專利名稱：脂肪酸及其衍生物的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供遺傳工程化的微生物以及它們的使用方法，所述微生物產(chǎn)生來(lái)自脂肪酸生物合成途徑的產(chǎn)物(脂肪酸衍生物)。

背景技術(shù)：
技術(shù)的發(fā)展伴隨著對(duì)燃料來(lái)源依賴的增加，這類燃料來(lái)源正變得日益有限和難以獲得。隨著化石燃料的燃燒正以空前的速度發(fā)生，很有可能不久以后世界上的燃料需求就將超過(guò)現(xiàn)在的燃料供給。
因此，現(xiàn)在的發(fā)展集中于利用再生能源，諸如日光、水、風(fēng)和生物質(zhì)(biomass)。利用生物質(zhì)產(chǎn)生新的燃料來(lái)源(即生物燃料)是一種可供選擇的方案，該燃料不是來(lái)自于石油。生物燃料(生物柴油)是一種由長(zhǎng)鏈烷烴和酯構(gòu)成的可生物降解的、清潔燃燒的燃料。在大部分內(nèi)燃柴油發(fā)動(dòng)機(jī)中，生物柴油的使用可以采用純的形式(被稱為“純”生物柴油)，或者按照任何濃度與常規(guī)的石化柴油混合。制備生物柴油的通用方法涉及三酰甘油(主要是植物油)的酯交換，這產(chǎn)生脂肪酸酯和不需要的副產(chǎn)品甘油的混合物，從而提供異質(zhì)性的產(chǎn)物和造成經(jīng)濟(jì)效益低下的廢產(chǎn)物。
簡(jiǎn)述 本文公開(kāi)的重組微生物能夠從脂肪酸生物合成途徑合成產(chǎn)物(脂肪酸衍生物)，并且可選的將這種產(chǎn)物釋放到發(fā)酵肉湯。這種脂肪酸衍生物還可用作生物燃料和專用化學(xué)品。這些生物燃料和專用化學(xué)品可用于制備其他產(chǎn)物，諸如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑、聚合物、石蠟替代物和個(gè)人護(hù)理用品。
本文公開(kāi)的重組微生物可以被工程化產(chǎn)生各種脂肪酸衍生物，包括但不限于，短鏈醇諸如乙醇、丙醇異丙醇和丁醇，脂肪醇，脂肪酸酯，烴和蠟酯。
在一個(gè)實(shí)例中，本文提供修飾微生物的方法，使其產(chǎn)生和可選的釋放，從可再生碳源產(chǎn)生的脂肪酸衍生物。這種微生物可以被遺傳工程化，例如，通過(guò)引入外源DNA序列，所述序列編碼一種或者多種蛋白，所述蛋白能夠代謝可再生碳源以產(chǎn)生脂肪酸衍生物，以及在一些實(shí)例中分泌脂肪酸衍生物。因此可以在產(chǎn)生有用脂肪酸衍生物的發(fā)酵過(guò)程中使用所述修飾的微生物，該過(guò)程利用可再生碳源(生物質(zhì))作為起始材料。在一些實(shí)例中，使用現(xiàn)有的遺傳易控制的微生物，這是因?yàn)楹?jiǎn)化對(duì)其途徑的工程化，所述途徑控制生長(zhǎng)、產(chǎn)生以及減少或者消除降低生物合成途徑效率的副反應(yīng)。此外，這種修飾的微生物可用于消耗可再生碳源以便產(chǎn)生可以直接用作生物燃料的燃料，不需要專門(mén)的儲(chǔ)存或者運(yùn)輸方法。在其他實(shí)例中，通過(guò)表達(dá)增加脂肪酸產(chǎn)生的外源核酸序列，天然產(chǎn)烴的微生物被工程化以過(guò)量產(chǎn)生烴。
本文提供的微生物產(chǎn)生脂肪酸衍生物，所述衍生物具有確定的碳鏈長(zhǎng)度、分枝和飽和水平。在特定實(shí)例中，均質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)生減少了與發(fā)酵和分離有關(guān)的總成本。在一些實(shí)例中，提供包括一種或者多種外源核酸序列的微生物，所述序列編碼至少一種硫酯酶(EC 3.1.2.14)和至少一種蠟合酶(EC 2.3.1.75)。在其他實(shí)例中提供包括一種或者多種外源核酸序列的微生物，所述序列編碼至少一種硫酯酶(EC 3.1.2.14)和至少一種醇乙?；D(zhuǎn)移酶(2.3.1.84)。仍在其他實(shí)例中，提供包括一種或者多種外源核酸序列的微生物，所述序列編碼至少一種硫酯酶(EC3.1.2.14)、至少一種酰基輔酶A還原酶(EC 1.2.1.50)和至少一種醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)。還提供表達(dá)一種或者多種外源核酸序列的微生物，所述序列編碼至少一種硫酯酶(EC 3.1.2.14)和至少一種脂肪醇形成酰基輔酶A還原酶(1.1.1.*)。可以選擇外源核酸序列編碼的硫酯酶肽來(lái)提供均質(zhì)產(chǎn)物。
在一些實(shí)例中，被工程化產(chǎn)生脂肪酸衍生物的微生物是大腸桿菌(E.coli)，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)，渾濁紅球菌(Rhodococcusopacus)，真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha)，弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，鏈霉菌(Streptomycetes)，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophila)，假單胞菌(Pseudomonas)或者藤黃微球菌(Micrococus leuteus)以及它們的親緣菌。
在其他實(shí)例中，按照本文描述通過(guò)優(yōu)化脂肪酸的生物合成途徑，內(nèi)源性產(chǎn)烴的微生物被工程化以過(guò)量產(chǎn)生烴。已知產(chǎn)生烴并且利用本文提供的教導(dǎo)可以被工程化過(guò)量產(chǎn)生烴的示例性微生物包括節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)，芽孢桿菌(Bacillus sp.)，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)，著色菌(Chromatium sp.)，樹(shù)脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)，巴斯德梭狀芽胞桿菌VKM(Clostridium pasteurianumVKM)，破傷風(fēng)形梭菌(Clostridium tenanomorphum)，尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)，棒狀桿菌(Corynebacterium species)，藍(lán)藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)，組囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)，絲狀藍(lán)藻(Phormidium luridum)，佛氏綠膠藍(lán)細(xì)菌(Chlorogloea fritschii)，紅海束毛藻(Trichodesmiumerythaeum)，Oscillatoria williamsii，微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)，Coccochloris elabens，Agmenellum quadruplicatum，Plectonematerebrans，具鞘微鞘藻(M vaginatus)，和巖生眉藻(C.scopulorum))，脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577)，Kineococcusradiotolerans(BAA-149)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)，小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146，398，401，533)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)，溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)，分支桿菌(Mycobacterium species)，青霉(Penicillium sp.)，曲霉(Aspergillus sp.)，綠色木霉(Trichoderma virida)，出芽短梗霉(Pullularia pullulans)，Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)，紅假單胞菌球狀綠菌(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.)，深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)，萬(wàn)尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)，路德類酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)，類酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)，弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)，海產(chǎn)弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)，Vibrio ponticus，海紅沙雷氏菌(Serratia marinorubra)，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，麥散黑粉菌(Ustilago nuda)，小麥條黑粉菌(Urocystis agropyri)，高粱絲黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)和腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)。
除了被工程化表達(dá)外源核酸序列(其允許脂肪酸衍生物的產(chǎn)生)外，所述微生物還可以具有被功能性去除或者弱化的一種或多種內(nèi)源性基因。例如，ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登錄號(hào)NP_418398)，fadE(EC1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC 2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其組合可以被弱化。
除了被工程化表達(dá)外源核酸序列(其允許脂肪酸衍生物的產(chǎn)生)外，所述微生物還可以具有一種或多種過(guò)表達(dá)的其他基因。例如，pdh，panK，aceEF(編碼丙酮酸鹽和2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的E1p脫氫酶組分和E2p二氫硫辛酰胺?；D(zhuǎn)移酶組分，登錄號(hào)NP_414656，NP_414657，EC1.2.4.1. 2.3.1.61，2.3.1.12)，accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(編碼FAS，登錄號(hào)CAD85557，CAD85558，NP_842277，NP_841683，NP_415613，EC2.3.1.180，2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3，2.3.1.179)，編碼脂乙酰輔酶A還原酶的基因(登錄號(hào)AAC45217，EC 1.2.1.-)，UdhA或者類似基因(編碼嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，登錄號(hào)CAA46822，EC1.6.1.1)和編碼脂乙酰輔酶A還原酶的基因(登錄號(hào)AAC45217，EC 1.2.1.-)。
在一些實(shí)例中，本文描述的微生物每升發(fā)酵肉湯產(chǎn)生至少1mg脂肪酸衍生物。在其他實(shí)例中，所述微生物每升發(fā)酵肉湯產(chǎn)生至少100mg/L，500mg/L，1g/L，5g/L，10g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，50g/L，100g/L或者120g/L脂肪酸衍生物。在一些實(shí)例中，從所述微生物產(chǎn)生并釋放脂肪酸衍生物，而在其他實(shí)例中，在分離產(chǎn)物前裂解所述微生物。
在一些實(shí)例中，所述脂肪酸衍生物包括至少長(zhǎng)8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32或者34碳的碳鏈。在一些實(shí)例中，至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或者95％的產(chǎn)生的脂肪酸衍生產(chǎn)物包含長(zhǎng)8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32或者34碳的碳鏈。在其他實(shí)例中，至少60％，70％，80％，85％，90％或者95％的脂肪酸衍生產(chǎn)物包含1，2，3，4或者5的不飽和點(diǎn)。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生脂肪酸衍生物的方法。這些方法包括培養(yǎng)本文描述的微生物以及從發(fā)酵肉湯分離產(chǎn)物。
這些以及其他實(shí)例在下面的詳細(xì)說(shuō)明中被進(jìn)一步描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示FAS生物合成途徑。
圖2顯示產(chǎn)生蠟的生物合成途徑。可以在宿主細(xì)胞中利用宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的醇產(chǎn)生蠟，或者可以向培養(yǎng)基中添加外源醇來(lái)產(chǎn)生蠟。被設(shè)計(jì)產(chǎn)生蠟的微生物將利用外源核酸序列以及硫酯酶(EC 3.1.2.14)序列產(chǎn)生蠟合酶(EC 2.3.1.75)。其他可以被調(diào)控增加蠟生成的酶包括參與脂肪酸合成的酶(FAS酶EC 2.3.1.85)，?；o酶A合酶(EC 2.3.1.86)，脂肪醇形成?；o酶A還原酶(EC 1.1.1.*)，?；o酶A還原酶(1.2.1.50)和醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)。
圖3顯示產(chǎn)生脂肪醇的生物合成途徑。通過(guò)表達(dá)編碼硫酯酶(EC3.1.2.14)的以及酰基輔酶A還原酶(EC 1.2.1.50)、醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)和脂肪醇形成?；o酶A還原酶(FAR，EC 1.1.1*)的組合的外源核酸序列可以產(chǎn)生具有確定碳鏈長(zhǎng)度的脂肪醇。其他能夠被調(diào)控增加脂肪醇生成的酶包括參與脂肪酸合成的酶(FAS酶EC 2.3.1.85)和?；o酶A合酶(EC 2.3.1.86)。
圖4顯示產(chǎn)生脂肪酸酯的生物合成途徑。通過(guò)外源表達(dá)各種硫酯酶(EC 3.1.2.14)，以及?；o酶A還原酶(1.2.1.50)、醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)和脂肪醇形成?；o酶A還原酶(FAR，EC 1.1.1*)的組合，和乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.84)，可以產(chǎn)生具有確定碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸酯。其他能夠被調(diào)控增加脂肪酸酯生成的酶包括參與脂肪酸合成的酶(FAS酶EC2.3.1.85)和?；o酶A合酶(EC 2.3.1.86)。
圖5顯示按照實(shí)施例4的描述，用pCDFDuet-1-fadD-acr1和包含各種硫酯酶基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化菌株的脂肪醇生成。在25℃的搖瓶中，所述菌株在包含0.4％葡萄糖的M9礦物培養(yǎng)基中好氧生長(zhǎng)。鑒定出飽和的C10、C12、C14、C16和C18脂肪醇。在一些樣品中還檢測(cè)出少量的C16:1和C18:1脂肪醇。利用乙酸乙酯從細(xì)胞沉淀提取脂肪醇，并利用N-三甲基硅烷基(TMS)咪唑?qū)⑵溲苌栽鰪?qiáng)檢測(cè)。
圖6顯示從制備菌株釋放脂肪醇。當(dāng)細(xì)胞在37℃生長(zhǎng)時(shí)，大約50％的生成的脂肪醇從細(xì)胞釋放。
圖7A-圖7D顯示表達(dá)醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(AATs，EC 2.3.1.84)的制備宿主和表達(dá)蠟合酶(EC 2.3.1.75)的制備宿主產(chǎn)生的辛酸辛酯(C8C8)的GS-MS譜。圖7A顯示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取，其中pHZ1.43質(zhì)粒表達(dá)ADP1(蠟合酶)。圖7B顯示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取，其中pHZ1.43質(zhì)粒表達(dá)SAAT。圖7C顯示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取，其中pHZ1.43質(zhì)粒不包含ADP1(蠟合酶)或者SAAT。圖7D顯示C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)生成的C8C8的質(zhì)譜和裂解譜，其中pHZ1.43質(zhì)粒表達(dá)SAAT。
圖8顯示當(dāng)來(lái)自不動(dòng)桿菌(A.baylyi)ADP1(WSadp1)的蠟合酶與來(lái)自萼距花(Cuphea hookeriana)的硫酯酶基因在制備宿主中共表達(dá)時(shí)，制備的乙酯的分布。
圖9A和圖9B顯示GC/MS分析的色譜。圖9A顯示乙基提取物的色譜，所述乙基提取物來(lái)自于用質(zhì)粒pCDFDuet-1-fadD-WSadp1、pETDuet-1-′tesA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌LS9001菌株的培養(yǎng)物。乙醇被添加到發(fā)酵物中。圖9B顯示用作參照的棕櫚酸乙酯和油酸乙酯的色譜。
圖10是標(biāo)明各種基因的表格，所述基因可以被過(guò)量表達(dá)或者弱化以增加脂肪酸衍生物的生成。所述表格還標(biāo)明能夠被調(diào)控以改變脂肪酸衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的各種基因。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解一些用于改變脂肪酸衍生物結(jié)構(gòu)的基因還會(huì)增加脂肪酸衍生物的生成。
縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ) 提供下列關(guān)于術(shù)語(yǔ)和方法的解釋以便更好的描述本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。本文使用的“包括(comprising)”表示“包含(including)”，單數(shù)形式的“一個(gè)(a)”或者“一個(gè)(an)”或者“the”包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文明確的另外指出。例如，“包括一個(gè)細(xì)胞”指包含一個(gè)或者多個(gè)這類細(xì)胞，“包括硫酯酶”指包含一種或者多種硫酯酶肽以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其同等物，等等。術(shù)語(yǔ)“或者”是指陳述的可選擇要素或者兩個(gè)或更多個(gè)要素組合中的單個(gè)要素，除非上下文明確的另外指出。例如短語(yǔ)“硫酯酶活性或者脂肪醇形成酰基輔酶A還原酶活性”是指硫酯酶活性、脂肪醇形成?；o酶A還原酶活性或者脂肪醇形成酰基輔酶A還原酶活性和硫酯酶活性兩者的組合。
除非另外解釋，所有本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。盡管與本文描述的類似或者等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或者試驗(yàn)，但下文描述了適合的方法和材料。所述材料、方法和實(shí)施例只是說(shuō)明性的，而不是用于限制。根據(jù)下面的詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征將是明顯。
登錄號(hào)貫穿本說(shuō)明書(shū)的登錄號(hào)來(lái)源于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院維護(hù)的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(國(guó)立生物技術(shù)信息中心)。所述登錄號(hào)是2007年3月27日由該數(shù)據(jù)庫(kù)提供的。
酶分類號(hào)(EC)貫穿本說(shuō)明書(shū)提供的EC編號(hào)來(lái)自京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)維護(hù)的KEGGLigand數(shù)據(jù)庫(kù)，這由東京大學(xué)部分資助。所述EC編號(hào)是2007年3月27日由該數(shù)據(jù)庫(kù)提供的。
弱化為了降低某物的影響、活性或者強(qiáng)度。在一個(gè)實(shí)例中，特定的酶對(duì)組合物(不是產(chǎn)物或者反應(yīng)物)造成的反饋抑制或者抑制(非途徑特異性反饋)的靈敏度被降低，這樣的話所述酶活性不受化合物存在的影響。例如，fabH基因和其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列是溫度敏感的，可以將其改變以降低對(duì)溫度變化的敏感性。當(dāng)需要支鏈氨基酸時(shí)，可以使用fabH基因的弱化作用。在另一個(gè)實(shí)例中，被改變成活性更低的酶可以被稱作弱化的。
可以使用酶的功能性缺失來(lái)弱化酶。功能性缺失是對(duì)基因序列或者控制基因序列轉(zhuǎn)錄的序列進(jìn)行的突變、部分或者全部缺失、插入或者其他變化，這減少或者抑制基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，或者導(dǎo)致基因產(chǎn)物沒(méi)有功能(即本文描述的對(duì)plsB基因的突變)。例如，大腸桿菌中fabR的功能性缺失減輕了脂肪酸生物合成途徑的抑制，允許大腸桿菌產(chǎn)生更多的不飽和脂肪酸(UFAs)。在一些情況下功能性缺失被描述成敲除突變。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解存在許多弱化酶活性的方法。例如，弱化作用可以通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)通過(guò)改變核酸序列引入氨基酸序列的變化，將基因置于活性較低的啟動(dòng)子控制之下，表達(dá)針對(duì)目的基因的干擾RNA、核酶或者反義序列，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意其他技術(shù)。
碳源通常指適合作為原核生物或者簡(jiǎn)單真核細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各種形式，包括但不限于聚合物，糖，酸，醇，醛，酮，氨基酸，肽，等等。這些包括，例如，各種單糖諸如葡萄糖，低聚糖，多糖，纖維素質(zhì)，木糖，和阿拉伯糖，二糖，諸如蔗糖，飽和或者不飽和的脂肪酸，琥珀酸鹽，乳酸鹽，乙酸鹽，乙醇，等等，或者其混合物。此外，碳源還可以是光合作用產(chǎn)物，包括但不限于葡萄糖。
cDNA(互補(bǔ)DNA)一段缺少內(nèi)部、非編碼片段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列的DNA?？梢酝ㄟ^(guò)從細(xì)胞提取的信使RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
缺失從核酸分子去除一個(gè)或者多個(gè)核苷酸，或者從蛋白去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，再將兩邊的區(qū)域連接到一起。
