專利名稱：在干果的開裂區(qū)中表達的啟動子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種啟動子，它允許一種相關的基因在干果開裂區(qū)(dehiscence zone)的 細胞中的特異性表達。
背景技術：
在進化過程中，各種植物已經為散播其種子建立了不同的體系。對于具有千開裂果的 植物來說，包含在果實中的種子是在成熟時所述果實的自發(fā)的張開后散播的。這種張開通 過一個或多個開裂區(qū)而發(fā)生。
一個開裂區(qū)包括在兩個區(qū)域(以下稱為邊緣(margin))的細胞之間的一個非木質化的 細胞的區(qū)域(以下稱為破裂區(qū))，這些細胞在果實成熟的過程中變?yōu)槟举|化；由這種木質 化作用引發(fā)的應力致使相鄰的破裂區(qū)裂開。在細胞壁中的水解酶也可能參與了開裂區(qū)的破 裂。
存在著不同類型的干開裂果。特別要提及的是莢果和長角果，它們分別屬于豆科 (Fabaceae)和十字花科(Brassicaceae),這兩科包括許多具有農學價值的植物。
莢果是一種源自單一心皮的干開裂果，該單一心皮通過胎座邊緣上的一個縫而閉合； 莢果通過兩個開裂區(qū)張開， 一個開裂區(qū)位于該胎座縫處而另一個位于心皮的中隔(median rib)處。
長角果是一種源自兩個心皮(也稱為瓣(valve))的干開裂果，這些心皮在其邊緣處 結合在一起并被一個間隔物(胎座框)分開。開裂區(qū)沿著瓣和胎座框之間的連接處定位。 每個開裂區(qū)包含一個破裂區(qū)，該破裂區(qū)一方面以瓣邊緣的木質化的細胞為界，而另一方面 以胎座框的木質化的細胞為界。在這個區(qū)域的撕裂導致這些瓣和胎座框的分離以及長角果 的張開。


圖1表示擬南芥的一個長角果的橫切面，表明瓣和胎座框的位置；破裂區(qū)(zR)的位 置以及瓣邊緣的木質化的細胞(CL)的位置也在圖的左側部分標注。
在果實達到成熟時發(fā)生的自發(fā)開裂在大量作物植物例如油菜或大豆中引發(fā)了不同的 問題。
自發(fā)開裂的主要的不利后果是產量的一個相當大的損失。這是因為在長角果張開時一
3些種子落到地上并因此在收割機經過時沒有收獲，這導致了不僅是產量的一個相當大的損 失(從10%到25%)，而且還有再生長問題，這損害輪作。此外，莢果或長角果不開裂也 使之有可能在一些植物例如大豆或濱豆中減少被某些害蟲或疾病侵染(ROBERTS et al， A腿ls of Botany， 86, 223-235, 2000)。
已經提出幾種方法以克服由自發(fā)性開裂引起的問題。某些涉及耕作的實踐，例如改善 收割機。其他方法是基于尋找在成熟時有更少的長角果開裂的品種。例如，已經對油菜提 出這種方法。因為在用于產油而種植的歐洲油菜(^ra^/ca "a/w^品種中關于這種特性存在 很少的遺傳變異，所以已經嘗試利用蕪青rBra^/c" ra;^J滲入一種或多種負責減少長角 果開裂的基因，在蕪青中對于這種特性的遺傳變異更大。然而，人們觀察到同時滲入了其 他一些可能不利的特性。
目前引起極大興趣的一種方法在于通過基因工程來修飾與干果的開裂有關(并且特別 是與長角果的開裂有關)的基因的表達，以便控制所述開裂。
已經識別了與長角果開裂有關的不同的基因(關于綜述，參照例如，F(xiàn)ERRANDIZ, J of Exp. Botany 53, 377, 2031-2038, 2002)。
在許多情況中，它們是與開裂區(qū)的細胞分化有關的基因。在這個類別中，應提及例如 S/^r7E7 /^(90F / CWJ禾卩5T^r7^/ 尸/ (90/^ f57 2J基因，它們編碼與毗連破裂區(qū)的 瓣的邊緣的木質化有關的MADS-box轉錄因子(LILJEGREN et al Nature, 404: 766-770， 2000)。當使這些基因失活時，未觀察到瓣的邊緣的木質化或開裂區(qū)的形成。
