專利名稱：用于獲得無標記轉基因植物的方法和組合物的制作方法
用于獲得無標記轉基因植物的方法和組合物
背景技術：
本申請要求于2006年5月12日提交的美國臨時申請系列號 60/799,875的優(yōu)先權，所述美國臨時申請的完整公開內容引入本文作為參考。
1. 發(fā)明領域
本發(fā)明總的來說涉及轉基因植物。更具體而言，本發(fā)明涉及轉基因 植物中不需要或不必要的DNA的鑒定和去除。
2. 相關領域的描述
轉基因植物中不必要或不需要的轉基因DNA的鑒定已成為眾多研 究的主題，并且在從此種植物中消除這些轉基因序列的努力中已檢查了 許多不同方法(例如Hanson等人，1999; Dale等人，1991; Ebinuma 等人，1997; Yoder等人，1994; Kononov等人，1997; Hare和Chua, 2002; Scutt等人，2002; Puchta, 2003; deVetten等人，2003; Halpin, 2005;美國公開申請20030110532;美國公開申請20040237142;美國 專利6,458,594 )。 一般而言，鑒定不包括不有助于轉基因植物中農業(yè)上 有用性狀的轉基因DNA的植物是有利的。
通過土壤桿菌屬(^4gra6a"enwm )介導的轉化用于在植物中引入轉 基因的許多方法利用T-DNA(轉化DNA)，所述T-DNA整合轉基因和 相關遺傳元件，并且將這些轉移到植物的基因組內。 一般地，轉基因以 右邊界DNA分子(RB)和左邊界DNA分子(LB)為邊界，并且被轉 移到植物基因組內，整合在一個或多個基因座上。已觀察到當DNA構 建體包含超過一種T-DNA時，這些T-DNAs和其中包含的轉基因可以 被整合到植物基因組內分開的基因座上(Fmmond等人，1986 )。這稱 為共轉化。
共轉化過程可以通過用土壤桿菌屬菌林的混合物遞送T-DNAs來達 到，所迷土壤桿菌屬菌林用攜帶分開的T-DNAs的質粒進行轉化。共轉 化還可以通過用2種或更多DNA構建體轉化一種土壤桿菌屬菌林來達 到，所述DNA構建體各自包含一種T-DNA。另外的方法利用在單個DNA 載體上的2種T-DNAs且鑒定已在不同基因座上整合T-DNAs的轉基因細胞或植物。在非土壤桿菌屬介導的轉化系統(tǒng)中，例如用于引入DNA 的物理方法包括用微粒轟擊，2種DNA分子可以獨立整合到靶基因組 內，并且隨后在隨后世代中獨立分離。也已描述了允許序列的獨立插入 及其遺傳分離的2種T-DNA構建體的使用(例如美國專利5,731,179; Zhou等人，2003; Breitler等人，2004; Sato等人，2004)。盡管前文 已促進了本領域的理解，但仍需要改善的方法和組合物用于獲得無標記 植物以使得產品開發(fā)更有效。先前描述的篩選過程是高度勞動力密集 的，例如需要DNA印跡或PCRTM分析隨后為R0和/或Rl植物材料的生 長。
美國公開20060041956描述了與土壤桿菌屬介導的轉化結合的視覺 標記基因的使用。然而，該出版物未描述其中此種標記與選擇或篩選標 記基因連接且不與目的基因連接的任何方法。因此，本領域非常需要將 改善容易和效率的方法和組合物，使用所述方法和組合物可以鑒定和消 除缺乏標記序列和/或其他轉基因DNA的植物，所述標記序列和/或其他 轉基因DNA不是農業(yè)上有用的。
發(fā)明概述
在一個方面，本發(fā)明提供了由轉基因植物制備無標記種子的方法， 其包括下述步驟a)獲得用第一種DNA區(qū)段和第二種DNA區(qū)段轉化 的轉基因植物的種子，所述第一種DNA區(qū)段包含目的核酸，且所述第 二種DNA區(qū)段包含與DNA盒物理和/或遺傳連接的植物標記基因，所 述DNA盒與在種子中有功能的啟動子可操作地連接，其中所述DNA盒 對包含DNA盒的種子賦予可檢測表型；b)就可檢測表型的不存在篩選 種子；和c)選擇缺乏可檢測表型的至少第一個種子以獲得無標記基因 的種子。在一個實施方案中，步驟c)進一步包括就目的核酸的存在測 定種子，并且選擇包含目的核酸且缺乏選擇標記基因的種子。在某些實 施方案中，標記基因是選擇或篩選標記基因。
在某些實施方案中，DNA盒可以與選擇標記基因翻譯或轉錄地融 合；即，它可以編碼與選擇標記基因翻譯或轉錄地融合的RNA。在進一 步的實施方案中，DNA盒包含具有與內源基因同源的至少19或21 bp 的反義或有義DNA片段，例如其中反義或有義DNA片段與在種子中有 功能的啟動子可操作地連接。在另外一個實施方案中，DNA盒包含一對
8反向重復的DNA片段，其中每個片段大小為至少19或21 bp,且其中 DNA片段與內源基因同源，與在種子中有功能的啟動子可操作地連接。 與內源基因同源的反向DNA片段重復也可以包埋在選擇標記基因內的 內含子中。在某些實施方案中，DNA盒編碼包含至少19或21個核苷酸 的有義或反義RNA，其中DNA片段與內源基因同源。