可檢測(cè)的能夠確定出現(xiàn)或者存在。例如，使用根據(jù)下面實(shí)施例11提供的方法，從反應(yīng)物產(chǎn)生的產(chǎn)物(諸如C18脂肪酸的生成)是可檢測(cè)的。
DNA脫氧核糖核酸。DNA是長(zhǎng)鏈聚合物，其包括大部分活的有機(jī)體(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遺傳物質(zhì)。DNA聚合物中的重復(fù)單位是4種不同的核苷酸，其包括4種堿基，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種，所述堿基上結(jié)合有脫氧核糖，而磷酸基與所述脫氧核糖連接。DNA分子中被稱為密碼子的核苷酸三聯(lián)體編碼肽的氨基酸。術(shù)語(yǔ)密碼子還指mRNA中3核苷酸的對(duì)應(yīng)(和互補(bǔ))序列，所述DNA序列被轉(zhuǎn)錄成所述mRNA。
內(nèi)源的當(dāng)在本文中對(duì)核酸分子和特定的細(xì)胞或者微生物使用時(shí)，是指位于細(xì)胞內(nèi)的核酸序列或者肽，其不是利用重組工程技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞的。例如，當(dāng)細(xì)胞最初從自然界分離時(shí)，已經(jīng)存在于所述細(xì)胞中的基因。即使調(diào)控序列諸如激活轉(zhuǎn)錄或者翻譯的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列已經(jīng)通過(guò)重組技術(shù)被改變，基因仍被認(rèn)為是內(nèi)源的。
外源的本文中對(duì)核酸分子和特定的細(xì)胞使用時(shí)，是指不是來(lái)源于自然界發(fā)現(xiàn)的特定細(xì)胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入細(xì)胞，則其被認(rèn)為是外源的。對(duì)特定細(xì)胞來(lái)說(shuō)，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦從細(xì)胞X分離的完整編碼序列被引入細(xì)胞Y，則該編碼序列對(duì)細(xì)胞Y來(lái)說(shuō)是外源核酸，即使X和Y是相同的細(xì)胞類型。
表達(dá)基因的編碼信息被轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能諸如蛋白、轉(zhuǎn)移RNA或者核糖體RNA的過(guò)程。表達(dá)的基因包括那些被轉(zhuǎn)錄為mRNA然后被翻譯為蛋白的基因，以及那些被轉(zhuǎn)錄為RNA但不被翻譯為蛋白的基因(例如，轉(zhuǎn)移和核醣體RNAs)。
脂肪酯包括由脂肪酸制備的任意酯。脂肪酸的碳鏈可以包含本文描述的修飾的任意組合。例如，碳鏈可以包含一個(gè)或多個(gè)不飽和點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)分枝點(diǎn)(包括環(huán)狀分枝)，以及可以被工程化變得短或者長(zhǎng)。任何醇都可以用于形成脂肪酸酯，例如來(lái)自脂肪酸生物合成途徑的醇，由制備宿主通過(guò)非脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生的醇，和發(fā)酵肉湯中提供的醇。
脂肪酸衍生物包括部分由宿主生物體的脂肪酸生物合成途徑制備的產(chǎn)物。脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸合酶，其可以按照本文的描述被工程化產(chǎn)生脂肪酸衍生物，以及在一些實(shí)例中其可以與其他酶一起表達(dá)以產(chǎn)生具有所需碳鏈特性的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括諸如短鏈和長(zhǎng)鏈醇、烴和脂肪酸酯，包括蠟。
發(fā)酵肉湯包括任意支持微生物生命(即主動(dòng)代謝碳的微生物)的培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。
烴包括那些包含元素碳(C)和氫(H)的化合物。所有烴都由碳骨架以及與該骨架連接的氫原子構(gòu)成。有時(shí)，該術(shù)語(yǔ)被用作術(shù)語(yǔ)“脂肪烴”的簡(jiǎn)稱?；旧洗嬖?種類型的烴(1)芳香族烴，其具有至少一個(gè)芳香環(huán)；(2)飽和烴，亦稱為烷，其缺少雙鍵、三鍵或者芳香鍵；和(3)不飽和烴，其在碳原子之間具有一個(gè)或者多個(gè)雙鍵或者三鍵，被分成烯烴、炔和二烯。液體的地質(zhì)提取的烴被稱作石油(字面理解是“巖石油”)或者礦物油，而氣態(tài)的地質(zhì)烴被稱作天然氣。所有這些均是作為制備有機(jī)化學(xué)品的原料的燃料和原材料的主要來(lái)源，它們通常是利用石油地質(zhì)工具在地球表面下發(fā)現(xiàn)的。沉積巖中的石油儲(chǔ)備是用于能源和化學(xué)工業(yè)的烴的主要來(lái)源。烴在經(jīng)濟(jì)上非常重要，因?yàn)樗鼈儼酥饕剂?煤，石油，天然氣，等等)和生物燃料以及塑料、蠟、溶劑和油類的成分。
分離的“分離的”生物學(xué)組分(諸如核酸分子、蛋白或者細(xì)胞)已經(jīng)基本上從該組分天然存在的其他生物學(xué)組分中分離或者純化，諸如其他染色體的和染色體外的DNA和RNA，以及蛋白。已經(jīng)被“分離的”核酸分子和蛋白包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包含在宿主細(xì)胞中利用重組表達(dá)制備的核酸分子和蛋白，以及化學(xué)合成的核酸分子和蛋白。
在一個(gè)實(shí)例中，分離的是指天然存在的核酸分子與兩個(gè)序列不是直接鄰接的，而在作為其來(lái)源的天然存在的生物體基因組中其與所述兩個(gè)序列是直接鄰接的(一個(gè)在5′端，一個(gè)在3′端)。
微生物包括來(lái)自古細(xì)菌域、真細(xì)菌域和真核生物域的原核和真核微生物種，后者包括酵母和絲狀真菌、原生動(dòng)物、藻類或者更高等的原生生物。術(shù)語(yǔ)“微生物細(xì)胞”和“微生物(microbes)”可以與術(shù)語(yǔ)微生物(microorganism)互換使用。
核酸分子包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因組DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化學(xué)合成或者重組產(chǎn)生的核酸分子。核酸分子可以是雙鏈或者單鏈的。單鏈時(shí)，核酸分子可以是正義鏈或者反義鏈。此外，核酸分子可以是環(huán)狀或者線性的。
可操作的連接當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列具有功能關(guān)系時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作的連接。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或者表達(dá)，則所述啟動(dòng)子與所述編碼序列可操作的連接。通常，可操作連接的DNA序列是連接的，并且必要時(shí)在相同閱讀框內(nèi)連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域。作為單個(gè)信使RNA串聯(lián)轉(zhuǎn)錄的分離基因的結(jié)構(gòu)被稱為操縱子。因此將基因緊密相鄰置于單個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下，例如在質(zhì)粒載體中，則構(gòu)成合成操縱子。
ORF(開(kāi)放閱讀框)不含任何終止密碼子的一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。這些序列通?？梢员环g為肽。
過(guò)表達(dá)當(dāng)基因的轉(zhuǎn)錄速率與其內(nèi)源轉(zhuǎn)錄速率相比提高的時(shí)候。在一些實(shí)例中，過(guò)表達(dá)還包括基因的翻譯速率高于該基因的內(nèi)源翻譯速率。檢測(cè)過(guò)表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的。例如可以利用rtPCR評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄的RNA水平，以及利用SDS page凝膠分析評(píng)價(jià)蛋白水平。
純化的術(shù)語(yǔ)“純化的”并不需要絕對(duì)的純度；它只是一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如，純化的脂肪酸衍生物制品(諸如蠟或者脂肪酸酯制品)是指比位于其細(xì)胞環(huán)境內(nèi)的產(chǎn)物濃度更高的產(chǎn)物。例如，純化的蠟是指與和其相伴的細(xì)胞組分(核酸、脂、糖和其他肽)基本上分離的蠟。在另一個(gè)實(shí)例中，純化的蠟制品是指基本上不含污染物(諸如那些發(fā)酵后可能存在的污染物)的蠟。
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)按重量計(jì)至少大約50％的樣品由脂肪酸酯組成時(shí)，例如當(dāng)至少大約60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，98％或者99％或者更高比例的樣品由脂肪酸酯組成時(shí)，脂肪酸酯是純化的?？捎糜诩兓?、脂肪醇和脂肪酸酯的方法的實(shí)例包括下面實(shí)施例11描述的方法。
重組重組核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工組合序列的兩個(gè)另外分離的序列片段制備的序列，或者以上兩者。例如可以通過(guò)化學(xué)合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分離片段，諸如遺傳工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)這種人工組合。重組還用于描述以下核酸分子，它們已經(jīng)被人工處理，但包含的調(diào)控序列和編碼區(qū)與分離所述核酸的生物體中發(fā)現(xiàn)的相同。重組細(xì)胞或者微生物是包含外源核酸分子諸如重組核酸分子的細(xì)胞或者微生物。
釋放化合物從細(xì)胞內(nèi)部(胞內(nèi))向細(xì)胞外部(胞外)的運(yùn)動(dòng)。該運(yùn)動(dòng)可以是主動(dòng)或者被動(dòng)的。當(dāng)釋放是主動(dòng)的時(shí)候，它可以被一種或者多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽推動(dòng)，在一些實(shí)例中，它可以消耗能量。當(dāng)釋放是被動(dòng)的時(shí)候，它能夠通過(guò)擴(kuò)散穿過(guò)膜，可以通過(guò)連續(xù)收集來(lái)自胞外環(huán)境的所需化合物來(lái)推動(dòng)，從而促進(jìn)進(jìn)一步的擴(kuò)散?；衔锏尼尫胚€可以通過(guò)裂解細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
表面活性劑能夠降低液體表面張力的物質(zhì)，其中該物質(zhì)溶于所述液體中。它們通常由水溶性的頭和烴鏈或者尾組成。水溶性基團(tuán)是親水性的，可以是離子的或者非離子的，而烴鏈?zhǔn)鞘杷缘?。表面活性劑被用于各種產(chǎn)品，包括去污劑和清潔劑，還可用作紡織品、皮革和紙的輔助劑，用于化工工藝、化妝品和藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)。此外，它們還可以用于輔助提取和分離處于難以接近環(huán)境的原油或者作為水乳膠。
根據(jù)不同的用途劃分存在4類表面活性劑。陰離子表面活性劑具有去污劑樣活性，通常適用于清潔用途。陽(yáng)離子表面活性劑包含長(zhǎng)鏈烴，通常被用于處理蛋白和合成聚合物或者作為織物柔軟劑和護(hù)發(fā)素的成分。兩性表面活性劑也包含長(zhǎng)鏈烴，通常在洗發(fā)劑中使用。非離子型表面活性劑通常被用于清潔產(chǎn)品。
轉(zhuǎn)化或者重組細(xì)胞例如通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)被引入核酸分子(諸如編碼?；o酶A合酶的核酸分子)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化包括能夠?qū)⒑怂岱肿右脒@類細(xì)胞的所有技術(shù)，包括但不限于，利用病毒載體轉(zhuǎn)染，接合作用，利用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，和通過(guò)電穿孔的裸DNA引入，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和顆粒槍加速。
在允許產(chǎn)物生成的條件下任何允許微生物產(chǎn)生所需產(chǎn)物(諸如脂肪酸，烴，脂肪醇，蠟或者脂肪酸酯)的發(fā)酵條件。發(fā)酵條件通常包括溫度范圍，通氣水平，和培養(yǎng)基選擇，將上述條件組合時(shí)允許微生物生長(zhǎng)。示例性的培養(yǎng)基包括肉湯或者凝膠。通常，培養(yǎng)基包括碳源諸如葡萄糖，果糖，纖維素，或者可以被微生物直接代謝的類似物，或者可以在培養(yǎng)基中使用促進(jìn)代謝碳源的酶。為了確定培養(yǎng)條件是否允許產(chǎn)物生成，將微生物培養(yǎng)24、36或者48小時(shí)，收集并分析樣品。例如，可以檢測(cè)樣品或者培養(yǎng)基(細(xì)胞在其中生長(zhǎng))的細(xì)胞中所需產(chǎn)物的存在。當(dāng)分析產(chǎn)物的存在時(shí)，可以使用下面實(shí)例提供的那些方法。
載體作為引入細(xì)胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的核酸分子。載體可以包括允許其在細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，諸如復(fù)制原點(diǎn)。載體還可以包括一種或者多種選擇性標(biāo)志物基因和本領(lǐng)域已知的其他遺傳成分。
蠟在指定物理?xiàng)l件下形成固體或者柔軟物質(zhì)的各種脂肪酸酯。被稱為蠟的脂肪酸酯通常比不是蠟的脂肪酸酯具有更長(zhǎng)的碳鏈。例如，室溫下蠟通常形成柔軟的物質(zhì)。
詳細(xì)說(shuō)明 I.脂肪酸衍生物的制備 被外源DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體可以是修飾的宿主生物體，例如生物體被修飾以增加?；鵄CP或者?；o酶A的產(chǎn)生，減少脂肪酸衍生物和中間物的分解代謝，或者降低生物合成途徑特定點(diǎn)的反饋抑制。除了修飾本文描述的基因外，其他細(xì)胞資源也可以被轉(zhuǎn)向過(guò)量產(chǎn)生脂肪酸，例如乳酸鹽、琥珀酸鹽和/或乙酸鹽途徑可以被弱化，而乙酰輔酶A羧化酶(ACC)被過(guò)表達(dá)。本文描述的制備宿主的修飾可以通過(guò)基因組改變、染色體外表達(dá)系統(tǒng)或者其組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。圖1和圖2提供所述途徑的概述。
A.乙酰輔酶A-丙二酰輔酶A到?；?ACP 脂肪酸合酶(FAS)是一組催化?；溒鹗己脱由斓碾?Marrakchi etal.，Biochemical Society，301050-1055，2002)。?；d體蛋白(ACP)以及FAS途徑的酶控制產(chǎn)生的脂肪酸的長(zhǎng)度、飽和度和分枝。被歸入FAS的酶包括AccABCD，F(xiàn)abD，F(xiàn)abH，F(xiàn)abG，F(xiàn)abA，F(xiàn)abZ，F(xiàn)abI，F(xiàn)abK，F(xiàn)abL，F(xiàn)abM，F(xiàn)abB和FabF。根據(jù)期望的產(chǎn)物，這些基因的一種或者多種可以被弱化或者過(guò)表達(dá)。
例如，制備宿主的脂肪酸生物合成途徑中使用前體乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A(圖2)。被工程化過(guò)量產(chǎn)生這些組分的大腸桿菌或者其他宿主生物體可以作為后續(xù)遺傳工程步驟的起點(diǎn)，以提供特異性輸出產(chǎn)物(諸如脂肪酸酯，烴，脂肪醇)?？梢詫?duì)宿主菌株進(jìn)行數(shù)種不同的修飾，其聯(lián)合或者單獨(dú)進(jìn)行，以獲得增加的乙酰輔酶A/丙二酰輔酶A/脂肪酸和脂肪酸衍生產(chǎn)物。例如，為了增加乙酰輔酶A生成，可以構(gòu)建以下質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含pdh，panK，aceEF，(編碼丙酮酸鹽和2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的E1p脫氫酶組分和E2p二氫硫辛酰胺酰基轉(zhuǎn)移酶組分)，fabHbbcpbF，以及在一些實(shí)例中編碼脂酰輔酶A還原酶和醛去羰基化酶的其他DNA，它們均位于組成性或者另外的可控啟動(dòng)子的控制下。這些基因的示例性的Genbank登錄號(hào)是pdh(BAB34380，AAC73227，AAC73226)，panK(也稱為coaA，AAC76952)，aceEF(AAC73227，AAC73226)，fabH(AAC74175)，fabD(AAC74176)，fabG(AAC74177)，acpP(AAC74178)，fabF(AAC74179)。
此外，通過(guò)用不包含相應(yīng)基因或者包含其缺失突變的條件復(fù)制型或者非復(fù)制型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，或者通過(guò)替代啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列，在工程化微生物中fadE，gpsA，ldhA，pflb，adhE，pta，poxB，ackA，和/或ackB可以被敲除，或者它們的表達(dá)水平可以被降低。這些基因示例性的Genbank登錄號(hào)是fadE(AAC73325)，gspA(AAC76632)，ldhA(AAC74462)，pflb(AAC73989)，adhE(AAC74323)，pta(AAC75357)，poxB(AAC73958)，ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。
獲得的工程化微生物可以在希望的環(huán)境中生長(zhǎng)，例如包含有限甘油的環(huán)境(培養(yǎng)基中低于1％ w/v)。這樣的話，這些微生物產(chǎn)生乙酰輔酶A的水平將增加。利用重頭合成質(zhì)粒中包含的編碼accABCD(乙酰輔酶A羧化酶，例如登錄號(hào)AAC73296，EC 6.4.1.2)的DNA，按照上文所述工程化微生物可以影響丙二酰輔酶A的過(guò)量產(chǎn)生。還可以在重頭合成質(zhì)粒中包含編碼脂肪酶(例如登錄號(hào)CAA89087，CAA98876)的DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)脂肪酸的過(guò)量產(chǎn)生。
在一些實(shí)例中，乙酰輔酶A羧化酶(ACC)被過(guò)表達(dá)以增加其胞內(nèi)濃度，例如是天然表達(dá)水平的至少2倍，諸如至少5倍，或者至少10倍。
此外，plsB(例如登錄號(hào)AAC77011)D311E突變可用于去除?；o酶A庫(kù)的限制。
此外，在制備宿主中可以包含sfa基因(FabA的抑制基因，例如登錄號(hào)AAN79592)的過(guò)表達(dá)以增加單不飽和脂肪酸的生成(Rock et al.，J.Bacteriology 1785382-5387，1996)。
B.?；鵄CP到脂肪酸 為了工程化制備宿主以產(chǎn)生脂肪酸衍生物的均質(zhì)群，一種或者多種內(nèi)源基因可以被弱化或者功能性去除，并且一種或者多種硫酯酶可以被表達(dá)。例如，通過(guò)弱化硫酯酶C18(例如登錄號(hào)AAC73596和P0ADA1)(其使用C18:1-ACP)并表達(dá)硫酯酶C10(例如登錄號(hào)Q39513)(其使用C10-ACP)來(lái)產(chǎn)生C10脂肪酸衍生物。因此，產(chǎn)生碳鏈長(zhǎng)度為10的脂肪酸衍生物的相對(duì)均質(zhì)群。在另一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)弱化內(nèi)源硫酯酶(其產(chǎn)生非C14脂肪酸)并表達(dá)硫酯酶登錄號(hào)Q39473(其使用C14-ACP)來(lái)產(chǎn)生C14脂肪酸衍生物。在另一實(shí)例中，通過(guò)表達(dá)使用C12-ACP的硫酯酶(例如登錄號(hào)Q41635)并弱化產(chǎn)生非C12脂肪酸的硫酯酶來(lái)產(chǎn)生C12脂肪酸衍生物。利用本領(lǐng)域已知的方法，例如在細(xì)胞裂解后利用放射性前體、HPLC和GC-MS，可以驗(yàn)證乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A和脂肪酸的過(guò)量產(chǎn)生。
表1 硫酯酶 *Mayer et al.，BMC Plant Biology 71-11，2007. C.脂肪酸到?；o酶A 可以利用已知的肽工程化制備宿主以產(chǎn)生各種長(zhǎng)度的脂肪酸。一種制備脂肪酸的方法涉及增加一種或者多種酰基輔酶A合酶肽(EC2.3.1.86)的表達(dá)或者表達(dá)它們更具活性的形式。
本文使用的?；o酶A合酶包括屬于酶分類號(hào)EC 2.3.1.86的肽，以及能夠催化脂肪酸轉(zhuǎn)化為?；o酶A的任意其他肽。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解一些?；o酶A合酶肽同樣也能催化其他反應(yīng)，例如一些?；o酶A合酶肽將接受脂肪酸以外的其他底物。因此還包括這類非特異性?；o酶A合酶肽。酰基輔酶A合酶肽的序列是公開(kāi)提供的。圖10提供示例性的GenBank登錄號(hào)。
D.?；o酶A到脂肪醇 可以利用已知的多肽工程化制備宿主以便從?；o酶A產(chǎn)生脂肪醇。一種制備脂肪醇的方法涉及增加脂肪醇形成?；o酶A還原酶(FAR，EC 1.1.1.*)或者酰基輔酶A還原酶(EC 1.2.1.50)和乙醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)的表達(dá)或者表達(dá)它們更具活性的形式。在下文中脂肪醇形成?；o酶A還原酶(FAR，EC 1.1.1.*)、?；o酶A還原酶(EC 1.2.1.50)和醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)被總稱為脂肪醇形成肽。在一些實(shí)例中，所有這3種脂肪醇形成基因都能在制備宿主中過(guò)表達(dá)，而在其他實(shí)例中，一種或者多種脂肪醇形成基因可以被過(guò)表達(dá)。
本文使用的脂肪醇形成肽包括屬于酶分類號(hào)EC 1.1.1.*、1.2.1.50和1.1.1.1的肽，以及能夠催化?；o酶A轉(zhuǎn)化為脂肪醇的任意其他肽。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解一些脂肪醇形成肽同樣也能催化其他反應(yīng)，例如一些酰基輔酶A還原酶將接受脂肪酸以外的其他底物。因此還包括這類非特異性肽。脂肪醇形成肽的序列是公開(kāi)提供的。圖10提供示例性的GenBank登錄號(hào)。
脂肪醇還被描述為基于烴的表面活性劑。為了制備表面活性劑，微生物被修飾以便從可再生碳源產(chǎn)生表面活性劑。這類微生物包括第一外源DNA序列和第二外源DNA序列，所述第一外源DNA序列編碼能夠?qū)⒅舅徂D(zhuǎn)化為脂肪醛的蛋白，所述第二外源DNA序列編碼能夠?qū)⒅救┺D(zhuǎn)化為醇的蛋白。在一些實(shí)例中，第一外源DNA序列編碼脂肪酸還原酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二外源DNA序列編碼哺乳動(dòng)物微粒體的醛還原酶或者長(zhǎng)鏈醛脫氫酶。在另一個(gè)實(shí)例中，第一和第二外源DNA序列來(lái)自于節(jié)桿菌AK19(Arthrobacter AK 19)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinins)、不動(dòng)桿菌M-1菌株(Acinobacter sp strain M-1)或者解脂假絲酵母(Candidalipolytica)的多酶復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二異源DNA序列來(lái)自于不動(dòng)桿菌M-1株或者解脂假絲酵母的多酶復(fù)合物。
