專利名稱：：病原體的鑒定的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及鑒定體液感染的病原體。
背景技術：
：盡管血源性感染的診斷和早期治療在不斷進步，死亡率仍舊很高。鑒定微生物的傳統(tǒng)方法是基于血液培養(yǎng)物的方法，其需要具有隨后的形態(tài)學和生理學表征的微生物培養(yǎng)(Peters等人，2004)。不同的科學家和一些臨床研究項目周期性地監(jiān)測人病原體的發(fā)生頻率。顯示超過所有血流感染的95%僅由15種不同的屬引起。葡萄J求菌屬(i^apA^/ococcws)和埃希氏菌屬(^sc力er/c力/a)占感染的50%以上。多樣性研究在不同國家和實驗室僅略微不同。而總的病原體感染率隨時間是穩(wěn)定的，特別的是，銅綠假單胞菌(尸sei^/咖0/7asaeri/^^osfl)感染明顯增力o,并代表著唯一與死亡率上升相關的病原體(Fluit等人，2001;Kempf等人，2000;Shigei等人，1995;Meremikwu等人,2005;Vincent等人，2006)。確定血流感染中細菌數量的第一種方法基于將全血在固體培養(yǎng)基上的分布、孵育以及隨后通過計數群落形成單位(CFU)的評價。分離自感染有葡萄球菌和鏈狀球菌的患者的培養(yǎng)物含有高至100CFU/ml血液，而經計數大腸桿菌超過1000CFU/ml。發(fā)現其他革蘭氏陰性菌也具有類似的數量(Yagupsky等人，1990;Henry等人，1983)。最近基于分子技術的出版物提出細菌計數可能比最初設想的高。使用定量RT-PCR首先確定全血中細菌數量的標準曲線用于隨后確定臨床樣品中細菌的負載量。發(fā)現血液中肺炎鏈球菌(57rej^ococcMp/2e咖o;7/ae)的密度范圍為104至5.4xl05細菌/ml。在菌血癥(6ac&rae邁/a)患者中檢測到其他革蘭氏陽性或陰性微生物為104至7107ml的范圍。Hackett甚至顯示在嚴重敗血病病例中的濃度峰值最大為1.8xl()9細菌/ml(Hackett等人，2002;vanHaeften等人，2003;Massi等人，2005，)。對于培養(yǎng)方法和分子方法之間的差異的解釋是一些微生物不能在標準培養(yǎng)條件下繁殖(Keer和Birch，2003)。此外，基于DNA檢測的方法還包括死亡或靜息細菌的未分解的基因組(Nogva等人，2000;Nikkari等人，2001)。自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)，例如BacT/Alert和BAC-TEC9240，是現代臨床實踐中的標準培養(yǎng)技術。幾個研究顯示由于不適當的生長條件導致假陰性結果周期性發(fā)生。進一步處理沒有可檢測的微生物生長的血液培養(yǎng)物，結果在3至40%的病例中(取決于檢測方法)得到陽性結果(Shigei等人,1995;Kocoglu等人，2005;Karahan等人,2006)。Heininger等人(1999)證實了在前抗生素治療的大鼠模型中PCR檢測的優(yōu)點。經典的血液培養(yǎng)物的檢測率在靜脈內施用頭孢噻肟后25分鐘內降低至10%，而那時PCR檢測率仍然為100%。常規(guī)下酵母的培養(yǎng)在特殊的培養(yǎng)瓶中進行。當用于檢測假絲酵母(Ca/^A/s)感染時，所提供的系統(tǒng)在100。/。的靈敏度下進行(Horvath等人，2004)。由于其對微生物生長的需要，常規(guī)的診斷方法持續(xù)至少24小時。一般而言，檢測和鑒定是一個長的過程，對大多數生物而言通常為2至5天，對難養(yǎng)生物而言甚至更長(Marlowe等人，2003;Reimer等人，1997;Henry等人，1983)。與之相反，基于DNA的方法滿足快速、可靠從而救生診斷的需要(Belgrader等人，1999;VincentandAbraham2006)。然而，這些方法不適合目前血液診斷領域中特異性和靈敏度的需要。Rivers等人(2005)強調了在加護病房(ICU)中出現菌血癥的第一癥狀后6小時內(即在敗血癥轉變成嚴重敗血癥之前)早期治療的重要性。預期分子檢測將替代目前用于檢測血流感染的常規(guī)微生物技術?；赑CR擴增和隨后的熒光探針雜交的方法似乎是最有前途的方法(Peters等人，2004)。已經對不同的分子方法(包括熒光標記探針的利用)進行改變使其適用于檢測臨床病原體。已經采用熒光原位雜交(FISH)、PCR、實時PCR、基于熒光的PCR單鏈構象多態(tài)性(SSCP)和寡核苷酸微陣列來鑒定來自菌血癥患者的微生物，然而仍然包括基于培養(yǎng)的細菌富集步驟(KempfV.A.J.等人，(2000);Peters等人，2006;MothershedE.A.和WhitneyA.M.(2006);Rantakokko-Jalava(2000);TurenneCY.等人，(2000);AokiS.等人，(2003);MartineauF.等人，(2001);YadafA.K.等人，(2005);LehnerA.等人，(2005);ShangS.,等人，(2005))。微陣列技術已經被描述為各種臨床應用的有力工具，所述臨床應用例如，尿道感染(UTI)、急性上呼吸道感染、牙周病原體和人腸道細菌的病原體鑒定。微陣列進一步應用于微生物基因表達和多樣性的分析(Bryant等人，2004;Kato-Maeda等人，2001;Wang等人，2002;Roth等人，2004;Yu等人，2004)。WO2001/07648Al描述了采用擴增步驟(例如PCR)的鑒定方法。微生物可以根據擴增物的長度進行分類。US2004/0023209Al描述了引物延伸反應，其用于顯現鑒定用的微生物序列。16S和18SrRM可用做探針。根據DE19713556Al，可通過短的寡核苷酸的分布來鑒定微生物。特殊的分布模式可能與某些微生物如大腸桿菌(^c力er/c力/aco//)、枯草桿菌(As由!7/s)和流行性感冒桿菌(A/i3/7we，e)有關?？傊?，在日常臨床生命中微生物的傳統(tǒng)鑒定方法通?；诤臅r的培養(yǎng)以及隨后的形態(tài)學和生理學表征。血液培養(yǎng)方法是血源性微生物感染診斷中的金標準。然而，早期鑒定由微生物引起的感染是快速和最佳靶向感染治療的關鍵必要條件。然而，不幸地是，由于需要富集微生物，這些常規(guī)診斷方法持續(xù)至少24小時。
發(fā)明內容因此，本發(fā)明的一個目的是提供快速但仍然可靠的用于體液中病原體的測試，特別是那些與人敗血癥相關或有關(或推測有關)的病原體。此外，需要一種方法，其能區(qū)分，還優(yōu)選快速追蹤密切相關但病理上或生理上不同的生物物種或類型。因此，本發(fā)明提供體液樣品中微生物病原體特別是傳染性病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供體液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)，并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，其中或其后對所擴增的核酸進行標記，c)使在b)步驟中經標記的擴增核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA，d)通過檢測與微陣列特異性結合的經標記的擴增核酸來檢測經標記的擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的經標記的擴增核酸的結合與針對微生物DNA的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定體液樣品中的微生物病原體，所述微生物MA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRM。在具體的實施方式中，所述微生物病原體是血流感染(例如敗血癥)的，且所述體液樣品是血液樣品。因此提供血液樣品中微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供血液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)，并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，其中或其后對所擴增的核酸進行標記，c)使在b)步驟中經標記的擴增核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DM編碼來自所述血流感染的微生物病原體的16S或18SrRNA，d)通過檢測與微陣列特異性結合的經標記的擴增核酸來檢測經標記的擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的經標記的擴增核酸的結合與針對微生物DNA的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定血液樣品中血流感染的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述血流感染的微生物病原體的16S或18SrRNA。在其他優(yōu)選的實施方式中，所述病原體是陰道病病原體且所述體液是陰道液。