 溶質(zhì)伴侶蛋白的特定亞組，包括Hsp70和Hsp40成員。
最近的研究鑒定了兩種不同的定位于ER的外源凝集素，它們在ERAD 中起著重要作用。第一種與甘露糖苷酶蛋白有關(guān)，負(fù)責(zé)ER內(nèi)N-聚糖的修飾， 但看來失去了其催化活性。第二種外源凝集素Yos9p與錯誤折疊的蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，Yos9p的丟失將導(dǎo)致錯誤折疊糖蛋白的降解的重大且特異性 的缺陷。
泛素-蛋白酶體途徑可能是去除具有聚集傾向的蛋白的主要途徑。現(xiàn)在看 來泛素^^飾實際上可以募集聚集的蛋白，通過一種獨立的機制"自P笪，，途徑 進(jìn)行清除。自噬涉及識別靶蛋白或者細(xì)胞器并將其包裝/吞噬入自噬體嚢泡，
該嚢泡與溶酶體融合，其中嚢泡和它們的內(nèi)容物均被破壞。超過20種所謂的 Atg組分介導(dǎo)該重要的過程。
現(xiàn)在已經(jīng)越來越清楚，即使伴侶蛋白和蛋白水解機器與錯誤折疊的蛋白 存在于相同的小室，體內(nèi)還是存在各種疾病，這些質(zhì)量控制機制失效，錯誤 折疊的蛋白形成聚集物。此外，這類胞內(nèi)聚集物與許多神經(jīng)變性疾病有關(guān)， 諸如亨廷頓氏病，阿爾茨海默氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化和帕金森氏病。對真 核細(xì)胞中蛋白聚集物的性質(zhì)和經(jīng)歷了解得很少。
不受任何理論的約束，下列實施例顯示，病毒衣殼蛋白，尤其是包含VP1 的VLP、 VP1五聚體或者突變的VP1分子，優(yōu)選的，VP1AC突變體，激活 參與質(zhì)量控制過程的蛋白，特別是伴侶蛋白(例如本發(fā)明的HSP/c70所示)， 從而導(dǎo)致被治療的病理性失調(diào)的明顯改善。本發(fā)明利用AKI(急性腎損傷)小鼠 模型(其被正式命名為ATN)清楚證明了病理性失調(diào)的這種改善。
因此，根據(jù)一個具體實施方式
，參與質(zhì)量控制過程的蛋白可以是伴倡蛋 白。例如，下列家族的伴侶蛋白HSP-40, HSP-70， CALNEXIN, BiP， HSP-27, HSP-22, HSP-60, HSP-65, HSP-27， HSP-90。
熱休克蛋白(HSP)被稱為應(yīng)激蛋白(stressprotein)或者分子伴侶，它們通過 折疊合成的或者應(yīng)激變性的蛋白來幫助細(xì)胞拯救(cellrescue)。如上所述，HSP 還被認(rèn)為是各種自身免疫疾病的誘發(fā)因素，所述疾病的病因被認(rèn)為來自于抗 靶分子HSP的免疫應(yīng)答。例如，在患有多發(fā)性硬化(MS)和其他神經(jīng)疾病患者 的腦脊液(CSF)中報道了對HSP60家族蛋白以及HSP70家族蛋白(HSP70和 HSC70)的抗體滴度升高，因此所述抗體滴度升高可能通過改變免疫應(yīng)答和分 子伴侶的細(xì)胞保護功能在MS的病理生理學(xué)中起著重要作用。
在Charcot-Marie-Tooth疾病(CMT)(該疾病是一種最常見的但是異質(zhì)性遺 傳的運動和感覺性神經(jīng)病)和遠(yuǎn)端型遺傳性運動神經(jīng)病(HMN)(這是專一的運 動性神經(jīng)病但也是臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)病)中鑒定出熱休克蛋白27 (HSP27)和HSP22的突變。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)(炎性應(yīng)答的實例)，軍團病(legioner disease) ， GBS (Guillain-Barre綜合征)和足細(xì)胞損傷(podocyte injury)也^皮證明 是與伴侶蛋白功能失常有關(guān)的失調(diào)，因此它們也是可以用本發(fā)明的組合物和 方法治療的失調(diào)。
根據(jù)另 一個實施方式，本發(fā)明的組合物尤其可應(yīng)用于并且適合于治療病 理性失調(diào)諸如神經(jīng)變性失調(diào)或者免疫相關(guān)失調(diào)。應(yīng)當(dāng)注意到，如上所述，利 用本發(fā)明組合物治療的病理性失調(diào)優(yōu)選的是與細(xì)胞蛋白失活有關(guān)的失調(diào)，所 述細(xì)胞蛋白參與細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量控制過程。
更特別地，免疫失調(diào)與Thl-Th2應(yīng)答的失衡有關(guān)，因此免疫相關(guān)失調(diào)可 以是例如，自身免疫病(例如，多發(fā)性硬化(MS), 1型糖尿病，狼瘡，Graves 病和甲狀腺炎)，惡性和非惡性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病， 炎癥以及病原體相關(guān)失調(diào)(諸如由致熱外毒素誘導(dǎo)的中毒性休克、失能和死 亡，膿毒性休克和嚴(yán)重膿毒病)。
炎癥包括任意炎性疾病，其中所述炎性疾病可以是下列疾病中的任意一 個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，哮喘，鼻炎，特發(fā)性肺 纖維化，腹膜炎，心血管炎癥，心肌缺血，再灌注損傷，動脈粥樣硬化，膿 毒病，創(chuàng)傷，II型糖尿病，視網(wǎng)膜病，銀屑病，胃腸炎癥，肝硬化和炎癥性 腸病。
通常，下文描述的本發(fā)明組合物以及方法，可用于治療任意自身免疫病 諸如，但不限于，類重癥肌無力綜合征(Eaton-Lambert syndrome),肺出血腎 綜合征(Goodpasture's syndrome), Greave's病，Guillain-Barr綜合癥，自身免 疫性溶血性貧血(AIHA)，肝炎，胰島素依賴性糖尿病(IDDM),系統(tǒng)性紅斑狼 癡(SLE)，多發(fā)性硬化(MS),重癥肌無力，神經(jīng)叢疾病(plexus disorder)諸如急 性臂神經(jīng)炎，多腺缺陷綜合征，原發(fā)性膽汁性肝硬變，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，硬 皮病，血小板減少，曱狀腺炎諸如橋本氏曱狀腺炎(Hashimoto's disease), Sjogren's綜合癥，過敏性紫癥，銀屑病，混合型結(jié)締組織病，多肌炎，皮肌 炎，血管炎(vasculitis)，多發(fā)性結(jié)節(jié)性動脈炎，風(fēng)濕性多肌痛，眶壞死性肉芽 腫病(Wegener's granulomatosis), Reiter's綜合征，Behget's綜合癥，關(guān)節(jié)強硬 性脊推炎(ankylosing spondylitis),天皰瘡，大皰性類天皰瘡，皰滲樣皮炎，胰 島素依賴型糖尿病，炎癥性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病(Crohn's
15當(dāng)在本文中用于描述本發(fā)明時，術(shù)語"惡性增生性失調(diào)"、"癌癥"、 "肺瘤"和"惡性腫瘤"都與組織或者器官的增生同等相關(guān)。如果組織是淋 巴系統(tǒng)或者免疫系統(tǒng)的一部分，則惡性細(xì)胞可以包括循環(huán)細(xì)胞的非實體瘤。 其他組織或者器官的惡性腫瘤可以產(chǎn)生實體瘤。通常，如下所述的本發(fā)明的
組合物以及方法可用于治療非實體瘤和實體瘤，例如，癌(carcinoma),黑素 瘤，白血病禾口'淋巴瘤。
因此，根據(jù)優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的SV40衣殼蛋白或者包括相同物 質(zhì)的任意組合物可用于治療或者抑制非實體癌，例如造血系統(tǒng)惡性病，諸如 所有類型的白血病，例如急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL),急性髓性白血病 (AML)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL),慢性髓性白血病(CML)，脊髓發(fā)育不 良綜合征(MDS)，月巴大細(xì)胞白血病，毛細(xì)胞白血病，霍奇金氏病，非霍奇金 氏淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤，以及用于治療或者抑制實體瘤 諸如以下位置的腫瘤唇和口腔、咽、喉、鼻旁竇、主要唾液腺、曱狀腺、 食管、胃、小腸、結(jié)腸、結(jié)直腸、肛管、肝、膽嚢、肝外膽管、肝胰管壺腹、, 外分泌胰腺、肺、肋膜的間皮瘤，骨，軟組織肉瘤，皮膚癌和皮膚惡性黑色 素瘤，乳腺，外陰，陰道，子宮頸，子宮體，卵巢，輸卵管，惡性滋養(yǎng)細(xì)胞 腫瘤，陰莖，前列腺，睪丸，腎，腎盂，輸尿管，膀胱，尿道，眼瞼癌，結(jié) 膜癌，結(jié)膜惡性黑色素瘤，葡萄膜惡性黑色素瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，淚腺癌， 眼眶肉瘤，腦，脊髓，血管系統(tǒng)，血管肉瘤和卡波西氏肉瘤。
在另一個具體實施方式
