專利名稱：：植物中高油酸含量的遺傳標(biāo)記物的制作方法植物中高油酸含量的遺傳標(biāo)記物本發(fā)明涉及可用于選擇具有高油酸含量的植物的新型遺傳和蛋白質(zhì)標(biāo)記物。由于健康利益以及油酸對(duì)于氧化和熱的穩(wěn)定性，植物油的高油酸含量是所希望的性狀。特別地，已顯示，油酸在降低血漿膽固醇水平方面是有效的(Bonanome等人，1988;Liu等人，2002)。此外，它的單不飽和鍵使得油酸(C18:1)成為相比其多不飽和的對(duì)應(yīng)物而言易損性小得多的脂肪酸。例如，亞麻酸(C18:3)的氧化速率是油酸的100倍(Debruyne，2004)。最有希望的通向此類植物的途徑之一是選擇基本上喪失了FAD2活性的植物。事實(shí)上，F(xiàn)AD2(512油酸去飽和酶)催化油酸(C18:1)轉(zhuǎn)化成亞油酸(C18:2);由于油酸的有限的分解代謝，因此具有降低的FAD2活性的植物具有更高的油酸含量。如此，W02004/072259提供了具有高油酸含量的歐洲油菜(Ara^/ca/a/7"s)植物，其中它的尸a^/2基因在FAD2的位置185處具有終止密碼子而不是谷氨酰胺(Q)密碼子。此外，US2005/0039233提供了具有高油酸含量的芥菜(5ra^sicaj'W7cea)植物，其中它的/ao^基因在FAD2的位置101處具有終止密碼子而不是色氨酸(W)密碼子。歐洲油菜(油籽油菜(rapeseed))是包含兩個(gè)二倍體祖先的基因組--蕪胥(5r譜/car，)(A基因組)和甘藍(lán)(Ar譜/cao/eracea)(C基因組)的雙二倍體(Pires等人，2004)。關(guān)于油籽油菜的傳統(tǒng)油，油酸含量為61%(StanSkrypetz，2005)。本發(fā)明特別起因于本發(fā)明人在歐洲油菜植物的尸a^基因中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)先前未識(shí)別的突變-在尸a^Z4基因(來自蕪菁基因組的尸a^/2基因)的位置269處G至A的置換，相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置90處W至終止密碼子的置換，-在尸adW基因(來自蕪菁基因組的尸a^基因)的位置346處C至T的置換，相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置116處Q至終止密碼子的置換，-在尸a^C基因(來自甘藍(lán)基因組的尸a^基因)的位置646處C至T的置換，相應(yīng)于在FAD2C蛋白的位置216處P至S的置換，-在尸aW力基因(來自蕪菁基因組的尸a^基因)的位置775處C至T的置換，相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置259處P至S的置換，-在尸afi^4基因(來自蕪菁基因組的尸aW基因)的位置827處C至T的置換，相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置276處T至M的置換，這些突變與擁有它們的植物的高油酸含量相關(guān)。特別地，這些經(jīng)突變的油籽油菜的油酸含量根據(jù)環(huán)境載培條件而從66%至82%變化。因此，本發(fā)明涉及來自植物(特別是十字花科(Crwc//erae)植物)的編碼5-12油酸去飽和酶(FAD2)的核酸的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列包含代表選自下述的氨基酸的至少一個(gè)密碼子的至少一個(gè)核苷酸的非保守突變-在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸，-在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置215處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置258處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置275處的氨基酸，或者通過至少一個(gè)核苷酸的置換、插入或缺失而衍生自所述突變9核酸序列，并且與所述突變核酸序列具有至少90%同源性的同源核酸序列，條件是所述同源核酸序列具有所述突變并且不編碼功能性FAD2,或者在嚴(yán)格條件下與所述突變核酸序列雜交的雜交核酸序列，條件是所述雜交核酸序列的互補(bǔ)序列具有所述突變并且不編碼功能性FAD2，或者所述突變核酸序列、同源核酸序列或雜交核酸序列的互補(bǔ)序列。給定核酸序列相對(duì)于突變核酸序列而言的同源性百分比通過下述方式進(jìn)行計(jì)算計(jì)數(shù)對(duì)于所述給定核酸序列和所述突變核酸序列的最佳序列比對(duì)的所有位置而言在所述給定核酸序列和所述突變核酸序列之間相同核苷酸的數(shù)目，并且將這個(gè)數(shù)目除以所述給定序列的核苷酸的總數(shù)目?？梢允止さ?，任選地通過在核苷酸之間引入缺口，或者通過使用基于計(jì)算機(jī)的比對(duì)工具例如BLAST(AUschul等人(1997)A7/c/e/cJc油to25:3389-402),來進(jìn)行最佳序列比對(duì)。關(guān)于給定核酸序列而言的"嚴(yán)格條件"可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，例如如Sambrook等人(2001)中描述的。具體的嚴(yán)格條件特別包括15mMNaC1/1.5mM種檬酸鈉(0.IXSSC)和0.1%月桂基硫酸鈉(SDS)，于50-65°C。如本文所希望的，來自十字花科的FAD2通常由383或384個(gè)氨基酸組成。然而，下列方面在本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技能之內(nèi)使對(duì)于上文定義的突變所給出的位置適應(yīng)于具有多于或少于383或384個(gè)氨基酸的FAD2。圖14中給出了來自各種十字花科物種的FAD2序列的示例性比對(duì)。如本文所希望的，"不編碼功能性FAD2"的核酸序列指這樣的核酸序列，其編碼具有比在相同條件下測(cè)量的相應(yīng)天然FAD2的活性更低的活性的FAD2,特別地所編碼的FAD2沒有活性。有利地，與在其他方面在遺傳上相同的植物(即除所述突變外在植物相比較，攜帶具有上述突變的核酸的突變型植物具有增加的油酸含量。優(yōu)選地，攜帶具有上述突變的核酸的突變型植物具有至少65%，更優(yōu)選地至少70%的油酸含在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特別涉及如上定義的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列包含至少一個(gè)選自下述的突變-代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸的密碼子被終止密碼子置換，-代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸的密碼子被終止密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置215處的氨基酸的密碼子，被代表不同于P的任意氨基酸的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置258處的氨基酸的密碼子，被代表不同于P的任意氨基酸的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置275處的氨基酸的密碼子，被代表不同于T的任意氨基酸的密碼子置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，更具體而言，本發(fā)明涉及如上定義的突變核酸序列，其中-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置215處的氨基酸的密碼子，被代表S的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2ii的氨基酸序列的位置259處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置258處的氨基酸的密碼子，被代表S的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置275處的氨基酸的密碼子，被代表M的密碼子置換。