在根據本發(fā)明制備無標記種子的方法中，所選擇的種子可以缺乏篩 選或篩選基因和DNA盒。獲得轉基因植物的種子可以包含用在分開的 DNA構建體上的第 一種和第二種DNA區(qū)段轉化或共轉化轉基因植物或 其任何前代的祖先。獲得轉基因植物的種子還可以包含用包含第一種和 第二種DNA區(qū)段的單個DNA構建體轉化轉基因植物或其任何前代的祖 先。第一種和第二種DNA區(qū)段由不同的T-DNA邊界序列限制范圍。在 本發(fā)明的方法中，通過用DNA構建體轉化植物或其任何前代的祖先來 產生轉基因植物，所述DNA構建體包含(i)側面為左和右T-DNA邊 界的第一種DNA區(qū)段，和(ii)側面為第二組左和右T-DNA邊界的第 二種DNA區(qū)段，其中所述第二種DNA區(qū)段進一步包含與在轉基因植物 中有功能的啟動子可操作地連接的選擇標記基因。第一種和第二種DNA 區(qū)段在轉基因植物中可以遺傳連鎖或不遺傳連鎖。
通過經由選自土壤桿菌屬、根瘤菌屬(朋,zo&wm)、中生根瘤菌屬 (M^or/zzzo6/wm )或中華根瘤菌屬(^力or/n'zo6/ww )的細菌菌林介導的 轉化，通過將第一種和第二種DNA區(qū)段引入植物或其任何前代的祖先 內可以生產根據本發(fā)明使用的轉基因植物。還可以例如通過微粒轟擊生 產轉基因植物。
與本發(fā)明一起使用的選擇標記可以編碼選自下述的產物CP4 EPSPS、 6w、 DMO、 NptII、草甘膦乙酰轉移酶、突變型乙酰乳酸合酶、 氨曱蝶呤抗性DHFR、茅草枯脫卣素酶、PMI、 Protox、潮霉素磷酸轉移 酶和5-甲基色氨酸抗性鄰氨基苯曱酸合酶。用于與本發(fā)明一起使用的 DNA盒序列可以選自例如crW、 gzM'、她> racy5、 /w;c、花青普合成基因、 Dey7/9-/aaA^、 ra/S、 OsCD尸iO、 y4尸2、爿/^入^AT轉錄因子、Z^"C2、
co6爿、AL4S4、 ^ "、玉米醇溶蛋白反向重復、B-peru和酵母 爿r尸-尸^x。所述盒可以與在組織中有功能的啟動子可操作地連接，所述 組織選自胚、種子胚乳、子葉、糊粉和種皮。啟動子可以例如選自油菜 籽蛋白(napin)啟動子、卩-菜豆蛋白啟動子、(3-伴大豆球蛋白(conglycinin)
9亞單位啟動子、玉米醇溶蛋白啟動子、Osgt-l啟動子、油質蛋白啟動子、 淀粉合酶啟動子、球蛋白1啟動子、大麥LTP2啟動子、a-淀粉酶啟動 子、殼多糖酶啟動子、P-葡聚糖酶啟動子、半胱氨酸蛋白酶啟動子、谷 氧還蛋白啟動子、HVA1啟動子、絲氨酸羧肽酶II啟動子、過氧化氫酶 啟動子、a-葡糖苷酶啟動子、(3-淀粉酶啟動子、VP1啟動子、USP啟動 子、USP88啟動子、USP99啟動子、凝集素和bronze2啟動子。可檢測 表型可以通過檢測催化活性進行測定?？蓹z測表型可以選自種子顏色、 種子不透明度、種子發(fā)芽力、種子大小、種子生存力、種子形狀、種子 紋理、以及缺陷或敗育種子。種子的篩選可以通過自動化種子分選機來 完成。
在另一個方面，本發(fā)明提供了 DNA構建體，其包含(a)包含在目 的基因側面的左和右T-DNA邊界的第一種DNA區(qū)段，所述目的基因與 在植物中有功能的啟動子可操作地連接，和(b)包含在種子中有功能 的啟動子側面的第二組左和右T-DNA邊界的第二種DNA區(qū)段，所述啟 動子與在種子中賦予可檢測表型的DNA盒可操作地連接，所述種子包 含DNA盒和與在植物中有功能的啟動子可操作地連接的選擇標記基因。 目的基因可以賦予選自下述的性狀除草劑耐受性、昆蟲或害蟲抗性、 抗病性、增加的生物量、改良的脂肪酸代謝、改良的碳水化合物代謝和 改良的營養(yǎng)質量。在所述構建體中，DNA盒和選擇標記基因可以與相同 啟動子可操作地連接。在一個實施方案中，DNA盒和選擇標記基因與不 同啟動子可操作地連接。在具體實施方案中，選擇標記基因編碼選自下 述的產物CP4EPSPS、膦絲菌素乙酰轉移酶、DMO、 NptII、草甘膦乙 酰轉移酶、突變型乙酰乳酸合酶、氨曱蝶呤抗性DHFR、茅草枯脫卣素 酶、PMI、 Protox、潮霉素磷酸轉移酶和5-曱基色氨酸抗性鄰氨基苯甲 酸合酶。在另一個實施方案中，DNA盒選自cw仏g^、妳、^c仏/wx、 花青苷合成基因、De/7/9-zaaM、 ro/仏OyCZ)尸AT2、爿尸2、 爿AT 轉錄因子、Zj C入5"/-/、 co6丄^4W、 ^"、玉米醇溶蛋白反向重復、 B-peru和酵母^ZP-尸fX。 DNA盒可以與在組織中有功能的啟動子可操 作地連接，所述組織選自胚、種子胚乳、子葉、糊粉和種皮。在一個實 施方案中，DNA盒與選自下述的啟動子可操作地連接油菜籽蛋白啟動 子、(3-菜豆蛋白啟動子、P-伴大豆球蛋白亞單位啟動子、玉米醇溶蛋白 啟動子、Osgt-l啟動子、油質蛋白啟動子、淀粉合酶啟動子、球蛋白1啟動子、大麥LTP2啟動子、a-淀粉酶啟動子、殼多糖酶啟動子、P-葡 聚糖酶啟動子、半胱氨酸蛋白酶啟動子、谷氧還蛋白啟動子、HVA1啟 動子、絲氨酸羧肽酶II啟動子、過氧化氫酶啟動子、a-葡糖苷酶啟動子、 卩-淀粉酶啟動子、VP1啟動子、USP88或USP99啟動子、和bronze2啟動子。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了用本文提供的構建體轉化的轉基因 細胞和植物。