因此提供陰道液樣品中陰道病的微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供陰道液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)，并對編碼16S或18SrRM的微生物DM進行核酸擴增反應，其中或其后對所擴增的核酸進行標記，c)使在b)步驟中經標記的擴增核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DM的固定探針，所述微生物DN.A編碼來自所述血流感染的微生物病原體的16S或18SrRM，d)通過檢測與微陣列特異性結合的經標記的擴增核酸來檢測經標記的擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的經標記的擴增核酸的結合與針對微生物DNA的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定陰道液樣品中陰道病的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述陰道病的微生物病原體的16S或18SrRNA。在本發(fā)明提供一種用于快速鑒定血液中傳染性病原體的分子方法，其結合核酸擴增與微陣列檢測。根據本發(fā)明的DNA芯片包括人體液的相關病原體的寡核苷酸捕獲探針，例如，在實施例部分中以完全開發(fā)的工業(yè)可應用的微芯片提供，25種不同的病原體包括革蘭氏陽性球菌、腸桿菌科家族的不同屬、非發(fā)酵的和臨床相關的念珠菌類。通過使用根據本發(fā)明檢測的微陣列，在短時間內，例如在6小時內檢測微生物是可能的，實現在屬和種水平上快速診斷來自感染患者的體液的病原體并提供重要的抗生素治療結論。細菌感染的快速診斷加速了治療并減少了復原護理(healthcare)。所述方法的靈敏度高并已經顯示在血流感染病原體的情況下降低至10細菌/ml全血(依賴于感染的物種)。優(yōu)選地，通過PCR反應對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應。所述擴增反應例如可以通過多重PCR進行，然而，根據本發(fā)明已經證明降低核酸擴增的引物數是有利的。因此，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選用編碼16S或18SrRNA的微生物DNA的通用引物對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，優(yōu)選不超過8個(4個正向、4個反向)引物，更優(yōu)選不超過6個(3個正向、3個反向)引物，優(yōu)選不超過4個(2個正向、2個反向)引物。已經確定Seq.IDNos.1、2、4和5所示的引物特別適用于本方法。對于血液樣品，任何來自懷疑具有所述血流病原體的患者的樣品都是可用的，包括來自處理過的血液制品(例如，血液級份、血液衍生物或血液產品)的樣品。根據本發(fā)明，特別優(yōu)選在進行核酸擴增反應前進行初始過濾步驟，其中所述體液樣品，尤其是所述血液樣品通過過濾器進行過濾，所述過濾器將白細胞保留在所述體液樣品中但不保留微生物病原體。通常，白細胞的排阻尺寸是lljum(直徑)，而本發(fā)明鑒定的大多數(細菌)病原體的大小為2jam。因此，例如排阻尺寸為51()Mm的過濾器，優(yōu)選7)am，絕對適合于過濾步驟。到目前為止，本方法的最大應用領域是人血液樣品的診斷，特別是與患有敗血癥或處于發(fā)展出敗血癥的風險中的患者相關的血液樣品的診斷。然而，本方法適合測試多種樣品，例如在醫(yī)院人員的測試或獸醫(yī)測試(例如，許多動物)中。優(yōu)選地，然而，根據本發(fā)明方法的測試用于鑒定人病原體。對于擴增期間或擴增后核酸(特別是DNA)的標記，本領域的技術人員可以利用許多方法。例如，核酸的標記可以通過下述方法進行引物延伸、體外轉錄、生物素-鏈親合素-標記、基于Uenow片段的等溫標記(isothermalKlenowfragmentbasedlabelling)或直接核酸擴增標記，優(yōu)選通過直接PCR標記。根據本發(fā)明大多數優(yōu)選的標記方法是引物延伸，優(yōu)選使用熒光染料(特別是Cy5)的引物延伸。該12優(yōu)選的實施方式顯示最佳的靈敏度和特異性。根fe本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式，在核酸擴增反應后將所述擴增的標記核酸直接應用于微陣列，無需純化或洗滌步驟。令人吃驚地，沒有純化在產物與微陣列結合過程中并沒有導致不利影響。相反，由于在與微陣列結合之前沒有進一步純化核酸，防止了產物損失。本發(fā)明的方法可以在其實驗過程中包括從血液中分離DNA、多重PCR、通過引物延伸步驟進行熒光標記(Cy5-dCTP)和隨后的微陣列雜交。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的微陣列包含針對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA來自下述微生物病原體中的至少10種，優(yōu)選至少15種，特別是至少20種大腸桿菌(ATCC35218,EC5，EC17,81617，68933，68307)、產氣腸桿菌(艇er。6a"eraeroge/es)(DSMZ30053，12676)、陰溝腸桿菌(^^ero&"erc/oacae)(26385，79232，93840，12720，74892)、肺炎克雷伯氏菌(i7由/W/a;麵扁/se)(25809，85813，26385，13253)、產酸克雷伯氏菌(r/e^/e//aojr/"ca)(26785,26384，73739，26786，96633)、克氏檸檬酸桿菌(C"r幽"eri:,r/)(DSMZ4595)、弗氏檸檬酸桿菌(C7"o&c"r/Vey/f///)(80324，73489)、金黃色葡萄球菌(5^;力/7ococci/sa",ews)(ATCC6538，ATCC25923，ATCC29213，83799，82913，73237，12998)、表皮葡萄球菌(^ap/^/ococcMe/7/cfe頂/df")(ATCC14990，73711，35989，80320，13000，77504,79510)、糞腸球菌(紐e，。歸"aeca/")(ATCC29212，EF4，81239，83776，27520)、屎腸球菌(^^erococc"s/"aec/w邁)(應Z20477)、肺炎鏈球菌(S"e/^ococ面，薩/2^J(應Z25500)、化膿鏈球菌(S"e/^ococci^p河e篇)(ATCC19615，10388)、奇異變形菌(戶ro^i/s邁/ra6i72's)(26786，ATCC14153，27761，97656，71913)、普通變形菌(戶ro"i^^/7,/s)(讓Z13387，80196)、粘質沙雷氏菌(Serr"/a邁arcesc)(應Z30121)、摩氏摩根菌(脅g謹/7a露g頻7)(DSMZ6675，12615)、銅綠13假單胞菌(26178，12950，26535，68961，74352)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(i^e/2o^ro/7力o頂o/7as/z/s/f(/力/7/a)(DSMZ50170，26394，26396)、鮑氏不動桿菌(Jc/z"o6a"er6畫雄2'/)(應Z30007)、魯氏不動桿菌(JC2./"o6ac"r/fra/77/)(DSMZ2403，75496)、抗輻射不動桿菌(Jc/i7e勵a"err油'ores/"ei^)(應Z6976)、約氏不動桿菌(Jc/z2"幽"er，扁/7//)(應Z6963)、白色假絲酵母(Ca"d/cTaa76/ca/7"(ATCC10231，21179，27184,96917，96635)、近平滑假絲酵母(Cs/7cT/^s/ara;^/7(^")(4344)。在血流感染的情況下，這些病原體特別重要。根據優(yōu)選的實施方式，根據本發(fā)明的微陣列包含下述物種的至少10個不同物種，優(yōu)選至少15個不同物種，特別是至少20個不同物種的至少一種菌林大腸桿菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、克氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、奇異變形菌、普通變形菌、粘質沙雷氏菌、摩氏摩根菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、鮑氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、抗輻射不動桿菌、約氏不動桿菌、白色假絲酵母、近平滑假絲酵母。本發(fā)明微陣列的一個優(yōu)選實施方式包括多特異性的固定探針。根據本發(fā)明"多特異性的，，理解為結合多種可能存在于體液樣品中的微生物病原體的特異性。這意味著對多種病原體的擴增核酸而言可以得到單一探針的特異性結合。