專利名稱：：改進(jìn)的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及啤酒發(fā)酵的方法。具體地，本發(fā)明涉及加速發(fā)酵啤酒的方法，所述方法涉及脯氨酸特異性蛋白酶。
背景技術(shù)：
：在傳統(tǒng)啤酒制造方法中，用啤酒酵母接種通過提取麥芽獲得的麥芽汁，并在8-15'C之間的最高溫度下進(jìn)行約7天的發(fā)酵，最高溫度取決于使用冷發(fā)酵方法還是暖發(fā)酵方法。該發(fā)酵也稱為初級(jí)發(fā)酵。一旦發(fā)酵完成，大部分可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)已化為醇時(shí)，沉淀出酵母。在儲(chǔ)藏(larger)啤酒的情況下，酵母在發(fā)酵底部收集，在其它啤酒中，它們?cè)诎l(fā)酵頂部收集。得自該初級(jí)發(fā)酵的"未成熟"啤酒仍然含有一些未沉淀的酵母以及相對(duì)高水平的不期望的氣味成分，特別是二酮如二乙酰和乙?；?。這些后來的不期望氣味成分向無(wú)味化合物的轉(zhuǎn)化是隨后的啤酒成熟階段的重要方面。特別地，將二乙酰(具有黃油異味的化合物)還原為3-羥基丁酮是費(fèi)時(shí)但是極為重要的工藝。在傳統(tǒng)的啤酒工藝中，該成熟步驟進(jìn)行約一周。在隨后的啤酒釀造階段(所謂的穩(wěn)定階段)，保持啤酒以促進(jìn)蛋白質(zhì)多酚聚集體的形成，然后去除沉淀的聚集體。這些蛋白質(zhì)多酚聚集體由多酚和來自麥芽的富含脯氨酸(所謂的混濁活性(hazeactive))蛋白質(zhì)組成。在穩(wěn)定階段，通過將啤酒冷卻至0或甚至-2'C約7到10天，以便這些聚集體聚集并隨后沉淀。根據(jù)Narziss(Narziss,L.1990ferment.3,54-62),后面這種冷穩(wěn)定時(shí)期是不可缺少的。去除沉淀物質(zhì)后，通常去除未沉淀的多酚和/或混濁活性蛋白質(zhì)，以防止在包裝的產(chǎn)品中形成"冰冷混濁"。為達(dá)到此目的，可通過吸附在聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)上來去除殘留的未沉淀多酚，和/或可通過吸附在硅膠上來去除殘留的混濁活性蛋白質(zhì)。之后可通過硅藻土過濾，將分別含有吸附的多酚和/或混濁活性蛋白質(zhì)的PVPP和/或硅膠一起去除，并去除任何殘余的酵母。總之，上述傳統(tǒng)啤酒制造方法耗時(shí)約20天。得到的產(chǎn)物完全清澈并穩(wěn)定，從而在其保質(zhì)期期間不會(huì)發(fā)生可見的變化。為了提高釀酒廠的適應(yīng)性和節(jié)約資本成本，近年來已經(jīng)進(jìn)行了大量工作，以使得釀造方法中的發(fā)酵、成熟和穩(wěn)定階段最短(Narziss,L.1990ferment.3，54-62)。例如在"壓力發(fā)酵"方法中，通過將發(fā)酵和成熟溫度通常提高至約14-18"C加速發(fā)酵和成熟。在該方法中，發(fā)酵加成熟在7天時(shí)期內(nèi)完成。整個(gè)制造過程(即包括穩(wěn)定)顯著縮短至略大于2周。然而，得到的啤酒可能會(huì)發(fā)展出輕微的酵母味道和總體上口味較差的口味等級(jí)。在流行的備選方法(所謂的"冷發(fā)酵-溫成熟"方法)中，通過堅(jiān)持傳統(tǒng)的低溫發(fā)酵過程得到口味較好的啤酒。通過將成熟階段的溫度提高到18至22'C來獲得所期望的更短的加工時(shí)間。結(jié)果，新鮮啤酒的未成熟口味在2到3天時(shí)間段內(nèi)被克服。通過傳統(tǒng)方法來獲得啤酒穩(wěn)定性。盡管獲得的啤酒具有極佳的質(zhì)量，但該方法的能量消耗相對(duì)較高。在加速啤酒成熟的另一方法中，對(duì)未成熟的啤酒進(jìn)行徹底的離心，以去除酵母，然后使其經(jīng)過含有高密度的被固定酵母的生物反應(yīng)器。組合厭氧加熱到9(TC的步驟，在l-2小時(shí)時(shí)間段內(nèi)所有的二乙酰都被還原為3-羥基丁酮。此外，也用通常的冷儲(chǔ)藏期和PVPP或硅膠處理來穩(wěn)定該快速成熟的啤酒。然而，該生物反應(yīng)器方法易于產(chǎn)生酵母異味，且由于使用了先進(jìn)科技設(shè)備，資產(chǎn)花費(fèi)很可能較高。此外，引入新開發(fā)的酶(其在啤酒發(fā)酵階段添加)正開始對(duì)啤酒制造產(chǎn)生影響。在最近的方法中，使用脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶作為PVPP或硅膠處理的替代品來預(yù)防冷凍混濁的形成(EP1326957)。在啤酒發(fā)酵期間，該酶選擇性地水解混濁活性、富含脯氨酸的蛋白質(zhì)，從而預(yù)防蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的沉淀。該方法的已報(bào)導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)在于PVPP或硅膠成為多余，因?yàn)樵撁改苡行ьA(yù)防冷凍混濁。另外，該方法在啤酒加工中該最終和最脆弱的階段產(chǎn)生了被顯著簡(jiǎn)化的加工步驟，而對(duì)啤酒釀造過程的長(zhǎng)度沒有顯著影響。實(shí)際上，PVPP和多酚之間和/或硅膠和混濁活性蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)幾乎是瞬時(shí)的。因此，去除PVPP或硅膠處理并不能導(dǎo)致產(chǎn)生更短的啤酒釀造過程。在另一酶促方法中，向傾斜的(pitched)麥芽汁中加入a-乙酰乳酸脫羧酶。這種添加防止在啤酒發(fā)酵中形成二乙酰，從而可將成熟期(其主要目的在于降低二乙酰水平)減少2到3天(參照US5,108,925和US4,708,875)。盡管存在許多關(guān)于縮短啤酒制造的成熟期的報(bào)導(dǎo)，但是迄今為止沒有關(guān)于加速啤酒穩(wěn)定期的可行方法的報(bào)導(dǎo)。然而，涉及可觀生產(chǎn)量并需要可觀能量投入的該穩(wěn)定期通常在ot:耗時(shí)一周。進(jìn)一步縮短和簡(jiǎn)化啤酒制造過程顯然具有重大的經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性。這類縮短和簡(jiǎn)化的制造過程將加強(qiáng)發(fā)酵工廠的適應(yīng)性，從而減少固定成本以及勞動(dòng)力成本。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明提供了脯氨酸特異性蛋白酶用于(優(yōu)選通過縮短儲(chǔ)藏期)加速啤酒釀造過程的用途。本發(fā)明還提供了一用于加速啤酒釀造過程的方法，所述方法包括存在脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)制造啤酒，其中儲(chǔ)藏期被縮短；和一用于制造啤酒的方法，所述方法包括存在脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)發(fā)酵麥芽汁，之后是成熟階段和穩(wěn)定階段，其中穩(wěn)定階段延續(xù)少于7天。另外，本發(fā)明提供可通過本發(fā)明方法獲得的啤酒，和含有所述啤酒的瓶、桶或罐。附圖概述圖1顯示了通過PCS針對(duì)來自IFBM實(shí)驗(yàn)工廠的十月齡啤酒測(cè)量的累積標(biāo)準(zhǔn)化分散強(qiáng)度對(duì)顆粒大小的函數(shù)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及脯氨酸特異性蛋白酶用于加速啤酒釀造過程的用途。具體地，本發(fā)明涉及脯氨酸特異性蛋白酶通過簡(jiǎn)化啤酒制造的穩(wěn)定階段加速啤酒釀造過程的用途。穩(wěn)定階段也可在比傳統(tǒng)釀造方法高的溫度下進(jìn)行。因此本發(fā)明有效地涉及一種方法，其中釀造過程的發(fā)酵后階段與現(xiàn)有技術(shù)方法相比被縮短和/或在比現(xiàn)有技術(shù)方法更高的溫度下進(jìn)行。因此，本發(fā)明還涉及用于加速啤酒釀造過程的方法，這包括存在脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)進(jìn)行該方法。與傳統(tǒng)釀造方法相比，該方法中的穩(wěn)定階段可以更短和/或在更高溫度下進(jìn)行。在世界上，有大量啤酒釀造方法被使用。然而典型地，所有這些方法基本上至少包含以下步驟，或與其對(duì)應(yīng)的階段發(fā)酵成熟禾急定過濾(然而一些方法不使用過濾)所述方法任選地包含進(jìn)一步提高穩(wěn)定性(如保質(zhì)期)的額外步驟。任何己知的技術(shù)可用于該目的，例如使用聚乙烯聚吡咯垸酮(PVPP)和/或硅膠處理。典型地，這類額外步驟可在穩(wěn)定和最終過濾階段之間進(jìn)行，盡管這類步驟可在所述方法的一些其它部分中進(jìn)行。在不同方法中各加工步驟的細(xì)節(jié)可能相當(dāng)不同，并且，在進(jìn)行啤酒釀造過程的方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)各階段有其自己的定義。