專利名稱：：分離hiv-1蛋白酶抑制劑的體系和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明至少涉及細胞生物學、分子生物學和醫(yī)學領(lǐng)域，特別涉及治療HIV/AIDS的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：HIV/AIDS依然是不可治愈的疾病，威脅全球數(shù)百萬人的生命。雞尾酒療法，一般也稱HAART或ART,是目前可以使患者的HIV-1降低到能夠檢測出的水平之下的最為成功的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。典型的ART療法需要聯(lián)合使用一個HIV-1蛋白酶抑制劑(HIV-1PI)和兩個HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。在兩類抗-HIV治療藥物中，HIV-1PI是最有效的病毒抑制劑，其單獨使用也能使病毒減少2-3個數(shù)量級。HIV蛋白酶是產(chǎn)生病毒感染力的根本，它能將病毒多聚前體蛋白切割成活性病毒酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶)和結(jié)構(gòu)蛋白。因此，HIV-1蛋白酶被用來生產(chǎn)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和酶，并且對于感染性病毒粒子的成熟也是必須的。目前，獲得美國FDA批準的PI—共有8個，所有的這些PI都屬于與蛋白酶的活性位點結(jié)合的競爭性抑制劑，事實上，這其中的許多PI都是設(shè)計成能夠與蛋白酶的活性位點結(jié)構(gòu)的匹配。PI與蛋白酶的活性位點的結(jié)合阻止蛋白酶切割病毒前體聚合多肽，因而阻斷了隨后的病毒成熟。ART療法面臨的主要問題之一是病毒會快速對藥物產(chǎn)生抗性，病毒的PI抗性一般是由于蛋白酶基因內(nèi)逐步累積的突變而出現(xiàn)，并且這種抗性增長迅速。ART治療失敗經(jīng)常是多抗藥性導(dǎo)致，即蛋白酶變得對使用的多數(shù)或全部PI有抗性，這瞀示我們HIV多抗藥性最終有可能超過目前我們所能獲得的PI數(shù)量。因而，目前急切需要開發(fā)其他能夠?qū)τ锌顾幮缘牡鞍酌妇哂兴幮У腜I。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明主要涉及一種與HIV治療藥物的篩選和使用有關(guān)的體系、方法和藥物組合物。特別是，發(fā)明人在本領(lǐng)域取得了一定的進步，使得篩選HIV-1蛋白酶抑制劑的標準方法得以發(fā)展和利用，當然這個方法也可以替換成HIV-2蛋白酶抑制劑的篩選方法。在本申請文件給出的第一個實施方案中，裂殖酵母因其內(nèi)的蛋白酶基因高水平表達而致死，這一發(fā)現(xiàn)為鑒別蛋白酶抑制劑提供了基礎(chǔ)，當?shù)鞍酌富虮磉_時，可以通過蛋白酶抑制劑具有的使細胞存活生長的能力而將其分離出來。在本發(fā)明的一些具體的實施方案中，提供了基于細胞的標準篩選方法，該方法可以鑒別出能同時抑制野生型和具有抗性的蛋白酶的化合物。這些新的抑制劑在某些情況下可能不會與活性位點結(jié)合，因此為我們揭示了抑制蛋白酶活性的新途徑，即通過耙向蛋白酶的其他區(qū)域和功能區(qū)。具體地，本發(fā)明可以在用于篩選HIV-1蛋白酶的廣譜抑制劑的全自動髙通量分子篩選(HTS)方法中采用一些基于裂殖酵母細胞的測試。更具體地，這些測試可以使用96孔板模式和比較小型化的模式。更具體地，蛋白酶活性的檢測可以采用吸光率檢測細胞密度，或者也可以采用熒光檢測細胞活性，如可以將熒光檢測作為進一步的確證實驗。在其他的或替代的實施方案中，采用對GFP-底物-Vpr融合蛋白進行綠色熒光重定位來作為檢測蛋白酶活性的反向篩選試驗。更具體地，這三種檢測方法可以被應(yīng)用到HTS模式中和/或利用一些潛在的抑制劑文庫，例如Sigma的LOPAC1280化合物文庫。本發(fā)明的某些內(nèi)容中，還提供了在幾個水平上來篩選鑒定蛋白酶抑制劑的方法。例如，當?shù)鞍酌富虮磉_時，將細胞活性作為篩選指標來篩選鑒別一些能夠使細胞繼續(xù)存活生長的蛋白酶抑制劑?；诹硪凰降暮Y選方法，使用體外酶法測定蛋白酶活性的方法來篩選蛋白酶抑制劑，這一方法可以與細胞活性測定方法聯(lián)合使用，也可以替代細胞活性測定方法，例如酶解蛋白酶底物。雖然在一般的實施方案中酶切位點可以是任何HIV-1能夠酶切的合適位點，但在特定的實施方案中，酶切位點序列可以優(yōu)選SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示序列。7在另一個實施方案中，采用體外測定蛋白酶活性的方法，蛋白酶活性通過綠色熒光蛋白(GFP)在細胞中定位來測定。這測定方法提供了一個半定量測定細胞內(nèi)蛋白酶總活性的方法，能夠用于對蛋白酶的底物特異性進行定性。就本發(fā)明的不少實施方案來說，例如，分離抑制劑一方面可以去掉因同源重組而缺失表達基因的細胞的背景。例如，將對抗生素(如G418)具有抗性的多聚核苷酸與蛋白酶多聚核苷酸連接，這些失去蛋白酶基因的細胞能很容易地被鑒別出來且在蛋白酶抑制劑篩選中被去除。這一手段將基因缺失導(dǎo)致的背景降到非常低的水平，以至于它不再能明顯干擾蛋白酶抑制劑的篩選。發(fā)明人將本發(fā)明的一個標準篩選方法，即將具有低背景和成功應(yīng)用過的程序，應(yīng)用到篩選裂殖酵母基因組文庫的方法中，鑒別出了hhp2基因為裂殖酵母的一個蛋白酶抑制劑?，F(xiàn)有技術(shù)中，沒有任何關(guān)于hhp2和HIV-l蛋白酶基因之間關(guān)系或者抑制機制可以被定性的報道。因此，hhp2多聚核苷酸是一個新的標準抑制機制，這個發(fā)現(xiàn)也為研究抑制HIV-1蛋白酶提供了新的策略。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種鑒別HIV蛋白酶抑制劑的方法，該方法包括以下步驟首先提供一種酵母細胞，所述的酵母細胞內(nèi)包含有由編碼HIV蛋白酶的基因序列組成的多聚核苷酸；然后將所述的多聚核苷酸置入候選試劑中；再評估以下的其中一項或兩項指標1)所述的酵母細胞的細胞活性和/或生長情況；其中，與缺少候選試劑的情況下的細胞進行對比，在所述的候選試劑存在的情況下細胞能夠存活的，所述的候選試劑為HIV蛋白酶抑制劑；2)HIV蛋白酶底物的酶切效果，其中能夠阻止底物被酶切的候選試劑為HIV蛋白酶抑制劑。更具體地，HIV蛋白酶為HIV-1蛋白酶或HIV-2蛋白酶。在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，HIV蛋白酶的表達受到過表達調(diào)控序列的調(diào)節(jié)。更進一步地，這些抑制劑可以是多肽、多聚核苷酸、小分子、抗體，或者以上多種物質(zhì)的混合物或組合物。酵母細胞優(yōu)選裂殖酵母，例如粟酒裂殖酵母。在本發(fā)明的特定實施方案中，多聚核苷酸被整合到酵母基因組中。過表達調(diào)控序列可以選擇nmll過表達調(diào)控序列、adhl調(diào)控序列、fbpl調(diào)控序列、invl調(diào)控序列，或者在某些情形下也可以是ctr4調(diào)控序列。多聚核苷酸可以進一步優(yōu)選包含至少一個能夠在細胞活性測試中減少背景生長信號的片段。在特定的實施方式中，減少背景的組分可以為標記物，例如可以為對抗生素具有抗性的標記物、對G418或潮霉素具有抗性的標記物、營養(yǎng)標記物、也可以選自adel、ade6、arg3、CAN1、his3、his7、leul、leu2、sup3-5、ura3和ura3。在某些具體實施方式中，HIV蛋白酶為人HIV蛋白酶，HIV蛋白酶底物為人HIV蛋白酶底物。更具體地，評估HIV蛋白酶底物的酶切效果可以為評估由第一多肽片段和第二多肽片段組成多肽的酶切效果，其中HIV蛋白酶的酶切位點位于所述的第一多肽片段和第二多肽片段之間。一方面，第一多肽片段中可以為可探測的標記，另一方面，第二多肽片段可以為HIV蛋白酶的底物，例如HIV-1Vpr多肽。具體地，酶切位點為DSQNYPIVQ(參見SEQIDNO:3)、DSFNSTQIT(參見SEQIDNO:4)、VSQNYPIVQN(參見SEQIDNO:8)、KARVLAEAMS(參見SEQIDNO:9)、SATIMMQRGN(參見SEQIDNO:10)、RPGNFLQSRP(參見SEQIDNO:ll)、VSPNFPQITL(參見SEQIDNO:12)、CTLNFPISPI(參見SEQIDNO:13)、GAETFYVDG(參見SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(參見SEQIDNO:15)。優(yōu)選地，可探測的標記可以是綠色熒光蛋白、翠綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白或者青色熒光蛋白。優(yōu)選地，該方法還可以進一步包括將治療有效劑量的所述抑制劑輸送到感染HIV病毒或者患有AIDS的個體的步驟。另外優(yōu)選地，該方法也還進一步包括將有效劑量的所述抑制劑輸送到可能感染HIV病毒或可能患上AIDS的個體來作為預(yù)防的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種治療感染HIV病毒或患AIDS的個體，該方法包括將治療有效劑量的包含有hhp2的藥物組合物輸送到患者體內(nèi)的步驟。具體地，hhp2是一種多聚核苷酸，優(yōu)選編碼hhp2多肽的多聚核苷酸。序列表中如SEQIDNO:16所示(GenBankAccessionNo.U10864)提供了粟酒裂殖酵母的hhp2多聚核苷酸的標準序列。粟酒裂殖酵母hhp2多肽的標準序列參見序列表中SEQIDNO:17(GenBankAccessionNo.AAA21545)所示。從蛋白序列和結(jié)構(gòu)來看，裂殖酵母hhp2與人類酪蛋白激酶1(CKl)同源；CKl多聚核苷酸的標準序列參見序列表SEQIDNO:18(GenBankAccseeionNo.X80693),CKl多肽的標準序列參見序列表SEQIDNO:19(GenBankAccessionNo.CAA56710)。本發(fā)明的藥物組合物，如用于治療HIV或AIDS的藥劑具有HIV-1和/或HIV-2蛋白酶抑制劑功能，例如其序列可能為序列表SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或者SEQIDNO:19所示，或者這些藥物組合物中包含有與序列表SEQIDNO:169或SEQIDNO:17所示序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的相似性的分子。在本發(fā)明的一個特定實施方式中，提供了一種包含有編碼HIV蛋白酶的多聚核苷酸的酵母細胞。具體地，HIV蛋白酶可以優(yōu)選HIV-1蛋白酶或者HIV-2蛋白酶。具體地，可以優(yōu)選其表達受到過表達調(diào)控序列的控制的多聚核苷酸。再進一步地，多聚核苷酸可以為標記物，例如對抗生素具有抗性的標記物，進一步優(yōu)選營養(yǎng)標記物。另一方面，酵母細胞內(nèi)也可以進一步包含有由編碼第一多肽片段的第一序列和編碼第二多肽片段的第二序列組成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位點位于第一多肽片段和第二多肽片段之間。更進一步地，第一多肽片段中包含有可檢測的標記，例如綠色熒光蛋白、翠綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白或者青色熒光蛋白；第二多肽片段也可以優(yōu)選HIV-1的Vpr多肽。