專利名稱：作為用于研發(fā)分枝桿菌特異性抑制劑的工具的肽脫甲?；傅闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)作為對(duì)抗分枝桿菌的潛在藥物靶物使用的分枝桿 菌肽脫甲?；钢械奶禺愋詤^(qū)域的鑒定。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與得自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的肽脫甲?；富虻?特異性區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)。在分枝桿菌的培養(yǎng)物中使用成，其中發(fā)現(xiàn)，所述的區(qū)域負(fù)責(zé)保持酶的穩(wěn)定性以及維持酶的功能， 從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明還確定了肽脫甲?；冈诜种U菌中的 必要性，并要求該酶在所述的微生物中作為藥物靶物的專利保護(hù)。
背景技術(shù)：
在過去幾十年，肺結(jié)核作為導(dǎo)致世界上相當(dāng)高的人死亡率的原因 而出現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌菌林出現(xiàn)的頻率正穩(wěn)定地升高，其中所 述的分枝桿菌已經(jīng)發(fā)展出了對(duì)抗一種或多種通常在治療中使用的抗分 枝桿菌試劑的抗性。因此，為了克服這種情況，需要有更好的藥物干 涉策略，而這種策略可以通過鑒定新的藥物靶物而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)這種推 斷，酶類的肽脫甲?；概c新生多肽的脫甲酰過程有關(guān)，所述的脫甲 酰過程通常似乎為分枝桿菌蛋白質(zhì)合成的必需步驟。因此，抑制這種 脫甲?；傅娜魏紊?非生物因子通常都可以阻止分枝桿菌中蛋白 質(zhì)的合成，并因此特異性地抑制此類細(xì)菌的生長(zhǎng)?，F(xiàn)有技術(shù)的說明病原微生物的藥物抗性已經(jīng)作為對(duì)世界公共健康的主要威脅而 出現(xiàn)。雖然已經(jīng)使用了大量的抗生素，但是這些抗生素所抑制的靶物 的種類是及其有限的。延期及過量使用這些抗生素的結(jié)果是使病原微生物產(chǎn)生了對(duì)多種藥物的抗性，因此，為了使抗微生物劑多樣化，迫 切需要基于合理的方法來構(gòu)建新的干涉策略(其會(huì)使藥物設(shè)計(jì)得到改 善)。一直以來，已經(jīng)證明蛋白質(zhì)合成是抗菌劑的靶物的豐富來源。與真核生物截然不同的是，原核生物中蛋白質(zhì)的合成是由N-甲酰基-甲 硫氨酰-tRNA(其使得在所有新生多肽的氨基末端甲?；?引發(fā)的。但 是，在真細(xì)菌的成熟蛋白質(zhì)中，沒有保留有N-曱酰基甲硫氨酸，并且 已經(jīng)報(bào)道N-甲酰基曱疏氨酸已經(jīng)被肽脫甲?；该摷柞；?。這種曱酰 化/脫甲?；录坪跏钦婕?xì)菌蛋白質(zhì)合成中的必需步驟，因此，已經(jīng) 長(zhǎng)期預(yù)想到了該酶的重要性?？衫玫幕蚪M序列的數(shù)據(jù)顯示出在整個(gè)真細(xì)菌系中編碼肽脫 甲?；?def)的推定基因的存在情況，其中所述的真細(xì)菌系包括以下 病原體，例如結(jié)核分枝桿菌(NCBI通用鑒定號(hào)GI: 38490165; SEQ ID NO: 8);金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (NCBI通用鑒定 號(hào)GI: 57651784);肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) (NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 16272565 SEQ ID NO: 2);流感嗜血桿菌(Haeniophi 1 lus influenzae) (NCBI通用鑒定號(hào)GI: 16272565; SEQ ID NO: 3);鉤 端螺旋體(Leptospira interrogans )(NCBI通用鑒定號(hào)GI: 14626937; SEQ ID NO: 4);糞腸球菌(Enterococcus feacelis) (NCBI通用鑒 定號(hào)GI: 29377524; SEQ ID NO: 5);幽門螺桿菌(Helicobacter pyroli) (NCBI通用鑒定號(hào)GI: 49089809; SEQ ID NO: 6);以及枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) (NCBI通用鑒定號(hào)GI: 16078635; SEQ ID NO: 7)等。早期研究已經(jīng)顯示出抑制多種微生物中的肽脫甲酰 基酶活性的多種化合物或制劑、以及它們的衍生物的鑒定和用途(專 利No. WO0138561、 WO2005026133、 W02005037272、 WO2005092872等)。Tomioka, H 的文章 (Prospects for development of new antituberculous drugs. Kekkaku. Aug; 77 [8] 573-84， 2002 )總 體上描述了諸如利福霉素(利福布汀、利福噴汀和利福拉齊)、氟喹 諾酮(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、加替沙星、西他沙星、莫西沙星等)和新的大環(huán)內(nèi)酯(克拉霉素、阿奇霉素和羅紅 霉素)之類的現(xiàn)有藥物的某些新衍生物的藥理學(xué)情況。這篇綜述還討 論了研發(fā)新的抗分枝桿菌試劑(特別是抗結(jié)合分枝桿菌試劑)的重要性，其中所述的試劑包括惡唑啉二酮(PNU-100480)、 5，-硝基咪唑 (CGI 17341)、 2-吡啶酮(ABT-255)、新的氯法齊明、硝基咪唑并吡喃 (PA-824)、新的酮內(nèi)酯(ABT-773，泰利霉素)和防御素(人嗜中性粒 細(xì)胞肽-I)。此外，許多作者描述了設(shè)計(jì)對(duì)作為新的藥物靶物的編碼 某些代謝酶或毒性因子的分枝桿菌基因具有特異性的抑制劑(當(dāng)然， 一種策略可以為反義技術(shù))的可能性。事實(shí)上，使用反義寡核苷酸來 關(guān)閉分枝桿菌基因的表達(dá)是非常熟悉的技術(shù)(參見Harth et al.， Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 99， 15614-15619， 2002)，并且 不是在本文中第一次提到。本發(fā)明強(qiáng)調(diào)了特異性地存在于分枝桿菌肽脫曱?；钢械牟迦?序列(其由氨基酸74-85構(gòu)成(請(qǐng)參見圖l和圖2),該序列負(fù)責(zé)保持 酶的功能(參見圖5，該圖中示出上述區(qū)域的缺失突變體沒有顯示出任 何的酶活性))的重要性。此外，使用這種針對(duì)插入?yún)^(qū)域的反義寡核苷 酸(與相應(yīng)的核酸序列互補(bǔ))減少了肽脫曱?；傅谋磉_(dá)(使用抗mPDF抗體，通過蛋白質(zhì)印跡方法得到的圖8所示)，其反過來導(dǎo)致對(duì)培養(yǎng) 中的分枝桿菌生長(zhǎng)的抑制(參見圖6A和圖7的左側(cè)板)。由此，上述 結(jié)果描述了分枝桿菌酶的插入?yún)^(qū)域的新穎性，根據(jù)基于所述的插入?yún)^(qū) 域來設(shè)計(jì)抑制劑的可能性，我們進(jìn)行了發(fā)明研究(已經(jīng)使用反義分子來闡明所迷區(qū)域在幫助分枝桿菌生長(zhǎng)中的重要性)。在Cynamon等人的另一篇文獻(xiàn)(Cynamon， et al. 2004. Journalof Antimicrobial Chemotherapy. 53: 403—405 )中，描述了放線寧 (一種由放線菌種類中分離得到的抗生素)以及BB3497 (—種放線寧 的羥氨酸衍生物)顯示出通過與PDF酶的活性位點(diǎn)結(jié)合來抑制不同微 生物的.PDF酶活性。所提及的文獻(xiàn)描述了 BB3497可能通過抑制PDF 酶活性來抑制培養(yǎng)中的分枝桿菌的生長(zhǎng)的效果。在Cynamon， et al， 2004的文獻(xiàn)中示出，已知的肽脫甲?；敢种苿┮种屏朔种U菌的生長(zhǎng)。另外，我們通過對(duì)mPDF進(jìn)行表征來開始了我們的研究，并確定雖 然所述的mPDF與其他細(xì)菌的同源物具有共性，但是它又明顯不同于其 他細(xì)菌的同源物。對(duì)結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲酰基酶的序列進(jìn)行分析表 明，特征性的插入物(殘基74-85 )存在于基序I和II之間(參見圖 1)。本申請(qǐng)中，由缺失突變體所得的結(jié)果表明，所述的區(qū)域?qū)γ傅墓?能有貢獻(xiàn)(參見圖5)。在目前所表征的PDF中，我們的分析表明， 插入?yún)^(qū)域的組成性氨基酸在分枝桿菌種類中具有代表性(參見圖2)。 此外，使用定向針對(duì)所述的插入?yún)^(qū)域的經(jīng)5'-硫代磷酸修飾的反義寡 脫氧核糖核苷酸，我們展示出了培養(yǎng)中的分枝桿菌的生長(zhǎng)受到抑制， 由此確定了所述區(qū)域的重要性(參見圖6A)。此外，定向針對(duì)分枝桿菌所特有的插入序列的反義寡核苷酸對(duì)得自諸如大腸桿菌 (Escherchia coli )之類的其他細(xì)菌的PDF酶的功能沒有效果(如圖 7右所示)。因此，我們的結(jié)果清楚地確定了定向針對(duì)所述的插入?yún)^(qū) 域的反義寡核苷酸特異性地抑制了分枝桿菌肽脫曱?；傅谋磉_(dá)(參 見圖8)，并由此抑制了分枝桿菌的生長(zhǎng)(參見圖6A和圖7左)。因 此，我們聲稱，我們已經(jīng)鑒定出分枝桿菌的肽脫甲?；钢袑?duì)分枝桿 菌的肽脫甲?