可用于表面活性劑制備的異源DNA序列(其編碼將脂肪酸轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈醇的蛋白)的其他來(lái)源包括，但不限于，高山被孢霉(Mortierella alpina)(ATCC 32222)，彎曲隱球菌(Crytococcus curvatus)(也稱為Apiotricumcurvatum)，Alcanivorax jadensis(T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)，不動(dòng)桿菌HO1-N(Acinetobacter sp.HO1-N)，(ATCC 14987)和混濁紅球菌(Rhodococcus opacus)(PD630 DSMZ 44193)。
在一個(gè)實(shí)例中，脂肪酸衍生物是飽和的或者不飽和的表面活性劑產(chǎn)物，其具有限于6-36個(gè)碳原子的碳原子含量。在另一個(gè)實(shí)例中，表面活性劑產(chǎn)物具有限于24-32個(gè)碳原子的碳原子含量。
用于產(chǎn)生表面活性劑的合適宿主可以是真核或者原核微生物。示例性的宿主包括節(jié)桿菌AK19，粘紅酵母，不動(dòng)桿菌M-1菌株，擬南芥(Arabidopsis thalania)或者解脂假絲酵母，釀酒酵母，和大腸桿菌，其被工程化表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶。先天具有合成高水平的脂和油形式的表面活性劑前體的宿主，諸如混濁紅球菌，節(jié)桿菌AK19，粘紅酵母和大腸桿菌，其被工程化表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶，以及其他油質(zhì)細(xì)菌、酵母和真菌也可以被使用。
E.脂肪醇到脂肪酯 可以利用已知的多肽工程化制備宿主以產(chǎn)生各種長(zhǎng)度的脂肪酯。一種制備脂肪酯的方法包括增加一種或者多種醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽(EC 2.3.1.84)的表達(dá)或者表達(dá)其更具活性的形式。這些肽催化乙酰輔酶A和醇的反應(yīng)，從而形成輔酶A和乙酸酯。在一些實(shí)例中，醇O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶肽可以與挑選的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽聯(lián)合表達(dá)，從而允許控制碳鏈長(zhǎng)度、飽和和分枝度。在一些情況下，可以共表達(dá)bkd操縱子以便產(chǎn)生支鏈脂肪酸前體。
本文使用的醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽包括屬于酶分類號(hào)EC 2.3.1.84的肽，以及能夠催化乙酰輔酶A和醇轉(zhuǎn)化形成輔酶A和乙酸酯的任意其他肽。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽將同樣催化其他反應(yīng)，例如一些醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽將接受脂肪醇或者乙酰輔酶A硫酯之外的其他底物，即諸如其他醇和其他?；o酶A硫酯。因此還包括這類非特異性或者各種特異性的醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽。醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽的序列是公開(kāi)提供的。圖10提供示例性的GenBank登錄號(hào)。用于表征特定醇O-乙?；D(zhuǎn)移酶肽活性的分析是本領(lǐng)域公知的。還可以產(chǎn)生工程化的O-乙?；D(zhuǎn)移酶和O-?；D(zhuǎn)移酶，它們對(duì)供體?；蛘呤荏w醇部分具有新的活性和特異性?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域記載的合理的進(jìn)化方法產(chǎn)生工程化酶。
F.?；o酶A到脂肪酯(生物柴油和蠟) 可以利用已知的肽工程化制備宿主以便從?；o酶A和醇產(chǎn)生脂肪酸酯。在一些實(shí)例中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中提供醇，而在其他實(shí)例中，如本文所述制備宿主可以提供醇。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在結(jié)構(gòu)上脂肪酸酯具有A側(cè)和B側(cè)。在本文中描述時(shí)，酯的A側(cè)用于描述醇提供的碳鏈，而酯的B側(cè)用于描述?；o酶A提供的碳鏈。鏈可以是飽和或者不飽和的，分枝或者不分枝的。制備宿主可以被工程化產(chǎn)生脂肪醇或者短鏈的醇。制備宿主還可以被工程化產(chǎn)生特異性?；o酶A分子。本文使用的脂肪酸酯是來(lái)自脂?；蝓ズ痛嫉孽?，其中所述酯的A側(cè)和B側(cè)的長(zhǎng)度可以獨(dú)立的不同。通常，酯的A側(cè)的長(zhǎng)度至少為1，2，3，4，5，6，7或者8個(gè)碳，而酯的B側(cè)的長(zhǎng)度是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26個(gè)碳。A側(cè)和B側(cè)可以是直鏈或者支鏈的，飽和或者不飽和的。
可以利用已知的多肽工程化脂肪酯的制備，其包括來(lái)自?；o酶A和醇的蠟。本文使用的蠟是長(zhǎng)鏈脂肪酸酯，其中所述酯的A側(cè)和B側(cè)的長(zhǎng)度可以獨(dú)立的不同。通常，酯的A側(cè)的長(zhǎng)度至少是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26個(gè)碳。類似地，酯的B側(cè)的長(zhǎng)度至少是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26個(gè)碳。A側(cè)和B側(cè)可以是單、雙或者三不飽和的。可以利用已知的多肽工程化脂肪酯的制備，其包括來(lái)自?；o酶A和醇的蠟。一種制備脂肪酯的方法包括增加一種或者多種蠟合酶(EC 2.3.1.75)的表達(dá)或者表達(dá)其更具活性的形式。
本文使用的蠟合酶包括屬于酶分類號(hào)EC 2.3.1.75的肽，以及能夠催化?；蝓マD(zhuǎn)化為脂肪酯的任意其他肽。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解一些蠟合酶肽同樣也能催化其他反應(yīng)，例如一些蠟合酶肽將接受短鏈?；o酶A和短鏈醇以產(chǎn)生脂肪酯。因此還包括這類非特異性蠟合酶。蠟合酶肽的序列是公開(kāi)提供的。圖10提供示例性的GenBank登錄號(hào)。鑒定蠟合酶活性的方法提供于美國(guó)專利第7,118,896號(hào)，其通過(guò)引用并入本文。
在特定實(shí)例中，如果所需產(chǎn)物是基于脂肪酯的生物燃料，則微生物被修飾以便從可再生能源產(chǎn)生脂肪酯。這類微生物包括編碼蠟酯合酶的外源DNA序列，其被表達(dá)以便給予所述微生物從可再生能源合成飽和的、不飽和的或者支鏈脂肪酯的能力。在一些實(shí)施方式中，蠟酯合成蛋白包括，但不限于脂肪酸延長(zhǎng)酶(elongases)，?；o酶A還原酶，?；D(zhuǎn)移酶或者蠟合酶，脂?；D(zhuǎn)移酶，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，?；o酶A蠟醇?；D(zhuǎn)移酶，雙功能蠟酯合酶/?；o酶A二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶，其選自希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不動(dòng)桿菌ADP1菌株(Acinetobactersp.strain ADP1)(更為正式地乙酸鈣不動(dòng)桿菌ADP1(Acinetobactercalcoaceticus ADP1))、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、Fundibacterjadensis、擬南芥或者真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alkaligenes eutrophus)的多酶復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酸延長(zhǎng)酶、?；o酶A還原酶或者蠟合酶來(lái)自于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌以及文獻(xiàn)中已知產(chǎn)生蠟和脂肪酸酯的其他生物體的多酶復(fù)合物。
編碼蠟合成蛋白(其可用于脂肪酯制備)的異源DNA的其他來(lái)源包括但不限于，高山被孢霉(例如ATCC 32222)，彎曲隱球菌(也稱為Apiotricum curvatum)，Alcanivoraxjadensis(例如T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)，不動(dòng)桿菌HO1-N(例如ATCC 14987)和混濁紅球菌(例如PD630，DSMZ 44193)。
本文描述的方法允許制備不同長(zhǎng)度的脂肪酯。在一個(gè)實(shí)例中，脂肪酸酯產(chǎn)物是飽和的或者不飽和的脂肪酯產(chǎn)物，其具有24-46個(gè)碳原子的碳原子含量。在一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酯產(chǎn)物具有24-32個(gè)碳原子的碳原子含量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酯產(chǎn)物具有14和20個(gè)碳的碳含量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酯是C18:1的甲酯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酯是C16:1的乙酯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酯是C16:1的甲酯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪酸酯是辛醇的十八烷酯。
用于產(chǎn)生脂肪酯的有用宿主可以是真核或者原核微生物。在一些實(shí)施方式中，這類宿主包括但不限于，釀酒酵母，解脂假絲酵母，大腸桿菌，節(jié)桿菌AK 19，粘紅酵母，不動(dòng)桿菌M-1菌株，解脂假絲酵母和其他油脂性微生物。
在一個(gè)實(shí)例中，使用來(lái)自不動(dòng)桿菌ADP1基因座AAO17391的蠟酯合酶(描述于Kalscheuer和Steinbuchel，J.Biol.Chem.2788075-8082，2003，通過(guò)引用并入本文)。在另一個(gè)實(shí)例中，使用來(lái)自希蒙得木基因座AAD38041的蠟酯合酶。
任選的使用蠟酯輸出者(exporter)諸如FATP家族的成員以促進(jìn)蠟或者酯釋放入胞外環(huán)境?？梢允褂玫南烏ポ敵稣邔?shí)例是脂肪酸(長(zhǎng)鏈)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CG7400-PA同種型A，這是來(lái)自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)基因座NP_524723的同種型。
G.酰基ACP、?；o酶A到烴 已知多種微生物產(chǎn)生烴，諸如烷、烯烴和類異戊二烯。這些烴中的許多來(lái)源于脂肪酸生物合成。通過(guò)控制天然宿主中與脂肪酸生物合成有關(guān)的基因，可以控制這些烴的產(chǎn)生。例如，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)的烴生物合成經(jīng)由脂肪醛的脫羰作用實(shí)現(xiàn)。通過(guò)脂酰輔酶A還原酶還原脂酰硫酯產(chǎn)生脂肪醛。因此，通過(guò)工程化布朗葡萄藻(B.braunii)表達(dá)特定基因諸如硫酯酶(其控制被導(dǎo)入烷生物合成途徑的脂肪酸的鏈長(zhǎng))，可以控制烷終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。在布朗葡萄藻中表達(dá)產(chǎn)生支鏈脂肪酸生物合成的酶將產(chǎn)生支鏈烷。引入影響脂肪酸去飽和產(chǎn)生的基因?qū)a(chǎn)生烯烴。這些基因的組合還可以提供對(duì)生成的烴的最終結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步控制。為了產(chǎn)生更高水平的天然或者工程化的烴，參與脂肪酸及其前體生物合成或者其他產(chǎn)物降解的基因可以被表達(dá)、過(guò)表達(dá)或者減弱。這些方法中的每一種都可用于在弗尼斯弧菌M1及其功能同系物中產(chǎn)生烷，所述弗尼斯弧菌M1通過(guò)還原脂肪醇產(chǎn)生烷(參見(jiàn)上文關(guān)于脂肪醇生成的生物合成和工程化)。這些方法中的每一種還可用于藤黃微球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、Jeogalicoccus sp.(ATCC8456)和相關(guān)微生物的許多菌株產(chǎn)生烯烴。這些微生物產(chǎn)生長(zhǎng)鏈內(nèi)烯烴，其來(lái)自于脂肪酸前體的頭對(duì)頭縮合。利用本文描述的方法控制脂肪酸前體的結(jié)構(gòu)和水平將形成不同鏈長(zhǎng)、分枝和飽和水平的烯烴。
還可以利用還原伯醇的進(jìn)化氧化/還原酶產(chǎn)生烴。已知脂肪伯醇可用于在微生物諸如弗尼斯弧菌M1中產(chǎn)生烷(Myong-Ok，J.Bacteriol.，1871426-1429，2005)。NAD(P)H依賴的氧化/還原酶是有效的催化劑。合成的NAD(P)H依賴性氧化還原酶可以利用進(jìn)化工程化產(chǎn)生，并在制備宿主中表達(dá)以產(chǎn)生脂肪酸衍生物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都清楚，“進(jìn)化”脂肪醇還原酶使其具有所需活性的方法是公知的(Kolkman和Stemmer NatBiotechnol.19423-8，2001，Ness etal.，Adv Protein Chem.55261-92，2000，Minshull和Stemmer Curr Opin Chem Biol.3284-90，1999，Huisman和Gray Curr Opin Biotechnol.Aug；13352-8，2002，以及參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0195947)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生NAD(P)H依賴性氧化還原酶文庫(kù)，所述標(biāo)準(zhǔn)方法諸如差錯(cuò)傾向PCR、位點(diǎn)特異性隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性飽和誘變或者定點(diǎn)特異性誘變。此外，還可以通過(guò)“改組”天然存在的NAD(P)H依賴性氧化還原酶編碼序列產(chǎn)生文庫(kù)。文庫(kù)在合適的宿主諸如大腸桿菌中表達(dá)。然后分析表達(dá)氧化/還原酶文庫(kù)不同成員的各個(gè)集落的氧化/還原酶的表達(dá)，所述氧化/還原酶能夠催化脂肪醇的還原。例如，可以通過(guò)針對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化、細(xì)胞提取物、透化的細(xì)胞或者純化的酶來(lái)分析每個(gè)細(xì)胞。通過(guò)分光光度或者熒光監(jiān)測(cè)NAD(P)H的脂肪醇依賴性氧化鑒定脂肪醇還原酶。通過(guò)GC/MS、TLC或者其他方法監(jiān)測(cè)烷的生成。采用這種方式鑒定的氧化/還原酶被用于產(chǎn)生烷、烯烴和相關(guān)支鏈徑。這可以在體外或者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。后者通過(guò)在諸如本文描述的那些產(chǎn)生脂肪醇的生物體中表達(dá)進(jìn)化的脂肪醇還原酶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。脂肪醇作為醇還原酶的底物，所述醇還原酶產(chǎn)生烷。其他氧化還原酶也可以被工程化催化該反應(yīng)，諸如那些使用分子氫、谷胱甘肽、FADH或者其他還原輔酶的氧化還原酶。
II.基因工程化制備菌株以增加脂肪酸衍生物的產(chǎn)生 利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，諸如電穿孔，磷酸鈣沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，結(jié)合作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)等等，可以將異源DNA序列穩(wěn)定的或者瞬時(shí)引入宿主細(xì)胞，所述異源DNA序列參與產(chǎn)生脂肪酸衍生物的生物合成途徑。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，DNA序列還包括選擇性標(biāo)志物，諸如，抗生素抗性，例如對(duì)新霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素的抗性，彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因，等等。
本文的各種實(shí)施方式利用包括異源DNA序列的表達(dá)載體，所述異源DNA序列編碼參與代謝或者生物合成途徑的蛋白。合適的表達(dá)載體包括，但不限于，病毒載體，諸如桿狀病毒載體，噬菌體(phage)載體，諸如噬菌體(bacteriophage)載體，質(zhì)粒，噬菌粒，粘粒，fosmids，細(xì)菌人工染色體，病毒載體(例如，基于以下病毒的病毒載體牛痘病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，SV40，單純皰疹病毒，等等)，基于P1的人工染色體，酵母質(zhì)粒，酵母人工染色體，和任意對(duì)目的特定宿主具有特異性的其他載體(諸如大腸桿菌、Pseudomonas pisum和釀酒酵母)。
有用的表達(dá)載體可以包括一種或者多種選擇性標(biāo)志基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型性狀。所述選擇性標(biāo)志基因編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞存活或者生長(zhǎng)必需的蛋白。沒(méi)有轉(zhuǎn)化包含選擇性標(biāo)志基因的載體的宿主細(xì)胞將不會(huì)在培養(yǎng)基中存活。通常的選擇基因編碼以下蛋白(a)提供對(duì)抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨芐青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或者四環(huán)素，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷，或者(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基沒(méi)有的重要營(yíng)養(yǎng)物，例如，編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可選的實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)志基因是編碼二氫葉酸還原酶或者提供新霉素抗性(用于真核細(xì)胞培養(yǎng))的基因，或者提供四環(huán)素或者氨芐青霉素抗性(用于原核宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌)的基因。
表達(dá)載體中編碼生物合成途徑基因產(chǎn)物的DNA序列被可操作的連接到合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，等等)，以指導(dǎo)所編碼基因產(chǎn)物的合成。這類啟動(dòng)子可以來(lái)源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根據(jù)使用的宿主/載體系統(tǒng)，表達(dá)載體可以使用大量合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件中的任意一種，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子，等等(參見(jiàn)例如，Bitter et al.，Methods in Enzymology，153516-544，1987)。
用于原核宿主細(xì)胞的合適啟動(dòng)子包括，但不限于，能夠識(shí)別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動(dòng)子，噬菌體λ的PR和PL啟動(dòng)子，大腸桿菌的trp、recA、熱休克和lacZ啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的α-淀粉酶和∑特異性啟動(dòng)子，桿菌噬菌體的啟動(dòng)子，鏈霉菌啟動(dòng)子，噬菌體λ的int啟動(dòng)子，pBR322 β-內(nèi)酰胺酶基因的bla啟動(dòng)子，和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動(dòng)子。原核啟動(dòng)子的綜述可參見(jiàn)Glick，J.Ind.Microbiol.1277，1987；Watson et al.，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE(基因的分子生物學(xué))，4th Ed.，Benjamin Cummins(1987)；和Sambrook et al.，上文。
用于真核宿主內(nèi)使用的合適真核啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例來(lái)源于病毒，包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動(dòng)子(Hamer et al.，J.Mol.Appl.Gen.1273，1982)；皰疹病毒的TK啟動(dòng)子(McKnight，Cell 31355，1982)；SV40早期啟動(dòng)子(Benoist et al.，Nature(London)290304，1981)；Rous肉瘤病毒啟動(dòng)子；巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(Foecking et al.，Gene 45101，1980)；酵母gal4基因啟動(dòng)子(Johnston，et al.，PNAS(USA)796971，1982；Silver，etal.，PNAS(USA)815951，1984)；和IgG啟動(dòng)子(Orlandi et al.，PNAS(USA)863833，1989)。
微生物宿主細(xì)胞可以用編碼生物合成途徑基因產(chǎn)物的異源DNA序列進(jìn)行遺傳修飾，所述異源DNA序列被可操作的連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的。合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于，受蛋白、代謝物或者化學(xué)制品影響的啟動(dòng)子。這些包括牛白血病病毒啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子，地塞米松誘導(dǎo)型MMTV啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子，MRP polIII啟動(dòng)子，四環(huán)素誘導(dǎo)型CMV啟動(dòng)子(諸如人即刻早期CMV啟動(dòng)子)以及那些來(lái)自trp和lac操縱子的啟動(dòng)子。