然而，鑒定對多種變形菌屬(Proteus)類型(例如奇異變形菌或普通變形菌)或多種不動桿菌屬(Acinetobacter)類型(例如鮑氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、抗輻射不動桿菌或約氏不動桿菌)具有特異性的核酸不認為是根據本發(fā)明"多特異性的"，只有例如特異性識別粘質沙雷氏菌和弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌，或大腸桿菌、奇異變形菌和粘質沙雷氏菌(然而每一種可能具有不同的強度)的探針被認為是根據本發(fā)明"多特異性的"。根據本發(fā)明的微陣列優(yōu)選包舍在表面上作為點的探針，優(yōu)選在每個點中只存在一種探針。本發(fā)明的探針是核酸分子，特別是與根據本發(fā)明所擴增的核酸結合的DNA分子，即，針對編碼16S或18SrRNA的病原體微生物DNA具有特異性。優(yōu)選地，所迷探針與擴增核酸的一部分結合，所述部分位于擴增反應的引物序列之間，因此僅擴增擴增產物的擴增部分而非引物序列。在該實施方案中，可以排除由于探針的引物結合所引起的假陽性信號的檢測風險。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的微陣列包含至少10種，優(yōu)選至少20種，更優(yōu)選至少30種，特別是至少40種多特異性固定探針。根據本發(fā)明的具體實施方式，微陣列優(yōu)選包含固定在微陣列上的探針總數的至少20%的多特異性探針，優(yōu)選至少40%的多特異性探針，特別是至少50。/。的多特異性探針的部分。根據本發(fā)明的優(yōu)選微陣列包含Seq.IDNos6至80所示的探針中的至少5個，優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少20個，甚至更優(yōu)選至少30個，特別是至少50個。優(yōu)選地，選擇所述探針以呈現至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，特別是至少98%的與微芯片上的敗血癥相關或懷疑與其相關(通過公認的醫(yī)學權威)的微生物病原體，特別是細菌病原體。優(yōu)選地，步驟e)的所述關聯(lián)通過使用經標記的核酸與固定在微陣列表面上的多特異性探針結合的信息來進行。該關聯(lián)可以通過計算機分析來進行。例如，通過使用加權錯配的推測雜交模式來進行步驟e)的關聯(lián)已經證明給出了本發(fā)明測試的極好結果。開發(fā)了提供統(tǒng)計學評價程序的原型軟件，允許在屬水平上10()0/。以及在種水平上96%的正確率。該自學軟件(如在本發(fā)明的實施例部分所描述的)可以在提供有病原體鑒定微陣列的全自動分析平臺上執(zhí)行。根據另一方面，本發(fā)明涉及如上定義的微陣列。微陣列(通常也稱為基因芯片、DNA芯片或生物芯片)是顯微鏡可見的DNA點的集合，所述點貼附于固體表面(例如玻璃、塑料或硅芯片)形成用于表達鐠目的的陣列，同時監(jiān)測大量擴增核酸的水平?？梢允褂貌煌夹g來制作微陣列，包括用尖頭針在玻璃片上印刷，使用預先做好的掩模的光刻法，使用動力微鏡設備的光刻法，噴墨印刷，或微電極陣列上的電化學法。微陣列包含大量固定的寡核苷酸分子，其在固體載體上以高密度提供。微陣列是以單一檢測步驟檢測數十、數百或甚至數千不同的根據本發(fā)明的擴增產物的高度有效的工具。所述微陣列通常在特別的微量滴定板中以玻片或刻板提供。在本領域現狀中，微陣列即可以定義為結合位點的微型化排列(即，材料，載體)也可以定義為包含微型化結合位點的載體(即，陣列)。這兩種定義都可應用于本發(fā)明的實施方式。對于這些定義的第一種，本發(fā)明優(yōu)選的實施方式是本發(fā)明寡核苷酸在微陣列中的微型化排列。在確保以高密度固定在固體栽體上的印刷設備的幫助下，所述寡核苷酸分子優(yōu)選固定在微陣列上。該微陣列在分析大量樣品時是特別有用的。根據本發(fā)明的微陣列通常指在表面的規(guī)定位置上以有序模式固定有探針的平面。根據備選實施方案，本發(fā)明提供體液樣品中微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供體液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)，并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，c)使在b)步驟中所擴增的核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA，d)使用檢測擴增核酸與固定探針的結合事件的微陣列裝置，通過檢測與微陣列特異性結合的擴增核酸來檢測擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的擴增核酸的結合與針對微生物DM的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定體液樣品中的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的編碼16S或18SrRNA。根據本發(fā)明的這種特異性備選方法，不需要標記擴增核酸，通過微陣列上特異性探針的雜交信號來檢測結合事件。根椐本領域可利用的常規(guī)技術，可以將其安排在微陣列上，使得可以分析每種探針或探16針的點是否產生了特異性結合(雜交)信號。在該特異性實施方式中，本發(fā)明的微陣列包含其他工具或設備，以檢測與微陣列表面上的探針或指定區(qū)域特異性結合的信號。這些設備包括計算機接口，例如以圖示法使結合事件可見，使得芯片(微陣列)上的結合事件可有效地相關聯(lián)以給出在本發(fā)明的步驟e)下合理的分析結果。尤其是，在血流感染的情況下，提供血液樣品中血流感染的微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供血液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，c)使在b)步驟中所擴增的核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述血流感染的微生物病原體的16S或18SrRNA，d)使用檢測擴增核酸與固定探針的結合事件的微陣列裝置，通過檢測與微陣列特異性結合的擴增核酸來檢測擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的擴增核酸的結合與針對微生物DNA的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定血液樣品中血流感染的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述血流感染的微生物病原體的16S或18SrRNA。在另一方法，本發(fā)明提供陰道液樣品中陰道病(也稱為陰道炎)的微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供陰道液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)并對編碼16S或18SrRNA的^t生物DM進行核酸擴增反應，c)使在b)步驟中所擴增的核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DM的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述陰道病的微生物病原體的16S或18SrRM，d)使用檢測擴增核酸與固定探針的結合事件的微陣列裝置，通過檢測與微陣列特異性結合的擴增核酸來檢測擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的擴增核酸的結合與針對微生物DM的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定血液樣品中血流感染的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述陰道病的微生物病原體的16S或18SrRNA。優(yōu)選待鑒定的陰道病病原體選自陰道加德納氏菌(&r^ere//ara^7刀s"s)、阿托波氏菌屬("o/7o6/咖)、動彎桿菌屬(#o62'/y/7cws)和擬桿菌屬(5ac^ero/cTe"。尤其是，固定探針選自下表4的SEQIDN0s81至138。健康的陰道通常含有許多微生物，常見的一些是巻曲乳桿菌(Zacfo6ac/7/i/51cr/s;a^s)和唐氏乳軒菌(^ac^6ac///〃^>/7"/727)。乳桿菌屬(Lsc&^3c/7/m)，特別是產生過氧化氬的物種，表現出幫助防止其他陰道微生物繁殖到引起癥狀的水平。涉及細菌性陰道病的微生物是非常多樣化的，但總是伴隨有標志物種之一，所述標志物種為陰道加德納氏菌、阿托波氏菌屬、動彎桿菌屬和擬桿菌屬?？赡苡煽股氐氖褂没騪H不平衡引起的正常細菌叢的改變，包括乳桿菌屬減少，允許具有更強抗性的細菌獲得據點并繁殖。隨即這些細菌產生影響身體自然防御并使健康細菌更難再移殖的毒素。在其他人病原體中，陰道病標記物種的存在可以通過使用DNA微陣列進行檢測，所述微陣列由物種特異性以及多特異性探針組成，所述多特異性探針在雜交后得到特征的信號模式?；谒龅慕y(tǒng)計學方法對雜交信號模式的評價允許明顯辨別感染物種以及標記物種。