專利名稱：Nat2基因擴增用引物對、含有其的nat2基因擴增用試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴增NAT2基因的引物對、含有其的NAT2基因擴增用試劑及其用途。

背景技術(shù)：
N-乙?；D(zhuǎn)移酶(NATs)是與利用N-結(jié)合將芳香族胺或雜環(huán)胺的芳胺代謝成無毒且穩(wěn)定的物質(zhì)的代謝途徑有關(guān)的酶。其中，NATs亞型中的NAT2關(guān)系到異煙肼(INH)、磺胺二甲嘧啶、其它的磺胺類、普魯卡因胺、肼酞嗪、咖啡因、氨苯砜等同素環(huán)和雜環(huán)芳胺、胼樣藥物的解毒過程及2-氨基芴、4-氨基聯(lián)苯、聯(lián)苯胺、β-萘胺、蛋白質(zhì)的熱分解物質(zhì)中存在的雜環(huán)芳胺等表達性生理物質(zhì)、環(huán)境物質(zhì)等的活化。已知NAT2顯示多態(tài)性，在人體中有19種多態(tài)性。這些多態(tài)性中，NAT2*5類(NAT2*5A～5D)為NAT2基因的mRNA中的341位的T(胸腺嘧啶)突變成C(胞嘧啶)的多態(tài)性，NAT2*6類(NAT2*6A、NAT2*6B)為上述mRNA中的590位的G(鳥嘌呤)突變成A(腺嘌呤)的多態(tài)性，NAT2*7類(NAT2*7A、NAT2*7B)為mRNA中的857位的G(鳥嘌呤)突變成A(腺嘌呤)的多態(tài)性。
已知具有這些突變的患者在服用作為抗拮抗劑的INH時，會發(fā)生肝功能損傷。其原因在于，由于NAT2基因突變，NAT2活性改變，由此無法充分地進行INH的N-乙酰化，肝毒性高的肼的產(chǎn)生增多。另外，還已知NAT2的基因多態(tài)性與上述普魯卡因胺或柳氮磺胺吡啶等的副作用有關(guān)。因此，確認患者NAT2基因多態(tài)性在回避副作用、進行適當(dāng)藥物治療時極為重要。特別是，對于NAT2而言，重要的是確認多個多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)。
另外，作為在基因水平解析所有疾病的原因、個體間的疾病易感性(易患疾病)、個體間的藥效不同等的方法，廣泛地進行點突變、所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測。點突變的通常檢測方法可以舉出(1)對于試樣的目標(biāo)DNA利用PCR(聚合物酶鏈反應(yīng))將相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域擴增、對其全基因序列進行解析的直接測序法；(2)對于試樣的目標(biāo)DNA，利用PCR將相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域擴增，通過隨著上述檢測對象序列中有無目標(biāo)突變而剪切作用不同的限制酶將該擴增產(chǎn)物切斷，進行電泳從而進行分型的RFLP解析；(3)使用目標(biāo)突變位于3’末端區(qū)域的引物進行PCR，通過有無擴增來判斷突變的ASP-PCR法等。
但是，這些方法例如必須進行由試樣提取的DNA的精制、電泳、限制酶處理等，因此需要功夫和成本。另外，進行PCR后，有必要暫時開啟反應(yīng)容器，因此有上述擴增產(chǎn)物混入到之后的反應(yīng)體系內(nèi)，解析精度降低的顧慮。而且，由于自動化困難，因此無法解析大量的樣品。另外，對于上述(3)的ASP-PCR法，還存在特異性低的問題。
由該問題出發(fā)，近年來作為點突變的檢測方法，正在實施對由目標(biāo)核酸和探針形成的雙鏈核酸的融解溫度(Tm)進行解析的方法。這種方法由于通過例如Tm解析或上述雙鏈的融解曲線的解析來進行，因此稱作融解曲線解析。其為以下的方法。即，首先使用與含有檢測目標(biāo)的點突變的檢測對象序列互補的探針，使檢測試樣中的目標(biāo)單鏈DNA與上述探針形成雜交體(雙鏈DNA)。接著，對該雜交產(chǎn)物實施加熱處理，通過吸光度等信號的變動來檢測伴隨溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后，根據(jù)該檢測結(jié)果確定Tm值，從而判斷有無點突變。在雜交產(chǎn)物的同源性越高時Tm值越高、同源性越低時Tm值越低。因此，對于含有點突變的檢測對象序列和與其互補的探針的雜交產(chǎn)物，預(yù)先求得Tm值(評價標(biāo)準(zhǔn)值)，再測定檢測試樣的目標(biāo)單鏈DNA和上述探針的Tm值(測定值)。上述測定值與評價標(biāo)準(zhǔn)值相同時，則可以判斷為匹配、即目標(biāo)DNA中存在點突變，測定值低于評價標(biāo)準(zhǔn)值時，則可以判斷為不匹配、即在目標(biāo)DNA上不存在點突變。而且，通過該方法還可以使基因解析自動化。
但是，對于這種利用Tm解析的檢測方法來說存在如下的問題在PCR中必需特異且高效地擴增含有檢測目標(biāo)位點的區(qū)域。特別是由于NAT存在多個同工酶、編碼它們的序列也極為相似，因此在PCR中，有NAT2以外的同工酶的編碼基因也被擴增的顧慮。另外，當(dāng)其它同工酶的編碼基因也被擴增的情況下，也成為例如在NAT2基因的特定多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)的解析(非專利文獻1或非專利文獻2)中解析結(jié)果的可靠性降低的原因。而且，如此由于解析1個樣品也需要大量的勞力，因此還具有解析大量樣品方面并不實用的問題。
非專利文獻1PMID8102908 Jpn J Hum Genet.1993 Jun；38(2)163-8. 非專利文獻2PMID10507782 Br J Cancer.1999 Oct；81(3)537-41.

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供用于利用基因擴增法特異擴增NAT2基因的目標(biāo)區(qū)域的引物對。
為了達成上述目的，本發(fā)明的引物對，其特征在于，是用于利用基因擴增法擴增NAT2基因的引物對，含有選自由下述引物對(1)～(3)所組成的組中的至少一對引物對。
引物對(1) 含有包含下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對 (F1)與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第20～32個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥嘌呤堿基(G)為3’末端， (R1)與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17～24個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1096位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端； 引物對(2) 含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對 (F2)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端， (R2)下述寡核苷酸中的至少一個 與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第25～40個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1355位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)為3’末端， 以及 與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端； 引物對(3) 含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對 (F3)下述寡核苷酸中的至少一個 與序列號1的堿基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基朝向5’方向至第21～40個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)為3’末端， 以及 與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端， (R3)與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
另外，本發(fā)明的基因擴增用試劑其特征在于，是用于利用基因擴增法擴增NAT2基因的試劑，其含有上述本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對。
本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，其特征在于，其為利用基因擴增法制造NAT2基因的擴增產(chǎn)物的方法，包含下述(I)工序 (I)以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對，在反應(yīng)液中擴增上述NAT2基因的工序。
本發(fā)明的多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析NAT2中3個檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包括下述(i)～(iv)工序 (i)利用本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，在反應(yīng)液中擴增NAT2基因中的含有檢測對象位點的區(qū)域的工序， (ii)準(zhǔn)備含有上述(i)工序的擴增產(chǎn)物和能夠與上述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的工序， (iii)改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物與上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的工序， (iv)由伴隨溫度變化的上述信號值的變動，確定上述檢測對象位點的多態(tài)性的工序。