在一些實(shí)例中，遺傳修飾的宿主細(xì)胞用編碼生物合成途徑基因產(chǎn)物的異源DNA序列進(jìn)行遺傳修飾，所述異源DNA序列被可操作的連接到組成型啟動(dòng)子。合適的組成型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，包括組成型腺病毒主要晚期啟動(dòng)子，組成型MPSV啟動(dòng)子和組成型CMV啟動(dòng)子。
在一些實(shí)例中，被修飾的宿主細(xì)胞是用外源DNA序列進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞，所述外源DNA序列編碼參與生物合成途徑的單個(gè)蛋白。在其他實(shí)施方式中，被修飾的宿主細(xì)胞是用外源DNA序列進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞，所述外源DNA序列編碼兩種或更多種參與生物合成途徑的蛋白-例如，生物合成途徑的第一和第二種酶。
當(dāng)宿主細(xì)胞被遺傳修飾而表達(dá)兩種或更多種參與生物合成途徑的蛋白時(shí)，所述DNA序列可以被包含在單個(gè)或者不同的表達(dá)載體中。當(dāng)所述DNA序列被包含在單個(gè)表達(dá)載體時(shí)，在一些實(shí)施方式中，核苷酸序列被可操作的連接到常見(jiàn)控制元件(例如，啟動(dòng)子)，例如，所述常見(jiàn)控制元件控制單個(gè)表達(dá)載體中所有編碼生物合成途徑蛋白的DNA序列的表達(dá)。
當(dāng)被修飾的宿主細(xì)胞用編碼兩種或更多種參與生物合成途徑的蛋白的異源DNA序列進(jìn)行遺傳修飾時(shí)，所述DNA序列之一被可操作的連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，而所述DNA序列的一個(gè)或者多個(gè)被可操作的連接到組成型啟動(dòng)子。
在一些實(shí)施方式中，可以增加生物合成途徑中間物的胞內(nèi)濃度(例如，遺傳修飾的宿主細(xì)胞的中間物濃度)以進(jìn)一步提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量。有許多方式可以增加中間物的胞內(nèi)濃度，包括但不限于，增加培養(yǎng)基中生物合成途徑底物的濃度；增強(qiáng)在生物合成途徑中起作用的酶的催化活性；增加底物(例如，初始底物)的胞內(nèi)量，所述底物是在生物合成途徑中起作用的酶的底物；等等。
在一些實(shí)例中，脂肪酸衍生物或者中間物在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中生成。有許多方式可以增加細(xì)胞質(zhì)濃度，包括但不限于，將脂肪酸結(jié)合輔酶A形成酰基輔酶A硫酯。此外，通過(guò)增加細(xì)胞中輔酶A的生物合成可以增加?；o酶A的濃度，諸如通過(guò)過(guò)表達(dá)與泛酸鹽生物合成有關(guān)的基因(panD)或者敲除與谷胱甘肽生物合成有關(guān)的基因(谷胱甘肽合酶)。
III.碳鏈特性 利用本文提供的教導(dǎo)可以制備大量產(chǎn)物。這些產(chǎn)物包括烴、脂肪醇、脂肪酸酯和蠟。其中一些產(chǎn)物可以用作生物燃料和專用化學(xué)品?？梢栽O(shè)計(jì)并在微生物中產(chǎn)生這些產(chǎn)物?？梢灾苽洚a(chǎn)物，以致它們包含分枝點(diǎn)、飽和水平和碳鏈長(zhǎng)度，從而使這些產(chǎn)物成為許多應(yīng)用所需的起始材料(圖10提供可以單獨(dú)或者聯(lián)合使用制備各種脂肪酸衍生物的各種酶的說(shuō)明)。
在其他實(shí)例中，可以將來(lái)源于不同物種的外源FAS基因的表達(dá)或者工程化的變異體引入宿主細(xì)胞，引起在結(jié)構(gòu)上(長(zhǎng)度，分枝，不飽和度，等等)與天然宿主不同的脂肪酸代謝物的生物合成。也可以選擇或者工程化這些異源基因產(chǎn)物以便它們不受宿主細(xì)胞中復(fù)雜的天然調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，從而以更為可控的方式產(chǎn)生需要的商品。例如可以在制備宿主中表達(dá)來(lái)自枯草芽孢桿菌，釀酒酵母，鏈霉菌(Streptomycesspp)，雷爾氏菌(Ralstonia)，紅球菌(Rhodococcus)，棒狀桿菌(Corynebacteria)，短桿菌(Brevibacteria)，分支桿菌(Mycobacteria)，油脂性酵母等等的FAS酶。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，當(dāng)制備宿主被工程化為從脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生脂肪酸(其包含特定水平的不飽和、分枝或者碳鏈長(zhǎng)度)時(shí)，獲得的工程化脂肪酸可用于脂肪酸衍生物的制備。因此，從制備宿主產(chǎn)生的脂肪酸衍生物可以顯示工程化脂肪酸的特性。例如，制備宿主可以被工程化為產(chǎn)生支鏈短鏈脂肪酸，然后利用本文提供的關(guān)于脂肪醇制備的教導(dǎo)(即包括醇形成酶諸如FAR)，制備宿主產(chǎn)生支鏈短鏈脂肪醇。類似地，通過(guò)工程化制備宿主產(chǎn)生具有確定水平的分枝、不飽和和/或碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸，可以產(chǎn)生烴，從而制備同質(zhì)烴群。此外，當(dāng)需要不飽和醇、脂肪酸酯或者烴時(shí)，可以工程化脂肪酸生物合成途徑，產(chǎn)生低水平的飽和脂肪酸，還可以表達(dá)其他去飽和酶以減少飽和產(chǎn)物的生成。
A.飽和 通過(guò)工程化制備宿主過(guò)表達(dá)fabB，或者通過(guò)在低溫(例如低于37℃)下增殖制備宿主，可以將制備宿主工程化為產(chǎn)生不飽和脂肪酸。FabB偏好順式-δ3癸烯酰ACP，并導(dǎo)致在大腸桿菌中產(chǎn)生顯著百分?jǐn)?shù)的不飽和脂肪酸。FabB的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致主要產(chǎn)生不飽和脂肪酸(de Mendoza etal.，J.Biol.Chem.，2582098-101，1983)。然后這些不飽和脂肪酸被用作制備宿主的中間物，所述制備宿主被工程化產(chǎn)生脂肪酸衍生物，諸如脂肪醇，酯，蠟，烯烴，烷，等等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，通過(guò)減弱fabA或者過(guò)表達(dá)FabB和表達(dá)特定硫酯酶(如下所述)，可以產(chǎn)生具有所需碳鏈長(zhǎng)度的不飽和脂肪酸衍生物?？蛇x擇地，可以去除脂肪酸生物合成的抑制物FabR(Genbank登錄號(hào)NP_418398)，這也導(dǎo)致大腸桿菌中不飽和脂肪酸生成的增加(Zhang et al.，J.Biol.Chem.277pp.15558，2002.)。通過(guò)FabM(反式-2，順式-3-癸烯?；?ACP異構(gòu)酶，Genbank登錄號(hào)DAA05501)的過(guò)表達(dá)和肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)FabK(反式-2-烯?；?ACP還原酶II，Genbank登錄號(hào)NP_357969)的受控表達(dá)(Marrakchi et al.，J.Biol.Chem.27744809，2002)，并去除大腸桿菌Fab I((反式-2-烯?；?ACP還原酶，Genbank登錄號(hào)NP_415804)，可以實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸的進(jìn)一步增加。此外，為了增加不飽和脂肪酸酯的百分比，微生物還可以過(guò)表達(dá)fabB(編碼β-酮?；?ACP合酶I，登錄號(hào)BAA16180，EC2.3.1.41)，Sfa(編碼fabA的抑制物，登錄號(hào)AAC44390)以及gnsA和gnsB(兩者均編碼secG缺失突變抑制物，又稱冷休克蛋白，登錄號(hào)ABD18647.1，AAC74076.1)。
在一些實(shí)例中，可以減弱內(nèi)源fabF基因，從而增加生成的棕櫚酸酯(palmitoleate)(C16:1)的百分比。
B.包括環(huán)狀部分的分枝 利用本文提供的教導(dǎo)，可以產(chǎn)生脂肪酸衍生物，其包含分枝點(diǎn)、環(huán)狀部分及其組合。
通過(guò)表達(dá)一種或者多種外源核酸序列，可以將天然產(chǎn)生直鏈脂肪酸(sFAs)的微生物工程化為產(chǎn)生支鏈脂肪酸(brFAs)。例如，大腸桿菌天然產(chǎn)生直鏈脂肪酸(sFAs)。為了工程化大腸桿菌產(chǎn)生brFAs，可以引入并表達(dá)數(shù)種基因，所述基因提供支化前體(bkd操縱子)并能夠從支化前體(fabH)起始脂肪酸生物合成。此外，生物體可以表達(dá)用于延伸brFAs(諸如ACP，F(xiàn)abF)的基因和/或去除通常產(chǎn)生sFAs以及會(huì)與被引入的基因(諸如FabH，F(xiàn)abF)競(jìng)爭(zhēng)的相應(yīng)大腸桿菌基因。
支化?；o酶A2-甲基-丁基-輔酶A、異戊酰-輔酶A和異丁基-輔酶A是brFA的前體。在大部分包含brFA的微生物中，它們從支化氨基酸(異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸)分兩個(gè)步驟被合成(在下文中詳細(xì)描述)(Kadena，Microbiol.Rev.55pp.288，1991)。為了工程化微生物產(chǎn)生brFAs或者過(guò)量產(chǎn)生brFAs，這兩個(gè)步驟中一種或者多種酶的表達(dá)或者過(guò)表達(dá)可以被工程化。例如，在一些情況下制備宿主可以具有可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)步驟的內(nèi)源性酶，這樣的話只需要重組表達(dá)參與第二個(gè)步驟的酶。
形成支化脂肪酸的第一步是通過(guò)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生相應(yīng)的α-酮酸。大腸桿菌具有這種酶，IlvE(EC 2.6.1.42；Genbank登錄號(hào)YP_026247)。在一些實(shí)例中，異源支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶可能不被表達(dá)。但是，大腸桿菌IlvE或者任意其他支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，諸如乳酸乳球菌的ilvE(Genbank登錄號(hào)AAF34406)，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的ilvE(Genbank登錄號(hào)NP_745648)或者天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)(Genbank登錄號(hào)NP_629657)的ilvE可以在宿主微生物中過(guò)表達(dá)，如果轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)是被挑選用于脂肪酸衍生物生成的宿主生物中brFA生物合成速率的限制性因素。
第二步，α-酮酸向相應(yīng)支鏈?；o酶A的氧化脫羧，被支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合物(bkd；EC 1.2.4.4.)催化(Denoya et al.J.Bacteriol.177pp.3504，1995)，所述復(fù)合物由E1α/β(脫羧酶)、E2(二氫硫辛酰轉(zhuǎn)酰酶)和E3(二氫硫辛酰脫氫酶)亞基構(gòu)成，類似于丙酮酸鹽和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物。表2顯示來(lái)自數(shù)種微生物的潛在bkd基因，它們可以在制備宿主中表達(dá)以提供支鏈?；o酶A前體?；旧?，每個(gè)具有brFAs和/或依賴支鏈氨基酸生長(zhǎng)的微生物都可以用作分離bkd基因的來(lái)源，所述bkd基因用于在制備宿主諸如大腸桿菌中表達(dá)。此外，大腸桿菌具有E3組分(作為其丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的一部分；lpd，EC1.8.1.4，Genbank登錄號(hào)NP_414658)，因此它足以只表達(dá)E1α/β.和E2 bkd基因。
表2 來(lái)自挑選的微生物的Bkd基因 在另一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)共表達(dá)巴豆酰輔酶A還原酶(Ccr，EC 1.1.1.9)和異丁基-輔酶A變位酶(大亞基IcmA，EC 5.4.99.2；小亞基IcmB，EC5.4.99.13)(Han和Reynolds J.Bacteriol.179pp.5157，1997)，在制備宿主諸如大腸桿菌中產(chǎn)生異丁基-輔酶A。巴豆酰輔酶A是大腸桿菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中間物。來(lái)自于所選微生物的ccr和icm基因的實(shí)例列于表3。
表3 來(lái)自所選微生物的Ccr和icm基因 除了bkd基因的表達(dá)外(參見(jiàn)上文)，brFA生物合成的起始利用對(duì)支鏈?；o酶A特異的β-酮酰-酰基-載體-蛋白合酶III(FabH，EC2.3.1.41)(Li etal.J.Bacteriol.187pp.3795，2005)。這類FabHs的實(shí)例列于表4?？梢栽谥苽渌拗髦斜磉_(dá)fabH基因，所述fabH基因參與任意包含brFA的微生物的脂肪酸生物合成。來(lái)自于天然不產(chǎn)生brFA的制備宿主的Bkd和FabH酶可以不支持brFA的生成，因此可以重組表達(dá)Bkd和FabH。類似地，Bkd和FabH生成的內(nèi)源性水平可能不足以產(chǎn)生brFA，因此，它們可以被過(guò)表達(dá)。此外，可以表達(dá)脂肪酸生物合成機(jī)器的其他組分，諸如?；d體蛋白(ACPs)和β-酮酰-酰基-載體-蛋白合酶II，候選物是酰基載體蛋白(ACPs)和β-酮酰-?；?載體-蛋白合酶II(fabF，EC 2.3.1.41)(候選物列于表4)。除了表達(dá)這些基因外，可以將制備宿主內(nèi)源性脂肪酸生物合成途徑中的一些基因弱化。例如，在大腸桿菌中干擾brFA生物合成的最可能的候選物是fabH(Genbank登錄號(hào)NP_415609)和/或fabF基因(Genbank登錄號(hào)NP_415613)。
如上所述，通過(guò)聯(lián)合表達(dá)支持brFA合成和醇合成的基因，可以產(chǎn)生支鏈醇。例如，當(dāng)醇還原酶諸如來(lái)自不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baylyi)ADP1的Acr1與bkd操縱子共表達(dá)時(shí)，大腸桿菌可以合成異戊醇、異丁醇或者2-甲基丁醇。類似地，當(dāng)Acr1與ccr/icm基因共表達(dá)時(shí)，大腸桿菌可以合成異丁醇。
為了將制備宿主諸如大腸桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚝铣搔?環(huán)狀脂肪酸(cyFAs)的生物，需要引入和表達(dá)數(shù)種基因，所述基因提供環(huán)狀前體環(huán)己基羰基輔酶A(Cropp et al.Nature Biotech.18pp.980，2000)。然后可以表達(dá)表4所列的基因(fabH，ACP和fabF)以起始和延伸ω-環(huán)狀脂肪酸?？蛇x擇地，同源基因可以從產(chǎn)生cyFAs的微生物中分離，并在大腸桿菌中表達(dá)。
表4 來(lái)自具有brFAs的所選微生物的FabH，ACP和fabF基因 下列基因的表達(dá)足以在大腸桿菌中提供環(huán)己基羰基輔酶A來(lái)自山丘鏈霉菌(Streptomyces collinus)安三烯菌(ansatrienin)基因簇的ansJ，ansK，ansL，chcA和ansM(Chenetal.，Eur.J.Biochem.261pp.1999，1999)或者來(lái)自鏈霉菌HK803磷內(nèi)酯霉素(phoslactomycin)B基因簇的plmJ，plmK，plmL，chcA和plmM(Palaniappan et al.，J.Biol.Chem.278pp.35552，2003)以及山丘鏈霉菌(S.collinnus)，阿維鏈霉菌(S.avermitilis)或者天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)的chcB基因(Patton et al.Biochem.，39pp.7595，2000)(參見(jiàn)表5的Genbank登錄號(hào))。
表5 用于環(huán)己基羰基輔酶A合成的基因 只有chcA在Genbank登錄號(hào)U72144下有注釋，ansJKLM參見(jiàn)Chen etal.(Eur.J.Biochem.261pp.1999，1999) 表4所列的基因(fabH，ACP和fabF)足以起始和延伸ω-環(huán)狀脂肪酸，因?yàn)樗鼈兙哂袕V泛的底物特異性。如果這些基因中的任意一種與表5的ansJKLM/chcAB或者pmlJKLM/chcAB基因的共表達(dá)而不產(chǎn)生cyFAs，可以從產(chǎn)生cyFAs的微生物分離fabH、ACP和/或fabF同系物(例如通過(guò)利用簡(jiǎn)并PCR引物或者異源DNA探針)，并共表達(dá)這些同系物。表6列出挑選的包含ω-環(huán)狀脂肪酸的微生物。
表6 包含ω-環(huán)狀脂肪酸的微生物的實(shí)例 *利用環(huán)庚基羰基輔酶A和不利用環(huán)己基羰基輔酶A作為cyFA生物合成的前體 C.酯特征 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，酯包括A側(cè)和B側(cè)。如本文所述，B側(cè)由宿主生物中從頭合成的脂肪酸提供。在宿主被另外工程化產(chǎn)生醇包括脂肪醇的情況下，A側(cè)也由宿主生物產(chǎn)生。在其他實(shí)例中，A側(cè)也可以在培養(yǎng)基中提供。如本文所述，通過(guò)選擇所需硫酯酶基因和當(dāng)脂肪醇被制備時(shí)，B側(cè)和A側(cè)可以被設(shè)計(jì)成具有某些碳鏈特征。這些特征包括不飽和點(diǎn)、分枝和需要的碳鏈長(zhǎng)度。下文的實(shí)施例6提供制備長(zhǎng)鏈脂肪酸酯的示例性方法，其中A側(cè)和B側(cè)由制備宿主產(chǎn)生。類似地，實(shí)施例5提供制備中鏈脂肪酸酯的方法。當(dāng)A側(cè)和B側(cè)都由制備宿主提供，并且它們都利用脂肪酸生物合成途徑中間物產(chǎn)生時(shí)，它們將具有類似的碳鏈特征。例如，至少50％、60％、70％或者80％的生成的脂肪酸酯將具有長(zhǎng)度相差6、4或者2個(gè)碳的A側(cè)和B側(cè)。A側(cè)和B側(cè)還顯示類似的分枝和飽和水平。
除了產(chǎn)生提供A側(cè)的脂肪醇外，宿主還可以產(chǎn)生其他短鏈醇諸如乙醇、丙醇、異丙醇、異丁醇和丁醇，所述短鏈醇可以利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)并入A側(cè)。例如，由宿主生物產(chǎn)生丁醇。為了制備產(chǎn)生丁醇的細(xì)胞，LS9001株(在下面的實(shí)施例1中描述)被進(jìn)一步工程化，在pBAD24表達(dá)載體中于prpBCDE啟動(dòng)子系統(tǒng)下表達(dá)大腸桿菌K12的atoB(乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶)，溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的β-羥丁酰輔酶A脫氫酶，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的巴豆酸酶，拜氏梭菌的丁酰輔酶A脫氫酶，黃枝孢霉(Cladosporium fulvum)的輔酶A酰化醛脫氫酶(ALDH)，和丙酮丁醇棱菌(Clostridium acetobutylicum)的adhE編碼醛-醇脫氫酶。類似地，可以利用Kalscheuer等教導(dǎo)的方法(Microbiology1522529-2536，2006，通過(guò)引用并入本文)，在制備宿主中產(chǎn)生乙醇。
IV.發(fā)酵 通過(guò)使用特定的發(fā)酵技術(shù)可以增強(qiáng)脂肪酸衍生物的生成和分離。一種將產(chǎn)生最大化并降低成本的方法是增加碳源百分比，所述碳源被轉(zhuǎn)變?yōu)闊N類產(chǎn)物。在正常的細(xì)胞生命周期中，碳被用于細(xì)胞功能包括產(chǎn)生脂、糖、蛋白、有機(jī)酸和核酸。降低生長(zhǎng)相關(guān)活性必需的碳的量可以增加碳源轉(zhuǎn)變?yōu)檩敵鑫锏墓π?。這可以通過(guò)首先增殖微生物到所需密度來(lái)實(shí)現(xiàn)，諸如在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的頂峰實(shí)現(xiàn)的密度。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，復(fù)制檢查點(diǎn)基因可用于終止細(xì)胞生長(zhǎng)。具體來(lái)說(shuō)，群感機(jī)制(綜述于Camilli和Bassler Science 3111113，2006；Venturi FEMS Microbio Rev30274-291，2006；和Reading和Sperandio FEMS Microbiol Lett2541-11，2006)可用于激活基因諸如p53、p21或者其他檢查點(diǎn)基因。在大腸桿菌中可以被激活以停止細(xì)胞復(fù)制和生長(zhǎng)的基因包括umuDC基因，其過(guò)表達(dá)停止了靜止期到指數(shù)生長(zhǎng)期的進(jìn)展(Murli et al.，J.ofBact.1821127，2000)。UmuC是DNA聚合酶，其可以進(jìn)行對(duì)非編碼損傷的跨損傷合成-大部分UV和化學(xué)誘變作用的機(jī)制基礎(chǔ)。umuDC基因產(chǎn)物用于跨損傷合成過(guò)程，并且還作為DNA損傷檢查點(diǎn)。UmuDC基因產(chǎn)物包括UmuC，UmuD，umuD’，UmuD’2C，UmuD’2和UmuD2。同時(shí)，產(chǎn)物生成基因?qū)⒈患せ?，因此?fù)制和維持途徑使用的需求被最小化，而脂肪酸衍生物被制備。
輸入的碳轉(zhuǎn)變?yōu)闊N類產(chǎn)物的百分比是成本動(dòng)因。效率越高(即百分比更高)，則方法越低廉。對(duì)于含氧碳源(即基于葡萄糖和其他糖的來(lái)源)，氧必須以二氧化碳的形式釋放。每釋放2個(gè)氧原子，還釋放1個(gè)碳原子，導(dǎo)致約34％(w/w)的最大理論代謝效率(對(duì)脂肪酸衍生的產(chǎn)物)。但是對(duì)于其他烴類產(chǎn)物和碳源來(lái)說(shuō)，該數(shù)字是變化的。文獻(xiàn)中通常的效率是約小于5％。生成烴類產(chǎn)物的工程化微生物可以具有大于1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％和30％的效率。在一個(gè)實(shí)例中，微生物顯示大約10％至大約25％的效率。在其他實(shí)例中，這類微生物顯示大約25％至大約30％的效率，以及在其他實(shí)例中，這類微生物顯示大于30％的效率。
在一些實(shí)例中，當(dāng)終產(chǎn)物從細(xì)胞被釋放時(shí)，可以使用連續(xù)過(guò)程。在這種方法中，可以將具有產(chǎn)生脂肪酸衍生物的生物的反應(yīng)器組裝成多通路。在一個(gè)實(shí)例中，去除一部分培養(yǎng)基，并保留一部分培養(yǎng)基。從水層分離脂肪酸衍生物，然后依次將其返回到發(fā)酵室。