在瓣中表達的/^L^TFMjL基因(Fw/)(它是另一個MADS-box轉錄因子)負向地控 制SW和脂的表達(FERRANDIZ et al., Science, 289: 436-438, 2000)。當它被過表達時， 觀察到與這兩個基因的失活所產生的表型相似的一種表型。相反地，JO4M0ra基因 正向地控制和幼2的表達。
J1C477"Z基因(Wc)是一種bHLH (堿性螺旋-環(huán)-螺旋)結構域蛋白，它使得發(fā)生 開裂區(qū)裂開的非木質化的區(qū)域能夠特化(RAJANI and SUNDARESAN, Curr Biol 11, 1914-1922,2001)。在這個基因被失活的突變體中，這個非木質化的區(qū)域不存在，導致果實 不開裂。
T^/lLf/Mi^SS基因(i ; /)是一種與胎座框的安置有關的同源結構域基因(ROEDER et al., Curr Biol, 13, 1630-5, 2003)。另一種同源結構域轉錄因子/M^/Z/SC五AT 也已 知與開裂區(qū)的分化有關(LILJEGREN et al., Cell, 116， 843-53， 2004)。
另一類與開裂有關的基因包括對參與細胞壁水解酶進行編碼的基因。例如，已經觀察
4到與果膠降解有關的一種多聚半乳糖醛酸酶(PG)是在開裂區(qū)中表達(JENKINS etal., J. Exp. Botany 47, 1111-1115, 1996; PETERSEN et al., Plant Mol Biol, 31， 517-527, 1996)。
為了控制開裂，已經提出針對與這種開裂有關的不同基因的表達開展工作。 作為舉例PCT申請WO 97/13865提出，為了推遲開裂，在開裂區(qū)的細胞中表達要么 是抑制細胞壁水解酶表達的一種RNA、要么是干擾新陳代謝(所述細胞的生理學或者發(fā)育) 的一種蛋白；PCT申請WO 01/79517提出通過抑制在開裂區(qū)中/^￡ ￡///1 6^^7基因的表達來 推遲開裂。
作用在一種基因的表達或者其產物的活性的一個常規(guī)的方法是在同一細胞中表達一 種外源DNA序列，該序列的轉錄或翻譯產物取決于所考慮的應用而正向地或負向地干預所 述蛋白的表達或活性。作為舉例，應提及所討論的基因、或其同源物、或這種基因的表達 的一種激活物的過表達，或者，相反地，反義抑制技術、或通常用于調節(jié)靶基因的表達的 RNA干擾技術。
在許多情況下，優(yōu)選的是把這種外源DNA序列的表達靶向于特定的細胞和特定的組 織，以避免對植物的其他功能的任何干擾。因此，為了對長角果的開裂起作用，人們希望 擁有對組成長角果并且具體是開裂區(qū)的不同細胞類型具有特異性的啟動子。

發(fā)明內容
諸位發(fā)明人己經從擬南芥中分離出一種啟動子，以下稱為pDRQ39啟動子，并且已經 在這種啟動子的控制下表達了編碼P-葡糖醛酸酶的w'W(GUS)報告基因。他們因此已經觀察 到該報告基因的表達被限制于長角果瓣邊緣的木質化的細胞。
這種pDRQ39啟動子位于擬南芥的At2g27220基因的翻譯起始密碼子上游的一個361 bp 區(qū)域。這個區(qū)域的序列如下(SEQIDNO:l)。
CAGAATA
這條序列也在圖2中列出，圖中還指明可能與調控這個基因的表達有關的那些主要的 預測框。諸位發(fā)明人已經將對于獲得在長角果邊緣的木質化的細胞中的特異性表達必須的這 種啟動子的部分局限在相對于At2g27220基因的翻譯起始密碼子的從-361位核苷酸到-201 位核苷酸的區(qū)域中(這些位置對應于序列SEQIDNO:l的1到161位)。
在本披露的上下文中，在參照由兩個核酸的位置所限定的一個范圍來定義一條序列 時，它被認為第一個標出位置的核苷酸是包括在這條序列中的，而第二個標出位置的核苷 酸不包括在這條序列中。