利用本發(fā)明的引物對，可以在反應(yīng)液中特異且高效地擴增NAT2基因中的、含有檢測目標(biāo)多態(tài)性(NAT2*5或NAT2*6、NAT2*7)發(fā)生位點的目標(biāo)區(qū)域。因此，與上述的現(xiàn)有方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于如此特異地擴增NAT2基因的含有特定多態(tài)性發(fā)生的檢測對象位點的區(qū)域，因此通過進一步使用與檢測對象序列互補的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進行Tm解析，將上述多態(tài)性分型。另外，由于可以在一個反應(yīng)液中進行擴增、分型，因此還能夠?qū)崿F(xiàn)操作的自動化。而且，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時，例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略預(yù)處理，因此可以更為迅速且簡單地進行擴增反應(yīng)。另外，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時，由于以優(yōu)于以往的擴增效率進行擴增反應(yīng)，因此還能夠縮短擴增反應(yīng)。因而，利用本發(fā)明的引物對、含有其的試劑、以及使用它們的擴增產(chǎn)物的制造方法和多態(tài)性解析方法，由于可以迅速且簡單地解析NAT2基因的多態(tài)性，因此在醫(yī)療領(lǐng)域中極為有效。



圖1為表示本發(fā)明實施例1的Tm解析結(jié)果的圖表。
圖2為表示本發(fā)明實施例2的Tm解析結(jié)果的圖表。

具體實施例方式 <NAT2基因擴增用引物對> 本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對如上所述，其特征在于，含有選自由上述引物對(1)～(3)所組成的組中的至少一對引物對。通過含有至少任一對引物對，例如可以特異地擴增NAT2基因中的特定目標(biāo)區(qū)域。
本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對例如可以僅含有上述引物對(1)～(3)中的任一種，還可以含有任兩種或者含有引物對(1)～(3)的全部。在后敘述，利用引物對(1)能夠特異擴增的目標(biāo)區(qū)域為在NAT2基因中含有多態(tài)性NAT2*5發(fā)生位點的區(qū)域，利用引物對(2)能夠特異擴增的目標(biāo)區(qū)域為在NAT2基因中含有多態(tài)性NAT2*6發(fā)生位點的區(qū)域，利用引物對(3)能夠特異擴增的目標(biāo)區(qū)域為在NAT2區(qū)域中含有多態(tài)性NAT2*7發(fā)生位點的區(qū)域。
如上所述，已知NAT2基因的這3種多態(tài)性全部為對藥物代謝具有影響的多態(tài)性，因此重要的是不僅對任1種進行研究，還要對任2種或者3種全部進行研究。但是，以往方法具有無法在一個反應(yīng)體系內(nèi)解析多個序列的問題。這是由于如上所述NAT存在多個同工酶，因此在PCR中，連NAT2以外的同工酶的編碼基因也被擴增。因而，為了研究NAT2基因的3種多態(tài)性(NAT2*5、NAT2,*6和NAT2*7)中的2種或3種全部多態(tài)性，有必要在各反應(yīng)體系中分別擴增含有各個多態(tài)性發(fā)生位點的區(qū)域，對所得擴增產(chǎn)物分別進行解析。如此，以往的方法難以做到僅將NAT基因中的NAT2基因作為模板、且在NAT2基因中僅特異地擴增分別含有上述多態(tài)性發(fā)生位點的2種或3種目標(biāo)區(qū)域。而且，由于解析1個樣品也需要大量勞力，因此具有解析大量樣品并不實用的問題。與此相反，通過本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對，在含有上述引物對(1)～(3)中的任2種或3種全部時，可以在同一反應(yīng)液中同時且特異地擴增各個目標(biāo)區(qū)域。因此，與上述以往方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于在同一反應(yīng)液中特異地擴增2個或3個目標(biāo)區(qū)域，因此例如通過使用與各個目標(biāo)區(qū)域的檢測對象序列互補的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進行Tm解析，分別對上述2種或3種多態(tài)性進行分型。如此，由于可以在同一反應(yīng)液中解析NAT2基因中的2種或3種多態(tài)性，因此本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對例如在含有引物對(1)～(3)任一種時當(dāng)然優(yōu)選，在含有任2種或3種時也優(yōu)選。使用這種NAT2基因擴增用引物對，擴增1個目標(biāo)區(qū)域當(dāng)然是可以的，當(dāng)同時擴增2個或3個目標(biāo)區(qū)域時，也可以較以往更為高效地進行NAT2基因的多態(tài)性解析。
予以說明，以下有時將正向引物稱作F引物、將反向引物稱作R引物。
上述引物對(1)如上所述，為含有包含下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對。
(F1)與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第20～32個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥嘌呤堿基(G)為3’末端， (R1)與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17～24個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1096位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端。
序列號1所示的堿基序列是人來源的芳胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶NAT等位基因1-2基因(Human h NAT allele 1-2 gene forarylamine N-acetyltransferase)的DNA序列，例如NCBI登錄號No.D10870所登錄的基因。
上述引物對(1)為用于擴增序列號1中的、含有第1039～第1095區(qū)域的DNA鏈及其互補鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第1063位堿基(序列號1的第1063位堿基)存在對NAT2的功能具有影響的點突變(1063T、1063C)，該多態(tài)性為上述NAT2*5。本發(fā)明中，該位點的多態(tài)性在為純合子時用1063T/T、1063C/C表示，在為雜合子時用1063T/C表示。予以說明，序列號1中的第1063位堿基相當(dāng)于NAT2基因的mRNA的第341位堿基，因此NAT2*5的多態(tài)性還可以表示為341T/T、341C/C、341T/C。以下，將該引物對(1)稱作“NAT2*5用引物對”。予以說明，在僅解析NAT2*5的多態(tài)性時，可以僅使用NAT2*5用引物對。
引物對(1)的F1引物和R1引物，只要是起到?jīng)Q定DNA聚合酶擴增的起始點的作用的3’末端堿基滿足上述條件即可。如此，通過固定各引物的3’末端的堿基，可以充分地防止引物對(1)例如結(jié)合在類似的其它同工酶基因(例如NAT1、NAT6、NAT8、NAT9基因等)上。
這樣，F(xiàn)1引物和R1引物由于只要其3’末端的堿基被固定即可，因此各引物的長度本身并無特別限定，可以適當(dāng)調(diào)整至普通的長度。作為引物長度的一例，例如為13～50mer的范圍、優(yōu)選為14～45mer、更優(yōu)選為15～40mer。作為具體例，上述F1引物優(yōu)選為如下與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第20～32個堿基(優(yōu)選第24～30個堿基、更優(yōu)選第25～29個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸。另外，上述R1引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17～24個堿基(優(yōu)選第19～23個堿基、更優(yōu)選第20～22個堿基)的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸。予以說明，由于F1引物和R1引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的區(qū)域例如如上所述為序列號1的第1039～第1095的區(qū)域，所得擴增產(chǎn)物的整個長度隨所用引物的長度而改變。
另外，R1引物可以是與序列號1所示的堿基序列并非完全互補的寡核苷酸、F1引物可以是與上述堿基序列的互補鏈并非完全互補的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端堿基以外的部分中，可以與完全互補的寡核苷酸有1個～5個堿基不同。
以下舉出F1引物和R1引物的具體例子，本發(fā)明并非限于此。另外，這些F1引物和R1引物的組合并無任何限定，這些中，特別優(yōu)選含有包含序列號5或序列號7的寡核苷酸的F1’引物和包含序列號16或序列號18的寡核苷酸的R1’引物的引物對(1’)。予以說明，下述表的“Tm(℃)”是下述表的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(℃)，通過MELTCALC軟件(http://www.meltcalc.com)、將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0.2μM、鈉當(dāng)量(Na eq.)50mM而計算的數(shù)值(以下相同)。上述Tm值例如可通過現(xiàn)有公知的MELTCALC軟件(http://www.meltcalc.com)等計算，另外，還可以通過鄰接法(Nearest Neighbor Method)確定(以下相同)。
表1
接著，上述引物對(2)如上所述，為含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反相引物的一對引物對。
(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端， (R2)下述寡核苷酸中的至少一個 與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第25～40個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1355位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)為3’末端， 以及 與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