；傅墓δ苄跃哂兄匾缘膮^(qū)域(氨基酸殘基74-85 )。與所述的分枝桿菌酶的所述區(qū)域發(fā)生相互作用并影響該酶的表達(dá)或產(chǎn) 生的任何分子(生物或非生物的)都可以抑制分枝桿菌的生長(zhǎng)。(我 們通過使用定向針對(duì)所述區(qū)域的反義寡核苷酸來確定上述結(jié)論的。因 此，這是驗(yàn)證我們的結(jié)論/發(fā)明的方法。)因此，我們第一次在分枝桿 菌中鑒定的以及確定其重要性(參見圖5至圖8)的所述區(qū)域(氨基 酸殘基74-85 )肯定為用于研發(fā)抗分枝桿菌的藥物靶物。Huntington, K. M. 2000. Biochemistry. Apr 18; 39 [15〗 4543-51報(bào)道了關(guān)于多種病原細(xì)菌(包括結(jié)核分枝桿菌)的整個(gè)基因 組的近期信息，在一定程度上提供了促進(jìn)編碼新的藥物靶物的基因的 鑒定進(jìn)程的良好平臺(tái)。編碼與病原微生物代謝和存活有關(guān)的蛋白質(zhì)的 必需基因通常為優(yōu)選的疫苗候選物。類似地，肽脫甲酰基酶是必需酶 中的一員，其涉及原核生物中N-甲?；嚯牡姆g后修飾(Mazeletal.， 1994， Margolis et al.， 2000 and 2001 )。在多種真細(xì)菌中， 所迷的脫甲?；副槐碚鳛楹\或含鐵的金屬蛋白酶。其在細(xì)菌細(xì)胞 中的基本特征使得其成為用于抗細(xì)菌藥物設(shè)計(jì)的引人注意的靶物。上 述所提及的文獻(xiàn)的作者指出，它們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列肽硫醇，其通 過與所述的活性位點(diǎn)相結(jié)合來起到經(jīng)純化的重組肽脫甲?；?得自 大腸桿菌和枯草桿菌(Bacillus subtil is))的潛在且可逆的抑制劑的 作用。PDF抑制劑誘導(dǎo)了細(xì)菌細(xì)胞的裂解，并被驗(yàn)證對(duì)枯草桿菌、表 皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis )、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和大腸桿菌具有殺菌作用。但是，本發(fā)明特異性地專注于 結(jié)核分枝桿菌。尚無人提及所述的這些化合物對(duì)經(jīng)純化的分枝桿菌酶 的活性、以及對(duì)分枝桿菌的生長(zhǎng)的作用。在其他方面，我們的工作特 異性地針對(duì)分枝桿菌PDF,并第一次要求分枝桿菌酶的特異性插入序
列用于研發(fā)新的抗分枝桿菌藥物的專利保護(hù)。
近來，我們已經(jīng)經(jīng)PCR擴(kuò)增出得自結(jié)核分枝桿菌的594個(gè)堿基對(duì) def基因，在將其克隆到pET28c載體中后，使其在大腸桿菌中作為組 氨酸標(biāo)記的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)(Saxena and Chakraborti， Biochem Biophys Res Commun (332): 418-425， (2005))。雖然原子吸收光 鐠表明，mPDF為含F(xiàn)e"的酶，但是其活性在30"C下非常穩(wěn)定，并且半 衰期為 4小時(shí)。此外，其通過對(duì)氧化劑(例如11202 )表現(xiàn)出抗性而保 持其與眾不同(Saxena and Chakraborti， Biochem Biophys Res Commun 332: 418-425， 2005; Saxena and Chakraborti, J, Bacteriol 187: 8216-8220 2005 )。由于環(huán)境中的氧而導(dǎo)致Fe"至Fe"的轉(zhuǎn)化會(huì) 使得大腸桿菌中的這種金屬蛋白酶失活(Rajagopalan， et. al.， J. Biol. Chem 36: 13910-13918， 1997 )，所以考慮到所迷的事實(shí)，以 下過程似乎為重要的觀察結(jié)果，所迷的過程為為了作為成功的病原 體而存活于宿主內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌必須善于處理氧化應(yīng)激情況。
上述情況使得我們對(duì)分枝桿菌的肽脫甲酰基酶進(jìn)行表征。與其他 研究(專利No. WO02074903 )截然不同的是，本發(fā)明涉及與分枝桿菌 肽脫甲?；富?de/)的特異性核苷酸區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸的用途，其中所迷的反義寡核苷酸抑制了酶的活性以及培養(yǎng)中的所述微 生物的生長(zhǎng)，由此確定了所述區(qū)域作為藥物靶物的必要性和潛力。
發(fā)明目的
本發(fā)明的主要目的是提供由序列ID No. 14所表示的分枝桿菌肽 脫甲?；傅腫^5/]基因序列。
由此，本發(fā)明的另一目的是提供分枝桿菌^5尸基因(其用作對(duì)抗
分枝桿菌的潛在藥物靶物)的氨基酸序列74至85。
本發(fā)明的另一目的是提供一種對(duì)抗分枝桿菌肽脫甲酰基酶的反 義寡核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于抑制分枝桿菌的活性和生長(zhǎng) 的寡核普酸。
本發(fā)明的另 一 目的是提供一種對(duì)抗分枝桿菌肽脫曱?；傅慕?jīng) 修飾的反義寡核苷酸。
本發(fā)明的另 一 目的是提供一種用于制備所述的反義寡核苷酸的 方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療結(jié)核的藥物組合物，其包 含寡核普酸、以及可任選的可藥用的載體、添加劑或稀釋劑。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明提供了與由序列ID No. 14表示的分枝桿菌肽脫甲 ?；竅^/]基因序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸，其中所述的基因序列對(duì)應(yīng) 于由XTXRRRGVVINP表示的12個(gè)氨基酸，其中X為20個(gè)已知氨基酸中 的任何一個(gè)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及反義寡核普酸在分枝桿菌培養(yǎng)中通過 與所述的區(qū)域進(jìn)行雜交來抑制肽脫甲?；傅纳?、并由此影響分枝 桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)中的用途。發(fā)現(xiàn)，得自結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲?；?內(nèi)的所述區(qū)域(氨基酸序列74-85 )涉及保持酶的穩(wěn)定性，以及維持 分枝桿菌酶的功能，由此突出了其重要性。使用所述的寡核苷酸進(jìn)行 處理來抑制分枝桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)一步確定了肽脫甲?；冈诜种U菌中的必要性，并因此要求其在所述的微生物中作為藥物靶物的專利
保護(hù)，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含12個(gè)氨基酸的分枝桿菌肽脫曱?；?[&/1的序列，該序列由XTXRRRGVVINP表示，其中X-20個(gè)已知氨基酸 中的任何一個(gè)，并且所述的序列在結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、牛分枝桿菌(M. bovis)、鳥分枝桿菌(M. avium)以 及麻瘋分枝桿菌(M. leprae)中具有90至95%的相似性。分枝桿菌 的de/基因的所述氨基酸序列是對(duì)抗分枝桿菌的潛在的藥物靶物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的分枝桿菌肽脫甲?；竅^/1 基因序列由序列IDNo. 14表示。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述的序列可用于對(duì)抗分枝桿菌的 潛在藥物乾物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述的序列包含由XTXRRRGVVINP 表示的12個(gè)氨基酸，其中X-20個(gè)已知氨基酸中的任何一個(gè)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述的氨基酸序列在結(jié)核分枝桿 菌、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌和麻瘋分枝桿菌中具有 90至95°/。的相似性。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為與由序列ID No. 14表示的基因序列互 補(bǔ)的反義寡核苷酸。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸特征在于是單(50 硫代磷酸修飾或全硫代磷酸修飾的寡脫氧核糖核苷酸。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸通過與分枝桿菌肽 脫甲?；?def)基因的所述的短區(qū)域雜交來抑制肽脫甲酰基酶的生 成。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸為對(duì)抗分枝桿菌的 潛在藥物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中涉及制備反義寡核苷酸的方法，該方 法包括由結(jié)核分枝桿菌分離多核苷酸序列的步驟，其中所述的多核 苷酸包含編碼具有肽脫甲酰基酶活性的多肽(197個(gè)氨基酸)的核酸 序列(594bp)，其中所述的多肽存在于諸如結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌和麻瘋分枝桿菌之類的不同種類的分