另外，酵母細胞可以是酵母細胞培養(yǎng)物或者酵母細胞克隆。在本發(fā)明的一個補充實施方案中，提供了治療和/或預(yù)防感染HIV和/或患上AIDS的藥物組合物試劑盒，該試劑盒中包含有裝在合適的容器中的編碼hhp2的多聚核苷酸或hhp2多肽。具體地，該試劑盒還可以進一步包含藥學上可以接受的賦型劑。本發(fā)明的另一個具體的補充實施方案中，提供了用于篩選一個或多個HIV蛋白酶抑制劑的試劑盒，該試劑盒中包含有本發(fā)明的酵母細胞。更具體地，本發(fā)明的酵母細胞還可以進一步包含有由編碼第一多肽片段的第一序列和編碼第二多肽片段的第二序列組成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位點位于第一多肽片段和第二多肽片段之間。上述內(nèi)容已經(jīng)列出了本發(fā)明的足夠多的技術(shù)特征以及技術(shù)進步，能夠幫助理解下面的本發(fā)明詳細說明。本發(fā)明的其他的技術(shù)特征以及技術(shù)進步將會在下文中介紹，這些也成為本發(fā)明權(quán)利要求書中的要求保護的主題。凡根據(jù)本發(fā)明申請文件中提供的發(fā)明構(gòu)思和具體實施方式所作的等效變化或修飾，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的；同樣的，凡是屬于本發(fā)明的精神實質(zhì)和權(quán)利要求書所確定的范圍的等同發(fā)明也是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。為了讓本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明的發(fā)明點、本發(fā)明的組成和實施方法、以及進一步改進的技術(shù)方案和技術(shù)進步，下面將結(jié)合具體實施方式和附圖對本發(fā)明進行詳細的說明。然而，提供的具體實施方式和附圖內(nèi)容只為解釋和說明本發(fā)明，并不能視為對本發(fā)明保護范圍的限制。為了更好的理解本發(fā)明，下面列出作為參考。圖1示出了在髙背景下篩選抑制劑時，通過同源重組去除整合酶基因；圖2表明蛋白酶附近的卡那霉素抗性基因，用于鑒別同源重組導(dǎo)致的缺失。圖3示出了通過同源重組整合進入iimtl位置的質(zhì)粒；圖4示出了分離的兩株G418抗性菌株，當?shù)鞍酌副磉_時它們的生長被強烈抑制；圖5闡明誘導(dǎo)平板上未形成克隆的細胞；圖6，蛋白酶表達被抑制后失去活性；圖7,使用GFP-Vpr融合蛋白重定位監(jiān)測蛋白酶活性；圖8，HIV-1蛋白酶不影響GFP的定位；圖9,蛋白酶沒有使GFP-Vpr重新定位到細胞質(zhì)；圖10，蛋白酶使GFP-SLMa-Vpr中的GFP再次定位到細胞質(zhì)；圖11,蛋白酶使GFP-SLp6-Vpr中的GFP再次定位到細胞質(zhì)；圖12,蛋白酶沒有使GFP-SLA-Vpr中的GFP再次定位到細胞質(zhì)；圖13，與PrliitB菌株相比，PrliitBG418抗性菌株生長受到抑制；圖14,盡管nmtl啟動子不同，兩典型菌株都有單個質(zhì)粒整合進入iimtl位點；圖15,以GFP百分比(GFP%)的方式反映蛋白酶活性；圖16，印地那韋(indinavir)蛋白酶對生長的作用；圖17,印地那韋(indinavir)阻止GFP-SLp6-Vpr中的GFP重新定位于細胞質(zhì)圖18,隨著印地那韋(indinavir)濃度的增加，GFP減少；圖19,印地那韋(indinavir)促進克隆斑形成；圖20，1000個細胞中只有1個可以在誘導(dǎo)平板上形成克隆；圖21，誘導(dǎo)平板上的大多數(shù)克隆缺少卡那霉素抗性；圖22,對G418復(fù)制子來源的克隆重新測試，表明大多數(shù)有蛋白酶基因；圖23,使用PrIndA菌株進行蛋白酶抑制劑的低背景篩選；圖24，背景舉例，包括G418抗性和在T平板上的猛烈生長；圖25,T培養(yǎng)基上的快速生長與質(zhì)粒無關(guān)；圖26,誘導(dǎo)平板上生長的背景菌株和正常菌株均的蛋白酶基因均有移碼突變；圖27,弱抑制劑質(zhì)粒的分離；圖28，依賴于質(zhì)粒的弱抑制；圖29,在大腸桿菌復(fù)活后，一個典型質(zhì)粒(pPS3-3)并沒有像其他的一樣進行重測；圖30，ll個復(fù)活質(zhì)粒中的IO個重新檢測，為生長的弱抑制劑；圖31，ll個復(fù)活質(zhì)粒中的IO個重新檢測為增加細胞活性的弱抑制劑；圖32，10個典型的抑制劑質(zhì)粒都含有hhp2基因。發(fā)明詳細說明I.定義為了與長期以來一直存在的專利法慣例保持一致，本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中使用的英文詞匯"a"和"an"表示"一個或多個"。本發(fā)明的一些實施方式中可能包含或本來就包含了一個或多個組分、步驟和/或方法。本申請文件中所提供的任何方法或組合物也可以替換成本領(lǐng)域技術(shù)人員所能夠想到的其他方法或組合物。II.本發(fā)明的具體實施說明HIV/AIDS是全球最具威脅性的疾病之一，2005年大約有4000萬人感染或攜帶HIV，每年約有400萬新感染者。在美國，HIV是25到44歲成年人的第二大殺手。HIV-1蛋白酶是最清楚的最成功的治療HIV感染的藥物靶標。蛋白酶產(chǎn)生于一個非活性的Gag-Pol前體聚合蛋白，在翻譯過程中移碼閱讀產(chǎn)生。蛋白酶在聚合蛋白的9處切割蛋白，釋放出感染性病毒組裝所必需的包括完全活性蛋白酶在內(nèi)的各種蛋白。既然蛋白酶作用過程是產(chǎn)生病毒粒子的重要步驟，蛋白酶成了抗HIV藥物的主要耙點，蛋白酶抑制劑(PI)是抗HIV治療的主要策略。單獨使用PI能夠使病毒數(shù)量降低2-3個數(shù)量級，聯(lián)合其他抗病毒藥物使用能夠?qū)⒉《舅浇档偷綑z測不到的水平。目前使用PI的一個問題是諸如髙脂血癥等副作用。另一個嚴重的問題是，長時間使用PI因其病毒多抗藥性。這些抗性突變的一些事PI特異性的，但是PI治療過程中病人蛋白12酶多個突變聚集導(dǎo)致多數(shù)甚至所有PI抗藥性(Palmer,Shafer和Merigan，1999;Vickrey等，2003)。交叉抗性產(chǎn)生頻率比預(yù)期更髙，致使任何可獲得的PI治療失敗(Palmer,Shafer和Merigan,1999)。例如，MDR769蛋白酶是從一個治療失敗的病人中分離的，除了對印地那韋有14倍的抗性外，對所有已獲批準的PI均有40倍的抗性(Logsdon等，2004)。這些治療過程中蛋白酶多耐藥性的產(chǎn)生是PI對HIV感染最終失去治療效果的主要原因，產(chǎn)生了HIV多抗藥性增長速度超過目前所能獲得的PI數(shù)量。因此，亟需針對抗藥性蛋白酶開發(fā)新的活性PI。因此，新的副作用小的PI能夠治療HIV-1感染，并作用于對已有PI具有抗性的蛋白酶。利用裂殖酵母進行新的PI篩選的細胞篩選系統(tǒng)具有兩個優(yōu)點。首先，細胞系統(tǒng)具有明顯優(yōu)勢，毒性化合物不能穿過細胞膜而被排除在外，而細胞內(nèi)的活性化合物檢測呈陽性。其次，篩選的化合物抑制蛋白酶活性而與它們是否與酶的活性位點結(jié)合無關(guān)。2005年FDA批準的所有PI均與蛋白酶的活性位點結(jié)合，它們的開發(fā)依賴于活性位點結(jié)構(gòu)細節(jié)信息。這樣一種篩選程序有可能發(fā)現(xiàn)針對蛋白酶其它區(qū)域和結(jié)構(gòu)域的抑制劑。例如，一個抑制蛋白酶活性的新的機制是針對26S蛋白酶體降解，這只有通過細胞篩選系統(tǒng)才能夠檢測到。作為新合成的非正確折疊蛋白質(zhì)或活性蛋白降解產(chǎn)物的未折疊蛋白，經(jīng)常通過26S蛋白酶體酶解(Wolf和Hilt，2004)。一個短時阻止新合成蛋白酶折疊的化合物可以被26S蛋白酶體降解，但是這樣的化合物無法通過無細胞的篩選系統(tǒng)檢測，因為它不存在新合成的蛋白酶和蛋白酶體。在這個例子中，需要重點指出的是，在裂殖酵母和人體細胞中有大量的類似26S蛋白酶的降解途徑(Parodi,1999),這一類似性含有許多其它的基本細胞過程(Zhao和Elder,2000;Zhao和Lieberman,1995)。因而，化合物需要細胞活性過程，裂殖酵母細胞是一個很好的開發(fā)細胞為基礎(chǔ)的化合物篩選系統(tǒng)，篩選出的化合物可用于人類。在此，發(fā)明人開發(fā)了一個裂殖酵母系統(tǒng)，通過誘導(dǎo)HIV-1蛋白酶基因表達使細胞死亡。除了影響細胞生長和活性，該發(fā)明提供了一項測定酵母細胞內(nèi)蛋白酶活性的測試，該測試能夠利用GFP的綠色熒光進行從細胞核到整個細胞范圍的重定位來表明蛋白酶活性。PI印地那韋在細胞內(nèi)抑制蛋白酶，這可以通過其對細胞生長的效應(yīng)和GFP的重定位試驗反映。裂殖酵母系統(tǒng)的三項顯示讀數(shù)可以用于開發(fā)髙通量篩選(HTS)系統(tǒng)。此外，利用突變，蛋白酶抗13性基因用于HTS系統(tǒng)使篩選的化合物有針對野生性和突變的蛋白酶的廣譜活性。這樣篩選鑒定的化合物能夠開發(fā)為目前治療方案失敗的病人中發(fā)現(xiàn)的抗性蛋白酶。至少本發(fā)明的某些方面考慮到了抗蛋白酶的抑制劑包括，例如針對HIV-1蛋白酶或者HIV-2蛋白酶，或者同時針對兩者。另外，裂殖酵母系統(tǒng)允許在細胞內(nèi)快速高通量篩選抗蛋白酶試劑。由于這一新建立的細胞系統(tǒng)與傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)設(shè)計有內(nèi)在不同，使用這一新的系統(tǒng)篩選抗PR藥物，至少提供了一種抗HIV治療的方案。IE.HIV-1蛋白酶蛋白酶是將蛋白質(zhì)切成組分多肽的一種酶。當"多聚體蛋白"被剪切后產(chǎn)生成熟病毒的活性蛋白成分，這些蛋白構(gòu)成人類免疫缺陷病毒(HIV)。HIV-1蛋白酶是一個剪切病毒復(fù)制過程中新生多聚蛋白的天冬氨酸蛋白酶。HIV-1蛋白酶(PR)水解病毒多聚蛋白形成對病毒裝配和活性具重要作用的功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可以促進病毒從宿主細胞出芽形成病毒粒子的成熟過程。PR是同源二聚體，每個單體由99個氨基酸構(gòu)成，構(gòu)象也一樣，N末端為脯氨酸Pro，C末端為苯丙氨酸Phe?；钚缘鞍酌傅拿總€單體位置呈中心對稱排列，其二級結(jié)構(gòu)包含一個《-螺旋和兩個反向平行的P片層。除了依靠非共價相互作用穩(wěn)定二聚體外，側(cè)鏈的疏水相互作用以及每個單體疏水核心的催化殘基、脂肪族氨基酸殘基都起到了重要作用。每一單體包含兩個半胱氨酸殘基，但并不參與形成二硫鍵。在二聚體界面處形成活性位點，通過作為四個來回的P折疊一部分的兩個結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生的裂縫形成，其位置處于接近分子的中心處?；钚晕稽c被一個擴展的轉(zhuǎn)角、一個P發(fā)卡環(huán)和一個卩片層覆蓋。這一片狀結(jié)構(gòu)從46位的苯丙氨酸(Met)—直到55位的賴氨酸(Lys),具有類似鉸鏈運動似的靈活性，通過開關(guān)進入疏水區(qū)域的末端促進底物達到活性部位，以此發(fā)揮PR活性的核心作用。PR呈橢圓形并相對扁平，在中空的裂縫中有幾個潛在的結(jié)合區(qū)域。蛋白酶催化的蛋白鏈的剪切是活性位點25位并列的兩個天門冬氨酸(Asp-25)介導(dǎo)的，這兩個天門冬氨酸形成一個"催化二聚體"。兩個羧基其中一個pKa值低于尋常為3.3,另一個為常規(guī)的5.3。這一催化二聚體經(jīng)常與酰氨基相互作用并被剪切成多肽底物。