上述引物對(2)為用于擴增序列號1中的、含有第1279～第1354區(qū)域或第1279～第1613區(qū)域的DNA鏈及其互補鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第1312位堿基(序列號1的第1312位堿基)存在對NAT2的功能具有影響的點突變(1312G、1312A)，該多態(tài)性為上述NAT2*6。本發(fā)明中，該位點的多態(tài)性在為純合子時可用1312G/G、1312A/A表示，在為雜合子時可用1312G/A表示。予以說明，序列號1中的第1312位堿基相當(dāng)于NAT2基因的mRNA中的第590位堿基，因此NAT2*6的多態(tài)性，例如還可以表示為590G/G、590A/A、590G/A。以下，將該引物對(2)稱作“NAT2*6用引物對”。予以說明，在僅解析NAT2*6的多態(tài)性時，可以僅使用NAT2*6用引物對。
本發(fā)明中，從與上述引物對(1)相同的理由出發(fā)，引物對(2)的F2引物和R2引物只要是起到?jīng)Q定DNA聚合酶的擴增起始點的作用的3’末端的堿基滿足上述條件即可。因此，F(xiàn)2引物和R2引物的長度本身并無特別限定，可以舉出與上述同樣的長度。作為具體例，上述F2引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基(優(yōu)選第21～38個堿基、更優(yōu)選第22～38個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸。另外，上述(R2)引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第25～40個堿基(優(yōu)選第27～35個堿基、更優(yōu)選第28～34個堿基)的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸或者與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基(優(yōu)選第23～36個堿基、更優(yōu)選第24～36個堿基)的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸。予以說明，由于F2引物和R2引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的區(qū)域通常為序列號1的第1279～第1354區(qū)域或第1279～第1613區(qū)域，所得擴增產(chǎn)物的整個長度隨所用引物的長度改變。
另外，R2引物可以是與序列號1所示的堿基序列并非完全互補的寡核苷酸、F2引物可以是與上述堿基序列的互補鏈并非完全互補的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的堿基外的部分，可以與完全互補的寡核苷酸有1個～5個堿基不同。
以下舉出F2引物和R2引物的具體例子，本發(fā)明并非限于此。另外，這些F2引物和R2引物的組合并無任何限定，這些中，特別優(yōu)選含有包含序列號33或序列號109的寡核苷酸的F2’引物和包含序列號39或序列號48的寡核苷酸的R2’引物的引物對(2’)。
表2
接著，如上所述，上述引物對(3)為含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對。
(F3)下述寡核苷酸中的至少一個 與序列號1的堿基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基朝向5’方向至第21～40個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)為3’末端， 以及 與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端， (R3)與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
上述引物對(3)為用于擴增序列號1中的、含有第1557～第1613區(qū)域或第1279～第1613區(qū)域的DNA鏈及其互補鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第1579位堿基(序列號1中的第1579位堿基)存在對NAT2的功能具有影響的點突變(1579G、1579A)，該多態(tài)性為上述NAT2*7。本發(fā)明中，該位點的多態(tài)性在為純合子時用1579G/G、1579A/A表示，在為雜合子時用1579G/A表示。予以說明，序列號1中的第1579位堿基相當(dāng)于NAT2基因的mRNA的第857位堿基，因此NAT2*7的多態(tài)性例如還可以表示為857G/G、857A/A、857G/A。以下，將該引物對(3)稱作“NAT2*7用引物對”。予以說明，在僅解析NAT2*7的多態(tài)性時，可以僅使用NAT2*7用引物對。
本發(fā)明中，從與上述引物對(1)相同的理由出發(fā)，引物對(3)的F3引物和R3引物只要是起到?jīng)Q定DNA聚合酶的擴增起始點的作用的3’末端的堿基滿足上述條件即可。因此，F(xiàn)3引物和R3引物的長度本身并無特別限定，可以舉出與上述同樣的長度。作為具體例，上述F3引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基朝向5’方向至第21～40個堿基(優(yōu)選第23～40個堿基、更優(yōu)選第24～40個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，或者優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基(優(yōu)選第21～38個堿基、更優(yōu)選第22～38個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸。上述(R3)引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基(優(yōu)選第23～35個堿基、更優(yōu)選第24～28個堿基)的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸。予以說明，由于F3引物和R3引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的區(qū)域通常如上所述為序列號1的第1557～第1613區(qū)域或第1279～第1613區(qū)域，所得擴增產(chǎn)物的整個長度隨所用引物的長度改變。
另外，R3引物可以是與序列號1所示的堿基序列并非完全互補的寡核苷酸、F3引物可以是與上述堿基序列的互補鏈并非完全互補的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的堿基以外的部分，可以與完全互補的寡核苷酸有1個～5個堿基不同。
以下舉出F3引物和R3引物的具體例子，本發(fā)明并非限于此。另外，這些F3引物和R3引物的組合并無任何限定，這些中，特別優(yōu)選含有包含序列號60或序列號113的寡核苷酸的F3’引物和包含序列號71或序列號81的寡核苷酸的R3’引物的引物對(3’)。
表3
另外，上述各引物例如為了提高擴增反應(yīng)的反應(yīng)溫度，還可以在5’末端添加現(xiàn)有公知的任意序列。
利用上述引物對(2)或上述引物對(3)擴增含有第1279～第1613的DNA鏈及其互補鏈時，無論任何引物對中，均可使用下面所示的相同的正向引物和反向引物。
正向引物 (F2)(F3)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端。
反向引物 (R2)(R3)與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
此時，本發(fā)明的引物對除了含有引物對(1)之外，例如可以僅含有1種引物對(NAT2*6*7用引物)作為引物對(2)和(3)。另外，正向引物可以包含兼有上述引物對(2)和引物對(3)的正向引物的1種正向引物，反向引物可以包含上述引物對(2)和引物對(3)的各自的反向引物。
含有這種引物對(1)～(3)的至少1種的本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對，例如優(yōu)選在擴增全血試樣等生物試樣的NAT2基因時使用。特別是，本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對與后述多態(tài)性檢測用探針一起使用時，優(yōu)選使基因擴增用反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例為0.1～0.5體積％。對于該方面在后敘述。
<NAT2基因擴增用試劑> 如上所述，本發(fā)明的NAT2基因擴增用試劑，其特征在于，其為用于利用基因擴增法擴增NAT2基因的試劑，包含本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對。本發(fā)明的NAT2基因擴增用試劑的特征在于含有本發(fā)明的引物對，除此之外的組成等并無任何限定。
為了對使用本發(fā)明引物對、利用基因擴增法獲得的擴增產(chǎn)物進行檢測，本發(fā)明的NAT2基因擴增用試劑還可以含有例如能夠與NAT2基因的檢測對象位點雜交的探針。如上所述，利用本發(fā)明的引物對，例如可以根據(jù)其中所含引物對(1)～(3)的種類，利用基因擴增法特異地擴增NAT2基因的1～3個目標(biāo)區(qū)域。因此，通過同時存在與上述各目標(biāo)區(qū)域的檢測對象序列互補的探針，例如可以利用后述的方法檢測有無擴增、分析檢測對象位點的基因型(多態(tài)性)等。對于這種探針及其利用方法，在之后的多態(tài)性解析方法中說明。另外，本發(fā)明的NAT2基因擴增用試劑優(yōu)選在擴增全血等生物試樣中的NAT2基因時使用。特別是，在同時使用本發(fā)明的NAT2基因擴增用試劑與上述探針時，優(yōu)選使基因擴增用反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例為0.1～0.5體積％。予以說明，本發(fā)明中“檢測對象序列”是指含有多態(tài)性發(fā)生位點(檢測對象位點)的序列。
本發(fā)明的NAT2基因擴增用試劑的形態(tài)并無特別限定，例如可以是含有本發(fā)明NAT2基因擴增用引物對的液體試劑，還可以是在使用前用溶劑混懸的干燥試劑。另外，NAT2基因擴增用引物對的含量也無特別限定。
<擴增產(chǎn)物的制造方法> 本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，如上所述，其特征在于，是利用基因擴增法制造NAT2基因的擴增產(chǎn)物的方法，包含下述(I)工序 (I)以試樣中的核酸為模板，使用本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對，在反應(yīng)液中擴增上述NAT2基因的工序。