中，下文中描述的本發(fā)明組合物以及本發(fā)明的方 法可用于治療神經(jīng)變性失調(diào)。
"神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，，是一種特征為神經(jīng)元細(xì)胞或者神經(jīng)元支持細(xì)胞異?；?者功能失常的病癥或者疾病。所述失調(diào)能夠影響中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)。示 例性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)病、骨骼^L萎縮和神經(jīng)變性疾病。
"神經(jīng)變性失調(diào)"是復(fù)雜和致命性的疾病，潛伏發(fā)病，隨后是進(jìn)行性衰 退。臨床表現(xiàn)由失調(diào)的部位和嚴(yán)重程度決定。盡管病因可能不同，但患有神 經(jīng)變性失調(diào)的患者很可能顯示定位于腦細(xì)胞的普遍萎縮，導(dǎo)致智力和軀體功 能的損害。示例性的神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默氏病，帕金森氏病， ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化)，亨廷頓氏病，taupathies諸如Pick's病，額顳癡呆 (fronto temporal dementia), 皮質(zhì)基底節(jié)變性(cortico-basal degeneration)和進(jìn)行 性核上性麻痹和海綿狀腦病諸如癢癢癥，瘋牛病和牛海綿狀腦病，
16Creutzfeldt-Jakob病，致死性家族性失目民，Gerstmann隱Straussler-Scheinker綜合
癥和庫魯病。
調(diào)。病原體包括原核微生物，低等真核微生物，復(fù)雜的真核生物，病毒，真 菌，朊蛋白，寄生蟲，酵母，毒素和毒液(venom)。
原核微生物包括細(xì)菌諸如革蘭氏陽性、革蘭氏陰性和革蘭氏可變細(xì)菌以 及胞內(nèi)細(xì)菌。本文預(yù)期的細(xì)菌實例包括以下屬中的種密螺旋體屬(7)^;7o"emfl ),發(fā)b螺、3走體屬(5o7re//a ),、淋3求菌屬(iVez.^en.a ),軍團#干菌屬(丄eg/owe〃a 博德特氏菌菌屬(Borafe&〃a 埃希氏桿菌屬(Esc/zen'c/z/a 沙門氏 菌屬(Sa/mowe〃a s/ .),志賀氏菌屬(57n'ge〃a 克雷伯氏菌屬(《/efo/e〃a s/ .)， 耶爾森氏菌屬(7era/"/a 弧菌屬(W6n'o w.)，嗜血桿菌屬(Hemop/n7w 立克次氏體屬(7 /cfetoz'a 衣原體屬(C7z/am>^/<3 sp.)， 支原體屬
(Jk^co/7/osma s/ .), 葡萄球菌屬(S啤/zy/ococcws 鏈球菌屬(5^印tococcws ".), 芽孑包桿菌屬(5acz'〃M61 s; .)， 梭菌屬(C7oWrWw附 sp,)， 棒桿菌屬 (Co/^weZ)ac&n'ww 5p.), 丙酸才干菌屬(iVop7.o"z,6ac&n'wm s/ .), 分支4干菌屬 (A^co6acten'ww sp.),脈y^體屬(t/reG/ /asmo！ 5/ .)和李其斤對爭菌屬(ZiWen'a 5p.)。
具體的種包括蒼白密螺旋體(7Ve;w"ema / a仏Ww附)，伯氏疏螺旋體 (5。^re/Za 6wrgdc^/^r0 ，'淋3求菌(A^e/Men'a go"on-Zzea)，月鹵月莫炎3求菌(7Vez-^en'a mem'"g7'^fo), 口耆月申軍團菌(丄eg7'owe〃a p"ewwop/n7a)， 百日咳4干菌(5onie&〃a / eWwM^), 大腸牙干菌(5^c/2en'c/z/a co//)，傷寒沙門氏菌(5"a/wowe〃a ^p/ /), 鼠傷 寒沙門氏菌(Sa/mowe〃" (yp/z/ww/wm), 痢疾#干菌(;S7z,ge〃a ，肺炎才干
菌(i^7efe/e〃ap"ewwom'ae), 鼠疫耶爾森氏菌(7era/m'ap&sto)， 霍^U瓜菌(K/6n'o c/ o/erae)， 流感嗜血桿菌(//emopMRy /"/7we"z—， 立氏立克次體(i /cAe咖'" Wcfetoz7)， 沙目艮衣原體(CTz/awj^/z'a frac/zo附"""，月申炎支原、體(Afyco/ /"iw" ， 金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/zy/ococcws Gwrews)， 肺炎鏈球菌 (5VreptococcMs /7wezw7om'ae)，酉良脈4連J求菌(5^ej! tococc^s /^ogewas), 炭癥4干菌 (萬ac/〃w awf/zrac/力，肉毒4干菌(C7osfr/(iz'wm 6ofw//wwm)，石皮傷風(fēng)4干菌(C7ostn.Www etom')， 產(chǎn)氣莢膜#炎菌(C7ostrz.(i/M附/ e yH"gera)， 白p娛4干菌(Co^v"e6acfeWww fi^似/zen'a/)， 痤齊丙酸才干菌(/Vc;pWom'6ac&n'Mm acwe力，結(jié)才亥分才支才干菌 (Afyco6acten.ww ^^e/rw/osz's)， 麻風(fēng)分才支才干菌(Afyco6acfen.wm /e/ rae)和單才亥纟田 月包增生李斯特菌(丄/Wen'" wo"。qytoge"as)。低等真核生物包括酵母或者真菌，諸如但不限于卡氏肺嚢蟲
(PweMw0c3Asto car/""), 白色念J朱菌(Ca"(i/cib a/6/cam1)， 曲霉(^s/ erg77/us), 莢 月莫組織月包漿菌(///sto/ /ay附a capsw/afw附),皮炎芽生菌(B/(xytomyces tfe廠ma份/(5fa)， 新型隱3求菌(0;/; tococciw weq/brwara1)， 發(fā)褲菌(Trichophyton) 和小孑包子菌(Microsporum)。
復(fù)雜的真核生物包括蠕蟲，昆蟲，蜘蛛，線蟲，aemobe,溶組織內(nèi)阿米 巴(五"tomoe6a /^to/少/7'ca), 藍(lán)氏賈第蟲(G/fln/z'a /"wW/a)， 陰道毛滴蟲 (TWc/zowowos vag/"a/^), 岡比亞布氏4偉蟲(7yy/ a"osom(3 6n/cez' gam6/erae),克 氏4,蟲(r^pa"oscww craz/), 結(jié)腸小袋纖毛蟲(5a/a""&ww co//)， 弓形蟲 (roxop/osma go"A7), 隱孑包'子蟲(Cryptosporidium)或者利"f十曼蟲(Leishmania)。
術(shù)語"病毒"使用其廣義，包括以下家族的病毒腺病毒，乳頭瘤和多 瘤病毒，皰滲病毒單純皰滲，水痘-帶狀皰疹，Epstein-Barr， CMV,痘病 毒天花，牛痘(vaccina),乙肝，鼻病毒，曱肝，脊髓灰質(zhì)炎病毒，風(fēng)疹病 毒，丙肝，蟲媒病毒，狂犬病病毒，流感病毒A和B,麻滲病毒，腮腺炎病 毒，HIV， HTLVI和II。
術(shù)語"真菌"包括例如，致病真菌諸如痺，組織胞漿菌病，芽生菌病， 曲霉病，隱J求菌病，孑包子絲菌病，；求孑包子菌病，paracoccidio畫idoinycosis和念 J朱菌病。
術(shù)語寄生蟲包括但不限于，體細(xì)胞絳蟲，肝蛭，組織蛔蟲，阿米巴，和 癡原蟲，錐蟲，利什曼蟲，和弓形蟲造成的感染。
根據(jù)一個具體和優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的組合物預(yù)期用于治療病原體 誘導(dǎo)的病理性失調(diào)。這類失調(diào)可能引起膿毒病，而這可能導(dǎo)致ARF(急性腎功 能衰竭)疾病或者病癥諸如AKI、 ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)和多系統(tǒng)器官衰 竭中的任意一種。
根據(jù)一個具體和優(yōu)選的實施方式，并且實施例3-7清楚的顯示，本發(fā)明 的組合物尤其適于治療ARF,這利用AKI模型得到證明，如上所述ARF是 一種可以通過激活或者添加伴侶蛋白緩解的失調(diào)。
急性腎損傷(AKI),原先被稱為"急性腎小管壞死，，，涉及多種病理生理 機制。直接的腎小管毒性，內(nèi)皮功能障礙伴腎微循環(huán)改變，腎小管低氧損傷， 來自活性氧物質(zhì)的損害，受損的腎小球血液動力學(xué)和局部或者全身的炎癥， 它們共同相互作用形成腎功能障礙，特征為腎小球濾過率(GFR)迅速降低和腎 小管功能缺陷。慢性腎病(CKD)的進(jìn)展也反映了多種病理生理機制，其在原
18發(fā)性腎結(jié)構(gòu)破壞后開始。3種主要的誘導(dǎo)因子(腎小球超過濾、蛋白尿和腎器 質(zhì)性缺氧)通過多種化合物和相互作用機制導(dǎo)致微血管和腎單位的萎縮以及
間質(zhì)性纖維化。CKD進(jìn)展到末期腎衰竭和AKI兩者都造成實質(zhì)上的病態(tài)，并
顯著的增加死亡率，還涉及臨床控制需要的巨額花費。
盡管與這些失調(diào)有關(guān)的生理機制只被部分的了解，但腎器質(zhì)性的凋亡或 者非凋亡細(xì)胞死亡顯然起著重要作用，弱化這些過程的方法是治療性介入的 主要目標(biāo)。 一種這樣的可能的介入是細(xì)胞適應(yīng)機制的誘導(dǎo)，諸如應(yīng)激應(yīng)答基
