專利名稱：利用蛋白酶和蛋白酶抑制劑血漿分析檢測(cè)舒張期心力衰竭的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求享有2006年5月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/798,953和2007年3月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/893,781的權(quán)益，上述申請(qǐng)均通過引用的方式全文納入本申請(qǐng)。
聯(lián)邦資助研究相關(guān)聲明
本申請(qǐng)是在退役軍人事務(wù)部(Depar tment of Veterans Affairs)的價(jià)值評(píng)議綜述(Spinale 0001)研究服務(wù)(Merit Review(Spinale 0001)Research Service)第VA號(hào)合同以及國(guó)家心臟、肺、血液研究所授予的第PO1-HL48788、RO1-HL-59165和MO1-RR-01070-251號(hào)合同的政府資助下完成的。
背景技術(shù)：
盡管在高血壓(血壓過高)藥物以及在認(rèn)為高血壓是發(fā)生心力衰竭的重大危險(xiǎn)因素這一認(rèn)識(shí)方面已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，在美國(guó)，該疾病仍然是主要的心血管疾病。識(shí)別具有發(fā)生高血壓心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的患者的一個(gè)具體問題是，缺乏一種快速篩選測(cè)試來識(shí)別出現(xiàn)高血壓繼發(fā)心肌自身改變的患者。長(zhǎng)期高血壓使得心肌質(zhì)量以及大小增加，但該現(xiàn)象直到該疾病過程的晚期才會(huì)出現(xiàn)。高血壓性心臟病和心力衰竭疾病進(jìn)程中的一個(gè)獨(dú)特的關(guān)鍵事件是，心肌自身纖維化加劇。這種改變的分子基礎(chǔ)至今未知。


發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的目的，如本文所具體體現(xiàn)并廣泛描述的，本發(fā)明涉及發(fā)生高血壓性心力衰竭的患者體內(nèi)出現(xiàn)的獨(dú)特的MMP/TIMP模式，該模式事實(shí)上能預(yù)測(cè)異常心臟功能的存在，而在此之前只可能通過昂貴且難于實(shí)施的測(cè)試法來識(shí)別這種存在。這種獨(dú)特的MMP/TIMP模式被用于識(shí)別具有發(fā)生高血壓繼發(fā)性心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)和即將發(fā)生高血壓繼發(fā)性心力衰竭的患者的方法中。
本申請(qǐng)公開的方法和組合物的其他優(yōu)點(diǎn)將部分通過下述說明書加以闡釋，部分通過說明書理解得到，或者可通過實(shí)施本申請(qǐng)公開的方法和組合物獲悉。本申請(qǐng)公開的方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)可通過隨附的權(quán)利要求中特別指出的要素和組合實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)理解，前文的總體描述和下文的具體描述均僅為示例性和解釋性的，對(duì)所要求保護(hù)的發(fā)明并無限制作用。



附圖被納入本說明書并構(gòu)成本說明書的一部分，附圖示出了所公開的方法和組合物的幾個(gè)實(shí)施方案，并與說明書相結(jié)合以闡明所公開的方法和組合物的原理。
圖1示出了存在和不存在高血壓的參比對(duì)照中的MMP-13的檢測(cè)限以及存在和不存在慢性心力衰竭的LVH中的檢測(cè)限。LVH患者中的MMP-13檢測(cè)限顯著降低。*＝與無高血壓的參比對(duì)照相比p<0.05，#＝與有高血壓的參比對(duì)照相比p<0.05，Δ＝與無CHF的LVH相比p<0.05。
圖2A示出了基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)和左心室容積/質(zhì)量之比之間的關(guān)系。較高的TIMP-1水平與較低的LV容積/質(zhì)量之比相關(guān)，這表明同心性重構(gòu)(concentric remodeling)更為明顯，r＝-0.56，p<0.05。圖2B示出了基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)與組織多普勒顯像(TDI)快速充盈波(E’)之間的關(guān)系。較高的TIMP-1水平與較低的E′值相關(guān)，這表明LV舒張期的舒張速率減慢，r＝-0.41，p<0.05。
圖3示出了正常心臟與舒張期心力衰竭的心臟的結(jié)構(gòu)和功能比較。
圖4示出了存在和不存在高血壓(HTN)的對(duì)照以及存在和不存在充血性心力衰竭(CGF)的心室肥大受試者的超聲心動(dòng)圖顯象結(jié)果，以及血漿MMP-9、MMP-2和TIMP-1測(cè)量結(jié)果。
圖5示出了相對(duì)于TIMP-1水平的組織多普勒顯像(TDI)快速充盈波(E’)。
圖6示出了對(duì)照和左心室肥大受試者的血漿MMP-13水平。
圖7示出了存在或不存在充血性心力衰竭且血漿TIMP-1水平高于或低于1200ng/ml的左心室肥大患者的百分比。
圖8示出了多元分析法測(cè)定的MMP-9、MMP-13、TNF-α和IL-6的校準(zhǔn)曲線。
圖9示出了通過MMP和TIMP水平來確定對(duì)高血壓患者的治療的算法。圖9A示出了被證實(shí)患有高血壓且定期進(jìn)行非急診的門診訪問的患者的治療示意圖。圖9B示出了患有新高血壓發(fā)病且進(jìn)行非急診的門診訪問的患者的治療示意圖。圖9C示出了表現(xiàn)出可能由HF所致的征候或癥狀的患者的治療示意圖。

具體實(shí)施例方式 參照以下對(duì)納入本文中的具體實(shí)施方案和實(shí)施例的詳細(xì)描述，并參照附圖和其相關(guān)的前后文描述，可更容易的理解所公開的方法和組合物。
公開了可用于所公開方法和組合物的、可與所公開方法和組合物一起使用的、可用于制備所公開組合物的和作為所公開方法和組合物的產(chǎn)品的物質(zhì)、組合物和組分。在本文中公開了這些物質(zhì)和其他物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)理解的是，在公開這些物質(zhì)的組合、子集、相互作用和群組等時(shí)，盡管關(guān)于這些化合物的每種具體的不同的個(gè)體和集體的組合和排列可能并未明確地公開，但每種都在此被特別地考慮和描述。例如，如果公開和討論了一種肽，并且討論了可以對(duì)包括該肽在內(nèi)的許多分子進(jìn)行的許多修飾，則除非特別指明相反，肽的每種和各種組合和排列以及可能的修飾均得到特別地考慮。因此，如果公開了一類分子A、B和C，并且還公開了一類分子D、E和F以及一個(gè)組合分子的實(shí)例A-D，則即使沒有每個(gè)逐一列舉，每個(gè)組合分子也單獨(dú)和共同得到考慮。因此，在這個(gè)實(shí)例中，組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E以及C-F中的每種也被特別地予以考慮，并且認(rèn)為上述每一個(gè)組合也因?yàn)锳、B和C；D、E和F；以及實(shí)例組合A-D的公開而被公開。同樣，這些分子的任何子集或組合也被特別地予以考慮和公開。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子群也被特別地考慮，并被認(rèn)為因?yàn)锳、B和C；D、E和F；以及實(shí)例組合A-D的公開而被公開。將這一概念適用于本申請(qǐng)的所有方面，包括但不限于制備和應(yīng)用所公開組合物的方法中的步驟。因此，如果有可以實(shí)施的多個(gè)其他步驟，則應(yīng)當(dāng)理解的是，所述其他步驟的每一步都可以用于所公開方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合，并且每種這樣的組合都被特別地予以考慮和被認(rèn)為公開了。
本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可意識(shí)到或者能確定本文所述方法和組合物的具體實(shí)施方案的許多等同方案。下文的權(quán)利要求意在涵蓋這類等同方案。
應(yīng)理解，所公開的方法和組合物不限于所描述的具體方法、方案和試劑，它們可以有變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語旨在僅描述特定的實(shí)施方案，而非意在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只由隨附的權(quán)利要求限定。
除非另外清楚說明，本文所述的任何方法都不應(yīng)被解釋為，需要按特定的順序?qū)嵤┢洳襟E。因此，當(dāng)一個(gè)方法權(quán)利要求未述及其步驟所遵循的順序，或者未在權(quán)利要求或說明書中特別說明該步驟限于特定順序，則在任何方面都不應(yīng)認(rèn)為存在某種順序。這一點(diǎn)適用于任何可能的用于解釋的未說明的基礎(chǔ)，包括步驟或操作流程設(shè)置相關(guān)的邏輯關(guān)系、源于語法結(jié)構(gòu)或標(biāo)點(diǎn)的明顯語義，以及說明書中記載的實(shí)施方案的數(shù)目和類型。更具體而言，已被測(cè)量含量的MMP和TIMP可以具有任何數(shù)量級(jí)的所述測(cè)量值。
A.定義 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與所公開的方法和組合物所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然在實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明的方法和組合物時(shí)可以使用與本申請(qǐng)所述方法材料類似或等同的任何方法和材料，但特別有用的方法、裝置和材料如所描述的那樣。本文所引用的出版物以及它們所引用的材料通過引用的方式具體地納入本說明書。本文的任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋為承認(rèn)，本發(fā)明未被賦予優(yōu)先于現(xiàn)有技術(shù)中的這類公開內(nèi)容的權(quán)利。未承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)中的討論陳述了其作者所聲稱的內(nèi)容，申請(qǐng)人保留質(zhì)疑所引用的文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和相關(guān)性的權(quán)利。
應(yīng)注意，除非上下文中另外明確指出，本文以及后附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的“一”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，“一種肽”的指代對(duì)象包括多種這類肽，“該肽”的指代對(duì)象指代一種或更多種肽及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等等。
“任選的”或“任選地”意為后面描述的事件、情況或物質(zhì)可能或也可能不出現(xiàn)或存在，這樣的描述包括所述事件、情況或物質(zhì)出現(xiàn)或存在的情況和所述事件、情況或物質(zhì)不出現(xiàn)或不存在的情況。
本文中范圍可以表示為從“大約”一個(gè)具體的數(shù)值，和/或至“大約”另一個(gè)具體的數(shù)值。當(dāng)表示為這種范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從所述的一個(gè)具體的數(shù)值和/或至所述的另一個(gè)具體的數(shù)值。類似地，當(dāng)通過在前面使用“大約”將數(shù)值表示為近似值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，該具體的數(shù)值構(gòu)成另一個(gè)實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)相關(guān)和獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。還應(yīng)當(dāng)理解的是此處公開了許多數(shù)值，且除了數(shù)值本身外每一個(gè)數(shù)值在此還被公開為“大約”該具體數(shù)值。例如，如果公開了數(shù)值“10”，那么也公開了“大約10”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開了一個(gè)數(shù)值時(shí)，也公開了“小于或等于”該數(shù)值，“大于或等于該數(shù)值”以及數(shù)值間可能的范圍，這正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所恰當(dāng)理解的。例如，如果公開了數(shù)值“10”，也就公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)理解，在整個(gè)本申請(qǐng)中，以多種不同格式提供數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)代表了端點(diǎn)和起點(diǎn)，以及這些數(shù)據(jù)點(diǎn)的任何組合的范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“10”和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)15，應(yīng)該理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之間的數(shù)值也認(rèn)為已經(jīng)被公開。還應(yīng)理解的是兩個(gè)特定單元之間的每個(gè)單元也都被公開了。例如，如果10和15被公開了，那么11、12、13和14也都被公開了。
在本申請(qǐng)的說明書部分和權(quán)利要求部分的通篇中，詞語“包括”及其變形(例如“包含”和“含有”)的含義為“包括但不限于”，并不意在排除例如其它的添加物、組分、整數(shù)或步驟。
“受試者”包括但不限于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒、寄生蟲和任何其他具有核酸的生物或?qū)嶓w。所述受試者可以是脊椎動(dòng)物，更具體而言可以是哺乳動(dòng)物(例如，人類、馬、豬、兔、狗、綿羊、山羊、非人類靈長(zhǎng)類、牛、貓、豚鼠或嚙齒動(dòng)物)、魚、鳥或爬行動(dòng)物或兩棲動(dòng)物。所述受試者可以是無脊椎動(dòng)物，更具體而言可以是節(jié)肢動(dòng)物(例如，昆蟲和甲殼動(dòng)物)。該術(shù)語并不指明特定的年齡和性別。因此，該術(shù)語意欲涵蓋雄性或雌性的、成年的和新生的受試者以及胎兒?；颊呤侵富加幸环N疾病或病癥的受試者。術(shù)語“患者”包括人類或獸醫(yī)學(xué)的受試者。
本文定義的“樣本”是指由一種生物體獲得的任何樣本。生物樣本的實(shí)例包括體液和組織標(biāo)本。所述樣本的來源可以是生理介質(zhì)，例如血液、血清、血漿、母乳、膿、組織刮屑、洗液、尿、組織，例如淋巴結(jié)等等。
本申請(qǐng)通篇引用了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引用的方式全文納入本申請(qǐng)，以便更充分地描述與本發(fā)明所屬的現(xiàn)有技術(shù)狀況。所公開的參考文獻(xiàn)中倚賴所述參考文獻(xiàn)的句子中所論述的素材也通過引用的方式單獨(dú)地并特別地納入本說明書。
B.方法 1.心力衰竭 充血性心力衰竭(CHF)也被稱之為充血性心衰(CCF)或僅僅稱為心力衰竭，它是一種由損害心臟充盈或者泵出充足的全身血量的能力的任何結(jié)構(gòu)性或功能性心臟病癥所致的疾病。因此，所公開的方法可用于治療任何形式的心力衰竭。
由于并不是所有患者都在初始或后續(xù)評(píng)價(jià)時(shí)具有容量過度負(fù)荷，因此術(shù)語“心力衰竭”優(yōu)于曾用語“充血性心力衰竭”。充血性心力衰竭的病因或促因包括以下所列(并具體指出左側(cè)(L)還是右側(cè)(R))CHF遺傳家族史、缺血性心臟病/心肌梗死(冠狀動(dòng)脈疾病)、感染、飲酒、犬惡絲蟲、貧血、甲狀腺毒癥(甲狀腺功能亢進(jìn)癥)、心律失常、高血壓(L)、主動(dòng)脈狹窄(L)、主動(dòng)脈[瓣]狹窄/反流(L)、二尖瓣反流(L)、導(dǎo)致肺源性心臟病(R)的肺動(dòng)脈瓣狹窄/肺動(dòng)脈高壓/肺栓塞，以及二尖瓣病(L)。
心力衰竭有多種不同的分類方式，包括涉及心臟哪側(cè)(左心衰竭和右心衰竭)，異常是否由心臟的收縮或舒張引起(收縮期心力衰竭和舒張期心力衰竭)，異常是否由低心輸出量或低體循環(huán)血管阻力(低排血量心力衰竭和高排血量心力衰竭)。
充血性心力衰竭(CHF)是心臟效能——特別是左心室(LV)功能的潛在疾病所致的征候和癥狀群(即呼吸急促、積液)。CHF的病因有多種，可以主要分為以下三類心臟病發(fā)作(心肌梗死)后的CHF、伴隨高血壓心臟病的CHF，和伴隨內(nèi)部肌肉疾病(通常稱為心肌病)的CHF。鑒定例如由高血壓心臟病導(dǎo)致的CHF的潛在病因還很困難，這成為本發(fā)明的方法的關(guān)注焦點(diǎn)。具體而言，高血壓心臟病導(dǎo)致LV肌肉生長(zhǎng)，這被稱之為肥大。LV肥大(LVH)通過其自身或者LV肥大自身可導(dǎo)致心肌功能缺陷，但在此之前都還沒有快速準(zhǔn)確識(shí)別LVH的血液測(cè)試。本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)了一種識(shí)別LVH患者的有效新方法。如果LVH過程繼續(xù)或者未得到充分治療，則患者將會(huì)出現(xiàn)主要是由于舒張期心力衰竭(DHF)導(dǎo)致的CHF征候和癥狀。然而，到迄今為止都還很難識(shí)別患有CHF(主要是DHF)的患者，也無法用簡(jiǎn)單快速的血液測(cè)試來識(shí)別這些患者。本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)了一種識(shí)別存在LVH的患者、存在發(fā)生DHF風(fēng)險(xiǎn)的患者的有效新方法，以及識(shí)別DHF患者的方法。因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)LVH的存在、預(yù)測(cè)可能存在發(fā)生DHF高風(fēng)險(xiǎn)的患者以及識(shí)別DHF患者的手段。通過使用小量的體液樣本，例如下述的血樣，可以進(jìn)行本方法的四種(但不必排他地)獨(dú)立應(yīng)用篩選、預(yù)測(cè)/預(yù)后、診斷和治療監(jiān)測(cè)。
因此，本文公開了一種診斷患有左心室肥大(LVH、HCM或HOCM)的受試者的方法。例如，提供可一種檢測(cè)受試者體內(nèi)LVH的方法，包括識(shí)別所述受試者體液的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的譜，本文中所述受試者伴隨有舒張期心力衰竭(DHF)。還提供了一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括識(shí)別所述受試者體液的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的譜，本文中所述受試者可能伴隨發(fā)生舒張期心力衰竭(DHF)。
2.MMP 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是鋅依賴性內(nèi)肽酶；其他的家族成員有蛇毒蛋白酶、沙雷菌蛋白酶(serralysin)、蝦紅素。MMP屬于一個(gè)被稱為metzincin超家族的較大的蛋白酶家族。
MMP之間共享一種共有的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。三種共有結(jié)構(gòu)域?yàn)榍半?、催化結(jié)構(gòu)域和通過柔性鉸鏈區(qū)與催化結(jié)構(gòu)域相連的血紅素結(jié)合蛋白樣C末端結(jié)構(gòu)域。
MMP最初是作為具有前肽結(jié)構(gòu)域的無活性酶原合成的，所述前肽結(jié)構(gòu)域須在酶激活前除去。所述前肽結(jié)構(gòu)域是“半胱氨酸開關(guān)”的一部分，所述“半胱氨酸開關(guān)”包含可與活性位點(diǎn)中的鋅相互作用并阻止底物結(jié)合和切割切割以保持酶處于無活性形式的保守性半胱氨酸殘基。多數(shù)MMP中，所述半胱氨酸殘基位于保守序列PRCGxPD中。某些MMP具有激素原轉(zhuǎn)化酶切割切割位點(diǎn)(弗林蛋白酶樣)作為該結(jié)構(gòu)域的一部分，它在切割被切割時(shí)會(huì)激活該酶。MMP-23A和MMP-23B在該結(jié)構(gòu)域(PMID10945999)中包括跨膜區(qū)段。
多種MMP的催化結(jié)構(gòu)域的X射線晶體結(jié)構(gòu)已證明該結(jié)構(gòu)域是測(cè)量值為35×30×30

(3.5×3×3nm)的扁圓球體?；钚晕稽c(diǎn)是一個(gè)穿過催化結(jié)構(gòu)域的20

(2nm)的溝。在所述催化結(jié)構(gòu)域的形成該活性位點(diǎn)的部分中存在催化上非常重要的Zn2+離子，該離子與存在于保守序列HexxHxxGxxH中的三個(gè)組氨酸氨基結(jié)合。因此，該序列為鋅結(jié)合基序。
該明膠酶(例如MMP-2)含有插入到該催化結(jié)構(gòu)域(PMID 12486137)中鋅結(jié)合基序正前位的II型纖連蛋白結(jié)構(gòu)功能域(module)。
所述催化結(jié)構(gòu)域通過柔性鉸鏈區(qū)或接頭區(qū)與C末端結(jié)構(gòu)域連接。它最多達(dá)75個(gè)氨基酸長(zhǎng)并且具有不確定的結(jié)構(gòu)。
