專利名稱：：純化流感病毒的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及對不同量的流感病毒或其衍生物的純化。特別地，本發(fā)明提供了一種快速有效并可放大的用于純化可用于人類(例如預防性應用，如疫苗接種)的商業(yè)量流感病毒的方法。
背景技術：
：流感病毒屬于正粘病毒科，并才艮據抗原性差異分為曱型、乙型和丙型。甲型和乙型流感病毒是重要的呼吸系統(tǒng)病原體，而甲型流感病毒是造成高致死率流行病的主要原因。流感病毒具有分段的、單鏈的負鏈RNA基因組。甲型流感病毒的基因組由編碼ll種(有些甲型流感病毒林為10種)蛋白質的8個RNA分子組成。病毒包膜由位于基質蛋白(Ml)層上的脂雙層構成。糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)包埋在脂雙層中，它們分別負責病毒附著并侵入細胞以及從受感染細胞中釋放出子代病毒。這兩種蛋白質還決定了甲型流感病毒的亞型。由于分段的基因組所致的高突變率和頻繁基因重排導致了曱型流感病毒的強免疫學變異性，特別是HA和NA抗原。乙型病毒不呈現出相同程度的抗原變異性并且主要是兒童病原體，其偶爾可以造成像甲型病毒同樣嚴重的流行病。流感的潛伏時間為l到5天。臨床發(fā)病特征為突然發(fā)燒、頭疼、不適和肌肉疼痛。全身癥狀通常持續(xù)3天。盡管沒有所有國家的流感相關死亡4的準確數據，但在美國，在年齡大于65歲的A^中與流感相關的死亡為每100000人中30到150人。在流感流行時，1%-5%的發(fā)病率是非常常見的，但;UC病率也可以達到40%-50%。因此，流感流行或甚至大流行在經濟上的影響可以是巨大的。疫苗接種被認為是限制流行及其有害影響的最佳方法。自從1940年代引入以來，已經發(fā)現基于培養(yǎng)于雞蛋中病毒材料的疫苗能明顯有效地抵抗流感的感染并顯著降低高危A^中的死亡率。早期的疫苗被雞蛋來源的成分高度污染，并且高致熱且缺乏效力。為了克服這些問題，嘗試了許多不同的純化流感病毒的純化技術和方法。Veerarghavan和Sreevalsan(1961)比較了幾種不同的濃縮和純化流感病毒的方法，并發(fā)現兩輪磷酸鋁處理是最好的方法，然后超速離心、紅細胞吸附、單輪磷酸鋁處理，最后是氧化鋅方法。1960年代，報道了在磷酸鉀和瓊脂糖凝膠柱上對流感病毒進行小規(guī)模色鐠純化的早期嘗試(Pepper，1967)，但在實驗中沒有測定病毒的感染性。Wallis等(1972)表明了在低于6.0的低pH條件下流感病毒可以吸附到不溶性聚電解質上，隨后在高pH值條件下被洗脫。因為病毒對pH值敏感以及沒有測定純化后病毒的感染性，該方法純化感染性流感病毒的適用性是未知的。也嘗試了用聚乙二醇沉淀隨后通過受控孔徑玻璃珠進行凝膠滲透色鐠對流感病毒進行純化并與密度梯度方法進行比較(Heyward等，1977)。密度梯度方法所需的時間是沉淀和皿滲透色謙之組合的10倍，而兩種方法獲得的病毒純度是相似的。Sagar等(1980)使用帶正電的"ZetaPlus，，過濾器對流感病毒進行濃縮，但如作者所建議的，仍需要進一步的純化步驟。US-A-3632745描述了通it^"含二價金屬陽離子(例如鎂)的水溶液透析病毒懸液來純化流感病毒。US-A-3485718和3547779都公開了將硫酸鋇用于純化流感病毒。US-A-3478145公開了磷酸釣在純化流感病毒中的用途。US-A-3874999描述了由不同的離心步驟、沉淀(用MgS04)、超濾和透析組成的方法。EP-A-0171086公開了通過使用纖維素硫酸酯或交聯多糖硫酸酯的柱色i普純化流感病毒的方法。所述專利申請僅僅公開了解決M嚢液中純化流感病毒，并且沒有根據仍然未知的病毒感染性來確定病毒的回收率。在病毒吸附到色鐠柱以及清潔步驟之后，用影響病毒感染性并降低感染性病毒回收率的含有高NaCl濃度(1.49M)的緩沖液從所述柱上洗脫病毒。所述方法基于對病毒顆粒具有低動態(tài)結合能力的顆粒載體，另外所述動態(tài)結合能力還強烈地依賴于流速。這些性質顯著影響下游方法，由于需要大的柱尺寸并只能使用低流速，所有這些都導致所述方法相當低的產率。US-A-6008036公開了一種用色鐠從細胞系培養(yǎng)物中純化病毒的一般性方法。所公開的方法包括離子交換色譜步驟，接著是陽離子交換色譜步驟，以及任選地金屬結合親和色鐠步驟。流感病毒純化的主要突破是區(qū)帶超速離心的ib艮(Reimer等，1966)。該技術是流感病毒以及其它病毒疫苗純化方法和工業(yè)生產的一場革命。到目前為止，它仍是流感病毒疫苗下游方法的基礎。通常^泉嚢液中純化流感病毒由離心澄清、超濾濃縮和超速離心純化所組成。這些當前純化流感病毒的方法都很繁瑣，無法輕易地用于為所要求純度的疫苗快速大，的生產病毒原料。將來可能發(fā)生新的流感流行和大流行，而當前基于雞蛋的疫苗生產凈支術似乎無法應對大流行的危機。因此，需要能夠快速生產新型流感疫苗的系統(tǒng)。其中一種這樣的方法是能夠輕易放大的基于細胞培養(yǎng)的方法。但是現有的流感病毒疫苗的純化方法跟不上該需求。最近，還有報道描述了一種包括深層過濾、滅活、超濾和凝膠過濾的可放大的流感病毒純化方法(PrasadNayaketal,2005)。