因此，范圍從At2g27220基因的ATG上游的-361到-201位的序列如下(SEQ IDNO:2):
本發(fā)明的主題是一種分離的多核苷酸，它能夠用于對鄰接干開裂果的破裂區(qū)邊緣的木 質化的細胞具有特異性的啟動子的構建，該多核苷酸的特征在于
-它與序列SEQIDNO:2的多核昔酸具有至少80Q/q的同一性，優(yōu)選為至少90%的同一 性，并且完全優(yōu)選為至少95%的同一性；
-它包含具有序列TAGTT的模體，該模體部分重疊具有序列TTGAC的"Wbox"; 具有序列AAAG的"DOF"框；以及具有序列GATA的"GATAMybstl"框。
有利的是，在57i4rr五i 尸; ooF/和s/^rr^ /^ooF2以及/m^//zsc￡at基因的啟
動子中也發(fā)現(xiàn)了該TAGTT模體，這些基因具有相似的組織表達特異性，因而提示這種模 體與在長角果瓣邊緣的木質化的細胞中這些基因的耙向表達有關。
本發(fā)明的主題還在于對鄰接干開裂果的破裂區(qū)邊緣的木質化的細胞具有特異性的啟 動子，其特征在于它包含如以上定義的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸。
"對鄰接干開裂果的破裂區(qū)邊緣的木質化的細胞具有特異性的啟動子"的表述意指 一種啟動子，該啟動子能夠在這些細胞中誘導一個表達水平，該水平比它在該植物其他組 織的細胞中誘導的表達水平高至少10倍，優(yōu)選為至少20倍。
根據(jù)本發(fā)明的啟動子的一種優(yōu)選的實施方式，除了以上定義的那些框和模體外，它還 包括具有序列TGTCACA的"fruitbox"。有利地，根據(jù)本發(fā)明的啟動子包含具有序列SEQ IDNO:l的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的啟動子的另一種優(yōu)選的實施方式，它是一種嵌合啟動子，其中根據(jù)本發(fā) 明的多核苷酸與最小啟動子組合。
在植物中發(fā)揮功能的嵌合啟動子的構建本身是眾所周知的；將一種最小啟動子與根據(jù) 希望獲得的表達特性(特異性，誘導性，表達水平)選擇的異源性調控性元件組合。 一種最小啟動子至少包含用于起始RNA聚合酶II轉錄的序列。例如， 一個最小啟動子一般而 言除了包含一個轉錄起始位點外，還包含位于轉錄起始位點的上游大約20 bp到40 bp位 置的至少一個TATA框，和/或位于轉錄起始位點水平的至少一個INR (INitiatoR)元件。
通過將最小啟動子與不同的順式調控元件組合而得到的嵌合啟動子的構建描述在例 如美國專利6555673，或另外在RUSHTON等人(Plant. Cell" 14, 749-762, 2002)，或 BHULLAR等人(Plant. Physiology" 132, 988-998, 2003)或DEABEAUJON等人(Plant Cell, 15,2514-2531,2003)的出版物中。
本發(fā)明的主題還在于根據(jù)本發(fā)明的一種啟動子的用途，該用途是在鄰接干開裂果的破 裂區(qū)邊緣的木質化的細胞中特異性表達一種相關的多核苷酸。
本發(fā)明還包括
-重組表達盒，它除了根據(jù)本發(fā)明的啟動子外還包含置于所述啟動子的轉錄控制下的 相關的一條異源序列(或者允許所述相關的序列插入的一個或多個限制酶切位點)；
-通過將根據(jù)本發(fā)明的啟動子或表達盒插入宿主載體中所產生的重組載體。
所述相關的序列具體可以是與干果(特別是長角果)的開裂有關的一個基因。它還可以 是用于調節(jié)與這種開裂有關的一個或多個基因的表達的多核苷酸；這種調節(jié)可以例如通過 反義抑制或共抑制、通過干擾性RNA (iRNA)的產生來實現(xiàn)。還有可能將希望對之評價 對開裂的影響的多核苷酸置于根據(jù)本發(fā)明的啟動子的控制之下。