在上文定義的突變核酸序列的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物是蕓苔屬(Ar譜ica)的植物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變核酸序列由SEQID22表示，并且包含至少一個(gè)選自下述的突變-在SEQIDNO:22的位置269處G至A的置換，22的位置346處C至T的置換，22的位置646處C至T的置換，22的位置775處C至T的置換，22的位置827處C至T的置換。個(gè)實(shí)施方案中，所述突變核酸序列選自下述N0-在SEQIDNO:-在SEQIDNO:-在SEQIDNO:-在SEQIDNO:在本發(fā)明的另外一-SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO242628303224表示在位置269處具有G至A的置換的歐洲油菜尸acTZ4基因(即來自蕪蕢基因組的尸aW基因)，這相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置90處W至終止密碼子的置換。這種突變特別發(fā)現(xiàn)于在下列實(shí)施例中稱為'H0R4，的過量產(chǎn)生油酸的油籽油菜品系中。'H0R4，已于2006年5月17日以登記號(hào)41403保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)。SEQIDNO:26表示在位置346處具有C至T的置換的歐洲油菜AdZ4基因，這相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置116處Q至終止密碼子的置換。這種突變特別發(fā)現(xiàn)于在下列實(shí)施例中稱為'H0R3，的過量產(chǎn)生油酸的油籽油菜品系中。'H0R3，已于2006年5月l7日以登記號(hào)41402保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)。SEQIDNO:28表示在位置646處具有C至T的置換的歐洲油菜尸a^C基因(即來自甘藍(lán)基因組的AW基因)，這相應(yīng)于在FAD2C蛋白質(zhì)的位置216處P至S的置換。這種突變特別發(fā)現(xiàn)于在下述實(shí)施例中稱為'H0R1，的過量產(chǎn)生油酸的油籽油菜品系中。'H0R1，已于2006年5月17日以登記號(hào)41400保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)。SEQIDNO:30表示在位置775處具有C至T的置換的歐洲油菜尸a^^基因，這相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置259處P至S的置換。這種突變特別發(fā)現(xiàn)于在下述實(shí)施例中稱為'H0R1，的過量產(chǎn)生油酸的油籽油菜品系中。SEQIDNO:32表示在位置827處具有C至T的置換的歐洲油菜AcTZ4基因，這相應(yīng)于在FAD2A蛋白的位置276處T至M的置換。這種突變特別發(fā)現(xiàn)于在下述實(shí)施例中稱為'H0R2，的過量產(chǎn)生油酸的油籽油菜品系中。'H0R2，已于2006年5月17日以登記號(hào)41401保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)。本發(fā)明還涉及如上定義的突變核酸的核酸片段，所述片段包含至少10個(gè)、優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少1000個(gè)核苷酸，并且包含與代表選自下述的氨基酸的至少一個(gè)密碼子鄰接的至少一個(gè)核苷酸-在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸，-在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置215處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置258處的氨基酸，13-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置275處的氨基酸，或者所述核酸片段的互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上文定義的核酸片段包含突變核苷酸。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上文定義的核酸片段選自SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:17、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。本發(fā)明還涉及具有增加的油酸含量的植物，優(yōu)選十字花科植物，更優(yōu)選蕓苔屬的植物，和更加優(yōu)選歐洲油菜物種的植物，或者所述植物的部分，其中所述植物包含至少一種上文定義的突變核酸序列或者含有所述突變核苷酸的上文定義的核酸片段。如本文所希望的，植物的部分特別涉及植物細(xì)胞、種子、分生組織、愈傷組織、花序、芽或葉。在上文定義的植物或植物的部分的一個(gè)具體實(shí)施方案中，在所述植物的基因組中所包含的AW基因的至少一個(gè)拷貝由如上文定義的突變核酸來表示。在上文定義的植物或植物的部分的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在所述植物的基因組中所包含的尸aW基因的每一個(gè)拷貝由如上文定義的突變核酸來表示。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及上文定義的植物或植物的部分，其中-一個(gè)拷貝的AcTZ4基因由SEQIDNO:30表示，和一個(gè)拷貝的尸ad^7基因由SEQIDNO:28表示，或-一個(gè)拷貝的尸ac/Z4基因由SEQIDNO:32表示，或-一個(gè)拷貝的尸acTZ4基因由SEQIDNO:26表示，或-一個(gè)拷貝的尸ad/W基因由SEQIDNO:24表示。14在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上文定義的植物或植物的部分是歐洲油菜物種的植物，其中尸acTZ^基因的2個(gè)拷貝獨(dú)立地由SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:30或SEQIDNO:32表示，和/或/a^C基因的2個(gè)拷貝由SEQIDNO:28表示。在另外一個(gè)具體實(shí)施方案中，上文定義的植物或植物的部分選自下述-于2006年5月17日以登記號(hào)41403保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物j-于2006年5月17日以登記號(hào)41402保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41400保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41401保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物。本發(fā)明還涉及上文定義的核酸的用途，所述用途為用于選擇具有增加的油酸含量的植物或植物的部分。本發(fā)明還涉及用于通過誘變來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法，其包括下述步驟-對(duì)植物或植物的部分實(shí)施誘變處理，-從所述^生的植物中^選擇出包含至少一種上^定義的^變核酸序列，或包含含有所述突變核普酸的上文定義的核酸片段的那些?