因，包括熱休克蛋白(HSP)的上調(diào)。這些沿著進(jìn)化樹非常保守的分子在受損蛋 白的整個蛋白酶體降解過程中充當(dāng)受損蛋白的伴侶蛋白[Aufricht, C. Pediatr. Nephrol. 20: 707-713 (2005)]。 HSP被認(rèn)為具有細(xì)胞保護作用，瞬時缺氧或者 熱應(yīng)激對它們的誘導(dǎo)被證明在體外和體內(nèi)均減弱凋亡損害和AKI [Lu， CY. et al, Curr. Opin. Nephrol, Hypertens. 16:83-89(2007)]。
文描述的本發(fā)明方法進(jìn)行治療。
根據(jù)另一個具體實施方式
，提供本發(fā)明的組合物用于治療ARF，尤其是 AKI。
如實施例2和7所示，包括SV40 VP 1的VLP保護腎細(xì)胞免受凋亡，還 可以保護細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。因此，應(yīng)當(dāng)注意到還可以體外(invitro)或者回體 (ex vivo)使用本發(fā)明的組合物從涉及氧化應(yīng)激和凋亡的病理過程中拯救有需 要的患者的細(xì)胞。
術(shù)語凋亡或者程序性細(xì)胞死亡，是多細(xì)胞機體發(fā)育和健康的正常組成。 細(xì)胞死亡是對各種刺激的應(yīng)答，并且細(xì)胞在凋亡期間對各種刺激的應(yīng)答受到 控制和調(diào)節(jié)。這使得凋亡不同于另一種形式的細(xì)胞死亡(稱為壞死)，在壞死中 不受控制的細(xì)胞死亡導(dǎo)致細(xì)胞裂解、炎性應(yīng)答并有可能導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題。 但是，如前文所述， 一些情況下不受控制的凋亡過程可能導(dǎo)致病理性失調(diào)， 例如AKI，因此應(yīng)當(dāng)預(yù)防所述過程。因此本發(fā)明提供減弱有害凋亡過程并誘 導(dǎo)細(xì)胞存活途徑的方法和組合物。
如上所述，本發(fā)明的組合物適用于涉及氧化應(yīng)激的疾病。活性氧的產(chǎn)生 與生物系統(tǒng)輕易使活性中間體解毒或者輕易修復(fù)所致?lián)p害的能力之間的失調(diào) 造成氧化應(yīng)激。所有形式的生命均在其細(xì)胞內(nèi)維持還原環(huán)境。細(xì)胞的氧化還 原環(huán)境由酶維持，所述酶通過代謝能量的恒定輸入維持還原狀態(tài)。對這種正 常氧化還原狀態(tài)的干擾可通過產(chǎn)生過氧化物和自由基引起毒性作用，所述過
19氧化物和自由基損害細(xì)胞的全部組分，包括蛋白、脂和DNA。廣泛多種疾病
都顯示自由基的過量產(chǎn)生、氧化應(yīng)激和不充足的抗氧化活性。神經(jīng)變性疾病
的一些實例是(見下文)，心臟病，HIV病，慢性疲勞綜合癥，肝炎，癌癥，自 身免疫疾病，等等。
如實施例所述，本發(fā)明人未出版的數(shù)據(jù)顯示SV40 VP1從氧化應(yīng)激和凋 亡中拯救細(xì)胞，這可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞存活機制，優(yōu)選的PI3K-PKB/Akt存活途 徑來實現(xiàn)。因此，根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的組合物可以用來在有需要的 患者的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞存活途徑，優(yōu)選的，PI3K-PKB/Akt存活途徑。
應(yīng)當(dāng)注意到PKB/Akt是多種細(xì)胞存活機制中的關(guān)鍵角色。這尤其是在神 經(jīng)變性疾病的潛在神經(jīng)保護中得到證明[Schmeer, C. et al. Restor Neurol Neurosci 24:79-95 (2006)]，所述疾病包括帕金森氏病[Fallon, L. et al. Nat. Cell. Biol. 8:834-842 (2006)],阿爾茨海默氏病[Cole, G.M. et al, Exp. Gerontol. 42:10-21 (2007)],以及中風(fēng)和腦損傷后的神經(jīng)存活[Zhang， X. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26:915-926 (2006)]。其他的實例是抗心肌肥厚[Patten, R.D. and Karas, R.H. Trends Cardiovasc. Med. 16:69- 75(2006)]和腎病[Mitch, W.E. J. Ren.Nutr. 17:66-69 (2007)]的保護。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供用于增強伴侶蛋白對病理性失調(diào)的改善作用的藥 物組合物。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的藥物組合物通常包括緩沖劑(一種調(diào)節(jié)其滲透性的試 劑)，以及可選的，本領(lǐng)域已知的一種或者多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑 和/或添加劑。組合物中還可以添加輔助活性成分。所述載體可以是溶劑或者 分散介質(zhì)，包含，例如，水，乙醇，多元醇(諸如，甘油，丙二醇，和液態(tài)聚 乙二醇，等等)，其合適的混合物，和植物油。例如，通過使用包衣諸如卵磷 脂，就分散劑來說通過維持需要的粒徑以及通過使用表面活性劑，可以維持 適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 本文使用的"藥學(xué)上可接受的載體"包括任意溶劑、分散介質(zhì)、包衣、 抗細(xì)菌劑和抗真菌劑等等。這類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng) 域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或者試劑與活性成分不相容，否則其在治療組 合物中的使用也包括在本發(fā)明中。
在第二個方面，本發(fā)明涉及在有需要的患者中治療病理性失調(diào)的方法。 該方法包括給^f皮治療的患者施用治療有效量的至少 一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括至少一種衣殼蛋白或者其任意肽、突變 體或者片段的VLP，或者包括相同物質(zhì)的組合物的步驟。
本發(fā)明的方法適用于治療患有病理性失調(diào)諸如神經(jīng)變性失調(diào)或者自身免 疫相關(guān)失調(diào)的患者。本文使用的術(shù)語"失調(diào)"是指正常功能存在障礙的病癥。 "疾病，，是身體或者心理的任意反常情況，這造成患者或者與其接觸的人的 不適、功能障礙或者痛苦。有時候該術(shù)語被廣泛使用包括損傷、殘疾、綜合 征、癥狀、偏差行為以及結(jié)構(gòu)與功能的不正常變化，而在其他情況下這些被
認(rèn)為是可區(qū)分的類型。應(yīng)當(dāng)注意到術(shù)語"疾病(disease)"、"失調(diào)(disorder)"、 "病癥(condition)"和"病(illness)"在本文中等同使用。
在說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語"治療(treat, treating, treatment)"表示 在患有病理性失調(diào)的患者中改善疾病活力的 一種或者多種臨床表現(xiàn)。
"治療"是指治療性處理(therapeutictreatment)。那些需要治療的是患有 任意病理性失調(diào)或者自身免疫相關(guān)失調(diào)的哺乳動物患者。"患者"或者"有 需要的患者"表示需要施用本發(fā)明的病毒衣殼蛋白或者任意藥物組合物，以 預(yù)防、克服或者減慢這類傷害的任何哺乳動物。
"預(yù)防性處理(preventive treatment)，，或者"預(yù)防性治療(prophylactic treatment)"是以保護性方式起作用，以抵御或者預(yù)防某事，特別是病癥或者 疾病。
根據(jù)一個實施方式，病毒衣殼蛋白可以是乳頭瘤病毒或者多瘤病毒衣殼 蛋白，或者其任意片段、肽、突變體、任意混合物和組合中的任意一種。優(yōu) 選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1、 VP2、 VP3,和其任意肽、片段、突 變體、混合物和組合中的至少一種。最優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1、其任意肽、突變體或者片段，或者包括SV40 VP1或者其任意肽、突變 體或者片段的任意VLP。
具體實施方式
涉及包括SEQIDNO:l所示氨基S吏序 列的SV40 VP1蛋白。
才艮據(jù)另一個具體實施方式