本發(fā)明的一些具體情形下，HIV-1蛋白酶是指人類HIV-1蛋白酶，而進一步的HIV-1蛋白酶多聚核苷酸序列是指SEQIDNO:l序列，多肽序列是指SEQIDNO:2序列。同樣，本發(fā)明的一些具體情形下，HIV-2蛋白酶是指人類HIV-2蛋白酶，HIV-2蛋白酶多肽序列是指SEQIDNO:5(GenBankAccessionNo.2MIPC,gi:443404)序列，HIV-2蛋白酶多聚核苷酸序列是指SEQIDNO:6序列。其他情形下，國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫GenBank中AccessionNo.S42993,gi:354697;SEQIDNO:7的HIV-1病毒感染因子(vif)也被應(yīng)用。在替代方案中，從此處提供的各自序列來看，HIV-1蛋白酶或HIV-2蛋白酶有一個或多個序列的變化，只要蛋白酶在酵母細胞過量表達，細胞將會死亡。本發(fā)明中所用的序列與此處提供的序列至少有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的一致性。目前的HIV-1蛋白酶抑制劑包括，例如Invirase(甲磺酸沙奎那韋，saquinavirmesylate;其化學名為N-叔丁基-D氫化-2-[2(R)-羥基-4-苯甲基-3(S)-[[N-(2-喹啉基甲?；?墨D-天門冬酰胺I氨基丁基]-(4AS，8AS)-異喹啉-3(S)-C甲酰氨甲磺酸；N-tert-butyl-decahydro-2-[2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-[[N-(2-quinolylcarbonyl)-D畫asparaginyl]amino]butyl]國(4aS，8aS)-isoquinoline誦3(S)-carboxamide),分子式為C38H5()N605,CH403S，分子量為766.96，其中自由基的分子量670.86;這些抑制劑在美國專利No.6,043,357中有敘述；法定的發(fā)明注冊號為H1649;還包括諸如利托那韋(Ritonavir,Norvir),安普那韋(Amprenavir),阿扎那韋(Atazanavir,ATV)，福沙普利那韋(Fosamprenavir),印地那韋(Indinavir),洛匹那韋(Lopinavir),替拉那韋(Tipranavir)，萘非那韋(Nelfinavir,Viracept)等。本發(fā)明鑒別的蛋白酶抑制劑可用于代替一個或者多個目前已知的HIV-1蛋白酶抑制劑，或者作為已有蛋白酶抑制劑的補充。IV.HIV-1蛋白酶抑制劑候選藥物在本發(fā)明的某些方面，使用的鑒定一個HIV-1蛋白酶抑制劑的篩選方法是直接鑒別HIV-1蛋白酶抑制因子的。只要是能夠抑制過量表達HIV-1蛋白酶酵母細胞的死亡，這些抑制劑可以是任何類型的。在一些替代方法中，可以鑒別較弱的抑制劑，例如通過至少一次的選擇生長較慢的菌落。在特定情形下，HIV-1蛋白酶抑制劑可以是一個或多個蛋白、多肽、肽段、抗體、DNA和/或RNA寡聚核苷酸、小分子、合成化合物、天然化合物等。抑制劑也可以從其他類似分子文庫中篩選，例如，可以利用候選藥物調(diào)節(jié)器文庫，包括多種有機體，如粟酒裂殖酵母和釀酒酵母，人類，小鼠，老鼠，真菌，果蠅，線蟲，擬南芥，紅鰭東方豚等。當然，有時候也用小分子文庫替代。一個例子是從一株或多株植物收集分子，文庫中所用的典型植物也包括中國的藥草。文庫也包括干擾RNA，例如包括RNAi,siRNA和shRNA。在某些方面，小分子文基于已知的蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)選擇，包括抑制的HIV-1和/或HIV-2抑制劑。V.酵母酵母是單細胞真菌，細胞調(diào)控機制與人類細胞非常類似，其精確分類是一門依賴于細胞、孢子和菌落形態(tài)特征的領(lǐng)域，也包括生理學特征。另一個更顯著的特征是將糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的能力。芽殖酵母屬于子囊菌門半子囊菌綱，真核酵母分為兩個主要的酵母菌目。酵母雜自然界分布廣泛，經(jīng)常在植物葉和花、土壤和鹽水中發(fā)現(xiàn)，也存作為一種共生或寄生方式在于恒溫動物的皮膚表面和內(nèi)臟。酵母單細胞繁殖的方式包括出芽(例如酵母目)或者直接分裂(裂殖，例如裂殖酵母菌)，或者它們簡單的以不規(guī)則的絲狀(菌絲體)生長。大多數(shù)形成子囊的酵母有性生殖方式中，至少包含八個以上的單個孢子，這些孢子可以與核融合并通過營養(yǎng)分裂倍增，或者有些酵母可與其它孢子融合。本項發(fā)明使用的酵母細胞，不僅限于酵母目(例如釀酒酵母；啤酒酵母)、裂殖酵母(如粟酒裂殖酵母)、畢赤氏酵母(如巴斯德畢赤酵母)、漢森酵母(如甲基營養(yǎng)酵母)、克魯維酵母(如乳酸克魯維酵母)和耶氏酵母(如解脂耶氏酵母)。本發(fā)明的某些特定方面使用的是粟酒裂殖酵母。酵母遺傳學的發(fā)展壯大部分歸因于粟酒裂殖酵母基因組表型產(chǎn)生基因區(qū)域的快速繪圖能力。粟酒裂殖酵母已經(jīng)成為許多分子遺傳學研究的模式系統(tǒng)。A.酵母細胞培養(yǎng)一些酵母種類復(fù)制速度和細菌一樣快，基因組大小只有不到哺乳動物的1%。它們可以被進行快速的分子遺傳學操作，其基因可以被刪除、替換或者16改變。它們也擁有非常規(guī)的單倍體增殖方式，細胞內(nèi)每個基因只有單一拷貝，這使得分離和研究某個基因的失活突變變得容易，也避免了細胞內(nèi)憂另一基因拷貝的復(fù)雜性。酵母菌的培養(yǎng)包括單個酵母細胞的分離、酵母培養(yǎng)和酵母的繁殖，直到獲得足夠數(shù)量的培養(yǎng)物。純的酵母培養(yǎng)物來源很多，例如可以購買商業(yè)化產(chǎn)品或者通過培養(yǎng)收集。收集純培養(yǎng)物有各種流程，包括從單個菌落、單個細胞或分離細胞和菌落的混合物開始培養(yǎng)。繁殖的目標是在盡量短的時間內(nèi)獲得大量的性能明確的酵母，一種方法是成批量的繁殖系統(tǒng)，即利用幾毫升的培養(yǎng)逐步放大直到獲得所需量的酵母，放大過程中加入活性強的生長細胞提供新鮮的營養(yǎng)，使酵母在最佳的生理狀態(tài)下拷貝復(fù)制。B.酵母啟動子在某些方面，一個調(diào)控區(qū)域指的是一個啟動子，用于促進HIV蛋白酶的表達而使細胞死亡。啟動子可能位于與蛋白酶多聚核苷酸操作有關(guān)的質(zhì)粒(或其他載體)上，也可能位于酵母基因組內(nèi)。啟動子可以是過量表達的，可誘導(dǎo)的或者組成性表達的。因此，包含HIV-1蛋白酶的表達結(jié)構(gòu)含有一個調(diào)控序列，調(diào)節(jié)HIV-1蛋白酶的表達到促使細胞死亡的水平。例如，調(diào)控序列可能促使HIV-1蛋白酶過量表達而殺死酵母細胞。其他情形下，調(diào)控序列可以被誘導(dǎo)，例如通過直接誘導(dǎo)HIV-1蛋白酶表達并暴露于特定的培養(yǎng)基中。Gal1和Gal10便是這類啟動子，可以通過半乳糖誘導(dǎo)。通過這樣的基因的開或關(guān)來改變表達經(jīng)常是值得的，因為這使得研究人員可以根據(jù)時間來調(diào)節(jié)表達。一些情形下，酵母細胞是裂殖酵母細胞，裂殖酵母的典型啟動子包括adhl+(組成性高表達)，fbpl+(碳源誘導(dǎo)反應(yīng))，基于CaMV啟動子的四環(huán)素抑制系統(tǒng)和目前最經(jīng)常使用的iuntl+(在硫胺中無信號)啟動子。nmtl+啟動子有三個版本全力啟動子和兩個在抑制和誘導(dǎo)條件下都弱化的版本。在nmt載體的REP/RIP系列中游擊個不同的聚合接頭，可以通過調(diào)節(jié)硫胺的濃度來部分激活。充分誘導(dǎo)無硫胺。充分抑制20pM的硫胺(5fig/ml)。部分誘導(dǎo)(如參考文獻所述)0.05fiM硫胺(0.016fig/ml)。iimtl啟動子不會完全關(guān)閉，構(gòu)建一個"切斷"質(zhì)粒的能力極大依賴于被表17達的蛋白質(zhì)和細胞對特定蛋白劑量的靈敏度。許多nmtl控制表達的基因即使在硫胺存在的情況下也可以通過最弱的啟動子得到補充，但也有許多基因被成功關(guān)閉得到無義表型的例子。因此，必須根據(jù)每個基因具體情況經(jīng)驗性的確定如何利用這類啟動子進行質(zhì)粒關(guān)閉實驗。其它對條件性表達有用的啟動子包括直接促進表達的nmtl、fbpl+、hiVl+和ctr4+，以可以認為這些啟動子對粟酒裂殖酵母十分有用。其他的啟動子，對釀酒酵母非常有用，例如包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油激酶、諸如烯醇化酶或甘油醛-3-磷酸脫氫酶等的I型糖分解酶和其他酶類，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶負責麥芽糖和半乳糖的利用。其它的較強的酵母啟動子是乙醉脫氫酶、乳糖酶和I型磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動子。Gall基因和GallO基因相鄰，從同一啟動子區(qū)域以相反的方向轉(zhuǎn)錄。含UAS序列的調(diào)控區(qū)域可以在DedlSau3A片段處被切斷，上游放置任何一個其它基因可以促進半乳糖誘導(dǎo)表達和抑制乳糖表達。PGK、GPD和ADH1啟動子時組成性髙表達啟動子(PGK-磷酸甘油激酶，GPD-甘油醛3磷酸脫氫酶，ADHh乙醇脫氫酶)。ADH2啟動子是一個葡萄糖抑制啟動子，在非發(fā)酵型碳源(與GAL1或10類似)中強烈轉(zhuǎn)錄并不受半乳糖誘導(dǎo)。CUP1啟動子金屬硫蛋白啟動子，通過加入銅或銀元素到培養(yǎng)基中活化，也是酵母細胞基因組中拷貝數(shù)多于一的幾個基因中的一個。根據(jù)菌株的不同，這一基因可髙達八個拷貝。PH05啟動子是編碼酸性磷酸酶的分泌型基因，在低濃度或無磷酸的培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)，磷酸酶的分泌可以促使一些磷酸從周圍環(huán)境中釋放出來。有磷酸的情況下，PH05無信號；無磷酸時，它強烈呈現(xiàn)。C.酵母轉(zhuǎn)化流程有諸多手段可以轉(zhuǎn)化酵母細胞，包括電轉(zhuǎn)、醋酸鋰和原生質(zhì)體。一種情形下，一個分子可以通過簡單的將酵母菌置于含該分子的培養(yǎng)基中進入酵母細胞。本發(fā)明的某些情形中，通過電轉(zhuǎn)化將分子運送至一個細胞器、細胞、組織或機體內(nèi)。電轉(zhuǎn)時，將細胞和DNA的懸浮液置于高壓電場中。該方法的修改方案，使用像果膠酶這樣的細胞壁降解酶處理，使處理的靶細胞比未處理細胞對電轉(zhuǎn)化更加敏感(美國專利U.S.PatentNo.5,384,253，見參考文獻部分)。消解酶至少可以用在粟酒裂殖酵母上。機械損傷可以使感受態(tài)對轉(zhuǎn)化更敏感。原生質(zhì)融合已經(jīng)用于克服阻止遺傳無關(guān)聯(lián)菌株交配的性別障礙(Svoboda，1976)，這有利于遺傳成分整體或部分的交換(Provost等，1978;Wilson等，1982;Perez等，1984;Spencer等，1985;Pina等，1986;Skala等，1988;Janderova等，1990;Gupthar,1992;Moluar和Sipiczki，1993)。這一過程依賴于細胞壁的消化，以及隨后的諸如聚乙二醇融合(Kao和Michayluk,1974)和已經(jīng)用于酵母融合試驗的原生質(zhì)吸附啟動子，Ca2+(vanSolingen和VanderPlaa"1997;Svoboda,198;Wison等，1982;Pina等，1986)。