所述C末端結(jié)構(gòu)域具有與血清蛋白質(zhì)血紅素結(jié)合蛋白類似的結(jié)構(gòu)。它有四個(gè)葉片狀β螺旋漿結(jié)構(gòu)。β螺旋漿結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)大的平坦表面，該表面被認(rèn)為參與蛋白-蛋白的相互作用。這也決定了底物特異性，并且成為與TIMP相互作用的位點(diǎn)。MMP-7、MMP-23和MMP-26以及植物和線蟲中不存在血紅素結(jié)合蛋白(Haemopexin)樣結(jié)構(gòu)域。MT-MMP通過該結(jié)構(gòu)域錨定在質(zhì)膜上，某些MT-MMP具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
MMP可以被以多種不同方式細(xì)分。通過將生物信息學(xué)方法用于比較MMP的一級(jí)序列，可提出以下MMP的演化分組MMP-19；MMP11、14、15、16和17；MMP-2和MMP-9；所有其他MMP。
對(duì)各催化結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)分析表明，當(dāng)主要類別分化時(shí)，催化結(jié)構(gòu)域也會(huì)進(jìn)一步演化，這也稱之為酶的底物特異性。(MMP生物學(xué)研究人員)最常用的分類，部分地基于對(duì)MMP底物特異性的組織學(xué)評(píng)價(jià)，部分地基于對(duì)MMP的細(xì)胞定位。這些類別有膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解酶和膜型MMP(MT-MMP)。逐漸地發(fā)現(xiàn)這些分類有一定的人為因素，因?yàn)檫€存在許多不適于分到任何常規(guī)類別的MMP。
膠原酶能夠?qū)⑷菪w維膠原降解為有區(qū)別的3/4和1/4片段。這些膠原是骨和軟骨的主要成分，并且MMP是唯一已知的能降解所述膠原的哺乳動(dòng)物酶。一般地，所述膠原酶為MMP-1(小腸膠原酶)、MMP-8(中性粒細(xì)胞膠原酶)、MMP-13(3型膠原酶)、MMP-18(4型膠原酶，xco14，非洲蟾蜍膠原酶。未知的人類正向同源物)、MMP-14(MT1-MMP)也已經(jīng)被表明可切割纖維膠原，更有爭(zhēng)議的是，有證據(jù)表明MMP-2能夠溶解膠原。
基質(zhì)降解酶顯示出廣泛地切割胞外基質(zhì)蛋白的能力，但它不能切割三螺旋纖維膠原。這類酶的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)成員為MMP-3(基質(zhì)降解酶1)、MMP-10(基質(zhì)降解酶2)和MMP-11(基質(zhì)降解酶3)。MMP-11顯示出與MT-MMP更相似，它可被轉(zhuǎn)化酶激活，因此其分泌通常與轉(zhuǎn)化酶可激活的MMP相關(guān)。
基質(zhì)溶解素類包括MMP-7(基質(zhì)溶解素，PUMP)和MMP-26(基質(zhì)溶解素-2，endometase)。
明膠酶的主要底物為IV型膠原和明膠，這些酶的特點(diǎn)在于在催化結(jié)構(gòu)域中插有附加的結(jié)構(gòu)域。明膠結(jié)合區(qū)位于鋅結(jié)合基序正前方，并形成獨(dú)立的折疊單元，該單元不會(huì)破壞該催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。這一亞類的兩個(gè)成員是MMP-2(72kDa明膠酶，明膠酶-A)和MMP-9(92kDa明膠酶，明膠酶-B)。
分泌的MMP包括MMP-11(基質(zhì)降解酶3)、MMP-21(X-MMP)和MMP-28(上皮水解素(Epilysin))。
膜結(jié)合MMP包括II型跨膜半胱氨酸陣列MMP-23、糖基磷脂酰肌醇結(jié)合的MMP 17和25(分別為MT4-MMP和MT6-MMP)以及I型跨膜MMP14、15、16、24(分別為MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP和MT5-MMP)。
6種MT-MMP在前肽中均有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，MMP-11也具有這一特征。
其他的MMP包括MMP-12(巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椥缘鞍酌?、MMP-19(RASI-I，有時(shí)也稱為基質(zhì)降解酶-4)、釉質(zhì)溶解素(Enamelysin)(MMP-20)和MMP-27(MMP-22，C-MMP)，MMP-23A(CA-MMP)和MMP-23B。
3.TIMP MMP可被特定的內(nèi)源金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)抑制，TIMP包括一個(gè)四種蛋白酶抑制劑的家族TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4?？偟貋碚f，所有的MMP一旦被激活，都可被TIMP抑制，但明膠酶(MMP-2和MMP-9)處于其潛在形式時(shí)可與TIMP形成復(fù)合體。潛在形式的MMP-2(MMP-2酶原)與TIMP-2的復(fù)合體可促進(jìn)一種膜錨定MMP即MT1-MMP(MMP-14)激活細(xì)胞表面的MMP-2酶原。
4.MMP/TIMP之比 高血壓性心臟病的MMP-TIMP分析的一個(gè)獨(dú)特特征是，利用了心臟特異性TIMP即TIMP-4，并將其置于含有在心肌梗阻和高血壓性患者中發(fā)生更顯著變化的MMP的環(huán)境中。還公開了MMP(例如MMP-9或MMP-13)與TIMP(例如TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4)的比值。所述比值在本文中首次被用作診斷鑒別特征并用于識(shí)別具有明顯不同的疾病狀況的患者。
5.血漿篩選 本發(fā)明教導(dǎo)的主要優(yōu)點(diǎn)是，本文公開的方法提供了一種從組織或體液識(shí)別具有發(fā)生不良LVH風(fēng)險(xiǎn)的受試者以及識(shí)別正加速發(fā)生該過程的患者的更快速簡(jiǎn)單的方法。因此，本文公開的方法可包括檢測(cè)受試者體液中的MMP和TIMP，所述體液例如有血、尿、血漿、血清、眼淚、淋巴、膽汁、腦脊液、間質(zhì)液、房水或玻璃體液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門和陰道分泌物、汗、精液、漏出液、滲出物和滑液。
血漿是血液的液體成分，其中懸浮有血細(xì)胞。血漿是血液最主要的單一成分，它占總血液體積的約55％。血清是指已去除凝血因子(例如纖維蛋白)的血漿。血漿含有許多重要的蛋白質(zhì)，包括血纖蛋白原、球蛋白和人血清白蛋白。有時(shí)，血漿可能含有必須通過病毒處理提取出來的病毒雜質(zhì)。
6.免疫測(cè)定 本領(lǐng)域中存在許多已知的或新發(fā)現(xiàn)的用于檢測(cè)例如蛋白質(zhì)(如MMP和TIMP)的分析物的方法，它們可用于本文公開的方法中。例如，可用標(biāo)準(zhǔn)免疫檢測(cè)法檢測(cè)MMP和TIMP。各種有用的免疫檢測(cè)法的步驟已在科技文獻(xiàn)中有描述，例如，Maggio et al.，Enzyme-Immunoassay，(1987)和Nakamura，et al.，Enzyme ImmunoassaysHeterogeneous andHomogeneous Systems，Handbook of Experimental Immunology，Vol.1Immunochemistry，27.1-27.20(1986)，通過引用的方式將它們的全文——特別是其關(guān)于免疫檢測(cè)的方法的教導(dǎo)——納入本文。從最簡(jiǎn)單直接的意義上來說，免疫測(cè)定是涉及抗體和抗原之間結(jié)合的結(jié)合測(cè)定法。許多類型和形式的免疫測(cè)定都是已知的，它們都適于檢測(cè)所公開的生物標(biāo)記。免疫測(cè)定的實(shí)例有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)、免疫珠捕獲測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、點(diǎn)印跡、凝膠移動(dòng)檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)陣列、多珠粒陣列、磁捕獲、體內(nèi)成像、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和光漂白后熒光恢復(fù)/定位(FRAP/FLAP)。
一般而言，免疫測(cè)定包括使被懷疑含有目的分子(例如本文公開的生物標(biāo)記)的樣本與該目的分子的抗體相接觸，或者使目的分子的抗體(例如，本文公開的生物標(biāo)記的抗體)與可被該抗體結(jié)合的分子相接觸，所述接觸過程可能是在有效使得能夠形成免疫復(fù)合體的條件下進(jìn)行。在有效形成免疫復(fù)合體(一級(jí)免疫復(fù)合體)的條件下且在足以使得免疫復(fù)合體形成的時(shí)間段內(nèi)，樣本與目的分子的抗體之間的接觸或者與可被目的分子的抗體結(jié)合的分子之間的接觸，通常只是簡(jiǎn)單地使所述分子或抗體與所述樣本接觸，并在足以使抗體與所存在的任何可與該抗體結(jié)合的分子(例如抗原)形成(即與其結(jié)合)免疫復(fù)合體的時(shí)間段內(nèi)，孵育上述混合物。在許多形式的免疫測(cè)定中，隨后可洗滌樣本-抗體組合物(例如組織切片、ELISA板、點(diǎn)印記或蛋白質(zhì)印跡)以除去任何非特異性結(jié)合的抗體種類，從而只允許與待檢測(cè)的一級(jí)免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的那些抗體存在。
免疫測(cè)定可包括用于檢測(cè)樣本中的目的分子(例如本文公開的生物標(biāo)記或它們的抗體)或?qū)ζ涠康姆椒?，所述方法通常包括檢測(cè)在結(jié)合過程中形成的任何免疫復(fù)合體或?qū)ζ涠俊Ｍǔ?，?duì)免疫復(fù)合體形成的檢測(cè)是本領(lǐng)域公知的，這可應(yīng)用多種方法實(shí)現(xiàn)。這些方法一般是基于檢測(cè)一種標(biāo)記物或標(biāo)記，例如任何放射性標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽、生物標(biāo)簽或酶標(biāo)簽或者任何其他已知的標(biāo)記物。參見例如，美國(guó)專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，通過引用的方式將上述每篇文獻(xiàn)全文——特別是與免疫檢測(cè)方法或標(biāo)記相關(guān)的教導(dǎo)——納入本文。
本文所使用的標(biāo)記可包括熒光染料、結(jié)合對(duì)的其中之一(例如生物素/鏈親和素)、金屬(例如金)或能與可被檢測(cè)的分子特異地相互作用(例如通過產(chǎn)生有色底物或熒光)的表位標(biāo)簽。適用于可檢測(cè)地標(biāo)記蛋白的底物包括熒光染料(本文中也被稱為熒光色素和熒光團(tuán))和可與顯色底物(例如辣根過氧化物酶)反應(yīng)的酶。實(shí)施本發(fā)明的過程中，一般優(yōu)選使用熒光染料，因?yàn)樗鼈兡軌蛟诤苌倭繒r(shí)被檢測(cè)到。此外，當(dāng)多個(gè)抗原與單個(gè)陣列反應(yīng)時(shí)，每個(gè)抗原可被不同的熒光化合物標(biāo)記以便同時(shí)檢出。可使用熒光計(jì)檢測(cè)陣列上的標(biāo)記點(diǎn)，當(dāng)存在信號(hào)時(shí)就表明抗原與特異性抗體結(jié)合。
熒光團(tuán)是能發(fā)光的化合物或分子。通常，熒光團(tuán)在一個(gè)波長(zhǎng)處吸收電磁能，在另一個(gè)波長(zhǎng)處發(fā)射電磁能。代表性的熒光團(tuán)包括但不限于1，5-IAEDANS、1，8-ANS、4-甲基傘形酮、5-羧-2，7-二氯熒光素、5-羧基熒光素(5-FAM)、5-羧基萘熒光素、5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)、5-羥色胺(5-HAT)、5-ROX(羧基-X-羅丹明)、6-羧羅丹明6G、6-CR6G、6-JOE、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放線菌素D(7-AAD)、7-羥基-4-I甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧吖啶(ACMA)、ABQ、酸性品紅、吖啶橙、吖啶紅、吖啶黃、錐蟲黃(Acriflavin)、錐蟲黃孚爾根SITSA(AcriflavinFeulgen SITSA)、水母發(fā)光蛋白(發(fā)光蛋白)、AFP-自主熒光蛋白-(量子生物技術(shù))(參見sgGFP、sgBFP)、Alexa Fluor 350TM、Alexa Fluor 430TM、Alexa Fluor 488TM、Alexa Fluor 532TM、Alexa Fluor 546TM、Alexa Fluor568TM、Alexa Fluor 594TM、Alexa Fluor 633TM、Alexa Fluor 647TM、Alexa Fluor 660TM、Alexa Fluor 680TM、茜素絡(luò)合酮、茜素紅、別藻藍(lán)蛋白(APC)、AMC、AMCA-S、氨甲基香豆素(AMCA)、AMCA-X、氨基放線菌素D、氨基香豆素、苯胺藍(lán)、硬脂酸蒽(Anthrocyl stearate)、APC-Cy7、APTRA-BTC、APTS、阿司屈拉崇(Astrazon)亮紅4G、阿司屈拉崇橙R、阿司屈拉崇紅6B、阿司屈拉崇黃7GLL、米帕林(Atabrine)、ATTO-TAGTMCBQCA、ATTO-TAGTM FQ、金胺、Aurophosphine G、Aurophosphine、BAO 9(雙氨基苯基噁二唑)、BCECF(高pH)、BCECF(低pH)、硫酸黃連素、β內(nèi)酰胺酶、BFP藍(lán)移GFP(Y66H)、藍(lán)色熒光蛋白、BFP/GFP FRET、Bimane、雙苯酰亞胺(Bisbenzemide)、雙苯酰亞胺(赫斯特)、雙BTC、布蘭科福爾(Blancophor)FFG、Blancophor SV、BOBOTM-1、BOBOTM-3、氟硼熒492/515、氟硼熒493/503、氟硼熒500/510、氟硼熒505/515、氟硼熒530/550、氟硼熒542/563、氟硼熒558/568、氟硼熒564/570、氟硼熒576/589、氟硼熒581/591、氟硼熒630/650-X、氟硼熒650/665-X、氟硼熒665/676、氟硼熒F1、氟硼熒FL ATP、氟硼熒F1-神經(jīng)酰胺、氟硼熒R6GSE、氟硼熒TMR、氟硼熒TMR-X綴合物、氟硼熒TMR-X SE、氟硼熒TR、氟硼熒Bodipy TR ATP、Bodipy TR-X SE、BO-PROTM-1、BO-PROTM-3、Brilliant Sulphoflavin FF、BTC、BTC-5N、鈣黃綠素、鈣黃綠素藍(lán)、CalciumCrimson-、Calcium Green、Calcium Green-1 Ca2+染料、Calcium Green-2Ca2+、Calcium Green-5N Ca2+、Calcium Green-C 18 Ca2+、Calcium Orange、Calcofluor White、羧基-X-羅丹明(5-ROX)、Cascade BlueTM、CascadeYellow、兒茶酚胺(Catecholamine)、CCF2(GeneBlazer)、CFDA、CFP(氰基熒光蛋白)、CFP/YFP FRET、葉綠素、色霉A、色霉A、CL-NERF、CMFDA、腔腸素(Coelenterazine)、腔腸素cp、腔腸素f、腔腸素fcp、腔腸素h、腔腸素hcp、腔腸素ip、腔腸素n、腔腸素0、香豆素毒傘素(CouniarinPhalloidin)、C-藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanine)、CPM I甲基香豆素、CTC、CTC甲臜(Formazan)、Cy2TM、Cy3.18、Cy3.5TM、Cy3TM、Cy5.18、Cy5.5TM、Cy5TM、Cy7TM、氰基GFP、cAMP熒光傳感器(Fluorosensor)(FiCRhR)、4-(4′-二甲對(duì)胺基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)、丹酰(dansyl)、丹酰胺、丹酰尸胺、丹酰氯、丹酰DHPE、丹酰氟、DAPI、Dapoxyl、Dapoxyl2、Dapoxyl3′DCFDA、DCFH(二氯二氫熒光素二乙酯)、DDAO、DHR(二氫羅丹明123)、二-4-ANEPPS、二-8-ANEPPS(非定比(non-ratio))、DiA(4-Di16-ASP)、二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH)、DiD-親脂示蹤物(Lipophilic Tracer)、DiD(DiI1C18(5))、DIDS、二氫羅丹明123(DHR)、Di1(Di1C18(3))、I二硝基苯酚、Di0(Di0C18(3))、DiR、DiR(Di1C18(7))、DM-NERF(高pH)、DNP、多巴胺、DsRed、DTAF、DY-630-NHS、DY-635-NHS、EBFP、ECFP、EGFP、ELF 97、伊紅、藻紅、藻紅ITC、溴化乙錠、乙啡啶同型二聚體-1(Ethidium homodimer-1)(EthD-1)、吖啶橙、EukoLight、氯化銪(111)、EYFP、速藍(lán)(Fast Blue)、FDA、孚爾根(副品紅)、FIF(甲醛誘導(dǎo)的熒光)、FITC、Flazo Orange、Fluo-3、Fluo-4、熒光素(FITC)、熒光素二乙酯、熒光祖母綠(Fluoro-Emerald)、熒光金(Fluoro-Gold)(羥基二脒替)、Fluor-Ruby、FluorX、FM 1-43TM、FM4-46、Fura RedTM(高pH)、Fura紅TM/Fluo-3、Fura-2、Fura-2/BCECF、Genacryl BrilliantRed B、Genacryl Brilliant Yellow 10GF、Genacryl Pink 3G、GenacrylYellow 5GF、GeneBlazer、(CCF2)、GFP(S65T)、紅移GFP(rsGFP)、非UV激發(fā)的野生型GFP(wtGFP)、UV激發(fā)的野生型GFP(wtGFP)、GFPuv、Gloxalic Acid、粒狀藍(lán)(Granular blue)、血卟啉(Haematoporphyrin)、赫斯特33258、赫斯特33342、赫斯特34580、HPTS、羥基香豆素、羥基二脒替(熒光金)、羥色胺、Indo-1(高鈣)、Indo-1(低鈣)、吲哚二碳菁(Indodicarbocyanine)(DiD)、吲哚三碳菁(Indotricarbocyanine)(DiR)、Intrawhite Cf、JC-1、JO JO-1、JO-PRO-1、LaserPro、Laurodan、LDS 751(DNA)、LDS 751(RNA)、雷可福(Leucophor)PAF、LeucophorSF、Leucophor WS、麗絲胺(Lissamine)羅丹明、麗絲胺羅丹明B、鈣黃綠素/乙啡啶同型二聚體、LOLO-1、LO-PRO-1、螢黃(Lucifer Yellow)、溶酶體藍(lán)色熒光探針(Lyso Tracker Blue)、溶酶體藍(lán)白色熒光探針(LysoTracker Blue-White)、溶酶體綠色熒光探針(Lyso Tracker Green)、溶酶體紅色熒光探針(Lyso Tracker Red)、溶酶體黃色熒光探針(LysoTracker Yellow)、LysoSensor Blue、LysoSensor Green、LysoSensorYellow/Blue、Mag Green、麥塔喇紅(Magdala Red)(Phloxin B)、Mag-FuraRed、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-lndo-1、鎂綠(Magnesium Green)、鎂橙(Magnesium Orange)、孔雀石綠、海藍(lán)(Marina Blue)、I MaxilonBrilliant Flavin 10 GFF、Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF、部花青(Merocyanin)、甲氧香豆素、線粒體綠色熒光探針(Mitotracker Green)FM、線粒體橙色熒光探針(Mitotracker Orange)、線粒體紅色熒光探針(Mitotracker Red)、光神霉素、Monobromobimane、Monobromobimane(mBBr-GSH)、Monochlorobimane、MPS(甲基氯焦寧芪(Methyl GreenPyronine Stilbene))、NBD、NBD胺、尼羅紅、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxedidole)、去甲腎上腺素(Noradrenaline)、核速紅(Nuclear Fast Red)、i核黃(i Nuclear Yellow)、Nylosan Brilliantlavin E8G、俄勒岡綠(Oregon Green)TM、俄勒岡綠TM488、俄勒岡綠TM500、俄勒岡綠TM514、太平藍(lán)(Pacific Blue)、，副品紅(孚爾根)、PBFI、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、PE-德克薩斯紅(613紅)、根皮紅(Phloxin)B(麥塔喇紅)、Phorwite AR、Phorwite BKL、PhorwiteRev、Phorwite RPA、膦3R、光致抗蝕劑(PhotoResist)、藻紅蛋白B[PE]、藻紅蛋白R(shí)[PE]、PKH26(Sigma)、PKH67、PMIA、Pontochrome Blue Black、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-I PRO-3、櫻草靈(Primuline)、普施安黃(Procion Yellow)、碘化丙啶(P1)、PyMPO、芘(Pyrene)、派洛寧(Pyronine)、派洛寧B、Pyrozal Brilliant Flavin 7GF、QSY 7、芥奎吖因(Quinacrine Mustard)、試鹵靈(Resorufin)、RH414、Rhod-2、羅丹明、羅丹明110、羅丹明123、羅丹明5GLD、羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明B200、堿性玫瑰精(Rhodamine B extra)、羅丹明BB、羅丹明BG、羅丹明綠、羅丹明毒傘素(Rhodamine Phallicidine)、羅丹明、鬼筆環(huán)肽(Phalloidine)、羅丹明紅、羅丹明WT、玫瑰紅、R-藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanine)、R-藻紅蛋白(PE)、rsGFP、S65A、S65C、S65L、S65T、深藍(lán)色GFP、SBFI、5-羥色胺、塞夫隆亮紅(Sevron Brilliant Red)2B、塞夫隆亮紅4G、塞夫隆亮紅B、塞夫隆橙、塞夫隆黃L、sgBFPTM(超發(fā)光(super glow)BFP)、sgGFPTM(超發(fā)光GFP)、SITS(櫻草靈，1，2-二苯乙烯異硫代硫酸)、SNAFL鈣黃綠素、SNAFL-1、SNAFL-2、SNAR鈣黃綠素、SNARF1、鈉綠(Sodium Green)、SpectrumAqua、SpectrumGreen、SpectrumOrange、Spectrum Red、SPQ(6-甲氧-N-(3磺丙基)喹啉銨)、1，2-二苯乙烯、磺羅丹明B和C、SulphoRhodamien Extra、SYTO 11、SYTO 12、SYTO 13、SYTO 14、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 17、SYTO 18、SYTO 20、SYTO 21、SYTO 22、SYTO 23、SYTO 24、SYTO 25、SYTO 40、SYTO 41、SYTO 42、SYTO 43、SYTO 44、SYTO 45、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62、SYTO 63、SYTO 64、SYTO 80、SYTO 81、SYTO 82、SYTO 83、SYTO 84、SYTO 85、SYTOX藍(lán)、SYTOX綠、SYTOX橙、四環(huán)素(Tetracycline)、四甲基羅丹明(TRITC)、德克薩斯紅TM、德克薩斯紅-XTM綴合物、硫代二羰花青(Thiadicarbocyanine)(DiSC3)、噻嗪紅R(Thiazine Red R)、噻唑橙、硫磺素5(Thioflavin)、硫磺素S、硫磺素TON、Thiolyte、ThiozoleOrange、Tinopol CBS(Calcofluor White)、TIER、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、Tricolor(PE-Cy5)、TRITC四甲基羅丹明異硫氰酸酯、正藍(lán)(True Blue)、正紅(Tru Red)、Ultralite、熒光素鈉(Uranine)B、Uvitex SFC、wtGFP、WW781、X-羅丹明、XRITC、二甲苯橙(Xylene Organge)、Y66F、Y66H、Y66W、黃色GFP、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO 3、YOYO-1、YOY0-3、Sybr Green、噻唑橙(內(nèi)螯合染料(interchelating dye))、例如量子點(diǎn)的半導(dǎo)體納米粒或(可被光或其他電磁能源激活的)封閉熒光團(tuán)(caged flurophore)，或者它們的組合。