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如在McCallum等人(2000)中描述的那些方法，來進(jìn)行誘變。特別地，使用甲磺酸乙酯(EMS)來進(jìn)行誘變?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如在Herman(2005)中描述的那些方法，來進(jìn)行從植物部分例如細(xì)胞中再生出植物。本發(fā)明還涉及用于通過雜交來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法，其包括下述步驟15-使植物或植物的部分與親本植物或親本植物的部分進(jìn)行雜交，所述親本植物或親本植物的部分包含至少一種上文定義的突變核酸序列或包含含有所述突變核苷酸的上文定義的核酸片段，-從通過雜交獲得的子代植物或植物的部分中選擇出包含至少一種上文定義的突變核酸序列的那些，或包含含有所述突變核苷酸的上文定義的核酸片段的那些?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如在Gallais(1997)中描述的那些方法，來進(jìn)行雜交。如本文所希望的，"子代"特別指雜交植物的幼苗。在上文定義的用于通過雜交來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)上文定義的用于通過誘變來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法來獲得親本植物。在上文定義的用于通過雜交來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，親本植物或親本植物的部分選自下述-于2006年5月17日以登記號(hào)41403保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41402保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41400保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41401保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物。特別地，下列技術(shù)可以用于上文定義的選擇方法的選擇步驟中PCR技術(shù)，例如TaqMar^測(cè)定法(實(shí)時(shí)PCR)或等位基因特異性PCR，Northern或Southern《卩跡、法，DNA孩吏卩車歹ij或大P車歹'J(macro—array)，分子信標(biāo)(MolecularBeacons)，DASH(動(dòng)力等位基因特異性雜交(DynamicAlleleSpecificHybridization))，引物延伸，寡核苷酸連接和核酸內(nèi)切酶切割。16在上文定義的用于選擇植物的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，選擇步驟通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進(jìn)行，優(yōu)選使用下述引物對(duì)中的至少一種SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSE(JIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO曰12和SEQIDNO14和SEQIDNO16和SEQIDNO34和SEQIDNO35和SEQIDNO37和SEQIDNO38和SEQIDNO39和SEQIDNO13,15，17，36，36，13，14，36。物本發(fā)明還涉及用于選擇具有高油酸含量的植物的試劑盒，其包含-至少一種植物或植物的部分，其包含至少一種上文定義的突變核酸序列，或包含含有所述突變核苷酸的上文定義的核酸片段，-至少一種上文定義的核酸片段。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上文定義的試劑盒包含選自下述的至少一種植物或植物的部分-于2006年5月17日以登記號(hào)41403保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41402保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41400保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物j-于2006年5月17日以登記號(hào)41401保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；下述引物對(duì)中的至少一種-SEQIDNO:12和SEQIDNO:13，-SEQIDNO:14和SEQIDNO:15，-SEQIDNO16和SEQIDNO17，一SEQIDNO.34和SEQIDNO36，-SEQIDNO35和SEQIDNO36，一SEQIDNO:37和SEQIDNO13，-SEQIDNO'38和SEQIDNO14，—SEQIDNO,39和SEQIDNO36。本發(fā)明還涉及由上文定義的突變核酸序列編碼的突變的來自植物的FAD2。本發(fā)明還涉及選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39的核酸。本發(fā)明還涉及特異性抗體，其針對(duì)上文定義的突變的來自植物的5-12油酸去飽和酶(FAD2)。如本文所希望的，"抗體"還包含抗體片段，例如Fab、F(ab)，2或scFv片段。通過下列標(biāo)準(zhǔn)操作程序，由根據(jù)本發(fā)明的突變的5-12油酸去飽和酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制備此類抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體尤其可用于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的突變的5-12油酸去飽和酶，特別是在植物細(xì)胞提取物中。附圖簡(jiǎn)述圖l顯示了從'LLR1，品系('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，品系)以及'H0R1，品系('HOR1#S005，、'H0R1并B005，和'H0R1#NPZ-12，品系)中克隆的/a^Z4基因(來自蕪菁基因組的尸aW基因)的部分基因組核苷酸序列。上面是'LLR1，序列(SEQIDNO:1)，和下面是'H0R1，序列(SEQIDNO:3)。箭頭指出C至T的單核苷酸突變，這導(dǎo)致氨基酸修飾。用于基于PCR的突變型等位基因特異性標(biāo)記物的正向和反向引物為粗體并加有下劃線。圖2顯示了從'LLR1，品系('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，品系)以及'H0R1，品系('HOR1#S005，、'HOR1#B005，和'H0R1#NPZ-12，品系)中克隆的尸aWC基因(來自甘藍(lán)基因組的AW基因)的部分基因組核苷酸序列。上面是'LLR1，序列(SEQIDNO:2)，和下面是'H0R1，序列(SEQIDNO:4)。箭頭指出C至T的單核苷酸突變，這導(dǎo)致氨基酸修飾。用于基于PCR的突變型等位基因特異性標(biāo)記物的正向和反向引物為粗體并加有下劃線。圖3顯示了從'LLR1，品系('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，品系)以及'H0R2，品系中克隆的/adZ4基因(來自蕪菁基因組的基因)的部分基因組核苷酸序列。上面是'LLR1，序列(SEQIDNO:1)，和下面是'H0R2，序列(SEQIDNO:5)。箭頭指出C至T的單核苷酸突變，這導(dǎo)致氨基酸修飾。用于基于PCR的突變型等位基因特異性標(biāo)記物的正向和反向引物為粗體并加有下劃線。