在一個實施方案中，提供了用包含第一種DNA區(qū)段的DNA 構建體和包含第二種DNA區(qū)段的第二種DNA構建體共轉化的轉基因植 物，所述第一種DNA區(qū)段包含在目的基因側面的左和右T-DNA邊界， 所述目的基因與在植物中有功能的啟動子可操作地連接，且所述第二種 DNA區(qū)段包含在種子中有功能的啟動子側面的第二組左和右T-DNA邊 界，所述啟動子與在種子中賦予可檢測表型的DNA盒可操作地連接， 所述種子包含DNA盒和與在植物中有功能的啟動子可操作地連接的選 擇標記基因。還提供了此種植物的細胞。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含右和左T-DNA邊界的DNA構 建體，其中包含與在植物中有功能的啟動子可操作地連接的目的基因的 第一種DNA區(qū)段位于右邊界后，且.包含對植物種子賦予可檢測表型的 DNA盒的第二種DNA區(qū)段位于左邊界后，所述植物種子包含DNA盒 和與在植物中有功能的啟動子可操作地連接的標記基因，例如選擇標記 基因。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含右和左T-DNA邊界的DNA構 建體，其中包含對植物種子賦予可檢測表型的DNA盒的第一種DNA區(qū) 段位于右邊界后，所述植物種子包含DNA盒和與在植物中有功能的啟 動子可操作地連接的選擇標記基因，且包含與在植物中有功能的啟動子 可操作地連接的目的基因的第二種DNA區(qū)段位于左邊界后。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含2個右T-DNA邊界的DNA構 建體，其中包含與在植物中有功能的啟動子可操作地連接的目的基因的 第一種DNA區(qū)段位于一個右邊界后，且包含對植物種子賦予可檢測表 型的DNA盒的第二種DNA區(qū)段位于另 一個右邊界后，所述植物種子包 含DNA盒和與在植物中有功能的啟動子可操作地連接的選擇標記基因。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO: 2, SEQ ID NO: 3,或與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少70%、 75%、 85%
ii或95%同一性，且編碼具有八氫番茄紅素合酶活性的多肽的序列的分離
的核酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了包含SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO: 3的核酸序列的重組DNA構建體，或包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少71 % 、 80%、 90%、 95%、 98 %或99 %同 一性，且編碼具有八氬番茄紅素合酶活性的多肽的序列的重組DNA構 建體，其與在植物中有功能的異源啟動子可操作地連接。包含此種序列 的宿主細胞是本發(fā)明的另 一 個實施方案，其中所述細胞是細菌細胞或植 物細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了轉基因植物或種子，其包 含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 3,或 與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少71 % 、 80%、 90%、 95%、 98%或99%同一性，且編碼具有八氬番茄紅素合酶活性的多肽的序列。
附圖簡述
下述附圖是本說明書的部分且被包括以進一步證實本發(fā)明的某些 方面。通過參考附圖與本文呈現(xiàn)的具體實施方案的詳細描述組合可以更 好地理解本發(fā)明。


圖1. (A) pMON10338; (B) pMON10339;和(C) pMON67465
的示意圖。
圖2.用pMON67465轉化的大豆組織中的CrtB表達。
圖3.在來自事件A33908的種子中的CrtB表達。
圖4.在未成熟的Rl種子中的cw仏gws和CP4/EPSPS表達。
圖5.在成熟的Rl種子中的cwS表達。
圖6. pMON67465種子的GUS染色。
圖7.關于GUS陽性種子的CP4和CrtB PCR。
圖8.用于篩選轉基因事件的連鎖-DNA印跡和篩選標記方法的比較。
圖9.通過使用包含用于無標記種子的與CP4選擇標記基因連接的 篩選基因的構建體轉移的DNA序列的示意概括。A )在用于土壤桿菌屬 介導的轉化的一種構建體中，GOI位于一種T-DNA中，側面為RB和 LB且與第二種T-DNA物理連接，所述第二種T-DNA包含與CP4選擇 標記基因連接的篩選基因；B)包含2個邊界的一種載體，將GOI置于 RB后，而將篩選和選擇標記基因連同主鏈一起置于第二個RB后或置于