標(biāo)記可以直接或間接進(jìn)行。在直接標(biāo)記中，檢測(cè)的抗體(目的分子的抗體)或檢測(cè)的分子(可被目的分子的抗體結(jié)合的分子)包括標(biāo)記物。檢測(cè)到標(biāo)記物就表明存在所述檢測(cè)的抗體或所述檢測(cè)的分子，這又分別表明存在目的分子或存在目的分子的抗體。在間接標(biāo)記中，使其他分子或部分與免疫復(fù)合體接觸，或者在免疫復(fù)合體處生成其他分子或部分。例如，可使產(chǎn)生信號(hào)的分子或部分(例如酶)附著到或者結(jié)合到所述檢測(cè)抗體或所述檢測(cè)分子上。之后，產(chǎn)生信號(hào)的分子可在免疫復(fù)合體處產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。例如，在向一種酶提供合適的底物時(shí)，該酶可在免疫復(fù)合體處產(chǎn)生可見的或可檢測(cè)的產(chǎn)物。ELISA應(yīng)用了這種間接標(biāo)記。
間接標(biāo)記的另一個(gè)實(shí)例是，使可結(jié)合目的分子或結(jié)合目的分子的抗體(一抗)的其他分子(可稱之為結(jié)合劑)——例如與一抗結(jié)合的二抗——與免疫復(fù)合體相接觸。所述其他分子可帶有標(biāo)記物或產(chǎn)生信號(hào)的分子或部分。所述其他分子可以是抗體，由此它可被稱為二抗。二抗與一抗的結(jié)合可與所述第一抗體(或一抗)和目的分子形成所謂的三明治。該免疫復(fù)合體可與經(jīng)標(biāo)記的二抗在有效使得二級(jí)免疫復(fù)合體形成的條件下相接觸，且接觸時(shí)間足以使得二級(jí)免疫復(fù)合體形成。然后，通?？上礈煸摱?jí)免疫復(fù)合體以除去任何非特異結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的二抗，隨后可檢測(cè)該二級(jí)免疫復(fù)合體中余下的標(biāo)記物。所述其他分子也可以是或包括一對(duì)彼此結(jié)合的分子或部分(例如生物素/鏈親和素對(duì))的其中之一。在這種模式中，所述檢測(cè)抗體或檢測(cè)分子應(yīng)包括該配對(duì)中的另一成員。
其他的間接標(biāo)記模式包括通過兩步驟法檢測(cè)一級(jí)免疫復(fù)合體。例如，如上所述，一種對(duì)目的分子或相應(yīng)抗體具有結(jié)合親和性的分子(它可被稱為第一結(jié)合劑)例如一種抗體可用于形成二級(jí)免疫復(fù)合體。洗滌后，也是在有效使得免疫復(fù)合體形成(由此形成三級(jí)免疫復(fù)合體)的條件下，在足以使得免疫復(fù)合體形成的時(shí)間內(nèi)，可使所述二級(jí)免疫復(fù)合體與另一種對(duì)所述第一結(jié)合劑具有結(jié)合親和性的分子(它可被稱為第二結(jié)合劑)相接觸。所述第二結(jié)合劑可與有可檢測(cè)標(biāo)記物或產(chǎn)生信號(hào)的分子或部分連接，以便能檢測(cè)所述的由此形成的三級(jí)免疫復(fù)合體。該體系可使信號(hào)放大。
涉及檢測(cè)底物(例如一種蛋白或一種特定蛋白的抗體)的免疫測(cè)定包括無標(biāo)記測(cè)定、蛋白分離法(即電泳)、固體載體捕獲測(cè)定或體內(nèi)檢測(cè)。無標(biāo)記測(cè)定是確定樣本中是否存在特定蛋白或特定蛋白的抗體的常用診斷手段。蛋白分離法也用于評(píng)價(jià)蛋白的物理特性，例如分子大小或凈電荷。捕獲測(cè)定通常在定量評(píng)價(jià)樣本中特定蛋白或特定蛋白的抗體的濃度時(shí)更為有用。最后，體內(nèi)檢測(cè)可用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的空間表達(dá)模式，即該物質(zhì)可存在于患者體內(nèi)的何處，組織還是細(xì)胞中。
如果濃度足夠，抗體-抗原相互作用產(chǎn)生的分子復(fù)合體([Ab-Ag]n)為肉眼可見的，但量更少時(shí)也有可能因其能散射光束而被檢測(cè)或測(cè)量到。復(fù)合體的形成表明兩種反應(yīng)物均存在，在免疫沉淀測(cè)定中，恒定濃度的試劑抗體被用于測(cè)量特定抗原([Ab-Ag]n)，試劑抗原被用于檢測(cè)特定抗體([Ab-Ag]n)。如果試劑種類被預(yù)先包被于細(xì)胞(如在血細(xì)胞凝集測(cè)定中)或微小顆粒(如在乳膠凝集測(cè)定中)上，包被顆粒的“凝集”在極低濃度時(shí)都可見。基于上述基本原理的各種測(cè)定法都是常用方法，包括Ouchterlony免疫擴(kuò)散測(cè)定、火箭免疫電泳和免疫濁度分析和濁度測(cè)定。這類測(cè)定的主要局限是與使用標(biāo)記物的測(cè)定法相比，其靈敏度有限(較低的檢測(cè)限)，并且某些情況下，極高濃度的分析物實(shí)際上可抑制復(fù)合體的形成這一事實(shí)使得這些方法更為復(fù)雜。這些一線測(cè)定法中的某些可追溯到發(fā)現(xiàn)抗體時(shí)，它們都沒有真正的“標(biāo)記物”(例如Ag-enz)。其他類型的無標(biāo)記免疫測(cè)定依賴于免疫傳感器，目前已有許多可直接檢測(cè)抗體-抗原相互作用的市售儀器。大多數(shù)都需要在具有固定化配體的傳感器表面上產(chǎn)生隱失波，從而可以連續(xù)監(jiān)測(cè)與配體的結(jié)合。免疫傳感器使得可以很容易進(jìn)行動(dòng)力學(xué)相互作用研究，并且隨著低成本專業(yè)儀器的出現(xiàn)使其在未來可廣泛應(yīng)用于免疫分析中。
使用免疫測(cè)定法檢測(cè)特定蛋白可包括通過電泳分離蛋白質(zhì)。電泳是指溶液中的荷電分子響應(yīng)于電場(chǎng)發(fā)生遷移。它們的遷移率取決于電場(chǎng)強(qiáng)度、分子的凈電荷、大小和形狀，還取決于其中泳動(dòng)分子的介質(zhì)的離子強(qiáng)度、粘度和溫度。電泳是一種簡(jiǎn)單、快速且高靈敏的分析工具。它被用于分析研究單一的荷電分子的性質(zhì)，并且也可作為一種分離技術(shù)。
通常，在載體基質(zhì)上泳動(dòng)樣本，例如在紙、醋酸纖維素、淀粉凝膠、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上。所述基質(zhì)可抑制發(fā)熱所致的對(duì)流混合，并且提供電泳記錄即在電泳結(jié)束時(shí)，可將基質(zhì)染色并用于掃描、放射自顯影或保存。此外，最常用的載體基質(zhì)——瓊脂糖和聚丙烯酰胺——提供了通過分子大小分離分子的工具，因?yàn)樗鼈兪嵌嗫啄z。多孔凝膠可通過延遲或者某些情況下完全阻止大分子移動(dòng)同時(shí)使小分子自由移動(dòng)來起到分子篩的作用。由于稀的瓊脂糖凝膠通常比相同濃度的聚丙烯酰胺更硬并且更容易處理，因此瓊脂糖被用于分離較大的大分子例如核酸、大的蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合體。聚丙烯酰胺在較高濃度時(shí)容易處理和制備，因此被用于分離需要較小的延遲凝膠孔徑的多數(shù)蛋白和較小寡核苷酸。
蛋白質(zhì)是兩性化合物，因此可通過其懸浮介質(zhì)的pH來測(cè)定它們的凈電荷。當(dāng)溶液pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白帶凈負(fù)電，并在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。低于其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白帶正電，向陰極移動(dòng)。此外，蛋白質(zhì)所帶的凈電荷與其分子大小無關(guān)，即不同的蛋白質(zhì)，每單位分子質(zhì)量(或長(zhǎng)度，蛋白質(zhì)和核酸是線性大分子時(shí))所帶電荷不同。因此，在給定的pH下，并且在非變性條件下，同時(shí)通過分子的大小和電荷來確定蛋白質(zhì)的電泳分離。
十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子變性劑，它可通過“包圍”多肽骨架而使蛋白質(zhì)變性，SDS與蛋白質(zhì)極特定地以1.4:1的質(zhì)量比結(jié)合。由此，SDS將賦予多肽與其長(zhǎng)度成比例的陰電荷。此外，通常還需要將蛋白的二硫鍵還原(變性)，如此之后，蛋白質(zhì)就可采取通過分子大小進(jìn)行分離所需的隨機(jī)卷曲構(gòu)型；還原可用2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇實(shí)現(xiàn)。因此，在變性SDS-PAGE分離中，遷移并不由多肽的內(nèi)部電荷決定，而是由分子量決定。
分子量的測(cè)定可通過將已知分子量的蛋白與待表征的蛋白一起進(jìn)行SDS-PAGE電泳來進(jìn)行。SDS變性的多肽或天然核酸的分子量的對(duì)數(shù)與其Rf之間存在線性關(guān)系。分子遷移距離與標(biāo)準(zhǔn)物染料前沿遷移距離之比即為Rf。一種通過電泳(Mr)測(cè)定相對(duì)分子量的簡(jiǎn)單方法是，繪制已知樣本遷移距離相對(duì)log 10MW的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在測(cè)量樣本在同一凝膠上的遷移距離后讀取樣本的logMr。
在二維電泳中，首先基于物理特性將蛋白質(zhì)分級(jí)分離，然后基于另一種特性通過另一步驟分級(jí)分離。例如，等電聚焦法可用于第一維度，這可方便地通過管式凝膠進(jìn)行，而平板凝膠上的SDS電泳可用于第二維度。該方法的一個(gè)實(shí)例是O′Farrell，P.H.，High Resolution Two-dimensionalElectrophoresis of Proteins，J.Biol.Chem.2504007-4021(1975)中的方法，該文獻(xiàn)就其二維電泳方法的教導(dǎo)通過引用的方式全文納入本文。其他的實(shí)例包括但不限于Anderson，L and Anderson，NG，Highresolution two-dimensional electrophoresis of human plasmaproteins，Proc.Natl.Acad.Sci.745421-5425(1977)和Ornstein，L.，Disc electrophoresis，L.Ann.N.Y.Acad.Sci.121321349(1964)中的方法，它們關(guān)于電泳方法的教導(dǎo)均通過引用的方式全文納入本文。
Laemmli，U.K.，Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4，Nature 227680(1970)中公開了一種用于分辨SDS變性蛋白的不連續(xù)系統(tǒng)，該文獻(xiàn)就其電泳方法的教導(dǎo)通過引用的方式全文納入本文。Laemmli緩沖系統(tǒng)中的先導(dǎo)離子是氯，尾隨離子是甘氨酸。因此，該分辨凝膠和積層凝膠是用(不同濃度和pH的)Tris-HCl緩沖液制備的，而電泳槽緩沖液為Tris-甘氨酸。所有緩沖液均含有0.1％ SDS。
本發(fā)明方法中考慮到的使用電泳的免疫測(cè)定的一個(gè)實(shí)例為蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡使得可以測(cè)定蛋白的分子質(zhì)量，以及測(cè)量不同樣本中存在的蛋白的相對(duì)量。檢測(cè)方法包括化學(xué)發(fā)光和顯色檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡分析的標(biāo)準(zhǔn)方法可參見例如D.M.Boltag et al.，ProteinMethods(2d edition 1996)和E.Harlow & D.Lane，Antibodies，aLaboratory Manual(1988)以及美國(guó)專利4,452,901，它們每一篇關(guān)于蛋白質(zhì)印跡方法的教導(dǎo)均通過引用的方式全文納入本文。一般用凝膠電泳(常用SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種例如硝酸纖維素的特殊印跡薄紙上，但也可使用其他類型的紙或膜。該蛋白保持其在凝膠上的分離模式。使該印跡與一種例如乳蛋白的總蛋白一起孵育，以結(jié)合硝酸纖維素膜上任何剩余的粘性區(qū)域。然后將能夠結(jié)合其特異性蛋白的抗體加入到該溶液中。
通過間接酶免疫測(cè)定技術(shù)可容易地顯示特異性抗體與特異性固定化抗原的結(jié)合，通常使用生色底物(例如，堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)或發(fā)光底物。其他可能的探測(cè)方法包括使用熒光或放射性同位素標(biāo)記物(例如，熒光素、125I)。檢測(cè)抗體結(jié)合的探針可以是綴合的抗免疫球蛋白、綴合的葡萄球菌蛋白A(結(jié)合IgG)或生物素化一抗的探針(例如，綴合的親和素/鏈親和素)。
該技術(shù)的有效性在于它能通過特定蛋白的抗原性同時(shí)檢測(cè)出該特定蛋白和它的分子量。首先，用SDS-PAGE根據(jù)質(zhì)量分離蛋白質(zhì)，然后通過免疫測(cè)定步驟進(jìn)行特異地檢測(cè)。因此，可同時(shí)電泳蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物(分子量標(biāo)準(zhǔn)(ladder))，以估計(jì)異源樣本中目的蛋白的分子量。
凝膠遷移測(cè)定或電泳遷移率測(cè)定(EMSA)可用于定性和定量地檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白和其同源DNA識(shí)別序列之間的相互作用。示例性的技術(shù)如Ornstein L.，Disc electrophoresis-IBackground and theory，Ann.NY Acad.Sci.121321-349(1964)和Matsudiara，PT and DR Burgess，SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis，Anal.Biochem.87386-396(1987)中所述，上述文獻(xiàn)就其凝膠遷移測(cè)定的相關(guān)教導(dǎo)均通過引用的方式全文納入本文。
在常規(guī)的凝膠測(cè)定中，可將純化的蛋白或細(xì)胞粗提物與一種標(biāo)記(例如32P放射標(biāo)記)的DNA或RNA探針一起孵育，然后通過非變性聚丙烯酰胺凝膠使該復(fù)合體與游離的探針分離。該復(fù)合體穿過凝膠的遷移速度比不結(jié)合的探針更慢。根據(jù)所述結(jié)合蛋白的活性，標(biāo)記的探針可以是雙鏈或單鏈的。對(duì)于例如轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)，可以使用純化的或部分純化的蛋白或者核細(xì)胞提取物。對(duì)于RNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)，可以使用純化的或部分純化的蛋白或者核或胞質(zhì)細(xì)胞提取物。DNA或RNA結(jié)合蛋白對(duì)于推定結(jié)合位點(diǎn)的特異性可通過競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)來確定，其中使用含有目的蛋白結(jié)合位點(diǎn)的DNA或RNA片段或寡核苷酸，或者其他無關(guān)序列。在特異和非特異競(jìng)爭(zhēng)物的存在下形成的復(fù)合體的性質(zhì)和強(qiáng)度差異使得可以識(shí)別特異的相互作用。參見Promega的凝膠遷移測(cè)定FAQ，它可從http://www.promega.com/faq/gelshfaq.html(上一次訪問于2005年3月25日)獲得，該內(nèi)容就其凝膠遷移法相關(guān)教導(dǎo)通過引用的方式全文納入本文。
凝膠遷移法可包括，例如使用膠體形式的考馬斯(Imperial ChemicalsIndustries，Ltd)藍(lán)色染料檢測(cè)凝膠(例如聚丙烯酰胺電泳凝膠)上的蛋白質(zhì)。這類方法在例如Neuhoff et al.，Electrophoresis 6427-448(1985)和Neuhoff et al，Electrophoresis 9255-262(1988)中有描述，所述文獻(xiàn)就其凝膠遷移方法相關(guān)教導(dǎo)均通過引用的方式全文納入本文。除了上述的常規(guī)蛋白質(zhì)測(cè)定方法，美國(guó)專利5,424,000中還描述了一種聯(lián)合清洗和蛋白質(zhì)染色的組合物，該文獻(xiàn)就其凝膠遷移方法相關(guān)教導(dǎo)通過引用的方式全文納入本文。該溶液可包括磷酸、硫酸和硝酸以及酸性紫染料。
放射免疫沉淀測(cè)定(RTPA)是一種使用放射性標(biāo)記的抗原來檢測(cè)血清中特異抗體的靈敏測(cè)定法。使抗原與血清反應(yīng)，然后用特殊的試劑例如蛋白A瓊脂糖(sepharose)珠粒進(jìn)行沉淀。之后，通常用凝膠電泳分析所述結(jié)合的經(jīng)放射性標(biāo)記的免疫沉淀。放射性免疫沉淀測(cè)定(RIPA)常被用作一種用于診斷是否存在HIV抗體的確診測(cè)試。RIPA在本領(lǐng)域中也被稱作Farr測(cè)定、沉淀測(cè)定、放射免疫沉淀測(cè)定；放射免疫沉淀分析；放射免疫沉淀分析和免疫沉淀分析。
雖然上述利用電泳分離和檢測(cè)所述特定目的蛋白的免疫測(cè)定可以評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的大小，但它們?cè)谠u(píng)價(jià)蛋白質(zhì)濃度方面不太靈敏。然而，還考慮了這樣一種免疫測(cè)定其中所述蛋白或蛋白的特異性抗體與固體載體(例如管、孔、珠?；蚣?xì)胞)結(jié)合以分別從樣本中捕獲所述抗體或目的蛋白，并且將這種測(cè)定與一種檢測(cè)載體上的所述蛋白或蛋白的特異性抗體的方法相結(jié)合。這類免疫測(cè)定的實(shí)例包括放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)陣列、多珠粒陣列和磁捕獲。