枝桿菌中，并且存在于所述這些分枝桿菌中的多肽分別由SEQ ID NO: 8、 9、 10、 11、 12表示，并且這些序列之間具有至少90至95%的序列 相似性；對(duì)由步驟(a)中分離得到的由多核苷酸序列IDNo. 14所示的 分枝桿菌肽脫甲?；钢械膮^(qū)域進(jìn)行鑒定，其中所迷的區(qū)域由氨基酸 序列74至85表示，并且所述的區(qū)域涉及保持酶的穩(wěn)定性和功能性， 而且所述的區(qū)域在所有種類的分枝桿菌中都是保守的；針對(duì)肽脫甲酰 基酶的保守區(qū)域制備反義寡核苷酸或?qū)ζ溥M(jìn)行可允許的修飾；使用反 義寡核苷酸來抑制酶的活性以及分枝桿菌的生長(zhǎng)。在本發(fā)明的另一實(shí) 施方案中，涉及所述的多核苷酸序列作為對(duì)抗分枝桿菌的潛在藥物靶 物的用途。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，涉及分枝桿菌def基因的氨基酸序 列作為對(duì)抗分枝桿菌的潛在藥物靶物的用途。
在本發(fā)明的另 一實(shí)施方案中，涉及抑制分枝桿菌的活性以及生長(zhǎng) 的寡核苷酸的用途。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一種藥物組合物，該組合物 包含寡核苷酸、以及可任選的可藥用的載體、添加劑或稀釋劑，所述 的組合物可用于治療結(jié)核。


對(duì)結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲?；高M(jìn)行的序列分析表明，在基序I 和II之間存在特征性的插入序列(殘基74-85 )。對(duì)所有真細(xì)菌的PDF 的氨基酸序列的分析表明，存在三個(gè)(I : GXGXAAXQ, II: EGCLS和 III: QHEXXH，其中X為任何的疏水性殘基)高度保守的基序。
圖2:
不同種類分枝桿菌的PDF序列的比對(duì)。當(dāng)對(duì)不同種類的分枝桿菌 進(jìn)行比較時(shí)，結(jié)核分枝桿菌肽脫甲酰基酶的插入?yún)^(qū)域表現(xiàn)出~84%的一 致性。圖3:
分枝桿菌肽脫甲?；富蛟诒磉_(dá)栽體中進(jìn)行克隆的示意性代表圖。
圖4:
在大腸桿菌中表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲?；傅募兓?。左圖 泳道l，分子量標(biāo)記物；泳道2，使用pET-PDF轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的粗提物； 泳道3:在IPTG誘導(dǎo)后，使用pET-PDF轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞粗提物；泳道4: 低速下的上清液部分；泳道5:在低速離心后得到的沉淀部分；泳道6: 尿素溶解的上清液部分；泳道7:在低速離心后的尿素溶解的沉淀部 分；泳道8: Ni-NTA樹脂純化的蛋白質(zhì)。右圖泳道l:使用pET-PDF 轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞粗提物；泳道2:在IPTG誘導(dǎo)后，使用pET-PDF轉(zhuǎn)化后 的細(xì)胞粗提物；泳道3: Ni-NTA樹脂純化的蛋白質(zhì)。箭頭表示純化的 mPDF的位置。
圖5:在大腸桿菌中表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲?；傅募兓?。 當(dāng)將酶活性作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，整個(gè)插入?yún)^(qū)域(AIR 突變體跨越殘基74-85 )的缺失完全喪失了酶的活性(參見圖5 )。由 此，所得的結(jié)果表明了插入?yún)^(qū)域?qū)Y(jié)核分枝桿菌肽脫甲?；傅拿富?性的重要性。
圖6a:
分枝桿菌肽脫甲?；傅谋Ｊ夭迦?yún)^(qū)域的反義寡核苷酸對(duì)生長(zhǎng)的 影響。與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物相比，我們所得的結(jié)果顯示，在PS-0DN1 存在下生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)降低5倍(參見圖6A)。
圖6B:
對(duì)使用PS-0DNI (綴合了 3，熒光素)處理的細(xì)胞進(jìn)行共焦顯微鏡
研究。 圖7:
對(duì)分枝桿菌肽脫甲?；傅谋Ｊ夭迦?yún)^(qū)域的反義寡核苷酸做出響 應(yīng)的不同細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。 圖8:對(duì)反義寡核苷酸處理做出響應(yīng)的肽脫甲?；傅鞍踪|(zhì)的表達(dá)情況。
發(fā)明詳述
本發(fā)明針對(duì)得自會(huì)導(dǎo)致可怕的結(jié)核疾病的病原細(xì)菌(結(jié)核分枝桿 菌)的肽脫甲?；?。本發(fā)明涉及與肽脫甲酰基酶(得自結(jié)核分枝桿 菌)的特異性區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)。在肽脫甲酰基酶(得 自結(jié)核分枝桿菌)中的所述區(qū)域涉及保持酶的穩(wěn)定性以及維持分枝桿 菌的酶的功能性。在分枝桿菌培養(yǎng)物中使用反義寡核苷酸可通過與所 述的區(qū)域進(jìn)行雜交來抑制肽脫曱?；傅纳桑⒂纱擞绊懛种U菌 細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在本公開的內(nèi)容中，將使用多個(gè)術(shù)語(yǔ)。本文中，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸 序列"、"核酸序列"、"核酸片段"、"經(jīng)分離的多核苷酸序列"、 "多肽"以及"多肽序列"可交換使用。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋了核苷酸/氨基
酸序列等。多核苷酸可以為RNA或DM的聚合物，其可以為單鏈或雙 鏈的。類似地，多肽為20種不同的氨基酸以不同方式排列、從而翻譯 形成功能性蛋白質(zhì)的聚合物。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由基因 組DNA或合成DM序列構(gòu)成。如本文所用，"基因"是指表達(dá)特異性 蛋白質(zhì)的核酸片段。"蛋白質(zhì)"或"多肽"為以特定順序排列的氨基 酸鏈，由編碼所述多肽的多核苷酸中的編碼序列決定。各種蛋白質(zhì)或 多肽具有獨(dú)特的功能。
"成熟蛋白質(zhì)"或者，當(dāng)術(shù)語(yǔ)"成熟"用于描述蛋白質(zhì)時(shí)，是指 經(jīng)過翻譯后加工的多肽。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"區(qū)域"是指核酸或氨基酸的短的保守序列， 該保守序列包含較長(zhǎng)序列的 一部分，并預(yù)計(jì)這種保守序列對(duì)于功能是 重要的，并且能夠用于鑒別新的靶物。預(yù)計(jì)，在任何給定的保守序列 中，可以有一個(gè)或兩個(gè)保守氨基酸與真正同源物中的氨基酸不同。
如本文所用，"基本上相似"是指這樣的核酸片段，其中一個(gè)或 多個(gè)核苷酸堿基的變化使得一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代，但是沒有影響由所述的核苷酸序列編碼的多肽的功能性質(zhì)。
"基本上相似"還指這樣的核酸片段，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿
如)反義技術(shù)來使基因沉默)的能力。
在本研究中使用的、基于結(jié)核分枝桿菌的特異性序列設(shè)計(jì)的反義 寡脫氧核糖核苷酸抑制了恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)，而在這兩個(gè)序列之間
沒有達(dá)到100%的序列一致性。此外，基本上相似的核酸片段還可以通
過它們的雜交能力來表征。這種同源性的評(píng)估可以在嚴(yán)謹(jǐn)條件下通過
DNA-DNA或DNA-RNA的雜交來提供。
此外，氨基酸或核苷酸序列的"基礎(chǔ)部分"包含這樣的氨基酸或 核苷酸序列，由該序列足以推定包含該氨基酸或核苷酸序列的蛋白質(zhì) 或基因。
如本文所用，"生長(zhǎng)抑制，，涉及經(jīng)反義寡核苷酸處理和未經(jīng)處理 的微生物在菌落形成單位和生長(zhǎng)曲線方面的差異。
"PCR"或"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"是用于擴(kuò)增特異性DNA片段的公知 的技術(shù)(美國(guó)專利No. 4， 683， 195和4， 800， 159 )。
SEQ ID NO: 1為金黃色葡萄球菌多肽脫甲?；傅陌被嵝蛄?(NCBI通用鑒定號(hào)GI: 57651784)。
SEQ ID NO: 2為肺炎鏈球菌多肽脫曱酰基酶的氨基酸序列(NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 15858846)。
SEQ ID NO: 3為流感嗜血桿菌多肽脫甲酰基酶的氨基酸序列(NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 16272565)。
SEQ ID NO: 4為鉤端螺旋體多肽脫甲?；傅陌被嵝蛄?NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 14626937)。
SEQ ID NO: 5為糞腸球菌多肽脫甲?；傅陌被嵝蛄?NCBI通 用鑒定號(hào)GI: 29377524)。