12LB后；C) GOI和篩選基因-DNAs在2種載體中分開，且轉化到一種土 壤桿菌屬細胞或分開的土壤桿菌屬細胞中；D)來自GOI以及篩選和選 擇標記基因的2種DNA區(qū)段的可能連接。只有單獨的GOI將顯示正常 的種子外觀，而包含篩選基因的細胞顯示可見表型；E)2種分開的DNA 區(qū)段包含GOI或篩選和選擇標記基因用于非細菌介導的轉化。 圖10. pMON67420表示用于共轉化的GOI構建體。 圖11.質粒pMON99575,包含經由種子特異性玉米醇溶蛋白啟動 子驅動的粟酒裂殖糖酵母(Sc/^oracc/ "ra附少c^ /wwZ e ) ATP依賴性果 糖磷酸激酶。
圖12.表達種子特異性酵母ATP依賴性果糖磷酸激酶的玉米穗取消 了正常的仁發(fā)育。
圖13.用于證實置于標記基因的內含子內的反向重復導致可見表型 的dsRNA編碼構建體的示意圖。
圖14.包埋在內含子中的反向重復產生可見表型。
圖15.玉米仁中的ct-玉米醇溶蛋白的沉默導致可見表型。
圖16.包含《AS^/的pMON83530的示意圖。
圖17.用pMON83530轉化的大豆種子的后代。左側的種子由于表 達^4S4而皺縮并且指出選擇標記的存在，而右側的種子是正常和無標記的。
圖18.包含《JW用作2T DNA構建體中的鑒定序列的
pMO畫7314的示意圖。
圖19.包含^"基因用作鑒定基因的pMON68581的示意圖。
圖20.用pMON68581轉化的后代大豆種子。右側的種子由于表達
而皺縮并且指出篩選或選擇標記的存在，而左側的種子是正常和無
標i己的。
圖21. 2T-DNA載體形式-示意圖。
發(fā)明詳述
下述是本發(fā)明的詳細描述，提供用于幫助本領域技術人員實踐本發(fā) 明。本領域普通技術人員可以在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下， 在本文描述的實施方案中進行修飾和變化。
本發(fā)明通過提供構建體和方法克服了現(xiàn)有技術中的缺陷，所述構建體和方法基于由種子表達的鑒定基因、序列或盒賦予的表型，允許有效 區(qū)分缺乏鑒定序列和標記基因序列但包括一種或多種目的基因(GOI ) 的種子與包含鑒定基因序列和標記基因序列的種子。具體地，在一個實 施方案中，本發(fā)明提供了用于轉化植物細胞的轉化構建體和方法，其包
括(i)目的基因；和(ii)在種子中表達且與選擇或篩選標記基因物
理連接的鑒定序列，所述選擇或篩選標記基因可以在各種植物組織中表
達，其中構建體和/或轉化法這樣設計，從而使得(i)和(ii)的遺傳元 件可以獨立整合到植物基因組內，且因此在遺傳上彼此分離。
鑒定序列在種子組織中的表達或其的缺乏允許直接鑒定種子和植 物，所述種子和植物缺乏種子表達的鑒定序列和物理連接的選擇或篩選 標記基因，同時允許選擇仍包含目的轉基因的種子和植物。在種子水平 上選擇包括目的基因且缺乏標記基因序列的種子代表顯著進步，因為它 避免了先前使用的相對昂貴和勞動力密集的篩選法的需要。另外可以節(jié) 省時間，因為篩選可以在發(fā)芽前或在發(fā)芽期間完成，而不需要使植物的 下一代生長至允許組織收獲的大小，如例如對于連鎖-DNA印跡分析所 需的。
在一個實施方案中，通過土壤桿菌屬或其他根瘤菌介導的方法進行 植物組織的轉化(參見例如，于2006年5月16日提交，名稱為"Use of Non-y4gro/ a"e〃'ww Bacterial Species for Plant Transformation"且指定4戈 理受理號MONS: 100USP1的美國臨時專利申請系列號60/800,872,所 述美國臨時專利申請的完整公開內容特別引入本文作為參考)，并且包 括在種子中表達的鑒定序列和物理連接的選擇或篩選標記基因的DNA 序列一起存在于轉移到植物細胞內的T-DNA或其他序列(例如，載體 主鏈)上(例如，側面為T-DNA RB和/或LB序列或不含邊界序列)。 鑒定序列和標記基因可以物理連接地轉移給植物，而目的基因存在于分 開的T-DNA上，側面為其自身的RB和LB序列或轉移到植物細胞內的 其他序列，并且可以整合到獨立基因座上(例如圖21)。選擇和/或篩 選標記允許鑒定轉化的植物組織?？梢垣@得能育的植物并且在育種方案 中進行自交或雜交，以跟蹤下一代中的表型分離。用于執(zhí)行此種育種的 策略是本領域眾所周知的，并且在不同植物之間在細節(jié)方面可以有變 化。鑒定序列的種子表達或缺乏表達允許就標記和鑒定序列的存在而言 容易的鑒定種子。目的基因例如可以包含編碼選自下述的性狀的至少一
14個植物表達盒除草劑耐受性、抗生素抗性、昆蟲抗性、抗病性、抗應 激性(例如干旱和寒冷)、增強的營養(yǎng)物使用效率、增強的營養(yǎng)含量(例 如，氨基酸、蛋白質、糖、碳水化合物、脂肪酸和/或油)、不育系統(tǒng)、 工業(yè)酶(例如，藥物和用于生物燃料的加工酶)和增強的產量。