放射性免疫測(cè)定(RIA)是一種檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的經(jīng)典定量測(cè)定，它使用了放射性標(biāo)記的物質(zhì)(放射性配體)，以直接地或間接地測(cè)量未標(biāo)記物質(zhì)與特異抗體或其他受體系統(tǒng)的結(jié)合?？墒褂梅派湫悦庖邷y(cè)定法例如檢測(cè)血液的激素水平，而不需要用生物測(cè)定法。非免疫源性物質(zhì)(例如半抗原)如與能誘導(dǎo)抗體形成的更大的載體蛋白(例如，牛γ球蛋白或人血清白蛋白)偶聯(lián)，則也可對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。RIA包括將放射性抗原(因?yàn)閷⒌庠右氲鞍踪|(zhì)的酪氨酸殘基中較容易，所以通常使用放射性同位素125I或131I)與該抗原的抗體混合。一般，使該抗體與例如管或微珠的固體載體結(jié)合。然后，加入已知量的未標(biāo)記抗原或“冷”抗原，并測(cè)量被置換的標(biāo)記抗原的量。最初，所述放射性抗原與抗體結(jié)合。當(dāng)加入冷抗原時(shí)，兩者會(huì)競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，更高濃度的冷抗原會(huì)更多地與該抗體結(jié)合，從而置換出該放射性變體。使結(jié)合的抗原與溶液中未結(jié)合的抗原相分離，通過各抗原的放射性來繪制結(jié)合曲線。這種技術(shù)極其靈敏并且特異性很高。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)——或者通常稱之為EIA(酶免疫測(cè)定)——是一種可檢測(cè)蛋白的特異抗體的免疫測(cè)定。在該測(cè)定中，與抗體結(jié)合試劑或抗原結(jié)合試劑相結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記是一種酶。當(dāng)酶與其底物接觸時(shí)，該酶以特定方式發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生例如可通過分光光度測(cè)定、熒光測(cè)定或可見方式檢測(cè)的化學(xué)部分?？捎糜诳蓹z測(cè)地標(biāo)記檢測(cè)試劑的酶包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母乙醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。關(guān)于ELISA方法的描述參見Voller，A.et al.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，1980；Butler，J.E.，InStructure of Antigens，Vol.1(Van Regenmortel，M.，CRC Press，BocaRaton，1992，pp.209-259；Butler，J.E.，Invan Oss，C.J.et al.，(eds)，Immunochemistry，Marcel Dekker，Inc.，New York，1994，pp.759-803；Butler，J.E.(ed.)，Immunochemistry of Solid-PhaseImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，1991)；Crowther，＂ELISATheoryand Practice，＂InMethods in Molecule Biology，Vol.42，HumanaPress；New Jersey，1995；美國(guó)專利4,376,110，上述每篇文獻(xiàn)——特別是關(guān)于ELISA方法的教導(dǎo)——均通過引用的方式全文納入本文。
ELISA技術(shù)的變化方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)變化方案中，可將能與蛋白結(jié)合的抗體固定在顯示出蛋白親和性的選定表面上，例如在聚苯乙烯微量滴定板的孔中。然后，向所述孔中加入懷疑含有標(biāo)記抗原的測(cè)試組合物。結(jié)合并洗去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合體后，可檢測(cè)結(jié)合的抗原?？赏ㄟ^加入特異性針對(duì)靶蛋白的二抗來進(jìn)行檢測(cè)，所述二抗與可檢測(cè)標(biāo)記相連。這類ELISA是一種簡(jiǎn)單的“夾心ELISA”。也可通過先加入二抗再加入對(duì)所述二抗有結(jié)合親和性的三抗來進(jìn)行檢測(cè)，所述三抗與可檢測(cè)標(biāo)記相連。
另一個(gè)變化方案是競(jìng)爭(zhēng)ELISA。在競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，測(cè)試樣本競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合已知量的標(biāo)記抗原或抗體。可通過在與包被孔一起孵育前或在孵育過程中，使樣本與所述已知的標(biāo)記物混合來測(cè)定樣本中反應(yīng)物的量。樣本中存在反應(yīng)物時(shí)會(huì)減少可結(jié)合孔的標(biāo)記物的量，由此而減弱最終的信號(hào)。
無論采用何種形式，ELISA都具有某些共同的特征，例如包被、孵育或結(jié)合、洗去非特異性結(jié)合的物質(zhì)以及檢測(cè)結(jié)合的免疫復(fù)合體?？墒箍乖蚩贵w與固體載體相連，并將待分析的樣本加到固定的抗原或抗體上，所述固體載體例如為板、珠粒、桿、膜或柱基質(zhì)的形式。用抗原或抗體包被板時(shí)，通常用抗原或抗體溶液孵育板孔，并孵育過夜或者一段具體的時(shí)間段。然后，清洗板孔以除去不完全吸附的物質(zhì)。然后，用對(duì)于測(cè)試抗血清呈抗原中性的非特異性蛋白“包被”任何剩余的可吸附的孔表面。它們包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和乳粉溶液。所述包被使得可以封閉固定化表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，并因此降低抗血清與表面非特異結(jié)合所致的本底。
在ELISA中，還可使用二次或三次檢測(cè)手段，而不用直接方法。因此，在使蛋白或抗體與孔結(jié)合，用無反應(yīng)活性物質(zhì)進(jìn)行包被以降低本底并洗去未結(jié)合物質(zhì)后，使固定化表面與待測(cè)對(duì)照臨床或生物樣本在可有效使得免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成的條件下相接觸。這樣，該免疫復(fù)合體的檢測(cè)就需要一種標(biāo)記的二級(jí)結(jié)合試劑或者與一種二級(jí)結(jié)合試劑和一種標(biāo)記的三級(jí)結(jié)合試劑的組合。
“在可有效使得免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成的條件下”意為該條件包括用例如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸鹽緩沖溶液(PBS)/吐溫的溶液稀釋抗原和抗體，以減少非特異性結(jié)合并提高合理的信噪比。
合適的條件也可意為在使得有效結(jié)合的溫度下和足夠時(shí)間內(nèi)進(jìn)行孵育。孵育步驟通?？稍诩s20℃至30℃下進(jìn)行約1分鐘至12小時(shí)，或者可在約0℃至約10℃下孵育過夜。
在ELISA中，進(jìn)行所有孵育步驟后，洗滌接觸表面以除去未復(fù)合的物質(zhì)。洗滌步驟可包括用例如PBS/吐溫或硼酸鹽緩沖液的溶液洗滌。在測(cè)試樣本與最初結(jié)合的物質(zhì)之間形成特異免疫復(fù)合體并進(jìn)行隨后洗滌后，可以測(cè)定甚至以很小量存在的免疫復(fù)合體。
為了提供一種檢測(cè)手段，如上所述，所述二抗或三抗可帶有結(jié)合的標(biāo)記物以便檢測(cè)。它可以是一種在與合適的生色底物孵育后可產(chǎn)生顏色的酶。因此，例如，可在利于進(jìn)一步形成免疫復(fù)合體的條件下以及時(shí)間段內(nèi)使第一或第二免疫復(fù)合體與標(biāo)記抗體相接觸并一起孵育(例如在室溫下，在含PBS的溶液(例如PBS-吐溫)中孵育2小時(shí))。
與標(biāo)記抗體一起孵育并且隨后洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，可對(duì)標(biāo)記物定量，例如在以過氧化物酶作為酶標(biāo)記時(shí)，可通過與生色底物例如脲和溴甲酚紫或2，2′-疊氮-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和H2O2一起孵育來定量。定量可通過測(cè)量生色程度來實(shí)現(xiàn)，例如使用可見光譜分光光度計(jì)。
蛋白測(cè)定為利用了表面固定化蛋白的固相配體結(jié)合測(cè)定系統(tǒng)，所述表面包括玻璃、膜、微量滴定孔、質(zhì)譜儀平板和珠?；蚱渌w粒。這些測(cè)定高度平行(多重)并且常常是小型化的(微陣列、蛋白質(zhì)芯片)。它們的優(yōu)點(diǎn)包括快速且自動(dòng)化、高靈敏度、試劑經(jīng)濟(jì)并且單次實(shí)驗(yàn)可給出的大量數(shù)據(jù)。生物信息學(xué)支持非常重要；數(shù)據(jù)的處理需要復(fù)雜的軟件和數(shù)據(jù)比較分析。然而，可對(duì)用于DNA陣列的軟件加以修改得到上述軟件，如同許多硬件和檢測(cè)系統(tǒng)一樣。
一種主要的形式是捕獲陣列，在該陣列中，配體結(jié)合劑被用于檢測(cè)例如血漿或組織提取物的混合物中的目的分子，所述配體結(jié)合劑通常為抗體，但也可以是蛋白支架、肽或核酸適體。在診斷中，捕獲陣列可用于平行進(jìn)行多個(gè)免疫測(cè)定，既可測(cè)定例如單個(gè)血清中的多種分析物，也可同時(shí)測(cè)定多個(gè)血清樣本。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，捕獲測(cè)定被用于對(duì)不同的健康和患病樣本的蛋白質(zhì)水平定量并加以比較，即蛋白質(zhì)表達(dá)作譜。除特異配體結(jié)合物之外的蛋白被用在所述用于體外功能相互作用(例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-藥物、受體-配體、酶-底物等等)篩選的陣列形式中?？舍槍?duì)多種蛋白對(duì)捕獲試劑自身進(jìn)行選擇和篩選，這也可通過針對(duì)多重蛋白靶標(biāo)的多陣列形式實(shí)現(xiàn)。
對(duì)于構(gòu)建陣列而言，蛋白質(zhì)的來源包括，用于重組蛋白的基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)、從天然來源純化、通過無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)體外生產(chǎn)和肽合成方法。這些方法中的許多種都可用于自動(dòng)高通量生產(chǎn)。對(duì)于捕獲陣列和蛋白功能分析而言，重要的是，蛋白應(yīng)正確折疊并具有功能；但事實(shí)并非總是如此，例如當(dāng)在變性條件下從細(xì)菌提取重組蛋白時(shí)。然而，變性蛋白的陣列可用于篩選抗體的交叉反應(yīng)性、識(shí)別自身抗體以及篩選配體結(jié)合蛋白。
蛋白陣列已被設(shè)計(jì)成，通常使用熒光讀數(shù)并且用機(jī)器推進(jìn)的微型化形式的常用免疫測(cè)定方法(例如ELISA和點(diǎn)印跡)，以及能夠平行進(jìn)行多個(gè)測(cè)定的高通量檢測(cè)系統(tǒng)。常用的物理載體包括載玻片、硅、微孔、硝酸纖維素或PVDF膜、以及磁微珠或其他微珠。盡管最常見的形式是加到平面表面的蛋白微滴，其他的結(jié)構(gòu)包括基于微流體(microfluidics)發(fā)展(Gyros，Monmouth Junction，NJ)和特殊芯片設(shè)計(jì)的CD離心裝置，例如板上設(shè)計(jì)的微通道(例如The Living ChipTM，Biotrove，Woburn，MA)和硅表面的微型3D桿(Zyomyx，Hayward CA)。懸浮顆粒也可作為陣列基礎(chǔ)，條件是需對(duì)它們進(jìn)行識(shí)別編碼；系統(tǒng)包括用于微珠(Luminex，Austin，TX；Bio-Rad Laboratories)和半導(dǎo)體納米晶體(例如，QDotsTM，QuantumDot，Hayward，CA)的彩色編碼和用于珠粒(UltraPlexTM，SmartBeadTechnologies Ltd，Babraham，Cambridge，UK)和多金屬微桿(例如NanobarcodesTM顆粒，Nanoplex Technologies，Mountain View，CA)的條形編碼。珠粒也可被組裝到半導(dǎo)體芯片上的平面陣列中(LEAPStechnology，BioArray Solutions，Warren，NJ)。
蛋白的固定化涉及偶聯(lián)試劑和待偶聯(lián)表面的性質(zhì)。優(yōu)良的蛋白陣列載體表面在偶聯(lián)過程前后都是化學(xué)穩(wěn)定的、使得產(chǎn)生良好的點(diǎn)形態(tài)、表現(xiàn)出非特異性結(jié)合最少、不會(huì)增加檢測(cè)系統(tǒng)的本底并且與不同的檢測(cè)系統(tǒng)兼容。使用的固定化方法有重現(xiàn)性、適用于具有不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)(大小、親水、疏水)、適于高通量和自動(dòng)化并且與完全功能蛋白活性的保留相容。表面結(jié)合蛋白的定向被認(rèn)為是將該蛋白以活性狀態(tài)提供給配體或底物過程中的重要因素；對(duì)于捕獲陣列而言，可通過定向的捕獲試劑獲得最有效的結(jié)合結(jié)果，所述捕獲試劑通常需要對(duì)蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性標(biāo)記。
共價(jià)的和非共價(jià)的蛋白固定化方法都可使用，它們都有各種優(yōu)缺點(diǎn)。表面被動(dòng)吸附在方法上很簡(jiǎn)單，但幾乎不能進(jìn)行定量或定向控制；它可能改變或者可能不改變蛋白的功能特異性，并且可重復(fù)性和效率是可變的。共價(jià)偶聯(lián)法提供了一種穩(wěn)定的連接，可應(yīng)用于很多種蛋白質(zhì)并且具有良好的重復(fù)性；然而，取向可能是可變的，化學(xué)衍生可能會(huì)改變蛋白質(zhì)功能并且需要穩(wěn)定的相互作用表面。利用蛋白上的標(biāo)簽的生物捕獲方法可提供穩(wěn)定的連接，并且可特異地且以可重復(fù)的取向結(jié)合蛋白質(zhì)，但首先須將所述生物試劑充分固定，并且，該陣列可能需要特殊處理，其穩(wěn)定性也可能變化。
用于蛋白質(zhì)陣列構(gòu)造的多種固定化學(xué)法和標(biāo)簽已有描述。用于共價(jià)結(jié)合的底物包括用含氨基或醛的硅烷試劑包被的載玻片。在VersalinxTM系統(tǒng)(Prolinx，Bothell，WA)中，可逆的共價(jià)偶聯(lián)可通過用苯二硼酸衍生的蛋白與載體表面上固定的水楊基氧肟酸之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)。該法的本底結(jié)合低，內(nèi)部熒光弱，并且可使固定的蛋白保留功能。基于三維聚丙烯酰胺凝膠，未修飾的蛋白的非共價(jià)結(jié)合發(fā)生在例如HydroGelTM(PerkinElmer，Wellesley，MA)的多孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)部；據(jù)報(bào)道，該底物在玻璃微陣列上的本底特別低，其蛋白容量高并且可保留蛋白功能。廣泛使用的生物偶聯(lián)方法是借助于生物素/鏈親和素或者六組氨酸/Ni相互作用，并且已經(jīng)對(duì)蛋白作過適當(dāng)修飾?？蓪⑸锼鼐Y合到例如二氧化鈦(Zyomyx)或五氧化二鉭(Zeptosens，Witterswil，Switzerland)的表面上固定的聚賴氨酸骨架上。
陣列制造方法包括機(jī)器連接印刷(robotic contact printing)、噴墨、壓電點(diǎn)印和照相平板印刷。許多商業(yè)化陣列(例如PackardBiosciences)以及手動(dòng)設(shè)備(V&P Scientific)都是可獲得的?？赏ㄟ^機(jī)器將細(xì)菌集落網(wǎng)載到PVDF膜上以誘導(dǎo)原位蛋白表達(dá)。
納米陣列是點(diǎn)的大小和密度的極限，點(diǎn)為納米空間級(jí)時(shí)，能使成千上萬的反應(yīng)可在小于1平方毫米的單一芯片上進(jìn)行。BioForce Laboratories已開發(fā)了具有1521個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的85μm2的納米陣列，這相當(dāng)于每平方厘米有二千五百萬個(gè)點(diǎn)，達(dá)到了光學(xué)檢測(cè)的極限；其讀出方法為熒光法和原子力顯微術(shù)(AFM)。
熒光標(biāo)記和檢測(cè)方法被廣泛使用。用于DNA微陣列讀數(shù)的儀器同樣可適用于蛋白質(zhì)陣列。為進(jìn)行差異顯示，可用來自兩種不同細(xì)胞狀態(tài)的熒光標(biāo)記蛋白探測(cè)捕獲(例如抗體)陣列，其中將細(xì)胞裂解物與不同的熒光團(tuán)(例如Cy-3、Cy-5)直接綴合并將所述細(xì)胞裂解物混合，從而以顏色作為靶標(biāo)豐度改變的讀數(shù)?？赏ㄟ^酪胺信號(hào)放大(TSA)(PerkinElmerLifesciences)將熒光讀數(shù)靈敏度放大10-100倍。平面導(dǎo)波技術(shù)(Zeptosens)能進(jìn)行超靈敏熒光檢測(cè)，另外還具有不干擾洗滌過程的優(yōu)點(diǎn)。也可以以藻紅蛋白作為標(biāo)記物(Luminex)或利用半導(dǎo)體納米晶體(Quantum Dot)的性質(zhì)，通過懸浮珠?；蝾w粒實(shí)現(xiàn)高靈敏度。特別是在生物技術(shù)商業(yè)領(lǐng)域中，許多新的替代讀數(shù)法已被開發(fā)出來。它們包括下述方法的變換方法表面等離子共振(HTS Biosystems，Intrinsic Bioprobes，Tempe，AZ)、滾環(huán)DNA擴(kuò)增(Molecular Staging，New Haven CT)、質(zhì)譜(Intrinsic Bioprobes；Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)、共振光散射(Genicon Sciences，San Diego，CA)和原子力顯微術(shù)(BioForceLaboratories)。
捕獲陣列構(gòu)成了可進(jìn)行表達(dá)作譜的診斷芯片和陣列的基礎(chǔ)。它們通過高親和性捕獲試劑以高通量方式結(jié)合并檢測(cè)特異的靶標(biāo)配體，所述高親和性捕獲試劑例如為常規(guī)抗體、單一結(jié)構(gòu)域、構(gòu)建的支架、肽或核酸適體。
抗體陣列具備所需的特異性性質(zhì)和可接受的本底，有些抗體陣列可商購(gòu)(BD Biosciences，San Jose，CA；Clontech，Mountain View，CA；BioRad；Sigma，St.Louis，MO)。用于捕獲陣列的抗體可通過常規(guī)免疫法(多克隆血清和雜交瘤)制備，或者作為從噬菌體或核糖體展示文庫(kù)篩選后通常用大腸桿菌表達(dá)的重組片段而制得(Cambridge Antibody Technology，Cambridge，UK；Biolnvent，Lund，Sweden；Affitech，Walnut Creek，CA；Biosite，San Diego，CA)。除了常規(guī)抗體，也可在陣列中使用Fab和scFv片段、駱駝科抗體(camelid)的單一V結(jié)構(gòu)域或改造的人類等同物(Domantis，Waltham，MA)。
術(shù)語“支架”是指蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它被改造成能結(jié)合多種靶標(biāo)分子的具有抗體樣特異性和親和性的多種變體。所述變體可通過遺傳文庫(kù)的形式產(chǎn)生，并且可通過噬菌體、細(xì)菌或核糖體展示針對(duì)個(gè)體靶標(biāo)進(jìn)行篩選。這類配體結(jié)合支架或骨架包括基于葡萄球菌蛋白A的“Affibody”(Affibody，Bromma，Sweden)、基于纖連蛋白的“Trinectin”(Phylos，Lexington，MA)和基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白結(jié)構(gòu)的“Anticalin”(PierisProteolab，F(xiàn)reising-Weihenstephan，Germany)。它們?cè)诓东@陣列中的使用方式類似抗體，并且具有耐用性好且容易生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
陣列中也可使用非蛋白捕獲分子，特別是以高特異性和親和性與蛋白配體結(jié)合的單鏈核酸適體(SomaLogic，Boulder，C0)。適體是通過SelexTM方法選自寡核苷酸文庫(kù)的，它們與蛋白質(zhì)的相互作用可通過摻入溴化脫氧尿苷和UV活化的交聯(lián)作用(光適體)，以共價(jià)連接方式得到增強(qiáng)。由于有特定的空間要求，與配體的光交聯(lián)可降低適體的交叉反應(yīng)性。適體具有容易通過自動(dòng)寡核苷酸合成生產(chǎn)、DNA的穩(wěn)定性且耐用性好的優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于光適體陣列，可使用通用的熒光蛋白染色劑檢測(cè)結(jié)合。
與抗體陣列結(jié)合的蛋白分析物的檢測(cè)可直接進(jìn)行或者通過夾心測(cè)定中的二抗進(jìn)行。直接標(biāo)記用于比較具有不同顏色的不同樣本。如果可獲得針對(duì)同一蛋白配體的抗體對(duì)，夾心免疫測(cè)定則可提供較高的特異性和靈敏度，并因此成為選擇用于低豐度蛋白例如細(xì)胞因子的方法；該測(cè)定還能檢測(cè)蛋白修飾物。包括質(zhì)譜、表面等離子共振和原子力顯微術(shù)在內(nèi)的無標(biāo)記檢測(cè)方法可避免配體的改變。對(duì)于任何方法都要求有最佳的靈敏度和特異性，以及較低背景以獲得較高的信噪比。由于分析物濃度范圍很寬，因此需對(duì)靈敏度作適當(dāng)調(diào)節(jié)；針對(duì)這一問題的解決方案是對(duì)樣本連續(xù)稀釋或者使用不同親和性的抗體。目的蛋白常常是體液或提取物中濃度很低的蛋白例如細(xì)胞因子或細(xì)胞中低表達(dá)的產(chǎn)物，因此就需要在pg范圍或更低水平上的檢測(cè)。
捕獲分子的陣列的一個(gè)替代方案是通過“分子印跡”技術(shù)實(shí)現(xiàn)，其中(例如來自蛋白C末端區(qū)域的)肽被用作模板以在可聚合基質(zhì)中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)的序列特異的洞穴；該洞穴則可特異地捕獲具有合適一級(jí)氨基酸序列的(變性)蛋白質(zhì)(ProteinPrintTM，Aspira Biosystems，Burlingame，CA)。