圖4顯示了從'LLR1，品系('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，品系)以及'H0R3，品系中克隆的尸adZ4基因(來自蕪菁基因組的基因)的部分基因組核苷酸序列。上面是'LLR1，序列(SEQIDNO:1)，和下面是'H0R3，序列(SEQIDNO:6)。箭頭指出C至T的單核苷酸突變，這導(dǎo)致帶有灰色陰影的終止密碼子(TAG)。用于基于PCR的突變型等位基因特異性標(biāo)記物的正向和反向引物為粗體并加有下劃線。19圖5顯示了從'LLR1，品系('LLR1并S007'和'LLR1#PR-2601，品系)以及'H0R4，品系中克隆的/a^^基因(來自蕪菁基因組的尸a^基因)的部分基因組核苷酸序列。上面是'LLR1，序列(SEQIDNO:1),和下面是'H0R4，序列(SEQIDNO:7)。箭頭指出G至A的單核苷酸突變，這導(dǎo)致帶有灰色陰影的終止密碼子(TAG)。用于基于PCR的突變型等位基因特異性標(biāo)記物的正向和反向引物為粗體并加有下劃線。圖6提供了從克隆自'LLR1，品系、'H0R1，的基因組核苷酸序列簡(jiǎn)并得到的尸ad"基因，公開的蕪菁/a^基因，和公開的歐洲油菜AW基因的氨基酸序列。箭頭指出在'H0R1，品系中由于單核苷酸突變(C至T)而引起的氨基酸置換(P至S)的位置。圖7提供了從克隆自'LLR1，品系、'H0R1，品系的基因組核苷酸序列簡(jiǎn)并得到的尸a^C基因，公開的甘藍(lán)尸ac^基因，和公開的歐洲油菜/s^基因的氨基酸序列。箭頭指出在'H0R1，品系中由于單核苷酸突變(C至T)而引起的氨基酸置換(P至S)的位置。圖8提供了從克隆自'LLR1，品系、'H0R2，品系的基因組核苷酸序列簡(jiǎn)并得到的Ad/Z4基因，公開的蕪著/a^基因，和公開的歐洲油菜尸a"基因的氨基酸序列。箭頭指出在'H0R2，品系中由于單核苷酸突變(C至T)而引起的氨基酸置換(T至M)的位置。圖9提供了從克隆自'LLR1，品系、'H0R3，品系的基因組核苷酸序列簡(jiǎn)并得到的尸ad/Z4基因，公開的蕪菁/ac^基因，和公開的歐洲油菜AW基因的氨基酸序列。箭頭指出在'H0R3，品系中由于單核苷酸突變(C至T)而引起的終止密碼子的位置。圖10提供了從克隆自'LLR1，品系、'H0R4，品系的基因組核苷酸序列簡(jiǎn)并得到的尸a^^基因，公開的完蕢/a^基因，和公開的歐洲油菜尸a^基因的氨基酸序列。箭頭指出在'H0R4，品系中由于單核香酸突變(G至A)而引起的終止密碼子的位置。圖11提供了從關(guān)于/"acTZ4基因的突變型等位基因特異性標(biāo)記物(194bp)和從6個(gè)DH群體之一的尸a^基因(內(nèi)部PCR對(duì)照，57bp)20擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。M:25bpDNA梯;泳道1:'LLR1井S007';泳道2:'HOR1#S005，;泳道3-23:來自'LLR1并S007'和'腿1并S005，雜交的DH品系；泳道24:水對(duì)照。通過在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳來分離PCR產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色。圖12提供了從關(guān)于尸ac^7基因的突變型等位基因特異性標(biāo)記物(123bp)和從6個(gè)DH群體之一的尸a^基因(內(nèi)部PCR對(duì)照，57bp)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。M:25bpDNA梯；泳道1:'LLR1#S007，；泳道2:'腿1并S005';泳道3-23:來自'LLR1#S007，和'HOmS005'雜交的DH品系；泳道24:水對(duì)照。通過在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳來分離PCR產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色。圖13提供了直方圖，其顯示了在田間和溫室試驗(yàn)中所述突變型等位基因特異性標(biāo)記物和油酸含量的相關(guān)性。圖14提供了來自不同蕓苔屬物種和來自擬南芥(JraWcTo/7s/s的FAD2的序列比對(duì)。下面列出了物種、登記號(hào)和俗名屬和種序列登記號(hào)俗名1蕪菁CAG26981變蘿卜2蕪菁CAD30827變蘿卜3歐洲油菜AAS92240油籽油菜4蕪菁AAC99622變蘿卜歐洲油菜AAT02411油籽油菜6歐洲油菜AAF78778油籽油菜7甘藍(lán)AAF14564巻心菜8隆線蕓莒AAD19742埃塞俄比亞芥9擬南芥NP—187819鼠耳芥21實(shí)施例材料和方法1.植物材料冬季油籽油菜品系'LLR1#S007，(野生型)、'LLR1#PR-2601，(野生型)、'HOR1#S005，(突變型)、'HOR1#B005，(突變型)、'H0R1#NPZ-12，(突變型)、'H0R2，(突變型)、'H0R3，(突變型)和'H0R4，(突變型)在本研究中用于克隆尸a^(脂肪酸去飽和酶-2)等位基因。已通過使甲磺酸乙酯(EMS)突變體品系'H0R1，與三種傳統(tǒng)油籽油菜品系(S005、B005和NPZ-12)雜交而獲得了'HOR1#S005，、'HOR1#B005，和'H0R1#NPZ-12，；這三種突變體品系具有約80-90%的油酸含量。'LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，是具有約60%的油酸含量的油籽油菜品系。'H0R2，、'H0R3，和'H0R4，是具有約75-85%的油酸含量的三種更獨(dú)立的EMS突變體品系。通過小孢子培養(yǎng)從下述品系之間雜交的F1植物形成了6個(gè)雙單倍體(DH)群體(Coventry等人，1988):(1)'LLR1#S007，和'H0R1并S005，油泮予油菜品系，(2)'LLR1井PR-2601'和'H0R1#NPZ-12，油籽油菜品系，(3)'LLR1#S007，和'HOR1#B005，油籽油菜品系，(4)'LLR1并S007'和'H0R1#NPZ-12，油籽油菜品系，(5)'LLR1#PR-2601，和'H0R1并B005，油籽油菜品系，以及(6)'LLR1#PR-2601，和'H0R1并S005，油籽油菜品系。每個(gè)DH群體分別由64、32、115、72、63和53個(gè)品系組成。通過使用氣相色譜來進(jìn)行DH品系及其各自親本的種子的完全脂肪酸分析。所有399個(gè)DH品系用于標(biāo)記物和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。沒有使用'H0R2，、22系來產(chǎn)生DH群體。2.基因組DNA的提取和定量使用來自Dellaporta等人(1983)的經(jīng)修改的基于CTAB的方法，從2周大的田間生長(zhǎng)的植物的葉中提取親本品系和399個(gè)DH品系的DNA。在260nm處的吸光度用于DNA定量。在UV-微量滴定板中，將195pl超純無菌水加入至每個(gè)孔內(nèi)，并隨后添加5ja1每種DNA樣品。然后，使平板短暫搖動(dòng)，并使用來自MolecularDevices的SpectraMaxM2微量培養(yǎng)板分光光度計(jì)進(jìn)行閱讀。3.PCR擴(kuò)增用于AW等位基因克隆的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包含3-4ng/pl基因組DNA、1.25juM每種引物、2.5mMMgCh、0.3raM每種dNTP、1XPCR緩沖液和0,12U/plDNA聚合酶。在PTC-225MJResearchPCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，所述PCR系統(tǒng)中所編制的程序?yàn)?4°C30秒、60°C30秒、72X:30秒的30個(gè)循環(huán)，和于72。C結(jié)束5分鐘。關(guān)于該399個(gè)DH的基因分型，已開發(fā)了內(nèi)部PCR標(biāo)記物以控制PCR效率。在尸a^基因上已設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(SEQIDNO:10和SEQIDNO:11)以擴(kuò)增57bp的片段。