可以轉移到植物細胞內的序列(例如T-DNAs)可以存在于用于轉 化的細菌菌林中的一個轉化載體上。在另一個實施方案中，序列包括鑒 定序列和植物選才奪標記以及包含目的基因的序列可以存在于細菌菌株 中的分開的轉化載體上。在另外一個實施方案中，可以在一起用于轉化 的分開的細菌細胞或菌抹中發(fā)現(xiàn)，包括鑒定序列和植物選擇標記的 T-DNA以及包含目的基因的T-DNA。
在另外一個實施方案中，DNA序列包括(i)目的基因；和(ii)在 種子中表達且與選擇或篩選標記基因物理連接的鑒定序列可以通過物 理方法例如微粒轟擊引入植物細胞內。在此種實施方案中，(i)和(ii) 的DNA序列可以位于分開的DNA片段上，所述分開的DNA片段可以 在用DNA包被微粒之前或期間混合在一起。DNA序列可以存在于單個 微粒上，或它們可以存在于分開的微粒上，所述分開的微粒在轟擊前混 合在一起。
由鑒定序列傳遞的表型可以通過下述來達到與組成型或種子特異 性啟動子連接的異源或內源基因的異位超表達，或使用反義RNA、 RNA 干擾或共抑制技術下調內源基因。內源基因的例子可以包括但不限于， 涉及糖/淀粉代謝、蛋白質代謝和脂肪酸代謝的基因。
在一個實施方案中，鑒定序列的種子表達導致在包含鑒定序列的轉 基因植物的種子中的可檢測表型。在某些實施方案中，表型可以通過目 測進行檢測，且可以包括種子顏色、不透明度(或半透明度)、熒光、 紋理、大小、形狀、發(fā)芽力、生存力、或通常任何組分或性質中的變化，
因型中發(fā)現(xiàn)的那種。在某些實施方案中，鑒定序列包括gwW、妳(Pang 等人，1996)、八氬番茄紅素合酶、或八氫番茄紅素去飽和酶編碼基因、 或花青普基因(Pl、 Lc、 B-Peru、 Cl、 R、 Rc、 或侈寸^口 Selinger
等人，1998; Ludwig等人，1989; Himi等人，2005; Kobayashi等人， 2002 ))。在具體實施方案中，鑒定基因包含編碼八氫番茄紅素合酶的 crW基因(美國專利號5,429,939; US 6,429,356;美國專利5,545,816 ),包括包含對于在單子葉植物例如玉米植物中的表達進行了密碼子最優(yōu) 化的序列的基因?？梢栽谶@點上使用的基因的另 一個例子是涉及種 子色素生產的基因。
在其他實施方案中，表型可通過催化活性的檢測進行測定。在另外 一個實施方案中，表型是組織切除表型，例如花粉、卵或種子組織的形 成中的阻斷。還設想了包括標記基因、沉默配子生產或生存力所需的基 因從而減少或阻止受精的組合物和方法。例如，可以使用導致花粉發(fā)育 和生存力所需的基因沉默的序列。衍生自攜帶標記基因的減數分裂分離 子的花粉將不發(fā)育或將是不能存活的，從而阻止標記基因通過花粉傳遞 給后代。在異型雜交授粉中，所有后代將是無標記的。還設想了導致其
他內源基因沉默(例如，RNAi技術包括miRNA)以導致種子表型的序 列的使用。此種基因包括但不限于編碼或修飾種子貯藏蛋白例如玉米 醇溶蛋白的表達的基因，Opaque2,『a矽，和編碼涉及種子中的碳水化 合物、蛋白質和/或脂質積聚的蛋白質的其他基因。
賦予不能存活的花粉表型的鑒定序列的表達也是希望的，因為當攜 帶在花粉特異性啟動子控制下的鑒定序列的轉基因品系用作雄性傳粉 者時，僅不含鑒定序列的花粉粒將能夠使卵受精，從而增加無鑒定序列 和標記序列的種子得率。鑒定序列可以生產對于花粉致命或對于花粉萌 發(fā)抑制性的蛋白質?？商娲?，與基本內源的花粉基因同源的一對反向 重復的表達可以用于沉默使得花粉不能存活的基因?；ǚ厶禺愋曰蚝?啟動子的例子是本領域技術人員已知的，并且包括例如如描述的(Eyal 等人，1995 ) LAT52和LAT59基因以及番茄啟動子。
在另一個實施方案中，鑒定序列可以在種子和花粉中進行表達，用 于進一 步增強具有目的基因的種子的選擇且消除具有鑒定序列和標記 基因的種子。這可以通過使用包含2種轉基因的鑒定序列來達到；所述 轉基因之一在種子中表達且另一種在花粉中表達?？商娲?，可以在花 粉和種子中表達相同鑒定序列的啟動子還可以導致在花粉和種子中的 可檢測表型。在花粉和種子中表達的啟動子的例子是來自玉蜀黍Waxy 基因(zmGBS; Shure等人，1983 )和稻小亞基ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 基因(osAGP; Anderson等人，1991)的啟動子?；ǚ酆头N子表達模式 也在Russell和Fromm, 1997中得到描述。
鑒定序列可以可替代地改變碳水化合物、蛋白質、脂質或者細胞或
16種子代謝的其他產物，以便產生可檢測表型。在一個實施方案中，鑒定
序列允許編碼果聚糖蔗糖酶或酵母ATP依賴性果糖磷酸激酶 (ATP-PFK)的McS基因的胚乳特異性表達，這取消包含鑒定序列和標 記基因的種子中的淀粉積聚(Caimi等人，1996;圖12)。鑒定序列可 以是基因。鑒定序列可以進一步編碼轉錄或翻譯融合物(例如U.S. 6,307,123;美國專利公開20060064772 )。
美國專利6,307,123涉及選擇標記基因("/^n )和篩選標記基因(妳) 之間的翻譯融合物的構建?？梢詰迷摲椒ㄒ援a生本文描述的鑒定序列 和本文描述的選擇或篩選標記之間的融合物。