另一種可用于診斷和表達(dá)作譜的方法是ProteinChip

陣列(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)，其中固相色譜表面結(jié)合例如血漿或腫瘤提取物的混合物中具有類似電荷或疏水性特征的蛋白質(zhì)，并且SELDI-TOF質(zhì)譜被用于檢測(cè)保留的蛋白質(zhì)。
大型的功能芯片是通過固定大量的純化蛋白來構(gòu)建的，并用于測(cè)定多種生物化學(xué)功能，例如與其他蛋白之間的蛋白相互作用、藥物-靶標(biāo)相互作用、酶-底物相互作用等。通常它們需要一種表達(dá)文庫(kù)，被克隆到大腸桿菌、酵母等中，然后例如通過His標(biāo)簽從中純化表達(dá)的蛋白并固定化。對(duì)于不能在細(xì)菌或其他體內(nèi)系統(tǒng)中良好表達(dá)的蛋白的合成而言，獨(dú)立于細(xì)胞的蛋白轉(zhuǎn)錄/翻譯是可行的替代方法。
對(duì)于蛋白-蛋白相互作用的檢測(cè)，蛋白質(zhì)陣列可成為所述基于細(xì)胞的酵母雙雜交系統(tǒng)的體外替代方案，并且當(dāng)該雙雜交系統(tǒng)有缺陷時(shí)，例如相互作用涉及分泌的蛋白或具有二硫橋的蛋白時(shí)，該陣列是有用的。用陣列對(duì)酵母蛋白激酶和酵母蛋白質(zhì)組的各種功能(蛋白-蛋白和蛋白脂質(zhì)相互作用)進(jìn)行的生物活性的高通量分析已有描述，其中酵母的所有可譯框架中的大部分都被表達(dá)并固定在微陣列上。大型“蛋白質(zhì)組芯片”在識(shí)別功能相互作用、藥物篩選等方面具有很好的應(yīng)用前景(Proteometrix，Branford，CT)。
作為個(gè)體元素的二維展示，蛋白陣列可用于篩選噬菌體或核糖體展示文庫(kù)，從而篩選出特異結(jié)合的配偶體，包括抗體、合成的支架、肽和適體?？赏ㄟ^這種方式進(jìn)行“文庫(kù)對(duì)文庫(kù)”的篩選。本方法的另一個(gè)應(yīng)用是，從針對(duì)一種陣列的組合化學(xué)文庫(kù)中篩選藥物候選物，所述陣列是基因組項(xiàng)目中識(shí)別出的蛋白靶標(biāo)的陣列。
例如BDTM細(xì)胞計(jì)量珠粒陣列的多珠粒測(cè)定是一系列可用于捕獲可溶性分析物并對(duì)其定量的光譜不連續(xù)顆粒。所述分析物再通過熒光發(fā)射檢測(cè)和流式細(xì)胞分析來測(cè)定。多珠粒測(cè)定產(chǎn)生與基于ELISA的測(cè)定相當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)，但是是以一種“多重”或同時(shí)的方式。以與任何夾心形式的測(cè)定法相同的方式計(jì)算細(xì)胞計(jì)量珠粒陣列的未知物濃度，即通過使用已知的標(biāo)準(zhǔn)樣并且將未知物繪制到標(biāo)準(zhǔn)曲線上。此外，多珠粒測(cè)定使得能夠?qū)颖局邢惹坝捎跇颖倔w積限制而從未考慮的可溶性分析物進(jìn)行定量。除了定量的數(shù)據(jù)，還可產(chǎn)生顯示獨(dú)特譜或特征的有效可視圖像，所述獨(dú)特譜或特征提供了用戶只需掃視一眼即可獲得附加的信息。
本文公開的MMP/TIMP譜是基于對(duì)單獨(dú)的MMP或TIMP的測(cè)量?？赏ㄟ^任何已知可提供一種示出在所述分析樣本中存在多少M(fèi)MP或TIMP的可用標(biāo)識(shí)的方法測(cè)量它們的量。測(cè)量方法的實(shí)例在實(shí)施例部分給出。分析物(例如MPP或TIMP)的定量方法包括對(duì)不存在的或者以不可檢測(cè)量存在的分析物的測(cè)量。
構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)的用于測(cè)量MMP和TIMP的技術(shù)和方法是基于高靈敏的免疫測(cè)定。這類免疫測(cè)定中有多種都是由本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的(即TIMP-4測(cè)定的測(cè)量法)。通過酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)進(jìn)行免疫測(cè)定，該免疫測(cè)定被標(biāo)準(zhǔn)化以提供表4所示的測(cè)量值。然而，本實(shí)驗(yàn)室施行了其他更靈敏快速的用于測(cè)量MMP和TIMP血液水平的方法，它們包括使用多重測(cè)定系統(tǒng)。在該實(shí)例中，可使用基于珠粒的多重夾心免疫測(cè)定來測(cè)量有限體積的樣本(例如血漿或其他生物樣本)中的多種分析物。這種用于多重分析的新技術(shù)是基于將ELISA的靈敏度和流式細(xì)胞檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)之上的，從而使得可以特異地測(cè)量不到50μl的單個(gè)樣本中最多達(dá)100種的不同分析物。該方法使得可以測(cè)量小量血樣中的多種MMP和TIMP。這類方法非常適合本文所描述的診斷、預(yù)后、預(yù)測(cè)和治療的監(jiān)測(cè)應(yīng)用。具體而言，為同時(shí)測(cè)量分析物濃度，將微珠與樣本(即血樣)一起孵育，并使所述微珠與所述特定目的分析物(即MMP)形成復(fù)合體。然后，向混合物中加入特異性針對(duì)各分析物上第二表位的檢測(cè)抗體(生物素化的)，并且使所述檢測(cè)抗體結(jié)合到所述已與分析物結(jié)合的微珠上。然后將該混合物與熒光報(bào)告分子(鏈親和素-藻紅蛋白)一起孵育，并使整個(gè)樣本通過雙激光流式細(xì)胞檢測(cè)儀。一個(gè)激光檢測(cè)用于確定待檢測(cè)的特定分析物的微珠的確切熒光，另一個(gè)激光檢測(cè)報(bào)告分子的熒光量，該量與所結(jié)合的分析物的量成正比。該方法已被用于多種MMP以及CHF過程可能涉及的其他分析物，如圖8和表1所示。這只是如何用極少量血樣測(cè)量單一或多種分析物的一個(gè)實(shí)例。已施行的與MMP/TIMP分析物相關(guān)的測(cè)量的其他實(shí)例包括放射免疫測(cè)定和免疫印跡測(cè)定。這些方法也是基于抗體。
表1用于對(duì)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正和線性回歸統(tǒng)計(jì)的分析物濃度范圍
7.抗體 特異性針對(duì)MMP和TIMP的抗體是已知的，并且可商購(gòu)。表2給出了抗體的實(shí)例。
表2MMP/TIMP抗體


本文中術(shù)語“抗體”作廣義使用，它包括多克隆抗體和單克隆抗體。除了完整的免疫球蛋白外，術(shù)語“抗體”還包括所述免疫球蛋白分子的片段或多聚物以及人類或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要根據(jù)它們與MMP或TIMP相互作用的能力來對(duì)其選擇即可?？墒褂帽疚乃龅捏w外測(cè)定或類似方法來測(cè)試抗體的所需活性，之后根據(jù)已知的臨床試驗(yàn)方法測(cè)定它們的體內(nèi)治療和/或預(yù)防活性。
本文使用的“術(shù)語”是指從基本上均一的抗體群體中獲得的抗體，即，該群體中的個(gè)體抗體相同，除了可存在于少量抗體分子中的可能存在的天然突變。本文的單克隆抗體特別地包括“嵌合抗體”及其片段，只要它們顯示出所需的拮抗活性，其中所述“嵌合抗體”中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自一種特定物種的抗體或?qū)儆谝环N特定抗體類別或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的其他部分與來自另一物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源(參見美國(guó)專利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。
所公開的單克隆抗體可用任何生產(chǎn)單克隆抗體的方法制備。例如，可用雜交瘤方法制備公開的單克隆抗體，例如Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)中所述。在雜交瘤法中，通常用免疫劑免疫小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物，以引發(fā)能產(chǎn)生或產(chǎn)生可與該免疫劑特異地結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。
也可用重組DNA法制備單克隆抗體，例如美國(guó)專利4,816,567(Cabilly等人)中所述。編碼所公開的單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法(例如，使用能特異地結(jié)合編碼鼠類抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離和測(cè)序。也可采用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生和篩選抗體或活性抗體片段的文庫(kù)，例如，如Burton等人的美國(guó)專利5,804,440和Barbas等人的美國(guó)專利6,096,441所述。
體外方法也適于制備單價(jià)抗體?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)方法消化抗體以產(chǎn)生抗體片段，特別是Fab片段。例如，可使用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化。木瓜蛋白酶消化的實(shí)例在1994年12月22日公開的WO 94/29348和美國(guó)專利4,342,566中有描述?？贵w的木瓜蛋白酶消化通常產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段以及余下的Fc片段，上述抗原結(jié)合片段稱為Fab片段，每個(gè)片段具有單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)。胃蛋白酶處理可得到具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能交聯(lián)抗原的片段。
不論是否與其他序列相連接，所述片段也可包含特定區(qū)域或特定氨基酸殘基的插入、缺失、取代或其他選定的修飾，條件是，與未修飾的抗體或抗體片段相比，不顯著改變或損害該抗體或抗體片段的活性。這類修飾可提供某些其他特性，例如，去除/添加能進(jìn)行二硫鍵合的氨基酸、提高其生物壽命、改變其分泌特征等。任何情況下，所述抗體或抗體片段都須具有生物活性，例如與其相關(guān)抗原特異地結(jié)合。所述抗體或抗體片段的功能性或活性區(qū)域可通過對(duì)蛋白質(zhì)特定區(qū)域誘變以及隨后進(jìn)行表達(dá)并且測(cè)試表達(dá)的多肽來識(shí)別。這類方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，可包括對(duì)編碼所述抗體或抗體片段的核酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變(Zoller，MJ.Curr.Opin.Biotechnol.3348-354，1992)。
本文所使用的術(shù)語“抗體”也可指人類抗體和/或人源化抗體。很多非人類抗體(例如來源于小鼠、大鼠或兔的抗體)天然地對(duì)人類具有抗原性，因此，當(dāng)將其給予人類時(shí)會(huì)產(chǎn)生不良的免疫反應(yīng)。因此，在所述方法中使用人類或人源化抗體可降低給予人類的抗體引起不良免疫反應(yīng)的可能性。
8.參照值 提供了可指示受試者中DHF的存在或預(yù)測(cè)受試者中DHF的發(fā)生的MMP和/或TIMP譜。所述指示受試者中DHF的存在或預(yù)測(cè)受試者中DHF的發(fā)生的MMP和/或TIMP譜可以是相對(duì)于正常值的數(shù)值。給定分析物(MMP或TIMP)的正常值可以是被證實(shí)無明顯心血管疾病跡象的年齡匹配受試者的參照值。因此，所述正常值可以是來自大量健康個(gè)體的群體值。這些參照正常值可通過群體研究獲得。已有大型群體研究例如測(cè)定出參比組的TIMP-1的相對(duì)水平(Framingham Heart Study，Circulation 2004；1092850-2856)大約為800ng/mL，該值與本文公開的參比對(duì)照值一致。
或者，所述正常值可以是被認(rèn)為對(duì)于既定受試者而言是正常的數(shù)值。例如，可以對(duì)健康個(gè)體的相關(guān)分析物進(jìn)行基線測(cè)量，并將其用于和后來從該個(gè)體獲得的測(cè)量值相比較，以識(shí)別當(dāng)前的疾病或向高血壓性心臟病發(fā)展的進(jìn)程。
不連續(xù)觀察(例如MMP-13的)是將連續(xù)變量(例如給定分析物的血漿濃度)轉(zhuǎn)變?yōu)槎肿兞俊Ｔ谠摼唧w實(shí)例中，若大于10ng/mL的值被認(rèn)為是可檢測(cè)的或者陽性數(shù)值，小于10ng/mL的值被認(rèn)為是陰性數(shù)值時(shí)，則可將一個(gè)+/-值賦予MMP-13。
例如，提供了一種診斷受試者體內(nèi)不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH的方法，包括測(cè)量所述受試者組織或體液中的MMP和/或TIMP水平，并將所述水平與參照值進(jìn)行比較。因此，MMP-2、MMP-9、MMP-7、MMP-13、MMP-8、TIMP-1、TIMP-2和/或TIMP-4的正常值即為表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的左心室肥大的標(biāo)識(shí)。
在某些方面，正常范圍內(nèi)的MMP-2血漿水平表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。在某些方面，正常范圍內(nèi)的MMP-9血漿水平表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。在某些方面，正常范圍內(nèi)的MMP-13血漿水平表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。在某些方面，正常范圍內(nèi)的TIMP-1血漿水平表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。在某些方面，正常范圍內(nèi)的TIMP-2血漿水平表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。在某些方面，正常范圍內(nèi)的TIMP-4血漿水平表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，MMP-2血漿水平高于約1000ng/ml，包括高于約1000、1100、1200、1300、1400和1500ng/ml時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，MMP-9血漿水平低于約20ng/ml，包括低于約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，可檢測(cè)的MMP-13血漿水平高于約5ng/ml，包括低于約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20ng/ml時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，TIMP-1血漿水平低于約1000ng/ml，包括高于約1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20或10ng/ml時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，TIMP-2血漿水平低于約50ng/ml，包括高于約50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、35、30、25、20、15或10ng/ml時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，TIMP-4血漿水平低于約2ng/ml，包括高于約2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.5或0.1ng/ml時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
所述方法可進(jìn)一步包括測(cè)量?jī)煞N或多種MMP和/或TIMP的血漿水平。例如，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-9、MMP-7、MMP-13、MMP-8、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4中的兩種、三種、四種、五種、六種、七種或八種。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2和MMP-9或者M(jìn)MP-2和MMP-7、MMP-2和MMP-13、MMP-2和MMP-8、MMP-2和TIMP-1、MMP-2和TIMP-2、MMP-2和TIMP-4、MMP-9和MMP-7、MMP-9和MMP-13、MMP-9和MMP-8、MMP-9和TIMP-1、MMP-9和TIMP-2、MMP-9和TIMP-4、MMP-7和MMP-13、MMP-7和MMP-8、MMP-7和TIMP-1、MMP-7和TIMP-2、MMP-7和TIMP-4、MMP-13和MMP-8、MMP-13和TIMP-1、MMP-13和TIMP-13、MMP-13和TIMP-4、MMP-8和TIMP-1、MMP-8和TIMP-2、MMP-8和TIMP-4、TIMP-1和TIMP-2、TIMP-1和TIMP-4、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-13和TIMP-1；MMP-2、MMP-13和TIMP-2；MMP-2、MMP-13和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-13、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-2、MMP-13、TIMP-2和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4；MMP-2、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。本文也考慮和公開了這些分析物的其他組合。
所述方法可進(jìn)一步包括計(jì)算一種或多種MMP或TIMP與其他的MMP或TIMP的比值，例如所述方法可包括計(jì)算MMP-9與TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值。
例如，在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比大于約7×103，包括大于約7×103、8×103、9×103、10×103、11×103、12×103、13×103或14×103時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比大于約10×104，包括大于約10×104，20×104，30×104或40×104時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血漿水平之比大于約1，包括大于約1、2、3、4、5、6、7、8或9時(shí)，即表示不存在與高血壓性心臟病相關(guān)的LVH。
所述參照正常值和在對(duì)高血樣患者篩選時(shí)測(cè)得的數(shù)值示于表3中。在該實(shí)例中，患有LVH的高血壓患者的MMP-2值會(huì)降低，但MMP-7值不變。然而，將對(duì)MMP-13進(jìn)行不連續(xù)觀察，因?yàn)樗诨加蠰VH的高血壓患者中檢測(cè)不到。因此，低于10ng/mL的分界點(diǎn)被認(rèn)為是高血壓和心力衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)。與參比對(duì)照值相比，患有LVH的高血壓患者的TIMP-1和TIMP-4水平可高50％。與參照正常值相比，患有LVH的高血壓患者的MMP-9/TIMP-4之比降低50％以上。
表3MMP和TIMP數(shù)據(jù)；參照正常值和高血壓性心臟病；診斷百分比分界點(diǎn)
NC＝相對(duì)于正常無變化 *與正常相比，p<0.05 9.LVH快速篩選 提供了一種可通過測(cè)定一種具體的MMP即MMP-13的水平獲得的“是/否”型快速結(jié)果?？蓪⒁粋€(gè)調(diào)定點(diǎn)——可根據(jù)年齡的改變和群體統(tǒng)計(jì)學(xué)而加以調(diào)整——用作為所述有效的讀數(shù)。例如，低于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/mL的閾值設(shè)置的MMP-13水平將使得需要更深入的血漿篩選和其他心血管成像研究。換言之，這種快速篩選測(cè)試可應(yīng)用于任何大型群體，然后可識(shí)別出那些可保證更嚴(yán)格的試驗(yàn)和隨訪的受試者。目前還沒有可用于識(shí)別LVH患者的快速篩選測(cè)試。
提供了一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量受試者體液中MMP-13的量，量小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/mL或者檢測(cè)不到即表示存在LVH并預(yù)示DHF。當(dāng)結(jié)合本文公開的其他相關(guān)分析物的異常測(cè)量值時(shí)，上述測(cè)量能檢測(cè)DHF。