如此通過使用本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對進行擴增反應(yīng)，如上所述可以擴增NAT2基因的目標(biāo)區(qū)域。另外，本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對含有上述引物對(1)～(3)中的任2種時，可以在同一反應(yīng)液中同時擴增NAT2基因的分別含有2個檢測對象位點的2個目標(biāo)區(qū)域。另外，本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對含有上述引物對(1)～(3)全部時，可以在同一反應(yīng)液中同時擴增NAT2基因的分別含有3個檢測對象位點的3個目標(biāo)區(qū)域。通過本發(fā)明擴增的目標(biāo)區(qū)域如上所述，為分別含有各多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7)發(fā)生的檢測對象位點的區(qū)域。予以說明，本發(fā)明的擴增產(chǎn)物制造方法的特征在于使用本發(fā)明的引物對，對基因擴增法的種類、條件等并無任何限定。
上述基因擴增法如上所述并無特別限定，例如可以舉出PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng))法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification，基于核酸序列的擴增)法、TMA(Transcription-mediated amplification，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增)法、SDA(Strand Displacement Amplification，鏈置換擴增)法等，優(yōu)選PCR法。另外，以下以PCR法為例說明本發(fā)明，但并非局限于此。
作為應(yīng)用本發(fā)明的試樣，例如只要含有做為模板的核酸即可，并無特別限定，例如優(yōu)選應(yīng)用于含有雜質(zhì)的材料。作為上述含有雜質(zhì)的試樣例如可以舉出全血、口腔內(nèi)細胞(例如口腔粘膜)、指甲或毛發(fā)等體細胞、生殖細胞、吐出的痰液、羊水、石蠟包埋組織、尿、胃液(例如胃洗滌液)等，它們的混懸液等。使用了本發(fā)明的引物對的擴增產(chǎn)物的制造方法，例如即便是含有各種雜質(zhì)的試樣(特別是全血、口腔內(nèi)細胞等生物材料)，也不易受雜質(zhì)的影響，可以特異地擴增NAT2基因的上述區(qū)域。因此，通過本發(fā)明，即便是通過以往方法較難分析的雜質(zhì)多的試樣，也可以不進行精制等預(yù)處理直接使用。因此，從試樣的預(yù)處理的觀點出發(fā)，可以較以往方法更為迅速地制造擴增產(chǎn)物。
上述反應(yīng)液中的試樣添加比例并無特別限定。作為具體例，當(dāng)上述試樣為生物試樣(例如全血試樣)時，上述反應(yīng)液中的添加比例的下限例如優(yōu)選為0.01體積％以上、更優(yōu)選為0.05體積％以上、進一步優(yōu)選為0.1體積％以上。上述添加比例的上限并無特別限定，例如優(yōu)選為2體積％以下、更優(yōu)選為1體積％以下、進一步優(yōu)選為0.5體積％以下。
另外，如后述的以光學(xué)檢測為目的時，特別是使用標(biāo)記探針進行光學(xué)檢測時，上述反應(yīng)液中的全血試樣等生物試樣的添加比例例如優(yōu)選設(shè)定為0.1～0.5體積％。在PCR反應(yīng)中，通常為了使DNA變性(解離成單鏈DNA)而實施熱處理，但由于該熱處理，試樣所含的糖、蛋白質(zhì)等發(fā)生變性，有產(chǎn)生不溶沉淀物、混濁等的顧慮。因此，在利用光學(xué)方法確認擴增產(chǎn)物的有無、檢測對象位點的基因型(多態(tài)性)時，這種沉淀物、混濁的發(fā)生有可能對測定精度造成影響。但是，通過將反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi)，雖然原理不明，但由于例如可以充分地防止變性所產(chǎn)生的沉淀物等造成的影響，因此可以提高光學(xué)方法的測定精度。另外，由于還可充分地抑制全血試樣中的雜質(zhì)對PCR的干擾，因此可以進一步提高擴增效率。因而，在使用本發(fā)明的引物對的基礎(chǔ)上，通過進一步將全血試樣等試樣的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi)，可以進一步降低試樣預(yù)處理的必要性。
另外，上述反應(yīng)液中的全血試樣的比例可以不用上述體積比例(例如0.1～0.5體積％)表示，用血紅蛋白(以下稱作“Hb”)的重量比例來表示也是可以的。此時，上述反應(yīng)液的全血試樣的比例換算為Hb量例如優(yōu)選為0.565～113g/L的范圍、更優(yōu)選為2.825～56.5g/L的范圍、進一步優(yōu)選為5.65～28.25g/L的范圍。予以說明，上述反應(yīng)中的全血試樣的添加比例例如可以滿足上述體積比例和Hb重量比例兩者，也可以滿足任一者。
作為全血，例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固組分的全血等任一種。
本發(fā)明中，試樣所含的目標(biāo)核酸例如為DNA。上述DNA例如可以是生物試樣等試樣中原本含有的DNA，還可以是通過基因擴增法擴增的擴增產(chǎn)物DNA。為后者時，可以舉出利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(例如RT-PCR(reverse transcriptase PCR))由上述試樣原本含有的RNA(總RNA、mRNA)生成的cDNA。
本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法中，優(yōu)選在基因擴增反應(yīng)開始前，向上述反應(yīng)液中添加白蛋白。通過這種白蛋白的添加，例如可以進一步降低上述沉淀物、懸濁的產(chǎn)生所帶來的影響，且可以進一步提高擴增效率。具體地說，優(yōu)選在上述(I)工序的擴增反應(yīng)中或解離成單鏈DNA的工序前添加白蛋白。
上述反應(yīng)液中的白蛋白添加比例例如為0.01～2重量％的范圍、優(yōu)選為0.1～1重量％、更優(yōu)選為0.2～0.8重量％。上述白蛋白并無特別限定，例如可以舉出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、馬血清白蛋白等，這些物質(zhì)可以使用任1種，還可以并用2種以上。
接著，列舉例子對本發(fā)明的擴增產(chǎn)物制造方法進行說明，所述例子為對全血試樣，以DNA為目標(biāo)核酸、使用含有上述引物對(1)～(3)的本發(fā)明NAT2基因擴增用引物對、利用PCR來制造NAT2基因的3個目標(biāo)區(qū)域的擴增產(chǎn)物的例子。予以說明，本發(fā)明的特征在于使用本發(fā)明的引物對，其他構(gòu)成及條件并無任何限定。
首先，制備PCR反應(yīng)液。本發(fā)明的引物對的添加比例并無特別限定，優(yōu)選按照引物對(1)～(3)的F引物分別達到0.1～2μmol/L地添加、更優(yōu)選為0.25～1.5μmol/L、特別優(yōu)選為0.5～1μmol/L。另外，優(yōu)選按照引物對(1)～(3)的R引物分別達到0.1～2μmol/L地添加、更優(yōu)選為0.25～1.5μmol/L、特別優(yōu)選為0.5～1μmol/L。各引物對中的F引物和R引物的添加比例(F:R的摩爾比)并無特別限定，例如優(yōu)選為1:0.25～1:4、更優(yōu)選為1:0.5～1:2。
反應(yīng)液中全血試樣的比例并無特別限定，優(yōu)選為上述范圍。全血試樣可以直接添加在反應(yīng)液中，還可以預(yù)先用水或緩沖液等溶劑稀釋后添加至反應(yīng)液中。預(yù)先稀釋全血試樣時，其稀釋率并無特別限定，例如可以按照反應(yīng)液中最終全血添加比例達到上述范圍進行設(shè)定，例如為100～2000倍、優(yōu)選為200～1000倍。
上述反應(yīng)液的其它組成成分并無特別限定，可以舉出以往公知的成分，其比例也無特別限定。上述組成成分例如可以舉出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶劑。另外，如上所述，優(yōu)選上述反應(yīng)液中進一步含有白蛋白。予以說明，上述反應(yīng)液中，各組成成分的添加順序并無任何限定。
上述DNA聚合酶并無特別限定，例如可以使用現(xiàn)有公知的耐熱性細菌來源的聚合酶。具體例子有可以商業(yè)地獲得的來自棲熱水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美國專利第4,889,818號以及美國專利第5,079,352號)(商品名Taq聚合酶)、來自極端嗜熱菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTth DNA polymerase)、來自強烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNApolymeraseStratagenes公司產(chǎn))、來自嗜熱球菌(Thermococcuslitoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455 430)(商標(biāo)VentNew EnglandBiolabs公司產(chǎn))等，其中，優(yōu)選來自棲熱水生菌(Thermusaquaticus)的耐熱性DNA聚合酶。
上述反應(yīng)液中DNA聚合酶的添加比例并無特別限定，例如為1～100U/mL、優(yōu)選為5～50U/mL、更優(yōu)選為20～30U/mL。予以說明，DNA聚合酶的活性單位(U)一般是以活化鮭魚精子DNA為模板和引物，在活性測定用反應(yīng)液中、74℃下、30分鐘內(nèi)將10nmol的總核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物的活性作為1U。上述活性測定用反應(yīng)液的組成例如為25mM TAPS buffer(pH9.3、25℃)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巰基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP、0.25mg/mL活性鮭魚精子DNA。
上述核苷三磷酸通?？梢耘e出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反應(yīng)液中的dNTP的添加比例并無特別限定，例如為0.01～1mmol/L、優(yōu)選為0.05～0.5mmol/L、更優(yōu)選為0.1～0.3mmol/L。
上述溶劑例如可以舉出Tris-HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等緩沖液，可以使用市售的PCR用緩沖液或市售的PCR試劑盒的緩沖液等。
另外，上述PCR反應(yīng)液還可以含有肝素、甜菜堿、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等，它們的添加比例例如可以在不阻礙PCR反應(yīng)的范圍內(nèi)設(shè)定。