如本文所述實現數據庫的創(chuàng)建，其由分位數標準化信號強度和單一雜交的統(tǒng)計學分析組成(Sha等人(2005)J.CIin.Microbiol.，43，4607-4612，Donders等人(1998)N.Engl.J.Med.，338，1548，Donders(1999)Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.，83，1-4，Donders(1999)Infect.Dis.Obstet.Gynecol.，7，126-127)。根據另一實施方式，本發(fā)明涉及測試試劑盒，其包括用于血液樣品的沖羊品夾持工具(asampleholdingmeans)、才艮據本發(fā)明的孩i18陣列和任選地根據本發(fā)明進行擴增反應的引物。例如，根據本發(fā)明的測試試劑盒可以包括對擴增如上定義的病原體的編碼16S和18SrRNA的微生物DNA具有特異性的引物。根據另一實施方式，本發(fā)明還涉及根據本發(fā)明的陣列的用途或根據本發(fā)明的測試試劑盒，其用于鑒定血液樣品中血流感染的微生物病原體，特別用于監(jiān)測敗血癥患者或處于發(fā)展出敗血癥的風險中的患者的血液。在本發(fā)明所有方面的優(yōu)選實施方式中(包括所述微陣列用于本發(fā)明方法的用途)，例如，通過PCR和/或標記，例如，通過引物延伸的擴增用選自下述的聚合酶來進行棲熱菌屬(r/e/7z/M)的種(例如，7K生棲熱菌(r力er/z7^a《i/a〃ci/"、黃棲熱菌(77er邁"s/7aTOS)或嗜熱棲熱菌(7力er邁M^ei7Z7op力//^))聚合酶，例如Taq聚合酶I，特別是GoTa(f或FirePolDNA聚合酶。用這兩種優(yōu)化的聚合酶得到特別例外的結果。FirePol是熱穩(wěn)定的聚合酶并類似于具有3'向5'核酸外切酶活性的TaqDNA聚合酶I(98%的同源性)。與Taq聚合酶i相比，優(yōu)選聚合酶的溫度抗性增加，優(yōu)選增加至少rc、2'C、3。C、4'C、5。C或更多，和/或具有3'向核酸外切酶活性和/或沒有5'向3'核酸外切酶活性。特異性聚合酶例如描述于EP0745676Al或US5079352中。所述反應進一步優(yōu)選在pH為7和9之間，特別優(yōu)選大于8，最優(yōu)選在約8.5，例如8.2~8.7之間進行。Mg(例如以MgCl2形式)，例如可以以0.5mM~5raM之間，優(yōu)選在1mM和3mM之間，最優(yōu)選約為1.5inM的濃度存在于聚合酶反應中。在另一方面，本發(fā)明提供病原體的鑒定方法，其包括a)提供所檢測到的結合事件的信號數據矩陣，所述結合事件為病原體的核苷酸材料與對病原體具有特異性的探針的結合事件，b)對該矩陣進行分位數標準化，c)通過k-最近鄰(k-nearestneighbour)(■)方法對信號數據進行分類。使用KNN算法，所述信號數據通過其臨近數據的多數票來進行分類，使所述信號被歸類在其i個最近鄰中最共同的類，如Ripley(1996)"PatternRecognitionandNeuralNetworks",Cambridge和Venables等人(2002)，"ModernAppliedStatisticwithS."，4thEd.，Springer;QuantileNormalizationwasperformedaccordingtoBolstad等人，Bioinfo纖tics19(2)(2003)，185-193所述。優(yōu)選k為l，所述信號被簡單地歸類為其最近鄰那一類。尤其是，所述矩陣包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18或20種病原體的數據。優(yōu)選，對每一種待檢測的病原體，使用至少1種探針來產生信號。然而，還可以對每一病原體使用多種不同探針，例如2、3、4、5、6、7、8、IO種或更多。換句話說，在所述矩陣中存在結合事件的至少兩種信號數據。尤其是，如果使用多種探針，在所述方法，特別是分類步驟中使用檢測每種病原體的探針的信號數據的中值。所述分類器(classifier)優(yōu)選在步驟d)中通過交叉驗證法，特別是通過留一(leave-one-out)法進行驗證。交叉驗證是將數據矩陣劃分到子集中的統(tǒng)計學實踐，使得所述分析最初在單一子集上進行，而保留其他子集隨后用于確認和驗證最初分析。矩陣的初始子集被稱為訓練集而其他子集被稱為驗證集或測試集。伊述留一法包括使用來自所述矩陣的單一信號數據作為驗證數據，和剩下的信號作為訓練數據。對其進行重復，使得樣品中每一種信號數據都被用作驗證數據一次。優(yōu)選地，所述病原體的核酸材料是DNA或RNA，特別是16SrRNA或18SrRNA。優(yōu)選地，所述結合事件包括多特異性探針的數據，所述多特異性探針結合兩種或多種病原體，優(yōu)選血流感染的病原體或陰道液病原體。通過下述附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步說明，但不對其進行限制。圖1顯示系統(tǒng)樹，其基于通過鄰近相連法計算的在最新開發(fā)的微20陣列上顯現的微生物的16S和18SrRNA序列分析。圖2顯示推測所設計的微陣列探針的雜交行為的矩陣(水平繪制)。錯配的范圍用顏色進行編碼。初始文件包括約19.OOO個物種。圖2B顯示圖2的圖例加權錯配的色鍵。圖3顯示由探針和物種所列出的所有雜交實驗的正常信號強度。首先使用分位數標準化對原始信號值進行標準化，然后對重復點和重復雜交進行平均(為了更清楚呈現，將真實值除以1000)。5001-10000、10001-20000、和>20001的經背景校正的雜交信號，分別以黃色、橙色和紅色表示。低于5000的標準化值沒有用顏色進行調配。對于計算，使用絕對值無需限定引起低信號指示的閾值，甚至當GenePix軟件將信號標記為負時。根據16S和18SrRNA序列的親緣關系列出物種。通過物種特異性對探針進行分類。探針名稱的縮寫列于表3中。圖4顯示來自細菌細胞培養(yǎng)物的稀釋系列的PCR產物，其溶于1.5%的瓊脂糖膠中。從103細菌/試驗的初始計數開始可以檢測出條帶。圖5顯示最低稀釋步驟的圖，其中可以檢測到微陣列上的陽性信號。所述稀釋系列由來自大腸桿菌(圖5A)和金黃色葡萄球菌(圖5B、的純培養(yǎng)物制成。大腸桿菌(檢出限10細菌/試驗)顯示比金黃色葡萄球菌(檢出限103細菌/試驗)低得多的檢出限。紅色、藍色和和pr-FW和pr-FWT7為PCR擴增對照)。標記的靶衍生自圖4所示的PCR產物。圖6顯示病原體的不同平行鑒定的比較。在分級群聚后繪制熱圖(Heatmap)。將每種耙組合與在等價的實驗條件下的單一培養(yǎng)物的雜交結果進行比較。排對應于探針且柱對應于雜交。顏色對應于信號值。使得藍色顯示高的信號值和紅色顯示無信號值。圖7顯示分離自全血的大腸桿菌的雜交信號。雖然血液中存在人DM的大背景，但沒有觀察到干擾(藍色顯示非特異性信號)。特異性信號顯示為紅色的條并且陽性對照顯示為黃色的條。圖8顯示從摻入大腸桿菌和奇異變形菌的血液中分離細菌DNA，模擬多微生物感染。探針名稱的縮寫列于表3。紅色、藍色和黃色的條代表特異性和非特異性信號以及陽性對照。圖9顯示分位數標準化的影響。圖10顯示分級群聚后以熱圖表示的所有雜交實驗的結果。柱對應于探針，排對應于雜交。顏色對應于信號值。不同實驗的變化系數與標準化信號值的表一起給出。由于eco2探針的假陰性信號聚集大腸桿菌耙的一種雜交結果而與其他分離。然而，在鑒定過程中，這可通過秩變換和k最近鄰法避免，其仍給出正確結果。顯示雜交的所述排可以被歸類到所檢測到的微生物(從上到下)大腸桿菌(35次)、克氏檸檬酸桿菌(8次)、白色假絲酵母(8次)、近平滑假絲酵母(4次)、白色假絲酵母(2次)、大腸桿菌(l次)、嗜麥芽窄食單孢菌(7次)、銅綠假單胞菌(ll次)、金黃色葡萄球菌(20次)、表皮葡萄球菌(12次)、化膿鏈球菌(IO次)、肺炎鏈球菌(5次)、產酸克雷伯氏菌(IO次)、陰溝腸桿菌(ll次)、肺炎克雷伯氏菌(4次)、產氣腸桿菌(11次)、肺炎克雷伯氏菌(8次)、摩氏摩根菌(6次)、弗氏檸檬酸桿菌(9次)、粘質沙雷氏菌(5次)、肺炎克雷伯氏菌(2次)、奇異變形菌(9次)、普通變形菌(4次)、奇異變形菌(4次)、普通變形菌(l次)、奇異變形菌(2次)、普通變形菌(1次)、奇異變形菌(1次)、糞腸球菌(12次)、屎腸球菌(3次)、魯氏不動桿菌(3次)、約氏不動桿菌(3次)、魯氏不動桿菌(1次)、鮑氏不動桿菌(3次)、抗輻射不動桿菌(4次)、鮑氏不動桿菌(1次)。實施例實施例1:樣品-參考林在本研究中測試的所有參考菌林來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)或"DeutscheSammlungfiirMikroorganismenundZellkultur"(DSMZ)。除了參考菌林外，還用臨床分離物測試了探針特異性和靈敏度，所述分離物已經通過經典微生物方法進行鑒定。對于長時間保存，在-80X:下以50%的甘油儲液保存所有的細菌林。對大多數實驗而言，使用一定數量細菌/ml的純培養(yǎng)物，其通過于37'C下在Caso肉湯中培養(yǎng)各種微生物過夜，并最后使用McFarlandstandard#0.5調節(jié)微生物濃度/ral來得到。