可以用于制備多肽融合物的另 一種方法基于泛蛋白(Ub )加工途徑。 這種方法可以用于將包含2個蛋白質結構域的長多肽切割成2種分開的 活性蛋白質。在這種方法中，單個基因盒可以編碼2個ORFs,其中例 如關于cw5和EPSPS-CP4的2個ORFs可以由Ub的14個C末端氨基 酸分開，隨后為全長Ub序列。在體內翻譯后，內源性脫遍在蛋白酶 (DUBs)將多蛋白切割成3個分開的單位l)N末端蛋白質，其包含 終止于Ub的14個C末端氨基酸的鑒定序列crW; 2)Ub單體；和3) C末端多肽，其編碼選擇標記EPSPS-CP4。此種方法是本領域技術人員 已知的(例如Walker等人，2007)。
通過使用內部核糖體進入位點(IRES)可以制備鑒定序列和選擇或 篩選標記之間的轉錄融合物。例如，可以制備編碼crW的ORF隨后為 ESPSP-CP4的ORF的轉錄物，其中在它們之間放置功能IRES元件。幾 種IRES是本領域技術人員已知的(參見例如引入本文作為參考的 Dinkova等人2005和其中的參考文獻;和美國專利7,119,187 )。
化學、免疫學和基于核酸(例如基于PCR)的方法進行檢測。鑒定序列 可以在種子組織中賦予可檢測表型，其可以與標記基因的表型區(qū)分開。 由鑒定序列賦予的表型可以包括改變的種子發(fā)芽。鑒定序列可以在種子
(仁)的一個或多個部分中表達，包括胚、胚乳、子葉和種皮(外種皮)， 從而使得可以辨別表型。
鑒定序列還可以引起無種子表型。為了實現(xiàn)組織切除，在一個實施 方案中，鑒定序列指導6/e/7/9-wa7W或在植物中的胚珠特異性表達
(例如Rotino等人1997, Carmi等人2003 ， GenBank AM422760， X64255,
1AE009418 )，這取消了胚珠發(fā)育且導致在包含標記和鑒定序列的子房中 的無種子表型。在另外一個實施方案中，鑒定序列指導OsCDPK2在谷 類農作物中的超表達，從而破壞種子發(fā)育(Morello等人2000;例如， GenBank Y13658 )。
遺傳元件還可以設計為抑制內源基因的表達，從而導致產生允許區(qū) 分包含標記基因的種子與不包含的那些的種子表型。這種鑒定序列的遺 傳元件與標記基因物理連接，例如包埋在標記DNA盒內，從而使得種 子表型與標記的存在連鎖，允許快速鑒定包含標記的種子。
RNAi可以用于沉默一種或多種基因，從而導致容易評分、優(yōu)選可 見的種子表型。RNAi介導的種子表型所需的DNA序列位于與標記基因
將容易鑒定。此種種子將無需進行生長且就標記基因的存在進行篩選。 因此，僅不含由鑒定序列賦予的表型的種子進行生長和/或就GOI的存 在進行篩選。依賴于種子來自自花傳粉還是異型雜交，這種方法減少了 需要種植且對于自交植物物種通過至少3X或對于異型雜交植物物種通 過IX篩選的種子數目。
可以用于使用RNAi相關途徑沉默靶基因的廣泛多樣的組合物是本 領域技術人員已知的。 一個實施方案是裝配DNA盒，所述DNA盒將轉 錄序列的反向重復，以產生雙鏈RNA (dsRNA), —般長度是至少約 19-21 bp且對應于耙向用于沉默的 一種或多種基因的部分。dsRNA長度 可以是約19-21 bp且對應于靶向用于沉默的一種或多種基因的部分。包 括鑒定序列的這種DNA盒位于與選擇標記基因相同的T-DNA內。本領 域技術人員已知的沉默基因的其他方法包括但不限于共抑制、反義、 miRNAs (天然或改造的)的表達、反式作用siRNAs的表達和核酶的表 達。如果基因沉默效應所需的序列位于與標記基因相同的T-DNA中， 那么可以使用這些方法中的任何一種。
鑒定序列可以增加或減少種子大小。在一個實施方案中，鑒定序列
予爿尸2基因(例如，GenBank U12546 )的下調，這導致包含鑒定序列 和選擇標記基因的較大種子。還可以通過j/^2基因(Schruff等人，2006; 例如，GenBank登記NM—203251; NM—180913 )或JAT轉錄因子 (Mizukami和Fisher, 2000;例如，GenBank NM 202701、 NM 119937、NM—180024、 NM—101474、 NM—202110 )的異位表達來達到較大的種子 大小。在另一個實施方案中，鑒定序列通過反義或RNAi或共抑制技術 來傳遞Zj C2 (例如，GenBank AF400123 )或GenBank AB101657、 AB101656、 AB101655 )基因的下調，這導致減少的種子大小(Mendoza 等人，2005; Radchuk等人，2006)。改變的種子大小可以通過人工和/ 或機械方法經由重量、形狀或篩分容易地分選。
檢測表型的種子。用這種方式可以有效篩選大量種子，并且可以收集缺 乏鑒定序列的種子。自動化技術可以比依賴人類技術員更快速、更廉價 和更精確。已描述了可以以這種方式使用的此種種子分選機。例如，美 國專利號4,946,046描述了用于根據顏色分選種子的裝置。在這種機器 中，通過將種子置于旋轉鼓中一致的凹槽行中且使種子在數字成像相機 和光源下經過根據顏色分選種子。通過相機閱讀圖像且輸入計算機，所 述計算機還接受來自鼓速度傳感器的信息。計算機產生引起氣流吹過包 含有色種子的凹槽底部的開口的信號，以收集此種種子。將收集的種子 注入收集漏斗內，并且將無色種子注入分開的漏斗內。