其他工作人員使用電融合技術(shù)替代聚乙二醇，報告了"一種增強的原生質(zhì)融合率"(Weber等，1981;Halfrnann等，1982)。聚乙二醇的作用并不明確，它催化同種或異種原生質(zhì)的凝集。融合過程總結(jié)如下(1)原生質(zhì)隨機融合成各種大小的凝塊；(2)通過膜的解體和原生質(zhì)內(nèi)容物的并入，將凝塊轉(zhuǎn)變?yōu)楹习w("嵌合原生質(zhì)融合產(chǎn)物")(Ahkong等，1975a;Gumper"1980;Svoboda,1981;Klinner和Bo"cher,1984);(3)膜的構(gòu)造(Ahkong等，1975a;Gumpert，1980)和異核體內(nèi)核的融合(Sarachek和Rhoads，1981;Klinner和Bottcher,1984)。另一種方法是利用電穿孔。首先用基本培養(yǎng)基(在到達早穩(wěn)定期(OD595=1.5)之前轉(zhuǎn)化頻率不受生長的影響)使細胞生長至約lxl07/ml(OD595=0.5)。收集細胞，20'C,3000rpm離心5分鐘，使用冰處理的水洗滌一次后接著利用冰浴好的1M的山梨醇洗滌。已有報道稱這些細胞在25mM的DTT(二硫蘇糖醇)孵育15分鐘可增強電穿孔能力。最終將細胞重懸浮于冰浴的1M的山梨醇中，密度為l-5xl09/ml。40jil細胞I的懸浮液加入到含轉(zhuǎn)化的DNA(100ng)的預(yù)冷的管子中冰浴5分鐘，電穿孔使用參數(shù)設(shè)置如下(a)1.5kV,200ohms，25jiF(Biorad);(b)1.5kV，132ohms,40(iF(Gensen/Flowgen)。細胞和DNA轉(zhuǎn)移到一預(yù)冷的玻璃管后脈沖處理0.9ml預(yù)冷的1M山梨醇立即加入玻璃管；在其它電穿孔進行的同時將細胞懸液返回管中冰浴。盡可能快的將細胞鋪在選擇平板上，32X:培養(yǎng)4-6天后轉(zhuǎn)化子將開始出現(xiàn)。下面的醋酸鋰草案來自O(shè)kazaki等(1990)、髙頻轉(zhuǎn)化方法和通過粟酒裂殖酵母反向互補的哺乳動物cDNA克隆的文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。細胞生長于150ml基本培養(yǎng)基到密度為0.5-1x107個細胞/ml(OD595-0.2-0.5)。細胞在含低濃度葡萄糖的培養(yǎng)基或者MB培養(yǎng)基(參考Okazaki等)中生長并不很好，但是可以提髙轉(zhuǎn)化效率。收集細胞室溫下3000rpm離心5分鐘后，用40ml無菌水洗后再同前次一樣離心沉淀。以lxl09個細胞/ml的濃度重懸浮于0.1M醋酸鋰溶液中(醋酸調(diào)節(jié)pH至4.9),并分成多個100ul加入Eppendorf管，30"(ts突變體為25"C)孵育60-120分鐘。每管加入溶于15ulTE(pH7.5)的1fig質(zhì)粒DNA，并輕微混合，使孵育過程中沉積的細胞重懸浮。在此期間必須保持管子的溫度不下降。290ul50%的PEG4000(w/v)預(yù)熱到30匸(ts突變體為25C)后加入管內(nèi)，接著輕微混合后30X:(ts突變體為25T:)孵育60分鐘。這些管子43T熱激15分鐘后冷卻10分鐘至室溫，使用Eppendorf離心機5000rpm離心2分鐘，小心吸出上清液。利用移液管piletmanP1000反復(fù)吸入吸出，將細胞重懸浮于1/2YE肉湯培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移到一個50ml燒瓶內(nèi)，加入9ml的1/2YE稀釋。細胞在(ts突變體為25'C)震蕩培養(yǎng)60分鐘或更長時間，取等量的小于0.3ml鋪于基本培養(yǎng)平板上。如果需要，將這時期的細胞離心后重懸浮于1ml培養(yǎng)基并鋪展更多細胞到平板上。D.酵母的密碼子偏好性為了獲得酵母細胞最佳表達的肽酶，編碼肽酶的核苷酸將依據(jù)酵母密碼子偏好性設(shè)計合成。下表提供了諸如粟酒裂殖酵母等的酵母偏好的密碼子。表l:粟酒裂殖酵母的密碼子偏好性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>CGTGinCAAHisCATProCCTE.酵母標志物在本發(fā)明的某些方面，利用標志物監(jiān)測特殊寡聚核苷酸的存在。標志物可以是營養(yǎng)標志物或者抗生素抗性標志物，可以使用一個或多個標志物。雖然檢測標記的寡聚核苷酸存在的任何營養(yǎng)標志物都可以利用，但是本發(fā)明中主要使用的營養(yǎng)標志物包括adel,ade6，arg3，CAN1,his3,his7，leul,leu2,sup3誦5，ura3和ura3。同時，雖然任何檢測標記的寡聚核苷酸存在的抗生物標志物都可以使用，但是本發(fā)明主要使用的抗性標志主要包括卡那霉素，G418和潮霉素。F.酵母表達載體在某些情形下，表達載體包含已有發(fā)明中的一個或多個成分。雖然任何適宜的載體都可使用，但是在具體試驗中，使用了一個或多個裂殖酵母載體，如表2所示，也可以通過南加州大學SusanForsberg的全球互聯(lián)網(wǎng)站搜尋其中一部分。表2:典型的通用裂殖酵母載體質(zhì)粒名稱基礎(chǔ)質(zhì)粒酵母標志物酵母來源其它特征和注釋pAL19pUCLEU2arsl藍白斑paR3arg3+arslpBGlpUChis3+arsl藍白斑pDBletbluescriptura4+2x兩個ars增加穩(wěn)ars3002定性pDB248XpBRLEU22micronpEA500pSP2his7十a(chǎn)rslpFL20pBR322URA3arslstbpIRT2pUCLEU2wslpIRT2Uura4+pIRT2-CANlpUCLEU2CAN1用于1-1菌CAN1株反相選擇pJK148bluescriptleul十—藍白斑插入pJK210ura4十21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表3:裂殖酵母表達載體<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>pSMl/2LEU22micronSV40啟動子pTLM2/pA17(pAU5)pSV40-無hCMV啟動子；通過滴加G418增加拷貝數(shù)p2MGpARTl/N795URA3IAJE22micron通過adh-糖皮質(zhì)激素受體(pART)調(diào)節(jié)GRE元件]VI.試驗檢測如上所述，本發(fā)明中的酵母細胞系統(tǒng)設(shè)計成鑒別挽救由于過表達HIV-l蛋白酶引起的細胞死亡的抑制劑和/或鑒別阻止蛋白酶活性的抑制劑，例如切斷蛋白酶底物。測試開發(fā)的某一具體情形，優(yōu)化和驗證一個或多個裂殖酵母試驗，用于典型的96孔板測定，特別是包括以下幾點1)將在RE294裂殖酵母菌株中測定HIV-1蛋白酶誘導(dǎo)生長抑制活性的瓊脂糖平板為基礎(chǔ)的測定轉(zhuǎn)化為吸光度測定。2)調(diào)節(jié)酵母存活/死亡的熒光讀數(shù)，確定蛋白酶誘導(dǎo)的細胞死亡。3)將GFP熒光細胞重定位測試轉(zhuǎn)化為監(jiān)測HIV蛋白酶活性的高密度熒光測定，將這一測試用作技術(shù)篩選檢測。在HTS類型測試中，對開發(fā)的測試方法進行二期優(yōu)化，進一步來構(gòu)建HTS，可以1)將所有的HIV-1蛋白酶測試修改為HTS形式，如果可能的話盡量小型化；2)將SAMINT軟件應(yīng)用到以HTS系統(tǒng)為核心的實驗室全自動系統(tǒng)中，以控制包括液體操作和孵育在內(nèi)的所有測試操作；3)根據(jù)質(zhì)量控制參數(shù)建立所有的反應(yīng)標準，包括測定重復(fù)性、變異系數(shù)(CV值)、信噪比和Z因子分析；4)使用藥代動力學活性LOPAC1280化合物庫(Sigma-RBI)運行檢測。在進行了建議的調(diào)整和確認之后，這些裂殖酵母細胞測試將用于新的HIV-1蛋白酶抑制劑的HTS篩選，這些抑制劑參與到分子文庫篩選中心的網(wǎng)絡(luò)中。HIV-1蛋白酶的剪切活性可以用任何適宜的方式測定。雖然在特定實驗中，這是通過檢測特定HIV-1蛋白酶剪切位點測定的。任何HIV蛋白酶位點23都可以使用，但本發(fā)明主要包含以下位點DSQNYPIVQ(SEQIDNO:3);DSFNFPOIT(SEQIDNO:4);VSQNYPIVQN(SEQIDNO:8);KARVLAEAMS(SEQIDNO:9);SATIMMQRGN(SWQIDNO:IO);RPGNFLQSRP(SEQIDNO:ll);VSPNFPQITL(SEQIDNO:12);CTLNFPISPI(SEQIDNO:13);GAETFYVDG(SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(SEQIDNO:15)(參考Wlodawer和Gustchina,2000)。表達異質(zhì)性HIV-1蛋白酶引起的宿主細胞死亡，但在有利于蛋白酶表達的條件下加入一種抑制劑，會阻斷蛋白酶引起的細胞死亡并促使酵母細胞繁殖。可以通過將生物多肽、蛋白、小分子或細胞內(nèi)重組抗體引入含異質(zhì)蛋白酶的酵母細胞，直接快速地進行選擇/鑒別允許酵母細胞在蛋白酶條件下生長和/或阻止蛋白酶底物剪切的抑制劑。A.遺傳選擇在遺傳選擇中，編碼潛在的多肽抑制劑的DNA文庫被髙頻(每毫克質(zhì)粒DNA超過10個轉(zhuǎn)化子)轉(zhuǎn)化到酵母細胞中。轉(zhuǎn)化子在瓊脂糖平板上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有蛋白酶基因表達抑制劑的誘導(dǎo)子和去除一個氨基酸的質(zhì)粒標記。大多數(shù)轉(zhuǎn)化子由于蛋白酶的表達而無法生長，有些轉(zhuǎn)化的細胞由于缺少質(zhì)粒而不能生長。然而，酵母轉(zhuǎn)化子中含有質(zhì)粒性抑制劑的將可以正常形成菌落?？梢愿鶕?jù)標準的DNA純化程序回收質(zhì)粒DNA，抑制子DNA序列可以通過DNA測序確定。候選抑制劑的來源可以包括核苷酸文庫，含基因組或cDNA文庫，蛋白文庫，多肽文庫，RNA文庫，抗體庫，小的有機分子庫。基因可以是任何形式，只要它們可以轉(zhuǎn)化進入酵母細胞。基因組文庫可以來源于酵母(包括粟酒裂殖酵母和釀酒酵母)、人類、小鼠、老鼠、藻類、真菌、果蠅、擬南芥和紅鰭河豚魚。B.髙通量篩選(HTS)可以通過本發(fā)明中的方法鑒別小分子肽和化學抑制劑。將酵母細胞稀釋并平均分配到含酵母省長培養(yǎng)基的孔內(nèi)，加入化合物，顯微鏡觀察或多孔板閱讀儀檢測酵母細胞生長情況。抑制劑的存在會促使細胞生長，孔內(nèi)濁度增加。這一HTS測試是一套標準的操作，已經(jīng)成功用于鑒別小分子抑制劑，并與本發(fā)24明有實質(zhì)性差異(Hughes,2002)。為了克服細胞滲透性等潛在的限制因素，可以使用特異性化合物如多粘菌素(Boguslaski,1985)增強細胞滲透性，或者使用細胞壁發(fā)生突變的酵母株(Brendel，1976)，也包含預(yù)期的受多重藥物主動外排引起損害的細胞。VO.聯(lián)合治療本發(fā)明的HIV-1蛋白酶抑制劑均是針對個體治療的需要，例如感染HIV的個體，患AIDS的個體，或者易感染HIV或易患AIDS的敏感個體。雖然本發(fā)明中的抑制劑沒有與其他藥物聯(lián)合治療HIV或AIDS，但為了增加抑制劑的治療效果，將這些成分與其它試劑聯(lián)合起來治療HIV/AIDS是必要的。更有可能的是這些組分通過聯(lián)合能更有效殺死HIV病毒和/或細胞成分。在一些特定方案中，發(fā)明中的組分與雞尾酒治療試劑聯(lián)合，包括將其與各種不同的HIV治療試劑合用。