由于病毒是滅活的，用該方法純化感染性流感病毒的適用性仍是未知的。因此，仍然需要一種快速、可放大、有效并且廉價的純化流感病毒的下游方法以用于需要純的具有免疫原性和/或感染性病毒的疫苗或任何其它應用。本發(fā)明公開了這樣的方法。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及一種純化流感疫苗或其衍生物的方法，其包括提供具有流感病毒或其衍生物之來源的步驟，任選地對所述來源進行預純化步驟，然后在平均孔徑為至少20nm的多孔顆粒、灌注顆粒(perfusionparticle)、6殼包凝膠顆粒(gel-in-a國shellparticle)、觸角型顆粒(tentaclelikeparticle)、膜吸附劑以及整體柱(monolith)上進行至少一個色鐠步驟，然后收集洗脫的含流感病毒或其衍生物的級分，附加條件是排除纖維素硫酸酯或交聯多糖硫酸酯。在本發(fā)明一個實施方案中，在選自平均孔徑為至少20nm的多孔顆粒、灌注顆粒、殼包:^顆粒、觸角型顆粒、膜吸附劑以及整體柱的材料上實施所述至少一個另外的色譜步驟。術語觸角型顆粒對于普通技術人員來說是公知的。在EP-A-0337144中公開了屬于此類的典型材料。同樣，術語殼包皿顆粒為本領域所使用的術語。例如，根據殼包皿技術生產的材料包含從在固體載體(如陶瓷載體)之大孔內聚合的高性能水凝膠所形成的結構。所述載體也可以從有機材料制備。例如，US-A-5268097或5234991中公開了這類構造。EP-A-0337144提到了包含由通過接枝聚合用至少一種共價結合的聚合物包被的含脂肪族伯羥基或仲羥基之載體的材料。這些^^質都是商品化的，其商品名為FractogelEMD和FractoPrep,可能還有一些其它的。這些名字在EP-A-0337144中沒有提到。US-A-5268097提到了鈍化多孔固體載體，其表現出高孔隙率、物理強度、高電荷密度、高流速和化學穩(wěn)定性。通過在其多孔表面上施加薄的保護性聚合物層使鈍化多孔固體載體穩(wěn)定化，以免在惡劣環(huán)境條件下浸出，并且其具有以下特征，即可逆的高吸附能力并基本上不伴隨非特異性吸附生物分子或與其相互作用。其商品名為HyperD。US-A-5234991提到了用具有陽離子性質的胺化多糖聚舍物包被的多孔礦物載體。術語灌注顆粒在本領域也是眾所周知的。US-A-5384042、US-A-5552041、US-A-5605623和US-A-5833861中公開了屬于此類的材料，并以商品名"POROS⑧，，市售。US-A-5384042、US-A-5552041、US-A'5605623和US-A-5833861公開了由相互連接的第一和第二組孔以及用于與所述第二組孔成員流體連通的溶質相互作用的高比表面積所限定的基質。所述第一和第二組孔表現為例如顆粒間的空隙和顆粒內的貫穿孔。該孔的尺寸使得在高流體itit下兩組孔中發(fā)生對流，而且對流流速超過了第二組孔中溶質擴散的速率。這些參考文獻和EP-A-0337144以參考形式并入本文。此外，本發(fā)明涉及制備流感病毒的方法，所述方法包括用流感病毒感染細胞、在所述細胞中擴增流感病毒、收獲所述流感病毒以及根據本發(fā)明純化流感病毒或其衍生物的方法對所收獲的流感病毒或其衍生物進行純化的步驟。本發(fā)明的方法適用于實驗室和商業(yè)用量的流感病毒的純化，例如，用作疫苗或病毒載體。本發(fā)明有利地避免了與純化流感病毒的現有方法相關的問題，并依賴于能夠簡單放大所述方法的超濾和色鐠技術。本發(fā)明的方法完成了從細胞裂解物中純化流感病毒顆粒，其任選地采用了超濾，隨后是病毒結合和之后從色譜栽體上洗脫的步驟，以及最后的從所剩雜質中純化出病毒以及同時更換此步驟之前病毒所處緩沖液的步驟。本純化方法極大的降低了流感病毒樣品中的污染物水平并使得純化后的流感病毒能夠應用于人。本發(fā)明的純化方法允許使用多種已知在實驗室或工業(yè)級水平上可用于分離生物材料的市售超濾裝置和色譜栽體。超濾裝置可以包括平板或中空纖維設計，而色鐠載體包括具有不同活性基團和不同床類型(多孔顆粒、膜、整體柱)的不同基礎材料(天然和合成聚合物)。由于條件溫和而能夠基本上維持流感病毒的效力，如免疫原性和/或感染性，所以本發(fā)明的方法是有利的。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述洗脫緩沖液包含^1MNaCl，優(yōu)選地為S0.8MNaCl，優(yōu)選地為^0.5MNaCl，或者為￡0.31\1&(:1。同樣地，當采用本發(fā)明的方法時，還可能保持流感病毒或其衍生物的結構完整性。當采用本發(fā)明的方法時，所述流感病毒或其衍生物基本上不含DNA從而可以避免用脫氧核糖核酸酶類(DNAse)進行處理。圖l:色鐠圖，其顯示出從三根并聯的CIM⑧QA8ml管式整體柱中流感病毒的洗脫曲線。圖2:色語圖，其表示從S印harose6FastFlow(^JM^號70/卯，2000ml)中流感病毒的洗脫曲線。圖3:在CIMQA整體柱和Sepharose6FastFlow柱上純化的級分的SDS-PAGE和Western印跡分析。圖4:在CIMQA整體柱上純化的級分的Southern印跡分析。