SEQ ID NO: 6為幽門螺桿菌多肽脫甲?；傅陌被嵝蛄?NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 49089809)。
SEQ ID NO: 7為枯草桿菌多肽脫甲?；傅陌被嵝蛄?NCBI通用鑒定號(hào)GI: 16078635)。
SEQ ID NO: 8為結(jié)核分枝桿菌多肽脫甲酰基酶的氛基酸序列(NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 38490165)。
SEQ ID NO: 9為恥垢分枝桿菌多肽脫甲酰基酶的氨基酸序列 (MSMEG0826肽脫甲?；?def) [3.5.1.88] {恥垢分枝桿菌MC2}
SEQ ID NO: 10為牛分枝桿菌多肽脫甲酰基酶的氨基酸序列(NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 31617046)。
SBQ ID NO: 11為鳥分枝桿菌多肽脫甲酰基酶的氨基酸序列(NCBI 通用鑒定號(hào)GI: 41398721)。
SEQ ID NO: 12為麻瘋分枝桿菌多肽脫甲酰基酶的氨基酸序列
(NCBI通用鑒定號(hào)GI: 13093428)。
SEQ ID NO: 8結(jié)核分枝桿菌gi: 38490165 MAVVPIRIVGDPVLHTATTPVTVAADGSLPADLAQLIATMYDTMDAANGVGLAA
RYARNAKRAVKSHGWGWGLSWLPGEDPDPFGH
SEQ ID NO: 9 MSMEG0826肽脫甲酰基酶(def) [3.5.1.88] {恥垢 分枝桿菌MC2) (www. tigr. org)
QIGVAKRLFVYDCAPTRGQTTRRRGWINPVLETSEVPETMPDPDBDEEGCL二VP
RYARAAKKAVKRNGWGGVPGLSWMPGEVPDPFGH SEQ ID NO: 10牛分枝桿菌gi: 31617046
NQIGCSLRLFVYI^CAADRAMTARKRGVVINPVLETSEIPETMPDFDTDDEGCLSV PGESFPTGRAKWARVTGLDADGSPVSIEGTGLFARMLQHETGHLDGFLYLDRLIG RYARNAKRAVKSHGWGVPGLSWLPGEDPDPFGH
SEQ ID NO: 11鳥分枝桿菌gi: 41398721MAVVPIRIVGDPVLHTPTQPVPVGDDGSLPADLGKLIADMYDTMDAAHGVGLAA NQIGVGLRVFVYDCADDRGLTERRRGVWNPVLETSEIPETMPDPDTODEGCLS
GRYARSAKRAVKSHNWGVPGLS麵PGEGPDPFGH
SEQ ID NO: 12麻瘋分枝桿菌gi: 13093428
RHARSAKRAIKSRHWGVPGLSWMPGEVPDPFGP
(在序列IDNo. 8、 9、 10、 11、 12中，12個(gè)氨基酸的插入?yún)^(qū)域 以粗體字示出)
得自結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲?；?tnPDF)的開放閱讀框的表征
由結(jié)核分枝桿菌菌林H37Ra中分離出基因組DNA，并用于mPDF基 因(def)的PCR擴(kuò)增。根據(jù)公開的結(jié)核分枝桿菌基因組的def (Rv0429c) 序列來設(shè)計(jì)使用的引物(CR1: CATATGGCAGTGGTACCC 3'，其中合 并有AWeI位點(diǎn)；以及CR3: 5' CCATTAGTGACCGAACGGG 3' ) (Coleet al.， Nature. 393 537-544 (1998))。使用長(zhǎng)模板PCR體系(Roche, Germany)，根據(jù)制造商建議的方案來PCR擴(kuò)增def開放閱讀框(5" bp)。在使用DM聚合酶I(Klenow)進(jìn)行處理后，將經(jīng)過PCR擴(kuò)增的 片段首先克隆到pUC19載體(pUC-PDF;參見圖3)中，然后使用自動(dòng)測(cè) 序儀測(cè)定其核酸序列。隨后，將所得的構(gòu)建體用于將^e/開放閱讀框 亞克隆在pET28c的^/eI/#/iHfIII位點(diǎn)處，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌林DH5 ot中(pET-PDF;參見圖3)。通過限制性分析證實(shí)了包含所關(guān)注基因的 克隆子。
將pET-PDF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌林BL21(DE3)中，以用于過表達(dá)。 對(duì)于蛋白質(zhì)的純化，將所得菌落的過夜培養(yǎng)物(在含50 pg/ml卡那 霉素的LB肉湯中在37X:下培養(yǎng) 15h)再次接種，并使其生長(zhǎng)，直到 0D6。。為 0. 8。然后，將細(xì)胞在25"C下用0. 4mM的IPTG誘導(dǎo)，12h后收獲細(xì)胞，并將其懸浮于裂解緩沖液(20mM的磷酸鹽緩沖液，pH7.4， 其包含5mM的DTT、 10 pg/ml的過氧化氫酶、lmM的苯曱基磺酰氟、 1 jag/ml的胃蛋白酶抑制劑和1 jug/ml的亮抑酶肽)中。對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行超聲波處理，然后將沉淀部分(~ 12, 000 xg， 4t;，離心30分鐘) 再次懸浮于含3M尿素和2%的Triton X100的裂解緩沖液中。離心后， 將上清液部分透析(在4X:下，14h)，從而除去尿素，并根據(jù)制造商 建議的方案在Ni-NTA柱(Qiagen)上進(jìn)行純化。最后，在洗脫緩沖液(20 mM的磷酸鹽緩沖液，pH7. 4，其含300 mM的NaCl、 250 mM的咪唑以 及IO pg/ml的過氧化氫酶)中洗脫mPDF，并根據(jù)Bradford的方法 評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)濃縮物(Bradford M. M， Anal. Biochem. 72 248-254 1976 )。
在12%的SDS-PAGE中對(duì)不同純化階段的mPDF蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳， 并使用抗組氨酸抗體通過蛋白質(zhì)印跡方法來確證(參見圖4)。將經(jīng) 純化的mPDF原液的蛋白質(zhì)濃縮物保持為3. 5mg/ml，并在使用前儲(chǔ)存 在-80t:下。使用稀釋緩沖液(20mM的磷酸鹽緩沖液，pH7. 4，其含1 mg/ml的BSA以及10 n g/ml的過氧化氬酶)稀釋mPDF，并在用于測(cè) 試前將蛋白質(zhì)濃縮物調(diào)節(jié)至3. 5 jig/ml。通過將30 jug的mPDF樣品
(在20mM的磷酸鹽緩沖液中制備，pH7.4)注射到石墨爐中來進(jìn)行原 子吸收光語(yǔ)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(使用1-10 pg的FeS04制成)來計(jì) 算mPDF中存在的鐵含量。表明，鐵存在于催化核心處(0. 94 ± 0. 21 mol鐵/mol的mPDF多肽，n - 4 )。
根據(jù)Groche等人(Groche et al., Biochem. Biophys, Res. Commun. 246 342-346 1998)所述的方法并稍作修改，在分光測(cè)試法中 來評(píng)價(jià)mPDF對(duì)甲硫氨酸進(jìn)行脫甲酰的能力。在溶于IX測(cè)試緩沖液
U00mM礴酸鹽緩沖液，pH7. 4，其含100 |i g/ml的過氧化氫酶)中 的50pl反應(yīng)體系的mPDF蛋白質(zhì)(通常為70ng)中進(jìn)行所述的測(cè)試， 其中所述的緩沖液在30匸下與底物(0至80mM的N-甲?；?Met-Ala， Sigma， USA)溫育了 30分鐘。通過加入50 u 1 4%的HC104來終止反 應(yīng)，然后將所得物進(jìn)一步與TNBSA試劑(0. 01%的該試劑溶于0. 1M的NaHC03緩沖液中，pH8. 4)進(jìn)一步溫育(在37C下溫育2h)。在加入 10X的sds(250 m l)和1N的HC1(125 jil)之后，在335n邁下測(cè)定高 度顯色的衍生物(其是由于伯胺與TNBSA反應(yīng)而產(chǎn)生的)(Hermanson G， Bioconjugate'techniques, AeademiG press， San Diego, California: 1996， pp， 112-113)。通過減去空白(即，包含除了 mPDF酶以外的所 有的組分)讀數(shù)來校正所得的值。使用已知量(0-42.8 nmole)的甲 硫氨酸來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用N-甲?；?甲硫氛酸-丙氨酸作為底物、 由三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)測(cè)定的催化參數(shù)表明，mPDF為活性酶，其 Michalis-Menton常數(shù)(U為4. 1 ± 0. 2 mM，最大速度(V隨)為13. 3 ± 0.7 lamoles/min/mg蛋白質(zhì)，催化效率為1220 ± 6 M_1s-1。
分枝桿菌肽脫甲?；富钚允歉叨确€(wěn)定的，并且對(duì)諸如過氧化氫 之類的氧化劑具有抗性