為了避免任何混淆，在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)發(fā)酵、成熟、穩(wěn)定、PVPP和硅膠處理和過濾旨在與說明書中公開的相同。注意在一些方法中，發(fā)酵也被稱為初級(jí)發(fā)酵。發(fā)酵階段是啤酒釀造中旨在通過加入的酵母將可獲得的糖發(fā)酵為醇的階段。成熟階段也被稱為次級(jí)發(fā)酵，其旨在將不期望的氣味成分(如二酮)轉(zhuǎn)化為口味更佳的成分。穩(wěn)定相旨在促進(jìn)多酚-蛋白質(zhì)聚集物的形成并使它們沉淀。如果使用PVPP和/或硅膠處理，則其旨在分別去除未沉淀的多酚和混濁活性蛋白質(zhì)，以使得包裝好的產(chǎn)品保質(zhì)期更為穩(wěn)定。最后，如果使用過濾步驟，則其旨在在包裝前去除沉淀的多酚和混濁活性蛋白質(zhì)、任何殘余的酵母、PVPP和/或硅膠。通常，在啤酒釀造期間可檢測(cè)大量參數(shù)?？赏ㄟ^例如測(cè)量正在制備的啤酒的密度，確定可發(fā)酵抽提物的減少(如葡萄糖數(shù)量)，來確定發(fā)酵階段的結(jié)束。發(fā)酵階段的結(jié)束通常被認(rèn)為是成熟階段的開始。典型地，可通7過測(cè)量啤酒中存在的二乙酰數(shù)量來確定成熟階段的結(jié)束以及由此地穩(wěn)定階段的開始。然而，實(shí)踐中這可根據(jù)所需啤酒的類型變化。例如，在一些釀造中，一旦鄰位二酮水平低于約0.10mg/l則認(rèn)為成熟階段完成，而在其它釀造中，一旦鄰位二酮水平低于約0.05mg/1即認(rèn)為成熟階段完成。因此，技術(shù)人員將能夠根據(jù)所期望的鄰位二酮水平來界定成熟階段的結(jié)束和穩(wěn)定階段的開始。在本發(fā)明的上下文中，穩(wěn)定階段的開始可被定義為根據(jù)EBC方法9.24.1VinicalDiketonesinBeer:SpectrophotometricMethod測(cè)量時(shí)，鄰位二乙酰水平被降低到少于約0.01mg/升的時(shí)刻。在本發(fā)明上下文中，穩(wěn)定期的結(jié)束被定義為對(duì)啤酒進(jìn)行其最終過濾步驟的時(shí)刻，或者，當(dāng)PVPP和/或硅膠處理是釀造方法的一部分時(shí)，將啤酒與PVPP和/或硅膠接觸的時(shí)刻。如果該方法是不進(jìn)行過濾的方法，則穩(wěn)定期的結(jié)束被定義為啤酒被包裝的點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，穩(wěn)定需要的時(shí)間可被縮短至少于約7天。優(yōu)選其少于6、5、4或3天。更優(yōu)選地，其被縮短至少于2或1天。最優(yōu)選地，其被縮短至下述程度在制造規(guī)模中，穩(wěn)定的持續(xù)時(shí)間被減少到等于將啤酒從成熟階段冷卻至所需溫度(例如啤酒過濾和/或包裝所需的溫度)的時(shí)期。該時(shí)期傳統(tǒng)上稱為冷卻時(shí)期。將穩(wěn)定時(shí)期縮短至將啤酒冷卻至所需溫度的時(shí)間是高度有利的，因?yàn)檫@樣穩(wěn)定階段的持續(xù)時(shí)間僅取決于可獲得的冷卻能力。傳統(tǒng)上，將來自成熟階段的啤酒冷卻至從約-2'C高至(包括)約0°C。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)使用根據(jù)本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)，穩(wěn)定階段可不僅被縮短，而且其還可在高于傳統(tǒng)上使用的溫度下進(jìn)行。傳統(tǒng)上有在更高溫度下進(jìn)行的穩(wěn)定方法，但是這些方法要耗費(fèi)更長(zhǎng)的時(shí)間，例如6周或更多。因此，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，穩(wěn)定期(其可典型地為如上定義的縮短的穩(wěn)定期)在優(yōu)選冷卻至最多約2r的啤酒上進(jìn)行，更優(yōu)選為至最多約3'C、4'C、5"C或6"C或甚至更優(yōu)選至最多約7"C或約8"C，最優(yōu)選至用于包裝(即裝瓶或裝桶)的期望溫度。包裝所需的溫度可在方法之間差異，但是優(yōu)選在至多且包括8°C，優(yōu)8選在7"C左右進(jìn)行，從而獲得啤酒中想要的水平的溶解的二氧化碳。在啤酒僅冷卻至包裝所需溫度的方法中，與本領(lǐng)域已知方法相比需要少得多的能源。在根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定階段被減少至將啤酒從成熟階段結(jié)束時(shí)的溫度冷卻至包裝所需溫度所需的時(shí)期，從而省略了傳統(tǒng)的冷穩(wěn)定期。因此根據(jù)本發(fā)明，啤酒可被冷卻至最多約2°C，更優(yōu)選為至最多約3°C、4'C、5。C或6'C或甚至更優(yōu)選至最多約7t:或約8T:，最優(yōu)選冷卻至用于包裝的期望溫度。然后可直接包裝啤酒，即在該實(shí)施方案中，在啤酒己經(jīng)被冷卻至的溫度其不再被維持任何時(shí)間段。在本發(fā)明中，如果需要的話，可進(jìn)行另外的加工步驟以達(dá)到額外的澄清度和/或穩(wěn)定性。事實(shí)上，如果使用對(duì)應(yīng)于將啤酒冷卻至包裝所需溫度所需要的時(shí)期的縮短的穩(wěn)定期，則可需要用例如PVPP和/或硅膠處理啤酒。這可幫助確保延長(zhǎng)的保質(zhì)期穩(wěn)定性。該實(shí)施方案的工業(yè)應(yīng)用是可從啤酒制造方法中被省略穩(wěn)定期，從而顯著節(jié)約成本，并加強(qiáng)了啤酒制造工廠的適應(yīng)性。根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定的啤酒可被進(jìn)一步加工，以達(dá)到使產(chǎn)品能夠售賣的澄清度和穩(wěn)定性水平。這通常使用額外的處理步驟完成。也可使用過濾步驟。這通常是釀造過程中包裝前的最后一個(gè)步驟。任何已知的技術(shù)可用于該目的。例如，所述額外的澄清和/或穩(wěn)定處理可通過使用合適的吸附處理完成，例如用PVPP、硅膠、沒食子單寧(gallotannins)或固定的交聯(lián)不溶性瓊脂糖進(jìn)行的處理。這些處理的用途和它們?cè)卺勗熘械膽?yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。PVPP通常以從約10到約70g/hl的數(shù)量添加。硅膠通常以從約10到約70g/hl的數(shù)量添加。固定的交聯(lián)不溶性瓊脂糖的實(shí)例包括WO97/43401和US6,001,406所述的組合穩(wěn)定體系，和GEHealthCareBioscienceAB(參閱Tayleretal.,2006,UseoftheCombinedStabilisationSystemanditsimpactonbeercomposition,ProceedingsoftheInstituteofBrewingandDistilling,AsiaPacificSection,Hobart,Australia)制造的組合穩(wěn)定體系樹脂?；蛘撸蛄硗?，可9使用酶處理(如用木瓜蛋白酶處理)以達(dá)到進(jìn)一步的穩(wěn)定和/或澄清。上述處理可以以固定形式(如固定的PVPP顆粒)使用。上文所列的所有額外處理可與本發(fā)明的穩(wěn)定過程聯(lián)合使用。額外處理(如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或所有這類額外處理)的組合可與本發(fā)明的穩(wěn)定過程聯(lián)合使用。一旦啤酒已根據(jù)本發(fā)明被穩(wěn)定，可便利地進(jìn)行這類額外澄清和/或穩(wěn)定處理。然而本發(fā)明還涉及下述方法其中額外的澄清和/或穩(wěn)定處理在該方法中的其它點(diǎn)進(jìn)行，或與本發(fā)明的穩(wěn)定同步進(jìn)行。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用如EP-A-1326957所公開的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，從而使得PVPP和二氧化硅處理成為多余，并使得用于PVPP再生設(shè)備的固有成本和與操作該裝置相關(guān)的勞動(dòng)力成本成為多余。另外，啤酒的自身抗氧化能力被提高，并且許多PVPP或硅膠處理的啤酒的邊緣膠狀穩(wěn)定性(marginalcolloidalstability)得到了促進(jìn)。另外，該飲料的氧暴露風(fēng)險(xiǎn)被徹底降低，且廢液流被最小化。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定階段的縮短或甚至省略與成熟階段(該階段主要目的在于將二乙酰轉(zhuǎn)化為3-羥基丁醇)的縮短組合使用。在本發(fā)明上下文中，成熟階段的開始在后文中被定義為表觀衰減程度達(dá)到使用啤酒密度測(cè)量時(shí)評(píng)估值的約70%到約90%的時(shí)刻，更優(yōu)選約77%到約84%的時(shí)刻。