例如，將一個或多個蛋白酶抑制劑與一個或多個逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑合用。這一過程也包括將個體細胞與發(fā)明的組分和額外的試劑或多個因子同時聯(lián)系起來。這可以是細胞與單一成分或包括兩種試劑的藥代動力學劑型聯(lián)合，或?qū)⒓毎c兩個或以上的獨特性成分或劑型聯(lián)合。同時，一個細胞包含發(fā)明的成分，而另一個細胞包含第二種試劑，這種聯(lián)合可以在兩種治療上產(chǎn)生累積或協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明中的治療可以在其它試劑治療之前或之后進行，時間間隔可以從幾分鐘到數(shù)周。在其它試劑和發(fā)明的成分分開使用的情形下，須確保有效的時間周期不會短于兩次給藥的間隔，這樣試劑和發(fā)明組分能持續(xù)發(fā)揮對細胞的聯(lián)合效應(yīng)。在這種情況下，必須考慮兩種情形，兩次給藥相隔12-24小時，更有可能是6-12小時。在一些情形下，可以顯著延長治療時間周期，然而，兩次給藥也可能間隔幾天(2、3、4、5、6或7)到幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)。如果發(fā)明成分為A,其它試劑為B,各種聯(lián)合方式可以為A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A本發(fā)明的抑制劑成分治療給藥遵循常規(guī)的流程，這些流程用于其它的HIV/AIDS治療。大家都期望可以按需要重復(fù)治療周期，也可考慮將各種標準治療與描述過的抑制劑治療聯(lián)合應(yīng)用。與本發(fā)明聯(lián)合使用的其它的HIV/AIDS治療試劑可以是如下一些非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如地拉韋啶、依法韋侖、奈韋拉平；核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如阿巴卡韋、拉米夫定、齊多夫定、司他夫定、替諾福韋、扎西他濱；蛋白酶抑制劑，如安普那韋、阿扎那韋、氟沙普利那韋、茚地那韋、洛匹那韋、利托那韋、奈非那韋、沙奎那韋；和/或融合抑制劑，如恩夫韋地。豐.藥劑學制備本發(fā)明的藥劑學組成包括一個或多個發(fā)明中篩選鑒定的HIV-1和/或HIV-2蛋白酶抑制劑，也可以加入額外的試劑，溶解或分散于藥劑學可接受的載體內(nèi)。例如本發(fā)明的一項具體案例中，藥劑學組分包含hhp2多聚核苷酸或多肽。短語"藥劑學或藥代動力學可接受的"是指在動物給藥時，分子實體和組分不會誘發(fā)副作用、過敏和不適反應(yīng)，這樣對人體才是適用的。藥劑學成分包含至少一個HIV-1蛋白酶抑制劑或加上活性中間體，其制備需要當前業(yè)內(nèi)一經(jīng)披露的一些技能，如Remington的制藥科學(第18版，Mack出版公司，1990),這些在參考文獻中有引用。此外，對動物(例如人類)給藥，其制備需要符合FDA生物學標準要求的無菌、熱源、常規(guī)安全和純度要求，這很容易理解。從此處的使用來看，"藥劑學上可接受的運載體"包括任何物質(zhì)和所有溶劑，如分散介質(zhì)，糖衣，表面活性劑，防腐劑(例如抗細菌劑和抗真菌劑)，同位素制劑，吸收延滯劑，鹽，藥物，藥物穩(wěn)定劑，凝膠，粘合劑，賦型劑，分解劑，潤滑劑，甜味劑，調(diào)味劑，染料，諸如類似的材料和化合物。這是業(yè)內(nèi)熟知的一種常規(guī)技能(Remington的制藥科學1289-1329頁；第18版，Mack出版公司，1990，參考文獻引用)。目前，除了不適宜藥物中間體外，任何傳統(tǒng)載體用于藥劑組分都是一件值得考慮的事情。HIV-1蛋白酶抑制劑所含不同的運載體類型依賴于藥物劑型是固體、液體還是氣體，也與如注射等給藥途徑是否需要無菌有關(guān)。本發(fā)明中的藥劑可以靜脈、皮內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、葉鞘內(nèi)、直腸、局部、肌內(nèi)、皮下、粘膜、口服、本地、吸入(如氣體吸入)、注射、灌輸、連續(xù)輸液、局部浸泡靶細胞灌注給藥，通過導(dǎo)管、灌腸、乳劑，在液體組分內(nèi)(如脂質(zhì)體)，或通過其他方法或業(yè)內(nèi)人和正在進行的常規(guī)方法。HIV-1蛋白酶抑制劑可以自由的賦予中性或鹽溶液的形式，藥劑學上可接受的的鹽包括酸性鹽類，例如那些蛋白組分的自由氨基，或者有機酸類，鹽酸鹽或磷酸鹽類，或者如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有機酸。自由羧基形成的鹽可來源于鈉、鉀、銨、鈣或氧化鐵等非有機元素，或異丙胺、三甲胺、組胺或普魯卡因等有機成分。對于劑型來說，溶液形式給藥方式應(yīng)該與劑量相應(yīng)，保證有效治療所需的量。該劑型極易給藥，包括一系列方式，如溶液注射類的非腸道給藥，氣體吸入至肺部，或者如釋放膠囊類似物的消化道給藥。為了進一步與本發(fā)明一致，本發(fā)明的藥物成分裝在藥劑學可接受的運載體內(nèi)，包含或者不包含惰性溶液。運載體應(yīng)該是可吸收的，包括液體，半固體如軟膏，固體。除了迄今為止的傳統(tǒng)載體，試劑溶液或用作賦型劑以提髙療效的載體外，將它們用于本發(fā)明中成分的給藥也是合適的。載體或溶液包括脂肪，油，鹽溶液，脂類，脂質(zhì)體，油脂，粘合劑，填充劑及類似物，或者它們的聯(lián)合。組分中也可以含有各種延緩氧化的抗氧化劑。此外，防止微生物活動可用防腐劑，如利用抗細菌劑和抗真菌劑，包括但不限于滅菌劑(如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞及它們的聯(lián)合。為了與本發(fā)明一致，組分與載體結(jié)合成任何方便實用的方式，如溶液、懸浮液、乳化劑、摻和劑、膠囊、吸收劑及類似物，這些都是業(yè)內(nèi)司空見慣的。本發(fā)明的具體案例中，組分是與半固體或固體載體徹底混合的，混合過程可以使用任何便利的方式，如研磨。為了保護組分不散失治療活性，混合過程也加入穩(wěn)定劑，如胃部變性。組分中使用的穩(wěn)定劑包括緩沖液，氨基酸如甘氨酸和賴氨酸，碳水化合物如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖和甘露醇。在進一步的方案中，本發(fā)明將考慮利用藥劑學脂質(zhì)載體成分，包括HIV-1蛋白酶抑制劑，一個或多個脂類和一種水性溶液。此處所用的"脂類"定義為包括任何廣泛的不容于水而可被有機溶液萃取的物質(zhì)，這些物質(zhì)對于業(yè)內(nèi)人員是非常熟悉的，而此處所說的"脂類"也不限于任何特殊的結(jié)構(gòu)。例如包括含長鏈脂肪烴及它們的衍生物。脂類可以自發(fā)產(chǎn)生或合成(如人工設(shè)計生產(chǎn))。然而，脂類通常是生物學底物，生物學脂類廣為人知，包括中性脂肪、磷脂、磷酸甘油、甾體、萜烯、溶源性脂類、鞘糖脂、糖脂、硫脂、含醚基和酯的脂肪酸以及聚合脂類，或者它們之間的聯(lián)合。當然，除了那些具體講述過的廣為人知的化合物外，本發(fā)明也包含了其它脂類構(gòu)成及方法。27該領(lǐng)域內(nèi)的一項常規(guī)技能包括熟悉那些將組分分散到脂類載體的技術(shù)。例如，HIV-1蛋白酶抑制劑分散進入脂類溶液、溶于脂類、脂類乳化、與脂類混合、與脂類結(jié)合、共價連接到脂類、形成脂類懸浮液、裝入膠囊或脂質(zhì)體內(nèi)，或與脂類或脂類結(jié)構(gòu)通過任何已知方式結(jié)合。這種分布或許導(dǎo)致形成脂質(zhì)體。藥物組分的實際給藥劑量根據(jù)患病動物的物理和生理因素確定，如體重、嚴重程度、疾病類型、原有治療和共同治療的情況、病人突發(fā)病情況和給藥路線。根據(jù)劑量和給藥路徑的不同，優(yōu)先劑量和/或有效劑量的給藥途徑數(shù)量由主體的反應(yīng)決定。在任何情形下，實際操作者對給藥負責，確定個體的藥物中間體的濃度和合適的劑量。在某些情形下，藥物組分可能包含一個活性化合物的0.1%,其他情形下，活性化合物重量比可在2%-75%之間，或在25%-60%之間，或任何其它的范圍。自然的，每一治療有效組分的活性化合物數(shù)量可以依據(jù)如下原則制備通過任何給定單位的化合物獲得適合的劑量。在制備制藥劑型的過程中應(yīng)考慮溶解性、生物利用度、生物學半衰期、給藥路線、產(chǎn)品保質(zhì)期和其它的藥物動力學因素。同時，不同的劑量和治療方案也應(yīng)該考慮。在其它非限制性實例中，劑量可以為1微克/千克/體重(fig/kg/bodyweight)、5fig/kg/bodyweigh"10(ig/kg/bodyweight、50fig/kg/bodyweight、100fig/kg/bodyweigh"200fig/kg/bodyweight、350fig/kg/bodyweight、500fig/kg/bodyweigh"1毫克/千克/體重(mg/kg/bodyweight)、5mg/kg/bodyweight、10mg/kg/bodyweight、50mg/kg/bodyweight、100mg/kg/bodyweight、200mg/kg/bodyweight、350mg/kg/bodyweigh"500mg/kg/bodyweight至!l1000mg/kg/bodyweight或者更多，甚至可以為任何劑量。從這些列出的數(shù)量衍生出來的范圍為5mg/kg/bodyweight至U500mg/kg/bodyweight的給藥劑量。C.消化道藥物成分和劑型本發(fā)明的優(yōu)先方案中，HIV-1蛋白酶抑制劑通過消化道給藥，此處披露的藥物組分所有可能的給藥途徑與消化道直接相關(guān)。具體說來，此處所講藥物組分可以口服、口腔、直腸或舍下給藥。因此，這些組分可以通過惰性溶液或可食用吸收載體賦型，或者壓成片劑，或者直接放入食品中。某些情形活性化合物整合入賦型劑成為可消化片劑、口腔片劑、藥片、膠28囊、甘香酒劑、懸液、糖漿、水溶液和類似物(Mathiowitz等，1997;Hwang等，1998;美國專利U.S.Pat.Nos.5,641，515;5,580,579和5,792,451。每個均通過參考文獻引用)。片劑、藥片、藥丸、膠囊劑類似物可以包含以下物質(zhì)粘合劑，如黃芪膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠或者它們之間的聯(lián)合；賦型劑，如磷酸二鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或它們之間的聯(lián)合；分解劑，如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸鈉或它們之間的聯(lián)合；潤滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑，如蔗糖、乳糖、糖精或硬脂酸鎂；調(diào)味劑，如薄荷糖、冬青油、櫻桃調(diào)味劑、橘子調(diào)味劑等。當劑量單位為膠囊時，除了上述物質(zhì)，還包含液體載體。各種其它物質(zhì)可以包被或者修飾劑量單位的物理形式，例如片劑、藥丸或者膠囊可以使用片膠、糖或者兩者合用包裹。膠囊劑除了上述物質(zhì)外，還包括液體載體。明膠膠囊、片劑或者藥丸可以加上腸道糖衣。腸道糖衣阻止胃部和腸道上部酸性環(huán)境引起的藥物變性，參考美國專利U.S.Pat.No.5,629,001。到大小腸后，內(nèi)部pH值促使包衣解離釋放出藥物成分，并被特定細胞吸收，如腸道內(nèi)皮細胞和腸道淋巴集合淋巴結(jié)細胞(Peyer，spatchcells)。