反應(yīng)液的總體積并無特別限定，例如可以根據(jù)所用儀器(熱循環(huán)儀)等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，通常為1～500μL、優(yōu)選為10～100μL。
接著，進行PCR。PCR循環(huán)條件并無特別限定，例如(1)全血來源的雙鏈DNA解離成單鏈DNA、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反應(yīng))分別如下所述。另外，循環(huán)數(shù)也無特別限定，以下述(1)～(3)的3步驟為1個循環(huán)，例如優(yōu)選為30個循環(huán)以上。上限并無特別限定，例如共計100個循環(huán)以下、優(yōu)選70個循環(huán)以下、更優(yōu)選50個循環(huán)以下。各步驟的溫度變化例如可以使用熱循環(huán)儀等自動地控制。使用本發(fā)明的引物對時，如上所述由于擴增效率優(yōu)異，因此與利用以往方法時50個循環(huán)需要3小時左右相比，利用本發(fā)明可以在約1小時左右(優(yōu)選1小時以內(nèi))完成50個循環(huán)。
表4
如上所述，可以制造與NAT2基因的3個區(qū)域互補的擴增產(chǎn)物。予以說明，在制造與3個目標(biāo)區(qū)域中任1個或任2個互補的擴增產(chǎn)物時，例如可以使用含有引物對(1)～(3)中與目標(biāo)區(qū)域相應(yīng)的任1種或任2種引物對的本發(fā)明的NAT2基因擴增用引物對。
本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法還包含檢測通過上述擴增反應(yīng)獲得的區(qū)域的擴增產(chǎn)物的工序。由此，可以檢測擴增產(chǎn)物的有無、NAT2基因的上述目標(biāo)區(qū)域中的基因型(多態(tài)性NAT2*5、多態(tài)性NAT2*6、多態(tài)性NAT2*7)。擴增產(chǎn)物的有無可以利用現(xiàn)有公知的方法確認。具體地說，在上述(I)工序中，在上述反應(yīng)液中預(yù)先添加能夠與NAT2基因的檢測對象位點雜交的探針(例如熒光標(biāo)記探針)，進而，通過(II)工序，即，測定上述反應(yīng)液中的上述探針的熒光標(biāo)記的熒光強度來確認。另外，當(dāng)所擴增的目標(biāo)區(qū)域為2個或3個時，例如在上述(I)工序中向上述反應(yīng)液中預(yù)先添加2種或3種能夠與NAT2基因的各檢測對象位點雜交的探針(例如熒光標(biāo)記探針)，進而，通過(III)工序，即，測定上述反應(yīng)液中的各探針的各熒光標(biāo)記的熒光強度來確認。予以說明，以下將NAT2基因的多態(tài)性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7的檢測作為本發(fā)明的一方式，進行說明。
<NAT2基因的多態(tài)性解析方法> 本發(fā)明的NAT2基因的多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析NAT2基因的檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包含下述(i)～(iv)工序 (i)利用本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，在反應(yīng)液中擴增NAT2基因的含有檢測對象位點的區(qū)域的工序， (ii)準(zhǔn)備含有上述(i)工序的擴增產(chǎn)物和能夠與上述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的工序， (iii)改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物與上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的工序， (iv)由伴隨溫度變化的上述信號值的變動，確定上述檢測對象位點的多態(tài)性的工序。
如此通過使用本發(fā)明的引物對制造擴增產(chǎn)物，可以如上所述地擴增NAT2基因中的含有多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)檢測對象位點的目標(biāo)區(qū)域、解析上述目標(biāo)區(qū)域的檢測對象位點的多態(tài)性。
上述(i)工序的探針并無特別限定，例如可以舉出與多態(tài)性NAT2*5的發(fā)生位點雜交的探針(以下也稱作“NAT2*5用探針”)、與多態(tài)性NAT2*6的發(fā)生位點雜交的探針(以下也稱作“NAT2*6用探針”)、與多態(tài)性NAT2*7的發(fā)生位點雜交的探針(以下也稱作“NAT2*7用探針”)。這些探針優(yōu)選為與含有上述檢測對象位點的檢測對象序列互補的探針。這些探針可以為任1種，還可以是任2種或3種全部，例如可以根據(jù)通過本發(fā)明NAT2基因擴增用引物對擴增的目標(biāo)區(qū)域的種類來確定。使用2種或3種探針時，例如可以使用同一反應(yīng)液解析任2個檢測對象位點或上述3個檢測對象位點全部的多態(tài)性。
用于檢測上述多態(tài)性的探針并無特別限定，可以利用現(xiàn)有公知的方法設(shè)定。例如作為含有多態(tài)性的檢測對象位點的檢測對象序列可以根據(jù)NAT2基因的正義鏈的序列來設(shè)計，還可以根據(jù)反義鏈的序列設(shè)計。另外，多態(tài)性檢測對象位點的堿基可根據(jù)各多態(tài)性的種類適當(dāng)?shù)卮_定。即，NAT2*5的情形中，已知序列號1的第1063位堿基存在“T”和“C”的多態(tài)性，因此可以舉出例如與第1063位為T的檢測對象序列和第1063位為C的檢測對象序列的任一個互補的探針(正義鏈的檢測用探針)、與其反義鏈的序列互補的探針(反義鏈的檢測用探針)。另外，NAT2*6的情形中，已知序列號1的第1312位堿基存在“G”和“A”的多態(tài)性，因此可以舉出例如與第1312位為G的檢測對象序列和第1312位為A的檢測對象序列的任一個互補的探針(正義鏈的檢測用探針)、與其反義鏈的序列互補的探針(反義鏈的檢測用探針)。NAT2*7的情形中，已知序列號1的第1579位堿基存在“G”和“A”的多態(tài)性，因此可以舉出例如與第1579位為G的檢測對象序列和第1579位為A的檢測對象序列的任一個互補的探針(正義鏈的檢測用探針)、與其反義鏈的序列互補的探針(反義鏈的檢測用探針)。這樣，在設(shè)計探針時，無論將發(fā)生多態(tài)性的檢測對象位點的堿基設(shè)定為上述哪種堿基，都可以利用后述的方法來判斷在NAT2基因的各檢測對象位點處顯示何種多態(tài)性。
上述各探針可以在上述(i)工序后、即對于NAT2基因的目標(biāo)區(qū)域進行擴增反應(yīng)后，添加于擴增反應(yīng)液中，但優(yōu)選在上述(i)工序的擴增反應(yīng)之前預(yù)先添加到反應(yīng)液中，其原因在于這樣可容易且迅速地進行解析。
上述反應(yīng)液中探針的添加比例并無特別限定，例如優(yōu)選按照達到10～400nmol/L的范圍添加各探針，更優(yōu)選為20～200nmol/L。另外，使用熒光染料作為探針的標(biāo)記時，例如為了調(diào)整所檢測的熒光強度，可以同時使用與標(biāo)記探針序列相同的但未標(biāo)記的探針，該未標(biāo)記探針可以在其3’末端附加有磷酸。此時，標(biāo)記探針與非標(biāo)記探針的摩爾比例如優(yōu)選為1:10～10:1。上述探針的長度并無特別限定，例如為5～50mer、優(yōu)選為10～30mer。
對于Tm值進行說明。當(dāng)持續(xù)加熱含有雙鏈DNA的溶液時，260nm的吸光度上升。這是由于雙鏈DNA雙鏈間的氫鍵通過加熱而打開，解離成單鏈DNA(DNA融解)。而且，當(dāng)全部的雙鏈DNA解離、變?yōu)閱捂淒NA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈DNA的吸光度)的約1.5倍左右，由此可以判斷融解結(jié)束。根據(jù)該現(xiàn)象，融解溫度Tm一般定義為吸光度到達吸光度總上升量的50％時的溫度。
在上述(iii)工序中，上述擴增產(chǎn)物與上述探針的雜交產(chǎn)物顯示溶解狀態(tài)的信號的測定，可以是上述260nm的吸光度測定，還可以是標(biāo)記物的信號測定。具體地說，優(yōu)選使用用標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記探針作為上述探針，測定上述標(biāo)記物的信號。作為上述標(biāo)記探針例如可以舉出單獨時顯示信號、由于形成雜交體而不顯示信號的標(biāo)記探針；或者單獨不顯示信號、由于形成雜交體而顯示信號的標(biāo)記探針。為前者的這種探針時，在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時不顯示信號，通過加熱探針游離時，則顯示信號。另外，為后者的探針時，在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時顯示信號，通過加熱探針游離時，則信號減少(消失)。因此，通過在信號特有條件(吸收波長等)下檢測該標(biāo)記所產(chǎn)生的信號，可以與上述260nm的吸光度測定同樣，可以確定融解的進展以及Tm值確定。
本發(fā)明中，如上所述，還可以對在同一反應(yīng)液中擴增的2個或3個目標(biāo)區(qū)域的擴增產(chǎn)物確認多態(tài)性。因此，使用2種或3種探針時，優(yōu)選使用在各不相同的條件下被檢測的不同標(biāo)記進行標(biāo)記。通過如此使用不同的標(biāo)記，即便是同一反應(yīng)液，通過改變檢測條件，也可以分別解析各擴增產(chǎn)物。
作為上述標(biāo)記探針的標(biāo)記物的具體例子，例如可以舉出熒光染料(熒光團)。作為上述標(biāo)記探針的具體例子例如優(yōu)選用熒光染料進行標(biāo)記、單獨時顯示熒光、且通過形成雜交體熒光減少(例如猝滅)的探針。利用這種熒光猝滅現(xiàn)象(Quenchingphenomenon)的探針一般被稱作熒光猝滅探針。其中，上述探針優(yōu)選寡核苷酸的3’末端或5’末端被熒光染料標(biāo)記，被標(biāo)記的上述末端的堿基優(yōu)選為C。此時，優(yōu)選將上述標(biāo)記探針的堿基序列設(shè)計成在上述標(biāo)記探針?biāo)s交的檢測對象序列中，與上述標(biāo)記探針的末端堿基C成對的堿基或者從上述成對的堿基起距離1～3個堿基的堿基為G。這種探針一般被稱作鳥嘌呤猝滅探針，已知有所謂的QProbe(注冊商標(biāo))。這種鳥嘌呤猝滅探針與檢測對象序列雜交時，被熒光染料標(biāo)記的末端C接近上述檢測對象DNA的G，因此顯示上述熒光染料的發(fā)色減弱(熒光強度減少)的現(xiàn)象。使用這種探針時，利用信號的變動可以容易地確認雜交或解離。