在一個(gè)實(shí)例中，發(fā)酵室包括經(jīng)歷連續(xù)還原的發(fā)酵作用。在這種情況下，將產(chǎn)生穩(wěn)定的還原環(huán)境。通過(guò)二氧化碳的釋放(氣態(tài)形式)保持電子平衡。增加NAD/H和NADP/H平衡的努力也有利于穩(wěn)定電子平衡。
通過(guò)工程化制備宿主表達(dá)NADH:NADPH轉(zhuǎn)氫酶，也可以增強(qiáng)胞內(nèi)NADPH的提供。一種或者多種NADH:NADPH轉(zhuǎn)氫酶的表達(dá)將糖酵解中產(chǎn)生的NADH轉(zhuǎn)化為NADPH，其增強(qiáng)脂肪酸衍生物的生成。
本文公開(kāi)的是通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從重組宿主微生物連續(xù)產(chǎn)生和輸出脂肪酸衍生物的系統(tǒng)。許多轉(zhuǎn)運(yùn)和外排蛋白用于分泌大量化合物，它們可以被進(jìn)化為對(duì)特定類型的脂肪酸衍生物具有選擇性。因此，在一些實(shí)施方式中，重組宿主微生物功能性表達(dá)編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外源DNA序列，這樣的話微生物將脂肪酸衍生物輸出到培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)例中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、擬南芥、真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌或者紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(基因座AAN73268)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)實(shí)例中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是選自CER5(基因座At1g51500或者AY734542)、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一些實(shí)例中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是CER5。在另一個(gè)實(shí)例中，CER5基因來(lái)自于擬南芥(基因座At1g51500、AY734542、At3g21090和Atlg51460)。
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如，還可以是選自以下蛋白的外排蛋白大腸桿菌的AcrAB、TolC和AcrEF，或者嗜熱藍(lán)細(xì)菌聚球藻BP-1(Thermo-synechococcus elongatus BP-1)的t111618、t111619和t110139。
此外，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是，例如，選自黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲(chóng)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)或者釀酒酵母或者哺乳動(dòng)物FATP’s中任意一種的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)。利用膜質(zhì)區(qū)反轉(zhuǎn)還可以再合成FATPs，以便反轉(zhuǎn)底物流的方向。具體來(lái)說(shuō)，組成蛋白親水性結(jié)構(gòu)域(或者膜結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列可以被反轉(zhuǎn)，但對(duì)各個(gè)特定氨基酸保持相同的密碼子。這些區(qū)域的鑒定是本領(lǐng)域公知的。
還可以根據(jù)釋放脂肪酸衍生物的內(nèi)在能力挑選制備宿主?？梢杂冒麅?nèi)產(chǎn)物對(duì)胞外產(chǎn)物的比例表示產(chǎn)物生成和釋放入發(fā)酵肉湯的效率。在一些實(shí)例中，該比例可以是5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4或者1:5。
此外可以將制備宿主工程化為表達(dá)重組纖維素小體(cellulosomes)，諸如在PCT申請(qǐng)第PCT/US2007/003736號(hào)中描述的那些，其允許制備宿主使用纖維素質(zhì)作為碳源。例如，還可以將制備宿主工程化為表達(dá)轉(zhuǎn)化酶(EC 3.2.1.26)，這樣的話蔗糖就可以被用作碳源。
類似地，利用Ingram等人在美國(guó)專利第5,000,000號(hào)，第5,028,539號(hào)，第5,424,202號(hào)，第5,482,846號(hào)和第5,602,030號(hào)中描述的教導(dǎo)，制備宿主可以被工程化，這樣的話制備宿主可以有效吸收碳并使用纖維素質(zhì)作為碳源。
IV.生成后加工 可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離發(fā)酵期間生成的脂肪酸衍生物?？梢允褂萌魏我阎膹乃橘|(zhì)分離脂肪酸衍生物的技術(shù)。本文提供的一個(gè)示例性分離法是兩相(雙相)分離法。該方法涉及在足以產(chǎn)生脂肪酸衍生物的條件下發(fā)酵遺傳工程化的制備宿主，允許在有機(jī)相中收集衍生物并從水性發(fā)酵肉湯分離有機(jī)相。該方法可以在分批以及連續(xù)發(fā)酵環(huán)境下實(shí)施。
雙相分離利用脂肪酸衍生物的相對(duì)不混溶性促進(jìn)分離。不混溶是指化合物相對(duì)不能溶于水，由化合物的分配系數(shù)定義。分配系數(shù)P被定義為化合物在有機(jī)相(在雙相系統(tǒng)中，有機(jī)相通常是生成過(guò)程中由脂肪酸衍生物形成的相，但是，在一些實(shí)例中可以提供有機(jī)相(諸如辛烷層以促進(jìn)產(chǎn)物分離))中的平衡濃度除以水相(即發(fā)酵肉湯)中處于平衡狀態(tài)的濃度。當(dāng)描述兩相系統(tǒng)時(shí)，通常采用logP來(lái)描述P。logP為10的化合物將為有機(jī)相分配10:1，而logP為0.1的化合物將為水相分配10:1。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，通過(guò)選擇發(fā)酵肉湯和有機(jī)相使生成的脂肪酸衍生物具有高logP值，即使發(fā)酵容器中的濃度非常低，脂肪酸衍生物也將進(jìn)入有機(jī)相。
通過(guò)本文所述方法產(chǎn)生的脂肪酸衍生物在發(fā)酵肉湯以及細(xì)胞質(zhì)中是相對(duì)不混溶的。因此，脂肪酸衍生物會(huì)在胞內(nèi)或者胞外于有機(jī)相中聚集。產(chǎn)物在有機(jī)相中的聚集將削弱脂肪酸衍生物對(duì)細(xì)胞功能的影響，這將允許制備宿主產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。換言之，脂肪酸衍生物的濃度不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞有顯著的影響。
按照本文所述產(chǎn)生的脂肪醇、脂肪酸酯、蠟和烴允許均質(zhì)化合物的制備，其中至少60％、70％、80％、90％或者95％的生成的脂肪醇、脂肪酸酯和蠟將具有相差小于4個(gè)碳或者小于2個(gè)碳的碳鏈長(zhǎng)度。這些化合物還可以被制備為具有相對(duì)一致的飽和度，例如至少60％、70％、80％、90％或者95％的脂肪醇、脂肪酸酯、烴和蠟是單不飽和、雙不飽和或者三不飽和的。這些化合物可以被直接用作燃料、個(gè)人護(hù)理添加劑、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑。這些化合物還可以被用作后續(xù)反應(yīng)的原料以制備其他產(chǎn)物，所述后續(xù)反應(yīng)諸如酯交換，氫化，通過(guò)氫化、熱裂解(pyrolisis)或者這兩者的催化裂化，或者環(huán)氧化反應(yīng)。
V.燃料成分 本文描述的脂肪酸衍生物可以被用作燃料。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，根據(jù)燃料的預(yù)定目的，可以制備和使用不同的脂肪酸衍生物。例如，對(duì)于預(yù)期在寒冷氣候中使用的汽車(chē)燃料，可能希望支化脂肪酸衍生物，因此利用本文提供的教導(dǎo)，可以制備支化烴、脂肪酸酯和醇。利用本文描述的方法，可以制備包括相對(duì)均質(zhì)的脂肪酸衍生物的燃料，其具有需要的燃料質(zhì)量。這類燃料可以用碳指紋法(carbonfingerprinting)進(jìn)行表征，與石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比，它們不含雜質(zhì)，此外，基于脂肪酸衍生物的燃料可以與其他燃料或者燃料添加劑組合以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的燃料。
A.碳指紋法 生物制備的脂肪酸衍生物代表了用于燃料(諸如醇、柴油和汽油)的新原料。一些利用脂肪酸衍生物制備的生物燃料不是從可再生來(lái)源生成，這樣的話，所述生物燃料是物質(zhì)的新組合物。根據(jù)雙碳同位素指紋法，可以將這些新的燃料與來(lái)自石化碳的燃料進(jìn)行區(qū)分。此外，通過(guò)雙碳同位素指紋法(參見(jiàn)，美國(guó)專利第7,169,588號(hào)，通過(guò)引用并入本文)，可以確定生物源碳(例如葡萄糖對(duì)甘油)的特定來(lái)源。
該方法有效的區(qū)別化學(xué)上相同的材料，并根據(jù)生物圈(植物)成分生長(zhǎng)的來(lái)源(以及可能的年份)區(qū)分產(chǎn)物中的碳。同位素14C和13C為該問(wèn)題提供補(bǔ)充信息。放射碳定年同位素(14C)，其核半衰期為5730年，可以清楚的區(qū)分碳樣品是化石(“死的”)還是生物圈(“活的”)原料[Currie，L.A.＂Source Apportionment of Atmospheric Particles(大氣顆粒來(lái)源區(qū)分)，＂Characterization of Environmental Particles(環(huán)境顆粒表征)，J.Buffle and H.P.van Leeuwen，Eds.，1 of Vol.I of the IUPACEnvironmental Analytical Chemistry Series(IUPAC環(huán)境分析化學(xué)系列I卷1版)(Lewis Publishers，Inc)(1992)374]。放射碳定年的基本假設(shè)是大氣中14C濃度的恒定性導(dǎo)致活生物體中14C的恒定性。當(dāng)處理分離的樣品時(shí)，該樣品的年代可以根據(jù)關(guān)系式t＝(-5730/0.693)ln(A/A.sub.O)(等式5)大致推斷，其中t＝年代，5730年是放射性碳的半衰期，A和A.sub.O分別是樣品和現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)品的特定14C活性[Hsieh，Y.，Soil Sci..Soc.Am J.，56，460，(1992)]。但是，因?yàn)?950年以來(lái)的大氣層核試驗(yàn)和1850年以來(lái)化石燃料的燃燒，14C獲得第二種、地球化學(xué)時(shí)間特征。它在大氣CO2中的濃度--由此在活生物圈中的濃度--在60年代中期的核試驗(yàn)頂峰時(shí)大概加倍。此后其逐漸回歸到大約1.2×1012的穩(wěn)態(tài)宇生(大氣)基本的同位素率(14C/12C)，具有7-10年的近似弛豫“半衰期”。(這后一半衰期不能從字面上理解；必須使用詳細(xì)的大氣核輸入/衰變功能來(lái)追蹤核時(shí)代開(kāi)始后大氣和生物圈14C的變化。)它是后一生物圈14C的時(shí)間特征，這保留了每年測(cè)定新近生物圈碳的年代的許諾。通過(guò)加速器質(zhì)譜法(AMS)測(cè)量14C，結(jié)果用“現(xiàn)代碳分?jǐn)?shù)”(fM)的單位表示。fM由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(National Institute of Standards andTechnology(NIST))標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)(Standard Reference Materials(SRMs))4990B和4990C確定，它們分別被稱為草酸標(biāo)準(zhǔn)品HOxI和HOxII。基本定義涉及0.95倍14C/12C同位素比HOxI(參照AD 1950)。這大致相當(dāng)于衰變-校正的工業(yè)革命前的木材。對(duì)于當(dāng)今的活生物圈(植物體)而言，fM大約是1.1。
穩(wěn)定的碳同位素比例(13C/12C)為鑒別和區(qū)分來(lái)源提供了互補(bǔ)途徑。指定生物來(lái)源材料中的13C/12C比例是二氧化碳被固定時(shí)大氣二氧化碳中13C/12C比例的結(jié)果，其也反映了準(zhǔn)確的代謝途徑。還存在區(qū)域性變化。石油，C3植物(闊葉)，C亞4植物(草)和海相碳酸鹽的13C/12C以及對(duì)應(yīng)的δ13C值都顯示顯著差異。此外，因?yàn)榇x途徑，C3和C4植物的脂質(zhì)分析不同于源于相同植物的糖組分的材料。在測(cè)量精度內(nèi)，由于同位素分餾作用，13C顯示大的變化，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)最明顯的就是光合機(jī)制。植物中碳同位素比差異的主要原因與植物中光合碳代謝途徑的差異密切相關(guān)，尤其是初始羧化作用期間發(fā)生的反應(yīng)，即大氣CO2的初步固定。植物的兩大類是并入“C3”(或者Calvin-Benson)光合循環(huán)的植物和并入“C4”(或者Hatch-Slack)光合循環(huán)的植物。C3植物諸如硬木和針葉樹(shù)，主要是在溫帶氣候帶。在C3植物中，初始CO2固定或者羧化反應(yīng)涉及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，第一穩(wěn)定產(chǎn)物是3-碳化合物。另一方面，C4植物包括這類植物諸如熱帶草、玉米和甘蔗。在C4植物中，涉及另一種酶磷酸烯醇-丙酮酸羧化酶的其他羧化反應(yīng)是初始羧化反應(yīng)。第一穩(wěn)定的碳化合物是4-碳酸，其隨后被脫去羧基。如此釋放的CO2然后被C3循環(huán)再固定。
C4和C3植物均顯示一定范圍的13C/12C同位素比，但通常值是千分之約-10到-14(C4)和千分之約-21到-26(C3)[Weber et al.，J.Agric.Food Chem.，45，2942(1997)]。煤和石油通常落于后一范圍。開(kāi)始用白堊系皮狄組中美洲擬箭石化石(pee dee belemnite)(PDB)石灰石對(duì)13C測(cè)量尺度調(diào)零，其中以該材料的千分之偏差給出值。“Δ13C”，采用千分之(per mil)單位的值，縮寫(xiě)為％，按如下公式計(jì)算

(等式6) 因?yàn)镻DB參考物質(zhì)(RM)已經(jīng)被耗盡，通過(guò)與IAEA、USGS、NIST和其他挑選的國(guó)際同位素實(shí)驗(yàn)室的合作已經(jīng)發(fā)展出一系列替代的RMs。與PDB千分偏差的標(biāo)記是Δ13C。通過(guò)對(duì)44、45和46分子離子質(zhì)量的高精度穩(wěn)定比例質(zhì)譜法(IRMS)測(cè)量CO2。
根據(jù)14C(fM)和雙碳同位素指紋法，可以將脂肪酸衍生物以及相關(guān)生物燃料、化學(xué)制品和混合物與它們石化來(lái)源的對(duì)應(yīng)物完全區(qū)分，指示物質(zhì)的新組合物。
本文描述的脂肪酸衍生物可用于制備生物燃料和化學(xué)制品。根據(jù)雙碳同位素指紋法，還可以區(qū)分本發(fā)明提供的基于新脂肪酸衍生物的產(chǎn)物組合物和只來(lái)自于石化來(lái)源的材料。區(qū)分這些產(chǎn)物的能力有益于在商業(yè)中追蹤這些材料。例如，可以將包括“新”和“老”碳同位素圖譜的燃料或者化學(xué)制品與只由“老”材料制備的燃料和化學(xué)制品進(jìn)行區(qū)分。因此，當(dāng)前材料可以在商業(yè)上進(jìn)行跟蹤，根據(jù)它們的獨(dú)特的圖譜，用于定義競(jìng)爭(zhēng)和確定保存限期的目的。
在一些實(shí)例中，制備的生物燃料組合物包括具有大約-10.9到大約-15.4的δ13C的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占組合物中生物來(lái)源材料(源自可再生資源諸如纖維素質(zhì)和糖)的至少大約85％。在其他實(shí)例中，生物燃料組合物包括具有以下化學(xué)式的脂肪酸衍生物 X——(CH(R))nCH3 其中X代表CH3，-CH2OR1；-C(O)OR2；或者-C(O)NR3R4； 對(duì)于每個(gè)n，R獨(dú)立的是不存在的、H或者低級(jí)脂肪族； N是從8到34的整數(shù)，諸如從10到24；和 R1，R2，R3和R4獨(dú)立的選自H和低級(jí)烷基。通常，當(dāng)R是低級(jí)脂肪族時(shí)，R代表分枝的、不分枝的或者環(huán)狀的低級(jí)烷基或者低級(jí)烯基部分。示例性的R基團(tuán)包括，但不限于，甲基，異丙基，異丁基，仲-丁基，環(huán)戊烯基等等。脂肪酸衍生物的特征還在于具有從大約-10.9到大約-15.4的δ13C；并且脂肪酸衍生物占組合物中生物來(lái)源材料的至少大約85％。在一些實(shí)例中，生物燃料組合物中脂肪酸衍生物的特征在于具有至少大約1.003、1.010或者1.5的現(xiàn)代碳分?jǐn)?shù)(fM14C)。
B.脂肪酸衍生物 各種脂肪酸酯的十六烷值(CN)、粘性、熔點(diǎn)和燃燒熱已經(jīng)在例如Knothe，F(xiàn)uel Processing Technology(燃料加工技術(shù))861059-1070，2005中被表征，其通過(guò)引用并入本文。利用本文提供的教導(dǎo)，可以將制備宿主工程化為產(chǎn)生Knothe(Fuel Processing Technology 861059-1070，2005)描述的任意一種脂肪酸酯。
通過(guò)本文描述的制備宿主可以產(chǎn)生醇(短鏈，長(zhǎng)鏈，支鏈或者不飽和的)。這類醇可以被直接用作燃料，或者它們可用于產(chǎn)生酯，即上文描述酯的A側(cè)。這類酯可以單獨(dú)的或者與本文描述的其他脂肪酸衍生物組合用作燃料。
類似地，從本文描述的微生物產(chǎn)生的烴也可以被用作生物燃料?？梢詫⒒谶@類烴的燃料設(shè)計(jì)為包含分枝點(diǎn)，確定的飽和度以及特定的碳長(zhǎng)度。當(dāng)被單獨(dú)或者與其他脂肪酸衍生物組合用作生物燃料時(shí)，烴還可以與添加劑或者其他傳統(tǒng)燃料(醇，源自甘油三酯的柴油，和基于石油的燃料)組合。
C.雜質(zhì) 本文描述的脂肪酸衍生物可用于制備生物燃料。這些脂肪酸衍生物從脂肪酸直接制備，而不是通過(guò)甘油三酯的化學(xué)加工制備。因此，包括所述脂肪酸衍生物的燃料包含的雜質(zhì)少于一般衍生自甘油三酯的生物燃料，諸如衍生自植物油和脂肪的燃料。
本文描述的脂肪酸衍生物生物燃料(在將脂肪酸衍生物與其他燃料諸如傳統(tǒng)燃料混合前)包含的轉(zhuǎn)酯催化劑少于石化柴油或者生物柴油。例如，脂肪酸衍生物可以包含低于大約2％，1.5％，1.0％，0.5％，0.3％，0.1％，0.05％或者0％的轉(zhuǎn)酯催化劑或者源自轉(zhuǎn)酯催化劑的雜質(zhì)。轉(zhuǎn)酯催化劑包括例如，氫氧化物催化劑諸如NaOH、KOH、LiOH，和酸性催化劑，諸如無(wú)機(jī)酸催化劑和路易斯酸催化劑。催化劑和源自轉(zhuǎn)酯催化劑的雜質(zhì)包括，但不限于，錫，鉛，汞，鎘，鋅，鈦，鋯，鉿，硼，鋁，磷，砷，銻，鉍，鈣，鎂，鍶，鈾，鉀，鈉，鋰，及其組合。
類似地，本文描述的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在將脂肪酸衍生物與其他燃料諸如石化柴油或生物柴油混合前)包含的甘油(或者丙三醇)少于由甘油三酯制備的生物燃料。例如，脂肪酸衍生物可以包含低于大約2％，1.5％，1.0％，.5％，.3％，.1％，.05％或者0％的甘油。
源自脂肪酸衍生物的粗生物燃料包含的游離醇(即用于產(chǎn)生酯的醇)也少于由甘油三酯制備的生物柴油。這部分歸因于制備宿主利用醇的效率。例如，脂肪酸衍生物包含低于大約2％，1.5％，1.0％，.5％，.3％，.1％，.05％或者0％的游離醇。
源自所述脂肪酸衍生物的生物燃料的特征還可以在于，其硫濃度低于石油衍生的柴油。例如，源自脂肪酸衍生物的生物燃料具有低于大約2％，1.5％，1.0％，.5％，.3％，.1％，.05％或者0％的硫。
D.添加劑 燃料添加劑用于增強(qiáng)燃料或者發(fā)動(dòng)機(jī)的性能。例如，燃料添加劑可用于改變冰點(diǎn)/膠凝點(diǎn)，濁點(diǎn)，潤(rùn)滑性，粘性，抗氧化性，發(fā)火性，辛烷值和閃點(diǎn)。在美國(guó)，所有的燃料添加劑必須在環(huán)境保護(hù)局(Environmental Protection Agency)登記，通過(guò)代理商的網(wǎng)站以及聯(lián)系代理商可以公開(kāi)獲得出售燃料添加劑的公司和燃料添加劑的名稱。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，本文描述的脂肪酸衍生物可以與一種或者多種這類添加劑混合以提供需要的質(zhì)量。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將理解，本文描述的脂肪酸衍生物可以與其他燃料混合，諸如源自甘油三酯的生物柴油，各種醇諸如乙醇和丁醇，以及石油衍生的產(chǎn)物諸如汽油。在一些實(shí)例中，制備具有低膠凝點(diǎn)的脂肪酸衍生物，諸如C16:1乙酯或者C18:1乙酯。將這種低膠凝點(diǎn)的脂肪酸衍生物與由甘油三酯制備的生物柴油混合以降低燃料的總膠凝點(diǎn)。類似地，可以將脂肪酸衍生物諸如C16:1乙酯或者C18:1乙酯與石油衍生的柴油混合以提供至少5％和經(jīng)常大于5％的生物柴油的混合物。在一些實(shí)例中，混合物包括至少20％或者更多的脂肪酸衍生物。
例如，可以將生物燃料組合物制備成包括至少大約20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％或者95％的脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳鏈。這類生物燃料組合物還可以包括至少一種選自以下物質(zhì)的添加物可以將濁點(diǎn)降低到低于約5℃或者約0℃的濁點(diǎn)降低添加劑，表面活性劑，或者微乳劑，至少大約5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或者80％，85％，90％，或者95％的來(lái)自甘油三酯的柴油燃料，石油衍生的汽油或者來(lái)自石油的柴油燃料。
實(shí)施例 圖1是FAS途徑示意圖，顯示直接參與酰基-ACP合成的酶。為了增加蠟/脂肪酸酯和脂肪醇的產(chǎn)生，可以過(guò)表達(dá)或者突變一種或者多種酶以減少反饋抑制。此外，代謝中間物產(chǎn)生基于非脂肪酸的產(chǎn)物(副反應(yīng))的酶可以被功能性缺失或者弱化以增加通過(guò)脂肪酸生物合成途徑的碳通量。下面的實(shí)施例1、2和8提供示例性的制備宿主，所述制備宿主已經(jīng)被工程化以增加脂肪酸產(chǎn)生。
圖2、圖3和圖4分別顯示可以被工程化以產(chǎn)生脂肪醇和蠟/脂肪酸酯的生物合成途徑。如圖2所示，可以利用數(shù)種不同的多肽實(shí)現(xiàn)各種底物(乙酰輔酶A，丙二酰輔酶A，酰基-ACP，脂肪酸，和?；o酶A)向各種產(chǎn)物(乙酰輔酶A，丙二酰輔酶A，?；?ACP，脂肪酸，和?；o酶A)的轉(zhuǎn)變。下面的實(shí)施例描述了已經(jīng)被工程化或者可以被工程化產(chǎn)生特定脂肪醇和蠟/脂肪酸酯和烴的微生物。