對下述細菌進行微陣列測試大腸桿菌(ATCC35218，EC5，EC17,81617，68933，68307)、產氣腸桿菌(DSMZ30053，12676)、陰溝腸桿菌(26385，79232，93840，12720，74892)、肺炎克雷伯氏菌(25809，85813，26385，13253)、產酸克雷伯氏菌(26785，26384，73739,26786，96633)、克氏檸檬酸桿菌(DSMZ4595)、弗氏檸檬酸桿菌(80324，73489)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538，ATCC25923，ATCC29213，83799，82913，7323712998)、表皮葡萄球菌(ATCC14990，73711，35989，80320，13000，77504，79510)、糞腸球菌(ATCC29212，EF4，81239,83776，27520)、屎腸球菌(DSMZ20477)、肺炎鏈球菌(DSMZ25500)、化膿鏈球菌(ATCC19615，10388)、奇異變形菌(26786，ATCC14153，27761，97656，71913)、普通變形菌(DSMZ13387，80196)、粘質沙雷氏菌(DSMZ30121)、摩氏摩根菌(DSMZ6675，12615)、銅綠假單胞菌(26178,12950，26535，68961，74352)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(DSMZ50170，26394，26396)、鮑氏不動桿菌(DSMZ30007)、魯氏不動桿菌(DSMZ2403，75496)、抗輻射不動桿菌(DSMZ6976)、約氏不動桿菌(DSMZ6963)、白色假絲酵母(ATCC10231，21179，2718496917，96635)、近平滑假絲酵母(4344)。實施例2:寡核苷酸探針的設計用ARB軟件包進行探針設計和分析(Ludwig等人，2004)。從NCBI主頁(www.ncbi.nlm.ni-h.gov)的GenBank下載所選擇的病原體細菌和酵母的核糖體DM(rDM)序列，并將其上載到ARB軟件包以創(chuàng)建包括超過27，000個16SrDM序列同時也超過7，000個18SrDNA序列的數據庫以檢測與真核序列的可能錯配。23在將新序列與預先存在的數據庫進行比對后，使用鄰近相連法計算系統(tǒng)樹(參見圖1)。使用探針設計函數(包括可變參數設定，例如探針長度(20個堿基)、最大非組命中率(maxira簡謹grouphits)、G+C含量、解鏈溫度和最小發(fā)夾環(huán))，根據ARB軟件的結果，設計物種和所選屬的探針。用軟件"01igo"測試探針序列的雙鏈和發(fā)夾的形成以及解鏈溫度。在其解鏈溫度下，首先通過刪除或添加堿基來改變不配對的序列。用ARB中的探針配對函數檢查最終探針序列。生物序列與任何單一探針配對產生的每一個雜交表用作Calc01igo(www,calcoligo.org)的輸入4言息、，Calc01igo為用于力口4又錯酉己{十算的軟件。根據實驗確定的公式對錯配進行加權(參見表1和表2)。表1:與序列中錯配位置相關的錯配加權。在第一位置的單一錯配加權為0.3，而在中心位置的錯配最高加權為1.2。5'—位1234N3210.30.61.01.21.21.10.80.3表2:由于錯配堿基類型引起的錯配加權。探針上腺噤呤與靶序列上胞嘧啶的錯配加權為0.4，而相同探針與靶序列中的鳥嘌呤的錯配加權為1.2。:針靶探針輩巴探針靶探針靶A-A1,0G-A1.0C_A0.7T-C1.0一C0.4一G1.0-C1.0-G1.0—G1.2—T1.0-T1.0—T1.0對每種探針的單一錯配進行加和以產生每一個物種的總加權值。排列這些值以產生雜交矩陣，然后在電子數據表中列表(關于該雜交矩陣的最終結果，參見圖2)。24由于假絲酵母屬的臨床相關性，也考慮將它們用于檢測，例外地用它們的18SrRNA序列。所述樹(參見圖1)進一步顯示革蘭氏陽性球菌屬(cocc/m.)和革蘭氏陰性細菌的明顯差異。腸桿菌科(^^ero6ac"r/aceae)家族的成員在樹的頂部形成一個孤立的組，表示與其他物種沒有關系以及強的內部序列類似度。在該組中，單一物種彼此緊密相關，使得充分鑒定屬于該組的細菌相對困難。探針序列基于幾個在ARB數據庫中挑選的個別序列為所選物種設計探針。使用arb軟件包設計所有96種不同的DM探針的全部。從probeBase網站(www.microbial-ecology,net/probebase/)下載其他探針(LoyA.等人，2003)。用于該研究的rDNA探針列于表3和4中。表3:在血流病原體研究中使用的探針的列表，包括其核苷酸序列和一些特征?？s寫Ab:不^^麥^、Cb:^裙^并^^<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例3:微陣列的制備寡核苷酸探針來自VBCGenomics(奧地利)。在每一個寡核苷酸的5'端加入5個胸腺嘧啶殘基作為間隔分子。為了確保與微陣列表面(CSS-IOOSilylatedSlides,CelAssociates,USA)上反應性醛基團的共價連接，探針為5'氨基修飾的。通過接觸式排列儀(contactarrayer)(0mnigrid，GeneMachines),以不同濃度(在3xSSC和1.5M—水合甜茱堿中50|aM，20uM和10uM)將探針印刷到硅烷化的載玻片上，同時調節(jié)空氣濕度為55和60%之間。每個微陣列印刷每種探針的6個副本。用SMP3針(TeleChem，USA)進行點樣，得到100jjm直徑的點大小。實施例4:耙的制備DNA分離通過無菌抽取到10mlK3E小管(BDVacutainerSystems,UK)中采集血液樣品。將細菌摻入到血液中，通過使用McFarlandstandard#0.5調節(jié)合適的密度，并轉移該恰當體積或稀釋到10ml全血中。為了分離白細胞，進行過濾步驟。細菌透過過濾器。如果不進行過濾，備選地應用下述Percoll步驟。對于最初的血細胞裂解，加入3mlTris-EDTA，pH8(10mMTris，1mMEDTA),混合并在10000g下離心10分鐘。重復該步驟以獲得重懸浮于生理NaCl中的小丸粒并小心轉移至Percoll(AmersharaBiosciences)溶液的頂部。根據制造商的說明書，將Percoll的物理密度調節(jié)至1.05g/cm3。在1500g下進行密度離心20分鐘。棄去上清液并用生理NaCl洗滌丸粒以除去殘余的Percoll。剩下的丸粒重懸浮于50jnl的蒸餾水中，并通過將懸30浮液加熱至95t:持續(xù)15分鐘來完成細胞裂解。通過在10000g下離心IO分鐘得到DM懸浮液，并將上清液轉移到新的小管中。DNA擴增使用正向引物27T7(5'-TAATACGACTCACTATAGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG;SEQIDNo.1)和反相引物1492(-TACGGYTACCTTGTTACGACTT;SEQIDNo.2)(VBCGenomics,Austria)(在PCR混合物中0.3nM)對16SrRNA基因進行PCR擴增(Gutenberger等人，1991)。在其5'端含有T7啟動子位點的正向引物(5'-TAATACGACTCACTATAG-3';SEQIDNO.3)，其使用PCR產物作為不同標記方法直接比較的模板實現T7RM聚合酶對體外轉錄的介導(Bodrossy等人，2003)。通過用引物CanFW(5'-TCCGCAGGTTCACCTAC;SEQIDNo.4)和CanRev(5'-CAAGTCTGGTGCCAGCA;SEQIDNo.5)預先擴增18SrRNA基因來鑒定假絲酵母物種(White等人，1990)。在10ml全血中的細菌用作優(yōu)化產生全長16SrRNA擴增子的靶scenario,用分離自1ml血液的細菌DM,通過變化不同組分的濃度并加入PCR增強子來優(yōu)化PCR的效率。對于25PCR反應混合物的優(yōu)化條件為3UTaqDNA聚合酶(Invitrogen，California)、2.5ul10xPCR-緩沖溶液、2mMMgCl2、10。/o甘油和0.5%甜菜堿。備選應用的PCRMastermixes為1.25UGoTaqDNA聚合酶(GoTaqFlexi艦-聚合酶，PromegaCorporation)、ImMMgCL2、5jil5xGoTaq-PCR-緩沖溶液、最終PCR濃度為0.5mM的每一種dNTP(ATP、GTP、CTP和TTP)和各自在PCR中的最終PCR-濃度為0.3nM的正向-和反向-引物。還備選的Mastermix為1.25UFirePolDNA聚合酶I(SolisBiodyne)、2mMMgCL2、2.5jnl10xGoTaq-PCR-緩沖溶液、最終PCR濃度為0.5mM的每一種dNTP(ATP、GTP、CTP和TTP)和各自在PCR中的最終PCR-濃度為0.15nM的正向-和反向-引物。PCR循環(huán)包括在95。C下持續(xù)5分鐘的初始變性步驟，然后40個在95'C下持續(xù)30秒、在55。C下持續(xù)1分鐘和在72'C下持續(xù)1分鐘的循環(huán)。溫度循環(huán)中止于在72'C下持續(xù)IO分鐘，然后在4'C下儲存直到下一次使用。成功的擴增通過將PCR產物溶于1.5%瓊脂糖膠(SeaKem，Biozym)來證實，所述瓊脂糖膠含有溶于TBE緩沖溶液(0.1MTris，90mM硼酸，1mMEDTA)的溴化乙錠(Invitrogen，UK)。擴增產物可以直接標記或在引物延伸PCR中標記。