，突變的SV40 VP1分子可以是VP1AC突變 體。該突變分子優(yōu)選的包括基本上由SEQIDN0.4表示的氨基酸序列。
優(yōu)選的，利用本發(fā)明方法治療的病理性失調(diào)是由參與質(zhì)量控制過程或者 炎性過程的細(xì)胞蛋白失活引起的病癥，因此，可以通過激活這類細(xì)胞蛋白得 到改善。
根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，參與質(zhì)量控制過程的蛋白可以是伴侶蛋 白。本發(fā)明清楚的證明，施用包含VP1的VLP或者由VP1 △ C突變分子組成的VP1五聚體，都會導(dǎo)致伴侶蛋白水平尤其是伴侶蛋白HSP/c70的升高。通
過被治療動物的存活、降低的血尿素和肌酸酐水平清楚的證明，這種升高與
SV40 VP1對ARP病癥諸如AKI的有益效果有關(guān)。
根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的方法打算用于治療病理性失調(diào)諸如神經(jīng) 變性失調(diào)或者免疫相關(guān)失調(diào)。
根據(jù)一個具體實施方式
，本發(fā)明的方法適合于治療免疫相關(guān)失調(diào)諸如自 身免疫病、惡性和非惡性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病，以 及病原體誘導(dǎo)的失調(diào)。
在另一個特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法特別適合于治療病原體 誘導(dǎo)的病理性失調(diào)。這類失調(diào)可引起膿毒病，而這可導(dǎo)致ARF(急性腎功能衰 竭)、ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)和多系統(tǒng)器官衰竭中的任意一種。
因此，根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，所述ARF疾病可以是AKI。
如前文所述，急性腎損傷(AKI)的病理特征是不同程度的腎小管細(xì)胞損 傷。腎細(xì)胞死亡可由長時間腎缺血、腎毒素或者膿毒病引起。AKI在臨床上 導(dǎo)致腎小球濾過率(GFR)和腎小管功能的快速(數(shù)小時到數(shù)天)下降，這導(dǎo)致尿 毒癥毒素的滯留、酸堿平衡失調(diào)、體液失衡和幾乎所有其他系統(tǒng)的功能障礙。
本發(fā)明方法使用的術(shù)語"有效量"或者"足夠量，，表示實現(xiàn)預(yù)期結(jié)果必 需的量。"有效治療量"由疾病的嚴(yán)重性以及預(yù)防或者治療目的、給藥途徑 和患者的身體條件(年齡，性別，體重和主治醫(yī)師已知的其他條件)決定。
可以按照任何常規(guī)劑量配方施用治療性制劑。根據(jù)一個具體和特定的實 施方式，本發(fā)明使用病毒衣殼蛋白治療ARF，如AKI模型所示。如實施例所 示，SV40 VP1蛋白以VLP的形式使用，其被注射到患病的動物。合適的劑 量范圍介于0.01-100mg/kg體重，優(yōu)選的大約0.1-50mg/kg,最優(yōu)選的 0.1-20mg/kg。制劑通常包括至少一種上文限定的活性成分，以及一種或者多 種其可接受的載體。
如實施例所示，本發(fā)明的組合物和方法還可以4吏用突變的SV40 VP1分 子VP1AC,盡管實現(xiàn)對被處理細(xì)胞所需的有益效果可能需要更高的量。
應(yīng)當(dāng)注意到本發(fā)明的組合物和方法使用的制劑包括那些適于口服、直腸、 鼻或者腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)，靜脈內(nèi)和真皮內(nèi)的)施用的制劑。所述制劑可 以方便地存在于單位劑型中，并且可以采用藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備。 包括在患者中產(chǎn)生預(yù)期作用所必需的有效量的所有這類化合物的性質(zhì)、可用 性和來源都是本領(lǐng)域公知的，無需在本文中進(jìn)一步描述。在另一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法的施用步驟，包括口服，靜脈內(nèi)， 肌內(nèi)，皮下，腹腔，胃腸外，透皮，陰道內(nèi)，鼻內(nèi)，粘膜，舌下，表面局部， 直腸或者皮下施用，或者其任意組合。
如上所述，利用一種或者多種生理上可接受的載體，用于本發(fā)明的藥物 組合物可以采用常規(guī)方式配制，所述載體包括賦形劑和輔助劑，其有利于將 活性成分加工成藥學(xué)上可以使用的制劑。合適的制劑取決于選擇的給藥途徑。
對于注射，本發(fā)明的活性成分可以在水性溶液中配制，優(yōu)選的是生理上
相容的緩沖液諸如Hank's液，Ringer's液或者生理鹽水緩沖液。對于透粘膜 施用，在制劑中使用對將滲透的屏障合適的滲透劑。這類滲透劑通常是本領(lǐng) 域已知的。
用于表面局部施用的藥物組合物可以包括透皮貼片，軟膏(ointment),洗 劑，乳劑，凝膠，滴劑，栓劑，噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)的藥物載體，水 性、粉末或者油性基質(zhì)，增稠劑等等可以是必需的或者所希望的。
對于口服給藥，通過將活性化合物與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體 組合可以輕易地配制化合物。這類載體可以將本發(fā)明的化合物配制為片劑， 丸劑，糖錠劑(dragee),膠嚢，液體，凝膠，糖漿劑，膏劑(slurry),懸液，等 等，用于患者的口服攝取。
用于口服的藥物制劑可以利用固體賦形劑來制備，可選的，在根據(jù)需要 添加合適的輔助劑后，研磨所獲混合物，并加工顆?；旌衔?，以獲得片劑或 糖錠劑核心。合適的賦形劑是，尤其是，填充劑諸如糖，包括乳糖，蔗糖， 甘露醇，或者山梨糖醇，纖維素制品諸如，例如，玉米淀4分，小麥淀粉，米 淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍樹膠，曱基纖維素，羥丙基曱基纖維素，羧 曱基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。增 稠劑，調(diào)味劑，稀釋劑，乳化劑，分散輔助劑或者結(jié)合劑可能也是需要的。
對于通過鼻吸入的施用，用于本發(fā)明的活性成分(其是病毒衣殼蛋白，或 者優(yōu)選的，包括SV40 VP1的VLP,或者突變VP1分子)，可以方便地采用氣 溶膠噴射物形式輸送，所述氣溶膠噴射物利用合適的噴射劑(例如，二氯二氟 曱烷，三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷或者二氧化碳)從加壓袋(pressurized pack) 或者噴霧器產(chǎn)生。就增壓氣溶膠而言，通過提供一個輸送指定量的閥來決定
劑量單位。例如可以將分配器使用的明膠膠囊和明膠藥筒制成包含化合物和 合適的粉末基質(zhì)(諸如乳糖或者淀粉)的粉末混合物?？梢詫⒈疚拿枋龅闹苿┡渲朴糜谀c胃外給藥，例如，通過推注或者連續(xù) 輸注給藥。用于注射的制劑可以存在于單位劑型，例如，安瓿中或者多劑量 容器中，可選的含有添加的防腐劑。組合物可以是溶于油性或者水性賦形劑
的懸液、溶液或者乳液，并且可以包含配方劑(formulatory agents)諸如懸浮劑、 穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于腸胃外給藥的藥物組合物包括水溶性形式的活性制劑的水溶液。此 外，可以將活性成分的懸液制成合適的基于油或者水的注射懸液。合適的親 脂性溶劑或者賦形劑包括脂肪油諸如芝麻油，或者合成脂肪酸酯諸如油酸乙 酯，甘油三酯或者脂質(zhì)體。水性注射懸液可以包含增加懸液粘性的物質(zhì)，諸 如羧曱基纖維素鈉，山梨糖醇或者葡聚糖?？蛇x的，懸液還可以包含合適的 穩(wěn)定劑或者增加活性成分的可溶性以制備高濃度溶液的試劑。
此外，活性成分可以采用粉末形式，以便用合適的賦形劑配好后投入使 用，所述賦形劑例如無菌的、無熱原的水溶液。
利用例如常規(guī)的栓劑基質(zhì)諸如可可脂或者其他甘油酯，還可以將本發(fā)明 的藥物組合物配制成直腸組合物諸如栓劑或者滯留型灌腸劑(retention enemas)。
因此，本發(fā)明的藥物組合物包括，但不限于，溶液，乳液，和包含脂質(zhì) 體的制劑。這些組合物可以利用各種組分產(chǎn)生，所述組分包括但不限于，預(yù) 制液體、自乳化固體和自乳化半固體。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括含有實現(xiàn)預(yù)期目的所需有效量的活性成 分的組合物。更具體地，治療有效量表示有效預(yù)防、減輕或者改善被治療患 者的病癥或者延長其存活的活性成分的量。
如上所述，治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
對于本發(fā)明治療方法使用的任何藥物組合物，最初都可以從體外分析估 算治療有效的量或者劑量。例如，在動物模型中配制一定的劑量，然后可以 使用這類信息更準(zhǔn)確的確定人的有效劑量。