當(dāng)將在上文提及的TNBSA測(cè)試中的重組蛋白質(zhì)(其濃度保持為3. 5 pg/ml)的酶活性作為時(shí)間函數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，其表現(xiàn)為半衰期為4.1 ± 0. 7 h。因此，盡管Fe"處于所述的重組mPDF的金屬結(jié)合核心中， 但是與大腸桿菌的PDF相比，所述的重組mPDF是非常穩(wěn)定的。上述觀 察結(jié)果以及結(jié)核分枝桿菌必需善于處理氧化應(yīng)激以便在宿主中存活的 事實(shí)，使得我們對(duì)諸如HA(過氧化氫)之類的氧化劑對(duì)mPDF的脫甲酰 能力的影響進(jìn)行監(jiān)測(cè)。盡管已經(jīng)報(bào)道微摩爾級(jí)的濃度會(huì)使大腸桿菌酶 快速并完全失活(Rajagopalan and. Pei， J. Biol， Chem. 273 22305-22310 1998),但是我們發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的對(duì)照相比，與500mM 的&02進(jìn)行預(yù)溫育(使70ng蛋白質(zhì)/反應(yīng)物處于301C下至2h)沒有顯 示出對(duì)mPDF的脫甲酰能力造成任何明顯的影響。因此，我們確定，盡 管mPDF與其他細(xì)菌的同源物具有共性，但是mPDF無疑地保持了與眾 不同的行為。
分枝桿菌肽脫甲?；钢信c保持酶的穩(wěn)定性有關(guān)的插入?yún)^(qū)域的鑒定
與其他革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(n型種類)類似，mPDF在保守的基序I 和II之間具有插入序列(氨基酸殘基74-85;如圖1中的IR所示)。 我們采用基于PCR的基因突變方法(Shirley, K. ， etal.， PCR Primer: A Laboratory Manual ppl43-155 in CW. Dieffenbach, G. S. Dveksler， (ed丄 Cold Spring HarborLaboratory， Cold Spring Harbor, NY. 1995 ))制備了 mPDF的插入序列(指定為IR，其中12個(gè)氨基酸 "MTARRRGVVINP"發(fā)生缺失)缺失突變體。然后估測(cè)酶活性，從而評(píng) 價(jià)所述區(qū)域?qū)PDF的脫甲酰能力的貢獻(xiàn)。在上文所述的TNBSA測(cè)試法 中，使用N-甲?；?Met-Ala作為底物，在過氧化氫酶和BSA存在下測(cè) 定mPDF的酶活性。通過蛋白質(zhì)印跡的證明方法，使用抗組氨酸標(biāo)記來 驗(yàn)證表達(dá)的突變體蛋白質(zhì)(IR)。通過在所述的測(cè)試方法中使用甚至過 量的蛋白質(zhì)(20 pg，與5mM的N-甲?；?Met-Ala溫育)，IR突變 體幾乎未顯示出任何的脫甲?；富钚?參見圖5)。
針對(duì)插入?yún)^(qū)域的反義寡核苷酸抑制了培養(yǎng)物中分枝桿菌的生長(zhǎng)以 及肽脫甲?；傅漠a(chǎn)生
def基因在多種病原細(xì)菌中的必要性使得被用作有希望的藥物靶 物(Yuan et al. ， Drug Discov. Today 6， 954-961 (2001))。此外 還報(bào)道，將培養(yǎng)物與所述酶的抑制劑一起溫育會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng) (Clements, et al.， Antimicrob. Agents. Chemother 45， 563-570 2001 and Cynamon, et al., J. Antimicrob. Chemother 53， 403-405 2004 )。由于插入序列對(duì)于保持mPDF的酶活性是至關(guān)重要的，所以我 們進(jìn)一步檢驗(yàn)了所述區(qū)域?qū)u垢分枝桿菌菌林m一155的生長(zhǎng)概況的貢 獻(xiàn)，其中所述的恥垢分枝桿菌菌林mc2l55是一種快速生長(zhǎng)的腐生菌， 其通常被用作用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因研究的模型(Flint, et al.， Proc. Natl, Acad. Sci U. S. A. 101， 12598-12603 2004 )。為了達(dá)到上述目的，使細(xì)菌培養(yǎng)物在經(jīng)5'硫代磷酸修飾的反義寡脫氧 核糖核苷酸PS-0DN1存在下生長(zhǎng)，其中所述的PS-0DN1被設(shè)計(jì)為跨越 了所有種類的分枝桿菌中最保守的(在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌 的def之間，在核苷酸水平上的同源性為~73%)區(qū)域(結(jié)核分枝桿菌 def的第219-249位的堿基)。
通過在600nm下記錄吸光率以及通過計(jì)數(shù)菌落形成單位來在不同 的時(shí)間間隔(0-24 h)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)概況。與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物相 比，我們得到的結(jié)果顯示，當(dāng)使用PS-0DN1處理時(shí)，在24h時(shí)，恥垢 分枝桿菌的生長(zhǎng)降低了 5倍(參見圖6A和7，左圖)。上述發(fā)現(xiàn)可以 通過使用所述區(qū)域(跨越了結(jié)核分枝桿菌def的第229-255位的堿基， 在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌之間的核苷酸序列中具有86%的同源 性)的另 一種反義寡脫氧核糖核苷酸(PS-0DN2)(其中所有的堿基都具 有硫代磷酸修飾(如圖6A的插入物所示))來證實(shí)。當(dāng)使用非特異性的 5'硫代磷酸修飾的反義寡脫氧核糖核苷酸PS-0DN3處理所述的細(xì)菌培 養(yǎng)物時(shí)，我們沒有觀察到所述的生長(zhǎng)抑制情況，其中所述的PS-0DN3 是根據(jù)非同源的序列(在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的def的第 100-117位堿基之間，同源性為22%)而設(shè)計(jì)得到的。由于PS-0DN1 對(duì)分枝桿菌具有特異性(即，其他細(xì)菌中缺乏插入序列)，所以PS-0DN1 對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)概況不產(chǎn)生影響(參見圖7右)。
為了確保PS-0DN1滲透到恥垢分枝桿菌的細(xì)胞中，使PS-0DN1在 3'末端與熒光素(PS-ODN4)綴合，并在處理24h后，在共聚焦顯微鏡中 現(xiàn)象時(shí)，顯示出熒光(參見圖6B)。至此，所有這些證據(jù)表明，靶向 針對(duì)分枝桿菌的代表性插入?yún)^(qū)域的PS-0DN滲透到細(xì)胞的內(nèi)部，并特異 性地抑制了恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)。
為了確定PS-0DN是否抑制恥垢分枝桿菌天然PDF蛋白質(zhì)的表達(dá)， 使培養(yǎng)物在PS-0DN1存在或缺乏情況下生長(zhǎng)2化。在使培養(yǎng)物沉淀之 后，在20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)中制備經(jīng)處理的和未處理的細(xì)胞裂 解物的可溶部分。然后，使這些樣品經(jīng)歷SDS-PAGE電泳(蛋白質(zhì)的加 載量-50 jag/槽)、以及使用了對(duì)抗重組mPDF的多克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡。與未經(jīng)處理的對(duì)照相比(參見麗春紅s染色印跡，其作為加栽
對(duì)照，參見圖8上)，注意到在使用PS-0DN1處理的恥垢分枝桿菌細(xì) 胞中，內(nèi)源PDF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯減少(參見圖8下)?？紤]到 我們得到的結(jié)果，確定插入?yún)^(qū)域?qū)λ雒傅墓δ苄云鸬搅岁P(guān)鍵的作用。
以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明的方式給出以下實(shí)施例，因此，這些實(shí) 施例不應(yīng)該被解釋為限定了本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例1
將源于核苷酸的mPDF氨基酸序列與NIH的BLAST-P程序(利用郵 件服務(wù)器)中的'nr，數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較(Altschul et al.， Nucleic. Acids. Res. 25 3389-3402 1997 )。利用Clustal X 1.81程序，對(duì) 搜索，'j的序歹'j ( retrieved sequence )的多個(gè)序歹'J進(jìn)4亍t匕對(duì)(Thompson et al.， Nucleic. Acids. Res. 25: 4876-4882 1997 )。對(duì)所有真 細(xì)菌PDF的氨基酸序列的分析表明，存在三個(gè)(I: GXGXAAXQ，II: EGCLS 以及III: QHEXXH，其中X為任何的疏水性殘基)高度保守的基序(參 見圖1)，但是所述的這些真細(xì)菌在文獻(xiàn)中被寬泛地歸類為I型(革 蘭氏陰性)和II型(革蘭氏陽(yáng)性)種類。我們將核苷酸衍生的mPDF 氨基酸序列與屬于I型(大腸桿菌)和II型(金黃色葡萄球菌)種類 的良好表征的代表性序列進(jìn)行比較。對(duì)結(jié)核分枝桿菌肽脫甲?；感?列的分析表明，mPDF具有插入序列(氨基酸殘基74-85，由圖1中IR 表示)。然后，將不同種類分枝桿菌的PDF序列進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)對(duì)不同 種類的分枝桿菌進(jìn)行比較時(shí)，結(jié)核分枝桿菌肽脫甲?；傅牟迦胄蛄?表現(xiàn)出~84%的一致性(參見圖2)。
進(jìn)行比對(duì):