啤酒密度可通過比重瓶或密度計(jì)(分別為EBC方法8.2.1和8.2.2)測(cè)量，衰減限度根據(jù)EBC方法8.6.1或8.6.2(Fermentability,Attenuationofwort)來確定。在本發(fā)明上下文中，成熟階段的結(jié)束可被定義為根據(jù)EBC方法9.24.1(VicinalDiketonesinBeer:SpectrophotometricMethod)測(cè)量時(shí)，二乙酰水平降低至少于約0.01mg/升的時(shí)刻。可通過本領(lǐng)域已知方法縮短成熟階段。例如，可使用高溫加速成熟，如"加壓發(fā)酵"和"冷發(fā)酵-溫成熟"方法所述(Narziss，L.1990Ferment,3,54-62)。還可通過使用生物反應(yīng)器中被固定的酵母，或通過使用乙酰乳酸脫羧酶活性來縮短成熟(ALDC:EC4丄1.5;參閱例如US5,108,925或US4,708,875)。使用這些方法之一或其組合可將成熟限制為兩天、一天或甚至少于一天(如使用在高溫下運(yùn)行的生物反應(yīng)器可實(shí)10行的)。在本發(fā)明上下文中，整合啤酒制造的成熟和穩(wěn)定階段的階段稱為儲(chǔ)藏期。因此，本發(fā)明提供了脯氨酸特異性蛋白酶用于加速啤酒釀造過程的用途。典型地，加速通過縮短發(fā)酵后時(shí)期完成，例如通過縮短儲(chǔ)藏持續(xù)時(shí)間完成，優(yōu)選通過縮短穩(wěn)定期完成。術(shù)語(yǔ)"加速"和"縮短"在本文上下文中旨在表示與未使用脯氨酸特異性蛋白酶的等效方法相比耗費(fèi)更短時(shí)間完成的啤酒釀造方法。加速通常作為縮短的發(fā)酵后時(shí)期(即當(dāng)使用脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)，與未使用該酶的等效方法相比，該時(shí)期可耗費(fèi)更少時(shí)間完成)的結(jié)果而發(fā)生。如果本發(fā)明的用途與縮短成熟期的手段組合使用，整個(gè)儲(chǔ)藏期可被限制為少于8、7或6天。優(yōu)選其被限制為少于5、4或3天。更優(yōu)選地，其被限制為少于2天。甚至更優(yōu)選地，整個(gè)儲(chǔ)藏期被限制為少于24小時(shí)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過組合脯氨酸特異性蛋白酶和乙酰乳酸脫羧酶(如a乙酰乳酸脫羧酶)，將儲(chǔ)藏期限制為4天或更少。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，向初級(jí)發(fā)酵中加入脯氨酸特異性蛋白酶以及可選的乙酰乳酸脫羧酶。在該初級(jí)發(fā)酵后可對(duì)未成熟的啤酒進(jìn)行快速成熟步驟，并可隨后在二乙酰水平降至少于約0.10mg/升后將啤酒立刻冷卻至約2'C，優(yōu)選至約5t:，更優(yōu)選至約7'C，最優(yōu)選至適于包裝的溫度，然后任選地進(jìn)行過濾以獲得澄清的啤酒以備裝瓶。由此可實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵后階段以及對(duì)整個(gè)釀造過程的加速。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于頂部和底部發(fā)酵的儲(chǔ)藏啤酒。頂部發(fā)酵的啤酒發(fā)酵和成熟非常迅速，但是與底部發(fā)酵的啤酒相同，它們都需要漫長(zhǎng)的冷卻儲(chǔ)藏期以去除多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)特別適用于底部發(fā)酵儲(chǔ)藏啤酒。本發(fā)明的用途和方法還可應(yīng)用于進(jìn)行自然發(fā)酵的啤酒。本發(fā)明另一方面涉及使用本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶的方法。也就是說，本發(fā)明提供了用于加速啤酒釀造過程的方法，這優(yōu)選通過減少儲(chǔ)藏期的持續(xù)時(shí)間(例如通過減少穩(wěn)定期的持續(xù)時(shí)間)來進(jìn)行，所述方法包括在存在脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)進(jìn)行所述啤酒釀造過程。儲(chǔ)藏過程(如穩(wěn)定階段)可在比傳統(tǒng)啤酒釀造方法中典型使用的溫度高的溫度下進(jìn)行。典型地，穩(wěn)定階段的持續(xù)時(shí)間將是將啤酒從成熟階段冷卻至包裝溫度所需的時(shí)間。在本發(fā)明上下文中，詞語(yǔ)"肽"和"蛋白質(zhì)"可交換使用。在本發(fā)明上下文中，詞語(yǔ)"混濁"、"渾暗(cloudiness)"和"渾濁"可互換使用。為了確定表觀衰減程度達(dá)到了約77%到約84%的時(shí)刻，使用EBC方》去9.24.1VinicalDiketonesinBeer:SpectrophotometricMethod定量二乙酰7jC平。注意EBC方法9.24.1被設(shè)計(jì)用來測(cè)量普遍的二酮水平，然而由于目前為止二乙酰是二酮的主要成分，因此在本發(fā)明上下文中該測(cè)量方法的結(jié)果被認(rèn)為代表二乙酰水平。或者可使用氣相色譜用EBC方法9.24.1VinicalDiketones在啤酒中測(cè)量二乙酰水平。為了對(duì)飲料渾濁度加以定量，可使用渾濁測(cè)量?jī)x(turbidmeter)。在渾濁測(cè)量?jī)x中測(cè)量相對(duì)于入射光波以指定角度散射的光線數(shù)量。渾濁度測(cè)量已知非常適用于測(cè)量蛋白質(zhì)-多酚相互作用導(dǎo)致的混濁形成。多酚被定義為具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)含有至少兩個(gè)被至少一個(gè)羥基取代的芳香環(huán)，或含有至少一個(gè)被至少兩個(gè)羥基取代的芳香環(huán)。多酚的實(shí)例為單寧或黃酮類，其包括例如兒茶素、黃酮醇和花色素。本文使用的術(shù)語(yǔ)"啤酒"用于至少涵蓋從由未發(fā)芽的谷物制備的糖化醪來制造的啤酒以及從由發(fā)芽谷物制備的所有糖化醪來制造的啤酒，以及從發(fā)芽和未發(fā)芽谷物的混合物制備的所有糖化醪來制造的啤酒。本文使用術(shù)語(yǔ)"啤酒"涵蓋底部發(fā)酵的和頂部發(fā)酵的啤酒，以及用添加劑制備的啤酒和含有所有可能的醇內(nèi)容物的啤酒。在發(fā)酵期間添加的脯氨酸特異性蛋白酶的量可根據(jù)使用的麥芽水平和進(jìn)行的發(fā)酵類型而變化。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案和/或方法中，每百升約12度Plato的100%麥芽啤酒中加入從約7.5到約15單位(PPU)，例如從約10到約12.5單位(PPU)的脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶活性。待添加的脯氨酸特異性蛋白酶活性的最大量不能特定指出。最大量取決于例如，所期望的混濁減少或預(yù)防、在蛋白酶具有其最大活性的pH下啤酒的組成。酶的單位定義在本申請(qǐng)的"材料和方法"部分提供。脯氨酸特異性蛋白酶可在啤酒制備中不同的時(shí)期加入。在發(fā)酵開始時(shí)加入酶得到可能的最好結(jié)果。然而，酶可加入麥芽漿中或在形成混濁前加入經(jīng)發(fā)酵的啤酒中。在本文中，術(shù)語(yǔ)脯氨酰特異性蛋白酶、脯氨酸特異性蛋白酶、脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶、脯氨酸特異性內(nèi)切肽酶和具有脯氨酰特異活性的蛋白酶或類似的表達(dá)可互換使用。脯氨酸特異性蛋白酶可以以經(jīng)分離的或經(jīng)純化的形式用于本發(fā)明。"經(jīng)分離的"或"經(jīng)純化的"是指從其天然環(huán)境中被取出的脯氨酸特異性蛋白酶。例如，就本發(fā)明目的而言，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的脯氨酸特異性蛋白酶被認(rèn)為是經(jīng)分離的，通過任何合適技術(shù)(例如SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公開的一步純化法)基本純化的天然或重組多肽也被認(rèn)為是經(jīng)分離的?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法從重組的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收適用于本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶，所述方法包括例如硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提和色譜法如高效液相色譜(HPLC)。