根據(jù)本發(fā)明的這些表達盒和重組載體當然還可以包含通常用于這種類型的構建物的 其他序列。常規(guī)地，將由本領域的普通技術人員具體根據(jù)標準(例如所選擇的宿主細胞、 所考慮的轉化方案等等)對這些其他的序列做出選擇。
作為非限制性舉例，應提及轉錄終止子，前導序列，增強子序列，聚腺苷酸化位點， 等等。這些序列對啟動子的特異性沒有任何影響，但是它們能夠從定性地或定量地改善整 體的轉錄以及在適當情況下的翻譯。
在通常用于表達盒和重組載體的構建的其他的序列中，還應提及用于以下轉化以及用 于識別和/或選擇被轉化的細胞或有機體的序列。它們具體地可以是賦予這些細胞或有機體 一種可容易識別的表型的報告基因，或另外是選擇性標記基因。
本發(fā)明的一個主題還在于一些細胞，所述細胞含有根據(jù)本發(fā)明的至少一種重組表達盒 或一種載體。它們可以是原核細胞或真核細胞。在原核細胞的情況中，它們具體可以是土 壤桿菌屬，例如根瘤土壤桿菌04gra6""er/iwj fw附e/ac/em")或發(fā)根土壤桿菌(/lgra&a"en'w附 A/加ge朋"。在真核細胞的情況中，它們具體可以是植物細胞。本發(fā)明還包括轉基因植物，這些植物在它們的基因組中包含至少一個拷貝的一種轉基 因，該轉基因含有根據(jù)本發(fā)明的表達盒。這個定義當然包括產生于原始基因轉移的那些植 物的子代，條件是它們在其基因組中保存該轉基因的至少一個拷貝。
有關的植物是所有那些產生干開裂果的植物，并且特別是十字花科植物，例如油菜， 或者是豆科植物，例如大豆，豌豆，豆(bean)等等。
從這些細胞或植物獲得的植物材料(原生質體、愈傷組織、切條、種子等等)也是本 發(fā)明的主題的一部分。本發(fā)明還包括從根據(jù)本發(fā)明的這些植物獲得的產物，具體是粗詞料、 木材、葉、莖、根、花以及果實。
具體實施例方式
通過以下的進一步說明將更清楚地理解本發(fā)明，該說明提及闡明pDRQ39啟動子的獲 得及其用于表達一個異源基因的用途的非限制性實例。
實施例1:在AT2G27220基因的上游區(qū)域的不同片斷的控制下一個報告基因的表達
從一個擬南芥的基因組DNA文庫中獲得位于At2g27220的ATG的5'端的大約1500 bp的一條序列。
通過GATEWAY 技術根據(jù)廠商的建議方法使用INVITROGEN試劑盒，將這條序列 的不同片斷在編碼GUS報告基因的序列的上游克隆進入pRlR2 GUS載體。使用的受體載 體pRlR2 GUS (BAUDRY et al. Plant J, 39， 366-380, 2004)含重組盒(recombination cassette) LR，這是編碼來自大腸桿菌的P-葡糖醛酸酶的基因的編碼序列和胭脂氨酸合酶基因的 nos-ter終止子。該載體還包含卡那抗性盒。
首先用包含重組位點Bl和B2的引物通過PCR擴增出啟動子序列，并且然后將這些 啟動子序列通過BP重組引入到入門載體(entry vector)中(pDONR 207， INVITROGEN)。 接著將含有所希望的片段的重組載體重組進入pRlR2 GUS載體以便產生用于轉化植物的 二元載體。
所制備的構建物如下
-Pl:這個構建物包含從At2g27220基因的ATG上游的-1471位到-4位的全長1467 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-1500/pDRQ39REV擴增該DNA 。
-P2:這個構建物包含從At2g27220基因的ATG上游的-1158位到-4位的全長1154 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-1158/pDRQ39REV擴增該DNA。