利用Clustal XI. 84程序，將得自大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和 結(jié)核分枝桿菌的含鐵肽脫甲?；傅暮塑账嵫苌被嵝蛄羞M(jìn)行比對(duì)。星號(hào)和圓點(diǎn)分別用于表示相同和相似的氨基酸。插入?yún)^(qū)域(74-85 ) 缺失從而形成厶IR突變體的氨基酸帶有下劃線。
得自不同種類分枝桿菌的肽脫甲?；傅亩鄠€(gè)序列進(jìn)行比對(duì)利 用ClustalX1.84程序，將通過PSI-BLAST搜索到的分枝桿菌序列進(jìn)
行比對(duì)。對(duì)包含保守殘基的分枝桿菌脫甲?；妇哂刑禺愋缘牟迦?yún)^(qū) 域帶有下劃線。星號(hào)和圓點(diǎn)分別用于表示相同和相似的氨基酸。 實(shí)施例2
使用得自結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA，在50C的退火溫度下，對(duì) def開放閱讀框(594 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)公開的結(jié)核分枝桿菌基 因組def (Rv0429c)序列設(shè)計(jì)引物(CR1: CATATGGCAGTGGTACCC 3、 其中合并有Ndel位點(diǎn)；以及CR3: CCATTAGTGACCGAACGGG 3 ' )(Cole et al. ， Nature. 393 537-544 1998 )。使用長(zhǎng)模板PCR體系(Roche )， 根據(jù)制造商建議的方案來進(jìn)行PCR。
在使用DNA聚合酶I(Klenow)進(jìn)行處理后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，將經(jīng) 過PCR擴(kuò)增的片段首先克隆到pUC19載體(pUC-mPDF)的Smal位點(diǎn)中 (Sambrook， J. and Russel， D.. Molecular cloning : a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor New York, USA 2001 )，然后使用自動(dòng)測(cè)序儀(Appl ied Biosystems) 測(cè)定其核酸序列。隨后，對(duì)在pUC19中克隆后的片段進(jìn)行測(cè)序，表明 在核苷酸水平上與結(jié)核分枝桿菌的公開def序列具有100%的一致性 (Cole et al.， Nature. 393 537-544 1998 )。
為了對(duì)mPDF的酶性質(zhì)進(jìn)行表征，通過使用Ndel/Hindlll限制性 酶對(duì)pUC-mPDF進(jìn)行限制性酶切而切下594bp的包含def開放閱讀框的 片段，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法將該片段連接到pET28c的相應(yīng)位點(diǎn)處 (Sambrook, J. and Russel， D.. Molecular cloning : a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor New York, USA 2001)。這形成了被稱為pET-mPDF的構(gòu)建體(參見圖 3)，將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌林BL21(DE3)中，從而得到重組蛋 白質(zhì)。對(duì)由包含質(zhì)粒pET-mPDF的宿主細(xì)胞制備而來的細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，在使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)之后，過表達(dá)出~ 30kDa 的蛋白質(zhì)(參見圖4左，并比較泳道2和泳道3)。
過表達(dá)的蛋白質(zhì)存在于沉淀部分中(參見圖4左，并比較泳道4 和泳道5)，使用3M的尿素溶解該蛋白質(zhì)(參見圖4左，泳道6)， 并在20mM的磷酸鹽緩沖液中透析。隨后可溶蛋白質(zhì)(參見圖4左，泳 道8)在Ni-NTA柱上的親和純化表明分子量為31 ± 1. 4 kDa (平均 值± SD， n = 7)。所表達(dá)的蛋白質(zhì)在氨基末端具有得自于載體的額 外19個(gè)氨基酸(HHHHHHSSGLVPRGSH)(其包含聚組氨酸區(qū)域(六個(gè)組氨 酸))。延伸的氨基末端不僅有助于蛋白質(zhì)的親和純化，而且提供了在 蛋白質(zhì)印跡中使用抗組氨酸標(biāo)記的單克隆抗體來檢測(cè)mPDF蛋白質(zhì)的 手段(參見圖4右，泳道2和泳道3)。在我們的研究中，這種構(gòu)建 體被稱為野生型。
將分枝桿菌肽脫甲?；缚寺〉奖磉_(dá)載體中的示意性代表方法 使用得自結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA對(duì)def開放閱讀框(594 bp)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。在使用DNA聚合酶I(Klenow)進(jìn)行處理后，將經(jīng)過PCR擴(kuò)增 的片段克隆到PUC19載體(pUC-PDF)的Smal位點(diǎn)中，并通過限制性酶 切證實(shí)其核酸序列，然后進(jìn)行核酸測(cè)序。隨后，將上迷構(gòu)建體用于將 開放閱讀框亞克隆到pET28c的Ndel/Hindl11位點(diǎn)處，并轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌菌林DH5 cx中，從而得到pET-PDF (WT)。利用獨(dú)特的 SacII/Hindin，在需要的位點(diǎn)處酶切包含突變的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將 該產(chǎn)物合并到pET-PDF構(gòu)建體的相應(yīng)位點(diǎn)處。
圖4:在大腸桿菌中表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌肽脫甲?；傅募兓?。 按照本文所述，對(duì)包含pET-PDF或缺失突變體(IR)的BL21 (DE3)細(xì)胞 的過夜培養(yǎng)物進(jìn)行處理。使各個(gè)純化階段的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)歷12%的 SDS-PAGE電泳，然后使用考馬斯亮蘭染色(左圖)，再使用抗組氨酸 的抗體(右圖)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡染色。左圖泳道1，分子量標(biāo)記； 泳道2，使用pET-PDF轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的粗提物；泳道3:在IPTG誘導(dǎo)后， 使用pET-PDF轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞粗提物；泳道4:低速下的上清液部分； 泳道5:在低速離心后得到的沉淀部分；泳道6:尿素溶解的上清液部分；泳道7:在低速離心后的尿素溶解的沉淀部分；泳道8: Ni-NTA 樹脂純化的蛋白質(zhì)。右圖泳道l:使用pET-PDF轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞粗提 物；泳道2:在IPTG誘導(dǎo)后，使用pET-PDF轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞粗提物；泳 道3: Ni-NTA樹脂純化的蛋白質(zhì)。箭頭表示純化的mPDF的位置。數(shù)字 表示標(biāo)記蛋白質(zhì)的分子量大小。
為了確定插入?yún)^(qū)域74-85的重要性，我們使用基于PCR的方法構(gòu) 建了缺失結(jié)核分枝桿菌肽脫曱?；傅陌被釟埢?4-85的突變體。 根據(jù)基于PCR的方法，使用pUC-PDF作為模板形成所述的突變體 (Shirley, K. ， et al. ， PCR Primer: A Laboratory Manual pp 143-155 in CW. Dieffenbach， G.S. Dveksler，(ed.). Cold Spring HarborUboratory， Cold Spring Harbor, NY. 1995)。使用兩個(gè)夕卜 部引物(引物CR26: 5' GGAATTCCATATGGCAGTCGTACCC3'和CR27: 5'CCCAA GCTT TTAGTGACCGAACGG3/ )和兩個(gè)內(nèi)部引物(CR88: GCGGACCGCGCAGTGCTTGAGACCTC3' 和 CR87:
5'GAGGTCTCAAGCACTGCGCGGTCCG 3、其被設(shè)計(jì)成相對(duì)于氨基酸殘基 74-85而言除去了 36個(gè)堿基對(duì))來進(jìn)行PCR。為了形成所需的突變， 進(jìn)行兩組一級(jí)PCR反應(yīng)(使用了 PCR引物CR27/CR87和CR26/CR88, 以及使用pUC-PDF作為模板)。將在一級(jí)反應(yīng)中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 以l:l的比例混合?；旌虾?，使用PCR產(chǎn)物作為模板，并使用外部引 物(CR26/CR27)來進(jìn)行二級(jí)PCR。在0. 8%瓊脂糖凝膠中純化包含所需突 變的最終PCR產(chǎn)物，然后使用SacII/Hindlll酶切該產(chǎn)物，再將所得 物合并到pET-mPDF的相應(yīng)位點(diǎn)處(參見圖3)。以這種方式得到的突 變體構(gòu)建體被稱為pET-AIRPDF。按照在野生型中提及的相似的方法 使pET-△ IR PDF (突變體構(gòu)建體)表達(dá)及純化。然后對(duì)野生型蛋白質(zhì)