適用于本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶可以是天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成產(chǎn)物、由重組技術(shù)從原核或真核宿主中制造的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、真菌、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。應(yīng)理解盡管蛋白酶可以與不影響酶目的活性的載體或稀釋劑混合，其仍可認(rèn)為是經(jīng)分離的。適用于本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶還可以是被更充分純化的形式。因此，脯氨酸特異性蛋白酶可包含在下述制劑中，所述制劑中多于70%，例如多于80%、90%、95%、98%或99%的蛋白質(zhì)為脯氨酸特異性蛋白酶。典型地，脯氨酸特異性蛋白酶可以是不含或基本上不含任何其它蛋白酶的形式。適用于本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶可以以固定的形式使用，從而能夠處理大量含蛋白質(zhì)的液體。選擇適當(dāng)支持材料和合適固定方法的途徑已在文獻(xiàn)中有過廣泛描述，例如"ImmobilizationofEnzumesandCells"(ed.GordonF.Bickerstaff;ISBN0-89603-386-4)。在本發(fā)明上下文中，脯氨酸特異性蛋白酶被定義為下述蛋白酶，所述蛋白酶在蛋白質(zhì)或肽鏈中含有脯氨酸殘基的位置切開蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，脯氨酸特異性蛋白酶是在蛋白質(zhì)或肽含有脯氨酸殘基的位置"切開"(水解)蛋白質(zhì)或肽的內(nèi)切蛋白酶。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用在脯氨酸殘基羧基端水解肽鍵的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。這類酶的實(shí)例為脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)，以及J.AgicFoodChem，Vol53(20),7950-7957,2005)所述的Aspergillusniger來源的脯氨酰內(nèi)切蛋白酶，和脯氨酸特異性的二肽基肽酶如DPPIV(EC3.4.14.5)。在脯氨酸殘基NH2-末端切開脯氨酸殘基的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶如例如15January1998,Vol.391,p.301-304的Nature公開內(nèi)容中所述。同針對(duì)酶活性來說典型的那樣，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的活性取決于pH。典型地，在本發(fā)明中使用下述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，所述蛋白酶在對(duì)應(yīng)于其被添加的啤酒的pH下具有最大的脯氨酰特異活性。在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，向初級(jí)啤酒發(fā)酵中加入具有酸性pH最適值(即具有6.0或更低一如pH5、4或3的pH最適值)的蛋白酶。在本發(fā)明用途和/或方法的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，向啤酒發(fā)酵中加入下述蛋白酶，所述蛋白酶具有酸性pH最適值，并且由食品級(jí)別微生物活躍地分泌進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基中。脯氨酸特異性蛋白酶被廣泛發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物和植物中，但是它們?cè)谖⑸镏写嬖谑怯邢薜摹Ｆ駷橹?，已在A/^/^7/m(EP0552428),F/aw^"ent/m(EP0967285)禾卩(J.Biochem.113，790-796)，Xa"說omomw和5acteraWes種類中鑒定了脯氨酸特異性蛋白酶。盡管來自這些生物中大部分的脯氨酸特異性酶在pH8附近有活性，但是^^wgz7/^酶在pH5附近活性最佳。本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶可從上述微生物物種之一分離，特別是來自J^e/^7/M。優(yōu)選地，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶分離自J^wgz7/^m'gw。更優(yōu)選地，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶分離自下述j^^^7/m"&w宿主，所述宿主被設(shè)計(jì)為過表達(dá)編碼脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶的基因，盡管其它宿主如5.co//也是合適的表達(dá)載體。例如，源自F/flW""eWwm的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在Eco"等中的克隆和超量生產(chǎn)使得某些脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶可以以純凈形式獲得。這類超量生產(chǎn)構(gòu)建體的實(shí)例提供于WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology,Vol11,pp209-212。優(yōu)選使用A/^gz7/ww'gw宿主來制造非重組的下述自身構(gòu)建體(self-construct)，所述自身構(gòu)建體使用A啟動(dòng)子控制編碼Am'gw脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基因表達(dá)。最優(yōu)選地，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶為EP-A-1326957中公開的內(nèi)切蛋白酶，所述蛋白酶通過引用并入本文。在EP-A-1326957中也公開了脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在啤酒釀造中的用途。然而在該文件中僅公開了減少飲料中混濁的用途。沒有公開脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶同樣可用于加速啤酒釀造過程。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員己知PVPP和/或硅膠處理是瞬時(shí)的。未公開儲(chǔ)藏期或穩(wěn)定期被縮短的的方法。在本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯知道，使用沒有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定階段的傳統(tǒng)方法的情況下，會(huì)得到質(zhì)量(例如膠質(zhì)穩(wěn)定和澄清)差的啤酒。因此令人驚奇的是，通過在啤酒釀造中使用脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，該過程可被縮短而不會(huì)有對(duì)啤酒質(zhì)量的不良影響。發(fā)酵中加入的乙酰乳酸脫羧酶活性可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的限度內(nèi)變化。對(duì)所需活性的指示由Hannemann(MBAATQ，Vol39,no3，2002，149-155)在文獻(xiàn)中提供?，F(xiàn)代釀酒廠努力從啤酒釀造過程中去除所有主要粉末如PVPP、硅膠或硅藻土。在該過程中，最終的硅藻土過濾通過膜過濾或交叉流動(dòng)(crossflow)過濾被替代。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，本發(fā)明的啤酒釀造方法的完成可不使用任何主要粉末(如PVPP或二氧化硅水凝膠或硅藻土)進(jìn)行過濾。因此，根據(jù)本發(fā)明用途和/或方法制備的啤酒可以不含或基本上不含PVPP和/或二氧化硅水凝膠和/或硅藻土。使用本發(fā)明的方法，可使用例如交叉流動(dòng)過濾的過濾技術(shù)來澄清啤酒。因此，本發(fā)明包括下述方法，在所述方法中使用脯氨酸特異性蛋白酶結(jié)合交叉流動(dòng)膜過濾來制備啤酒。15本發(fā)明涉及啤酒釀造方法，其中使用脯氨酸特異性蛋白酶，由此相對(duì)于未使用脯氨酸特異性蛋白酶的釀造方法而言，穩(wěn)定期被縮短，同時(shí)至少保持與根據(jù)EBC9.29目測(cè)術(shù)語(yǔ)規(guī)定的啤酒目測(cè)澄清度相同的性質(zhì)。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的啤酒。