對于直接標記步驟，可以使用6nmolCy5-dCTP(AmershamBiosciences,UK)或使用0.3nMCy3端標記引物/反應混合物。對不同的標記方案(例如引物延伸、體外轉錄、生物素-鏈親合素-標記、基于Klenow片段的等溫標記，或使用5'端標記的引物的直接PCR標記)進行優(yōu)化和比較。無需PCR產物的純化也可以獲得好的結果。引物延伸的方法顯示好的靈敏度和特異性，并因此用作標準方法。在引物延伸反應混合物中使用6ja1的PCR產物用于標記，其含有0.9mM正向引物27、1.5UVent(exo)聚合酶(NewEnglandBiolabs，UK)、3mMMgS04和50的dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及25juMCy5-dCTP。所述反應混合物循環(huán)25次于95C、60。C和72'C下各20秒，然后在72。C下進行最終延伸步驟5分鐘。在進行溫度循環(huán)之前于95'C下孵育3分鐘。實施例5:雜交在雜交之前，所述微陣列玻片在室溫下用封閉緩沖溶液(氰硼氫化物緩沖溶液20mMNa2HP04，10mMNaH2P04，200mMNaCl，50mMNaBH3CN)預處理30分鐘，以使玻片表面上的反應基團失活。將雜交混合物調節(jié)到在24p1的經擴增和標記的DNA反應混合物中4xSSC、0.1%SDS的終濃度。將22iu1的總體積轉移到蓋玻片上(22x22mm)并將其施用到微陣列表面。在65。C下，在飽和蒸汽室中實現雜交1小時。在2xSSC和0.1%SDS中洗滌玻片5分鐘，然后在320.2xSSC中洗涂2分鐘并在0.lxSSC中洗滌1分鐘。通過在900g下離心2分鐘來干燥玻片。實施例6:信號檢測和數據分析對于每一個玻片，在相同的光電倍增器(650pmt)的激光功率和靈敏度水平下，用AxonGenepix4000A微陣列掃描儀器(Axon,USA)在lOjam的分辨率下掃描玻片。因此，可以直接比較獨立實驗的絕對和相對信號強度。使用Genepix軟件分析所獲得的圖象并將所得的gpr-文件用于進一步分析。統(tǒng)計學評價在R(www,r-project.org)中使用limma、affy、stats和class軟件包進行數據分析。數據集由在病原體鑒定微陣列的3種不同布局(layout)上的241雜交組成。不同的布局共享76種探針；在分析中使用這些。忽略所有其他探針。每一種病原體由不同序列的2-5種不同探針表示。為了增加牢固度，每種探針在陣列上點樣6次。每一種雜交由一個gpr文件表示，所有的gpr文件在R中共同儲存為RGList對象。使用來自affy軟件包的分位數標準化對信號進行標準化。將6個重復點的中值用于監(jiān)視型(supervised)k-最近鄰(k-l)分類法。在留一交叉驗證法中驗證分類器。(根據Ripley(1996)"PatternRecognitionandNeuralNetworks",CambridgeandVenables等人(2002)，"ModernAppliedStatisticwithS."，4thEd.，Springer進行KNN;根據Bolstad等人，Bioin-formatics19(2)(2003)，185-193進行分位數標準化)標準化標準化是所有微陣列試驗的一個重要方面。通常，其需要一組探針，所述探針預期在所有雜交中給出恒定信號。在本組實驗中，這是不可行的。因此，基于這樣一個假定(即，每個陣列應該具有許多給33出陽性信號(對應于樣品中存在病原體)的探針且其余的探針給出低信號(或沒有)信號)，來選擇分位數標準化方法。該算法是陣列間的標準化方法，所述方法通過用所有陣列的最高信號的平均值來代替每個陣列的最高信號，然后通過用所有第二高信號的平均值來代替笫二高信號等。在致密區(qū)中，通過推移每一個致密區(qū)以匹配所有陣列的平均密度。實施例7:電腦模擬雜交矩陣用ARB軟件包和Calc01igo軟件中的探針匹配函數(ProbeMatchfunction)來產生雜交矩陣。每種探針的模型雜交行為(圖2)良好地與真實的實驗數據符合。由于每個成員高度保守的16SrRNA序列，可預期腸桿菌科家族中的交叉雜交，其導致在預測的雜交矩陣中引起強的群聚(clustering)。其他物種的探針應該導致特異性信號。尤其是，預期革蘭氏陽性物種給出物種特異性信號。與此相反，在檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬組中的革蘭氏陰性菌顯示較低的特異性雜交。然而，甚至這些個別物種最終也能被來自多種探針的多特異性信號模式鑒定。毫無疑問所有其他革蘭氏陰性菌將在物種水平上被區(qū)分。假絲酵母屬的18SrRNA探針對細菌物種沒有顯示非特異性信號并在物種間提供良好的區(qū)分。預測的雜交值可以通過實驗數據驗證。實施例8:特異性在圖3中總結了241個雜交實驗的標準化信號值。觀察到的雜交值在6個重復點中和在不同試驗中顯示低的變異系數(CV)。所有特異性信號的CV對于80%的探針而言為2.4%~64.1%。實驗結果與由ARB和Calc01igo軟件預測的雜交行為密切相關(與圖2的比較顯示類似的雜交強度)。如根據Calc01igo分析所預期的，個別探針的交叉雜交發(fā)生在腸桿菌科家族內，特別是在克雷伯氏菌屬-腸桿菌屬-檸檬酸桿菌屬的組中。然而，特異性信號模式可被歸屬到每一個物種，34實現物種水平上的培養(yǎng)物鑒定。實施例9:靈敏度用摻雜的血液樣品和純培養(yǎng)物(使用從108~10°細菌/1111的稀釋系列，所述細菌來自所選的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌物種)來評估細菌檢出限(L0D)。由于血液成分的PCR干擾，在純培養(yǎng)物中的檢出限比摻雜血液中的低。發(fā)現由純培養(yǎng)物進行PCR來擴增DNA(低至103細胞/試驗)，在1.5%瓊脂糖膠上得到明顯可見的條帶(參見圖4)?；谖㈥嚵械蔫b定比所證實的瓊脂糖膠評價靈敏100倍。對于大腸桿菌，可以獲得特異性和可繁殖的信號低至10細菌/試驗。分析葡萄球菌培養(yǎng)物顯示在革蘭氏陽性菌組中最高的檢出限為必需約103細胞/試驗才能在微陣列上看到信號(參見圖5)。靈敏度的差異可以歸因于效率較低的細胞裂解，其由持久的細胞壁的存在或葡萄球菌蛋白組學中熱穩(wěn)定DNAse的存在引起(Heininger等人，20(H)。然而，所述工具的預期用途要求快速和可靠的方法，其迫切要求時間、適用性和靈敏度之間的折衷。該方案通過采用不同的細胞裂解步驟或額外的酶處理能進一步改善檢出限。實施例10:病原體的平行檢測如實施例4所述調節(jié)細菌懸浮液密度，并將等量的懸浮液加入到單一物種和兩個物種實驗中。將不同林的組合的雜交結果與單一林的雜交結果比較。顯示在相同的細菌負載下，信號強度是類似的，與單一物種或多個物種的組合無關。多種微生物試驗產生顯示單一物種雜交的復合信號的信號模式(參見圖6)。由于這些結果，在多種微生物感染中明顯區(qū)分物種是可能的?；趽诫s血液進行一些實驗，證實了純培養(yǎng)物的結果(圖8)。實施例11:血液樣品分離物的雜交用分離自血液樣品的細菌DNA來優(yōu)化PCR和標記方案以降低血液組分的干擾。雖然存在大量殘留的人DNA，甘油和甜菜堿的加入降低PCR和標記步驟中的非特異性擴增。通過這種方式，特異性PCR產物的產率還明顯增加，導致與培養(yǎng)的微生物相當的特異性。觀察到由人DNA引起的非交叉-雜交(圖7)。如上面已經描述的，通過檢測模擬多種微生物感染的單一微生物的組合得到類似結果。所獲得的信號模式對于所加入的菌林具有與來自單一微陣列雜交的那些一樣的特異性(圖8)。通過提供在10ml摻雜血液中的IO倍稀釋系列來確定該方法的靈敏度。發(fā)現檢出限在全血樣品中低至10細菌/ml。然而，如用純培養(yǎng)物觀察到的，革蘭氏陽性菌的靈敏度高得多，例如，對于金黃色葡萄球菌而言為107ml血液。實施例12:假絲酵母存在于微陣列上的微生物探針包括四種靼向18SrRNA基因的假絲酵母屬特異性探針。圖3已經顯示了與細菌靶序列的低交叉-雜交，表明假絲酵母探針極高的特異性。白色假絲酵母靶的非特異性信號應答獲自魯氏不動桿菌探針。近平滑假絲酵母顯示與spn3探針的低雜交，所述探針對肺炎鏈球菌具有特異性。以類似的靈敏度水平，還將細菌的優(yōu)化方案應用于假絲酵母屬。為了優(yōu)化兩個引物對的PCR，16SrRNA引物的濃度應該是相對于18SrRM引物的三倍。實施例13:分類圖9顯示雜交以及探針的明顯的簇(cluster)。雖然每種探針被設計為與一種特異性病原體結合，熱圖顯示一些探針非常特異于一個物種而其他探針產生較寬范圍的不同生物的信號，且一些探針完全不顯示任何特異性信號。經典的方法將是評價所有雜交的每種探針集并確定信號閥值，例如通過ROC分析(Bilban等人，2002)以區(qū)分正信號和負信號。然而，由于一些探針在物種間或甚至在屬間顯示交叉-雜交，這不僅引起特異性問題，還意味著在交叉-雜交模式中包含的信息的損失。通過與已知生物雜交的類似性，使用機器改進方法(amachinelearningapproach)對雜交模式進行分類。使用k-最近鄰(k-l)方法并在留一交叉-驗證法中進行驗證。在屬水平上，所有241個雜交被正確分類且96.7%的雜交在種水平上正確分類。結論性說明所陳述的鑒定血源性病原體的微陣列是第一分子診斷工具，其能鑒定寬范圍的臨床相關細菌和酵母，所述細菌和酵母直接來自合適時間內的血液。