用于對(duì)該399個(gè)DH品系進(jìn)行基因分型的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包含3-4ng/jul基因組DNA、0.625jaM每種引物(SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11)、1.5mMMgCh、0.3mM每種dNTP、1XPCR緩沖液和0.06U/plDM聚合酶。在PTC-225MJResearchPCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，所述PCR系統(tǒng)中所編制的程序?yàn)?4°C30秒、60'C30秒、72'C10秒的30個(gè)循環(huán)，和于72。C結(jié)束5分鐘。4./a^等位基因的克隆通過使用在來自Genbank登記號(hào)AY577313的尸ad2基因序列上用Priraer3軟件i殳計(jì)出的引物來擴(kuò)增親本品系'LLR1#S007，、23'LLR1#PR-2601，、'HOR1#S005，、'HOR1#B005，、'H0R1#NPZ-12，、'H0R2，、'H0R3，和'H0R4，的Af^片段。才艮據(jù)制造商的說明書，使用pGEM-TEasyVectorSystem試齊'j盒(PromegaCorp.,Madison,USA)將通過引物FAD2BnFl和FAD2BnRl從每個(gè)所述親本中擴(kuò)增出的尸aW片段連接至pGEM-TEasy克隆載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，并將細(xì)胞鋪板在包含氨節(jié)青霉素、X-GAL和IPTG的LB-瓊脂平板上，以使得能夠進(jìn)行白色/藍(lán)色選擇。挑取轉(zhuǎn)化平板中的白色菌落，并通過使用通用M13正向和反向引物(位于所述插入片段的側(cè)翼)的PCR來驗(yàn)證經(jīng)克隆的PCR產(chǎn)物的鑒定。PCR揭示出了具有預(yù)期大小的插入片段。包含該插入片段的陽(yáng)性克隆通過GenomeExpress(Meylan，F(xiàn)rance)進(jìn)行測(cè)序。5./a^基因中的突變的鑒定參考圖1-5，將在來自Genbank登記號(hào)AY577313的尸aW基因序列上用Primer3軟件設(shè)計(jì)出的引物用于從歐洲油菜品系'LLR1#S007，、'LLR1#PR-2601，、'HOR1#S005，、'HOR1#B005，、'H0R1#NPZ-12，、'H0R2，、'H0R3，和'H0R4，中擴(kuò)增出尸a^基因的基因組DNA片段。引物對(duì)FAD2BnFl:AGTGTCTCCTCCCTCCAAAAA(SEQIDNO:8)和FAD2BnRl:TCTTCTCACCTTGCCTGTCC(SEQIDNO:9)從所述6個(gè)親本中的每一個(gè)之中擴(kuò)增出相同長(zhǎng)度(1100bp)的尸aW片段。然后，克隆該經(jīng)擴(kuò)增的片段，并進(jìn)行測(cè)序以研究5個(gè)親本之間的/ac^基因的序列差異。6.序列和數(shù)據(jù)分析通過使用ClustalW(KyotoUniversityBioinformaticsCenter)和Genedoc軟件(Nicholas等人，1997)來對(duì)序列進(jìn)行分析和比對(duì)。通過卜檢驗(yàn)分析來測(cè)定所述標(biāo)記物和高油酸性狀之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果在本研究中，對(duì)7個(gè)'LLR1，克隆('LLR1#S007，和'LLR1井PR-2601')、12個(gè)'H0R1，克隆('HOR1井S005，、'廳1并B005，和'H0R1#NPZ-12，)、12個(gè)'H0R2，、20個(gè)'H0R3，和20個(gè)'H0R4，克隆進(jìn)行了測(cè)序。這些克隆與在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的蕪菁和甘藍(lán)AW序列的序列比對(duì)鑒定出(1)對(duì)于'H0R1，品系，2種源于蕪膂(/a^ZO和甘藍(lán)(尸aWC)的/"a^基因，(2)對(duì)于'H0R2，品系，l種源于蕪蕢(尸adZO的尸ac^基因，(3)對(duì)于'H0R3，品系，l種源于蕪菁(尸a^ZO的/aW基因，和(4)對(duì)于'H0R4，品系，l種源于蕪菁(/a^ZO的/a^基因。對(duì)于'H0R1，品系，序列分析在每種尸aW基因中鑒定出單核苷酸突變。在擴(kuò)增出的片段的位置752(即全長(zhǎng)fad2A基因中的位置775)處的在AdZ4基因中的單核苷酸突變(C至T)出現(xiàn)在所有'H0R1，克隆('HOR1#S005，、'HOR1#B005，和'H0R1#NPZ-12，)的尸ac/"基因序列(SEQIDNO:3)中，但沒有出現(xiàn)在'LLR1，克隆('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，)的尸a^Z4基因序列(SEQID.NO:1)中(參見圖1)。在擴(kuò)增出的片段的位置623(即全長(zhǎng)fad2C基因中的位置646)處的在Ac^7基因中的單核苷酸突變(C至T)出現(xiàn)在所有'H0R1，克隆('HOR1#S005，、'HOR1#B005，和'H0R1#NPZ-12，)的尸ad^C基因序列(SEQIDNO:4)中，但沒有出現(xiàn)在'LLR1，克隆('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，)的尸a^C基因序列(SEQID.NO:2)中(參見圖2)。進(jìn)一步的分析表明，這些單核苷酸突變出現(xiàn)在/ad/Z4和/ad^:基因的編碼序列中(參見圖6-7)。如圖1—2和圖6-7中進(jìn)一步顯示的，/"a^Z4和尸aWC基因中C至T的突變出現(xiàn)在密碼子的第一個(gè)核苷酸處，導(dǎo)致分別在氨基酸259和216處脯氨酸(P)至絲氨酸(S)的置換。在使用TMH麗Serverv.2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)注釋(跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè))后，F(xiàn)AD2A蛋白中脯氨酸(P)至絲氨酸(S)的置換被定位于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中，而FAD2C蛋白中脯氨酸(P)至絲氨酸(S)的置換存在于跨膜結(jié)構(gòu)域中。脯氨酸是非極性氨基酸，其趨于位于蛋白質(zhì)的中心內(nèi)，而絲氨酸是極性且相對(duì)疏水的氨基酸，其趨于呈現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表面上。這些不同的性質(zhì)可以引起FAD2A和FAD2C蛋白的結(jié)構(gòu)修飾，從而導(dǎo)致無活性的512油酸去飽和酶。對(duì)于'H0R2，品系，序列分析在尸acTZ4基因中鑒定出單核苷酸突變。在擴(kuò)增出的片段的位置804(即全長(zhǎng)fad2A基因中的位置827)處的在尸adW基因中的單核苷酸突變(C至T)出現(xiàn)在所有'H0R2，克隆的/acTZ4基因序列(SEQIDNO:5)中，但沒有出現(xiàn)在'LLR1，克隆('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，)的尸adZ4基因序列(SEQID.NO:1)中(參見圖3)。進(jìn)一步的分析表明，這個(gè)單核苷酸突變出現(xiàn)在尸a^Z4基因的編碼序列中(參見圖8)。如圖3和圖8中進(jìn)一步顯示的，尸a^Z4基因中C至T的突變出現(xiàn)在密碼子的第二個(gè)核苷酸處，導(dǎo)致在氨基酸276處蘇氨酸(T)至甲硫氨酸(M)的置換。