通過標(biāo)準(zhǔn)的體外藥學(xué)步驟，在細(xì)胞培養(yǎng)物或者實^r動物中確定本文所述 活性成分的毒性和治療效果。從體外細(xì)胞培養(yǎng)物分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù) 可用于配制給人使用的劑量范圍。根據(jù)使用的劑型和釆用的給藥途徑，該劑 量可以變化。各個醫(yī)生根據(jù)患者情況可以選擇準(zhǔn)確的劑型、給藥途徑和劑量。根據(jù)待治療病癥的嚴(yán)重性和應(yīng)答性，給藥可以是單次或者多次施用，療 程持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，或者直到治療起了作用或者實現(xiàn)了疾病狀態(tài)或者癥狀的 減輕。
施用藥物組合物的量顯然取決于被治療的患者，疾病的嚴(yán)重性，給藥方 式，處方醫(yī)生的判斷，等等。
盡管預(yù)期本發(fā)明的方法尤其被用于治療人類的病理性失調(diào)，但也包括其 他哺乳動物。作為非限制性的實例，哺乳動物患者包括猴，馬，牛，犬，貓， 小鼠，大鼠和豬。
在第三個方面，本發(fā)明涉及增強細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)的改善作用的方 法，所述細(xì)胞蛋白參與質(zhì)量控制過程。該方法包括將從患有病理性失調(diào)的患 者獲得的細(xì)胞在回體或者體外與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意 肽或者片段接觸的步驟。
本發(fā)明還提供在有需要的患者中增強細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)的改善作用 的方法，所述細(xì)胞蛋白參與質(zhì)量控制過程。該方法包括給所述患者施用治療 有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽或者片段，或者包括相同物質(zhì)
的任意VLP,或者包括相同物質(zhì)的組合物的步驟。
根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白可以是伴 侶蛋白，尤其是HSP/c70。
本發(fā)明還提供一種從氧化應(yīng)激或者凋亡中拯救細(xì)胞的方法，包括將經(jīng)歷 氧化應(yīng)激或者凋亡過程的細(xì)胞與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意 肽、突變體或者片段，或者包括所述病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或 者片段的VLP，或者包括相同物質(zhì)的組合物接觸的步驟。
根據(jù)一個具體實施方式
，這些細(xì)胞是患有病理性失調(diào)的患者的細(xì)胞，所 述失調(diào)與凋亡過程或者氧化應(yīng)激有關(guān)。
本發(fā)明還提供增強細(xì)胞存活途徑，優(yōu)選的PBK-PKB/Akt存活途徑的方 法。本發(fā)明的方法包括將細(xì)胞與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意 肽、突變體或者片段或者包括相同物質(zhì)的VLP接觸的步驟。根據(jù)一個具體實 施方式，利用本發(fā)明的方法和組合物對細(xì)胞存活途徑的誘導(dǎo)，可以在體外或 者體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行，或者，在有需要的患者體內(nèi)進(jìn)行。
根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明任意方法提供的病毒衣殼蛋白可以是乳頭瘤 病毒或者多瘤病毒的任意衣殼蛋白，或者其任意片段、肽以及混合物和組合。 優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1、 VP2、 VP3,和其任意肽、片段、突變體、任意混合物和組合中的至少一種。最優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是
SV40VP1或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括SV40VP1的VLP。特 別的，SV40VP1蛋白可以包括SEQIDNO:l所示的氨基^f列。
在另一個實施方式中，本發(fā)明方法使用的突變VP1分子可以是VP1AC 突變體，其優(yōu)選的包括SEQ ID N0.4所示氨基酸序列。
優(yōu)選的，本發(fā)明的方法增強參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白的改善作用， 因此尤其可用于由這類蛋白失活引起的病理性失調(diào)，所述細(xì)胞蛋白優(yōu)選的是 伴侶蛋白。
根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的方法增強細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)諸如神 經(jīng)變性失調(diào)或者免疫相關(guān)失調(diào)的改善作用，所述細(xì)胞蛋白優(yōu)選的是伴侶蛋白。
根據(jù)一個具體實施方式
，免疫相關(guān)失調(diào)可以是自身免疫病、惡性和非惡 性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病，以及病原體誘導(dǎo)的失調(diào)。
在另一個特別優(yōu)選的實施方式中，病原體誘導(dǎo)的病理性失調(diào)可能引起膿 毒病，此病導(dǎo)致ARF疾病、ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)和多系統(tǒng)器官衰竭 中的任意一種。
因此，根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，這類ARF失調(diào)可以是AKI。
在第四個方面，本發(fā)明涉及至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變 體或者片段在制備治療病理性失調(diào)的藥物組合物中的用途。
根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明使用的病毒衣殼蛋白可以是乳頭瘤病毒或者 多瘤病毒的任意衣殼蛋白，或者其任意片段、肽、突變體、混合物和組合。 優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1、 VP2、 VP3,和其任意肽、片段、 突變體、混合物和組合中的至少一種。最優(yōu)選的，病毒衣殼蛋白可以是SV40 VP1或者其任意肽、突變體或者片段。
優(yōu)選的，本發(fā)明的用途是制備增強參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白的改善 作用的組合物，因此尤其可用于治療由這類蛋白失活引起的病理性失調(diào)，所 述細(xì)胞蛋白優(yōu)選的是伴侶蛋白。
根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明病毒衣殼蛋白的用途是制備治療病理性失 調(diào)諸如神經(jīng)變性失調(diào)或者免疫相關(guān)失調(diào)的組合物。
根據(jù)一個具體實施方式
，免疫相關(guān)失調(diào)可以是自身免疫病、惡性和非惡 性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病，以及病原體誘導(dǎo)的失調(diào)。
病原體誘導(dǎo)的病理性失調(diào)可引起膿毒病，這可導(dǎo)致ARF失調(diào)、ARDS(急 性呼吸窘迫綜合征)和多系統(tǒng)器官衰竭中的任意一種。
26根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，這類ARF失調(diào)可以是AKI。本發(fā)明還提供至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段，
或者包括所述衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP,在制備用于
從氧化應(yīng)激或者凋亡中拯救細(xì)胞的藥物組合物中的用途。
根據(jù)一個具體實施方式
，本發(fā)明可以使用突變的VP1AC分子。雖然進(jìn)行了公開和描述，但應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文公開的特定實施例、
方法步驟和組合物，因為這類方法步驟和組合物可以稍微不同。還應(yīng)理解本
文使用的術(shù)語只是用于描述具體實施方式
，而不是旨在限制，因為本發(fā)明的
范圍只是由所附權(quán)利要求和其同等物來限定。