PCR擴增與微陣列雜交的結合呈現了強有力的病原體鑒定工具。其在速度上優(yōu)于常規(guī)技術，且在極高的特異性下進行。在實現比表型方法更強，重復性更高，和更準確的測試之前已經報道了16SrRM基因的分析(Clarridge,2004)。arb軟件包分析超過27.000個序列，以計算所選物種的雜交行為。預測值和實驗值顯示高的相關性。平行于16SrRNA靶向探針對23SrRNA基因進行測試。由于較大的序列數據庫，相對于23SrRNA更偏好16SrRNA基因。通過在標記前引入DNA擴增步驟來增強靈敏度。擴增和標記方案的選擇對靈敏度具有高的影響，雖然僅引起特異性的微小變化。微陣列的雜交導致靈敏度比直接擴增的靶檢測高約100倍。標準的臨床鑒定方法需要2天并且對于難培養(yǎng)的微生物高至5天。基于微陣列的系統(tǒng)實現微生物快速和準確的鑒定。本方案從取血樣到分析軟件顯示結果在6小時內完成。毛細管PCR或微型PCR設備大大降低目前約為2.5小時的PCR循環(huán)時間，所述設備允許PCR在不到20分鐘內完成?；贒NA的方法實現對靜息細胞或甚至基因組降解前的死細胞的檢測，例如在施用抗生素的情況下，當沒有觀察到培養(yǎng)物中進一步生長時(Heininger等人，1999)。應用supervisedk-最近鄰(k-l)分類法，在屬水平上正確識別37所有測試的細菌和酵母以及在種水平上正確識別96%的細菌和酵母。在奇異變形菌和普通變形菌以及抗輻射不動桿菌和鮑氏不動桿菌情況下，高的16SrDNA序列類似性引起誤分類。到目前為止，大多數公布的方法僅識別腸桿菌科家族或不同革蘭氏陽性屬(如葡萄狀球菌和鏈球菌)的從屬(affiliation)。此外，還沒有公布同時鑒定細菌和酵母的技術(Shang等人，.2005;Jordan等人，2005;Kempf等人，2000;Jansen等人，2000;JordanandDurso，細5)。所有血流感染的7%為多種微生物的(Henry等人，1983)。多種微生物的信號模式可以根據單一微生物信號來解釋。信號強度與單一感染的強度相等。探針板對所有隨機選擇的雙細菌組合具有特異性。未摻雜的血液的陰性對照給出陰性PCR擴增和雜交結果。這證實在健康人血液中不存在多形性細菌或細菌DNA(McLaughlin等人，2002;Nikkari等人，2001)。來自純培養(yǎng)物的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢出限分別為10和103細菌/測試。其他細菌物種的檢出限(LOD)為102和103之間。顯示來自純培養(yǎng)物的靈敏度較高的公布數據，通?；贒NA濃度的稀釋以及擴增小得多的靶序列，其只提供確定細菌存在的可能(Wilson等人，2002)。對于摻雜的血液，發(fā)現本發(fā)明的方案和微陣列的LOD為10~105細菌/ml血液。然而，與純的培養(yǎng)物相比，摻雜的血液樣品較高的LOD可能由血液中的PCR抑制成分引起(Al-Soud等人，2000，2001)。額外的DNA純化能降低這些抑制劑的量，但高含量的殘留DNA仍然導致難以獲得較低的L0D。公布的大多數基于微陣列技術的鑒定方法，沒有對LOD進行估計。對血液樣品靈敏度的說明通?；赑CR和RT-PCR實驗。此處LOD范圍為40~2000CFU/ml摻雜血液，盡管考慮靜息細菌可能增加這些數量。對于標準的16SrRNAPCR，大腸桿菌的LOD為10Vml血液，金黃色葡萄球菌的LOD為10Vml血液。然而，這些試驗僅在于證實血液38中存在細菌而不是鑒定(JordanandDurso，2005;Heininger等人，2004)。可以將有希望增加強度并進一步降低微陣列分析L0D的不同方法應用于該測試。例如，已經提議使用連續(xù)和不連續(xù)的旋轉微反應室(Vanderhoeven等人,2005;Peplies等人，2003;Liu等人，2001;Francois等人，2003)。建立用作應用統(tǒng)計方法的分類器的數據庫。評價執(zhí)行模式識別和及其改進算法。k-最近鄰法在完全自動的平臺內完成準確鑒定。此外，軟件包正在開發(fā)中，其包括連續(xù)添加單一探針、個別物種、物種組或甚至整個分類器的交換的機動性。因為降低了由假陰性信號或交叉雜交引起的誤譯的可能性(特別是對于變形菌和不動桿菌物種)，分類器的擴大通過添加進一步雜交結果來來增加鑒定特異性。所述軟件將允許全自動處理來自genepix軟件的gpr文件并將找回屬和種名。此外，根據對周期性更新的抗生素抗性信息的統(tǒng)計學評估來推薦合適的抗生素治療。在本實施例中，一種基于DM鑒定臨床相關病原體的快速和靈敏的方法，所述病原體引起血流感染。由于本結果，該微陣列的靈敏度是能在低至10細菌/ml的濃度下鑒定病原體。根據信號模式的分析，所述特異性在屬水平上確定為100%,在種水平上高于96%。這顯示基于16SrRNA標記基因的鑒定工具展示為一個用于常規(guī)臨床實驗的有力方法。與標準方法相比，使用血液培養(yǎng)物，可以在6小時內進行微陣列鑒定，且還考慮了多微生物感染。此外，可識別的生物的數量能容易地通過新病原體得到延伸。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式提供多特異性探針，其特異性地鑒定Enteroceae家族內l個以上的物種，特別是特異性鑒定腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和檸檬酸桿菌屬的探針。權利要求1.體液樣品中微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供體液樣品，b)裂解所述微生物病原體并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，其中或其后對所擴增的核酸進行標記，c)使在b)步驟中經標記的擴增核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA，d)通過檢測與微陣列特異性結合的經標記的擴增核酸來檢測經標記的擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的經標記的擴增核酸的結合與針對微生物DNA的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定體液樣品中的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA。2.根據權利要求1的方法，其特征在于通過PCR反應對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行所述核酸擴增反應。3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于用編碼16S或18SrRNA的微生物DNA的通用引物對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行所述核酸擴增反應，所述通用引物優(yōu)選不超過8個(4個正向、4個反向)引物，更優(yōu)選不超過6個(3個正向、3個反向)引物，優(yōu)選不超過4個(2個正向、2個反向)引物。4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其特征在于用Seq.IDNos.1、2、4和5所示的引物，優(yōu)選用GoTa(f或FirePolDNA聚合酶對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行所述核酸擴增反應。5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其特征在于在步驟a)和步驟b)之間進行過濾步驟，其中所述樣品通過過濾器進行過濾，所述過濾器將白細胞保留在所述體液樣品，優(yōu)選血液樣品中但不保留微生物病原體。6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其特征在于所述微生物病原體是人病原體。7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其特征在于所述核酸的標記過程通過引物延伸、體外轉錄、生物素-鏈親合素-標記、基于Klenow片段的等溫標記或直接核酸擴增標記，優(yōu)選通過直接PCR標記來進行。8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其特征在于在核酸擴增反應后將所述擴增的標記核酸直接應用于微陣列，無需純化或洗滌步驟。9.根據權利要求1-8中任一項的方法，其特征在于所述微陣列包含針對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA來自下述微生物病原體中的至少10種，優(yōu)選至少15種，特別是至少20種大腸桿菌(腸力er/c力2.ac。//)(ATCC35218,EC5，EC17，81617，68933，68307)、產氣腸桿菌(紐er由"eraer,腳)(應Z30053，12676)、陰溝腸桿菌(i"i^ero6a"er"oacae)(26385,79232，93840，12720，74892)、肺炎克雷伯氏菌(J/由/e/7ap扁細/ae)(25809，85813，26385，13253)、產酸克雷伯氏菌(i7e^/e7/ac/"ca)(26785，26384，73739，26786,96633)、克氏檸檬酸桿菌(C7"o6ac^erirweW)(DSMZ4595)、弗氏檸檬酸桿菌(。