實(shí)施例1，制備宿主構(gòu)建 一個(gè)示例性的制備宿主是LS9001。通過(guò)修飾Overexpress.com(Saint Beausine，F(xiàn)rance)的C41(DE3)以功能性缺失fadE基因(酰基輔酶A脫氫酶)，制備LS9001。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，利用引物YafV_NotI和Ivry_O1擴(kuò)增大約830bp的fadE上游，以及利用引物L(fēng)pcaf_ol和LpcaR_Bam擴(kuò)增大約960bp的fadE下游，制備大腸桿菌的fadE敲除菌株。使用重疊PCR產(chǎn)生讀框內(nèi)缺失完整fadE基因的構(gòu)建體。將fadE缺失構(gòu)建體克隆入溫度敏感質(zhì)粒pKOV3，其包含用于反選擇的SacB基因，并按照Link等人(J.Bact.1796228-6237，1997)的方法實(shí)現(xiàn)fadE的染色體缺失。所獲菌株無(wú)法降解脂肪酸和脂酰輔酶A(該功能缺失在本文中被稱為ΔfadE)。
制備宿主可以包括的其他修飾包括，引入載有4種負(fù)責(zé)大腸桿菌中乙酰輔酶A羧化酶活性的基因(accA，B，C，和D，登錄號(hào)NP_414727，NP_417721，NP_417722，NP_416819，EC 6.4.1.2)的質(zhì)粒。分兩步將accABCD基因作為雙順?lè)醋?bicistronic)操縱子克隆入pACYCDuet-1(Novagen，Madison，WI)的NcoI/HindIII和NdeI/AvrII位點(diǎn)，所獲質(zhì)粒被稱為pAS004.126。
制備宿主可以包括的其他修飾包括以下aceEF(編碼丙酮酸鹽和2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的E1p脫氫酶組分和E2p二氫硫辛酰胺?；D(zhuǎn)移酶組分)的過(guò)表達(dá)；和來(lái)自本領(lǐng)域已知編碼這類蛋白的任意生物的fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(編碼FAS)等等可以在制備宿主中被表達(dá)，所述生物包括例如大腸桿菌，歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonaseuropaea)(ATCC 19718)，枯草芽孢桿菌，釀酒酵母，鏈霉菌，雷爾氏菌，紅球菌，棒狀桿菌，短桿菌，分支桿菌，油脂性酵母。類似地，可以將制備宿主工程化為表達(dá)豌豆(Pisum savitum)的accABCD(編碼乙酰輔酶A羧化酶)以取代大腸桿菌同系物，或者除了大腸桿菌同系物之外再表達(dá)。但是，當(dāng)制備宿主也產(chǎn)生丁醇時(shí)，較不希望表達(dá)豌豆同系物。
在一些示例性的制備宿主中，可以利用Link等人(J.Bacteriol.1796228-6237，1997)的方法敲除或者弱化基因。例如，可以被敲除或者弱化的基因包括gpsA(編碼生物合成sn-甘油3-磷酸脫氫酶，登錄號(hào)NP_418065，EC1.1.1.94)；ldhA(編碼乳酸脫氫酶，登錄號(hào)NP_415898，EC1.1.1.28)；pflb(編碼甲酸鹽乙?；D(zhuǎn)移酶1，登錄號(hào)P09373，EC2.3.1.54)；adhE(編碼醇脫氫酶，登錄號(hào)CAA47743，EC1.1.1.1，1.2.1.10)；pta(編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，登錄號(hào)NP_416800，EC2.3.1.8)；poxB(編碼丙酮酸氧化酶，登錄號(hào)NP_415392，EC1.2.2.2)；ackA(編碼醋酸鹽激酶，登錄號(hào)NP_416799，EC2.7.2.1)及其組合。
類似地，利用上述用于fadE缺失的方法，可以將PlsB[D311E]突變引入LS9001以弱化PlsB。一旦被引入，該突變將減少碳向磷脂產(chǎn)生轉(zhuǎn)向的量(參見(jiàn)，圖1)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，通過(guò)用谷氨酸的GAA密碼子取代天冬氨酸311的GAC密碼子，制備編碼PlsB[D311E]的等位基因。通過(guò)基因合成制備被改變的等位基因，利用Link等人的方法(參見(jiàn)上文)將染色體plsB野生型等位基因替換為突變的plsB[D311E]等位基因。
實(shí)施例2，制備宿主修飾 構(gòu)建下列質(zhì)粒用于表達(dá)各種蛋白，所述蛋白被用于合成脂肪酸衍生物。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備構(gòu)建體，所有被克隆的基因均在IPTG-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(T7，tac或者lac啟動(dòng)子)的控制下。
將大腸桿菌的‘tesA基因(硫酯酶A基因，登錄號(hào)NP_415027，不含前導(dǎo)序列(Cho and Cronan，The J.ofBiol.Chem.，2704216-9，1995，EC3.1.1.5，3.1.2.-)克隆入NdeI/AvrII消化的pETDuet-1(本文描述的pETDuet-1購(gòu)自Novagen，Madison，WI)。將編碼加利福尼亞桂樹(shù)(Umbellularia California)、萼距花(Cuphea hookeriana)和樟樹(shù)(Cinnamonum camphorum)的FatB型植物硫酯酶(TEs)的基因(登錄號(hào)UcFatB1＝AAA34215，ChFatB2＝AAC49269，ChFatB3＝AAC72881，CcFatB＝AAC49151)分別克隆入3種不同的載體(i)NdeI/AvrII消化的pETDuet-1，(ii)XhoI/HindIII消化的pBluescript KS+(Stratagene，LaJolla，CA)(用于產(chǎn)生N端lacZ::TE融合蛋白)和(iii)XbaI/HindIII消化的pMAL-c2X(New England Lab，Ipswich，MA)(用于產(chǎn)生n端MalE::TE融合)。將大腸桿菌的fadD基因(編碼?；o酶A合成酶)克隆入NcoI/HindIII消化的pCDFDuet-1衍生物，所述衍生物在其N(xiāo)deI/AvrII位點(diǎn)內(nèi)包含不動(dòng)桿菌ADP1的acr1基因(酰基輔酶A還原酶)。表7提供用于制備數(shù)個(gè)示例性制備菌株的質(zhì)粒的概述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可以使用不同的質(zhì)粒和基因組修飾獲得類似的菌株。
表7 制備宿主中使用的質(zhì)粒概述 挑選的表達(dá)質(zhì)粒包含相容的復(fù)制子和抗生素抗性標(biāo)志物，這樣的話可以建立4質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。因此，可以用(i)任意TE表達(dá)質(zhì)粒，(ii)FadD表達(dá)質(zhì)粒，其也表達(dá)acr1和(iii)蠟合酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化LS9001。當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，所獲菌株從碳源諸如葡萄糖產(chǎn)生脂肪醇的濃度將增加。生成的脂肪醇的碳鏈長(zhǎng)度和飽和度取決于表達(dá)的硫酯酶基因。
實(shí)施例3，脂肪醇在重組大腸桿菌菌株中的產(chǎn)生 通過(guò)在制備宿主中外源表達(dá)硫酯酶基因和?；o酶A還原酶基因(FAR)，產(chǎn)生脂肪醇。更具體的，將質(zhì)粒pCDFDuet-1-fadD-acr1(?；o酶A還原酶)和pETDuet-1-′tesA(硫酯酶)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株LS9001(實(shí)施例1中描述)，在添加100mg/L壯觀霉素和50mg/L羧芐青霉素的LB板中挑選對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化體。將LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1的4個(gè)轉(zhuǎn)化體分別接種3mL添加50mg/L羧芐青霉素和100mg/L壯觀霉素的M9培養(yǎng)基。包含所述轉(zhuǎn)化體的樣品在25℃的振蕩器(250rpm)上生長(zhǎng)，直到它們達(dá)到0.5OD600。每種樣品取1.5mL轉(zhuǎn)移入包含30mL上述培養(yǎng)基的250mL燒瓶中。所獲培養(yǎng)物在25℃的振蕩器上生長(zhǎng)，直到培養(yǎng)物達(dá)到0.5-1.0OD600。然后添加IPTG到1mM的終濃度，繼續(xù)生長(zhǎng)40小時(shí)。
然后在4000rpm離心細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀懸浮于1.0mL甲醇中。然后將3mL乙酸乙酯與懸浮細(xì)胞混合。然后向混合物中添加3mLH2O，并用超聲處理所述混合物20分鐘。在4000rpm離心所獲樣品5分鐘，將包含脂肪醇的有機(jī)相(上層相)進(jìn)行GC/MS分析。全部醇(包括十四醇、十六醇、十六碳烯醇和十八碳烯醇)的產(chǎn)量大約是1-10mg/L。當(dāng)以相同方式培養(yǎng)只載有空載體的大腸桿菌菌株時(shí)，在乙酸乙酯提取物中只發(fā)現(xiàn)了0.2-0.5mg/L的脂肪醇。
實(shí)施例4，脂肪醇在制備宿主的產(chǎn)生和釋放 在大腸桿菌中表達(dá)Acr1(?；o酶A還原酶)，所述大腸桿菌僅依靠葡萄糖作為唯一的碳源和能源生長(zhǎng)。大腸桿菌產(chǎn)生少量的脂肪醇諸如十二醇(C12:0-OH)，十四醇(C14:0-OH)和十六醇(C16:0-OH)。在其他樣品中，F(xiàn)adD(?；o酶A合成酶)與acr1在大腸桿菌中一起表達(dá)，觀察到脂肪醇生成增加5倍。
在其他樣品中，在野生型大腸桿菌C41(DE3)和大腸桿菌C41(DE3 ΔfadE)(缺失酰基輔酶A脫氫酶的菌株)中表達(dá)acr1、fadD、accABCD(乙酰輔酶A羧化酶)(如實(shí)施例1所述構(gòu)建的載有accABCD的質(zhì)粒)以及各種不同的硫酯酶(TEs)。這導(dǎo)致脂肪醇生成的額外增加并調(diào)節(jié)脂肪醇模式(參見(jiàn)圖5)。例如，大腸桿菌′tesA(pETDuet-1-′tesA)在該系統(tǒng)的過(guò)表達(dá)實(shí)現(xiàn)C12:0-OH、C14:0-OH和C16:0-OH的大約60倍增加，其中C14:0-OH是主要的脂肪醇。當(dāng)表達(dá)ChFatB3酶(pMAL-c2X-TEcu中來(lái)自萼距花的FatB3)，獲得非常類似的結(jié)果。當(dāng)表達(dá)UcFatB1酶(pMAL-c2X-TEuc中來(lái)自加利福尼亞桂樹(shù)的FatB1)時(shí)，脂肪醇生成增加大約20倍，并且C12:0-OH是主要的脂肪醇。
ChFatB3和UcFatB1表達(dá)還分別導(dǎo)致顯著量不飽和脂肪醇C16:1-OH和C14:1-OH的生成。在利用tesA表達(dá)產(chǎn)生的樣品上清中也發(fā)現(xiàn)了脂肪醇的存在(圖6)。在37℃發(fā)現(xiàn)上清和細(xì)胞沉淀中脂肪醇的量近似相等，而在25℃發(fā)現(xiàn)大約25％的脂肪醇在上清中。
實(shí)施例5，中鏈脂肪酸酯 醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(AATs，EC 2.3.1.84)，其負(fù)責(zé)各種植物中的?；宜狨ブ苽洌捎糜诋a(chǎn)生中等鏈長(zhǎng)度的蠟，諸如辛酸辛酯，辛酸癸酯，癸酸癸酯，等等。從中鏈醇(諸如C6、C8)合成的脂肪酯和中鏈?；o酶A(或者脂肪酸，諸如C6或者C8)具有相對(duì)低的熔點(diǎn)。例如，己酸己酯具有-55℃的熔點(diǎn)，而辛酸辛酯具有-18℃到-17℃的熔點(diǎn)。這些化合物的低熔點(diǎn)使它們成為生物燃料的良好候選物。
在該實(shí)施例中，SAAT基因與大腸桿菌的fadD和acr1(不動(dòng)桿菌ADP1的醇還原酶)在制備宿主C41(DE3，ΔfadE)中共表達(dá)，并向發(fā)酵肉湯中提供辛酸。這導(dǎo)致辛酸辛酯的生成。類似地，當(dāng)在制備宿主中表達(dá)不動(dòng)桿菌ADP1的蠟合酶基因以替代SAAT基因時(shí)，產(chǎn)生辛酸辛酯。
利用DNA 2.0(Menlo Park，CA 94025)合成重組SAAT基因。合成的DNA基于公開(kāi)的基因序列(登錄號(hào)AF193789)，并被修飾以去除NcoI位點(diǎn)。將合成的SAAT基因(作為BamHI-HindIII片段)克隆入用BamHI和HindIII線性化的pRSET B(Invitrogen，Calsbad，California)。將所獲質(zhì)粒pHZ1.63A與pAS004.114B共轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備宿主，其載有大腸桿菌的fadD基因和不動(dòng)桿菌ADP1的acr1基因。所述轉(zhuǎn)化體在3mL含有2％葡萄糖的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在IPTG誘導(dǎo)和添加0.02％辛酸后，在25℃繼續(xù)培養(yǎng)40小時(shí)。然后，向全培養(yǎng)物中添加3mL乙酰乙酸酯，并用混合器混合若干次。利用GC/MS分析乙酰乙酸酯相。
令人驚訝的是，在乙酰乙酸酯提取物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)?；宜狨ァ５?，發(fā)現(xiàn)新化合物，該化合物是辛酸辛酯。而不含SAAT基因的對(duì)照菌株[C41(DE3，ΔfadE)/pRSET B+pAS004.114B]不產(chǎn)生辛酸辛酯。菌株[C41(DE3，ΔfadE)/pHZ1.43B+pAS004.114B]也產(chǎn)生辛酸辛酯，其中pHZ1.43載有不動(dòng)桿菌ADP1的蠟合酶基因(參見(jiàn)圖7B)。
以前沒(méi)有關(guān)于SAAT活性產(chǎn)生辛酸辛酯的報(bào)道，該發(fā)現(xiàn)使制備中鏈蠟諸如辛酸辛酯、辛基癸酸成為可能，它們具有低熔點(diǎn)，是取代基于甘油三酯的生物柴油的生物燃料的良好候選物。
實(shí)施例6，蠟酯在大腸桿菌菌株LS9001中的產(chǎn)生 通過(guò)工程化大腸桿菌制備宿主表達(dá)脂肪醇形成?；o酶A還原酶、硫酯酶和蠟合酶，產(chǎn)生蠟酯。因此，制備宿主產(chǎn)生酯的A側(cè)和B側(cè)兩者，而兩側(cè)的結(jié)構(gòu)均受硫酯酶基因表達(dá)的影響。
更具體地，利用不動(dòng)桿菌ADP1的基因組DNA作為模板，通過(guò)下列引物擴(kuò)增不動(dòng)桿菌ADP1的蠟合酶(稱為WSadp1，登錄號(hào)AA017391，EC2.3.175)。所述引物是(1)WSadp1_NdeI，5’-TCATATGCGCCCA TTACATCCG-3’和(2)WSadp1_Avr，5’-TCCTAGGAGGGCTAATTT AGCCCTTTAGTT-3’。PCR產(chǎn)物用NdeI和AvrII消化，并被克隆入pCOALDeut-1得到pHZ1.43。將載有WSadp1的質(zhì)粒與pETDuet-1′tesA和pCDFDuet-1-fadD-acr1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株LS9001，在添加50mg/L卡那霉素、50mg/L羧芐青霉素和100mg/L壯觀霉素的LB板中挑選轉(zhuǎn)化體。將3個(gè)轉(zhuǎn)化體接種于3mL LBKCS(添加50mg/L卡那霉素、50mg/L羧芐青霉素、100mg/L壯觀霉素和10g/L葡萄糖的LB肉湯)，在37℃振蕩器(250rpm)上培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到0.5OD600時(shí)，將1.5mL各種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到250mL包含50mL LBKCS的燒瓶中，讓燒瓶在37℃的振蕩器(250rpm)上生長(zhǎng)，直至培養(yǎng)物達(dá)到0.5-1.0OD600。然后添加IPTG到1mM的終濃度。所述被誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在37℃振蕩器上再生長(zhǎng)40-48小時(shí)。
然后將培養(yǎng)物放入50mL錐形管中，將細(xì)胞以3500×g離心10分鐘。然后將細(xì)胞沉淀與5mL乙酸乙酯混合。利用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。蠟(包括C16C16，C14:1C16，C18:1C18:1，C2C14，C2C16，C2C16:1，C16C16:1和C2C18:1)的胞內(nèi)產(chǎn)量大約是10mg/L。當(dāng)以相同方式培養(yǎng)只載有空載體的大腸桿菌菌株時(shí)，在乙酸乙酯提取物中只發(fā)現(xiàn)了0.2mg/L的蠟。
實(shí)施例7，脂肪-乙酯在制備宿主中的產(chǎn)生和釋放 通過(guò)用載有不動(dòng)桿菌的蠟合酶基因(質(zhì)粒pHZ1.43)、萼距花的硫酯酶基因(質(zhì)粒pMAL-c2X-TEcu)和大腸桿菌的fadD基因(質(zhì)粒pCDFDuet-1-fadD)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LS9001菌株，實(shí)現(xiàn)對(duì)該菌株的修飾。該重組菌株在25℃ 3mL含有50mg/L卡那霉素、100mg/L羧芐青霉素和100mg/L壯觀霉素的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在IPTG誘導(dǎo)后，將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到1％乙醇和2％葡萄糖的終濃度。IPTG誘導(dǎo)后讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)40小時(shí)。通過(guò)在3500×g離心10分鐘，從消耗的培養(yǎng)基分離細(xì)胞。用3mL M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。然后用1個(gè)體積的乙酸乙酯提取細(xì)胞懸液和消耗的培養(yǎng)基。對(duì)來(lái)自細(xì)胞懸液和上清的所獲乙酸乙酯相進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果顯示C16乙酯是最主要的酯(與對(duì)這種硫酯酶的預(yù)期一致，參見(jiàn)表1)，并且生成脂肪酸酯的20％從細(xì)胞釋放(參見(jiàn)圖8)。包含pCOLADuet-1(蠟合酶基因的空載體)、pMAL-c2X-TEuc(包含加利福尼亞桂樹(shù)的fatB)和pCDFDuet-1-fadD(大腸桿菌的fadD基因)的對(duì)照大腸桿菌菌株C41(DE3，ΔfadE)未能產(chǎn)生可檢測(cè)量的脂肪乙酯。利用商品化的棕櫚酸乙酯作為參照定量脂肪酸酯。除了向發(fā)酵肉湯中添加甲醇或者異丙醇以外，還利用本文描述的的方法制備脂肪酸酯，產(chǎn)生預(yù)期的脂肪酸酯。
實(shí)施例8，各種硫酯酶對(duì)重組大腸桿菌菌株產(chǎn)生的脂肪乙酯組合物的影響。
硫酯酶FatB3(萼距花)、TesA(大腸桿菌)和FatB(加利福尼亞桂樹(shù))與蠟合酶(不動(dòng)桿菌)同時(shí)被表達(dá)。通過(guò)用pHZ1.43的NotI-AvrII片段替換NotI-AvrII片段(載有acr1基因)，構(gòu)建稱為pHZ1.61的質(zhì)粒，這樣的話fadD和ADP1蠟合酶位于同一質(zhì)粒中，并且兩條編碼序列均處于分離的T7啟動(dòng)子控制下。pHZ1.61的構(gòu)建使利用兩質(zhì)粒系統(tǒng)替代實(shí)施例6描述的三質(zhì)粒系統(tǒng)成為可能。然后將pHZ1.61與載有上述不同硫酯酶基因的各種質(zhì)粒中的一種共轉(zhuǎn)化大腸桿菌C41(DE3，ΔfadE)。
利用本文描述的技術(shù)測(cè)定這些轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的總脂肪酸乙酯(上清和胞內(nèi)的脂肪酸乙酯)。脂肪酸乙酯的產(chǎn)量和組合物概述于表8。
表8 重組大腸桿菌C41(DE3，ΔfadE)/pHZ1.61和載有各種硫酯酶基因的質(zhì)粒產(chǎn)生的脂肪酸乙酯的產(chǎn)量(mg/L)和組合物。
注釋‘TesA，pETDuet-1-‘tesA；chFatB3，pMAL-c2X-TEcu；ucFatB，pMAL-c2X-TEuc；pMAL，pMAL-c2X，用于本研究所用硫酯酶的空載體。
實(shí)施例9，制備宿主構(gòu)建 控制脂肪酸產(chǎn)生的基因在微生物之間是保守的。例如，表9鑒定了本文描述的許多基因的同系物，已知它們?cè)诋a(chǎn)生烴的微生物中表達(dá)。為了增加諸如表9所示的那些微生物中脂肪酸的產(chǎn)生，從而增加烴的產(chǎn)生，可以表達(dá)異源基因，諸如那些來(lái)自大腸桿菌的基因。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將理解，也可以利用本文描述的方法過(guò)表達(dá)或者弱化表9所示微生物的內(nèi)源性基因。此外，可以在內(nèi)源性產(chǎn)生烴的微生物中表達(dá)或者弱化圖10描述的基因，以產(chǎn)生具有確定碳鏈長(zhǎng)度、飽和點(diǎn)和分枝點(diǎn)的特定烴。
例如，將編碼乙酰輔酶A羧化酶的外源核酸序列引入K.radiotolerans。下列基因包括K.radiotolerans的乙酰輔酶A羧化酶蛋白產(chǎn)物，乙酰輔酶A羧化酶，α亞基(accA/ZP_00618306)，乙酰輔酶A羧化酶，生物素羧基載體蛋白(accB/ZP_00618387)，乙酰輔酶A羧化酶，生物素羧化酶亞基(accC/ZP_00618040)，和乙酰輔酶A羧化酶，β(羧基轉(zhuǎn)移酶)亞基(accD/ZP_00618306)。將這些基因克隆入質(zhì)粒，這樣的話制備出受Kradiotolerans表達(dá)系統(tǒng)控制的合成乙酰輔酶A羧化酶操縱子(accABCD)，所述表達(dá)系統(tǒng)諸如Ruyter等人(Appl EnvironMicrobiol.623662-3667，1996)公開(kāi)的表達(dá)系統(tǒng)。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化K.radiotolerans將增強(qiáng)脂肪酸產(chǎn)生。還可以利用本文公開(kāi)的方法，將K.radiotolerans的烴產(chǎn)生菌株工程化為產(chǎn)生具有特定碳鏈長(zhǎng)度的支化不飽和烴。