可以在初步試驗(yàn)或醫(yī)學(xué)篩選時(shí)進(jìn)行血漿作譜?？舍槍?duì)一種或多種MMP和/或TIMP進(jìn)行上述篩選測(cè)量。如果所述一個(gè)或多個(gè)測(cè)量值落在參照值之外，則可進(jìn)行其他的測(cè)量。例如，可用MMP-13進(jìn)行初步篩選，這樣，如果檢測(cè)不到MMP-13，則可對(duì)該血漿樣本進(jìn)行另一測(cè)定。類似地，也可用MMP-9和TIMP-1、TIMP-2和/或TIMP-4進(jìn)行初步篩選，這樣，如果MMP-9與TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值低于具有確定閾值的正常限度時(shí)，則可對(duì)血漿樣本進(jìn)行另一測(cè)定。所述另一測(cè)定可用于獲得表3所示的全部譜或其一部分。如果該譜達(dá)到高血壓心臟病的標(biāo)準(zhǔn)，則可通過更強(qiáng)效的測(cè)試評(píng)價(jià)所述患者，所述測(cè)試可包括合適的超聲心動(dòng)圖顯象、導(dǎo)管插入術(shù)、核成像。也可對(duì)患者進(jìn)行更強(qiáng)效的醫(yī)學(xué)處理評(píng)價(jià)。
10.診斷 還提供了一種可用于例如以下一種受試者的診斷方法，所述受試者表現(xiàn)出CHF征候和癥狀，但該表現(xiàn)的根本原因難以確定。這種情況極其頻繁地發(fā)生；當(dāng)患者患有CHF時(shí)，很難確定是否存在LVH和DHF，以及它們是否會(huì)促進(jìn)CHF過程的加劇。本申請(qǐng)所述的一種簡(jiǎn)單快速地“確定”或“排除”LVH和DHF存在的血液測(cè)試的應(yīng)用，可提供這種所需的診斷方法。具體而言，可測(cè)量血樣的MMP-13、MMP-9、MMP-2、TIMP-1和/或TIMP-4?？蓪@得的數(shù)值與本文公開的正常參照值進(jìn)行比較。如果該值偏離由本文確定的閾值表示的正常限度，則可確定患者具有DHF。
例如，提供了一種診斷受試者的LVH的方法，包括測(cè)量所述受試者組織或體液中的MMP和/或TIMP水平，并將所述水平與參照值進(jìn)行比較。
在某些方面，MMP-2血漿水平低于正常值時(shí)即表示有高血壓性心臟病。例如，MMP-2的量比正常平均值至少低約20％時(shí)可表示有高血壓性心臟病。在某些方面，MMP-2血漿水平低于約1000ng/ml，包括低于約1000、990、980、970、960、950、940、930、920、920、900、890、880、870、860、850、840、830、820、810、800、790、780、770、760、750、740、730、720、710、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、250或100ng/ml時(shí)即表示有高血壓性心臟病。
在某些方面，MMP-9血漿水平高于正常值時(shí)即表示有高血壓性心臟病。例如，MMP-9的量比正常平均值至少高約50％時(shí)，可表示有高血壓性心臟病。在某些方面，MMP-9血漿水平高于約20ng/ml，包括高于約20、21、22、23、24、15、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml時(shí)即表示有高血壓性心臟病。
在某些方面，MMP-13血漿水平檢測(cè)不到時(shí)即表示有LVH。在某些方面，MMP-13血漿水平低于約10ng/ml，包括低于約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml時(shí)即表示有LVH。
在某些方面，TIMP-1血漿水平高于正常值時(shí)即表示有高血壓性心臟病。例如，TIMP-1的量比正常平均值至少高約50％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，TIMP-1血漿水平高于約1000ng/ml，包括高于約1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400或1500ng/ml時(shí)即表示有LVH。
在某些方面，TIMP-2血漿水平高于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，TIMP-2的量比正常平均值至少高約50％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，TIMP-2血漿水平高于約50ng/ml，包括高于約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml時(shí)即表示有LVH。
在某些方面，TIMP-4血漿水平高于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，TIMP-4的量比正常平均值至少高約50％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，TIMP-4血漿水平高于約2ng/ml，包括高于約2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/ml時(shí)即表示有LVH。
在某些方面，MMP-7血漿水平在正常范圍內(nèi)時(shí)可表示有LVH。在某些方面，MMP-8血漿水平在正常范圍內(nèi)時(shí)可表示有LVH。
所述方法可進(jìn)一步包括測(cè)量?jī)煞N或多種MMP和/或TIMP的血漿水平。例如，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-9、MMP-7、MMP-13、MMP-8、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4中的兩種、三種、四種、五種、六種、七種或八種。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2和MMP-9；MMP-2和MMP-13；MMP-13和TIMP-1；MMP-13和TIMP-2；MMP-13和TIMP-4；MMP-2，MMP-13和TIMP-1；MMP-2，MMP-13和TIMP-2；MMP-2，MMP-13和TIMP-4；或者M(jìn)MP-2、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。本文考慮并公開了上述分析物的其他組合。
例如，當(dāng)TIMP-1增加(TIMP-1>1200ng/mL)且MMP-13水平降低時(shí)，即可檢出DHF。又例如，當(dāng)TIMP-4的量高于3ng/mL，且MMP-13水平降低、TIMP-1水平增加時(shí)，就表明有LVH并可預(yù)測(cè)DHF。因此，一種檢測(cè)受試者LVH并預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量受試者體液中的MMP-13、TIMP-1和TIMP-4的譜。MMP-13的量檢測(cè)不到、TIMP-1的量比正常值高約50％(或高于1200ng/mL)且TIMP-4的量比正常值至少高約50％(或高于3ng/mL)時(shí)的譜預(yù)示DHF。
所述方法可進(jìn)一步包括計(jì)算一種或多種MMP或TIMP與其他MMP或TIMP的比值。例如，所述方法可包括計(jì)算MMP-9與TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-1之比比正常平均值至少小約50％時(shí)，可表示有LVH。例如，在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于約7×103，包括小于約7×103、6×103、5×103、4×103、5×103、6×103、1×103時(shí)，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-2之比比正常平均值至少小約50％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于約100×103，包括小于約100×103、90×103、80×103、70×103、60×103、50×103、40×103、30×103、20×103或10×103時(shí)，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-4之比比正常平均值至少小約50％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于約3，包括小于約3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01時(shí)，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于約5×103，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于約100×103，以及MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于約1時(shí)，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-2血漿水平小于約1000ng/ml，MMP-13血漿水平小于約5ng/ml，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于約5×103，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于約100×103，以及MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于約1時(shí)，即表示有LVH。
11.預(yù)后 還提供了一種可用于例如以下一種受試者的舒張期心力衰竭的預(yù)后方法，所述選用于進(jìn)行篩選以及之后進(jìn)一步的血漿作譜的受試者被證實(shí)患有嚴(yán)重的LVH并且具有發(fā)生DHF的風(fēng)險(xiǎn)。在該情況中，對(duì)MMP-13水平以及TIMP水平定量。MMP-13水平較低/檢測(cè)不到(0-5ng/mL)，且TIMP水平與對(duì)照正常受試者TIMP水平相比較高(例如TIMP-1>1200ng/mL、TIMP-2>700ng/mL和/或TIMP-4>3ng/mL)時(shí)，可能會(huì)得出反映心肌纖維化和舒張期功能障礙程度的重要觀察結(jié)果。這就提供了關(guān)于癥狀發(fā)展和住院治療進(jìn)程的預(yù)后值。具體而言，可用高血壓藥物對(duì)這些患者進(jìn)行進(jìn)一步加強(qiáng)治療，并可對(duì)其進(jìn)行更常規(guī)的心血管成像研究。
例如，提供了一種識(shí)別發(fā)生舒張期心力衰竭(DHF)的風(fēng)險(xiǎn)增加的患者的方法，包括測(cè)量所述受試者組織或體液中的MMP和/或TIMP水平，并將所述水平與參照值進(jìn)行比較。
在某些方面，MMP-2血漿水平低于正常值時(shí)即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。例如，MMP-2的量比正常平均值至少低約20％時(shí)，可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，MMP-2血漿水平低于約500ng/ml，包括低于約500、450、400、350、300、250、200、250或100ng/ml時(shí)，即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在某些方面，MMP-13血漿水平檢測(cè)不到時(shí)即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，MMP-13血漿水平低于約10ng/ml，包括低于約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml時(shí)，即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在某些方面，TIMP-1血漿水平高于正常值時(shí)即表示發(fā)生舒張期心理衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。例如，TIMP-1的量比正常平均值高至少約50％時(shí)，可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，TIMP-1血漿水平高于約1000ng/ml，包括高于約1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000ng/ml時(shí)，即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在某些方面，TIMP-2血漿水平高于正常值時(shí)即表示發(fā)生舒張期心理衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。例如，TIMP-2的量比正常平均值高至少約50％時(shí)，可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，TIMP-2血漿水平高于約50ng/ml，包括高于約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml時(shí)，即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在某些方面，TIMP-4血漿水平高于正常值時(shí)即表示發(fā)生舒張期心理衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。例如，TIMP-4的量比正常平均值高至少約50％時(shí)，可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，TIMP-4血漿水平高于約2ng/ml，包括高于約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml時(shí)，即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在某些方面，MMP-9血漿水平在正常范圍內(nèi)時(shí)可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，MMP-7血漿水平在正常范圍內(nèi)時(shí)可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。在某些方面，MMP-8血漿水平在正常范圍內(nèi)時(shí)可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
所述方法可進(jìn)一步包括測(cè)量?jī)煞N或多種MMP和/或TIMP的血漿水平。例如，所述方法可包括測(cè)量MMP-2，MMP-9，MMP-7，MMP-13，MMP-8，TIMP-1，TIMP-2和TIMP-4中的兩種、三種、四種、五種、六種、七種或八種。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2和MMP-9、MMP-2和MMP-7、MMP-2和MMP-13、MMP-2和MMP-8、MMP-2和TIMP-1、MMP-2和TIMP-2、MMP-2和TIMP-4、MMP-9和MMP-7、MMP-9和MMP-13、MMP-9和MMP-8、MMP-9和TIMP-1、MMP-9和TIMP-2、MMP-9和TIMP-4、MMP-7和MMP-13、MMP-7和MMP-8、MMP-7和TIMP-1、MMP-7和TIMP-2、MMP-7和TIMP-4、MMP-13和MMP-8、MMP-13和TIMP-1、MMP-13和TIMP-13、MMP-13和TIMP-4、MMP-8和TIMP-1、MMP-8和TIMP-2、MMP-8和TIMP-4、TIMP-1和TIMP-2、TIMP-1和TIMP-4、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-13和TIMP-1；MMP-2、MMP-13和TIMP-2；MMP-2、MMP-13和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-13、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-2、MMP-13、TIMP-2和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1、TIMP-2，和TIMP-4；MMP-2、TIMP-1、TIMP-2，和TIMP-4。因此，所述方法可包括測(cè)量MMP-2、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。本文還考慮和公開了這些分析物的其他組合。
例如，提供了一種檢測(cè)受試者的舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中的MMP-13、TIMP-1、TIMP-4和MMP-9的量。還提供了一種預(yù)測(cè)受試者的舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中的MMP-13、TIMP-1、TIMP-4和MMP-9的量。在這些方法中，可顯示出MMP-13的量檢測(cè)不到(或低于10ng/mL)、TIMP-1的量比正常值高約50％或高于1200ng/mL、TIMP-4的量比正常值至少高約50％或高于3ng/mL，以及MMP-9的量比正常值至少高約50％的譜可檢出LVH和DHF。
還提供了一種檢測(cè)受試者的舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中的MMP-13、TIMP-1，TIMP-4和MMP-2的量。還提供了一種預(yù)測(cè)受試者的舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中MMP-13、TIMP-1，TIMP-4和MMP-2的量。在這些方法中，譜圖可顯示出MMP-13的量檢測(cè)不到(或低于10ng/mL)、TIMP-1的量比正常值高約50％(或高于1200ng/mL)、TIMP-4的量比正常值至少高約50％(或高于3ng/mL)、以及MMP-2的量比正常值至少高約20％。
所述方法可進(jìn)一步包括計(jì)算一種或多種MMP或TIMP與其他MMP或TIMP的比值。例如所述方法可包括計(jì)算MMP-9與TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-1之比比正常平均值至少小約50％時(shí)，可表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。例如，在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于約7×103，包括小于約7×103、6×103、5×103、4×103、5×103、6×103、1×103、9×102、8×102、7×102、6×102、5×102、4×102、3×102、2×102或1×102時(shí)，即表示發(fā)生舒張期心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-2之比比正常平均值至少小約50％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于約100×103，包括小于約100×103、90×103、80×103、70×103、60×103、50×103、40×103、30×103、20×103、10×103、9×103、8×103、7×103、6×103、5×103、4×103、3×103、2×103或1×103時(shí)，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于正常值時(shí)即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-4之比比正常平均值至少小約100％時(shí)，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于約1，包括約1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.25、0.2、0.15、0.10、0.05或0.01時(shí)，即表示有LVH。
因此，所述方法提供了一種檢測(cè)或預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括檢測(cè)到所述受試者體液的MMP-9與TIMP-4之比比提供的正常比值低。所述方法包括測(cè)量到該比值比正常比值低至少約50％。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于約5×103，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于約100×103，以及MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于約1時(shí)，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-2血漿水平小于約1000ng/ml，MMP-13血漿水平小于約5ng/ml，MMP-9/TIMP-1血漿水平之比小于約5×103，MMP-9/TIMP-2血漿水平之比小于約100×103，以及MMP-9/TIMP-4血漿水平之比小于約1時(shí)，即表示有LVH。
12.指導(dǎo)治療性干預(yù) 在治療中，MMP-13低水平和TIMP-1高水平可作為藥物療效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。有多種高度適用上述指標(biāo)的相關(guān)臨床狀況。例如，當(dāng)高血壓患者的血壓在“正常限度”內(nèi)時(shí)，MMP-13水平降低，TIMP水平升高。于是可使用增加某些高血壓藥物以使這些心肌纖維化和舒張期心力衰竭的生物標(biāo)記正常。該方法的目標(biāo)是連續(xù)測(cè)量如表3所示的血液MMP和TIMP值，以及增加用藥以使這些譜在正常參照范圍內(nèi)。
對(duì)于被確定因高血壓致使心臟質(zhì)量(大小)增加的高血壓患者，MMP/TIMP譜可用于跟蹤治療的適當(dāng)性?？蓪?duì)本文公開的這些已識(shí)別出的特定譜進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述MMP/TIMP譜向正常范圍移動(dòng)時(shí)可確定治療有效。
MMP/TIMP譜是基于對(duì)單個(gè)MMP或TIMP的測(cè)量。它們的量可通過任何已知的方法測(cè)量，以提供一種可接受的指標(biāo)以指示它們?cè)谒治龅臉颖局械暮俊?shí)施例部分給出了測(cè)量方法的一個(gè)實(shí)例。測(cè)量分析物(例如，MMP或TIMP)量的方法包括分析物不存在或分析物不可檢測(cè)時(shí)對(duì)分析物量的測(cè)量。用于構(gòu)成該方法基礎(chǔ)的MMP和TIMP的測(cè)量技術(shù)和方法基于高靈敏免疫測(cè)定。這些免疫測(cè)定中有多種均由本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)(即，TIMP-4測(cè)定測(cè)量法)。