在使用TMH薩Serverv.2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)注釋(跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè))后，F(xiàn)AD2A蛋白中蘇氨酸(T)至甲硫氨酸(M)的置換被定位于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中。曱硫氨酸(M)是非極性氨基酸，其趨于位于蛋白質(zhì)的中心內(nèi)，而蘇氨酸(T)是極性且相對(duì)疏水的氨基酸，其趨于呈現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表面上。這些不同的性質(zhì)可以引起FAD2A蛋白的結(jié)構(gòu)修飾，從而導(dǎo)致無活性的512油酸去飽和酶。對(duì)于'H0R3，品系，序列分析在尸a^Z4基因中鑒定出單核苷酸突變。在擴(kuò)增出的片段的位置323(即全長(zhǎng)fad2A基因中的位置346)處的在Z^dZ4基因中的單核苷酸突變(C至T)出現(xiàn)在所有'H0R3，克隆的尸adi^基因序列(SEQIDNO:6)中，但沒有出現(xiàn)在'LLR1，克隆('LLR1#S007，和'LLR1#PR-2601，)的尸adZ4基因序列(SEQID-NO:1)中(參見圖4)。進(jìn)一步的分析表明，這個(gè)單核苷酸突變出現(xiàn)26在尸WZ4基因的編碼序列中(參見圖9)。如圖4和圖9中進(jìn)一步顯示的，尸a^Z4基因中C至T的突變出現(xiàn)在密碼子的第一個(gè)核苷酸處，從而形成終止密碼子(TAG),其引起多肽鏈在翻譯過程中的早期終止。該終止密碼子導(dǎo)致僅115個(gè)氨基酸摻入多肽中，而不是全長(zhǎng)多肽的所有384個(gè)氨基酸。對(duì)于'H0R4，品系，序列分析在尸ad"基因中鑒定出單核苷酸突變。在擴(kuò)增出的片段的位置246(即全長(zhǎng)fad2A基因中的位置2.69)處的在尸aWJ基因中的單核苷酸突變(G至A)出現(xiàn)在所有'H0R4，克隆的/^d"基因序列(SEQIDNO:7)中，但沒有出現(xiàn)在'LLR1，克隆('LLR1并S007'和'LLR1#PR—2601，)的/s^Z4基因序列(SEQID-NO:1)中(參見圖5)。進(jìn)一步的分析表明，這個(gè)單核苷酸突變出現(xiàn)在尸ad"基因的編碼序列中(參見圖10)。如圖5和圖10中進(jìn)一步顯示的，尸at/Z4基因中G至A的突變出現(xiàn)在密碼子的第一個(gè)核苷酸處，從而形成終止密碼子(TAG)，其引起多肽鏈在翻譯過程中的早期終止。該終止密碼子導(dǎo)致僅89個(gè)氨基酸摻入多肽中，而不是全長(zhǎng)多肽的所有384個(gè)氨基酸。開發(fā)了用于對(duì)所述6個(gè)雙單倍體群體進(jìn)行基因分型的分子測(cè)試。對(duì)于顯性測(cè)試(dominanttests),開發(fā)了內(nèi)部PCR標(biāo)記物以控制PCR效率。在尸WJ基因上已設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(SEQIDNO:10和SEQIDNO:11)以擴(kuò)增57bp的片段。用于檢測(cè)C752T突變的正向和反向PCR引物(分別為SEQIDNO:14和SEQIDNO:15);陂用于對(duì)DH品系進(jìn)行基因分型，所述DH品系來自'LLR1#S007，和'HOR1#S005，的雜交(參見圖11)、'LLR1#PR-2601，和'H0R1#NPZ-12，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)、'LLR1#S007，和'HOR1#B005，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)、'LLR1#S007，和'H0R1#NPZ-12，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)、'LLR1#PR-2601，和'HOR1#B005，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)以及'LLR1#PR-2601，和'HOR1#S005，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)。用于檢測(cè)C623T突變的正向和反向PCR引物(分別為SEQIDNO:12和SEQIDNO:13)被用于對(duì)DH品系進(jìn)行基因分型，所述DH品系來自'LLR1#S007，27和'HOR1#S005，的雜交(參見圖12)、'LLR1并PR-2601，和'腿1并NPZ-12，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)、'LLR1#S007，和'HOR1#B005，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)、'LLR1#S007，和'H0R1#NPZ-12，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)、'LLR1#PR-2601，和'HOR1#B005，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)以及'LLR1#PR-2601，和'HOR1#S005，的雜交(數(shù)據(jù)未顯示)。用于檢測(cè)C804T突變的正向和反向PCR引物(分別為SEQIDNO:16和SEQIDNO:17)被用于測(cè)試'H0R2，和野生型品系(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，正向和反向PCR引物被用于測(cè)試'H0R3，(SEQIDNO:34和SEQIDNO:36)、'H0R4，(SEQIDNO:35和SEQIDNO:36)和野生型品系。在對(duì)所有399個(gè)DH品系進(jìn)行基因分型后，發(fā)現(xiàn)等位基因分布與高C18:l高度相關(guān)(參見圖13,表l)。表l,在不同DH品系類別的田間和溫室試驗(yàn)中突變型等位基因特異性標(biāo)記物和油酸含量的相關(guān)性。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>此外，設(shè)計(jì)了PCR引物以便提供共顯性標(biāo)記物，用于確定所述突變存在于尸a^基因的僅1個(gè)等位基因(雜合子)還是2個(gè)等位基因(純合子)上。對(duì)于C646突變(在'H0R1，中發(fā)現(xiàn))，使用下述PCR引物-正向引物5，ATTTCCACCCCAACCGCT3，(SEQIDNO:37)一反向引物5，AGGCCACTCCCTGCG3，(SEQIDNO:13)。利用經(jīng)由正向引物在相應(yīng)于/s^^野生型基因的擴(kuò)增出的片段中引入5wBI限制位點(diǎn)，通過^rBI酶來切割PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這產(chǎn)生下述相區(qū)別的限制圖鐠-野生型純合子16bp+108bp-突變的純合子124bp-雜合子16bp+108bp+124bp。對(duì)于C775T突變(在'H0R1，中發(fā)現(xiàn))，使用下述PCR引物一正向引物5，TCTACCGCTACGCTGCTGTC3，(SEQIDNO:38)-反向引物5，GTGCGTGTCCGTGATATTGT3，(SEQIDNO:15)。利用在具有C775T突變的突變型尸ac/Z4基因中#/7/I限制位點(diǎn)的消除，通過M/1酶來切割PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這產(chǎn)生下述相區(qū)別的限制圖鐠-野生型純合子14bp+26bp+41bp+66bp+83bp-突變的純合子14bp+41bp+83bp+92bp一雜合子14bp+26bp+41bp+66bp+83bp+92bp。