必須指出，在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式"一個(a)"、"一個(an)"和"the"包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文明確另外規(guī)定。
在本說明書以及下面的實施例和權(quán)利要求中，除非上下文另外需要，單
詞"包括(comprise)"和其變形"包括(comprises)""包括(comprising)"應(yīng)被_理解為表示包含一個指定的整體或者步驟(step)或者一組整體或者步驟(steps),但不排除任意其他整體或者步驟或者一組整體或者步驟。
下列實施例代表本發(fā)明人實施本發(fā)明各個方面使用的技術(shù)。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)這些技術(shù)作為實施本發(fā)明的示例性優(yōu)選實施方式時，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)，將意識到可以做出許多不背離本發(fā)明精神和預(yù)期范圍的改變。
實施例實驗步驟
還傲歸場郝模型,
通過6.5 mg/kg劑量的腎毒劑HgCb誘導(dǎo)AKI,其被正式稱為ATN (急性
腎小管壞死)。觀察小鼠的全身表現(xiàn)并測量血液中的尿素水平，確認(rèn)被注射小鼠患上了AKI。正常健康動物的血尿素水平范圍通常〈50mg/dL。在頭3-4天AKI動物的血尿素顯著增加。利用該HgCl2劑量處理的大部分動物在4天內(nèi)死亡。存活的那些小鼠從第5天開始顯示血尿素減少，傾向于康復(fù)。K丄尸財/務(wù)
在Sf9細(xì)胞中擴增利用多角體蛋白啟動子[Sandalon (1997) ibid.; Sandalon,Z. and Oppenheim, A. In SV40 protocols, L. Raptis， ed. (Totowa, NJ, HumanaPress Inc.) (2001)]表達(dá)VP1的重組桿狀病毒。簡單來說，使用moi 10的高滴度病毒原液(stock)( >109 pfu/ml)感染Sf9細(xì)胞的對數(shù)期培養(yǎng)物，用于VP1制備。
27感染72小時后離心收集細(xì)胞，利用從Schreiber等[Schreiber et al.， NucleicAcids Research 17: 6419 (1989)]改進(jìn)的步驟制備核提取物，或者在5-6天后，裂解被感染的Sf9細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基收集核提取物。將核提取物等分，保存于-80'C。這類核提取物包含自發(fā)組裝的SV40病毒樣粒子(VLP)。為了去除大分子，主要是RNA(其可能滯留在VLP內(nèi))，核提取物按照下面3個步驟被分解然后再組裝步驟A,在37。C用1 jal 150 mM DTT和10 (ig RNase處理5(il Sf9核提取物20分鐘，終體積為10 pl。步驟B，向被處理的核提取物(步驟A)中添加一種再組裝混合物(包含10 mM ATP， 20 mM Hepes-KOH緩沖液pH7.9, 80mMKCl， 40mMNH4Cl， 10mMMgCl2, 16%甘油和0.08% NP-40,終體積為10 pl),在37。C孵育該再組裝反應(yīng)物1小時。步驟C，添加10 |^1穩(wěn)定緩沖液(150 mM醋酸鈉緩沖液pH 5.2， 3 mM CaCl2， 120 mM KC1和40mMNH4Cl，保持160 mM的鹽濃度)后，將包裝反應(yīng)物在冰上靜置過夜，得到30jil的總體積。
將反應(yīng)混合物用氯仿(5 W)處理，然后渦旋振蕩所述混合物，離心分離并在含水層中回收部分純化的VLP。在氬氣中利用XM300膜(Millipore)通過攪拌-超濾作用將VLP進(jìn)一步純化，并濃縮 300倍(到終濃度5-10mg/ml)。將濃縮物重懸于0.5 M NaCl鹽水(初始體積的一半)，另外再過濾3次。將純化的VLP等分，并在-20。C保存直至使用。在使用前VLP用H20稀釋3倍(到166mM的NaCl終濃度)，再用鹽水(saline)稀釋到需要的VP1濃度。
如下進(jìn)行VLP的透射電子顯微鏡成像將樣品吸附到聚乙烯醇縮甲醛(formvar)-碳-包被的銅網(wǎng)，并用1%磷鴒酸鈉pH7.0染色。利用100kV的電壓，在Philips CM-12電子顯微鏡下觀察樣品，并按照66,000 x的放大率拍照。
圖1顯示純化的VLP。如該圖所示，在兩種收集方法中(核或者培養(yǎng)基)，VLP均表現(xiàn)為與野生型SV40(圖1B)類似的均勻形狀和大小的分離的納米顆粒(圖1A)。凝膠電泳顯示它們包含 95%的VP1(圖1C)。在顆粒中沒有檢測到DNA。
實施例1
丄FP對伴^蛋^(H^/c7^ #謬尋/遂活
如本發(fā)明背景部分所述，伴侶蛋白被證明可以改善臨床病癥諸如急性腎小管壞死(ATN)或者現(xiàn)在被稱為AKI的病癥，并且SV40激活伴倡蛋白Hsp70測了不含任何遺傳物質(zhì)的SV40衣殼蛋白是否影響或者調(diào)節(jié)伴侶蛋白蛋白諸如Hsp70的水平。因此，然后鑒定了SV40衣殼蛋白對伴侶蛋白生物合成的誘導(dǎo)。向來自非洲綠猴腎的CV1細(xì)胞添加SV40衣殼蛋白(SV40VLP, 50ng和500 ng每l(^個細(xì)胞)，所述SV斗0衣殼蛋白是只包含VP1的病毒樣粒子(VLP)以及解離的VP1五聚體。在添加衣殼蛋白后的數(shù)個時間點收集總細(xì)胞蛋白，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡分析等量的總細(xì)胞蛋白，所述Western印跡利用對哺乳動物HSP/c70伴侶蛋白特異的抗體。未接受治療的小鼠被用作對照。圖2A顯示W(wǎng)estern印跡，其指示Hsp/c70蛋白的水平。進(jìn)一步分析SV40 VLP對HSP/c70表達(dá)的增強作用。如圖2B所示，CV1細(xì)胞用50ngVLP處理，抗Hsp/c70抗體免疫染色，并在共焦顯微鏡T觀察。該圖清楚的顯示，猴CV-1對VLP感染產(chǎn)生應(yīng)答，表現(xiàn)為上調(diào)Hsp/c70。 Western分析顯示在兩種VP1濃度(50和500 ng),感染9小時后的蛋白水平均顯著增力口。共焦顯微鏡檢查(圖2B)顯示第6個小時Hsp/c70水平的微小增加。Hsp/c70在細(xì)胞中持續(xù)聚積，并且在感染9小時后向細(xì)胞核移位。第48小時Hsp/c70不再出現(xiàn)。利用突變的VP1 AC分子獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因此本發(fā)明人總結(jié)出存在Hsp/c70的增加，開始于感染后6-9個小時。
實施例2
KLP保^培券時f"勿應(yīng)浙^源亡
不斷增加的證據(jù)表明伴估蛋白預(yù)防腎衰竭[Lu, CY. et al. Curr. OP. inNephrol. Hypertens. 16:83-89 (2007); Riordan， M. et al. Nat. Clin. Pract. N印hrol.2:149-156 (2006); Kelly, K丄Contrib. Nephrol. 148:86-106(2005)]。因此，本發(fā)明人檢測了 SV40 VLP對hsp/c70的誘導(dǎo)是否可以保護細(xì)胞抵抗凋亡。利用依托泊戒誘導(dǎo)人腎HEK細(xì)胞的凋亡。如圖3所示，每106個細(xì)胞添加50 ng VLP顯著改善凋亡效應(yīng)，所述細(xì)胞表現(xiàn)得類似于未經(jīng)處理的對照。利用CV-1細(xì)胞獲得類似的結(jié)果。乾々f ^
在自然界中SV40位于靈長類動物的腎。因此病毒靶向于小鼠的腎是并不令人驚訝的。如圖4A和4B所示，單次尾靜脈注射SV40 VLP 48小時后，利用抗VP1抗體在小鼠的腎小管中觀察到大范圍的染色。因此，這進(jìn)一步證明了利用VLP或者衣殼蛋白治療ARF失調(diào)的適用性和可行性。
29實施例3
V、虞,賽遂^^^4A7)模費的建i
觀察到的SV40 VLP和衣殼蛋白提高伴侶蛋白水平以及抗腎細(xì)胞凋亡的保護作用的效果鼓勵本發(fā)明人進(jìn)一步研究SV40 VLP和衣殼蛋白對病理性失調(diào)的可能有益效果，所述病理性失調(diào)尤其與腎有關(guān)。選擇汞腎毒性小鼠模型用于初步研究，因為它具有高度重現(xiàn)性。為了建立小鼠模型，使用19-21克(6-9周)的BALB/C雌性小鼠。給小鼠腹腔內(nèi)施用指定濃度的HgCl2。在指定天數(shù)從尾靜脈取血，利用Reflotron尿素試驗(Roche)測量尿素。如圖5所示，各個HgCl2濃度的血尿素水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差較低。根據(jù)該實驗選擇6.5 mg/kg HgCl2的劑量用于本發(fā)明的研究。在重復(fù)實驗中該劑量的死亡率一直是大約90%。
^^凝^^/、^IV、^勿應(yīng)危菱/^a2謬爭w源亡