作為上述熒光染料并無特別限定，例如可以舉出熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等，作為市售的熒光染料例如可以舉出BODIPY FL(商標(biāo)、モレキユラ—·プロ—ブ公司制)、FluorePrime(商品名、アマシヤムフアルマシア公司制)、Fluoredite(商品名、Milipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy5(アマシヤムフアルマシア公司制)、TAMRA(モレキユラ—·プロ—ブ公司制)等。3種探針中使用的熒光染料的組合例如只要能夠在不同條件下檢測即可，并無特別限定，例如可以舉出Pacific Blue(檢測波長450～480nm)、TAMRA(檢測波長585～700nm)和BODIPY FL(檢測波長515～555nm)的組合等。
以下舉出用于檢測多態(tài)性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7的探針序列的具體例子，本發(fā)明并非局限于此。下述探針(1)為NAT2*5用探針的一例，是用于檢測正義鏈的探針。下述探針(2)為NAT2*6用探針的一例，是用于檢測反義鏈的探針。下述探針(3)為NAT2*7用探針的一例，是用于檢測反義鏈的探針。
探針(1) (1-1)與序列號1中的、以第1056位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第13～19個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基為3’末端。
探針(2) 與序列號1中的、以第1302位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第18～27個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基為5’末端。
探針(3) 與序列號1中的、以第1583位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第16～21個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基為3’末端。
上述探針(1)中，與序列號1的第1063位堿基互補的堿基用r表示，上述r為A或G，上述探針(2)中，位于序列號1的第1312位的堿基用r表示，上述r為G或A，上述探針(3)中，位于序列號1的第1579位的堿基用r表示，上述r為G或A。
然后將上述探針(1)、探針(2)和探針(3)的具體例子示于下述表中。予以說明，下述表中“Tm(℃)”是下述表中的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(℃)，是利用MELTCAL軟件(http://www.meltcalc.com/)、將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0.2μM、鈉當(dāng)量(Na eq.)50mM而計算出的值。
表5
上述表的探針(1)包含與序列號1的第1063位為C的區(qū)域互補的序列，大寫的堿基表示與序列號1的第1063位堿基互補的堿基。予以說明，上述探針(1)中，上述大寫堿基可以置換成r、上述r可以為G和A的任一種。上述表的探針(2)包含與序列號1的第1312位為A的區(qū)域相同的序列，大寫的堿基表示序列號1的第1312位堿基。予以說明，上述探針(2)中，上述大寫堿基可以置換成r、上述r可以為G和A的任一種。上述表的探針(3)包含與序列號1的第1579位為A的區(qū)域相同的序列，大寫的堿基表示序列號1的第1579位堿基。予以說明，上述探針(3)中，大寫堿基可以置換成r、上述r可以為G和A的任一種。本發(fā)明探針的具體例子，還可以是如上所述的上述表所示的寡核苷酸的互補鏈。
上述探針為一個例子，本發(fā)明并非局限于此。在上述探針(1)中，優(yōu)選選自含有序列號90、含有序列號91、含有序列號118和含有序列號122的堿基序列的寡核苷酸所組成的組中的至少1個寡核苷酸作為NAT2*5用探針。另外，優(yōu)選并用所謂的野生型檢測用探針和突變型檢測用探針作為NAT2*5用探針。這里，野生型檢測用探針是指例如用于檢測序列號1的第1063位堿基為T的檢測對象序列(正義鏈)或其互補鏈(反義鏈)的探針，突變型檢測用探針是指例如用于檢測序列號1的第1063位堿基為C的檢測對象序列(正義鏈)或其互補鏈(反義鏈)的探針。本發(fā)明中，優(yōu)選例如并用包含序列號87～92和116的堿基序列的至少1個寡核苷酸(突變型檢測用探針)和包含序列號117～123的堿基序列的至少1個寡核苷酸(野生型檢測用探針)，更優(yōu)選并用包含序列號90或包含序列號91的堿序列的寡核苷酸(突變型檢測用探針)和包含序列號118或序列號122的堿基序列的寡核苷酸(野生型檢測用探針)。如此，當(dāng)并用野生型檢測用探針和突變型檢測用探針時，例如優(yōu)選將各探針的完全匹配的Tm值設(shè)定為錯開。
NAT2*6用探針優(yōu)選為包含序列號99的堿基序列的寡核苷酸。NAT2*7用探針優(yōu)選為包含序列號105或序列號107的堿基序列的寡核苷酸。
這些探針在使用2種以上時，如上所述，優(yōu)選用分別不同的熒光染料(用不同波長檢測的熒光染料)標(biāo)記。例如，當(dāng)使上述表所示探針為鳥嘌呤猝滅探針時，優(yōu)選NAT2*5用探針(探針(1))和NAT2*7用探針(探針(3))3’末端的胞嘧啶用上述熒光染料(例如B ODIPY EL、TAMRA等)標(biāo)記，優(yōu)選NAT2*6用探針(探針(2))5’末端的胞嘧啶用上述熒光染料(例如PacificBlue)標(biāo)記。另外，為了防止5’末端被熒光染料標(biāo)記的探針本身延伸，可以在其3’末端附加磷酸基。另外，如上所述使用野生型檢測用探針和突變型檢測用探針時，各個熒光染料可以相同也可以不同。
接著，列舉一個例子說明本發(fā)明的檢測方法，即，使用下述探針檢測NAT2基因的3個多態(tài)性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7。予以說明，本發(fā)明并非局限于此。
(探針) NAT2*5用探針 5’-tgccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號90)、 5’-gccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號91)、 5’-cctgccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號118)、或、 5’-ccgtcaAtgtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號122) NAT2*6用探針 5’-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3’(序列號99) NAT2*7用探針 5’-caaacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列號105)、或 5’-aacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列號107) 首先使用添加有上述3種標(biāo)記探針的反應(yīng)液，如上所述地進行PCR，在同一反應(yīng)液中同時擴增NAT2基因的3個區(qū)域。上述反應(yīng)液含有例如本發(fā)明NAT2基因擴增用引物對、DNA聚合酶、dNTP、含有成為模板的核酸的試樣以及上述3種探針。除此之外，還可以含有能夠用于核酸擴增的各種添加劑。
接著，進行所得擴增產(chǎn)物的解離以及使通過解離獲得的單鏈DNA與上述標(biāo)記探針進行雜交。這可以通過例如改變上述反應(yīng)液的溫度來進行。
上述解離工序的加熱溫度只要是能使上述擴增產(chǎn)物解離的溫度則無特別限定，例如為85～95℃。加熱時間也無特別限定，通常為1秒～10分鐘、優(yōu)選1秒～5分鐘。
解離的單鏈DNA和上述標(biāo)記探針的雜交例如可以在上述解離工序后，降低上述解離工序的加熱溫度來進行。溫度條件例如為40～50℃。
然后，改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物與上述標(biāo)記探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值。具體地說，例如加熱上述反應(yīng)液(上述單鏈DNA與上述標(biāo)記探針的雜交產(chǎn)物)，測定伴隨溫度上升的信號值變動。如上所述，當(dāng)使用末端的C堿基被標(biāo)記的探針(鳥嘌呤猝滅探針)時，在與單鏈雜交的狀態(tài)下，熒光減少(或者猝滅)，在解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光。因此，例如可以慢慢加熱熒光減少(或者猝滅)了的雜交產(chǎn)物，測定伴隨溫度上升的熒光強度增加。
測定熒光強度的變動時的溫度范圍并無特別限定，例如起始溫度為室溫～85℃、優(yōu)選為25～70℃，終止溫度例如為40～105℃。另外，溫度的上升速度并無特別限定，例如為0.1～20℃/秒、優(yōu)選為0.3～5℃/秒。
接著，解析上述信號的變動來確定Tm值。具體地說，從所得熒光強度求得各溫度下每單位時間的熒光強度變化量(-d熒光強度增加量/dt)，將顯示最低值的溫度作為Tm值。另外，也可以將每單位時間的熒光強度增加量(d熒光強度增加量/dt)最高的點作為Tm值。予以說明，不使用猝滅探針，而是使用單獨不顯示信號且通過雜交顯示信號的探針作為標(biāo)記探針時，相反地可以測定熒光強度的減少量。
本發(fā)明中，為了檢測3個多態(tài)性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7，可以在與3種探針的各標(biāo)記相應(yīng)的條件下確定各個Tm值。NAT2*5用探針BODIPY FL例如可以在檢測波長515～555nm下檢測，NAT2*6用探針Pacific Blue例如可以在檢測波長450～480nm下檢測、NAT2*7用探針TAMRA例如可以在檢測波長585～700nm下檢測。
然后，由這些Tm值確定各檢測對象位點的基因型。Tm解析中，可以獲得如下的結(jié)果完全互補的雜交體(匹配)的顯示解離的Tm值比有一個堿基不同的雜交體(不匹配)高。因此，通過對上述探針預(yù)先確定完全互補的雜交體的Tm值和有一個堿基不同的雜交體的Tm值，可以確定各檢測對象位點的基因型。例如，在將檢測對象位點的堿基假設(shè)為突變型(例如序列號1的第1063位堿基為C)，使用與含有其的檢測對象序列互補的探針時，所形成的雜交體的Tm值若與完全互補的雜交體的Tm值相同，則可確定上述擴增產(chǎn)物的多態(tài)性為突變型。另外，所形成的雜交體的Tm值若與有一個堿基不同的雜交體的Tm值相同(低于完全互補的雜交體的Tm值)，則可確定上述擴增產(chǎn)物的多態(tài)性為野生型(例如序列號1的第1063位堿基為T)。而且，當(dāng)檢測到兩種Tm值時，可以判斷為雜合子。如此，由與各標(biāo)記探針相應(yīng)的3個Tm值，可以判斷多態(tài)性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7的基因型。