對(duì)于C346T和G269A突變(分別在'HOR3，和'HOR4，中發(fā)現(xiàn))，使用下述PCR引物-正向引物5，AGTGTCTCCTCCCTCCAAAAA3，(SEQIDNO:39)一反向引物5，ATCGAGGCAACTCCTTGGA3，(SEQIDNO:36)。通過酶來切割PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這產(chǎn)生下述相區(qū)別的限制圖鐠*C346T-野生型純合子732bp-突變的純合子410bp+322bp-雜合子732bp+410bp+322bpG269A-野生型純合子732bp-突變的純合子244bp+488bp-雜合子732bp+244bp+488bp。29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>參考文獻(xiàn)BonanomeA，GrundySM.Effectofdietarystearicacidonplasmacholesterolandlipoproteinlevels.NEnglJMed.1988May12;318(19):1244-8.Liu，Q.，Singh，S.，Green,A.(2002).High-01eicandHigh-StearicCottonseedOils:NutritionallyImprovedCookingOilsDevelopedUsingGeneSilencing./h6W7iV"fr21:205S-211.DebruyneI.SoybeanOilProcessing:QualityCriteriaandFlavorReversion.0/7Volume110，July2004.McCallum，C.M.,Comai，L.，Greene,E.A.和Henikoff，S.(2000).TargetinginducedlocallesionsINgenomes(TILLING)forplantfunctionalgenomics,/7a/7f/%y57<7/.123，439—442.HermanE.B.(2005).MediaandTechniquesforGrowth,RegenerationandStorage2002—2005.Volume9ofRecentAdvancesinPlantTissueCulture.AgricellReport.GallaisA.(1997).Th6oriedelaselectionenameliorationdesplantes.EditionsMasson.Coventry,J;LKott和WBeversdorf:1988.Manualformicrosporecultureof5ra5""'ca/za/ws.UniversityofGuelphTechnicalBulletin,0ACPublication0489DellaportaSL，WoodJ和HicksJB(1983)AplantDMminipreparation:versionII.PlantMolBiolRep1:19-21.NicholasK.B.，NicholasJrH.B.和DeerfieldIID.W.(1997)GeneDoc:AnalysisandVisualizationofGeneticVariation.http://www.psc.edu/biomed/genedoc[accessedon6April2005].SambrookJ和RussellDW(2001)Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress.Cold31SpringHarbor,NewYork.J.C.Pires，J.Zhao，M.E.Schranz，E.J.Leon，P.A.QuijadaL.N.Lukens和T.C.Osborn(2004).FloweringtimedivergenceandgenomicrearrangementsinresynthesizedAras"'"polyploids(Brassicaceae).Volume82Page675Issue4.BiologicalJournaloftheLinneanSociety.StanSkrypetz,2005.LeBuiletinbimensuel.AgricultureetAgroalimentaireCanada.Volume18Num6ro17.KoniecznyA，AusubelFM(1993)AprocedureformappingJi"a6!oj3s/smutationsusingco-dominantecotype—specificPCR—basedmarker.PlantJ4:403—410權(quán)利要求1.來自十字花科(Cruciferae)植物的編碼δ-12油酸去飽和酶(FAD2)的核酸的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列包含代表選自下述的氨基酸的至少一個(gè)密碼子的至少一個(gè)核苷酸的非保守突變-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置258處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置215處的氨基酸，-在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸，-在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置275處的氨基酸，或者通過至少一個(gè)核苷酸的置換、插入或缺失而衍生自所述突變核酸序列，并且與所述突變核酸序列具有至少90％同源性的同源核酸序列，條件是所述同源核酸序列具有所述突變并且不編碼功能性FAD2，或者在嚴(yán)格條件下與所述突變核酸序列雜交的雜交核酸序列，條件是所述雜交核酸序列的互補(bǔ)序列具有所述突變并且不編碼功能性FAD2，或者所述突變核酸序列、同源核酸序列或雜交核酸序列的互補(bǔ)序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列包含至少一個(gè)選自下述的突變-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置258處的氨基酸的密碼子，被代表不同于P的任意氨基酸的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置215處的氨基酸的密碼子，被代表不同于P的任意氨基酸的密碼子置換，-代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸的密碼子被終止密碼子置換，-代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸的密碼子被終止密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置275處的氨基酸的密碼子，被不同于T的任意氨基酸置換。3.根據(jù)權(quán)利要求2的突變核酸序列，其中-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置258處的氨基酸的密碼子，被代表S的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置215處的氨基酸的密碼子，被代表S的密碼子置換，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸的密碼子，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，代表在位置275處的氨基酸的密碼子，被代表M的密碼子置換。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的突變核酸序列，其中所述植物是蕓苔屬(Arass/ca)的植物。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列由SEQIDN0:22表示，并且包含至少一個(gè)選自下述的突變-在SEQIDNO:22的位置269處G至A的置換，-在SEQIDNO:22的位置346處C至T的置換，-在SEQIDNO:22的位置646處C至T的置換，-在SEQIDNO:22的位置775處C至T的置換，-在SEQIDNO:22的位置827處C至T的置換。