通過改變用于檢測有色種子的光源的波長，以及置于有色種子和檢 測相機之間的屏障濾光片，可以用這種技術檢測可能地任何鑒定標記。 例如，為了檢測表達GFP的種子，激發(fā)波長在藍光UV譜中， 一般在約 395 nm處。用于UV發(fā)射的合適的光源是本領域技術人員眾所周知的并 且包括氱和汞燈。合適的濾光片組也是本領域技術人員眾所周知的，并 且包括例如BP450-4卯激發(fā)器濾光片、FT510彩色分束器和BP515-565 屏障濾光片(Carl Zeiss, Inc., Thornwood， NY)。此種濾光片組和發(fā) 射波長在Heim和Tsien, 1996中更詳細討論，其^^開內容特別整體引 入本文作為參考。
通過使用包括一種或多種鑒定序列的構建體，選擇能力可以擴展至 多種選擇和/或篩選基因和目的基因。因此，可以有效篩選表示多種不同 的轉化事件的大量轉基因種子，并且可以選擇僅具有(或缺乏)所需鑒 定序列組的那些種子。
重組DNA載體可以例如是線性DNA區(qū)段或閉合環(huán)狀質粒。載體系 統(tǒng)可以是單個載體或質?；蛘咭黄鸢胫参锘蚪M內的總DNA 的2個或更多載體或質粒。如本文所述的核酸分子可以例如適當地插入
19載體內在合適的啟動子的控制下，所述啟動子在植物細胞中起作用，以
驅動連接的編碼序列或其他DNA序列的表達。許多載體可用于這個目 的，并且合適的載體的選擇將主要依賴于待插入載體內的核酸的大小和
待用載體轉化的具體宿主細胞。依賴于其功能和與之一起使用或相容的 具體載體和植物細胞，每個載體包含各種組分。
適合于穩(wěn)定轉化植物細胞或確立轉基因植物的許多載體是眾所周 知的，例如Gelvin等人(1990)。 一般地，植物表達載體包括但不限于， 一個或多個目的基因轉錄單位，其中每個包括5'非翻譯區(qū)，其包括控 制可操作地連接的蛋白質編碼序列("可讀框"，ORF)的轉錄(例如， 順式作用啟動子序列例如增強子、轉錄起始開始位點等)和翻譯(例如， 核糖體結合位點)的序列；3'非翻譯區(qū)，其包括來自植物基因的3'末端 的另外調節(jié)區(qū)(Thomburg等人，1987) ; An等人，1989 ),例如3'終 止子區(qū)以增加mRNA穩(wěn)定性?？商娲?，植物表達載體可以設計用于表 達mRNA分子，其例如可以通過RNAi介導的方法改變植物基因表達。 此外，此種構建體通常包括選擇和/或篩選標記轉錄單位和任選地復制起 點或載體在細菌宿主細胞中復制所需的其他序列。
構建體還可以包含在細菌細胞中提供復制功能和抗生素選擇的質 粒主鏈DNA區(qū)段，例如，大腸桿菌(E^c/2enc/n'a co/z')復制起點例如 on322、廣宿主范圍復制起點例如on'V或oriRi、和關于選擇標記的編碼 區(qū)，例如編碼賦予對于壯觀霉素或鏈霉素的抗性的Tn7氨基糖普腺芬酸 轉移酶(aat^)的Spec/Strp，或慶大霉素(Gm, Gent)選擇標記基因。 對于植物轉化，宿主細菌菌林通常是攜帶具有用于表達單位的轉移功能 的質粒的才艮癌土 i裒桿菌(」gra6a"en力m fwwe/ac/em ) ABI 、 C58 、 LBA4404、 EHA101或EHA105。植物轉化領域技術人員已知的其他菌 林可以在本發(fā)明中起作用。
植物表達載體任選包括RNA加工信號，例如可以在轉基因中置于 多肽編碼序列的上游或下游的內含子。此外，表達載體還可以包括來自 植物基因的3'非翻譯區(qū)的另外的調節(jié)序列。這些3'非翻譯區(qū)包含mRNA 轉錄終止信號。包含在植物表達載體中的其他可移動元件可以包括5'前 導序列、轉運信號序列和編碼序列。
表達和克隆載體可以包含選擇基因，也稱為植物選擇標記。這種基 因編碼在選擇性培養(yǎng)方案中生長的轉化植物細胞的存活或生長所需的蛋白質。 一般的選擇基因編碼賦予對于選擇劑的抗性的蛋白質，所述選 擇劑例如抗生素，包括除草劑或其他毒素，例如新霉素、氨曱蝶呤、麥 草畏、草銨膦或草甘膦。用異源蛋白質或其片段成功轉化的那些細胞產 生賦予例如抗藥性的蛋白質，且從而經受得住選擇方案。各種選擇/篩選
/可評分標記的例子和編碼其的基因公開于Miki和McHugh, 2004中。
用于生產mRNA的表達載體還可以包含誘導型或組織特異性啟動 子，其在宿主植物細胞中被識別且與編碼目的核酸分子或其片段的核酸 可操作地連接。植物啟動子在下文得到討論。