為了檢測VLP對腎毒性的效果，使用小鼠腎小管細(xì)胞[Haverty， T.P. et al.J. Cell Biol. 107:1359-1368 (1988)]代表急性腎衰竭期間體內(nèi)受影響的腎小管上皮細(xì)胞。圖6A和6B清楚的顯示，利用15 ^MHgCl2處理細(xì)胞導(dǎo)致普遍的凋亡，而50 ng VLP/106個細(xì)胞的感染提供有效的保護。HEK和CV-1細(xì)胞獲得類似的結(jié)果(未顯示)。
實施例4
較宏浙量龍厲的n尸治^小農(nóng)增>存活
如上所示，利用AKI動物模型，注射6.5mg/kgHgCl2的大部分動物都在3-4天內(nèi)死亡。這些結(jié)果得到圖7A證實，只有2/20(10%)的AKI動物存活。相反，施用VLP的動物中的存活率要高得多。圖7A顯示按照60-600微克/小鼠的劑量，接受3次VLP注射的11只動物的數(shù)據(jù)。該組的存活率是5/11(45%)。這些實驗清楚證明了 VLP對AKI具有治療效果。
為了進(jìn)一步研究這些令人振奮的初步數(shù)據(jù)，檢查下列3個實驗組以分析VLP對存活的影響第一組(Sham)被施用替代VLP的鹽水和替代HgCl2的PBS，第二組用HgCl2和VLP(AKI+VLP)處理，第三組用替代VLP的鹽水和HgCl2處理。采用連續(xù)3次的每日注射(0.1mg/kg每天，第-3、 -2、 -1天)通過尾靜脈給小鼠施用VLP (0.3 mg/kg,溶于鹽水)。不施用VLP的小鼠被平行注射鹽水。在第四天腹腔內(nèi)注射溶于PBS的HgCl2，這一天在下面所示的實驗中被記為第0天。平行的給sham動物施用PBS。觀察到小鼠又存活了 14天。
30如圖7C所示，所述治療導(dǎo)致存活率從12% (6/49)增加到63% (19/30)。利用Kaplan-Meier/Mantel-Cox log-rank檢驗的統(tǒng)計分析標(biāo)明顯著性為P=0.000002。如圖7B所示，在3 |ig/kg-3 mg/kg的較寬劑量范圍內(nèi)都觀察到減毒作用。
實施例5
PTi ^果沐弄^f減弱AK7 ^活遂
本發(fā)明人然后檢驗了觀察到的有益效果是否需要完整的衣殼，或者VP1五聚體中是否存在凋亡保護作用的足量信息。SV40 VLP由主要衣殼蛋白VP1的72個五聚體組成(360個單體)。單體結(jié)構(gòu)是具有延伸的氨基端臂和羧基端臂的P-心型軸(barrel core)。五聚體通過360個羧基端臂聚集在一起。VP1 △C, 一種在羧基端臂有缺失的突變VP1衣殼蛋白，保留了核心結(jié)構(gòu)但無法組裝成VLP。在Sf9細(xì)胞中產(chǎn)生缺失突變體VP1 △ C65-His [Roitman- Shemer, V.et al. Biochem Biophys. Res. Commun. 353:424-430 (2007)]，并通過His-標(biāo)簽在Ni-NTA樹月旨(Qiagen)上純化?？捡R斯染色的SDS-PAGE(圖8A)顯示，在上樣lmg蛋白的泳道中，蛋白是大約95%純。
如上對VLP所述在各組小鼠(每組4只動物)中進(jìn)行存活實驗。如圖8B所示，在注射0.750 mg/kg的小鼠中，VP1治療導(dǎo)致75% (3/4)的存活。這些結(jié)果提示VP1 AC也能有效預(yù)防汞損傷，盡管與VLP相比其劑量更高。
實施例6
KjLP々衣^蛋^對不/f侈4措^^parameter)的放耒
本發(fā)明人進(jìn)一步研究了用SV40 VLP治療病理性失調(diào)(優(yōu)選的是ARF)對其他腎衰竭指征的適用性和可行性。被檢測的一個指征是腎臟結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)。汞損傷3天后收集的3組小鼠的代表性腎在下面顯示。盡管AKI腎更小并且較蒼白，但來自VLP治療小鼠的腎表現(xiàn)的與sham腎類似(圖9A)。當(dāng)檢測其他指征時，也觀察到VLP的有益效果。如圖9B所示，感染后4天，與未接受治療的AKI小鼠相比，VLP治療AKI小鼠中血清尿素和肌酸酐水平(腎衰竭的兩個標(biāo)志)的增加顯著減弱。值得注意的是，AKI小鼠的血清尿素在該實驗的4天期間持續(xù)增加。相反，如圖9C所示，接受VLP治療的AKI動物的血清尿素在第3天達(dá)到峰值，此后開始降低。這種方式與VLP治療動物的腎功能恢復(fù)一致，并與更高的存活率有關(guān)。實施例7棵^的批賴
為了分析SV40 VLP和VP1衣殼蛋白保護AKI動物的可能機制，檢測了涉及的應(yīng)激信號。
利用硫代巴比土酸反應(yīng)物(TBARS)分析測量脂質(zhì)過氧化作用的水平。
VLP治療小鼠中該水平降低(圖10)，表明VLP對氧化應(yīng)激的減弱至少部分地
介導(dǎo)保護腎功能免受汞誘導(dǎo)的腎毒性。
在一個平行研究(未公開的數(shù)據(jù)，未顯示)中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用VP1 VLP
處理細(xì)胞導(dǎo)致PLC-Y和其信號途徑非常迅速的激活。尤其是PARP-1以及caspases3和10的快速激活(在第1小時時)，表明凋亡途徑的起始。但是細(xì)胞不進(jìn)展到凋亡，該過程在第6小時被伴侶蛋白(Hsp/c70)和PI3K-PKB/Akt存活途徑的激活終止，所述途徑包括PI3K-PKB/Akt和Bad蛋白的磷酸化。因此，不受任何理論的約束，本發(fā)明人提出以下假設(shè)，即SV40 VP1衣殼蛋白(或者其任何突變體或者VLP)誘導(dǎo)PI3K-PKB/Akt存活途徑。
權(quán)利要求
1. 一種治療病理性失調(diào)的藥物組合物，包括治療有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括至少一種衣殼蛋白或者其任意肽、突變體、衍生物或者片段的病毒樣粒子(VLP)作為活性成分。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是乳頭瘤病毒或者多瘤病毒的任意衣殼蛋白，或者其任意片l殳、突變體、衍生物、肽、混合物和組合。
3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是SV40VP1、 VP2、 VP3,以及其任意肽、突變體、衍生物、片段、混合物和組合中的至少一種。
4. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是SV40VP1或者其任意肽、突變體或者片段，或者所述組合物包括含有至少一種SV40 VP1或者其任意肽、突變體或者片段的VLP。
5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于所述SV40 VP1突變體在其羧基端臂有缺失，被命名為VP1 △ C。
6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于通過激活參與質(zhì)量控制過程或者炎性過程的細(xì)胞蛋白改善所述病理性失調(diào)。
7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于參與質(zhì)量控制過程的所述蛋白是伴侶蛋白。
8. 如權(quán)利要求6和7中任一所述的組合物，其特征在于所述病理性失調(diào)可以是神經(jīng)變性失調(diào)和免疫相關(guān)失調(diào)中的任意一種。
9. 如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于所述免疫相關(guān)的失調(diào)是自身免疫病、惡性和非惡性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病，以及病原體誘導(dǎo)的失調(diào)中的任意 一種。
10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于病原體誘導(dǎo)的所述病理性失調(diào)引起膿毒病，其導(dǎo)致急性腎衰竭(ARF)、 ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)和多系統(tǒng)器官衰竭中的任意一種。
11. 如權(quán)利要求IO所述的組合物，其特征在于所述ARF(急性腎衰竭)是AKI(急性腎損傷)。
12. 如權(quán)利要求1-5中任一所述的組合物，其用于治療ARF的組合物。
13. 如權(quán)利要求1-5中任一所述的組合物，用于拯救細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和 凋亡中的任意一種，并誘導(dǎo)所述細(xì)胞的存活途徑。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，用于拯救來自有需要的患者的細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和凋亡中的任意一種，并誘導(dǎo)所述細(xì)胞的存活途徑。