表9 烴制備宿主 生物 基因名登錄號(hào)/Seq ID/基因座 EC號(hào) 脫硫脫硫弧菌 G20 accA YP_388034 6.4.1.2 6.3.4.14， 脫硫脫硫弧菌 G22 accC YP_388573/YP_3880336.4.1.2 脫硫脫硫弧菌 G23 accD YP_388034 6.4.1.2 脫硫脫硫弧菌 G28 fabH YP_388920 2.3.1.180 脫硫脫硫弧菌 G29 fabD YP_388786 2.3.1.39 脫硫脫硫弧菌 G30 fabG YP_388921 1.1.1.100 3.1.26.3， 脫硫脫硫弧菌 G31 acpP YP_388922/YP_3891501.6.5.3， 1.6.99.3 脫硫脫硫弧菌 G32 fabF YP_388923 2.3.1.179 脫硫脫硫弧菌 G33 gpsA YP_389667 1.1.1.94 1.1.1.27， 脫硫脫硫弧菌 G34 ldhA YP_388173/YP_3901771.1.1.28 梨火疫病菌(微球菌)(Erwinia accA 942060-943016 6.4.1.2 (micrococcus)amylovora) 梨火疫病菌(微球菌) accB 3440869-3441336 6.4.1.2 梨火疫病菌(微球菌) accC 3441351-3442697 6.3.4.14， 6.4.1.2 梨火疫病菌(微球菌) accD 2517571-2516696 6.4.1.2 梨火疫病菌(微球菌) fadE 1003232-1000791 1.3.99.- 梨火疫病菌(微球菌) plsB(D311E)333843-331423 2.3.1.15 梨火疫病菌(微球菌) aceE 840558-843218 1.2.4.1 梨火疫病菌(微球菌) aceF 843248-844828 2.3.1.12 梨火疫病菌(微球菌) fabH 1579839-1580789 2.3.1.180 梨火疫病菌(微球菌) fabD 1580826-1581749 2.3.1.39 梨火疫病菌(微球菌) fabG CAA74944 1.1.1.100 3.1.26.3， 梨火疫病菌(微球菌) acpP 1582658-1582891 1.6.5.3， 1.6.99.3 梨火疫病菌(微球菌) fabF 1582983-1584221 2.3.1.179 梨火疫病菌(微球菌) gpsA 124800-125810 1.1.1.94 1.1.1.27， 梨火疫病菌(微球菌) ldhA 1956806-1957789 1.1.1.28 Kineococcus radiotolerans SRS30216 accA ZP_00618306 6.4.1.2 Kineococcus radiotolerans SRS30216 accB ZP_00618387 6.4.1.2 Kineococcus radiotolerans ZP_006180406.3.4.14， SRS30216 accC /ZP_00618387 6.4.1.2 Kineococcus radiotolerans SRS30216 accD ZP_006183066.4.1.2 Kineococcus radiotolerans SRS30216 fadE ZP_006177731.3.99.- Kineococcus radiotolerans SRS30216 plsB(D311E)ZP_006172792.3.1.15 Kineococcus radiotolerans SRS30216 aceE ZP_006176001.2.4.1 Kineococcus radiotolerans SRS30216 aceF ZP_006193072.3.1.12 Kineococcus radiotolerans SRS30216 fabH ZP_006180032.3.1.180 Kineococcus radiotolerans SRS30216 fabD ZP_006176022.3.1.39 Kineococcus radiotolerans SRS30216 fabG ZP_006156511.1.1.100 Kineococcus radiotolerans acpP ZP_006176043.1.26.3， SRS302161.6.5.3， 1.6.99.3 Kineococcus radiotolerans SRS30216 fabF ZP_00617605 2.3.1.179 Kineococcus radiotolerans SRS30216 gpsA ZP_00618825 1.1.1.94 Kineococcus radiotolerans 1.1.1.27， SRS30216 ldhA ZP_00618879 1.1.1.28 深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)accA YP_425310 6.4.1.2 深紅紅螺菌 accB YP_427521 6.4.1.2 YP_427522/YP_425144/ YP_427028/YP_426209/ 6.3.4.14， 深紅紅螺菌 accC YP_427404 6.4.1.2 深紅紅螺菌 accD YP_428511 6.4.1.2 深紅紅螺菌 fadE YP_427035 1.3.99.- 深紅紅螺菌 aceE YP_427492 1.2.4.1 深紅紅螺菌 aceF YP_426966 2.3.1.12 深紅紅螺菌 fabH YP_426754 2.3.1.180 深紅紅螺菌 fabD YP_425507 2.3.1.39 深紅紅螺菌 fabG YP_425508/YP_425365 1.1.1.100 3.1.26.3， 1.6.5.3， 深紅紅螺菌 acpP YP_425509 1.6.99.3 YP_425510/YP_425510 深紅紅螺菌 fabF /YP_4252852.3.1.179 深紅紅螺菌 gpsA YP_428652 1.1.1.94 1.1.1.27， 深紅紅螺菌 ldhA YP_426902/YP_428871 1.1.1.28 弗尼斯弧菌 accA 1，16 6.4.1.2 弗尼斯弧菌 accB 2，17 6.4.1.2 6.3.4.14， 弗尼斯弧菌 accC 3，18 6.4.1.2 弗尼斯弧菌 accD 4，19 6.4.1.2 弗尼斯弧菌 fadE 5，20 1.3.99.- 弗尼斯弧菌 plsB(D311E)6，21 2.3.1.15 弗尼斯弧菌 aceE 7，22 1.2.4.1 弗尼斯弧菌 aceF 8，23 2.3.1.12 弗尼斯弧菌 fabH 9，24 2.3.1.180 弗尼斯弧菌 fabD 10，252.3.1.39 弗尼斯弧菌 fabG 11，261.1.1.100 弗尼斯弧菌 acpP 12，273.1.26.3， 1.6.5.3， 1.6.99.3 弗尼斯弧菌 fabF 13，28 2.3.1.179 弗尼斯弧菌 gpsA 14，29 1.1.1.94 1.1.1.27， 弗尼斯弧菌 ldhA 15，30 1.1.1.28 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 accA ZP_016437996.4.1.2 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 accB ZP_016440366.4.1.2 6.3.4.14， 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 accC ZP_016440376.4.1.2 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 accD ZP_016448016.4.1.2 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 fadE ZP_016458231.3.99.- 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 plsB(D311E) ZP_016441522.3.1.15 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 aceE ZP_016447241.2.4.1 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 aceF ZP_016457952.3.1.12 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 fabH ZP_016432472.3.1.180 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 fabD ZP_016435352.3.1.39 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 fabG ZP_016430621.1.1.100 3.1.26.3， 1.6.5.3， 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 acpP ZP_016430631.6.99.3 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 fabF ZP_016430642.3.1.179 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 gpsA ZP_016432161.1.1.94 1.1.1.27， 嗜麥芽窄食單胞菌 R551-3 ldhA ZP_016453951.1.1.28 對(duì)于表9，登錄號(hào)來(lái)自于GenBank，2007年4月15號(hào)Release 159.0， EC編號(hào)來(lái)自于KEGG，2007年4月Release 42.0(加上每日更新直至并包括05/09/07)，梨火疫病菌菌株Ea273的結(jié)果來(lái)自于Sanger測(cè)序中心，5/9/07的完整鳥(niǎo)槍序列，歐文氏菌(Erwinia)的位置代表Sanger假染色體上的位置，弗尼斯弧菌M1的序列來(lái)自于LS9 VFM1假染色體，v2完成，9/28/06，并且包括完整的基因，還可能包括側(cè)翼序列。
實(shí)施例10，其他示例性制備菌株 下面的表10提供其他的示例性制備菌株。描述了兩種產(chǎn)生脂肪酸、脂肪醇和蠟酯的示例性生物合成途徑。通過(guò)將大腸桿菌的accABCD基因、大腸桿菌的′tesA基因和大腸桿菌的fadD基因的表達(dá)克隆入宿主細(xì)胞，可以產(chǎn)生遺傳工程化的宿主。宿主細(xì)胞可以選自大腸桿菌、酵母，將它們添加到該表中。還可以將這些基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被修飾以包含上面實(shí)施例1和2描述的一個(gè)或者多個(gè)遺傳操作。如表10所示，可以利用指定的外源基因產(chǎn)生其他的制備宿主。
表10 用于制備遺傳工程化制備菌株的基因組合

實(shí)施例11，發(fā)酵 可以將宿主微生物工程化為表達(dá)在pBAD24中prpBCDE啟動(dòng)子系統(tǒng)下來(lái)自大腸桿菌的umuC和umuD，其通過(guò)該基因與合適終產(chǎn)物制備基因的從頭合成。對(duì)于小規(guī)模的烴產(chǎn)物制備，將載有pBAD24(具有氨芐青霉素抗性和終產(chǎn)物合成途徑)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰輔酶A/丙二酰輔酶A過(guò)表達(dá)系統(tǒng))的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞在2L燒瓶的500ml LB培養(yǎng)基中37℃振蕩>200rpm孵育過(guò)夜，所述LB培養(yǎng)基添加有75μg/mL氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素，直到培養(yǎng)物達(dá)到OD600>0.8。當(dāng)實(shí)現(xiàn)OD600>0.8時(shí)，向細(xì)胞中添加25mM丙酸鈉(pH 8.0)，以激活用于制備的工程化基因系統(tǒng)并且停止細(xì)胞增殖(通過(guò)umuC和umuD蛋白的激活)。誘導(dǎo)在30℃進(jìn)行6小時(shí)。孵育后，利用GC-MS(如下所述)檢查培養(yǎng)基中的產(chǎn)物。
對(duì)于大規(guī)模產(chǎn)物制備，工程化的微生物在10L、100L或者更大的批次中生長(zhǎng)，發(fā)酵，并酌情根據(jù)質(zhì)粒中編碼的特定基因而誘導(dǎo)表達(dá)所需產(chǎn)物。將載有pBAD24(具有氨芐青霉素抗性和終產(chǎn)物合成途徑)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰輔酶A/丙二酰輔酶A過(guò)表達(dá)系統(tǒng))的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基(無(wú)甘油)中37℃振蕩>200rpm孵育，500mL種子培養(yǎng)物用于10L發(fā)酵(5L用于100L發(fā)酵)，直到與75μg/mL氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素孵育的培養(yǎng)物達(dá)到OD600>0.8(通常16小時(shí))。通過(guò)連續(xù)添加維持培養(yǎng)基中25mM丙酸鈉(pH 8.0)，以激活用于制備的工程化基因系統(tǒng)并且停止細(xì)胞增殖(通過(guò)umuC和umuD蛋白的激活)。向培養(yǎng)基中連續(xù)添加葡萄糖以維持90g/100mL的濃度。誘導(dǎo)1小時(shí)后，每小時(shí)取出不超過(guò)總細(xì)胞體積10％的等份式樣，并保持不攪動(dòng)，以便烴產(chǎn)物上升到表面并經(jīng)歷自發(fā)的相分離。然后收集烴組分，并將水相返回反應(yīng)室。反應(yīng)室連續(xù)運(yùn)作。當(dāng)OD600降低到0.6以下時(shí)，用來(lái)源于種子培養(yǎng)物的新批次替換細(xì)胞。
對(duì)于蠟酯制備，分離后，用1M HCl簡(jiǎn)單洗滌蠟酯以打開(kāi)酯鍵，然后用蒸餾水徹底洗滌恢復(fù)到pH 7。
實(shí)施例12，產(chǎn)物表征 為了表征和定量脂肪醇和脂肪酸酯，使用電子碰撞質(zhì)譜(MS)與氣相色譜法(GC)聯(lián)合的檢測(cè)法。首先用過(guò)量的的N-三甲基硅烷(TMS)咪唑衍生化脂肪醇樣品以增加檢測(cè)靈敏度。脂肪酸酯不需要衍生化。將脂肪醇-TMS衍生物和脂肪酸酯溶于合適的揮發(fā)性溶劑，諸如乙酸乙酯。利用下列方法在30m DP-5毛細(xì)管柱上分析樣品。無(wú)分流注射1μL到GC/MS柱后，將烘箱維持在100℃ 3分鐘。按照20℃/分鐘的速率將溫度升至320℃。烘箱在320℃再維持5分鐘。載氣氦的流速是1.3mL/分鐘。MS四極式掃描50-550m/z。將產(chǎn)物峰的保留時(shí)間和裂解譜與可靠參照進(jìn)行比較以證實(shí)峰的同一性。
例如，十六烷酸乙酯在10.18分鐘洗脫(圖9A和圖9B)。非常容易的觀察到284質(zhì)量單位的母離子。更多的是質(zhì)譜裂解期間產(chǎn)生的子離子。這包括最普遍的80質(zhì)量單位的子離子。衍生化脂肪醇十六醇-TMS在10.29分鐘洗脫，可以觀察到313的母離子。最普遍的離子是299質(zhì)量單位的M-14離子。
利用如上所述的GC/MS方法，通過(guò)注射各種濃度的合適可靠參照進(jìn)行定量。該信息用于繪制應(yīng)答(總積分的離子計(jì)數(shù))相對(duì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
等同 當(dāng)本發(fā)明的具體實(shí)例在本文中明確公開(kāi)時(shí)，上述說(shuō)明書(shū)和本文的實(shí)例只是說(shuō)明性的，而非限制性的。在瀏覽了本說(shuō)明書(shū)包括實(shí)例后，本發(fā)明的許多變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的全部范圍應(yīng)該參考實(shí)例和等同物的全部范圍以及說(shuō)明書(shū)和這種變化來(lái)確定。
序列表
<110>LS9公司
<120>脂肪酸及其衍生物的制備
<130>7771-77376-02
<160>30
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>498
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>1
<210>2
<211>564
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>2
<210>3
<211>1344
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>3
<210>4
<211>927
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>4
<210>5
<211>2445
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>5
<210>6
<211>2424
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>6
<210>7
<211>2661
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>7
<210>8
<211>1893
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>8
<210>9
<211>951
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>9
<210>10
<211>924
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>10
<210>11
<211>747
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>11
<210>12
<211>525
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>12
<210>13
<211>1251
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>13
<210>14
<211>1035
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>14
<210>15
<211>855
<212>DNA
<213>弗尼斯弧菌
<400>15
<210>16
<211>177
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>16
<210>17
<211>187
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>17
<210>18
<211>447
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>18
<210>19
<211>308
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>19
<210>20
<211>814
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>20
<210>21
<211>807
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>21
<210>22
<211>886
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>22
<210>23
<211>630
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>23
<210>24
<211>316
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>24
<210>25
<211>307
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>25
<210>26
<211>248
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>26
<210>27
<211>77
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>27
<210>28
<211>416
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>28
<210>29
<211>344
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>29
<210>30
<211>284
<212>PRT
<213>弗尼斯弧菌
<400>30
權(quán)利要求
1.微生物，包括一種或者多種編碼至少一種肽的外源核酸序列，所述肽選自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其組合，和包括蠟合酶(EC 2.3.1.75)的肽。
2.微生物，包括一種或者多種編碼至少一種肽的外源核酸序列，所述肽選自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其組合，和包括醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(2.3.1.84)的肽。
3.微生物，包括一種或者多種編碼至少一種肽的外源核酸序列，所述肽選自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其組合，和包括醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)的肽。
4.微生物，包括一種或者多種編碼至少一種肽的外源核酸序列，所述肽選自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其組合，和包括脂肪醇形成?；o酶A還原酶(1.1.1.*)的肽。
5.微生物，包括一種或者多種弱化的內(nèi)源核酸序列，所述序列選自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登錄號(hào)NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其組合，和一種或者多種編碼包括蠟合酶(EC 2.3.1.75)或者?；D(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.84)的第二肽的外源核酸序列。
6.微生物，包括一種或者多種弱化的內(nèi)源核酸序列，所述序列選自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登錄號(hào)NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其組合，和一種或者多種編碼包括醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.84)的肽的外源核酸序列。
7.微生物，包括一種或者多種弱化的內(nèi)源核酸序列，所述序列選自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登錄號(hào)NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其組合，和一種或者多種編碼包括醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)的肽的外源核酸序列。
8.微生物，包括一種或者多種弱化的內(nèi)源核酸序列，所述序列選自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登錄號(hào)NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其組合，和一種或者多種編碼包括脂肪醇形成?；o酶A還原酶(1.2.1.*)的肽的外源核酸序列。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌(E.coli)。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物還包括脂肪酸衍生物。
11.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述微生物還包括編碼ACP、Sfa或者其組合的外源核酸序列。
12.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述微生物表達(dá)一種或者多種編碼酶的外源核酸序列，所述酶選自支鏈酮酸脫氫酶復(fù)合物(EC1.2.4.4)的一種或者多種組分，llve(EC 2.6.1.42)，lpd(EC 1.8.1.4)，Ccr(EC1.1.19)，IcmA(EC5.4.99.2)，IcmB(5.4.99.13)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabH3(EC 2.3.1.180)，fabC3(NP_823468)，β-酮酰-ACP合酶II(EC 2.3.1.180)，烯酰輔酶A還原酶(EC 1.3.1.34)，烯酰輔酶A異構(gòu)酶(EC 4.2.1.-)及其組合，其中所述脂肪酸衍生物是分枝的。
13.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述微生物表達(dá)一種或者多種編碼硫酯酶(3.1.2.-，3.1.1.-)的外源核酸序列。
14.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述微生物表達(dá)一種或者多種編碼酶的外源核酸序列，所述酶選自fabB(EC2.3.1.41)，fabK(EC 1.2.1.9)，fabL(EC 1.2.1.9)，fabM(5.3.3.14)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)及其組合，并且其中所述脂肪酸衍生物是不飽和的。
15.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中fadE被弱化。
16.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中accABCE、fadD被過(guò)表達(dá)。