圖5:色鐠圖，其顯示出CIMDEAE盤式整體柱上流感病毒的洗脫曲線。圖6:色旙圖，其顯示出CIM⑧QA盤式整體柱上流感病毒的洗脫曲線。圖7:色鐠圖，其顯示出CIM⑧EDA盤式整體柱上流感病毒的洗脫曲線。圖8:流感病毒在QSepharoseXLVims上的純化。圖9:流感病毒在CIM⑧QA盤式整體柱上的純化。圖10:流感病毒在MustangQ膜上的純化。圖11:流感病毒在Sepharose6FastFlow上的洗脫曲線。圖12:流感病毒在Fractoge^BioSEC上的洗脫曲線。圖13:流感病毒在ToyopearlHW-75上的洗脫曲線。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及對有用量的任何流感病毒或其衍生物的純化方法的開發(fā)，特別是滿足實驗室或工業(yè)規(guī)模需要而用作疫苗或病毒載體的流感病毒或其衍生物。本發(fā)明避免了與現有流感病毒純化方法有關的問題并依賴于使得過程放大簡單易行并能提高生產效率的超濾和色鐠技術。現有的流感病毒純化方法基于超速離心，因此持續(xù)時間長，效率低并難以放大。根據本發(fā)明，通過下列步驟純化流感病毒或其衍生物，所述步驟為提供含有流感病毒或其衍生物的來源，任選地對所述來源進行預純化步驟，然后在平均孔徑為至少20nm的多孔顆粒、膜吸附劑和整體柱上進行至少一個色謙步驟，收集洗脫的含有流感病毒或其衍生物的級分。通常，具有9約10nm到約50nm顆粒尺寸的所述多孔顆粒按壓汞法測得具有約20nm到約500nm或更大的平均孔徑。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以在優(yōu)選地選自平均孔徑為至少20nm的多孔顆粒、灌注顆粒、殼包凝膠顆粒、觸角型顆粒、膜吸附劑以及整體柱的材料上實施至少一個另外的色譜步驟。優(yōu)選地，流感病毒的洗脫在溫和條件(即洗脫緩沖液的離子強度低)下實施。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在多孔顆粒、膜吸附劑和整體柱上實施至少一個色鐠步驟后，實施超濾和/或過濾除菌。在多孔顆粒、膜吸附劑和整體柱上實施的所述至少一個色譜步驟可以釆用離子交換、親和、疏水或親水相互作用、體積排阻材料或其組合來實施。在另一個實施方案中，可以在色鐠步驟之前或之后加入DNA核酸酶。任何已知的流感病毒或其衍生物的上游生產方法可用于生產本發(fā)明純化方法所用的起始材料。流感病毒或其衍生物的合適來源為任何支持流感病毒復制的真核細胞。優(yōu)選的宿主細胞為支持流感病毒感染和復制的哺乳動物宿主細胞系。根據本發(fā)明，流感病毒的衍生物特別地是遺傳改造的流感病毒或病毒樣顆?；蜻f送外源物質(如生物或藥物活性物質，例如生物聚合物以及小分子)的流感病毒顆粒(病毒載體)。生物聚合物特別地為蛋白質，如抗體、受體酶；核酸(反義核酸)、脂類或多糖?？梢岳鐝恼婧思毎磉_的流感病毒蛋白或者通過體外操作流感病毒和/或包含流感病毒的分子產生流感病毒樣顆粒。對流感病毒基因組的遺傳操作可以包括突變、缺失、插入或對流感病毒基因組的任何其它操作。特別地，所述流感病毒含有NS1基因的至少一種修飾和/或缺失。因此，在本發(fā)明的方法中，所述流感病毒或其衍生物選自野生型流感病毒、含有修飾(包括替換、突變、插入和/或缺失)的流感病毒和免疫原性流感病毒樣顆粒。根據本發(fā)明的純化方法還用于生產流感病毒的方法中，其包括用流感病毒感染細胞、在所述細胞中擴增流感病毒、收獲流感病毒以及對所收獲的流感病毒或其衍生物實施本發(fā)明純化方法的步驟。特別地，本發(fā)明公開并要求保護一種生產或純化流感病毒或其衍生物的方法，所述方法包括以下步驟-用流感病毒感染細胞；-在所述細胞中擴增所述流感病毒；-收獲所述流感病毒；-在具有300kDa截斷值的平板或中空纖維裝置上用切向流過濾濃縮所收獲的流感病毒；-將濃縮后的流感病毒加到CIMQA整體柱；-將從CIMQA整體柱上洗脫的流感病毒級分加到Sepharose6FF柱；畫從Sepharose6FF柱收集流感病毒級分；-對流感病毒ii行過濾除菌。本發(fā)明的主題還包括可以根據本發(fā)明流感病毒或其衍生物純化方法得到的流感病毒或其衍生物的級分，以及任選地包含佐劑和/或可藥用載體的疫苗?？筛鶕景l(fā)明得到的包含流感病毒載體的級分也是本發(fā)明的主題。流感病毒載體可以包含可以從流感病毒載體轉移到宿主細胞的異源核酸序列。異源核酸序列可以編碼治療性蛋白質、治療性核酸或者可以在生物體內產生免疫應答的蛋白質。將異源核酸引入到病毒載體中的方法在本領域中是公知的。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述預純化步驟包括離心、過濾、超濾、選擇性沉淀、膨脹床色鐠、包含磁性珠的批處理色鐠或其組合。通常在預純化步驟中，從細胞裂解物中除去細胞碎片和其它污染物，其可以另外地調節(jié)到最適于下一步純化的條件。特別地，預純化步驟可以包括離心、過濾和超濾。還可進行使用聚乙二醇或任何其它化合物的選擇性沉淀，其造成流感病毒或污染物沉淀。膨脹床色鐠和批處理色譜可用作預純化步驟以避免如色鐠柱被細胞碎片阻塞和堵塞的問題。