通常可以以多種途徑判斷啤酒的澄清度。EBC方法9.29描述了如何測(cè)量啤酒中的混濁。EBC單位在混濁測(cè)量?jī)x中90度角下測(cè)量?；蛘呖蛇M(jìn)行目測(cè)。根據(jù)EBC方法9.29(即在90度散射角下測(cè)量EBC單位時(shí))，具有低于0.5EBC單位的啤酒會(huì)被目測(cè)為"鮮亮的"。啤酒渾濁度在約0.5和1.0EBC單位之間時(shí)，啤酒會(huì)被目測(cè)為"非常透明"，在2和1EBC單位間時(shí)為"很輕的混濁"，在2和4EBC單位間為"混濁"和在8EBC單位以上為"非?；鞚?。當(dāng)然不能預(yù)期在不同實(shí)驗(yàn)室做出的不同混濁刻度或不同目測(cè)觀察精確相等，但是不會(huì)出現(xiàn)重大分歧。另外，最終由消費(fèi)者進(jìn)行的目測(cè)從商業(yè)觀點(diǎn)來看是重要的。因此，通常接受啤酒應(yīng)當(dāng)(幾乎)是鮮亮的(即在90度散射下測(cè)量具有最多為1的EBC單位)，以便商業(yè)上可被接受。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)對(duì)于用本發(fā)明方法制備的啤酒而言，EBC值并不對(duì)應(yīng)于熟練小組的目測(cè)評(píng)估。假設(shè)更高數(shù)量的蛋白質(zhì)和多酚仍然存在于啤酒內(nèi)導(dǎo)致高于90度的散射值，但是肉眼無(wú)法檢測(cè)。如實(shí)施例中所示，發(fā)現(xiàn)可能對(duì)具有高于1的EBC單位值的啤酒做出"鮮亮的"的目測(cè)評(píng)估，，并也可能對(duì)具有高于2(甚至高達(dá)8)的EBC單位值的啤酒做出"基本鮮亮"的目測(cè)評(píng)估。也就是說，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的啤酒具有與傳統(tǒng)釀造的啤酒不同的(物理)化學(xué)組成。已用對(duì)通過不同方法穩(wěn)定的啤酒的顆粒分析對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。其顯示根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定的啤酒包含下述顆粒，所述顆粒平均小于使用PVPP或二氧化硅水凝膠穩(wěn)定的啤酒中經(jīng)鑒定的顆粒。因此，本發(fā)明的另一方面為具有高于1EBC單位渾濁度的啤酒，優(yōu)選等于或高于1.25，最優(yōu)選等于或高于1.5，而由熟練小組在釀造后立刻使用EBc術(shù)語(yǔ)學(xué)在rc下測(cè)量的目測(cè)評(píng)估會(huì)將該啤酒分級(jí)為"鮮亮的"。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有高于2EBC單位渾濁度的啤酒，優(yōu)選高于3，更優(yōu)選高于4，甚至更優(yōu)選高于6并最優(yōu)選高于8EBC單位，而在將啤酒儲(chǔ)存于環(huán)境溫度中至少3月后，優(yōu)選將啤酒儲(chǔ)存至少六月后或最優(yōu)選將啤酒儲(chǔ)存于環(huán)境溫度中至少9個(gè)月后，由熟練小組使用EBC術(shù)語(yǔ)學(xué)在rc下測(cè)量的目測(cè)評(píng)估會(huì)將該啤酒分級(jí)為"幾乎鮮亮的"。根據(jù)本發(fā)明用途和/或方法獲得的啤酒將被典型地包裝?？墒褂萌魏魏线m的包裝，如瓶、桶或罐。根據(jù)本發(fā)明用途和/或方法制備的啤酒還可包裝于氣缸(bulktank)中。因此，本發(fā)明提供包含根據(jù)本發(fā)明用途和/或方法獲得的啤酒的包裝，例如包含該啤酒的瓶、桶或罐。下文通過以下的非限制性實(shí)施例來闡述本發(fā)明。材料和方法脯氨酸特異性蛋白酶活性測(cè)量在37"C下，檸檬酸鹽/磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.6)中，針對(duì)合成的肽Z-Gly-Pro-pNA，來測(cè)定具有低于pH6.0的最適pH的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的活性。在37。C下，磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，針對(duì)合成的肽Z-Gly-Pro-pNA，來測(cè)定具有中性最適pH的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的活性。在37"C下，檸檬酸鹽/磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.6)中，針對(duì)合成的肽Gly-Pro-pNA，來測(cè)定具有低于pH6.0的最適pH的二肽基二肽酶的活性。在37。C下，磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，針對(duì)合成的肽Gly-Pro陽(yáng)pNA，來測(cè)定具有低于pH6.0的最適pH的二肽基二肽酶的活性。在405nM處用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)所有脯氨酸特異性蛋白酶的反應(yīng)產(chǎn)物。一個(gè)單位(1PPU)被定義為在該檢測(cè)條件下每分鐘釋放1微摩爾硝基苯胺的酶數(shù)量。釀造過程期間的分析除非另有說明，根據(jù)2004版的，7^&1>4化3-EBC"(FachverlagHansCarl,Numberg,Germany)進(jìn)行多種分析。根據(jù)以下EBC方法4-2、4-5-1、4-9-1、4-3-1、4-18、8-13-2、4-8、4-15和4-14進(jìn)行麥芽分析。通過測(cè)量糖化率和麥芽汁過濾監(jiān)控淀粉糖化。根據(jù)EBC4-5-1、4-7-2、8-13-2、4-8、4-1715和4-14分析麥芽汁，以及游離氨基氮(EBC方法8.10)、總氮(通過EBC方法8.9.1-Kjeldahl-或8.9.2-Dumas燃燒法)、pH和總麥芽汁多酚(EBC方法8.12)。根據(jù)溫度、提取物減少和壓強(qiáng)來開展多種發(fā)酵方法。在加料、發(fā)酵第一天和啤酒過濾前確定酵母種群。通過氣相色譜在發(fā)酵中、成熟中和過濾前測(cè)量雙乙酰。過濾前后通過相應(yīng)壓強(qiáng)降低和流速來計(jì)數(shù)酵母，以監(jiān)測(cè)啤酒過濾。在(進(jìn)入過濾和濾出的啤酒中，和瓶裝的啤酒中)充碳酸的水中測(cè)量溶解氧。多種啤酒分析包括用于泡持力(headretention)、反式-2-nonenal和還原力的EBC9.4、9.6、9.7、9.8、9.11、9.24.1、9.24.2、9.29、9.30、9.35、9.37、Ross&Clark和NIBEM(9.42)方法。使用VOSROTA90/25混濁測(cè)量?jī)x(Haffmans，Venlo，TheNetherlands)在25和90度散射角下，在不同溫度(參閱實(shí)施例2)下使用多種混濁測(cè)量法測(cè)量混濁發(fā)展。根據(jù)EBC9.30的預(yù)言性保質(zhì)期檢測(cè)進(jìn)行加壓測(cè)試。釀造方法所有的啤酒釀造實(shí)驗(yàn)以20hi規(guī)模進(jìn)行，其中使用300kgpilsen麥芽(HeinekenA型)和用于麥芽汁的9501水。釀造包括具有以下溫度程序的淀粉糖化過程45°C20分鐘，在20分鐘內(nèi)從45'C到64'C，64°C15分鐘，在12分鐘內(nèi)從64"C到76°C，76°C25分鐘和最終在5分鐘內(nèi)從76°C到78°C，然后是麥芽汁過濾。噴淋使用熱水。煮沸90分鐘，并以啤酒花小球的形式加入啤酒花。在如個(gè)體實(shí)施例中所述的條件下進(jìn)行冷穩(wěn)定。使用包有粗糙的和精細(xì)級(jí)別濾料層的濾板過濾啤酒。精細(xì)級(jí)別的濾料層也用作主體加料。裝瓶使用Carbofill濾紙。瓶子在60'C下15分鐘進(jìn)行巴氏滅菌。實(shí)施例實(shí)施例l中試規(guī)模啤酒制造在IFBM(InstituteFrancaisdelaBrasserieetdelaMalterie，Vandoeuvre-les-Nancy，F(xiàn)rance)啤酒廠的20hi半工業(yè)中試中，在相同條件下釀造兩種18純的麥芽。在發(fā)酵中向這些麥芽之一以10PPU/百升麥芽的濃度加入脯氨酸特異性蛋白酶(BrewersClarexfromDSMFoodSpecialities,Delft,TheNetherlands，含有5PPU/克產(chǎn)品)，并在發(fā)酵開始時(shí)以4500ADU/百升麥芽的濃度加入乙酰乳酸脫羧酶(MaturexLfromNOVO,Bagscaerd，Denmark,含有1,500ADU/克產(chǎn)品)。該發(fā)酵稱為"試驗(yàn)發(fā)酵"。另一麥芽同樣發(fā)酵，并稱為"對(duì)照發(fā)酵"。釀造從300kg大麥麥芽和啤酒花小球制造釀造物。淀粉糖化條件為1:4的水麥芽比例(vol/wt),pH5.6。