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列選自下述SEQIDNO:24;SEQIDNO:26;SEQIDNO:28;SEQIDNO:30;SEQIDNO:32。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的突變核酸的核酸片段，所述片段包含至少10個(gè)核苷酸，并且包含與代表選自下述的氨基酸的至少一個(gè)密碼子鄰接的至少一個(gè)核苷酸-在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸，-在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置215處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置258處的氨基酸，-當(dāng)所述FAD2序列由384個(gè)氨基酸組成時(shí)，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸，或當(dāng)所述FAD2序列由383個(gè)氨基酸組成時(shí)，在位置275處的氨基酸，或者所述核酸片段的互補(bǔ)序列。8.根據(jù)權(quán)利要求7的核酸片段，其中所述片段包含所述突變核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求7的核酸片段，其中所述核酸片段選自SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:17、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。10.具有增加的油酸含量的植物，或所述植物的部分，其中所述植物包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6或8中任一項(xiàng)的核酸。11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的核酸的用途，所述用途為用于選擇具有增加的油酸含量的植物或植物的部分。12.用于通過誘變來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法，其包括下述步驟-對(duì)植物或植物的部分實(shí)施i秀變處理，-從所述經(jīng)處理的植物或植物的部分再生出植物或植物的部分，-從所述再生的植物中選擇出包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6或8中任一項(xiàng)的核酸的那些。13.用于通過雜交來選擇具有增加的油酸含量的植物的方法，其包括下述步驟-使植物或植物的部分與包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6或8中任一項(xiàng)的核酸的親本植物或親本植物的部分進(jìn)行雜交，_從通過雜交獲得的子代植物或植物的部分中選擇出包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6或8中任一項(xiàng)的核酸的那些。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述親本植物根據(jù)權(quán)利要求12的方法獲得。15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述親本植物或親本植物的部分選自下述-于2006年5月17日以登記號(hào)41403保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41402保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41400保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物5-于2006年5月17日以登記號(hào)41401保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物。16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇步驟通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進(jìn)行。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述PCR使用下述引物對(duì)中的至少一種來進(jìn)行-SEQIDNO:12和SEQIDNO:13，-SEQIDNO:14和SEQIDNO:15，-SEQIDNO:16和SEQIDNO:17，-SEQIDNO:34和SEQIDNO:36，一SEQIDNO:35和SEQIDNO:36，_SEQIDNO:37和SEQIDNO:13，一SEQIDNO:38和SEQIDNO:14，-SEQIDNO:39和SEQIDNO:36。18.可根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的方法獲得的植物。19.用于選擇具有高油酸含量的植物的試劑盒，其包含-包含根據(jù)權(quán)利要求1-6或8中任一項(xiàng)的核酸的至少一種植物或植物的部分，-至少一種根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的核酸。20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其包含,選自下述的至少一種植物或植物的部分-于2006年5月17日以登記號(hào)41403保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41402保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41400保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；-于2006年5月17日以登記號(hào)41401保藏在NCIMB(Aberdeen,Scotland)的植物；下述引物對(duì)中的至少一種-SEQIDNO:12和SEQIDNO:13，一SEQIDNO:14和SEQIDNO:15,-SEQIDNO:16和SEQIDNO:17,一SEQIDNO:34和SEQIDNO:36，一SEQIDNO:35和SEQIDNO:36，-SEQIDNO:37和SEQIDNO:13，一SEQIDNO:38和SEQIDNO:14，一SEQIDNO:39和SEQIDNO:36。21.突變的來自植物的FAD2，其由在權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)之中定義的突變核酸序列編碼。22.特異性抗體，其針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求21的突變的來自植物的FAD2。23.核酸，其選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39。全文摘要本發(fā)明涉及來自十字花科(Cruciferae)植物的編碼δ-12油酸去飽和酶(FAD2)的核酸的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列包含表示選自下述的氨基酸的至少一個(gè)密碼子的至少一個(gè)核苷酸的非保守突變?cè)谒鯢AD2的氨基酸序列的位置259處的氨基酸；在所述FAD2的氨基酸序列的位置216處的氨基酸；在所述FAD2的氨基酸序列的位置90處的氨基酸；在所述FAD2的氨基酸序列的位置116處的氨基酸；在所述FAD2的氨基酸序列的位置276處的氨基酸。文檔編號(hào)C12N15/53GK101490259SQ200780025771公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2006年5月29日發(fā)明者C·法朗坦,M·O·盧卡斯,M·勒納爾,M·布雷容申請(qǐng)人:國(guó)家農(nóng)藝研究院