無論是野生型、突變體或是重組病毒或病毒樣顆粒，任何流感病毒都可以通過本發(fā)明進行純化。根據本領域已知的方法，可以制備和培養(yǎng)流感病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述流感病毒或其衍生物選自野生型流感病毒、包含突變(包括插入和缺失)的流感病毒以及流感病毒樣顆粒。突變是核,列的改變，其導致相關基因所編碼的蛋白質的M^列的改變。缺失是指某核酸區(qū)域被消除的突變。插入是指在核酸序列中插入另外一段>^#。流感病毒樣顆?？梢詮牟煌婧思毎磉_的流感病毒蛋白產生。特別地，流感病毒樣顆粒A^疫原性的，其意味著當這些顆粒i^某一生物體后引M疫應答。本文中所描述的方法允許在水性介質中回收高濃度的純化感染性流感病毒顆粒。所述方法適用于制備實驗室或工業(yè)用量的任何流感病毒顆粒。更詳細地描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于所述的實施方案?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何方法擴增和制備流感病毒。所述病毒可以根據文獻中所說明的已知方法培養(yǎng)于雞蛋中或細胞培養(yǎng)物中。優(yōu)選地，流感病毒收獲自病毒感染的細胞，例如Vero細胞。為了優(yōu)化產率，可以在高感染復數下感染細胞?？梢允褂萌魏芜m于從感染細胞中回收病毒的方法?？梢酝ㄟ^離心然后過濾來除去細胞碎片。離心后過濾或不過濾都是可行的，但是在本發(fā)明中兩種方法的組合可能是最穩(wěn)健的澄清方法。對于較小的體積，可以進行批處理離心，但^l:對于較大的體積(大于50L)，連續(xù)離心優(yōu)于批處理方法?？梢钥紤]過濾步驟以進一步除去細胞碎片并增加方法的可靠性。維持良好澄清度和總產率之間的平衡需要研究大量過濾形式。一種示例性過濾使用0.65-0.45pm的醋酸纖維素過濾器。接著可以對包含流感病毒的澄清的裂解物使用色鐠技術，或它可以首先用超濾濃縮然后再在色鐠柱上純化。優(yōu)選釆用切向流超濾，并且可以使用不同的裝置(例如，Millipore公司的Proflux和LabscaleTFF系統(tǒng))。所選的具體超濾膜的尺寸足夠小到截留流感病毒但又足夠大到有效清除雜質。才艮據生產廠家和膜類型的不同，100到1000kDa的標稱截留分子量12可能是合適的(例如，GEHealthcare公司的UFP-750-E-5A;Millipore公司的BiomaxNMWC1000)。所述膜的組成可以是但不限于再生纖維素、聚醚砜、聚砜。膜可以是平板膜或中空纖維膜。超濾過程中，濃縮倍數將是培養(yǎng)M(包括培養(yǎng)基、細胞密度和病毒生產效率)的函數，并可以由技術人員進行調整。近似地，例如，以本身公知的方式，IO倍濃縮是有用的。應該優(yōu)化的典型^lt有通量率和跨膜壓。結合標稱截留分子量，這兩個^t應能夠同時實現有效雜質去除和高病毒產率。技術人員知道如何處理這些參數并能輕易地設計優(yōu)化實驗。超濾時，特別地至少80%的宿主細胞蛋白質與流感病毒分離開并能在滲透液中檢測到。特別地，通過使用截留分子量為300kDa、500kDa和750kDa的膜，通常，超過卯％的蛋白質與病毒分離，而所述病毒則保留在保留物(retenate)中。所述病毒可以根據其表面電荷進行進一步純化。如所提到的，可以用離子交換色語純化澄清裂解物或通^濾制備的濃縮物。澄清裂解物或濃縮物可以直接上樣于色i普柱，或者為了實現本方法的最大效率可以調整到某些M下上樣。不同的緩沖溶液可用于調節(jié)和離子交換色譜步驟?？梢栽陔x子交換色鐠步驟中使用的緩沖液實例包括磷酸鹽、檸檬酸磷酸鹽、Tris-HCl、MOPS、HEPES等。還可以配制加入了穩(wěn)定劑(例如，如蔗糖的二糖類)的緩沖液。離子交換色譜步驟允許使用多種已知用于生物材料分級分離的市售色鐠材料。不同基礎材料(天然或合成聚合物)的色鐠載體可在本發(fā)明中使用。這些基礎材料可以具有不同的形狀，包括顆粒載體、膜和M柱。陰離子交換色譜可以通過采用多種官能團來實施，所述官能團包括但不限于DEAE(二乙基胺)、EDA(乙二胺)和QA(季銨)。這些官能團可以連接到任何適用于本發(fā)明的樹脂上。陽離子交換色鐠也可以用于流感病毒的純化，其包括但不限于，連接到任何適合樹脂上的S03(磺?；?和CM(羧甲1^)官能團。將澄清裂解物或通it^濾制備的濃縮物調節(jié)到下述條件，即在此IHf下流感病毒可以結合到所述色鐠載體表面上帶正電荷(陰離子)和負電荷(陽離子)的官能團上。1^，使用離子強度增加的緩沖液將結合的病毒13顆粒從色鐠載體上洗脫下來。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法的離子交換色譜步驟中使用基于聚(甲基丙烯酸縮7jc甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)基質并帶有季銨(QA)官能團的整體柱載體(例如，CIIV^QA整體柱)。澄清細胞裂解物或超濾濃縮物可以調節(jié)到能使流感病毒結合到色鐠載體帶正電官能團上的條件。優(yōu)選地，此步驟采用了pH值介于7到8之間的具有高緩沖能力的緩沖液(例如Tris、HEPES)。