17.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物位于包括發(fā)酵肉湯的容器中，所述發(fā)酵肉湯包括至少10mg/L脂肪酸酯，10mg/L脂肪醇，10mg/L烴或者至少10mg/L蠟。
18.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述脂肪酸衍生物包括大約1個(gè)到大約5個(gè)雙鍵。
19.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述脂肪酸衍生物包括大約8到大約30的碳鏈長(zhǎng)度。
20.如權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述脂肪酸衍生物包括大約1個(gè)到大約5個(gè)分枝點(diǎn)。
21.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物還包括具有A側(cè)和B側(cè)的脂肪酸酯或者蠟。
22.如權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述A側(cè)和B側(cè)由所述微生物產(chǎn)生。
23.如權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述A側(cè)、B側(cè)或者A側(cè)和B側(cè)兩者包括大約1個(gè)到大約5個(gè)雙鍵。
24.如權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述A側(cè)、B側(cè)或者A側(cè)和B側(cè)兩者包括大約1到大約26的碳鏈長(zhǎng)度。
25.如權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述A側(cè)、B側(cè)或者A側(cè)和B側(cè)兩者包括大約1個(gè)到大約5個(gè)碳分枝點(diǎn)。
26.如權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述A側(cè)、B側(cè)或者A側(cè)和B側(cè)兩者包括1到5個(gè)環(huán)丙基部分。
27.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物是節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)，芽孢桿菌(Bacillus sp.)，布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)，著色菌(Chromatium sp.)，樹(shù)脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)，巴斯德梭狀芽胞桿菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM)，破傷風(fēng)形梭菌(Clostridiumtenanomorphum)，尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)，棒狀桿菌(Corynebacterium species)，藍(lán)藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)，組囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)，絲狀藍(lán)藻(Phormidium luridum)，佛氏綠膠藍(lán)細(xì)菌(Chlorogloea fritschii)，紅海束毛藻(Trichodesmium erythaeum)，Oscillatoria williamsii，微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)，Coccochloris elabens，Agmenellumquadruplicatum，Plectonema terebrans，具鞘微鞘藻(M vaginatus)和巖生眉藻(C.scopulorum))，脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)(ATCC29577)，Kineococcus radiotolerans(BAA-149)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)，小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146，398，401，533)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)，分支桿菌(Mycobacterium species)，青霉(Penicillium sp.)，曲霉(Aspergillus sp.)，綠色木霉(Trichodermavirida)，出芽短梗霉(Pullularia pullulans)，Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)，紅假單胞菌球狀綠菌(Rhodopseudomonasspheroids Chlorobium sp.)，深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)，萬(wàn)尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)，路德類酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)，類酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)，弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)，海產(chǎn)弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)，Vibrio ponticus，海紅沙雷氏菌(Serratia marinorubra)，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，麥散黑粉菌(Ustilago nuda)，小麥條黑粉菌(Urocystis agropyri)，高粱絲黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)，或者腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)。
28.產(chǎn)生脂肪醇的方法，包括在足以產(chǎn)生脂肪醇的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求3、4、7或者8中任一項(xiàng)所述的微生物；并分離所述脂肪醇。
29.產(chǎn)生脂肪酸酯的方法，包括在足以產(chǎn)生脂肪酸酯的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1、2、6、7或者21-25中任一項(xiàng)所述的微生物；并分離所述脂肪酸酯。
30.產(chǎn)生蠟的方法，包括在足以產(chǎn)生蠟的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1、2、6、7或者21-25中任一項(xiàng)所述的微生物；并分離所述蠟。
31.微生物，選自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、著色菌(Chromatium sp.)、樹(shù)脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)、巴斯德梭狀芽胞桿菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM)、破傷風(fēng)形梭菌(Clostridiumtenanomorphum)、尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)、棒狀桿菌(Corynebacterium species)、藍(lán)藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)、組囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)、絲狀藍(lán)藻(Phormidium luridum)、佛氏綠膠藍(lán)細(xì)菌(Chlorogloea fritschii)、紅海束毛藻(Trichodesmium erythaeum)、Oscillatoria williamsii、微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)、Coccochloris elabens、Agmenellumquadruplicatum、Plectonema terebrans、具鞘微鞘藻(M vaginatus)和巖生眉藻(C.scopulorum))、脫硫脫硫弧菌(ATCC29577)(Desulfovibriodesulfuricans)，Kineococcus radiotolerans(BAA-149)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)，小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146，398，401，533)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、分支桿菌(Mycobacterium species)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、綠色木霉(Trichoderma virida)、出芽短梗霉(Pullularia pullulans)、Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)、紅假單胞菌球狀綠菌(Rhodopseudomonasspheroids Chlorobium sp.)、深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)、萬(wàn)尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)、路德類酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)、類酵母(Saccharomycessp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)、弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)、海產(chǎn)弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)、Vibrio ponticus，海紅沙雷氏菌(Serratia marinorubra)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、麥散黑粉菌(Ustilago nuda)、小麥條黑粉菌(Urocystis agropyri)、高粱絲黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)或者腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)，其包括一種或者多種編碼第一多肽的外源核酸序列，所述第一多肽選自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其組合，其中與野生型微生物相比，所述微生物產(chǎn)生烴的量增加。
32.微生物，選自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、著色菌(Chromatium sp.)、樹(shù)脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)、巴斯德梭狀芽胞桿菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM)、破傷風(fēng)形梭菌(Clostridiumtenanomorphum)、尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)、棒狀桿菌(Corynebacterium species)、藍(lán)藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)、組囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)、絲狀藍(lán)藻(Phormidium luridum)、佛氏綠膠藍(lán)細(xì)菌(Chlorogloea fritschii)、紅海束毛藻(Trichodesmium erythaeum)、Oscillatoria williamsii、微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)、Coccochloris elabens、Agmenellumquadruplicatum、Plectonema terebrans、具鞘微鞘藻(M vaginatus)和巖生眉藻(C.scopulorum))、脫硫脫硫弧菌(ATCC29577)(Desulfovibriodesulfuricans)，Kineococcus radiotolerans(BAA-149)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)、小球菌(Micrococcu sp.)(ATCC 146，398，401，533)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、分支桿菌(Mycobacterium species)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、綠色木霉(Trichoderma virida)、出芽短梗霉(Pullularia pullulans)、Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)、紅假單胞菌球狀綠菌(Rhodopseudomonasspheroids Chlorobium sp.)、深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)、萬(wàn)尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)、路德類酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)、類酵母(Saccharomycessp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)、弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)、海產(chǎn)弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)、Vibrio ponticus、海紅沙雷氏菌(Serratia marinorubra)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、麥散黑粉菌(Ustilago nuda)、小麥條黑粉菌(Urocystis agropyri)、高粱絲黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)和腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)，其包括一種或者多種弱化的內(nèi)源核酸序列，所述核酸序列選自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登錄號(hào)NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其組合，其中與野生型微生物相比，所述微生物產(chǎn)生烴的量增加。
33.如權(quán)利要求31或者32中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物還表達(dá)酶，所述酶選自蠟合酶(EC 2.3.1.75)，醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(2.3.1.84)，醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)和脂肪醇形成酰基輔酶A還原酶(1.1.1.*)。
34.如權(quán)利要求31和32中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物表達(dá)一種或者多種編碼酶的核酸序列，所述酶選自支鏈酮酸脫氫酶復(fù)合物(EC 1.2.4.4)的一種或者多種組分，llve(EC 2.6.1.42)，lpd(EC1.8.1.4)，Ccr(EC 1.1.19)，IcmA(EC5.4.99.2)，IcmB(5.4.99.13)，fabH(EC2.3.1.180)，ACP(登錄號(hào)NP_626635)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabH3(EC2.3.1.180)，fabC3(NP_823468)，β-酮酰-ACP合酶II(EC 2.3.1.180)，烯酰輔酶A還原酶(EC 1.3.1.34)，烯酰輔酶A異構(gòu)酶(EC 4.2.1.-)及其組合，其中所述脂肪酸衍生物是分枝的。
35.如權(quán)利要求31和32中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物表達(dá)一種或者多種編碼硫酯酶(3.1.2.-，3.1.1.-)的外源核酸序列。
36.如權(quán)利要求31和32中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物表達(dá)一種或者多種編碼酶的外源核酸序列，所述酶選自FadA(EC2.3.1.16)，F(xiàn)adI(EC 2.3.1.16)，F(xiàn)adB(EC 2.3.1.41)，F(xiàn)adJ(EC 4.2.1.17，EC 5.1.2.3，EC 5.3.3.8，EC 1.1.1.35)，F(xiàn)abK(EC 1.2.1.9)，F(xiàn)abL(EC1.2.1.9)，F(xiàn)abM(5.3.3.14)及其組合。
37.獲得純化的脂肪酸衍生物的方法，包括，
在足以產(chǎn)生脂肪酸衍生物的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求1-28和31-36中任一項(xiàng)所述的微生物；
使所述脂肪酸衍生物分離進(jìn)入有機(jī)相；和
從所述有機(jī)相純化所述脂肪酸衍生物。
38.生物燃料組合物，包括
至少大約85％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括選自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳鏈；和
至少一種足以將所述生物燃料組合物的濁點(diǎn)降低到低于大約0℃的添加劑。
39.生物燃料組合物，包括
至少大約17％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括選自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳鏈；和
至少大約80％的常規(guī)柴油。
40.生物燃料組合物或者原料，包括具有大約-10.9到大約-15.4的δ13C的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占所述組合物中生物來(lái)源材料的至少大約85％。
41.生物燃料組合物或者原料，包括具有以下化學(xué)式的脂肪酸衍生物
X——(CH(R))nCH3
其中X代表CH3，-CH2OR1；-C(O)OR2；或者-C(O)NR3R4；
對(duì)于每個(gè)n，R獨(dú)立地是不存在的、H或者低級(jí)脂肪族；
n是從8到34的整數(shù)；和
R1，R2，R3和R4獨(dú)立地選自H和低級(jí)烷基；
其中所述脂肪酸衍生物具有大約-10.9到大約-15.4的δ13C；并且所述脂肪酸衍生物占所述組合物中生物來(lái)源材料的至少大約85％。
42.如權(quán)利要求40所述的生物燃料組合物，其中所述脂肪酸衍生物占所述組合物中生物來(lái)源的脂肪酸衍生材料的至少大約85％。
43.如權(quán)利要求41所述的生物燃料組合物或者原料，其中所述脂肪酸衍生物具有至少大約1.003的現(xiàn)代碳分?jǐn)?shù)(fM 14C)。
44.如權(quán)利要求41所述的生物燃料組合物或者原料，其中對(duì)于每個(gè)n來(lái)說(shuō)，R獨(dú)立地選自H，甲基，乙基，異丙基，異丁基，仲丁基和環(huán)戊烯基。
45.如權(quán)利要求41所述的生物燃料組合物或者原料，其中所述式
(CH(R))n
包括至少一個(gè)烯基部分。
46.如權(quán)利要求41所述的生物燃料組合物或者原料，其中所述脂肪酸衍生物包括選自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳鏈。
47.如權(quán)利要求41所述的生物燃料組合物或者原料，在所述生物燃料組合物中還包括低級(jí)醇。
48.如權(quán)利要求47所述的生物燃料組合物，其中所述低級(jí)醇選自乙醇、丁醇、己醇或者其組合。
49.如權(quán)利要求47所述的生物燃料組合物，還包括表面活性劑。
50.如權(quán)利要求47所述的生物燃料組合物，其中所述生物燃料組合物包括微乳劑。
51.生物燃料組合物，包括
至少大約55％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括選自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳鏈；和
至少一種足以將所述生物燃料組合物的濁點(diǎn)降低到低于大約0℃的添加劑。
52.如權(quán)利要求51所述的生物燃料組合物，其中所述脂肪酸衍生物具有大約-10.9到大約-15.4的δ13C。
53.如權(quán)利要求51所述的生物燃料組合物，還包括低級(jí)醇。
54.生物燃料組合物，包括
至少大約11％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括選自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳鏈；和
至少大約80％的常規(guī)柴油。
55.生物燃料組合物或者原料，包括具有以下化學(xué)式的脂肪酸衍生物
X——(CH(R))nCH3
其中X代表CH3，-CH2OR1；-C(O)OR2；或者-C(O)NR3R4；
對(duì)于每個(gè)n，R獨(dú)立地是不存在的、H或者低級(jí)烷基，并且至少一個(gè)R是低級(jí)烷基；
n是從8到34的整數(shù)；
R1，R2，R3和R4獨(dú)立地選自H和低級(jí)烷基；和
其中所述脂肪酸衍生物具有大約-10.9到大約-15.4的δ13C。
56.如權(quán)利要求55所述的生物燃料組合物，其中所述脂肪酸衍生物是所述生物燃料組合物的至少大約10％。
57.生物燃料組合物，基本上由具有以下化學(xué)式的脂肪酸衍生物組成
X——(CH(R))nCH3
其中X代表CH3，-CH2OR1；-C(O)OR2；或者-C(O)NR3R4；
對(duì)于每個(gè)n，R獨(dú)立地是不存在的、H或者低級(jí)烷基；
n是從8到34的整數(shù)；和
R1，R2，R3和R4獨(dú)立地選自H和低級(jí)烷基；
其中所述脂肪酸衍生物具有大約-10.9到大約-15.4的δ13C。
58.如權(quán)利要求38-57中任一項(xiàng)所述的生物燃料，其中所述生物燃料包括低于.1％的甘油。
59.如權(quán)利要求38-58中任一項(xiàng)所述的生物燃料，其中所述生物燃料包括低于0.1％的轉(zhuǎn)酯催化劑。
全文摘要
本發(fā)明提供遺傳工程化的微生物以及它們的使用方法，所述微生物產(chǎn)生來(lái)自脂肪酸生物合成途徑的產(chǎn)物(脂肪酸衍生物)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101490241SQ200780025145
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者杰伊·D·基斯凌, 胡志浩, 克里斯·薩默維爾, 喬治·丘奇, 大衛(wèi)·貝里, 利薩·弗里德曼, 安德里亞斯·席爾默, 謝恩·布魯貝克, 斯蒂芬·B·德?tīng)柨栠_(dá)耶 申請(qǐng)人:Ls9公司