另外，本發(fā)明中，如上所述，還可以取代提高含有上述探針的反應(yīng)液的溫度(加熱雜交產(chǎn)物)、測定伴隨溫度上升的信號變動的方法，例如可以進行雜交體形成時的信號變動的測定。即，可以在降低含有上述探針的反應(yīng)液的溫度形成雜交產(chǎn)物時，測定伴隨上述溫度降低的信號變動。
作為具體例，當(dāng)使用單獨顯示信號、且由于形成雜交體而不顯示信號的標(biāo)記探針(例如鳥嘌呤猝滅探針)時，在單鏈DNA和探針解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光，但由于溫度的降低而形成雜交體時，上述熒光減少(或者猝滅)。因此，例如可以慢慢降低上述反應(yīng)液的溫度，測定伴隨溫度降低的熒光強度的減少。另外，使用單獨不顯示信號、且由于形成雜交體而顯示信號的標(biāo)記探針時，在單鏈DNA和探針解離的狀態(tài)下不會發(fā)出熒光，但由于溫度的降低而形成雜交體時，則發(fā)出熒光。因此，例如可以慢慢降低上述反應(yīng)液的溫度，測定伴隨溫度降低的熒光強度的增加。
予以說明，當(dāng)對NAT2基因的3種多態(tài)性(多態(tài)性NAT2*5、NAT2*6或NAT2*7)中任1個或任2個多態(tài)性進行解析時，例如可以使用包含引物對(1)～(3)中與目標(biāo)區(qū)域相應(yīng)的任1種或任2種引物對的本發(fā)明NAT2基因擴增用引物對，進而使用與目標(biāo)檢測對象位點雜交的任1種或任2種探針。
接著，說明本發(fā)明的實施例。本發(fā)明并不受下述實施例的限定。
實施例1 使用肝素鋰采血管對4位待測者進行采血(樣品1～4)。將所得血液10μL與蒸餾水90μL混合，進而將該混合液10μL與蒸餾水90μL混合。將該混合液10μL添加至下述組成的PCR反應(yīng)液40μL中，使用熱循環(huán)儀進行PCR。PCR的條件為在95℃下處理60秒鐘后，以95℃下1秒鐘和60℃下10秒鐘為1個循環(huán)重復(fù)進行50個循環(huán)，進而在95℃下處理1秒鐘，在40℃下處理60秒鐘。接著，使溫度的上升速度為1℃/3秒鐘，將上述PCR反應(yīng)液從40℃加熱至95℃，測定實時的熒光強度變化。測定波長為450～480nm(熒光染料Pacific Blue的檢測)、515～555nm(熒光染料BODIPY FL的檢測)和585～700nm(熒光染料TAMRA的檢測)。予以說明，50個循環(huán)的PCR所需要的時間約為1個小時。
表6
*商品名Gene Taq FPニツポンジ—ン公司制 (探針) NAT2*5用探針1 5’-tgccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號90) NAT2*5用探針2 5’-tgccgtcaGtggtcac-P-3’(序列號90) NAT2*6用探針 5’-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3’(序列號99) NAT2*7用探針 5’-caaacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列號105) (引物對) NAT2*5 F1引物 5’-cagttaacaaatacagcactggcatgg-3’(序列號7) NAT2*5 R1引物 5’-acatctgggaggagcttccag-3’(序列號18) NAT2*6 F2引物 5’-ctcatctcctgccaaagaagaaac-3’(序列號33) NAT2*6 R2引物 5’-gatgtggttataaatgaagatgttggagac-3’(序列號48) NAT2*7 F3引物 5’-aaatatatttaagatttccttggggagaaat-3’(序列號60) NAT2*7 R3引物 5’-tgagttgggtgatacatacacaaggg-3’(序列號81) 與NAT2*5用探針匹配的雜交體的Tm值為66.0、錯誤匹配的雜交體的Tm值為58.0℃，與NAT2*6用探針匹配的雜交體的Tm值為61.0℃、錯誤匹配的雜交體的Tm值為53.0℃，與NAT2*7用探針匹配的雜交體的Tm值為63.0℃、錯誤匹配的雜交體的Tm值為56.0℃。
將樣品1～4的結(jié)果示于圖1。該圖為表示伴隨溫度上升的熒光強度變化的Tm解析的圖表，縱軸的微分值表示“-d熒光強度增加量/dt”、橫軸表示溫度(以下同樣)。如該圖所示，由信號的峰確定各樣品的NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的基因型。為了支持這些實施例的結(jié)果，利用RFLP法和測序法對4位待測者確認NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的多態(tài)性，結(jié)果獲得與實施例相同的結(jié)果。如此，通過使用本發(fā)明的引物對，可以使用不實施預(yù)處理的全血試樣，在同一反應(yīng)液中同時擴增NAT2基因的3個區(qū)域，且可以使用上述同一反應(yīng)液解析3種多態(tài)性。
實施例2 使用EDTA采血管對3位待測者進行采血(樣品1～3)。將所得血液10μL與下述稀釋液A 70μL混合，進而將該混合液10μL與下述稀釋液B 70μL混合。在95℃下將所得混合液10μL加熱處理5分鐘后，添加至下述組成的PCR反應(yīng)液46μL中，使用熱循環(huán)儀進行PCR。PCR的條件為在95℃下處理60秒鐘后，以95℃下1秒鐘和65℃下15秒鐘為1個循環(huán)，重復(fù)進行50個循環(huán)，進而在95℃下處理1秒鐘，在40℃下處理60秒鐘。接著，使溫度的上升速度為1℃/3秒鐘，將上述PCR反應(yīng)液從40℃加熱至75℃，測定實時的熒光強度變化。測定波長為450～480nm(熒光染料Pacific Blue的檢測)、515～555nm(熒光染料BODIPY FL的檢測)和585～700nm(熒光染料TAMRA的檢測)。
(稀釋液A) 10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05％NaN3、0.3％SDS (稀釋液B) 10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05％NaN3 表7
*商品名Gene Taq FPニツポンジ—ン公司制 (探針) NAT2*5用探針1 5’-gccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號91) NAT2*5用探針2 5’-ccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列號118) NAT2*6用探針 5’-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3’(序列號99) NAT2*7用探針 5’-aacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列號107) (引物對) NAT2*5 F1引物 5’-tccagttaacaaatacagcactggcatgg-3’(序列號7) NAT2*5 R1引物 5’-ccacatctgggaggagcttccag-3’(序列號18) NAT2*6 F2引物 5’-agaatttcttaattctcatctcctgccaaagaagaaac-3’(序列號33) NAT2*6 R2引物 5’-gaacaaaatgatgtggttataaatgaagatgttggagac-3’(序列號48) NAT2*7 F3引物 5’-agtgctgaaaaatatatttaagatttccttggggagaaat-3’(序列號60) NAT2*7 R3引物 5’-tgataattagtgagttgggtgatacatacacaaggg-3’(序列號81) 與NAT2*5用探針匹配的雜交體的Tm值為63℃、錯誤匹配的雜交體的Tm值為56℃，與NAT2*6用探針匹配的雜交體的Tm值為58℃、錯誤匹配的雜交體的Tm值為50.5℃，與NAT2*7用探針匹配的雜交體的Tm值為58℃、錯誤匹配的雜交體的Tm值為49℃。
將樣品1～3的結(jié)果示于圖2。該圖為表示伴隨溫度上升的熒光強度變化的Tm解析的圖表，縱軸的微分值表示“-d熒光強度增加量/dt”、橫軸表示溫度。如該圖所示，由信號的峰確定各樣品的NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的基因型。為了支持這些實施例的結(jié)果，利用RFLP法和測序法對3位待測者確認NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的多態(tài)性，結(jié)果獲得與實施例相同的結(jié)果。如此，通過使用本發(fā)明的引物對，可以使用不實施預(yù)處理的全血試樣，在同一反應(yīng)液中同時擴增NAT2基因的3個區(qū)域，且使用上述同一反應(yīng)液可以解析3種多態(tài)性。
產(chǎn)業(yè)實用性 如上所述，利用本發(fā)明的引物對時，可以特異且高效地擴增NAT2基因的含有特定多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6或NAT2*7)發(fā)生位點的區(qū)域。因此，與上述現(xiàn)有方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于如上所述含有多態(tài)性檢測對象位點的區(qū)域被特異地擴增，因此通過使用與含有上述檢測對象位點的檢測對象序列互補的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進行Tm解析、對上述多態(tài)性進行分型。另外，由于可以用1個反應(yīng)液擴增或分型，因此操作的自動化也成為可能。而且，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時，例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略預(yù)處理，因此可以更為迅速且簡單地進行擴增反應(yīng)。另外，使用本發(fā)明的引物對時，由于可以以較以往更為優(yōu)異的擴增效率進行擴增反應(yīng)，因此還能夠縮短擴增反應(yīng)。因而，通過本發(fā)明的引物對、含有其的試劑以及使用它們的擴增產(chǎn)物的制造方法，可以迅速且簡單地解析NAT2基因的多態(tài)性，因而在醫(yī)療領(lǐng)域中極為有效。
序列表
<110>愛科來株式會社(ARKRAY，Inc.)