在此條件下，帶負電荷的病毒顆粒結合到整體柱載體表面上帶正電荷的官能團。例如通過增加緩沖液的離子強度(特別地，使用氯化鈉)實現所述病毒顆粒的洗脫。該陰離子交換色鐠步驟也可以用于除去DNA。由于宿主細胞DNA帶負電荷，它將會結合到色鐠載體表面的官能團上。相比于流感病毒，在更高的離子強度下從所述陰離子交換載體上洗脫DNA。在適于流感病毒洗脫的離子強度下，從陰離子交換柱上洗脫下來的物質將不包含宿主細胞DNA。因而，在優(yōu)選的實施方案中，不需要用脫氧核糖核酸酶(例如，Merck7〉司的Benzonase)處理含流感病毒的溶液。與此相反，優(yōu)選在本發(fā)明中不使用脫氧核糖核酸酶，因為DNA斷裂和尺寸的減小會增加最終流感病毒匯集物中的DNA含量，同樣也必須從預期用于人的終產品中除去脫氧核糖核酸酶。可以根據其大小進一步純化從陰離子交換柱上洗脫下來的流感病毒樣品。優(yōu)選地，與此同時，將病毒從陰離子交換柱上洗脫下來的緩沖液也會或多或少地發(fā)生交換。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選體積排阻色鐠和切向流過濾。兩種方法都能在幾乎相同的時間里實現雜質去除和緩沖液交換。切向流超濾是一種可用于除去殘留蛋白質和核酸以及將工作緩沖液交換成最終制劑緩沖液的方法。優(yōu)選使用切向流的超濾，并且可以使用不同的裝置(例如，Millipore公司的Proflux和LabscaleTFF系統(tǒng))。所選的具體超濾膜應具有足夠小到可以保留流感病毒但又大到能夠使雜質穿過的過濾孔徑。才艮據生產廠家和膜類型的不同，標稱截留分子量為100到1000kDa(例如，GEHealthcare公司的UFP-750-E-5A;Millipore公司的BiomaxNMWC1000)可能是合適的。所述膜的組成可以是，但不限于，再生纖維素、聚醚砜、聚砜。膜可以是平擬度或中空纖維膜。必須進行優(yōu)化的主要M為通量率和跨膜壓。結合標稱截留分子量，這兩個M能夠獲得有效的純化和緩沖液交換以及高病毒產率。體積排阻色譜(SEC)也能同時實現的雜質移除和緩沖液交換。SEC允許使用多種已知可用于生物材料SEC的市售色譜材料。本發(fā)明中可以使用不同M材料(天然和合成聚合物)的色譜載體。SEC載體可以具有不同的顆粒尺寸和孔徑。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用具有導致流感病毒顆粒完全被排除在樹脂顆粒的孔之外并因此洗脫在柱的空體積中之孔徑的SEC栽體。與此同時，樹脂顆?？讖綉猑吏得雜質能夠i^而導致與流感病毒顆粒相比較長的洗脫體積，以便進一步純化所述產品。特別地，在一組分離模式中，SEC載體如Sepharose6FF(GEHealthcare)、FractogelEMDBioSEC(MerckkGaA)和ToyopearlHW-75(TosohBioscience)可以用于流感病毒的純化?？梢栽赟EC步驟中使用的緣沖液包括磷酸鹽、檬酸鹽磷酸鹽和其它生物相容性緩沖液。還可以使用穩(wěn)定劑(例如，如蔗糖的二糖類和/或去污劑)來配制緩沖液。還可以在所述緩沖液中加入防止SEC樹脂和流感病毒之間離子相互作用的化合物，如氯化鈉。作為附加步驟，可以實施過濾除菌來消除生物負荷。因此可以用0.22fim過濾器過濾SEC洗脫液或超濾步驟的最終保留物。所述過濾器可以用多種材料構建，其可包括但不限于聚丙烯、纖維素、纖維素酯、尼龍、聚醚砜、或符合低非特異性流感病毒結合要求的任何其它材料。所述過濾器可以具有單層膜或多于一層或者可摻入用相同或不同材料制成的預過濾器。經過濾的流感病毒可以冷凍保存或在約4'C保存以備1^操作使用。本發(fā)明描述了由超濾和色鐠方法構成的流感病毒純化方法。這樣的超濾和色譜方法的放大在本領域中是眾所周知的。本公開的發(fā)明可以用于實驗室級或可以使用前述方法轉到中試或工業(yè)級別。當然，當對流感病毒顆粒沒有嚴格的高純度要求時(這特別地適用于在實驗室級別應用)，可以省略最后一步，即過濾除菌，或最后兩步，即過濾除菌和SEC(或超濾)。實施例實施例1本實施例證明了使用順序如下的切向流過濾、陰離子交換色鐠、體積排阻色譜和過濾除菌的本發(fā)明優(yōu)選的流感病毒純化方法。在GibcoTMOptiPROTMSFM培養(yǎng)基中的Vero細胞中培養(yǎng)具有NS1基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排流感病毒。通過在室溫下以2400rpm離心10分鐘澄清約15000ml細胞裂解物。收集上清液并通過具有0.65-0.45醋酸纖維素膜的SartobranP500cm2的嚢式過濾器進行過通過釆用Proflux系統(tǒng)(Millipore)和具有750kDa標稱截流分子量和0.12m2面積的中空纖維TFF濾筒(GEHealthcare,UFP-750-E-5A)的切向流過濾對所述濾液ii行濃縮?？缒簽?.2到0.3bar.濃縮液的最^f^積為1400ml。接著用三根并列的CIMQA8ml管式整體柱(BIASeparations,總床體積為24ml)進一步純化濃縮液。