在一個實施方案中，使用的植物轉化載體包括分離和純化的DNA 分子，包括與本發(fā)明的 一種或多種核酸序列可操作地連接的異源種子特 異性啟動子。在另一個實施方案中，啟動子是種子表達的，但不是種子 特異性的。植物轉化載體可以包含來自一種或多種基因的序列，從而允 許在植物細胞中生產超過一種mRNA。本領域技術人員將容易理解可以 將DNA的區(qū)段組合到單個復合DNA區(qū)段內用于在轉基因植物中表達。 認為用于與本發(fā)明 一 起使用的用于轉化宿主細胞的合適方法包括 通過其可以將DNA引入細胞內的事實上任何方法(參見，例如Miki等 人，1993 ),例如通過原生質體的轉化(美國專利號5,508,184; Omirulleh 等人，1993 )、通過干燥/抑制介導的DNA攝取(Potrykus等人，1985 )、 通過電穿孔(美國專利號5,384,253 )、通過用碳化硅纖維攪動(Kaeppler 等人，1990;美國專利號5,302,523;和美國專利號5,464,765 )、通過 土壤桿菌屬介導的轉化(美國專利號5,563,055; 5,591，616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; 6,384,301 )和通過DNA包被粒子的加速(美國 專利號5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 6,403,865; Padgette等人1995 )等。通過諸如這些的技術的應用，可以穩(wěn)定轉化事 實上任何物種的細胞。在多細胞物種的情況下，轉基因細胞可以再生成 轉基因生物。
用于將表達載體引入植物內的最廣泛使用的方法基于土壤桿菌屬 的天然轉化系統(tǒng)(例如，Horsch等人，1985 )。根癌土壤桿菌和發(fā)根土 壤桿菌(A r/nzoge"e^ )各自的Ti和Ri質粒攜帶負責植物的遺傳轉化的 基因。土壤桿菌屬載體系統(tǒng)和用于土壤桿菌屬介導的基因轉移的方法的 描述由眾多參考文獻提供，包括Gruber等人，1993; Miki等人，1993, Moloney等人，1989,以及美國專利號4,940,838和5,464,763。其他細
21菌例如與植物天然相互作用的中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和中生根瘤菌屬
可以進行修飾以介導至眾多不同植物的基因轉移(Broothaerts等人， 2005 )。這些植物相關的共生細菌可以通過獲得使得無效的Ti質粒和 合適的二元載體制備成感受態(tài)的用于基因轉移。待經由土壤桿菌屬介導 的轉化法轉移的DNA序列包括通常限定轉移DNA (T-DNA)范圍的一 個或多個"邊界"序列，例如右邊界(RB)和左邊界(LB)序列，所述 轉移DNA包含在植物細胞中待表達的一種或多種基因，且可以進一步 包括增強子序列，例如如美國臨時專利申請?zhí)?0/831,814中公開的超驅 動序列(Toro等人，1989 )或多個超驅動序列，所述美國臨時專利申請 引入本文作為參考。
在棉花轉化的背景中可以特別有用的技術公開于美國專利號 5,846.797、 5,159,135 、 5,004，863和6,624,344中。用于轉化蕓苔屬 (v5ra^,c")植物的技術特別公開于例如美國專利5,750,871中；且用于 轉化大豆的技術公開于例如Zhang等人，1999，美國專利6,384,301和 US 7,002,058中。用于轉化玉米的技術公開于WO9506722中?？梢栽?本發(fā)明中找到用途的植物的一些非限制性例子包括苜蓿、大麥、豆類、 甜菜、嫩莖花椰菜、甘藍、胡蘿卜、低芥酸菜子、花椰菜、芽菜、大白 菜、玉米、棉花、黃瓜、干菜豆、茄子、茴香、四季豆、銀果、韭、萵 苣、瓜、燕麥、秋葵、洋蔥、豌豆、胡椒、南瓜、花生、馬鈴薯、南瓜、 蘿卜、稻、高粱、大豆、菠菜、西葫蘆、甜玉米、甜菜、向日葵、番茄、 西瓜和小麥。
載體或構建體還可以包括各種調節(jié)元件。5'非翻譯前導序列可以衍 生自選擇用于表達本發(fā)明的DNA分子的異源基因序列的啟動子，并且 若需要則可以特別修飾以便增加mRNA的翻譯。5'非翻譯區(qū)還可以得自 植物病毒RNAs (例如煙草花葉病毒、煙草蝕斑病毒、玉米矮花葉病毒、 苜?；ㄈ~病毒)，來自合適的真核基因、植物基因(小麥和玉蜀黍葉綠 素a/b結合蛋白質基因前導區(qū))或來自合成基因序列。前導序列還可以 衍生自無關啟動子或編碼序列。在本發(fā)明的背景中有用的前導序列包括 玉蜀黍Hsp70前導區(qū)(整體引入本文作為參考的美國專利號5,362,865 和美國專利號5,859,347 )和TMVw元件(Gallie等人，1989 )。翻譯前 導序列的例子尤其包括玉蜀黍和矮牽?；峒さ鞍浊皩^(qū)(美國專利號 5,362,865 )、植物病毒外殼蛋白質前導區(qū)、植物核酮糖二磷酸羧化酶-
22加氧酶前導區(qū)、GmHsp (美國專利5,659,122 ) 、 PhDnaK ("美國專利5,362,865 ) 、 AtAntl、 TEV ( Carrington和Freed, 1990) 、 AGRtunos(GenBank登記V00087; Bevan等人，1983 ) 、 OsActl (美國專利5641876 ) 、 OsTPI (美國專利號7,132,528 )和OsActl5 (美國
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