糖漿可以包含蔗糖作為甲基化試劑，加入對羥基苯甲酸丙酯作為防腐劑，也包含染料和調(diào)味劑，如櫻桃和橘子調(diào)味劑。當然，任何用作藥物劑型的物質(zhì)均應(yīng)滿足制藥學純度，同時還不具有實質(zhì)的毒性。此外，活性化合物可以融入持續(xù)釋放的劑型中。本法明組分的口服給藥可以選擇性整合入一種或多種賦型劑，如漱口水、牙膏、口腔給藥、片劑、口服噴霧劑或舌下口服給藥劑型。例如，漱口水可以將所需量的活性中間體放入合適的溶劑中，如硼酸鈉溶液?；蛘呋钚灾虚g體可以置于口服液中，如硼酸鈉、甘油和硼酸鉀，或分散于牙膏中，或加入有效劑量到含有水粘合劑、研磨劑、調(diào)味劑、浸泡劑和濕潤劑的組分中。或者將組分裝入片劑或置于舌下給藥的溶液，或者溶于口中。其它適用于腸道給藥的劑型包括栓賽劑。栓賽劑是固體制劑，有各種形狀和重量，通常是插入直腸給藥。插入后，栓賽劑變軟，融化/溶解釋放出活性液體。通常，栓賽劑可以包含0.5%-10%,更多的是1%-20%的活性中間體藥物。D.非腸道藥物成分和劑型更進一步，HIV-1蛋白酶抑制劑可以是非腸道給藥形式。此處，"非腸道"29包括腸道旁路給藥進入。具體說來，此處所指藥劑組分可以通過但不僅僅限于以下方式靜脈、皮內(nèi)、肌內(nèi)、動脈、鞘內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)，美國專利U.S.Pat.No*6，7537，514;6，613，308;5，466，468;5，543，158;5,641,515和5,399,363(每個具體案例通過參考文獻完全引用)。自由基或藥劑學可接受鹽類活性化合物溶液可以通過在水中加入如羥丙基纖維素等表面活性劑制備。分散劑也可以在甘油、液體聚乙二醉(PEG)或兩者的混合液和油中制備。在常規(guī)的儲存和使用條件下，這些制備過程包含防腐劑以阻止微生物生長。適于注射的藥劑形式包括滅菌水溶液或分散液，和用于臨時制備無菌注射液或分散液的無菌粉末(美國專利U.S.Pat.No.5，466，468;通過參考文獻完全引用)。在所有的情形中，劑型必須是無菌且為易于注射的液體形式，在制備和儲存條件下必須穩(wěn)定，必須防止細菌和真菌等微生物污染。載體應(yīng)可溶于或分散于含水、乙醇、醇類聚合物(如PEG，液體PEG及類似物等)以及合適的混合物，和/或植物油。保持適度的流動性，例如，利用包衣、卵磷脂，在分散過程中通過表面活性劑保持顆粒大小。加入各種抗細菌劑和抗真菌劑阻止微生物的活動，如羥基本甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞及類似物。許多情形下，也傾向于包括同位素制劑，如糖類或氯化汞。通過試劑組分延緩吸收，可以延長注射組分的吸收時間，如單硬脂酸鋁和明膠。對于水性溶液的非腸道給藥，例如，必要情況下溶液必須為合適的緩沖液，使用足量的鹽或葡萄糖保持等滲。這些特殊的水溶液十分適合于靜脈、肌內(nèi)、鞘內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥。這種情形下，滅菌水溶液是該領(lǐng)域內(nèi)經(jīng)常使用的介質(zhì)。例如,一份劑量溶于1ml等滲氯化鈉(NaCl)溶液，加入1000ml皮下灌輸或在建議的融合位點注射給藥。根據(jù)注射治療條件，可以改變劑量，對于人體來說，藥劑應(yīng)符合FDA生物學標準要求的無菌、熱源、常規(guī)安全和純度。將適量的活性化合物溶于適量溶劑，與上述列舉的其它中間體混合，接著過濾除菌，制備無菌注射液。通常將各種無菌活性中間體置于基本分散介質(zhì)的無菌載體中，并需要前面所列舉的其它中間體。用于臨時制備注射液的無菌粉末，使用真空干燥和冷凍干燥制備，產(chǎn)生從前述的其它各種藥物中間體。粉末組分與液體載體(如水或鹽溶液)有關(guān)聯(lián)，可以包含穩(wěn)定劑，也可以沒有穩(wěn)定劑。E.混雜的藥劑學成分和劑型在本發(fā)明其它推薦方案中，活性HIV-1蛋白酶抑制劑可以設(shè)計成通過各種混雜路線給藥，例如局部給藥(如透皮)，粘膜給藥(鼻內(nèi)、陰道等)和/或吸入給藥。局部給藥的組分包括醫(yī)學可用的活性化合物，如藥膏、漿糊、奶油或粉末。藥膏包括所有的油劑、吸收劑、乳劑和局部給藥的水溶性成份。而奶油或洗劑只包括乳劑。局部給藥制劑包含利于活性中間體穿過皮膚吸收的滲透增強劑。合適的增強劑有甘油、乙醇、二甲亞砜、吡咯垸酮和月桂氮酮。局部給藥可能的基本成分包括PEG、羊毛脂、冷奶油和凡士林，還有其它合適的吸收劑、乳劑或水溶性油劑。局部制劑也包括乳化劑、凝膠制劑和必要的抗微生物防腐劑，以維持活性中間體，提供同源混合物。本發(fā)明中的透皮給藥也包括使用"貼片"，例如通過貼片提供一個或多個活性化合物，在固定時間內(nèi)以預(yù)定比例持續(xù)給藥。在某些情形下，藥劑組分可以通過滴眼液、鼻內(nèi)噴灑、吸入和/或其它氣體傳送載體給藥。組分通過鼻內(nèi)噴氣直接運送至肺部，參考美國專利U.S.Pat.Nos.5,756,353和5,804,212(每個具體案例通過參考文獻完全引用)。類似的，使用鼻內(nèi)微粒脂(Takenaga等，1998)和磷酸甘油酯(美國專利U.S.Pat.No.5,725,871,通過參考文獻完全引用)也是業(yè)內(nèi)十分常見的方式。同樣，透過粘膜給藥以聚四氟乙烯支持基質(zhì)輸送藥物也已經(jīng)在美國專利U.S.Pat.No.5,780,045種描述過。氣體形式指的是可以很好的將固體顆粒分散進入液體或壓縮氣體中的膠質(zhì)系統(tǒng)。本發(fā)明中典型的吸入氣體制劑由液體推進劑或液體推進劑混合液和合適的溶劑。合適的推進劑有碳水化合物和碳水化合物醚類。容器根據(jù)推進劑壓力要求有所不同，氣體制劑給藥依據(jù)主體的年齡、體重、嚴重程度和反應(yīng)特征而不同。K.發(fā)明中的代表性試劑盒此處所描述的任何一種組分均可以組成一個試劑盒。在非限制性例子中，一種試劑盒可以包括本發(fā)明中篩選方法鑒別的HIV-1蛋白酶抑制劑和額外的試劑。試劑盒在適當?shù)娜萜鲀?nèi)，由HIV-1蛋白酶抑制劑和其它隨意一個試劑組成。31試劑盒包含適當?shù)囊后wHIV-1蛋白酶抑制劑，可以是液體水介質(zhì)或凍干狀態(tài)。容器通常至少包括藥瓶、試管、長頸瓶、玻璃瓶、注射器或其它容器，組分可以置于容器內(nèi)部，最好是液體形式。試劑盒多于一種組分時，通常使用第二、第三或更多的容器分開裝多余組分。然而，不同組分的聯(lián)合也可以置于同一藥瓶內(nèi)。本發(fā)明試劑盒也包括將HIV-1蛋白酶抑制劑與其它試劑包裝盒綁定銷售的方式，這些包裝容器包括注射器或吹融塑料容器，可以保持內(nèi)部成分的活性。當試劑盒組分為一種或多種溶液時，溶液可以是水性溶液，最好是無菌水溶液。HIV-1蛋白酶抑制劑組分也可以是注射用組分。這種情形下，包裝容器本身可以是注射器、移液器和/或其它類似裝置，使劑型可以用于機體敏感區(qū)域，注射動物，和/或甚至可與試劑盒其它成分混合使用。然而，試劑盒組分可能是干粉形式。當試劑和/或組分為干粉時，通過加入適當溶劑可以使干粉重構(gòu)。將溶劑置于另一容器內(nèi)同時提供的方式也是很常見的。不管容器數(shù)量和/或類型如何，本發(fā)明試劑盒也可以包含和/或包裝入一種裝置中，該裝置用于幫助將HIV-1蛋白酶抑制劑組分注射給藥和/或?qū)⒔M分置于動物體內(nèi)。這類裝置可以是注射器、移液器、鉗狀骨針和/或任何這類醫(yī)療許可的傳遞工具。具體實施例下面列出的具體實施例是為了說明本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，但并不限于這些實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體實施例中所列舉的技術(shù)內(nèi)容，即發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上做出的改進的技術(shù)內(nèi)容，能夠很好地實現(xiàn)本發(fā)明，因此，這些技術(shù)內(nèi)容組成了實施本發(fā)明的優(yōu)選的方式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明申請文件的內(nèi)容，可以在所列舉的具體實施例的基礎(chǔ)上做出一些變化，并且可以在不脫離本發(fā)明的發(fā)明精神實質(zhì)和保護范圍的基礎(chǔ)上得到一些相似或等同的變形方案。實施例1本發(fā)明的標準實施方式從質(zhì)粒nmtl啟動子中得到的HIV-1蛋白酶基因表達后能殺死裂殖酵母，是我們在這里討論的內(nèi)容。這種殺死裂殖酵母的能力是基于對蛋白酶抑制因子的篩選，也是該項發(fā)明的一個特殊的領(lǐng)域。盡管通過質(zhì)粒中蛋白酶基因的表達來殺死酵母的方法是首次被證實，因為相對于將一個基因整合到染色體中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒更容易操作，當然在某些方面，通過質(zhì)粒的自我復(fù)制進行抑制物篩選并不是最佳的選擇。與染色體相比，裂殖酵母中的質(zhì)粒極不穩(wěn)定，將基因整合到染色體中具有內(nèi)在穩(wěn)定性的優(yōu)勢?；蛘峡梢砸疠^多的均一表達，因為質(zhì)粒復(fù)制倍數(shù)從0-30倍不等，導(dǎo)致質(zhì)粒中基因表達水平變化幅度較大。不同于質(zhì)粒基因，利用整合基因作為抑制因子篩選的明顯優(yōu)勢是能均一水平地表達，以及潛在增強穩(wěn)定性的能力。然而，整合基因進入染色體的標準操作方法事實上是引起不穩(wěn)定的原因之一(Keeney和Boeke，1994)。運用標準操作方法，將同源重組基因整合到染色體時，通常是在ura4位置，整合基因兩側(cè)的nra4區(qū)域基因會進行復(fù)制(圖1)。在同源重組基因復(fù)制時，很容易出現(xiàn)整合基因缺失的現(xiàn)象。因此，運用標準操作方法，從整合基因中篩選蛋白酶抑制因子時，有時會出現(xiàn)很髙的蛋白酶因子缺失細胞形成的菌落本底值。能髙水平表達蛋白酶基因的典型nmtl啟動子會增加基因缺失的機率。nmtl啟動子受維生素Bl的調(diào)控，但并不反應(yīng)維生素Bl的情況。當介質(zhì)中存在高濃度的維生素B時能抑制啟動子的表達。相反當細胞中缺少維生素B時則啟動子就進行表達。細胞從周圍介質(zhì)中吸收儲存維生素B后，將它置于無維生素B介質(zhì)中不會馬上引起反應(yīng)。只有通過細胞分裂使細胞內(nèi)部維生素B濃度有效稀釋后，才能引起nmtl啟動子的髙水平表達，且至少通過四次細胞分裂(Tommasino和Maundrell，1991)。在誘導(dǎo)介質(zhì)中nmtl啟動子起作用前，要求細胞進行分裂繁殖，意味著單個細胞能長成一個微型集落。在進行抑制因子篩選時，如果集落中的一個細胞失去基因，這些細胞就會長成本底集落。在實際操作中，培養(yǎng)與誘導(dǎo)介質(zhì)中的細胞基因丟失的比例有時可以髙達2%，最終導(dǎo)致整個菌落基因的丟失。這種髙濃度的本底菌落能干擾抑制因子的識別。為了能有效的識別抑制因子，我們研究出了一個很典型的方法，它可以快速簡便地檢測到基因缺失菌落。在這個方法中，我們將kan基因整合到染色體中使之與蛋白酶基因相連(圖2),kan基因能使裂殖酵母在富含YE的介質(zhì)中抵制G418抗生素繼續(xù)生長。將設(shè)計好的kan基因整合進入nmtl基因位置33附近，選擇在YE介質(zhì)中能抵抗G418抗生素的轉(zhuǎn)化株(圖3),其余表達蛋白酶基因的菌株在誘導(dǎo)介質(zhì)中全部凋亡。相比通常使用的ura4+和leul+基因(Keeney和Boeke,1994),使用kan基因的一優(yōu)點是，在培養(yǎng)含整合蛋白酶基因的菌株時ura4+和leiil+兩個基因標記仍然可以選擇使用。