使用下列緩沖液緩沖液A:50mMHEPES(pH=7.5),緩沖液B:50mMHEPES/0.3MNaCl(pH=7.5)，緩沖液C:50mMHEPES/2.0MNaCl(pH=7.5)。流速為每分鐘300ml。在使用之前，用40倍柱體積的1MNaOH(接觸時間2小時)清潔CIMQA8ml管式整體柱。用20倍柱體積的緩沖液C然后再用20倍柱體積的緩沖液A進行平衡。將1350ml包含所述流感病毒的濃縮液上樣于所述色鐠柱，之后用20倍柱體積的緩沖液A清潔色鐠柱。用緩沖液B洗脫流感病毒，收集到115ml洗脫液。用緩沖液C洗脫結合在柱上的殘留雜質(圖1)。最后，用40倍柱體積的1MNaOH(接觸時間2小時)清潔色鐠柱。使用體積排阻色譜作為最終純化和緩沖液交換步驟。用Sepharose6FastFlow(GEHealthcare,17-0159-05)填充M^號70/950色鐠柱至2000ml床體積(N:4664/m)。采用SPG緩沖液(0.218M蔗糖、0.0038MKH2P04、0.0072MK2HP04、0.0049谷氨酸鉀；pH8.0±0.2)，流速為20ml/分。用5倍柱體積的1MNaOH(接觸時間2小時)清潔色鐠柱并用5倍柱體積的SGP緩沖液平衡。40mlCIMQA洗脫液(2%的柱體積)上樣于所述色鐠柱。包含流感病毒的級分洗脫在所述色鐠柱的空體積中并收集到128ml洗脫液(圖2)。檢測所收集級分中宿主細胞蛋白含量(圖3)、DNA大小(圖4)，用BCA法測定蛋白含量、用Picogreen法測定DNA含量，用TCID50檢測法測定病毒滴度(表1)。結果證實所述方法能夠快速(1天)有效的純化流感病毒。圖3顯示了對在CIMQA整體柱和Sepharose6FastFlow上所純化級分的SDS-PAGE和Western印跡分析。A:用4艮染試劑盒PlusOne(GEHealthcare)染色的PAGEGoldTris誦甘氨酸^M(10-20%)(Cambrex)。泳道1:PageRulerProteinLadder(Fermentas，200、150、120、100、85、70、60、50、40、30、25、20、15、10kDa);泳道2:TFF濃縮物；泳道3:CI]VfQA洗脫液；泳道4:SEC洗脫液；泳道5:Vero宿主細胞蛋白。B:用兔多克隆抗血清和HRP綴合抗-兔抗體檢測Vero宿主細胞蛋白。泳道l:PageRulerProteinLadder(Fermentas，200、150、120、100、85、70、60、50、40、30、25、20、15、10kDa);泳道2:TFF濃縮物；泳道3:CI]V^QA洗脫液；泳道4:SEC洗脫液；泳道5:Vero宿主細胞蛋白。圖4描繪了對在CEV^QA整體柱上所純化級分的Sou仇ern印跡分析。A:用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳。泳道1:DNA標準品(1kbPlusDNALadder,Invitrogen);泳道2:帶DIG標記的DNA分子量標記III(Roche);泳道3:Vero細胞DNA;泳道4:Vero細胞DNA;泳道5:TFF濃縮物；泳道6:CIIV^QA洗脫液。B:采用地高辛標記探針進行的Vero細胞DNA的Southern印記和檢測(DIGHighPrimeDNA標記和檢測初步試劑盒II)。泳道l:DNA標準品(1kbPlusDNALadder,Invitrogen);泳道2:DIG標記的DNA分子量標記III(Roche);泳道3:Vero細胞DNA;泳道4:Vero細胞DNA;泳道5:TFF濃縮物；泳道6:CIM^QA洗脫液。表l:在純化方法的不同步驟中所收集樣品的分析病毒滴度(TCID50/ml)DNA(ng/ml)蛋白質(|jg/ml)收獲物1.0E+07--濃縮物1.0E+081510950CIMQA洗脫液6.3E+081.5240SEC洗脫液1.5E+082.417實施例2在本實施例中，比較了三種不同的陰離子交換官能團。本實施例說明了不同的陰離子交換官能團可用于流感病毒顆粒的純化。在GibcoTMOptiPROSFM培養(yǎng)基中Vero細胞中培養(yǎng)了具有NS1基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室溫下以2400rpm離心10分鐘來澄清細胞裂解物。收集上清液并通過使用LabscaleTFF系統(tǒng)(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Maiipore，PXB300C50)的切向流過濾進行濃縮。濃縮液用于比較三種CI1V^盤式整體柱CIM⑧QA盤式、CIMDEAE盤式和CIMEDA盤式整體柱(BIASeparations),4吏用以下的緩沖液緩沖液A:50mMHEPES(pH=7.5),緩沖液B:50mMHEPES/0.3MNaCl(pH=7.5)，緩沖液C:50mMHEPES/1.5MNaCl(pH=7.5)。將6ml濃縮液上樣于每根色鐠柱上，并用緩沖液B以分步梯度將所述病毒洗脫下來。CIMDEAE盤式柱上的流速為6ml/分(圖5)，CIMQA盤式柱(圖6)和CIM⑧EDA盤式柱(圖7)上的流速為3ml/分。