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<210>107
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探針
<400>107
<210>108
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>108
<210>109
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>109
<210>110
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>正向引物
<400>110
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>正向引物
<400>111
<210>112
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>正向引物
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<210>113
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>113
<210>114
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>114
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<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>正向引物
<400>115
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<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探針
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探針
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<213>人工序列
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<223>探針
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<400>119
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<223>探針
<400>120
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<223>探針
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<210>123
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>12權(quán)利要求
1.一種NAT2基因擴增用引物對，其特征在于，其為用于利用基因擴增法擴增NAT2基因的引物對，含有選自由下述引物對(1)～(3)所組成的組中的至少一對引物對
引物對(1)
含有包含下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F1)與序列號1的堿基序列中的、以第1038位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向5’方向至第20～32個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥嘌呤堿基(G)為3’末端，
(R1)與序列號1的堿基序列中的、以第1096位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第17～24個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1096位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端；
引物對(2)
含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端，
(R2)下述寡核苷酸中的至少一個
與序列號1的堿基序列中的、以第1355位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基朝向3’方向至第25～40個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1355位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)為3’末端，
以及
與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端；
引物對(3)
含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F3)下述寡核苷酸中的至少一個
與序列號1的堿基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基朝向5’方向至第21～40個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)為3’末端，
以及
與序列號1的堿基序列中的、以第1278位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向5’方向至第20～38個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)為3’末端，
(R3)與序列號1的堿基序列中的、以第1614位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基朝向3’方向至第21～36個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1614位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)為3’末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NAT2基因擴增用引物對，其中，所述引物對(1)～(3)分別為下述引物對(1’)～(3’)
引物對(1’)
含有包含下述(F1’)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1’)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F1’)包含序列號5的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號7的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸，
(R1’)包含序列號16的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號18的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸；
引物對(2’)
含有包含下述(F2’)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2’)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F2’)包含序列號33的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號109的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸，
(R2’)包含序列號39的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號48的堿基序列的寡核苷酸的至少1種寡核苷酸；
引物對(3’)
含有包含下述(F3’)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3’)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對
(F3’)包含序列號60的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號113的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸，
(R3’)包含序列號71的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號81的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NAT2基因擴增用引物對，其中，NAT2基因擴增用引物對為用于擴增生物試樣中的NAT2基因的引物對。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NAT2基因擴增用引物對，其中，所述生物試樣為全血。
5.一種NAT2基因擴增用試劑，其特征在于，其為用于利用基因擴增法擴增NAT2基因的試劑，含有權(quán)利要求1所述的NAT2基因擴增用引物對。
6.權(quán)利要求5所述的NAT2基因擴增用試劑，其還含有能夠與NAT2基因的檢測對象位點雜交的探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的NAT2基因擴增用試劑，其中，所述探針為選自下述(P1’)～(P3’)所示的寡核苷酸所組成的組中的至少一個探針
(P1’)選自由包含序列號90的堿基序列的寡核苷酸、包含序列號91的堿基序列的寡核苷酸、包含序列號118的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號122的堿基序列的寡核苷酸所組成的組中的至少1種寡核苷酸，
(P2’)包含序列號99的堿基序列的寡核苷酸，
(P3’)包含序列號105的堿基序列的寡核苷酸以及包含序列號107的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的NAT2基因擴增用試劑，其中，所述探針為熒光標(biāo)記探針。
9.一種擴增產(chǎn)物的制造方法，其特征在于，其為利用基因擴增法制造NAT2基因的擴增產(chǎn)物的方法，包括下述(I)工序
(I)以試樣中的核酸作為模板，使用權(quán)利要求1所述的NAT2基因擴增用引物對，在反應(yīng)液中擴增上述NAT2基因的工序。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其中，在所述(I)工序中，所述反應(yīng)液中還添加能夠與NAT2基因的檢測對象位點雜交的探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其中，所述探針為選自下述(P1’)～(P3’)所示的寡核苷酸所組成的組中的至少1個探針
(P1’)選自由包含序列號90的堿基序列的寡核苷酸、包含序列號91的堿基序列的寡核苷酸、包含序列號118的堿基序列的寡核苷酸和包含序列號122的堿基序列的寡核苷酸所組成的組中的至少1種寡核苷酸，
(P2’)包含序列號99的堿基序列的寡核苷酸，
(P3’)包含序列號105的堿基序列的寡核苷酸以及包含序列號107的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其中，所述探針為熒光標(biāo)記探針。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其還包括下述(II)工序
(II)對于所述反應(yīng)液測定所述熒光標(biāo)記探針的熒光標(biāo)記的熒光強度的工序。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其中，所述試樣為生物試樣。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其中，所述生物試樣為全血。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，其中，所述反應(yīng)液中全血試樣的添加比例為0.1～0.5體積％。
17.一種多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析NAT2基因的檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包括下述(i)～(iv)工序
(i)利用權(quán)利要求9所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，在反應(yīng)液中擴增NAT2基因中含有檢測對象位點的區(qū)域的工序，
(ii)準(zhǔn)備含有上述(i)工序的擴增產(chǎn)物和能夠與所述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的工序，
(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度，測定所述擴增產(chǎn)物與所述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的工序，
(iv)由伴隨溫度變化的所述信號值的變動，確定所述檢測對象位點的多態(tài)性的工序。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多態(tài)性解析方法，其中，在所述(i)工序中，在擴增反應(yīng)之前，向所述反應(yīng)液中添加能夠與所述檢測對象位點雜交的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供一種引物對，其為用于利用基因擴增法擴增NAT2基因中的含有檢測目標(biāo)位點的目標(biāo)區(qū)域的引物對，其能夠特異地擴增上述區(qū)域。使用分別包含含有序列號7、序列號33和序列號60的堿基序列的正向引物和包含序列號18、序列號48和序列號81的堿基序列的反向引物的3對引物對。通過使用該引物對，可以在同一反應(yīng)液中同時擴增NAT2基因的分別含有3種多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)發(fā)生位點的3個區(qū)域。
文檔編號C12N15/00GK101490255SQ200780027648
公開日2009年7月22日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者平井光春, 間島智史 申請人:愛科來株式會社