淀粉糖化圖包括45°C20分鐘的第一步，64°C15分鐘的第二步，74°C30分鐘的第三步和最終78。C5分鐘結(jié)束淀粉糖化。加熱速度為每次rc/分鐘。停止淀粉糖化后，將麥芽汁過濾進(jìn)Lanter酒桶中；先進(jìn)行麥芽循環(huán)和隨后在pH5.6下熱(78°C)噴淋。得到的麥芽煮沸90分鐘，之后使用漩渦進(jìn)行良好的trub分離。發(fā)酵發(fā)酵用購(gòu)自VLB(Berlin,Germany)的底部酵母菌株Rh進(jìn)行，用12°CPlato的麥芽以17.106活細(xì)胞/1111接種。發(fā)酵過程在12'C進(jìn)行，直到5°CPlato(3天)，然后在14。C繼續(xù)，直至發(fā)酵結(jié)束(3天)。發(fā)酵后發(fā)酵結(jié)束時(shí)，將對(duì)照發(fā)酵在14'C多保持三天，以降低二乙酰水平。在該成熟期后，將啤酒在一天內(nèi)冷卻至0°C，并將啤酒在0'C穩(wěn)定5天，之后單獨(dú)使用30g/Hl劑量的PVPP處理，用硅藻土過濾啤酒并煮沸。然而，對(duì)于試驗(yàn)發(fā)酵而言，不應(yīng)用成熟期。另外，穩(wěn)定期被限制為將啤酒冷卻至4'C所需的時(shí)期。發(fā)酵結(jié)束后，直接按照線性溫度降低，在4天的時(shí)期內(nèi)將啤酒冷卻至4'C。因?yàn)樵诎l(fā)酵中施用BrewersClarex，所以不添加啤酒穩(wěn)定劑(例如PVPP或硅膠)。代替地，冷卻啤酒后，用硅藻土直接過濾，并隨后裝瓶。根據(jù)EuropeanBreweryConvention(EBC)確定的方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)啤酒參數(shù)(例如pH、顏色、苦味、乙醇等)，所述方法描述于它們的"Analytica-EBC"中。結(jié)果總體而言，標(biāo)準(zhǔn)啤酒分析指出對(duì)照和試驗(yàn)發(fā)酵的啤酒參數(shù)類似。兩組試驗(yàn)中溶解的氧水平相當(dāng)，并低于0.2mg/1。兩種啤酒的初始混濁水平相當(dāng)，但是在根據(jù)L.Chapon(EBC方法9.41)的醇冰冷混濁測(cè)試中，試驗(yàn)啤酒具有顯著更低的值。另外，在啤酒加壓測(cè)試"PredictionoftheShelf-lifeofBeer"(EBC方法9.30)中，試驗(yàn)啤酒比得自對(duì)照發(fā)酵的啤酒表現(xiàn)更好。從試驗(yàn)和對(duì)照發(fā)酵獲得的啤酒的鄰二酮水平均低于0.10mg/升(用EBC方法9.24.1VivinalDiketonesinBeer:SpectrophotometricMethod領(lǐng)!j量)。通過IFBM(Vandoeuvre-les-Nancy，F(xiàn)rance)的熟練小組(由8個(gè)人組成)在標(biāo)準(zhǔn)化的程序中進(jìn)行感覺分析，在品嘗樣品后，評(píng)估員給口味品質(zhì)判以強(qiáng)度分值。收集結(jié)果，形成感覺譜。該測(cè)試根據(jù)感覺分析的指導(dǎo)完成，描述于2004版"Analytica-EBC"的第13章。品嘗小組在來自對(duì)照和試驗(yàn)發(fā)酵的啤酒間未觀察到顯著口味差異。結(jié)論該實(shí)施例說明通過應(yīng)用脯氨酸特異性蛋白酶和乙酰乳酸脫羧酶，可以生產(chǎn)出具有標(biāo)準(zhǔn)啤酒參數(shù)(用EuropeanBreweryConvention(EBC)確定的方法測(cè)量)的啤酒，其與參考啤酒的參數(shù)類似，并且與參考啤酒相比未顯示顯著的口味差異。另外，使用本發(fā)明可獲得省時(shí)的方法，因?yàn)?天的儲(chǔ)藏期(對(duì)照)可被減少至4天。另外，通過在4天內(nèi)冷卻至4'C代替在一天內(nèi)冷卻至0'C并將該溫度再保持5天，可達(dá)到顯著的能量節(jié)約。實(shí)施例2縮短冷穩(wěn)定期及其對(duì)酶穩(wěn)定的、100%麥芽啤酒澄清度的影響進(jìn)行釀造試驗(yàn)，以評(píng)估通過使用縮短的冷卻期，脯氨酸特異性蛋白酶對(duì)100%麥芽啤酒的影響。為此，制備六種不同的麥芽汁，并根據(jù)完全相20同的流程(參閱"材料和方法")進(jìn)行發(fā)酵。向五個(gè)發(fā)酵罐中添加0.125PPU/升(參閱"材料和方法"中的活性定義)濃度的來自^^wgz7/w脯氨酸特異性蛋白酶，并且在所有五個(gè)發(fā)酵中，在接種前將酶加入冷麥芽汁中。第六個(gè)發(fā)酵用作參考，并且不添加脯氨酸特異性蛋白酶。所有的發(fā)酵罐都用新鮮的儲(chǔ)藏酵母(約1700萬(wàn)細(xì)胞/ml麥芽汁)接種，發(fā)酵在12°C進(jìn)行直到5plato，然后溫度上升直到14'C，用于去除鄰二酮，如二乙酰。成熟結(jié)束時(shí)(在該情況下為發(fā)酵開始后九天)將啤酒冷卻至負(fù)rc。來自添加了酶的所有發(fā)酵罐的成熟啤酒在負(fù)rc下保持不同的時(shí)間段，然后用硅藻土過濾。已添加了脯氨酸特異性蛋白酶的四批也同樣過濾。用單一用途PVPP(40g/hl;注射進(jìn)啤酒濾器)內(nèi)部處理含有添加的脯氨酸特異性蛋白酶的第五批，然后過濾。來自未添加酶的發(fā)酵罐的成熟啤酒也冷卻至負(fù)rc并進(jìn)行"經(jīng)典"穩(wěn)定流程，即啤酒在負(fù)rC保持9天，然后用40g/hl的單一用途PVPP進(jìn)行相同的內(nèi)部處理，并隨后用硅藻土過濾。填裝后將瓶子在15PU下巴氏滅菌并儲(chǔ)藏在20°C。六周的儲(chǔ)藏期后，在2(rc和rc對(duì)多種啤酒進(jìn)行混濁測(cè)量。為此將啤酒在測(cè)量溫度(即rC或20°C)下預(yù)孵育24小時(shí)，然后在該溫度下測(cè)量啤酒混濁。使用渾濁測(cè)量?jī)x在90和25度散射下測(cè)量，記錄混濁讀數(shù)。用該渾濁測(cè)量?jī)x(HaffmansVOSROTA90/25)得到的90和25度散射數(shù)據(jù)在表1中與相關(guān)測(cè)量溫度一起分別顯示為"H90"和"H25"值?；鞚釡y(cè)量前將瓶子搖動(dòng)使其均勻，并放置足夠長(zhǎng)的時(shí)間使氣泡消失。進(jìn)行多次測(cè)量以確保氣泡沒有影響讀數(shù)。除這些混濁測(cè)量外，也使用熟練的小組(n=5)進(jìn)行目測(cè)和口味評(píng)估。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>根據(jù)視覺觀察，所有瓶裝的啤酒(即包括未進(jìn)行任何冷穩(wěn)定期的經(jīng)酶處理的啤酒)在2(TC六周的儲(chǔ)藏期后冷卻24消失至8'C后均完全澄清。非常令人驚奇的是，這些視覺混濁評(píng)估與獲得的不同混濁讀數(shù)并不完全一致。根據(jù)EBC標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)EBC9.29方法(在90度散射角下測(cè)量)測(cè)量的啤酒和產(chǎn)生的1.0和2.0EBC之間的值是"非常輕微混濁"。2.0EBC之山，啤酒開始稱為"輕微混濁"。產(chǎn)生的90度散射讀數(shù)數(shù)值高至1.26EBC(參閱表1)，然而所有這些啤酒視覺評(píng)級(jí)為"鮮亮的"。該矛盾在實(shí)施例3中有所解釋。還值得注意的是，根據(jù)專業(yè)品嘗小組，所產(chǎn)生的啤酒均未顯示異常的口味譜。實(shí)施例3渾濁度測(cè)量和混濁形成根據(jù)實(shí)施例2中描述的流程對(duì)12Plato的100%麥芽汁進(jìn)行三種20Hl發(fā)酵。第一種發(fā)酵(參考)發(fā)酵中不添加脯氨酸特異性蛋白酶。在接種時(shí)向兩種其它發(fā)酵中分別以0.125和0.20PPU/1濃度的來自A的脯氨酸特異性蛋白酶。成熟結(jié)束時(shí)(在該情況下為發(fā)酵開始后9天)，所有三種啤酒都在TC冷穩(wěn)定5天，之后去除酵母和冷的沉淀。不進(jìn)行PVPP處理，也不進(jìn)行硅膠處理。所有三種啤酒在硅藻土濾器上過濾，所述濾器具有粗糙的和精細(xì)級(jí)別的濾料層。最后將啤酒裝瓶并在15PU下巴氏滅菌，然后在環(huán)境溫度下儲(chǔ)藏用于保質(zhì)期研究。多種儲(chǔ)藏期后將啤酒在rC預(yù)孵育24小時(shí)，然后在該溫度和90度散射角下測(cè)量啤酒混濁。測(cè)量前搖晃瓶子使其均勻，并放置足夠長(zhǎng)時(shí)間使氣泡消失。進(jìn)行多次測(cè)量以確保氣泡不影響讀數(shù)。獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)于表2中。表2在2(TC儲(chǔ)藏的月數(shù)0369在rC測(cè)量的H90(EBC)值參考(無(wú)酶)7.224.820.721.8發(fā)酵+酶(0.125PPU/1)1.54.67.56.9發(fā)酵+酶(0.20PPU/1)1.34.06.95.2與渾濁度測(cè)量一起，由熟練的小組(n-5)視覺觀察啤酒，并使用EBC9.29術(shù)語(yǔ)學(xué)評(píng)價(jià)。