用血凝素檢測法分析洗脫級分中的流感病4^量并計算病毒產率(表2)。結果證實盡管強陰離子(QA)交換柱看上去是最適合的，但是不同的陰離子交換功能基團都可以用于流感病毒的純化。表2:不同陰離子交換CI1V^盤式整體柱上的流感病毒回收率18病毒產率00CIMDEAE25CIM50CIMEDA25實施例3在本實施例中，比較了三種不同類型的色譜栽體。本實施例說明多孔顆粒載體、膜和整體柱可用于流感病毒的純化。在GibcoTMOptiPROTMSFM培養(yǎng)基中的Fm>細胞中培養(yǎng)了具有NS1基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室溫下以2400rpm離心10分鐘澄清細胞裂解物。收集上清液并通過^^用LabscaleTFF系統(tǒng)(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore,PXB300C50)的切向流過濾進行濃縮。濃縮液用于比較三種不同的色鐠載體CIMQA盤式整體柱(BIASeparations)、病毒許可的QS印haroseXL(GEHealthcare)和MustangQcoin(Pall)。4吏用以下的緩沖溶液緩沖液A:50mMHEPES(pH=7.5)，緩沖液B:50mMHEPES/0.3MNaCl(pH=7.5)，緩沖液C:50mMHEPES/1.5MNaCl(pH=7.5)。將一等分試樣的含流感病毒濃縮液以1ml/分的流速上樣到病毒許可的QSepharoseXL柱(1ml床體積)上。用緩沖液B以分步梯度方法洗脫所述病毒。用緩沖液C洗脫包括宿主細胞DNA的殘留雜質(圖8)。將另一等分試樣的病毒濃縮液以3ml/分的流速上樣到MustangQcoin(0.35ml床體積)柱上，而另一等份以6ml/分的流速上樣到CIMQA盤式整體柱上(0.34ml床體積)。用緩沖液B以分步梯度方式從所有單元中洗脫病毒，并且在CIMQA的色i脊圖(圖9)中觀察到兩個峰，而在MustangQcoin的色鐠圖(圖10)中只存在1個峰。用TCID50檢測法分析所收集級分中的流感病毒含量并分析其中的宿主細胞DNA存在情況(Picogreen檢測法)(表3)。表3.從不同陰離子交換載體上洗脫的含流感病毒級分的分析。19<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例4在本實施例中，比較了三種不同類型的體積排阻色譜(SEC)載體。本實施例說明了不同的SEC栽體可用于流感病毒的純化。在GibcoTMOptiPROTMSFM培養(yǎng)基中的細胞中培養(yǎng)了具有NSl基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室溫下以2400rpm離心10分鐘澄清細胞裂解物。收集上清液并通過4吏用LabscaleTFF系統(tǒng)(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore,PXB300C50)的切向流過濾進行濃縮。如實施例1中所描述，所述濃縮液在CIMQA整體柱上進一步純化(BIASeparations)。將在50mMHEPES/0.3MNaCI(pH=7.5)中從CIMQA整體柱上洗脫的流感病毒用于SEC載體的比較。用Sepharose6FF(GEHealthcare)、ToyopearlHW-75(TosohBioscience)和FractogelEMDBioSEC(Merck)裝填HR16/50色鐠柱至床體積100ml并比較它們的分離曲線圖和回收率。對于所有實驗，都采用了SPG緩沖液((U18M蔗糖、0.0038MKH2P04、0.0072MK2HP04、0.0049K-谷氨酸；pH8.0±0.2)。以1ml/分(30cm/小時)的流速，將從CIMQA整體柱上洗脫的含流感病毒級分上樣到不同的SEC載體上。用血凝素檢測法分析所收集級分中的流感病毒含量并計算病毒產率(表4)。在Sepharose6FF(圖ll)和FractogelEMDBioSEC(圖12)上，流感病毒洗脫在色鐠柱的空體積中，而在ToyopearlHW-75柱(圖13)上，病毒與載體相互作用并較晚被洗脫。表4:不同SEC載體上的流感病毒回收率回收Sepharose6FF40.0ToyopearlHW-7546.9FractogelEMDBioSEC54.5實施例5在本實施例中，針對動態(tài)結合流感病毒顆粒的能力而論，比較了四種不同類型的色譜載體。本實施例一方面說明了膜、整體柱和顆粒之間的差別，另一方面與才艮據EP-A-0171086的材料(以Cdufinesulfate為代表)進行比較。在GibcoTMOptiPROTMSFM培養(yǎng)基中的細胞中培養(yǎng)了具有NSl基因的缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通過在室溫下以2400rpm離心10分鐘來澄清細胞裂解物。收集上清液并通過使用LabscaleTFF系統(tǒng)(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore，PXB300C50)的切向流過濾進行濃縮。