可將免疫測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)化以提供表1所示的測(cè)量值，用酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)實(shí)施該免疫測(cè)定方法。然而，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)施行了其他更靈敏快速的MMP和TIMP血液水平測(cè)量方法，它們包括使用一種多重測(cè)定系統(tǒng)。在該實(shí)例中，可使用基于珠粒的多重夾心免疫測(cè)定來測(cè)量有限體積的樣本(例如血漿或其他生物樣本)中的多種分析物。這種用于多重分析的新技術(shù)是基于將ELISA的靈敏度和流式細(xì)胞檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)之上的，從而使得可以特異地測(cè)量不到50μl的單個(gè)樣本中最多達(dá)100種的不同分析物。該方法使得可以測(cè)量小量血樣中的多種MMP和TIMP。這類方法可用于本文所描述的診斷、預(yù)后、預(yù)測(cè)和治療監(jiān)測(cè)應(yīng)用。具體而言，為同時(shí)測(cè)量分析物濃度，將微珠與樣本(即血樣)一起孵育，并使得所述微珠與所述特定目的分析物(即MMP)形成復(fù)合體。然后，向混合物中加入特異性針對(duì)各分析物上第二表位的檢測(cè)抗體(生物素化的)，并使其與復(fù)合了分析物的珠粒結(jié)合。然后，將該混合物與熒光報(bào)告分子(鏈親和素-藻紅蛋白)一起孵育，并使整個(gè)樣本通過雙激光流式細(xì)胞檢測(cè)儀。一個(gè)激光檢測(cè)用于確定待檢測(cè)的特定分析物的微珠的確切熒光，另一個(gè)激光檢測(cè)報(bào)告分子的熒光量，該量與所結(jié)合的分析物的量成正比。該方法已被用于多種MMP以及CHF過程可能涉及的其他分析物，如圖16和表1所示。這只是如何用極少量血樣測(cè)量單一或多種分析物的一個(gè)實(shí)例。本實(shí)驗(yàn)室已施行的與MMP/TIMP分析物相關(guān)的測(cè)量的其他實(shí)例包括放射免疫測(cè)定和免疫印跡測(cè)定。這些方法也是基于抗體。
13.組合 本文公開的方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)心力衰竭的其他標(biāo)記。例如，本文公開的方法可進(jìn)一步包括測(cè)量所述受試者組織或體液中的NT-proBNP水平，并將所述水平與參照值進(jìn)行比較。本文公開的方法可進(jìn)一步包括測(cè)量所述受試者組織或體液中的肌鈣蛋白-I的水平，并將所述水平與參照值進(jìn)行比較。
14.測(cè)量時(shí)機(jī) 如下文所述以及其他用于篩選和治療監(jiān)測(cè)的實(shí)施例所說明的，測(cè)量時(shí)機(jī)應(yīng)結(jié)合特定的背景。對(duì)于篩選，可以在受試者進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查的任何時(shí)候進(jìn)行。其實(shí)例可包括每年的體格檢查、保健展會(huì)以及借助家用裝置的篩選。因此，所公開的診斷方法可用于診斷表現(xiàn)出CHF征候和癥狀但該表現(xiàn)的根本原因難以確定的受試者。
存在至少三個(gè)用于本文所公開方法的MMP/TIMP作譜的初始時(shí)間點(diǎn)。初始測(cè)量可在具有確定的高血壓病史且經(jīng)常訪問門診的患者中進(jìn)行。初始測(cè)量可在可能導(dǎo)致門診訪問的保健展會(huì)時(shí)進(jìn)行。初始測(cè)量可在表現(xiàn)出高血壓性心臟病所致的癥狀的患者中進(jìn)行。圖9A-C示出了每種情況中針對(duì)各個(gè)情況的采樣和診斷方案。
因此，公開的預(yù)后方法可用于鑒定表現(xiàn)有高血壓(血壓過高)的受試者是否有LVH或者具有發(fā)生DHF的風(fēng)險(xiǎn)。公開的預(yù)后方法也可用于鑒定表現(xiàn)出CHF征候和癥狀的受試者是否有LVH并且具有發(fā)生舒張期心力衰竭(DHF)的風(fēng)險(xiǎn)。例如，所述方法可用于向醫(yī)生訴說不適且該不適與CHF相符的患者。這樣，醫(yī)生可應(yīng)用血液測(cè)試以確定是否存在與LVH和DHF相符的MMP/TIMP譜。由此可指導(dǎo)醫(yī)生制定進(jìn)一步的診斷測(cè)試和治療計(jì)劃。
另一個(gè)采集血樣的時(shí)機(jī)的實(shí)例是在患者被識(shí)別患有確定的LVH時(shí)，可將MMP/TIMP連續(xù)監(jiān)測(cè)譜用作預(yù)測(cè)DHF進(jìn)程的工具。這些測(cè)試作為篩選工具可在任何給定的受試者中只應(yīng)用一次，或者連續(xù)應(yīng)用多次。
C.試劑盒 本文公開的試劑盒涉及可用于實(shí)施本文公開的方法的試劑。所述試劑盒可包括本文所述的任何試劑或試劑的組合，或者被認(rèn)為是實(shí)施本文公開的方法所需的或?qū)ζ溆幸娴脑噭┗蛟噭┑慕M合。例如，公開了一種用于評(píng)估受試者發(fā)生DHF風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其中的組分包括前文所述的組分。例如，MMP/TIMP試劑盒的組分可包括相關(guān)目的MMP和/或TIMP(參見表3中相關(guān)MMP和TIMP的列表)與一種檢測(cè)試劑復(fù)合所必需的試劑。在免疫測(cè)定方法的實(shí)例中，可將血樣與針對(duì)特定的MMP或TIMP的熒光標(biāo)記的抗體一起孵育，并在洗滌和非特異性結(jié)合清除步驟之后，通過測(cè)量熒光相對(duì)強(qiáng)度計(jì)算與所述目的MMP或TIMP結(jié)合的抗體量。它可以是一種非常簡(jiǎn)單的可用于篩選的試劑盒，或者是一種更為復(fù)雜的測(cè)量單個(gè)樣本中的多種MMP/TIMP的系統(tǒng)。從測(cè)量一種目的MMP或TIMP到同時(shí)測(cè)量多種MMP/TIMP的多層次方法的基本原理已在前文中描述。對(duì)于篩選測(cè)定(即MMP-13)，可將小量血樣處理成血漿(離心)，并將該血漿與抗MMP-13抗體混合?？蓪⒒旌衔镌俅坞x心，通過熒光分析系統(tǒng)讀取特異性結(jié)合MMP-13的抗體。該設(shè)備和測(cè)量系統(tǒng)可容易地制成小型手提箱或桌面系統(tǒng)。上述系統(tǒng)的讀數(shù)可指示MMP-13是否低于或高于(如前文中所定義的)特定的測(cè)量閾值。
D.實(shí)施例 1.實(shí)施例1基質(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶的組織抑制劑基質(zhì)組分的蛋白水解因子的改變與高血壓心臟病的結(jié)構(gòu)、功能和臨床表現(xiàn)間的關(guān)系 方法和結(jié)果簡(jiǎn)述將103名受試者分為如下4組a)未顯示出心血管疾病的參照受試者(CTL)；b)高血壓(HTN)，血壓已控制且無LV肥大；c)高血壓，血壓已控制且有LV肥大(HTN&LVH)，但無CHF；d)高血壓，血壓已控制，LVH且CHF(HTN&LVH&CHF)，從上述受試者中獲得了血漿MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2，以及多普勒回聲心動(dòng)描記圖。與CTL相比，HTN患者的所有MMP或TIMP均無明顯改變。HTN&LVH患者的MMP-9和MMP-13降低，MMP-9升高。只有HTN&LVH&CHF患者的TIMP-1升高。TIMP-1>1200ng/mL時(shí)預(yù)示了CHF。
結(jié)論LV結(jié)構(gòu)和功能正常的高血壓患者具有正常的MMP/TIMP譜。傾向于減少ECM降解的MMP譜的改變與LV肥大和舒張期功能障礙有關(guān)。TIMP-1升高預(yù)示了存在CHF。這些數(shù)據(jù)表明，MMP/TIMP平衡的變化在高血壓心臟病的結(jié)構(gòu)、功能和臨床表現(xiàn)中具有重要作用， 方法 受試者本研究中招募了兩組受試者參比對(duì)照和LVH患者。通過當(dāng)?shù)刭Y助的保健展會(huì)和來自南卡羅萊納醫(yī)科大學(xué)員工的志愿者確定參比對(duì)照。所篩選的參比對(duì)照中，35％入選，50％符合下文所列的排除標(biāo)準(zhǔn)中的一條，15％未準(zhǔn)予參加。通過超聲心動(dòng)圖研究識(shí)別LVH患者。所篩選的患者超聲心動(dòng)圖中，10％入選，75％符合下文所列的排除標(biāo)準(zhǔn)中的一條，15％未準(zhǔn)予參加。兩組具有一些共有的排除標(biāo)準(zhǔn) 1)心肌梗塞病史，2)區(qū)域性室壁運(yùn)動(dòng)異常，3)冠狀動(dòng)脈重建手術(shù)，4)淀粉樣變、結(jié)節(jié)病、HIV、肥大性栓塞性心肌病、瓣膜性心臟病，5)射血分?jǐn)?shù)<50％，6)惡性腫瘤，7)嚴(yán)重的腎或肝功能障礙，8)風(fēng)濕性疾病，9)血壓>140/90mmHg。
有103名受試者入選本研究53名參比對(duì)照受試者和50名顯示出LVH的受試者[LV室壁厚度>1.2cm和/或LV質(zhì)量指數(shù)≥125gm/m2(表4)]?；谑欠翊嬖诟哐獕簩⒈葘?duì)照受試者細(xì)分為兩組；39名對(duì)照受試者(稱為“無高血壓的參比對(duì)照”)無高血壓病史、未顯示出心血管(CV)疾病、無心血管疾病的癥狀或體征、無心血管給藥且所有超聲心動(dòng)圖測(cè)量均在正常范圍內(nèi)(表5)；14名患者(稱為“有高血壓的參比對(duì)照”)有高動(dòng)脈壓病史、血壓已控制(經(jīng)藥物治療以達(dá)到JNC7標(biāo)準(zhǔn)，即<140/90mmHg)、無左心室肥大(Chobanian AV，et al.2003)且所有超聲心動(dòng)圖測(cè)量均在正常范圍內(nèi)(表5)。
表4左心室結(jié)構(gòu)/功能和MMP/TIMP的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)
縮寫數(shù)據(jù)以平均值+SEM表示，LV＝左心室，LVH＝高血壓性左心室肥大的患者，參比對(duì)照＝未顯示出心血管疾病的受試者，IVRT＝等容舒張時(shí)間，PCWP＝肺毛細(xì)血管楔壓，MMP＝基質(zhì)金屬蛋白酶，TIMP＝MMP組織抑制劑，*＝與參比對(duì)照相比p<0.05。
表5有高血壓和無高血壓的參比對(duì)照，有CHF和無CHF的LVH
縮寫數(shù)據(jù)以平均值+SEM表示，LV＝左心室，PCWP＝肺毛細(xì)血管楔壓，EDV＝舒張期末容積，Ea＝有效動(dòng)脈回彈率，MMP＝基質(zhì)金屬蛋白酶，TIMP＝MMP組織抑制劑，LVH＝高血壓性左心室肥大的患者，CHF＝慢性心臟病。用ANOVA和Tukey多重比較檢驗(yàn)分析所有4組間的顯著性差異，*＝與無高血壓的參比對(duì)照相比p<0.05，#＝與有高血壓的參比對(duì)照相比p<0.05，Δ＝與無CHF的LVH相比p<0.05。
基于是否存在CHF將LVH患者細(xì)分為兩組。23名血壓受控制且有LVF但無CHF的高血壓患者被稱為“無CHF的LVH”(表5)。第二亞組由26名血壓受控制且有LVH和CHF的高血壓患者組成，被稱為“有CHF的LVH”。所有這些患者顯示出符合Framingham標(biāo)準(zhǔn)(Levy D，et al.1996)定義的CHF，顯示出舒張異常(E’減小)，硬度增加(PCWP增加以及PCWP/EDV比值增加)，6分鐘的通行距離顯著減小(與無CHF的LVH組的1839±60英尺相比，有CHF的LVH組為979±86英尺，p<0.05)，EF>50％，因此，存在舒張期心力衰竭。
由患者的主治醫(yī)生而非研究者來選擇和檢測(cè)用于治療高血壓的藥物。它們包括利尿藥、腎素血管緊張素醛固酮拮抗劑(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體阻斷劑和醛固酮阻斷劑)、直接的血管擴(kuò)張藥(硝酸鹽、肼屈嗪)、α腎上腺素能阻斷劑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)阻斷劑、阿司匹林、β腎上腺素能阻斷劑和鈣通道阻斷劑?？垢哐獕褐委煹钠骄掷m(xù)時(shí)間為6.4±1.5年。
超聲心動(dòng)描記法 用裝有S-4MHz換能器的Sonos 5500系統(tǒng)獲得超聲心動(dòng)圖。使用美國(guó)超聲心動(dòng)描記術(shù)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量(Sahn DJ，et al.1978；Schiller NB，et al.1989)。用圓盤法(Schiller NB，et al.19)計(jì)算LV和左房容積。用Reichek和Devereux的公式(Devereux RB，et al.1986)計(jì)算LV質(zhì)量。對(duì)二尖瓣流入E和A波速、E/A比值、E波減速時(shí)間和等容舒張時(shí)間(IVRT)進(jìn)行多普勒測(cè)量。對(duì)二尖瓣E’和A’波速進(jìn)行組織多普勒(側(cè)二尖瓣環(huán))測(cè)量。用公式2+1/3E/E′(Nagueh SF，et al.1998)計(jì)算肺毛細(xì)血管楔壓(PCWP)。用公式收縮期末壓/每搏量來計(jì)算有效動(dòng)脈回彈率(Ea)。
MMP/TIMP血漿測(cè)量用雙位點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)檢測(cè)明膠酶(MMP-2和MMP-9)、膠原酶(MMP-13)和MMP組織抑制劑(TIMP-1和TIMP-2)。將血漿和各MMP標(biāo)準(zhǔn)物加入含有目的MMP或TIMP的抗體的預(yù)包被孔中，并洗滌。在450nm波長(zhǎng)處對(duì)所得反應(yīng)讀數(shù)(Labsystems Multiskan MCC/340，Helsinki，F(xiàn)inland)。由于MMP-13在血漿中的存在水平極其低，將MMP-13分為可檢測(cè)的和檢測(cè)不到的。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在6小時(shí)時(shí)間段內(nèi)每2小時(shí)測(cè)量MMP和TIMP，以利用單因素隨機(jī)效果ANOVA(random effects ANOVA)計(jì)算一個(gè)參比對(duì)照受試者亞組(n＝20)的個(gè)體受試者之間以及個(gè)體受試者內(nèi)的MMP/TIMP測(cè)量值的變異系數(shù)。通過個(gè)體均方誤差的平方根乘以100計(jì)算所述系數(shù)。MMP-2的患者內(nèi)變異系數(shù)＝11.2±1.1％，TIMP-1＝8.5±2.2％，TIMP-2＝14.3±1.7％。確定所述測(cè)定技術(shù)本身變異量而測(cè)定的內(nèi)變異系數(shù)對(duì)于所有MMP和TIMP均小于6％。
最初，用雙側(cè)Studentt檢驗(yàn)比較參比對(duì)照和LVH受試者。然后用ANOVA和Tukery多重比較檢驗(yàn)在所有四組間(有高血壓的參比對(duì)照、無高血壓的參比對(duì)照、有CHF的LVH與無CHF的LVH)進(jìn)行分析比較。p值<0.05就被認(rèn)為是顯著的。使用簡(jiǎn)單線性回歸考察MMP和TIMP水平與LV結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。用Mantel Hanzel χ2檢驗(yàn)和受試者工作曲線評(píng)價(jià)MMP-13和TIMP-1水平與LVH和CHF的存在間的關(guān)系。首先用單變量、然后用多變量回歸分析，來考察藥物對(duì)結(jié)構(gòu)、功能或血漿數(shù)據(jù)的潛在影響。結(jié)構(gòu)、功能、MMP或TIMP測(cè)量值是因變量，同時(shí)以輸入的藥物作為虛擬變量。先考察單個(gè)藥物，再考察藥物組合。
本研究使用的研究方案由南卡羅萊納醫(yī)科大學(xué)的機(jī)構(gòu)審核委員會(huì)審核批準(zhǔn)。獲得了所有參加者的書面知情同意。作者已完整獲得這些數(shù)據(jù)并對(duì)其完整性負(fù)責(zé)。所有作者已閱讀并同意原始書寫稿。
結(jié)果 參比對(duì)照與LVH 結(jié)構(gòu)/功能數(shù)據(jù)參比對(duì)照受試者的年齡和性別分布與LVH受試者相似(表3和4)。與參比對(duì)照相比，LVH的收縮壓更高，具有表現(xiàn)為L(zhǎng)V質(zhì)量指數(shù)高60％的明顯同心性重構(gòu)，舒張期末容積無差異，以及LV舒張期末容積與質(zhì)量之比低40％。與參比對(duì)照相比，LVH的LV舒張期舒張指數(shù)和LV舒張期硬度指數(shù)均明顯異常IVRT增加、E波減速時(shí)間增加、E’減少、肺毛細(xì)血管楔壓增加，以及與參比對(duì)照(0.09±0.01mmHg/mL)相比，PCWP與LV舒張期末容積的比值增大(LVH中0.16±0.01mmHg/mL，p<0.05)，表明了LV瞬時(shí)舒張期末動(dòng)作性僵硬(instantaneous end diastolicoperating stiffness)增加。
MMP和TIMP血漿譜與參比對(duì)照相比，LVH中MMP-2降低，MMP-9升高。MMP-13的可檢測(cè)性存在顯著差異(圖1)。47％的參比對(duì)照具有可檢測(cè)水平的MMP-13，而只有在15％的LVH受試者中可檢測(cè)到MMP-13(χ2＝17.89，p<0.001，優(yōu)勢(shì)比＝0.24)。與參比對(duì)照相比，LVH中的血漿TIMP-1顯著升高。參比對(duì)照和LVH的TIMP-2以及MMP-9/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2比值并無差異。
無高血壓的參比對(duì)照與有高血壓的參比對(duì)照 結(jié)構(gòu)/功能數(shù)據(jù)將無高血壓的參比對(duì)照受試者作為年齡和性別匹配的參比對(duì)照組用于與有高血壓的參比對(duì)照、無CHF的LVH和有CHF的LVH組進(jìn)行比較。無高血壓的參比對(duì)照與有高血壓的參比對(duì)照之間，LV結(jié)構(gòu)或功能的任何人口統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)或任何超聲心動(dòng)圖測(cè)量值均沒有顯著差異(表3和4)。無高血壓的參比對(duì)照的左房最大容積(LAMV)和排空分?jǐn)?shù)(LAEF)(LAMV＝40±2ml，LAEF＝42±3％)與有高血壓的參比對(duì)照(LAMV＝42±4ml，LAEF＝43±2％)相似。
MMP和TIMP血漿譜無高血壓的參比對(duì)照受試者與有高血壓的參比對(duì)照之間的任何MMP或TIMP血漿水平均無顯著性差異。
無CHF的LVH與有CHF的LVH 結(jié)構(gòu)/功能數(shù)據(jù)無CHF的LVH與有CHF的LVH受試者之間的收縮壓、LV容積或質(zhì)量均無顯著差異(表5)。但與無CHF的LVH相比，有CHF的LVH的舒張期功能被損害的程度明顯更嚴(yán)重。與無CHF的LVH相比，有CHF的LVH的舒張期舒張指數(shù)更慢、舒張期硬度指數(shù)更高并且充盈壓指數(shù)更高。具體而言，與無高血壓的參比對(duì)照(10±0.4cm/s，95％CI＝9.3，11)以及有高血壓的參比對(duì)照(9.8±0.5cm/s，95％CI＝8.1，11)相比，無CHF的LVH患者的組織多普勒E’降低(8.4±0.4cm/s，95％置信區(qū)間(CI)為7.4，9.3)。有CHF的LVH中的E’進(jìn)一步降低(7.2±0.5cm/s，95％CI＝6.2，8.3)。與無高血壓的參比對(duì)照(10±1mmHg，95％CI＝9.3，10.6)以及有高血壓的參比對(duì)照(11±1mmHg，95％CI＝9.1，12.2)相比，無CHF的LVH患者的PCWP未改變(13±2mmHg，95％CI＝10.5，15.2)，但是在有CHF的LVH中增加(17±2mmHg，95％CI＝15.2，17.7)。在無CHF的LVH患者中，PCWP與LV舒張期末容積之比不變，但在有CHF的LVH患者中該比值顯著升高。有效動(dòng)脈回彈率在無CHF的LVH中升高，在有CHF的LVH中降低。LAMV在無CHF的LVH中升高(LAMV＝53±4ml，與參比對(duì)照相比p<0.05)，在有CHF的LVH中進(jìn)一步升高(LAMV＝70±5ml，與無CHF的LVH相比p<0.05)。LAEF在有CHF的LVH中不變(LAEF＝42±3％，與參比對(duì)照相比p<0.05)，但在有CHF的LVH中增加(LAEF＝48±2％，與無CHF的LVH相比)。
MMP和TIMP血漿譜與有CHF的LVH相比，無CHF的LVH的MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-2或MMP/TIMP比值無顯著差異(圖1)。然而，與無CHF的LVH相比(1092±77ng/ml，95％CI＝933，1252)，有CHF的LVH的TIMP-1顯著增加(1364±86ng/ml，95％CI＝1185，1543)。事實(shí)上，TIMP-1只在有CHF的受試者中增加。與無高血壓的參比對(duì)照(1000±42ng/ml，95％CI＝915，1085)以及有高血壓的參比對(duì)照(988±76ng/ml，95％CI＝824，1152)相比，無CHF的LVH患者的TIMP-1未改變。
MMP和TIMP血漿譜與LV結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系TIMP-1和LV重構(gòu)程度之間存在明顯關(guān)聯(lián)。當(dāng)TIMP-1增加時(shí)，LV質(zhì)量增加(r＝0.30，p＝0.005)，容積/質(zhì)量比值下降(r＝-0.56，p＝0.001，圖2A)。TIMP-1與舒張期功能障礙程度之間存在明顯關(guān)聯(lián)。當(dāng)TIMP-1增加時(shí)，二尖瓣E/A比值下降(r＝-0.22，p<O.027)、E’下降(r＝-0.62，p＝0.001，圖2B)并且PCWP增大(r＝0.28，p＝0.013)。最后，CHF程度與TIMP-1水平之間存在明顯關(guān)聯(lián)。NYHA III類有CHF的LVH受試者的TIMP-1平均值比NYHA II類有CHF的LVH受試者更高。TIMP-1水平>1200ng/ml時(shí)，預(yù)示為有CHF的LVH(χ2＝4.6，p＝0.03，特異性＝88％以及陽性預(yù)測(cè)值＝94％，優(yōu)勢(shì)比＝3.54，95％置信區(qū)間＝1.08，11.50)。受試者工作特征曲線(ROC)下面積為0.71。