大部分實驗室里，實驗人員在構(gòu)建裂殖酵母載體時一般都使用ura4+或leul+兩個標記基因來選擇轉(zhuǎn)化株，這兩種因子都能被轉(zhuǎn)染到菌株后進行篩選。然而，利用kaii基因篩選菌株的最大優(yōu)勢是同源重組后丟失蛋白酶基因的同時也會失去kan基因，因而對G418抗生素產(chǎn)生敏感(圖3)。在下面將要描述的利用G418進行抗性篩選的過程里，誘導(dǎo)介質(zhì)中蛋白酶基因缺失的本底菌落可以減少到1/105以下。成功篩選出抑制因子的頻率很低，因此將本底菌落減少到低水平是一個至關(guān)重要的步驟。例證2具有整合蛋白酶基因菌落的特性描述我們對整合有蛋白酶基因的兩個抗G418轉(zhuǎn)化株進行了分離鑒定。蛋白酶基因髙表達的毒性作用可以從三個方面來解釋。首先，將它們培養(yǎng)于nmtl啟動子抑制性(+T)或誘導(dǎo)性(-T)的液體介質(zhì)中時，生長率在抑制性介質(zhì)中表現(xiàn)正常，而在誘導(dǎo)性介質(zhì)中，兩種菌株的生長都受到抑制(圖4)。其次，將在抑制性介質(zhì)中培養(yǎng)生長的細胞重新置于抑制性或誘導(dǎo)性介質(zhì)中進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在抑制性介質(zhì)中形成正常大小的菌落，而誘導(dǎo)性介質(zhì)中幾乎不形成或形成極小的菌落(圖5)。第三，將抑制性介質(zhì)中生長的細胞重新置于誘導(dǎo)性或抑制性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，與不同時間點測定細胞集落形成能力。在抑制性介質(zhì)培養(yǎng)基中，每次測量都有大于95%的細胞形成了菌落，而在誘導(dǎo)性介質(zhì)中細胞形成集落的能力迅速下降，在切換到誘導(dǎo)性基質(zhì)的24小時內(nèi)，集落形成能力下降到小于1%。因為nmtl啟動子大約在細胞培養(yǎng)至14-16小時時出現(xiàn)最強的誘導(dǎo)效果(Maimdrell,1993),蛋白酶基因表達出現(xiàn)最大效應(yīng)的幾個小時后，細胞就失去了生存能力。將綠色熒光蛋白(GFP)與HIV-1Vpr蛋白結(jié)合后進行的在體試驗對了酵母菌落的蛋白酶活性進行了驗證(圖7)。綠色熒光蛋白本身能到達裂殖酵母細胞的各個部位。將GFP與Vpr蛋白熔融后，該融合物到達細胞的部位則根據(jù)Vpr蛋白的信號，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分熔融物都以環(huán)狀帶或點的方式聚集在細34胞中心的核膜附近，其他部位幾乎沒有綠色的熒光物質(zhì)出現(xiàn)(圖9(Chen，Elder等，1999))。酶活性試驗的關(guān)鍵步驟是在GFP與Vpr蛋白之間的蛋白酶切割位點導(dǎo)入一個多肽銜接物(圖7)。如果該蛋白酶沒有活性，那么由GFP，多肽銜接物和Vpr組成的蛋白混合物會根據(jù)Vpr的信號到達核膜附近。相反，如果該蛋白酶具有活性，那么多肽銜接物就會被剪切掉，GFP不能與Vpr有效鏈接后會分布在細胞的各個部位。這種特殊銜接物被酶解的在體試驗表明了帶有整合基因的兩種菌落都具有蛋白酶活性。兩個對照實驗給出了預(yù)期的結(jié)果。第一個試驗是GFP不受蛋白酶存在與否的影響可以定位于細胞的任何一個部位(圖8)。第二個試驗是當GFP與Vpr蛋白之間沒有銜接物時，蛋白酶不影響GFP-Vpr熔融物到達細胞核膜位置，這樣蛋白酶就無法剪切而釋放出GFP(圖9)。然而，當GFP與Vpr蛋白之間存在一個像細胞間質(zhì)蛋白與HIV-1衣殼蛋白結(jié)合點處的經(jīng)典酶切位點時，則該蛋白酶的存在會使GFP的定位出現(xiàn)很大的變化(圖10)。如不存在該蛋白酶，那么GFP-SLMA-Vpr到達核膜位置，當該蛋白酶基因表達后，被剪切而釋放出的GFP就會到達細胞的各個部位，此時大部分的細胞核都會失去標記。同樣，當GFP與Vpr蛋白之間若存在p6與HIV-1(Diiiiii，Goodenow等，2002)蛋白酶的酶切位點時，該蛋白酶的表達會使GFP的核膜定位轉(zhuǎn)變?yōu)檎麄€細胞的定位(圖11)。這個對比實驗表明GFP與Vpr蛋白之間的銜接物必須存在一個酶切位點才能發(fā)生重新定位。如果銜接物中不存在已知的HIV-1蛋白酶切位點，而存在一個炭疽致死因子(Cummings，Salowe等，2002)的酶切位點，貝ljGFP-SLA-Vpr結(jié)合蛋白在蛋白酶表達前后都定位在核膜位置(圖12)。GFP定位可以用于酶活性的半定量實驗，也可以用于帶有整合蛋白酶基因的兩種菌落之間的對比試驗。對整合有蛋白酶基因的兩種菌落的生長特征進行比較時發(fā)現(xiàn)，第一種菌落(命名為PrliitA或RE294)的生長抑制現(xiàn)象比第二種菌落(命名PrlntB或RE295)更明顯。當nmtl啟動子被抑制(+T)后兩種菌落生長都表現(xiàn)正常時，PrliitA菌落在誘導(dǎo)性介質(zhì)中(-T)基本上停止了生長，而PrliitB菌落在同樣介質(zhì)中生長速率減緩。生長率出現(xiàn)明顯變化的效應(yīng)表明了PrlntA菌落表達了高水平的蛋白酶，同時兩種菌落之間整合基因進入染色體的不同方式也從另一個角度解釋了PrlntA菌落中酶基因的高表達現(xiàn)象。將單拷貝的蛋白酶基因整合到nmtl位點，交叉點的不同導(dǎo)致兩種菌落35中nmtl啟動子的小片段序列出現(xiàn)差異(圖14)。轉(zhuǎn)染iimtl表達載體后，nmtl啟動子上的Ndel限制位點被切除并插入cDNA(Maundrell,1993)。這種沒有Ndel限制位點的iuntl啟動子突變體可以用于整合蛋白酶基因，發(fā)生重組同源基因整合的染色體具有與Ndel限制位相似的原生型序列。同源重組基因插入的具體位點決定了nmtl啟動子表達的蛋白酶為原生序列或突變體序列。研究發(fā)現(xiàn)PrIntA菌落中nmtl啟動子表達的蛋白酶基因為Ndel限制位點原生序列，而PrlntB菌落中表達的是突變序列(圖14)。nmtl啟動子的調(diào)節(jié)序列包括了Ndel限制位點序列(Zurlinden和Schweingruber,1997),可能PrIntA菌落中就是這種原生型序列導(dǎo)致了蛋白酶的髙水平表達以及強烈的生長抑制現(xiàn)象。GFP-SLMA-Vpr中GFP重新定位的程度也表明了PrIntA菌落中蛋白酶的活性高于PrlntB菌落。當細胞中出現(xiàn)GFP-SLMA-Vpr時，通過測定熒光可以反應(yīng)GFP的分布狀況，或者分布于整個細胞中，或根據(jù)Vpr信號分布于細胞核膜表面。在測定中細胞分別被計數(shù)為GFP型和Vpr型。也有一些介于中間的細胞，它們在核膜及整個細胞都檢測到綠色熒光，這些細胞就被計數(shù)為Vpr型。根據(jù)這個規(guī)則，當細胞沒有蛋白酶活性時，幾乎所有的GFP都聚集在核膜表面，即GFP分布型細胞為0%。PrIntA菌落中整合基因表達時，大約84%的細胞為GFP分布型(圖10-15)。而PrlntB菌落只有47%的細胞為GFP型。這樣在誘導(dǎo)性介質(zhì)中的生長率和GFP型細胞的比例同時表明了PrlntB中的酶活性低于PrIntA菌落。蛋白拮抗劑藥物印地那韋闡述了一個蛋白酶活性抑制劑如何影響PrIntA菌落，它同時可以用于酶抑制物的篩選。蛋白酶抑制劑是治療HIV感染的最有效的一類藥物，印地那韋是其中一個藥物。這些藥物競爭性地與酶活性中心結(jié)合(Randolph和DeGoey,2004)。用印地那韋治療PrIntA,則誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶基因的效應(yīng)降低。在-T介質(zhì)中誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶基因后，12.5jig/ml濃度的印地那韋能增加生長速率，切換到-T介質(zhì)中后大約25小時生長速度達到最大值，接近于不能誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶基因的+T介質(zhì)中的繁殖速度(圖16)。GFP-SLMA-Vpr結(jié)合物中綠色熒光分布現(xiàn)象中也可以反應(yīng)抑制劑的酶活性抑制現(xiàn)象。大多數(shù)沒有經(jīng)過處理的細胞具有GFP型分布，隨著印地那韋濃度的增加，Vpr型細胞頻繁地出現(xiàn)(圖17)。統(tǒng)計細胞的分布類型，隨著印地那韋濃度的增加，GFP型細胞的數(shù)目逐漸減少(圖18),當濃度達到最髙的200jig/ml36時，已僅有極少部分的細胞為GFP型。印地那韋的實驗直接表明了PrlntA菌落可以用于酶抑制劑的篩選。篩選過程的基本思路如下抑制因子能夠使PrIntA在誘導(dǎo)型培養(yǎng)基中形成菌落，而正常表達的蛋白酶毒性作用能影響生成正常大小的集落。分別將500個細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)型和抑制型介質(zhì)中，5天后，抑制型介質(zhì)中大部分的細胞長成了集落，而誘導(dǎo)型介質(zhì)中幾乎沒有或只形成了很小的聚落(圖19)。(玻片19中由于蛋白酶基因缺失導(dǎo)致的兩個較大的集落將在以下內(nèi)容中介紹)。將印地那韋加入到誘導(dǎo)型介質(zhì)中即形成了集落，加入髙濃度的印地那韋后形成的集落大小與抑制型介質(zhì)培養(yǎng)基中形成的集落大小相似。例證3通過降低本底值進行抑制物篩選試驗之前已經(jīng)闡述PrlntA菌落可以用于抑制物的篩選，為使篩選過程中本底降低到最小值進行了本試驗。誘導(dǎo)型介質(zhì)中一些本底細胞因為同源基因重組后丟失了蛋白酶基因而長成了集落，而最近研究出來的一個三步法程序可以消除失去蛋白酶基因的本底細胞。這種三步法操作是一個很經(jīng)典的抑制物篩選過程，試驗也證明了它可以消除本底的影響，該操作包括1)將細胞與誘導(dǎo)型介質(zhì)中進行培養(yǎng)；2)復(fù)制后進行G418抗性篩選試驗；3)在誘導(dǎo)介質(zhì)條件下檢査抗G418細胞所形成集落的生長狀況。應(yīng)用這個三步驟操作法對RE294進行了研究后發(fā)現(xiàn)抑制蛋白酶基因的本底細胞形成集落的能力小于1/106。首先，將在抑制型介質(zhì)中培養(yǎng)長成的載體攜帶的PrlntA細胞切換到誘導(dǎo)型介質(zhì)中(-T)進行培養(yǎng)。由于蛋白酶基因的表達，大部分的細胞死亡，大約1/1000的細胞長成了集落(圖20)?？瓷先ニ坪醮蟛糠稚踔了械募涠际怯赏粗亟M基因與啟動子重復(fù)交叉引起的蛋白酶基因缺失細胞所形成的，通過這種方式失去蛋白酶基因還回導(dǎo)致kaii基因的缺失(圖3)。含Kaii基因的裂殖酵母細胞能抵抗G418抗生素，將誘導(dǎo)型基質(zhì)復(fù)制到含G418基質(zhì)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)即可鑒定是否存在kan基因。同時也將誘導(dǎo)型基質(zhì)轉(zhuǎn)移到不含G418抗生素的YE介質(zhì)中作為對照實驗。在該對照實驗中，與初始介質(zhì)中相似，所有的集落都長成同一類型細胞的集落。相反，從誘導(dǎo)型基質(zhì)轉(zhuǎn)移到G418培養(yǎng)板上的集落，大部分都停止了生長(FIG.21)，表明大多數(shù)的細胞都失去了kan基因，而這些集落在誘導(dǎo)介質(zhì)中的生長主要由蛋白酶基因的缺失引起。