濃縮液用于比較四種不同的色鐠載體CIMQA盤式整體柱(BIASeparations)、病毒i午可的QSepharoseXL(GEHealthcare),MustangQcoin(Pall)和Celufinesulfate(Chisso)。使用以下緩沖液緩沖液A:50mMHEPES(pH=7.5),緩沖液B:50mMHEPES/0.5MNaCl(pH=7.5)，緩沖液C:50mMHEPES/2.0MNaCl)(pH=7.5)。以限定的流速將濃縮液泵過每根色鐠柱，收集級分并分析存在的流感病毒。在穿透處計算每種載體的動態(tài)結合能力(表5)。一方面在顆粒載體之間(Celufinesulfate和QS印haroseXL)另一方面在整體柱和膜之間(CIMQAandMustangQ)存;著10到100倍的動態(tài)結合能力的差異。這些差異可以顯著影響純化方法的設計。表5:不同載體對流感病毒的動態(tài)結合能力21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例6在本實施例中，比較了4種不同類型的色鐠載體。本實施例說明了顆粒載體、膜和整體柱都可用于流感病毒的純化，但是也可觀察到顯著影響純化方法的差異。在GibcoTMOptiPROTMSFM培養(yǎng)基中的Vero細胞中培養(yǎng)了具有NS1基因和IVR-116缺失的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室溫下以2400rpm離心10分鐘來澄清細胞裂解物。收集上清液并通過4吏用LabscaleTFF系統(tǒng)(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore，PXB300C50)的切向流過濾進行濃縮。濃縮液用于比較四種不同的色鐠載體CIMQA盤式整體柱(BIASeparations)、病毒許可的QSepharoseXL(GEHealthcare)、MustangQcoin(Pall)和Celufmesulfate(Chisso)。使用以下緩沖液緩沖液A:50mMHEPES(pH-7.5)，緩沖液B:50mMHEPES/0.5MNaCl(pH=7.5),緩沖液C:50mMHEPES/2.0MNaCl(pH=7.5)。以0.5ml/分的流速，將包含流感病毒的等分試樣濃縮液上樣到病毒許可的QSepharoseXL柱(0.34ml床體積)和Cdufinesulfate(0.35ml床體積)柱上。將另一等份病毒濃縮液以3.5ml/分的流速上樣到MustangQcoin(0.35ml床體積)，將又一等份以3ml/分的流速上樣到CIMQA盤式整體柱上(0.34ml床層體積)。用緩沖液B以分步梯度洗脫的方式將病毒從所有色鐠柱上洗脫下來。用緩沖液C洗脫包括宿主細胞DNA的殘留雜質。用TCID50和血凝素檢測法分析所收集級分中的流感病毒含量，并用Picogreen檢測法分析宿主細胞DNA含量以及用BCA檢測法分析蛋白含量(表6)。從所測試的栽體上洗脫的級分中病毒、DNA和蛋白含量各有不同。在CIMQA上得到了最高的病毒滴度和病毒回收率，并且該級分具有最高的蛋白含量和低的DNA濃度。從Celufinesulfate上洗脫下來的級分具有最低的病毒滴度和最低的病毒回收率，以及最高的DNA濃度。表6:用緩沖液B從不同陰離子交換載體上洗脫的含流感病毒級分的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>參考文獻PrasakNayakD,LehmannS,ReichlU.DownstreamprocessingofMDCKcel卜derivedequineinfluenzavirus.JChramatograpB,823(2005),75-81.PepperDS.Achromatographicprocedureforthepurificationofinfluenzavirus.JGenVirol,1(1967),49-55.WallisC,HommaA,MefnicJLConcentrationandpurificationofinfluenzavirusoninsQlublepolyelectrolytes.ApplMicrobiol,23(1972),740-744.HeywardJT,KlinasRA,StappMD,ObijeskiJF.Therapidconcentrationandpurificatfonofinfluenzavirusfromallantoicfluid.ArrchVirol,55(1977),107-119.SagarMG,HanssenH,GerbaCP.Simplemethodfortheconcentrationofinfluenzavirusfromallantoicfluidonmicroporousfilters.ApplEnvironMicrobiol39(1980),500-504.ReimerCB,BakerRS,NewlinTE,HavensMLInfluenzaviruspuri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