7ro6a"erZVewKf//)(80324，73489)、金黃色葡萄球菌(&a/7力/7ococci^awrew"(ATCC6538，ATCC25923，ATCC29213，83799，82913，73237，12998)、表皮葡萄球菌(57aMr7,c面ep油r/z7油、)(ATCC14990，73711,35989，80320，13000，77504，79510)、糞腸球菌(f雄a/")(ATCC29212，EF4，81239，83776，27520)、屎腸球菌(射er卿c面尸aec/"邁)(應Z20477)、肺炎鏈球菌(S"一歸c禱p扁麵/ae)(應Z25500)、化膿鏈球菌(5Yre;^ococci^/7/oge/7es)(ATCC19615，10388)、奇異變形菌(/VWei^/H/i^W/")(26786，ATCC14153，27761，97656，71913)、普通變形菌ra/,/s)(DSMZ13387，80196)、粘質沙雷氏菌(Sem".a邁arce/2S)(DSMZ30121)、摩氏摩根菌(for^g/e"a忠or^3/7/2')(DSMZ6675，12615)、銅綠假單胞菌(Ae油細a"er"g/應a)(26178，12950，26535，68961，74352)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單另包菌(5Ye/ofro/7力(M70/23S/z7s7fo;7力j7/a)(DSMZ50170，,26394，26396)、鮑氏不動桿菌(Jc/i3"o&"er6麵s鹿7)(DSMZ30007)、魯氏不動桿菌(Jc/力e她Wer細/*/7/)(DSMZ2403，75496)、抗輻射不動桿菌(Jc//7"o6a"errad/ores2'"e/^)(應Z6976)、約氏不動桿菌(Jc//2"o6a"eryo力謂///)(DSMZ6963)、白色假絲酵母(Ca/7&afl/62.ca力s)(ATCC10231，21179，27184，96917，96635)、近平滑假絲酵母(Ca/Kf/cTa,，//o""(4344)。10.根據權利要求9的方法，其特征在于所述微陣列包含下列物種中的至少10個不同物種，優(yōu)選至少15個不同物種，特別是至少20個不同物種的至少一種菌林大腸桿菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、克氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、奇異變形菌、普通變形菌、粘質沙雷氏菌、摩氏摩根菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、鮑氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、抗輻射不動桿菌、約氏不動桿菌、白色假絲酵母、近平滑假絲酵母。11.根據權利要求1-10中任一項的方法，其特征在于所述微陣列包含多特異性的固定探針。12.根據權利要求1-11中任一項的方法，其特征在于所述微陣列包含至少10種，優(yōu)選至少20種，更優(yōu)選至少30種，特別是至少40種多特異性的固定探針。13.根據權利要求1-12中任一項的方法，其特征在于至少20%,優(yōu)選至少40%，特別是至少50%固定在微陣列上的探針是多特異性探針。14.根據權利要求1-13中任一項的方法，其特征在于步驟e)的針結合的信息來進;。、、15.根據權利要求14的方法，其特征在于步驟e)的所迷關聯(lián)通過使用加權錯配的推測雜交模式來進行。16.根據權利要求1-15中任一項的方法，其特征在于所述微陣列包含Seq.IDNos6至80所示的探針中的至少5種，優(yōu)選至少10種，更優(yōu)選至少20種，甚至更優(yōu)選至少30種，特別是至少50種。17.根據權利要求1-16中任一項的方法，其特征在于選擇微陣列上的探針以呈現至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，特別是至少98%的與敗血癥相關或懷疑與其相關的微生物病原體，特別是細菌病原體。18.根據權利要求1-17中任一項的方法，其特征在于所述微生物病原體是血流感染的且所述體液樣品是血液樣品。19.根據權利要求1-16中任一項的方法，其特征在于所述病原體是陰道病病原體，并且所述體液樣品是陰道液樣品。20.根據權利要求19的方法，其特征在于所述微陣列包含Seq.IDNos81至138所示的探針中的至少5種，優(yōu)選至少10種，更優(yōu)選至少20種，甚至更優(yōu)選至少30種，特別是至少50種。21.根據權利要求19或20的方法，其特征在于所述微陣列包含針對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA來自下述微生物病原體中的至少l種，優(yōu)選至少2種，特別是至少3種陰道加德納氏菌(Gardnerellavaginalis)、阿托波氏菌屬(Atopobium)、動彎桿菌屬(Mobil腦us)和擬桿菌屬(Bacteroides)。22.體液樣品中微生物病原體的鑒定方法，其包括下述步驟a)提供體液樣品(懷疑其含有所述微生物病原體)，b)裂解所述微生物病原體(如果存在的話)，并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，c)使b)步驟的擴增核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上含有針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA，d)使用檢測擴增核酸與固定探針的結合事件的微陣列裝置，通過檢測與微陣列特異性結合的擴增核酸來檢測擴增核酸的一種或多種與探針的結合，和e)通過使所檢測到的擴增核酸的結合與針對微生物DM的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定體液樣品中的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA。23.根據權利要求22的方法，其特征在于應用如權利要求2-21中任一項所定義的具體實施方式，除了應用未標記的核酸代替經標記的擴增核酸之外。24.如權利要求1和9-23中任一項所定義的微陣列。25.測試試劑盒，其包括用于血液樣品的樣品夾持工具、根據權利要求24的微陣列、和任選地如權利要求1-4中任一項所定義的引物。26.根據權利要求25的測試試劑盒，其特征在于其包含針對擴增如權利要求1、9、10、18、19或21中任一項所定義的病原體的編碼16S和18SrRNA的微生物DM具有特異性的引物。27.根據權利要求24的微陣列或者根據權利要求25或26的測試試劑盒的用途，取決于權利要求18，用于鑒定血液樣品中血流感染的微生物病原體，特別用于監(jiān)測敗血癥患者或處于發(fā)展出敗血癥的風險中的患者的血液。28.根據權利要求24的微陣列或者根據權利要求25或26的測試試劑盒的用途，取決于權利要求19，用于鑒定陰道液樣品中陰道病的微生物病原體。29.病原體的鑒定方法，其包括a)提供所檢測到的結合事件的信號數據矩陣，所述結合事件為病原體的核苷酸材料，優(yōu)選病原體的DM或RM,特別是16SrRM或18SrRNA與對病原體具有特異性的探針的結合事件，b)對該矩陣進行分位數標準化，c)通過k-最近鄰算法對信號數據進行分類，其中優(yōu)選k-l。30.根據權利要求29的方法，其特征在于所述矩陣包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18或20種病原體的信號數據。31.根據權利要求29或20的方法，其特征在于在矩陣中存在結合事件的至少兩種信號數據，優(yōu)選3、4、5或6種。32.根據權利要求29-31中任一項的方法，其特征在于所述分類在步驟d)中通過交叉驗證方法，特別是通過留一法進行驗證。全文摘要公開了一種鑒定體液樣品中微生物病原體的方法，其包括下述步驟a)提供體液樣品；b)裂解微生物病原體并對編碼16S或18SrRNA的微生物DNA進行核酸擴增反應，其中或其后對所擴增的核酸進行標記；c)使在b)步驟中經標記的擴增核酸與微陣列接觸，所述微陣列在微陣列表面的規(guī)定區(qū)域上包含針對微生物DNA的固定探針，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA；d)通過檢測與微陣列特異性結合的經標記的擴增核酸來檢測經標記的擴增核酸的一種或多種與探針的結合；和e)通過使所檢測到的經標記的擴增核酸的結合與針對微生物DNA的固定探針的規(guī)定區(qū)域相關聯(lián)來鑒定體液樣品中的微生物病原體，所述微生物DNA編碼來自所述微生物病原體的16S或18SrRNA。文檔編號C12Q1/68GK101501219SQ200780029365公開日2009年8月5日申請日期2007年7月5日優(yōu)先權日2006年7月5日發(fā)明者C·內哈默爾,H·維辛格梅爾,L·博羅賽,R·皮希勒申請人:奧地利研究中心有限公司