和突變體蛋白質(zhì)的酶活性進(jìn)行檢測(cè)。
根據(jù)本文其他處所述的方法(Hermanson G， Bioconjugate
techniques, Academic press, San Diego， California, 1996， pp，
112-113)，并稍作修改，使用分光測(cè)試評(píng)價(jià)mPDF或突變體蛋白質(zhì)對(duì)甲
硫氨酸鹽進(jìn)行脫曱酰的能力。簡(jiǎn)而言之，將溶于lx測(cè)試緩沖液(100mM磷酸緩沖液，pH7. 4，其舍IOO jig/ml的過氧化氫酶)中的50pl反 應(yīng)體積的mPDF蛋白質(zhì)或突變體蛋白質(zhì)(通常為32ng-20jug)在30*C 下與底物(5mM的N-甲?；?Met-Ala， Sigma, USA)溫育30分鐘，通 過加入50 pi 4%的HC104來終止反應(yīng)，然后將所得物進(jìn)一步與三硝 基苯磺酸(TNBSA)試劑(0. 01%的該試劑溶于0. 1M的NaHC03緩沖液中， pH8.4)進(jìn)一步溫育(在37"C下溫育2h)。在加入10%的SDS (250 n l)和1N的HC1 (125 n l)之后，在335nm下測(cè)定高度顯色的衍生物(其 是由于伯胺與TNBSA反應(yīng)而產(chǎn)生的)。通過減去空白(即，包含除了 酶以外的所有的組分)讀數(shù)來校正所得的值。使用已知量(0-42. 8 認(rèn)ole)的甲硫氨酸來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將mPDF的酶活性以nmole的 所產(chǎn)生的游離氨基/min/mg蛋白質(zhì)來表示。最后，將所得數(shù)據(jù)以得自 至少三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值土SD的形式示出。當(dāng)將酶活性作為蛋白質(zhì) 濃度的函數(shù)來進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，整個(gè)插入?yún)^(qū)域(跨越了殘基74-85的厶IR 突變體)的缺失完全喪失了酶活性(參見圖5)。因此，上述結(jié)果表 明了插入?yún)^(qū)域?qū)Y(jié)核分枝桿菌肽脫甲?；傅拿富钚缘闹匾?。
突變對(duì)結(jié)核分枝桿菌肽脫甲?；傅拿富钚缘挠绊?。按照本文所 述的基于PCR的突變方法來產(chǎn)生缺失突變體(A IR 74-85)。在表達(dá)后， 對(duì)野生型蛋白質(zhì)和mPDF突變體蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。使用5mM的N-甲酰 基-Met-Ala作為底物，使脫甲酰的能力作為逐漸增加的蛋白質(zhì)濃度 (0. 032、 0.16、 0. 8、 4. 0、 20 jng)的函數(shù)，來比較突變體厶IR (74-85) 和野生型(WT)的脫甲酰的能力。
實(shí)施例3
我們進(jìn)一步檢驗(yàn)了所述區(qū)域?qū)u垢分枝桿菌菌林mc2l55的生長(zhǎng)的 貢獻(xiàn),其中所述的恥垢分枝桿菌菌林mc2l55是一種快速生長(zhǎng)的腐生菌， 其通常被用作用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因研究的模型(Flint, et al.， Proc. Natl, Acad. Sci U. S. A. 101， 12598-12603 2004 )。 將~ lx105的恥垢分枝桿菌細(xì)胞(得自鋪滿培養(yǎng)，并且細(xì)胞數(shù)量通過系 列稀釋來調(diào)節(jié))與lOpM的PS-0DN1 一起在3ml的肉湯(補(bǔ)充有10%ADC的7H9 Middlebrook培養(yǎng)基)中溫育。將PS-0DN1設(shè)計(jì)成跨越了所有 種類分枝桿菌中的最保守(在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的def之 間，在核苷酸水平上的同源性為~73%)的區(qū)域(結(jié)核分枝桿菌def 的笫219-249位的堿基)。在不同的時(shí)間間隔(O、 6、 12、 24 hr)時(shí)， 取出少量的等分試樣，并記錄在600mn下的光學(xué)密度，從而得到使用 PS-0DN1處理和未使用PS-0DN1處理的細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)概況。同時(shí)， 對(duì)在不同時(shí)間間隔時(shí)回收的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行洗滌，在經(jīng)過系列稀釋后將 這些細(xì)胞平板接種于7H10Middlebrook瓊脂(補(bǔ)充有10%的ADC)上， 然后在37C下溫育3天后，計(jì)數(shù)菌落形成單位。與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物 相比，我們得到的結(jié)果表明，在PS-0DN1存在下生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌 培養(yǎng)物的生長(zhǎng)降低了 5倍(參見圖6A和7)(當(dāng)通過在600nm下測(cè)定 培養(yǎng)物的光學(xué)密度以及通過計(jì)數(shù)平板上得到的菌落數(shù)量來檢測(cè)生長(zhǎng)情 況時(shí)，得到了相似的生長(zhǎng)概況)。上述發(fā)現(xiàn)可以通過使用所述區(qū)域(跨 越了結(jié)核分枝桿菌def的第229-255位的堿基，在結(jié)核分枝桿菌和恥 垢分枝桿菌之間的核苷酸序列中具有86%的同源性)的另一種反義寡 脫氧核糖核苷酸(PS-0DN2)(其中所有的堿基都具有硫代磷酸修飾(如 圖6A的插入物所示))來證實(shí)。
此外，為了確保PS-0DN1滲透到恥垢分枝桿菌的細(xì)胞中，使 PS-0DN1與3'熒光素標(biāo)記綴合，并用于處理分枝桿菌培養(yǎng)物(將~ lxl05 的恥祐分枝桿菌與10juM的PS-ODN —起在3ml的7H9 Middlebrook 肉湯(補(bǔ)充有10%的ADC)中溫育，并在37t7200 rpm下生長(zhǎng)24hr)。 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在使用lxPBS(pH7.4)洗滌之后，將細(xì)胞用綴合了 3' 熒光素的PS-0DN1處理，當(dāng)在共聚焦顯微鏡中觀察這些細(xì)胞時(shí)，其表 現(xiàn)為發(fā)出熒光(參見圖6B)。由于PS-0DN1是分枝桿菌特異性的，所 以在所述的插入序列缺乏的大腸桿菌中，當(dāng)使用10juM的PS-0DN1對(duì) 培養(yǎng)物進(jìn)行處理時(shí)，沒有對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)造成影響(參見圖7右)。 至此，所有這些證據(jù)表明，靶向針對(duì)分枝桿菌的代表性插入?yún)^(qū)域的 PS-ODN滲透到細(xì)胞的內(nèi)部，并特異性地抑制了恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)。
分枝桿菌肽脫曱酰基酶的保守插入?yún)^(qū)域的反義寡核苷酸對(duì)生長(zhǎng)的影響。將恥垢分枝桿菌(使lxl(^細(xì)胞處于3ml的Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基中，其中所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%的清蛋白、葡萄糖和過氣化 氫酶的混合物)與PS-ODN—起溫育，其中所述的PS-ODN被設(shè)計(jì)成針 對(duì)分枝桿菌的代表性的插入?yún)^(qū)域。在不同的時(shí)間間隔(O、 6、 12、 24hr) 時(shí)，取出等分試樣，并記錄在600nm下的光學(xué)密度，從而得到使用 PS-ODN處理和未使用PS-ODN處理的細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)概況。插入物 當(dāng)使用非特異性的經(jīng)5'硫代磷酸修飾的反義寡脫氧核糖核苷酸 PS-0DN3處理所述的分枝桿菌培養(yǎng)物、并使其按照上文所述生長(zhǎng)時(shí)， 我們沒有觀察到所述的生長(zhǎng)抑制情況，其中所述的PS-0DN3是根據(jù)非 同源的序列(在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的def的第100-117位 堿基之間，同源性為22%)而設(shè)計(jì)得到的(B)在共聚焦顯微鏡下觀察 了使用PS-ODN (綴合了 3'焚光素)處理24小時(shí)的細(xì)菌細(xì)胞。上圖 未經(jīng)處理的恥垢分枝桿菌，下圖使用PS-ODN(綴合了 3'熒光素)處 理的恥垢分枝桿菌。
對(duì)分枝桿菌肽脫甲?；傅谋Ｊ夭迦?yún)^(qū)域的反義寡核苷酸做出響 應(yīng)的不同的細(xì)菌生長(zhǎng)。在不同的時(shí)間間隔下，取出在10 pM PS-ODN
(其是針對(duì)分枝桿菌的特異性插入?yún)^(qū)域設(shè)計(jì)而成的)缺乏和存在下生 長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物(使lxl()5細(xì)胞處于3ml的培養(yǎng)基中，其中恥垢分枝 桿菌使用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10%的清蛋白、 葡萄糖和過氧化氬酶的混合物；大腸桿菌使用Lauria-Bertani培養(yǎng) 基)，然后進(jìn)行洗滌，再將培養(yǎng)物經(jīng)過系列稀釋后平板接種f Middlebrook 7H10瓊脂(補(bǔ)充有10%的清蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶 的混合物(恥垢分枝桿菌))上或Lauria-Bertani-瓊脂(大腸桿菌)平 板上。對(duì)在37X:下溫育3天(恥垢分枝桿菌)和12hr (大腸桿菌)后 所得到的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將其作為未經(jīng)處理的培養(yǎng)物的生長(zhǎng)百分率 繪圖。