特定藥物的使用與各組間LV結(jié)構(gòu)、功能或血漿MMP/TIMP譜的差異之間并無關(guān)聯(lián)。具體而言，以任何藥物或藥物組合分組的患者之間的任何MMP或TIMP水平無差異。然而，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本研究并不足以徹底弄清藥物對(duì)LV結(jié)構(gòu)、功能或血漿MMP/TIMP譜的影響。因此，應(yīng)適當(dāng)謹(jǐn)慎地解釋這些數(shù)據(jù)和分析。
討論 本研究有三個(gè)獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)1)LV結(jié)構(gòu)和功能正常的高血壓患者具有正常的MMP/TIMP譜，2)傾向于減少ECM降解(MMP-2、MMP-13減少，TIMP-1增加)的MMP和TIMP譜的改變與LV肥大和舒張期功能障礙相關(guān)，和3)TIMP-1增加預(yù)示了存在CHF。
雖然MMP和TIMP的底物和作用具有多效性，但心肌MMP和TIMP的改變對(duì)ECM有可預(yù)測(cè)的影響(Spinale，F(xiàn)G.2002；Chapman RE，et al.2004)。例如，MMP-2(一種明膠酶)可降解基底膜蛋白、纖維膠原肽和新合成的膠原纖維。在本研究中，高血壓性LVH患者中的MMP-2顯著降低。MMP-9(一種明膠酶)與MMP-2具有結(jié)構(gòu)相同的蛋白底物，但MMP-9活性水平低得多。然而，MMP-9可顯著影響重要的生物活性蛋白/肽(例如TGF-)以及其他“促纖維變性”蛋白和途徑。可預(yù)期，通過增加的MMP-9來激活促纖維通路會(huì)增加ECM累積。因此，本研究中LVH患者的MMP2水平降低和MMP-9水平升高可能是一個(gè)促進(jìn)在高血壓性心臟病中所觀察到的結(jié)構(gòu)和功能改變的因素。
MMP-13是一種在血漿中水平極低的膠原酶，即使是用高靈敏測(cè)定法也難以對(duì)其精確定量。因此，本研究中并不以定量值報(bào)告MMP-13，而是將結(jié)果分為兩類。LVH患者血漿中的可檢測(cè)的MMP-13水平顯著下降，在患有CHF和LVH的患者中，該水平進(jìn)一步下降。該膠原酶的減少被預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致纖維膠原周轉(zhuǎn)減少、降解減少并且ECM累積增加。
可在多個(gè)水平上調(diào)節(jié)MMP活性，不僅包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，還包括翻譯后修飾，例如TIMP結(jié)合。TIMP與活性MMP以1:1的關(guān)系結(jié)合，抑制MMP酶活性并由此構(gòu)成凈ECM蛋白水解活性的一個(gè)重要控制點(diǎn)(Spinale，F(xiàn)G.2002；Chapman RE，et al.2004；Brew K，et al.2000)。本研究表明，具有LVH和CHF的患者的TIMP-1血漿水平升高。所以，向有助于ECM蛋白水解活性降低的方向改變MMP和TIMP間的平衡，由此促進(jìn)了ECM累積。有四種已知的TIMP，這些分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)并不一致(Brew K，et al.2000)。在動(dòng)物心力衰竭模型和心肌疾病患者中已觀察到各TIMP的水平不一致(Wilson EM，et al.2002；Stroud RE.2005)。在本研究中，觀察到有CHF的LVH患者的TIMP-1穩(wěn)定升高。相比之下，在有CHF或無CHF的LVH患者中均僅觀察到TIMP-2的少量增加。這些觀測(cè)結(jié)果可能突出了LV重構(gòu)過程中各TIMP的不同功能和調(diào)節(jié)途徑。本研究的一個(gè)獨(dú)特發(fā)現(xiàn)是，一種特定類型的TIMP即TIMP-1與CHF的發(fā)生密切相關(guān)。對(duì)于患有CHF和LVH的患者，還不清楚TIMP-1增加是否促進(jìn)CHF的發(fā)生或者是否是發(fā)生CHF的結(jié)果。然而，已清楚，TMMP-1唯獨(dú)在有LVH和CHF的患者中升高，血漿TIMP-1數(shù)值>1200ng/ml預(yù)示了存在CHF。因此，應(yīng)在開發(fā)射血分?jǐn)?shù)正常的心力衰竭(舒張期心力衰竭)的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，以及在設(shè)計(jì)用于舒張期心力衰竭的新治療處理方案中，考慮該血漿分析物。然而，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，TIMP-1＝1200ng/ml這一分界值是以經(jīng)驗(yàn)方式(post-poc)選定，而不是以前瞻方式選定。因此，對(duì)該預(yù)測(cè)值的有效性應(yīng)適當(dāng)謹(jǐn)慎地予以解釋，并用其他使用大型前瞻性系列研究設(shè)計(jì)的研究來證實(shí)。
高血壓性心臟病患者中發(fā)生的MMP/TIMP的改變可影響細(xì)胞外和心肌細(xì)胞區(qū)室的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，從而一起導(dǎo)致同心性LV肥大和膠原含量增加。膠原穩(wěn)態(tài)是由合成、翻譯后修飾和降解間的平衡確定。對(duì)于高血壓性心臟病，Diez等人和其他人已證明，膠原含量升高與膠原合成的血漿標(biāo)記物增加、膠原降解減少以及膠原周轉(zhuǎn)減少有關(guān)(Diez J，et al.2002；Lopez B，etal.2001a；Lopez B，et al.2001b)。本研究中發(fā)現(xiàn)的MMP/TIMP譜的改變公開了可能改變合成、降解和周轉(zhuǎn)的潛在機(jī)制。
雖然LV結(jié)構(gòu)重構(gòu)有許多決定因素，血壓是其中最為重要的一種因素。然而，本研究的數(shù)據(jù)表明，即使血壓已被充分控制，MMP和TIMP的持續(xù)性改變預(yù)示了、可能決定了長(zhǎng)期的同心性重構(gòu)、LVH和舒張期心力衰竭并且確定與長(zhǎng)期的同心性重構(gòu)、LVH和舒張期心力衰竭相關(guān)。LVH的消退需要適當(dāng)?shù)腅CM重構(gòu)，包括ECM成分(特別是基底膜蛋白)的降解和周轉(zhuǎn)以及心肌細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用的改變。本研究表明，高血壓性LVH患者的特定MMP(MMP-2減少)和TIMP(TIMP-1增加)譜持續(xù)異常(MMP-2減少，TIMP-1增加)，預(yù)計(jì)這會(huì)利于心肌細(xì)胞-基底膜-基質(zhì)的持續(xù)連接，而不利于為使LV質(zhì)量恢復(fù)所需的ECM周轉(zhuǎn)。因此，看起來在本研究觀察到的MMP和TIMP的持續(xù)性改變可能促進(jìn)了存在于高血壓性心臟病中的表型和結(jié)構(gòu)改變。
本研究以MMP和TIMP的血漿水平作為反映上述酶和肽的心肌水平變化的代表性標(biāo)志。MMP激活和TIMP結(jié)合是發(fā)生在心肌間質(zhì)中的區(qū)室化過程(Spinale，F(xiàn)G.2002；Chapman RE，et al.2004)。因此，血漿水平并不必然反映出現(xiàn)在心肌中的凈ECM蛋白水解活性。本研究中觀察到的參比對(duì)照和高血壓性心臟病患者間的MMP和TIMP血漿水平間的差異可能反映心肌水平的差異(Joffs C，et al.2001；Yarbrough WM，et al.2003；Lindsey ML，et al.2003)。LVH患者中心肌可能不是MMP和TIMP的唯一來源。因此，血漿MMP和TIMP水平的測(cè)量值代表了從心臟以及非心臟來源釋放的MMP和TIMP的總和。然而，本研究中使用的特定排除標(biāo)準(zhǔn)有助于消除MMP和TIMP的主要非心肌來源的明顯變化。然而，需認(rèn)識(shí)到，存在或不存在慢性心力衰竭的LVH高血壓患者的其他非心臟組織(例如腎和脈管系統(tǒng))中的變化可能有助于MMP和TIMP向血漿釋放。本研究的發(fā)現(xiàn)證明了參比對(duì)照和LVH患者之間血漿MMP和TIMP水平的差異。
結(jié)論ECM蛋白水解系統(tǒng)的特定改變模式與高血壓性心臟病的每種結(jié)構(gòu)、功能和/或臨床表現(xiàn)相關(guān)。血壓被充分控制且左心室無結(jié)構(gòu)或功能改變的受試者的MMP/TIMP指標(biāo)無任何變化。但LVH患者即使血壓被充分控制也表現(xiàn)出MMP-2和MMP-13降低。TIMP-1增加出現(xiàn)在患有LVH和CHF的患者中。具體而言，高血壓性LVH和CHF的發(fā)生之間的轉(zhuǎn)變可由MMP和TIMP的變化——例如TIMP-1>1200ng/ml或者不存在MMP-13——預(yù)測(cè)。但本研究中樣本大小有限，采用的是橫向設(shè)計(jì)，并且未進(jìn)行長(zhǎng)期系列研究。這些局限性使得需要利用大型的前瞻性系列研究涉及對(duì)我們的觀察結(jié)果進(jìn)一步檢驗(yàn)和確證。然而，本研究的數(shù)據(jù)證明，觀察到的MMP/TIMP隨機(jī)改變?cè)诟哐獕盒孕呐K病表現(xiàn)中具有重要作用。對(duì)于該ECM依賴性病理生理學(xué)的理解有助于改善對(duì)高血壓性心臟病患者的診斷和治療。
臨床論點(diǎn)慢性高動(dòng)脈壓是導(dǎo)致LV同心性肥大、弛豫率降低和硬度增加的常見原因。高血壓所致的結(jié)構(gòu)和功能的改變是由于心肌的主要成分——心肌細(xì)胞的改變以及特別是由于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的改變而導(dǎo)致。這些LV結(jié)構(gòu)和功能改變產(chǎn)生了發(fā)生舒張期心力衰竭(DHF)所必需的底物。然而，還不清楚ECM的這些變化受何種因素控制、單純的控制血壓可否防止或逆轉(zhuǎn)這些變化，也不清楚對(duì)ECM控制機(jī)制的認(rèn)識(shí)是否有助于高血壓心臟病的診斷或治療。本研究證明，特定的ECM蛋白水解蛋白/肽(MMP和TIMP)模式的改變與高血壓性心臟病的每種結(jié)構(gòu)、功能和臨床表現(xiàn)有關(guān)。血壓被充分控制且無LV結(jié)構(gòu)或功能改變的受試者的MMP/TIMP指標(biāo)無任何改變。因此，對(duì)高血壓的治療可防止ECM和ECM蛋白水解系統(tǒng)的改變。然而，具有殘余LVH或抗性LVH的患者的血壓盡管被充分控制，他們的MMP仍異常。TIMP-1>1200ng/ml的增加預(yù)示了DHF的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)表明，LVH的消退以及DHF的預(yù)防不僅僅單純?nèi)Q于血壓的改變，可能需要找準(zhǔn)MMP/TIMP變化并將該變化正常化。對(duì)于該ECM依賴性病理生理學(xué)的理解有助于改善對(duì)高血壓患者的診斷和治療。
2.實(shí)施例2基質(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑基質(zhì)組分的蛋白水解因子的改變與高血壓心臟病的結(jié)構(gòu)、功能和臨床表現(xiàn)間的關(guān)系 方法 研究準(zhǔn)入表6示出了本研究準(zhǔn)入情況。排除標(biāo)準(zhǔn)為心肌梗塞病史、心肌病、瓣膜或室壁運(yùn)動(dòng)異常、心律失常、浸潤(rùn)性心臟病、EF<50％、未控制的高血壓(SBP>140或DBP>90)或者影響MMP/TIMP血漿譜的全身性疾病。對(duì)照和HTN對(duì)照的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)為未顯示出結(jié)構(gòu)性心血管疾病的年齡在18-90歲的男性和女性。LVH和有CHF的LVH的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)為有超聲心動(dòng)圖確證的LV肥大(室壁厚度>1.2cm或者LV質(zhì)量指數(shù)>125g/m2)、年齡在18-90歲的男性和女性。
表6研究準(zhǔn)入
超聲心動(dòng)圖測(cè)量使用維度超聲心動(dòng)圖標(biāo)準(zhǔn)。
超聲心動(dòng)圖計(jì)算用圓盤法計(jì)算LV容積。用Penn法計(jì)算LV質(zhì)量。PCWP通過2+1.3×(E/Ea)計(jì)算。
MMP/TIMP血漿測(cè)量通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(AmmershamPharmacia Biotech)獲得明膠酶MMP-2和MMP-9、膠原酶MMP-13以及TIMP類的TIMP-1和TIMP-2的血漿測(cè)量值。
結(jié)果 圖7-11示出了研究結(jié)果。
結(jié)論 LV結(jié)構(gòu)和功能正常的HTN患者具有正常的MMP/TIMP譜。傾向于減少ECM降解的MMP/TIMP譜的改變與LV肥大和舒張期功能障礙相關(guān)。TIMP-1的增加預(yù)示了CHF的存在?？墒褂眠x定的MMP和TIMP的血漿測(cè)定法測(cè)量心肌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解系統(tǒng)的變化。高血壓心臟病的每種表現(xiàn)都與ECM蛋白水解系統(tǒng)的特定改變模式相關(guān)。具有結(jié)構(gòu)重構(gòu)、舒張期功能障礙和/或臨床CHF的高血壓患者的特征是MMP減少和TIMP增加。
3.實(shí)施例4區(qū)分、預(yù)測(cè)和診斷高血壓患者的心力衰竭的標(biāo)準(zhǔn) 表7中提供了在所述年齡范圍內(nèi)和跨性別的人類受試者的正常值的明確列表。如本發(fā)明所包含的MMP/TIMP正常參照值的編撰列表在以前并未提供過，并且由于包含無心血管疾病的年齡匹配的受試者，表7還提供了正常參比范圍。而且，提供了MMP/TIMP譜的新的化學(xué)計(jì)量比值，可證明該譜涵蓋了下表詳述的重要診斷和預(yù)后信息。從100多名受試者中收集這些數(shù)據(jù)并加以分析。
表7正常人類*參比范圍
*正常成人年齡25-70歲 表8給出了被診斷有高血壓但血壓被良好控制的患者的MMP和TIMP絕對(duì)值、MMP/TIMP比值絕對(duì)值以及相對(duì)于基于絕對(duì)值的正常參比值的變化百分比。按照原始申請(qǐng)中所述，收集這些數(shù)值。證實(shí)了一種獨(dú)特的血漿譜，該譜無法從從前的動(dòng)物研究報(bào)告或以前公開的有限臨床研究中預(yù)測(cè)得出。該獨(dú)特譜包括MMP-2下降、MMP-9無變化、MMP-13檢測(cè)不到(低于任何目前使用的測(cè)定系統(tǒng)的靈敏度)，以及TIMP-1水平穩(wěn)定上升。而且，可證明心血管特異性標(biāo)記物TIMP-4增加。MMP和TIMP譜的這些變化是高血壓患者特有的，并且證實(shí)了在這些患者的心臟組織內(nèi)發(fā)生的早期改變。這種獨(dú)特、特異的譜可用于指導(dǎo)治療，以將相對(duì)于正常受試者的MMP和TIMP譜變化減至最小。而且，這些血漿譜可用于全面篩選處于危險(xiǎn)中的患者群體，并識(shí)別出具有未來發(fā)生不良事件的風(fēng)險(xiǎn)的患者。
表8高血壓性心臟病的診斷
*被診斷有高血壓并經(jīng)適當(dāng)醫(yī)療處理的患者 表9示出了患有高血壓性心臟病繼發(fā)心力衰竭的患者中出現(xiàn)的MMP和TIMP的血漿譜。這些數(shù)據(jù)取自原始申請(qǐng)中提供的研究。該既往研究表明，可通過MMP-13信號(hào)的消失、TIMP-1的穩(wěn)定增加來判斷高血壓患者是否存在心力衰竭。實(shí)際上，先前已經(jīng)提供用于預(yù)測(cè)和診斷心力衰竭的受試者工作特征曲線(ROC)。與患有心肌梗塞(心臟病發(fā)作)繼發(fā)心力衰竭的患者顯著不同的是，MMP-9水平正?；蛘叩陀谡！？梢詫?duì)這兩種疾病狀態(tài)予以區(qū)分，下表中給出該區(qū)分結(jié)果。而且，通過使用心血管特異性標(biāo)記物TIMP-4，證明了高血壓性心臟病患者的TIMP-4增加，并且為所述以前從未被證明的血漿譜提供了心血管特異性。這些數(shù)據(jù)提供了首個(gè)用于通過血漿標(biāo)記物識(shí)別具有高血壓性心臟病所致的心力衰竭的患者的鑒別譜。這是一個(gè)重要的問題，因?yàn)楦鶕?jù)心力衰竭的根本病因不同，治療方式會(huì)有差異。原始申請(qǐng)中已提供了關(guān)于如何將這些數(shù)據(jù)用于指導(dǎo)治療和臨床決策的內(nèi)容。
表9心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加的高血壓患者*
*被診斷有高血壓并經(jīng)適當(dāng)醫(yī)療處理的患者 由本申請(qǐng)中開發(fā)出的并在支持材料中顯示出的獨(dú)特血漿特征，首次提供了區(qū)分心力衰竭患者的根本病因的能力。具體而言，如表10所示，具有發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的患者，或表現(xiàn)出心肌梗塞繼發(fā)心力衰竭的患者，或者高血壓繼發(fā)心力衰竭的患者中出現(xiàn)了獨(dú)特且非常不同的血漿譜。這些數(shù)據(jù)取自我們所完成的構(gòu)成本申請(qǐng)基礎(chǔ)的研究。因此，對(duì)這些譜進(jìn)行鑒別診斷，更重要的是，可考慮到更具有針對(duì)性的臨床決策和治療策略。該譜的臨床應(yīng)用的實(shí)例，以及如何利用這些譜進(jìn)行臨床決策的內(nèi)容在原始申請(qǐng)中已給出。
表10收縮期(MI后)或舒張期(高血壓性心臟病)心力衰竭的鑒別診斷*
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權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中MMP-13的量，量小于10ng/mL時(shí)就表明存在舒張期心力衰竭或者預(yù)示心力衰竭。
2.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括檢測(cè)到所述受試者體液中TIMP-1的量高于正常值。
3.權(quán)利要求2的方法，其中MMP-2的量比正常值至少高約20％。
4.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括檢測(cè)到所述受試者體液中TIMP-4的量高于正常值。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述TIMP-4的量比正常值至少高約50％。
6.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中MMP-13、TIMP-1和TIMP-4的量。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述MMP-13的量檢測(cè)不到，所述TIMP-1的量比正常值至少高約50％，并且TIMP-4的量比正常值至少高約50％。
8.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4的量。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述MMP-13的量檢測(cè)不到，所述TIMP-1的量比正常值至少高約50％，所述TIMP-2的量比正常值至少高約50％，并且TIMP-4的量比正常值至少高約50％。
10.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括測(cè)量所述受試者體液中MMP-13、TIMP-1、TIMP-4和MMP-2的量。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述MMP-13的量檢測(cè)不到，所述TIMP-1的量比正常值至少高約50％，所述TIMP-4的量比正常值至少高約50％，并且MMP-2的量比正常值至少高約20％。
12.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括檢測(cè)到所述受試者體液中MMP-9與TIMP-1的比值比正常比值低。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述比值比正常比值至少低約50％。
14.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括檢測(cè)到所述受試者體液中MMP-9與TIMP-2的比值比正常比值低。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述比值比正常比值至少低約50％。
16.一種預(yù)測(cè)受試者舒張期心力衰竭的方法，包括檢測(cè)到所述受試者體液中MMP-9與TIMP-4的比值比正常比值低。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述比值比正常比值至少低約50％。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中所述體液為血液。
19.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中所述體液為血漿。
全文摘要
本文公開了檢測(cè)和預(yù)測(cè)舒張期心力衰竭以及預(yù)測(cè)充血性心力衰竭的方法，該方法包括蛋白酶和蛋白酶抑制劑分析。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK101490273SQ200780025921
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月9日
發(fā)明者F·G·斯皮納爾, R·E·斯特勞德, M·R·齊利 申請(qǐng)人:南卡羅來納州醫(yī)科大學(xué)研究發(fā)展基金會(huì)