如所期望的一樣，不經(jīng)酶處理的參考啤酒顯示較高的H90EBC值。與這些較高的H90值一致，視覺觀察將所有1=0、3、6和9個(gè)月的樣品定級(jí)為"非?；鞚?(定級(jí)使用EBC方法9.29中所述的術(shù)語(yǔ))。在經(jīng)酶處理的啤酒中，僅新鮮(t=0)樣品顯示較低的H90值(分別為1.5和1.3EBC)。與我們的期望相反，視覺小組將該新鮮的、經(jīng)酶處理的啤酒(t=0月)讀為"鮮亮的"，而根據(jù)獲得的H90值，預(yù)期是"非常輕微混濁"的評(píng)級(jí)。經(jīng)酶處理的長(zhǎng)期儲(chǔ)存的樣品均顯示4EBC或更高的H90值。令人驚奇的是，儲(chǔ)存3、6和9個(gè)月后得自兩種經(jīng)酶處理啤酒的視覺評(píng)級(jí)為"幾乎鮮亮的"，而不是根據(jù)它們的H90值所預(yù)期的"混濁"。因此，我們推定作為在啤酒發(fā)酵方法中使用脯氨酸特異性蛋白酶的結(jié)果，儀器的H90散射值并不指示視覺的混濁感覺，也不指示本發(fā)明的經(jīng)包裝啤酒的膠狀穩(wěn)定性。另外，我們推定根據(jù)本發(fā)明的啤酒與本領(lǐng)域己知的啤酒不同。實(shí)施例4顆粒大小分析通過不同方法穩(wěn)定的啤酒在IFBM(InstituteFrancaisdelaBrasserieetdelaMalterie，Vandoeuvre-23工業(yè)中試啤酒廠里，根據(jù)實(shí)施例2中所述用于12Plato100麥芽汁的流程進(jìn)行四個(gè)發(fā)酵。在接種時(shí)向其中一個(gè)發(fā)酵中添加0.125PPU/1濃度的來自Am'gw的脯氨酸特異性蛋白酶。在成熟結(jié)束時(shí)(在該情況下為發(fā)酵開始后九天)，將所有的啤酒在rc下冷穩(wěn)定5天，之后去除酵母和冷的沉淀。然后用30g/Hl單用途PVPP(注入啤酒過濾中)穩(wěn)定未用脯氨酸特異性蛋白酶穩(wěn)定的三種啤酒之一。未添加脯氨酸特異性蛋白酶的另一啤酒用30g/Hl二氧化硅水凝膠(注入啤酒過濾中)穩(wěn)定。同樣過濾用來自A的脯氨酸特異性蛋白酶處理的啤酒和余下的"未被處理的"對(duì)照啤酒，即不添加PVPP或二氧化硅水凝膠。在硅藻土濾器上過濾所有四種啤酒，所述硅藻土濾器帶有粗糙的和精細(xì)級(jí)別的濾料層，并在所有情況中過濾時(shí)添加硅藻土主體加料。最后將啤酒裝瓶并在15PU下巴氏滅菌，然后保存于環(huán)境溫度下。在該過程中，仔細(xì)地最小化氧水平，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)于所有四種啤酒是相當(dāng)?shù)摹Ｔ诃h(huán)境溫度下儲(chǔ)藏約10個(gè)月后，在BrewingResearchInternational(BRI,Nutfield，UnitedKingdom)使用PhotonCorrelationSpectroscopy(PCS)在6'C下研究四種啤酒的顆粒大小分布。該技術(shù)并不同樣計(jì)數(shù)顆粒，但是提供光散射讀數(shù)，并能夠?qū)⒃撋⑸渥x數(shù)表征為特定顆粒大小種類，從而允許比較四種啤酒樣品的顆粒大小分布。累積標(biāo)準(zhǔn)化散射強(qiáng)度士于圖l中。圖1表明在"未處理的"對(duì)照啤酒中，所有的散射光得自小于2000納米的顆粒。對(duì)于用PVPP和二氧化硅水凝膠穩(wěn)定的啤酒，使光線散射的所有顆粒分別小于約1250和750nm。然而，在脯氨酸特異性蛋白酶處理過的啤酒中均值更小沒有發(fā)現(xiàn)大于385nm的顆粒。為比較圖1中的圖表，用兩個(gè)變量來定量d50，顆粒直徑，50%的光散射來自小于該直徑的顆粒，和；d90，顆粒直徑，90%的光散射來自小于該直徑的顆粒。后一數(shù)據(jù)提供于表3中。表3:經(jīng)不同穩(wěn)定的iFBM啤酒樣品的d50和d90值(參閱文本解釋)。NT:未處理，PVPP:聚乙烯吡咯烷酮多聚體，SHG:二氧化硅水24凝膠，PSP:脯氨酸特異性蛋白酶。處理溫度rc)d50(nm)d9o(nm)NT-對(duì)照6895107330g/hlPVPP6556114130g/hlSHG65376290.125PPU/1PSP6325361表3中的d50和d90值均表明有脯氨酸特異性蛋白酶的啤酒中產(chǎn)生散射的顆粒實(shí)質(zhì)上小于在用PVPP或二氧化硅水凝膠穩(wěn)定的啤酒中的顆粒。這與我們的假設(shè)(脯氨酸特異性蛋白酶對(duì)混濁活性蛋白的水解預(yù)防或減少了成熟中蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成)一致。我們推定作為脯氨酸特異性蛋白酶的作用結(jié)果，混濁活性蛋白被水解，從而儲(chǔ)藏中的蛋白質(zhì)和多酚之間的復(fù)合物保持得較小，因此導(dǎo)致了專業(yè)小組視覺混濁評(píng)估和相對(duì)高的儀器90度散射讀數(shù)之間所觀察到的分歧。我們?cè)俅瓮贫ㄊ褂帽景l(fā)明方法可獲得的啤酒與本領(lǐng)域已知啤酒不同。實(shí)施例5縮短冷穩(wěn)定期及其對(duì)100%麥芽啤酒在周圍溫度下儲(chǔ)藏4和6個(gè)月后混濁發(fā)展的影響在該實(shí)施例中，提供了實(shí)施例2所述啤酒的長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。瓶裝并經(jīng)巴氏滅菌的啤酒儲(chǔ)存在環(huán)境溫度(約20°C)下多至6個(gè)月。儲(chǔ)藏4和6個(gè)月后，使用也描述于實(shí)施例2的混濁測(cè)量和視覺評(píng)估分析啤酒(第1、2、3、4和5批加上表1所列參考)。獲得的數(shù)據(jù)列于表4中。表4第l批第2批第3批第4批第5批參考在-rc穩(wěn)定第天數(shù)01509脯氨酸特異性蛋白是是是是是否PVPP(40g/hl)否否否否是是在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存4個(gè)月后獲得的數(shù)據(jù)25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例2中表1提供的數(shù)據(jù)顯示在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存6周后，按照根據(jù)EBC9.29的視覺評(píng)估，所有瓶裝并經(jīng)巴氏滅菌的啤酒均被評(píng)級(jí)為"鮮亮的"。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，單獨(dú)使用脯氨酸特異性蛋白酶保證了極好的啤酒，即便冷穩(wěn)定期被縮短為將成熟的啤酒冷卻至負(fù)rc所需的時(shí)期，即在該低溫下不保持一段時(shí)間。然而，如表4中所示，當(dāng)啤酒被儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，啤酒的混濁穩(wěn)定性發(fā)生改變。在環(huán)境中儲(chǔ)存四個(gè)月后，對(duì)所有經(jīng)酶處理的啤酒進(jìn)行從0天到多至5天的冷穩(wěn)定，產(chǎn)生非常微弱的混濁。因此我們推定如果脯氨酸特異性蛋白酶與最短冷穩(wěn)定期組合使用，則100%的麥芽啤酒可在至少多至6周的時(shí)期保持視覺上的穩(wěn)定。盡管用脯氨酸特異性蛋白酶加上PVPP處理的第5批啤酒進(jìn)行了最短零下穩(wěn)定期，但是其仍保持為"鮮亮的"。因此后一發(fā)現(xiàn)表明將脯氨酸特異性蛋白酶和PVPP組合使用允許顯著縮短冷穩(wěn)定期，而對(duì)啤酒的長(zhǎng)期混濁穩(wěn)定性沒有任何有害影響。我們使用的是100%麥芽啤酒的事實(shí)使得該發(fā)現(xiàn)更加令人驚訝。實(shí)施例6將酶處理與經(jīng)提高溫度下的短穩(wěn)定期組合除冷穩(wěn)定期長(zhǎng)度之外，將啤酒冷卻至0'C以下所需的能量給啤酒制造方法添加了顯著的成本。因此，使用脯氨酸特異性蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)理想地不應(yīng)僅限于更短的冷穩(wěn)定期，還使得零下穩(wěn)定溫度成為多余。為了測(cè)試后一選擇，我們開始了一組新的中試規(guī)模釀造實(shí)驗(yàn)。以20hl的規(guī)模進(jìn)行六個(gè)釀造試驗(yàn)，基本采用本申請(qǐng)"材料和方法"部分和實(shí)施例2中所述的條件。將使用脯氨酸特異性蛋白酶的效果與使用PVPP和二氧化硅的效果再比較。使用多種冷穩(wěn)定流程，所述流程在0和7t下從幾小時(shí)到4天的范圍內(nèi)。由于脯氨酸特異性蛋白酶加上PVPP似乎代表了有效的穩(wěn)定組合，重復(fù)實(shí)施例2中所述實(shí)驗(yàn)第5批的條件。然而在本實(shí)驗(yàn)中，啤酒不冷卻至負(fù)rc而只冷卻至7"C。后一溫度提供了一種便利的選擇，因?yàn)槠浯砹搜b瓶或裝桶通常使用的最高溫度。在第一個(gè)20hl發(fā)酵中，成熟的啤酒進(jìn)行冷穩(wěn)定期(涉及1天，冷卻至0'C)然后在0"C進(jìn)行4天儲(chǔ)存期。