實(shí)施例4
為了確定PS-ODN是否抑制恥垢分枝桿菌天然PDF蛋白質(zhì)的表達(dá)， 使培養(yǎng)物在PD-0DN1存在或缺乏情況下生長(zhǎng)24h。在使培養(yǎng)物沉淀之后，在20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)中制備經(jīng)處理的和未處理的細(xì)胞裂 解物的可溶部分。然后，使這些樣品經(jīng)歷SDS-PAGE電泳(蛋白質(zhì)的加 載量=50 ng/槽)、以及使用了對(duì)抗重組mPDF的多克隆抗體的蛋白質(zhì) 印跡。與未經(jīng)處理的對(duì)照相比(參見麗春紅S染色印跡，其作為加栽 對(duì)照，參見圖8上)，注意到在使用PS-0DN1處理的恥垢分枝桿菌細(xì) 胞中，內(nèi)源PDF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯減少(參見圖8下)?？紤]到 我們得到的結(jié)果，確定插入?yún)^(qū)域?qū)λ雒傅墓δ苄云鸬搅岁P(guān)鍵的作用。
圖8:對(duì)反義寡核苷酸處理做出響應(yīng)的肽脫甲?；傅鞍踪|(zhì)的表 達(dá)情況。將恥垢分枝桿菌培養(yǎng)物(處于3ml Middlebrook 7H9培養(yǎng)基 中的1xl()5細(xì)胞，其中所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%的清蛋白、葡萄糖和過 氧化氫酶的混合物)與PS-ODN(IO "M)—起溫育24h，其中所述的 PS-ODN被設(shè)計(jì)針對(duì)分枝桿菌的代表性的插入?yún)^(qū)域。收獲細(xì)胞，對(duì)其進(jìn) 行超聲波處理，然后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將上清液部分(13200 rpm) 隨后進(jìn)行使用。將經(jīng)過12% SDS-PAGE (對(duì)于經(jīng)處理或未經(jīng)處理的樣品， 加栽量為50 ]Lig蛋白質(zhì)/槽)分辨的蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡分析(其 中使用了對(duì)抗經(jīng)純化的重組mPDF的多克隆抗體)。上圖使用對(duì)抗 mPDF的多克隆抗體探測(cè)的印跡；泳道l， Ni-NTA純化的mPDF (作為對(duì) 照)；泳道2，得自未經(jīng)處理的恥垢分枝桿菌的上清液部分；泳道3， 得自使用經(jīng)過lOnMPS-ODN處理的恥垢分枝桿菌的上清液部分；泳道 4，預(yù)染色的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物。下圖采用麗春紅S染色法染色的 一些印跡，其作為加載對(duì)照示出。
優(yōu)點(diǎn)
在過去幾十年中，結(jié)核已經(jīng)作為全球健康危害而再次出現(xiàn)，其導(dǎo) 致全世界數(shù)百萬(wàn)人死亡。雖然，已知有多種抗結(jié)核藥物，但是抗一種 或多種藥物的病原分枝桿菌菌林的出現(xiàn)已經(jīng)普遍地被認(rèn)為是這種致死 性疾病得以復(fù)蘇的一個(gè)主要原因。為了克服這種情況，迫切需要研發(fā) 新的藥物干預(yù)策略。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，鑒定藥物靶物是首要條件。 在本文中，本發(fā)明總體上專注于分枝桿菌中蛋白質(zhì)的合成過程，該過 程通常被證實(shí)為用于篩選抗細(xì)菌化合物的靶物的豐富來源。與真核生物中胞質(zhì)蛋白質(zhì)的合成截然不同的是，甲?；?脫甲?；录坪跏钦?br> 細(xì)菌蛋白質(zhì)合成中的必需步驟，因此，已經(jīng)長(zhǎng)期預(yù)想到了 PDF酶的重 要性。盡管分枝桿菌PDF與不同細(xì)菌的PDF具有共性，但是分枝桿菌 PDF具有多種與眾不同的特征。在這些特征中，插入序列(殘基74-85 ) (只在分枝桿菌中是獨(dú)特的)在保持酶的穩(wěn)定性以及該蛋白質(zhì)的功能 性方面的貢獻(xiàn)是主要的特征，到目前為止，這一特征還沒有從任何其 他的細(xì)菌中有所報(bào)道。針對(duì)所述的插入序列設(shè)計(jì)并合成的硫代磷酸修 飾的反義寡核苷酸抑制了培養(yǎng)物中分枝桿菌的生長(zhǎng)以及分枝桿菌肽脫 甲?；傅谋磉_(dá)。因此，這些結(jié)果突出了分枝桿菌酶的插入?yún)^(qū)域的新 穎性，基于此，合理的藥物設(shè)計(jì)成為可能。因此，本發(fā)明在鑒定/研發(fā) 任何抗分枝桿菌化合物(生物的或非生物的)方面都具有明確的優(yōu)點(diǎn)， 其中所述的化合物與分枝桿菌酶的所述區(qū)域相互作用，并影響了所述 酶的表達(dá)或產(chǎn)生，從而能夠抑制分枝桿菌的生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.序列ID No.14表示的分枝桿菌肽脫甲酰基酶[def]基因序列的插入序列。
2. 權(quán)利要求l的序列，其中所述序列被用作對(duì)抗分枝桿菌的潛 在的藥物靶物。
3. 權(quán)利要求l的序列，其包含由XTXRRRGVVINP表示的12個(gè)氨 基酸，其中X-20個(gè)已知氨基酸中的任何一個(gè)氨基酸。
4. 權(quán)利要求3的氨基酸序列，其中所述序列在結(jié)核分枝桿菌(M. ^erci;/o" )、恥紫分枝桿菌(M.，拜〃s)、牛分枝桿菌(M.、鳥分枝桿菌(M. ar/咖)和麻風(fēng)分枝桿菌(M. /e，e) 中具有90至95%的相似性。
5. 與權(quán)利要求1中的序列ID No. 14表示的基因序列互補(bǔ)的反 義寡核苷酸。
6. 權(quán)利要求5的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的特征在于 其為單(5，)硫代磷酸修飾或全硫代磷酸修飾的寡脫氧核糖核苷酸。
7. 權(quán)利要求5的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通過與分枝 桿菌肽脫甲?；?de尸)基因的所述的短區(qū)域雜交來抑制肽脫甲酰 基酶的生成。
8. 權(quán)利要求5的反義寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸為對(duì)抗分 枝桿菌的潛在藥物。
9. 制備權(quán)利要求5的反義寡核苷酸的方法，其中所述方法包括 下列步驟a.由結(jié)核分枝桿菌中分離出多核苷酸序列，所述的多核苷酸序 列包含編碼具有肽脫甲?；富钚缘亩嚯?197個(gè)氨基酸)的核酸序 列(594bp)，其中所述的多肽存在于不同種類的分枝桿菌中，例如 結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌以及麻風(fēng)分 枝桿菌，分別由SEQ ID NO: 8、 9、 10、 11、 12表示，并且在這些 序列中，序列的相似性為至少90至95%;b. 對(duì)由步驟(a)中分離得到的分枝桿菌肽脫甲?；钢械膮^(qū) 域進(jìn)行鑒定，其中所述的區(qū)域由氛基酸序列74至85表示，并且所述 的區(qū)域涉及保持酶的穩(wěn)定性和功能性，而且所述的區(qū)域在步驟(a) 中給出的所有種類的分枝桿菌中都是保守的；c. 針對(duì)由步驟(b)中鑒定的肽脫甲酰基酶的保守區(qū)域制備反 義寡核苷酸或?qū)ζ溥M(jìn)行可允許的修飾；d. 使用由步驟(c)制備的反義寡核苷酸來抑制酶的活性以及 分枝桿菌的生長(zhǎng)。
10. 權(quán)利要求1的多核苷酸插入序列，被用作對(duì)抗分枝桿菌的 潛在的藥物把物。
11. 權(quán)利要求3的多核苷酸插入序列，被用作對(duì)抗分枝桿菌的 潛在的藥物靼物。
12. 權(quán)利要求4的多核苷酸，被用于抑制分枝桿菌的活性和生長(zhǎng)。
13. 用于治療結(jié)核的藥物組合物，其包含權(quán)利要求5的寡核苷酸 或者與權(quán)利要求1中的所述區(qū)域相互作用的生物/非生物的化合物，以 及可任選的可藥用的載體、添加劑或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及與得自結(jié)核分枝桿菌的肽脫甲?；富虻奶禺愋詤^(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)。在分枝桿菌培養(yǎng)物中使用所述的反義寡核苷酸通過抑制所述的區(qū)域來抑制肽脫甲?；傅纳?，其中發(fā)現(xiàn)，所述的肽脫甲?；肛?fù)責(zé)保持酶的穩(wěn)定性以及維持酶的功能性，因此，會(huì)依次影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明還確定了肽脫甲?；冈诜种U菌中的必要性，并要求該酶在所述的微生物中作為藥物靶物的專利保護(hù)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101541964SQ200780028866
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日
發(fā)明者P·K·查克拉波提, R·塞克森納 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)