-P3:這個構建物包含從At2g27220基因的ATG上游的-591位到-4位的全長587 bp的序列。用寡核苷酸pDRQ39-590/pDRQ39 REV擴增該DNA。
-P4:這個構建物包含從At2g27220基因的ATG上游的-360位到-4位的全長356 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-361/pDRQ39 REV擴增該DNA。
-P5:這個構建物包含從At2g27220基因的ATG上游的-201位到-4位的全長197 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-201/pDRQ39 REV擴增該DNA。
這些不同的構建物的界限示于圖2中。
所使用的寡核苷酸表明如下(5'-3'方向，用粗體的序列對應于Gateway重組序列)； (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4)
pD卿9 -5卯GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTACATTTGCGACCACATT
(SEQ ID NO :5)
pDR(^39 -361: GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTACATATTTTTCCCATTT
(SEQ ID NO:6)
pD卿9 -201: GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCCATAATTTGCTGCTCATC
(SEQ ID NO:7)
(SEQIDNO:8)
通過植物滲入(floral infiltration)的方法(BECHTOLD et al.， C.R. Acad. Sci., 316， 1194-1199, 1993)將這些不同的構建物轉移進入生態(tài)型為Wassilewskija的擬南芥植物中。 將這些種子滅菌并將初級轉化體在含有選擇劑卡那霉素(100 mg/l)的MS培養(yǎng)基(Duchefa， M02 555，pH5.6)上進行選擇。隨后將所選的植物轉移進入罐(pot)中并在玻璃下生長。 只將顯示正常表型的能繁育的植物保留用于分析。
在Tl代和T2代的營養(yǎng)器官、長角果以及種子中尋找gus基因的表達。 通過一種組織化學測試的手段檢測(3-葡糖醛酸酶活性，即通過檢測由5-溴-4-氯-3-吲哚 -p-D-葡萄糖醛酸(X-gluc根據(jù)JEFFERSON等人描述的方案(Plant Mol. Biol. Report 5， 387-405,1987))的水解反應產生的藍色顯色。
gUS基因在營養(yǎng)器官中的表達
在體外對葉、玻璃下面的莖以及根進行分析。在那些非轉化植物中沒有檢測到gus的 活性。在轉化有P1、 P2、 P3、 P4和P5構建物的這些植物的情況下，在X-Gluc存在下孵 育后沒有檢測到活性。這些結果表明At2g27220啟動子不允許gus基因在所測試的器官中 的表達。
9gUS基因在長角果和種子中的表達
為了確定在At2g27220啟動子控制下GUS基因的表達位置，切割組織切片并通過光 子顯微術進行觀察。
對于P1、 P2、 P3或P4構建物，在長角果瓣邊緣觀察到大量的標記，而胚細胞、胎座 框細胞以及中果皮細胞未顯示標記。對于P5構建物來說，未檢測到標記，表明所述構建 物不再包含必需的的調控元件。
實例2: AT2G27220基因的啟動子的結構分析
對At2g27220基因的啟動子進行了分析以便尋找可能與控制表達有關的推定的調控模體。