然后用硅藻土過濾啤酒并將其在啤酒過濾中分成兩部分最早的7hl用混合了硅藻土的PVPP以30g/hl處理(主體加料)，最后的7hl用也混合了硅藻土的硅膠S(Spindal，Armainvilliers,France;40g/hl)處理(主體加料)。過濾后將啤酒裝瓶并巴氏滅菌。在表5中，這兩種產(chǎn)物稱為第1批(用PVPP的)和第2批(用硅膠的)。27第二個(gè)20hi發(fā)酵以與第一個(gè)發(fā)酵完全相同的方式進(jìn)行。然而，在該情況下啤酒進(jìn)行涉及1天冷卻至7'C的冷穩(wěn)定期，然后在7"C進(jìn)行4天儲(chǔ)存期。這兩種產(chǎn)物稱為第3批(用PVPP的)和第4批(用硅膠的)。第三和第四個(gè)20hl發(fā)酵均通過在接種前向冷麥芽汁中以0.125PPU/I的濃度添加來自A的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來進(jìn)行。得自該第三種發(fā)酵的啤酒進(jìn)行涉及1天冷卻至0'C的冷穩(wěn)定期，然后在0'C進(jìn)行4天的儲(chǔ)存期，然后硅藻土過濾(不添加PVPP或硅膠)、裝瓶并巴氏滅菌(第5批)。來自第四種發(fā)酵的啤酒進(jìn)行涉及1天冷卻至7'C的冷穩(wěn)定期，然后在7"下進(jìn)行4天的儲(chǔ)存期。然后也用硅藻土過濾(不添加PVPP或硅膠)、裝瓶并巴氏滅菌(第6批)。在第五種發(fā)酵中，冷穩(wěn)定通過僅將成熟的啤酒冷卻至0°C(耗時(shí)少于1天)完成，然后用硅藻土過濾啤酒。然后再將得到的啤酒在啤酒過濾中分成兩份最早的7hl用混合了硅藻土的PVPP以30g/hl處理(第7批)。最后的7hl啤酒用也混合了硅藻土的硅膠S以40g/hl(Spindal,Armainvilliers，F(xiàn)rance;40g/hl)處理(主體加料)，裝瓶并巴氏滅菌(第8批)。在第六種發(fā)酵中，也在接種前以(0.125PPU/1)的濃度在冷麥芽汁中使用來自Am'g^的脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶。成熟后將啤酒直接冷卻至7°C，并用混合了硅藻土的PPVP以30g/hl處理。過濾后也將啤酒直接裝瓶并巴氏滅菌。在表5中得到的啤酒稱為第9批。裝瓶后不久，對(duì)所有的啤酒進(jìn)行大量標(biāo)準(zhǔn)啤酒分析，例如醇、苦味、二乙酰、多酚和壬醛(nonenal)水平。還確定泡沫頭持久性(NIBEMandR0SS&Clark)。得到的數(shù)據(jù)顯示獲得的多種啤酒的質(zhì)量是類似的，并未顯示不期望的差異。感官分析也僅顯示較小的差異。如所預(yù)期的，發(fā)現(xiàn)最大的差異在于啤酒在多種加壓檢測(cè)中的表現(xiàn)。例如，在多種啤酒裝瓶后不久測(cè)定根據(jù)EBC9.29的加壓數(shù)據(jù)和6天、6(TC加速成熟測(cè)試的最終混濁。這些測(cè)量的結(jié)果顯示于表5(參閱"加壓"和"60°C6天")。表5還提供了在環(huán)境溫度下8周儲(chǔ)存期后記錄的瓶裝啤酒的多種H90渾濁度數(shù)據(jù)和視覺評(píng)估。對(duì)這些H90數(shù)據(jù)的測(cè)量如實(shí)施例2所述進(jìn)行。28表5<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>均在儲(chǔ)存24小時(shí)候基于根據(jù)EBC9.29的視覺評(píng)估。"僅冷卻0"是指冷卻至所指溫度而隨后不在所述溫度保持。表5中提供的數(shù)據(jù)再次表明單獨(dú)使用脯氨酸特異性蛋白酶允許顯著縮短的冷穩(wěn)定時(shí)間(參閱第5批)。另外，表5中第數(shù)據(jù)說明這類短穩(wěn)定期在提高的溫度下也是可行的(參閱第6批)。同樣，該發(fā)現(xiàn)對(duì)啤酒釀造者的特定范疇而言與經(jīng)濟(jì)高度相關(guān)。實(shí)施例5中出現(xiàn)的數(shù)據(jù)結(jié)合如本實(shí)施例的表5中所示不使用脯氨酸特異性蛋白酶穩(wěn)定的啤酒相對(duì)較高的EBC.9.30加壓值也提示，這些穩(wěn)定條件可不足以保證在延長(zhǎng)的儲(chǔ)存期后視覺上鮮亮的啤酒。如果可以預(yù)期長(zhǎng)期的保質(zhì)期，則此處(第9批)出現(xiàn)的數(shù)據(jù)提示了一個(gè)"僅冷卻至裝瓶溫度"的流程(即快速冷卻至7t:左右)是足夠的，只要將脯氨酸特異性蛋白酶與PVPP處理組合。因此，本實(shí)施例最令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是將脯氨酸特異性蛋白酶組合(如果期望長(zhǎng)期貨架期，則任選地與PVPP組合)似乎允許完全省略冷穩(wěn)定期。這暗示了非常顯著的加工捷徑從成熟直接到裝瓶，并產(chǎn)生貨架期穩(wěn)定、視覺上鮮亮的權(quán)利要求1.脯氨酸特異性蛋白酶用于加速啤酒釀造過程的用途，優(yōu)選通過縮短儲(chǔ)藏期來加速啤酒釀造過程。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中隊(duì)所述啤酒釀造過程的加速通過減少穩(wěn)定階段的持續(xù)時(shí)間完成。3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述穩(wěn)定階段在適于包裝啤酒單獨(dú)溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在7'C左右。4.如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述穩(wěn)定階段的持續(xù)時(shí)間被減少為將啤酒冷卻至用于過濾和/或包裝的期望最終溫度所需的時(shí)間。5.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的用途，與a-乙酰乳酸脫羧酶組合使用。6.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的用途，與聚乙烯吡咯垸酮(PVPP)組合使用。7.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的用途，與交叉流動(dòng)膜濾器組合使用。8.用于加速啤酒釀造過程的方法，所述方法包括在存在脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)制備啤酒，其中儲(chǔ)藏期被縮短。9.用于制造啤酒的方法，所述方法包括在存在脯氨酸特異性蛋白酶時(shí)發(fā)酵麥芽汁，然后進(jìn)行成熟階段和穩(wěn)定階段，其中穩(wěn)定階段具有少于7天的持續(xù)時(shí)間。10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述穩(wěn)定階段的持續(xù)時(shí)間被減少至將啤酒冷卻至用于過濾和/或包裝的期望最終溫度所需的時(shí)間。11.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述穩(wěn)定階段在適用于包裝啤酒的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選7'C左右。12.如權(quán)利要求8到11中任一項(xiàng)所述的方法，其中發(fā)酵期間也存在a-乙酰乳酸脫羧酶。13.如權(quán)利要求8到12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述儲(chǔ)藏期的持續(xù)時(shí)間少于8天。14.如權(quán)利要求8到14中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用PVPP。215.如權(quán)利要求8到14中任一項(xiàng)所述的方法，其包含過濾步驟，所述過濾步驟中使用交叉流動(dòng)膜濾器。16.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中脯氨酸特異性蛋白酶為具有酸性pH最適值的脯氨酸特異性蛋白酶。17.可通過如權(quán)利要求8到16中任一項(xiàng)的方法獲得的啤酒。18.包含如權(quán)利要求17所述啤酒的瓶、桶或罐。全文摘要本發(fā)明涉及脯氨酸特異性蛋白酶用于加速啤酒釀造過程的用途。具體地，其涉及脯氨酸特異性蛋白酶通過縮短和簡(jiǎn)化啤酒制造的穩(wěn)定階段來加速啤酒釀造過程的用途。該穩(wěn)定期可從啤酒制造方法中原樣省略，從而顯著節(jié)省成本并增加啤酒制造廠的靈活性。文檔編號(hào)C12C5/00GK101490235SQ200780026551公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年6月22日優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日發(fā)明者葉羅恩·路易斯·洛恩·范,明-達(dá)姆·源,路泊·埃登斯申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司