15. —種在有需要的患者中治療病理性失調(diào)的方法，包括以下步驟給 所述患者施用治療有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或 者片段，或者包括至少一種衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的病毒 樣粒子(VLP),或者包括相同物質(zhì)的組合物。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是乳頭瘤 病毒或者多瘤病毒的衣殼蛋白，或者其任意片段、突變體、肽以及混合物和 組合中的任意一種。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是SV40 VP1、 VP2、 VP3，以及其任意肽、突變體、片段、混合物和組合中的至少一種o
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是SV40 VP1或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括所述SV40VP1的任意VLP。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述SV180 VP1突變體在其 羧基端臂有缺失，被命名為VP1AC。
20. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于通過激活參與質(zhì)量控制過程 或者炎性過程的細(xì)胞蛋白改善所述病理性失調(diào)。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于參與質(zhì)量控制過程的所述蛋 白是伴侶蛋白。
22. 如權(quán)利要求20和21中任一所述的組合物，其特征在于所述病理性 失調(diào)是神經(jīng)變性失調(diào)和免疫相關(guān)失調(diào)中的任意一種。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述免疫相關(guān)的失調(diào)是自身 免疫病、惡性和非惡性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病，以及 病原體誘導(dǎo)的失調(diào)中的任意 一種。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于病原體誘導(dǎo)的所述病理性失 調(diào)引起膿毒病，其導(dǎo)致ARF、 ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)和多系統(tǒng)器官衰竭 中的任意一種。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述ARF是AKI。
26. —種增強細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)的改善作用的方法，所述細(xì)胞蛋白參與質(zhì)量控制過程，所述方法包括以下步驟將從患有病理性失調(diào)的患者獲 得的細(xì)胞與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段， 或者包括所述病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP接觸。
27. —種在有需要的患者中增強細(xì)胞蛋白對病理性失調(diào)的改善作用的方 法，所述細(xì)胞蛋白參與質(zhì)量控制過程，所述方法包括以下步驟給所述患者 施用治療有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段， 或者包括所述病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP,或者包 括相同物質(zhì)的組合物。
28. —種從氧化應(yīng)激或者凋亡中拯救細(xì)胞的方法，包括以下步驟將經(jīng) 歷氧化應(yīng)激或者凋亡過程的細(xì)胞與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任 意肽、突變體或者片段，或者包括所述病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體 或者片段的VLP，或者包括相同物質(zhì)的組合物接觸。
29. —種在有需要的細(xì)胞中誘導(dǎo)存活途徑的方法，包括以下步驟將所 述細(xì)胞與有效量的至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段， 或者包括所述病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP,或者包 括相同物質(zhì)的組合物接觸。
30. 如權(quán)利要求28和29中任一所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞是患 有病理性失調(diào)的患者的細(xì)胞。
31. 如權(quán)利要求28和29中任一所述的方法，其特征在于所述病毒衣殼 蛋白是SV40VP1或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括SV40VP1或者 其任意肽、突變體或者片段的VLP。
32. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于所述SV40VP1突變體在其 羧基端臂有缺失，被命名為VP1 △ C。
33. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于所述病理性失調(diào)是神經(jīng)變性 失調(diào)和免疫相關(guān)失調(diào)中的任意 一種。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于所述病理性失調(diào)是ARF。
35. 至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括 所述衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP，在制備用于治療病理 性失調(diào)的藥物組合物中的用途。
36. 如權(quán)利要求35所述的用途，其特征在于所述病毒衣殼蛋白或者其任 意肽、突變體或者片段，或者包括所述病毒衣殼蛋白的VLP,增強細(xì)胞蛋白在所述病理性失調(diào)中的改善作用，所述細(xì)胞蛋白與質(zhì)量控制過程有關(guān)，優(yōu)選 的是伴侶蛋白。
37. 至少一種病毒衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括 所述衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段的VLP，在制備用于從氧化應(yīng) 激或者凋亡中拯救細(xì)胞的藥物組合物中的用途。
38. 如權(quán)利要求35和37中任一所述的用途，其特征在于所述病毒衣殼 蛋白是乳頭瘤病毒或者多瘤病毒的衣殼蛋白，或者其任意片段、肽、突變體 以及混合物和組合，或者包括所述衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段 中的VLP。
39. 如權(quán)利要求38所述的用途，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是SV40 VP1、 VP2、 VP3,以及其任意肽、突變體、片段、混合物和組合，或者包括 所述衣殼蛋白或者其任意肽、突變體或者片段中的VLP。
40. 如權(quán)利要求39所述的用途，其特征在于所述病毒衣殼蛋白是SV40 VP1或者其任意肽、突變體或者片段，或者包括所述SV40VP1或者其任意 肽、突變體或者片^:的VLP。
41. 如權(quán)利要求40所述的用途，其特征在于所述SV40VP1突變體在其 羧基端臂有缺失，被命名為VP1AC。
42. 如權(quán)利要求40所述的用途，其特征在于所述免疫相關(guān)的失調(diào)是自身 免疫病、惡性和非惡性增生性失調(diào)，移植排斥疾病和移植抗宿主疾病，以及 病原體誘導(dǎo)的失調(diào)中的任意一種。
43. 如權(quán)利要求42所述的用途，其特征在于所述病理性失調(diào)是AKI。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒衣殼蛋白作為治療病理性失調(diào)的藥物。更特別的，本發(fā)明涉及病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，優(yōu)選的，SV40 VP1或者其任意肽、片段、突變體、衍生物和混合物，或者包含相同物質(zhì)的病毒樣粒子(VLP)，作為治療病理性失調(diào)的組合物的活性成分，所述失調(diào)優(yōu)選的是與參與質(zhì)量控制過程的細(xì)胞蛋白尤其是伴侶蛋白的失活有關(guān)的疾病。本發(fā)明還提供治療這類失調(diào)的方法以及SV40衣殼蛋白在制備藥物組合物中的用途。
文檔編號C12N7/01GK101506357SQ200780022745
公開日2009年8月12日 申請日期2007年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月18日
發(fā)明者阿里拉·奧本海姆 申請人:基因載體技術(shù)(Gvt)公司