將該啟動子同擬南芥的57i47T￡7 /^0(9F /基因、S/^77^/ 尸7 0(9F 2基因(分別為 At3g58780， At2g42830)以及/^￡ ￡:///5(^7^7基因(Atlg00120)的啟動子序列進行比較。
這個分析表明這些啟動子共同存在一個5bp的模體(TAGTT)，并且這些啟動子中不 存在在臨近開裂區(qū)的細胞中表達的其他轉錄因子。
在pDRQ39啟動子中所識別的其他推定的轉錄調控序列中，將具體指出以下這些 "DOF "框(ANAGISAWA and SCHMIDT, PlanU 17, 209-214 1999); " GATA Mybst 1 "框 (EAKLE et al., Plant Mol Biol. 50, 43-57 2002); "W"框(HEN et al., Plant Cell 14, 559-574， 2002)，它位于-361位和-201位之間。"Fruit box" (TGTCACA motif; YAMAGATA et al., J Biol Chem. 277, 11582-11590, 2002)也在位于-201位與翻譯起始位點之間的區(qū)域中被識 別。這個框在調節(jié)位于-361和-201之間的那些框時可能起一定作用。
At2g27220基因的翻譯起始密碼子上游的1467bp序列示于圖2。該翻譯起始位點用粗 體和下劃線表示。"DOF" 、 "GATA" 、 "W"框以及"Fruitbox"用實線框入。TAGTT 模體用虛線框入。
10
權利要求
1.能夠用于構建對鄰接一種干開裂果的破裂區(qū)邊緣的木質化的細胞具有特異性的啟動子的分離的多核苷酸，該多核苷酸的特征在于-它與序列SEQ ID NO2的多核苷酸具有至少80％的同一性，優(yōu)選為至少90％的同一性，并且完全優(yōu)選為至少95％的同一性；-它包含具有序列TAGTT的模體，該模體部分重疊具有序列TTGAC的“Wbox”；具有序列AAAG的“DOF”框；以及具有序列GATA的“GATA”框。
2. 分離的啟動子，該啟動子允許在鄰接干開裂果的破裂區(qū)的邊緣的木質化細胞中的相 關的多核苷酸的特異性表達，其特征在于它包含根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸。
3. 如權利要求2所述的啟動子，特征在于它包含多核苷酸序列SEQIDNO: 1。
4. 嵌合啟動子，包含根據(jù)權利要求1的多核苷酸，該多核苷酸與最小啟動子組合。
5. 如權利要求1至4中的任一項所述的啟動子在鄰接干開裂果的破裂區(qū)的邊緣的木質 化的細胞中用于特異地表達相關的多核苷酸的用途。
6. 重組表達盒，其特征在于它包含根據(jù)權利要求2至4中的任一項所述的啟動子，以 及置于所述啟動子的轉錄控制下的相關的基因。
7. 重組載體，包含根據(jù)權利要求6所述的表達盒。
8. 宿主細胞，它被轉化為具有根據(jù)權利要求6所述的表達盒。
9. 如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于它是植物細胞。
10. 轉基因植物，包含至少一種轉基因，該轉基因包含根據(jù)權利要求6所述的表達盒。
11. 如權利要求IO所述的轉基因植物，其特征在于它是十字花科(Brassicaceae)的一 種植物或一種十字花(cruciferous)植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及對干果的開裂區(qū)細胞具有特異性的啟動子，并涉及這種啟動子用于在這種開裂區(qū)中特異性表達所相關的基因的用途。
文檔編號C12N15/82GK101495638SQ200780025229
公開日2009年7月29日 申請日期2007年7月6日 優(yōu)先權日2006年7月6日
發(fā)明者盧瓦克·萊皮尼克, 貝特朗·迪布勒克 申請人:法國植物基因組研究計劃-華萊