然而，G418復(fù)制板上大約只有1%的集落在生長(其中兩個在圖21中可見)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些集落事實上不是因為酶的抑制作用，由于在誘導(dǎo)介質(zhì)中各種不同的混合細胞形成集落而停止了生長。對這些抗G418集落在誘導(dǎo)培養(yǎng)板中進行重新試驗后，它們?nèi)客Ｖ沽松L，而在對照實驗中，這些菌落中似乎保留有蛋白酶基因且對該基因的表達仍然具有敏感性(圖22)。從G418抗生素篩選的細胞長成的兩種對比菌落在丟失蛋白酶基因后生長較好(圖22上)，PrlntA細菌在G418培養(yǎng)的初始階段，只有一小部分失去蛋白酶基因的細胞長成了少數(shù)幾個比較大的集落(圖23周邊)，大部分的細胞停止生長。將從G418抗生素篩選的生長型集落培養(yǎng)與誘導(dǎo)介質(zhì)中進行再次檢測時，大部分的細胞與PrlntA細菌在G418中的初始行為一致，即沒有長成正常大小的集落(圖22的其余六個部分)。G418r蛋白與G418s蛋白細胞的混合物同時存在，是形成這種在初始誘導(dǎo)介質(zhì)中生長集落加入G418進行抗性篩選后，細胞即停止生長的對立現(xiàn)象的主要原因。細胞在原始誘導(dǎo)基質(zhì)中長成集落時，失去蛋白酶基因和kanr基因的細胞很快就長成無G418蛋白細胞的集落。但集落中的一部分細胞會仍然含有G418r蛋白。將該基質(zhì)復(fù)制到富含維生素B的G418培養(yǎng)板上，因為維生素能夠抑制蛋白酶基因的表達，少數(shù)的G418r蛋白細胞就長成了集落，無G418蛋白的細胞則被抗生素殺死。在圖22中可以看出G418復(fù)制板上的集落細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)介質(zhì)中即停止了生長。在從PrlntA載體篩選抑制物的實驗中，將大于106個細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)介質(zhì)中，將這些介質(zhì)復(fù)制到含G418培養(yǎng)基中，然后在誘導(dǎo)介質(zhì)中對集落細胞再次進行抗生素篩選。在完成了這三個步驟的篩選后，對G418抗生素產(chǎn)生抗性的集落即被分離出來(圖23)。這個結(jié)果表明在三個步驟的篩選過程中，在本底達到最小時，仍然可以對極少數(shù)的蛋白抑制物進行分離。例證4裂殖酵母染色體庫的篩選實驗在這個經(jīng)典的篩選質(zhì)粒庫的過程中，有一些本底集落透過了這三個步驟(圖20),但是這些微量的集落對質(zhì)粒抑制物的分離和篩選不會產(chǎn)生多大的影響。另外，對篩選過程中質(zhì)粒的丟失增加一個實驗步驟可以提髙實驗的可靠性，但前提需要有效區(qū)地分本底菌落與帶有靶標抑制質(zhì)粒的菌落。實驗中用到的裂秩酵母染色體組由帶有ura4基因的pUR18載體攜帶(Barbet，Muriel等，1992)。在對pUR18載體質(zhì)粒進行蛋白酶抑制物篩選的過程中，每個細胞有5-10個質(zhì)粒發(fā)生過表達現(xiàn)象；在-T基質(zhì)中能生長的抗G418細胞是抑制質(zhì)粒篩選的目標細胞，在一些特殊的情況下，檢測在-T介質(zhì)中的生長情況可以有效地排出少數(shù)一些質(zhì)粒丟失的細胞的影響。質(zhì)粒中的基因整合到細胞基因庫中后，平均每個細胞可以復(fù)制到5-10倍以上。PrlntA被轉(zhuǎn)染到基因庫中，在一個抑制板上選擇大約40000ura4+基因來抑制蛋白酶基因的表達。被轉(zhuǎn)染后的細胞被重新培養(yǎng)與誘導(dǎo)介質(zhì)中進行第三個步驟的篩選。在對轉(zhuǎn)染體的篩選過程中我們分離了兩種能強烈抑制蛋白酶的菌落，但進一步分析后發(fā)現(xiàn)，這兩種菌落都含有該蛋白酶的突變基因。這兩種菌落在含G418的介質(zhì)中生長良好，而在誘導(dǎo)介質(zhì)中恰好與pUR18載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PrIntA菌落形成了對比，帶有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的PrlntA菌落在G418基質(zhì)中生長也較好，而在誘導(dǎo)介質(zhì)中則大部分的細胞停止生長。這兩種菌落似乎是很好的pUR18載體酶抑制質(zhì)粒的攜帶者，一旦該質(zhì)粒丟失后，在誘導(dǎo)介質(zhì)中這兩種菌落還會持續(xù)生長(圖25)。pUR18基因庫中得到的質(zhì)粒在裂殖酵母中穩(wěn)定性較差，在不能對質(zhì)粒進行篩選的富含尿嘧啶介質(zhì)中生長后，一些細胞就會丟失質(zhì)粒后停止生長，并且只有在添加尿嘧啶的條件下才能繼續(xù)生長。圖25中最上面的培養(yǎng)板中對無選擇性培養(yǎng)基中生長的單個集落進行了檢測，在不添加尿嘧啶的條件下通過觀察該菌落能不能生長來確定是否含有質(zhì)粒(帶有ura4基因的pUR18載體質(zhì)粒)。上面兩部分的菌落停止了生長表明該菌落丟失了質(zhì)粒，相反，其余保持生長的四個部分表明質(zhì)粒沒有丟失。將同樣的單個菌落置于添加了尿嘧啶的抑制性介質(zhì)中進行檢測時(圖25左下部分)，所有六個菌落生長狀況與預(yù)期一致，而在誘導(dǎo)介質(zhì)中生長也同樣的好(圖25的右下部分)。這些實驗表明了這些菌落中的質(zhì)粒不攜帶抑制物。在這個篩選過程中我們還發(fā)現(xiàn)了具有相同性質(zhì)的第二種菌落。我們對這兩種不含有抑制物質(zhì)粒菌落中的蛋白酶基因進行了PCR擴增測序。兩個菌落中的蛋白酶基因都存在第18個密碼子后的氨基酸轉(zhuǎn)位突變現(xiàn)象(圖26),這種突變可以引起酶的失活。兩個轉(zhuǎn)位突變都發(fā)生在原始密碼子16-17區(qū)域的6G部位，一個多了一個鳥嘌呤，另一個則少了一個鳥嘌呤。同區(qū)域的兩種轉(zhuǎn)位突變同時發(fā)生表明了6G是發(fā)生突變頻率較髙的區(qū)域。另外，酶基因發(fā)生自然突變的頻率就是最小的本底值，在篩選過程中可以檢測到，對兩種自然突變物進行分離后，整個篩選過程就達到了最小本底值。將在篩選過39程丟失的質(zhì)粒混合后，本底達到最小以至于在整個基因庫篩選過程中僅發(fā)現(xiàn)一個假陽性(在以下內(nèi)容中介紹)。在篩選抑制性質(zhì)粒過程中涉及到的本底值如下在篩選3X105個細胞時，只發(fā)現(xiàn)兩個抗G418菌落在-T中有很強的生長能力，這種強的生長能力不需要質(zhì)粒，且蛋白酶基因中都存在密碼移位突變，僅有的一個假陽性菌落在-T介質(zhì)中生長能力較弱，在酵母中檢測發(fā)現(xiàn)從該假陽性菌落中分離得到的質(zhì)粒不具有抑制能力。例證五典型的質(zhì)粒抑制因子攜帶有HHP2基因在完成通過質(zhì)粒篩選抑制物后，我們分離了11種具有抑制作用的菌落，圖27顯示了對其中6個弱抑制劑從G418復(fù)制到誘導(dǎo)介質(zhì)中的復(fù)篩選過程(分別標記為PS3，PS4，PS5，PS6和PS7)。這六個抑制菌落在G418(頂部培養(yǎng)皿)和抑制性培養(yǎng)皿(左邊底部培養(yǎng)皿)中生長較好，而在誘導(dǎo)型培養(yǎng)皿(右邊底部)生長較緩慢，不同于一般的3-4天，在培養(yǎng)六天后才長到中等大小的集落。圖28中PS4的質(zhì)粒丟失表明了這些弱蛋白酶抑制劑的抑制能力主要取決于其中的質(zhì)粒。PS4在無選擇性培養(yǎng)基中生長后形成的四個單集落被分別標記為PS4-1,PS4-2，PS4-3和PS4-4，在選擇性基質(zhì)中對這四個單集落的質(zhì)粒進行了分析(頂部培養(yǎng)皿)，其中PS4-1和PS4-2失去了質(zhì)粒，其余兩個仍保留著質(zhì)粒。這四個集落都生長在抑制性培養(yǎng)皿的左邊底部位置，其中帶有質(zhì)粒的PS4-3和PS4-4在誘導(dǎo)介質(zhì)中長成了許多集落，而大部分不帶質(zhì)粒的PS4-1和PS4-2細胞停止了生長。為了確認這11種菌落的質(zhì)粒中存在抑制因子，利用這些菌落制備DNA用于E.coli的轉(zhuǎn)染，氨芐青霉素抗性篩選后回收質(zhì)粒。質(zhì)粒上攜帶的抑制因子經(jīng)最后確認后，將回收的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)染到PrliitA,然后重新測定其抑制能力。在E.coli中回收PS2和PS3兩種酵母抑制菌株中pPS3-2和pPS4-10質(zhì)粒，檢測兩種PrlntA轉(zhuǎn)染體。pPS3-2質(zhì)粒不是蛋白酶抑制因子，因為兩個轉(zhuǎn)染體的生長現(xiàn)象與pUR18載體一致(圖29)。pPS3是通過所有篩選步驟的唯一一個帶有質(zhì)粒的菌落，但是將其中的質(zhì)?；厥詹⒅匦罗D(zhuǎn)染到PrliitA后，檢測后不具抑制活性。對于pPS4-10質(zhì)粒，兩個轉(zhuǎn)染體在誘導(dǎo)介質(zhì)中生長狀況都比pUR18載體及pPS3-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體好(圖29)。表明pPS4-10質(zhì)粒帶有較弱活性的抑制因子。從弱抑制性酵母菌落中回收的其他九個質(zhì)粒在誘導(dǎo)介質(zhì)中也有40一定的生長現(xiàn)象(圖30)。將pPS3-2質(zhì)粒與pUR18載體導(dǎo)入后24小時時測定其平板效率只有0.4%左右，而其他十個回收的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體的平板效率達能達到7%(圖31)。對這十個抑制性質(zhì)粒中插入基因末端的600個核苷酸進行了測序，發(fā)現(xiàn)它們只攜帶有hhp2基因(圖32)。十個質(zhì)粒都有完整的hhp2開放讀碼框(ORF),而鄰近部位的基因都沒有ORF。從基因庫中篩選的40000個轉(zhuǎn)染體中得到的這十個hhp2質(zhì)粒，我們分離了六個不同的質(zhì)粒，他們都來自于不同的轉(zhuǎn)染體。多次分離到同一個質(zhì)粒的三種情況都是因為來源于同一個轉(zhuǎn)染池或?qū)ν粋€轉(zhuǎn)染體進行了重復(fù)分離。所有的弱抑制性質(zhì)粒都包含hhp2基因十個弱抑制菌落通過了質(zhì)粒丟失篩選的所有步驟，將這些菌落中分離得到的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)染到裂殖酵母后檢測發(fā)現(xiàn)都有較弱的抑制活性，它們只帶有hhp2基因；這十個質(zhì)粒包含了六個不同的hhp2質(zhì)粒。因為hhp2是從六個不同的轉(zhuǎn)染池中分離得到的，而且也沒有檢測到其他的基因，推測hhp2基因是pUR18基因庫中唯一一個能抑制蛋白酶活性的在篩選目的基因。在酶抑制因子篩選過程中我們沒有發(fā)現(xiàn)hhpl基因。hhpl和hhp2基因序列非常相似(74%相一致)，且具有部分重疊功能(Dhillon和Hoekstra,1994、對hhp2基因的鑒定排除了具有抑制活性的可能性。酶的高水平表達會對酵母產(chǎn)生毒性，因為酵母中的一個必需蛋白被這種酶分解消化低至一定濃度后，細胞就會失去生存能力。在這個模型中，如果細胞能夠合成足夠多的必需蛋白，就能降低毒副作用。但是這個模型并不是用于hhp2,因為hhp2基因缺失的菌落仍然具有很好的生存能力(Dhillon和Hoekstra,1994)。不能將其它抑制基因進行分離的原因可能是該蛋白酶同時作用于多個必須蛋白，或在交替的過程中存在其它的毒性機制。hhp2抑制蛋白酶的具體機制還要進一步進行研究。hhp2激酶屬于CK1族激酶(Dhilloii和Hoekstra1994),目前對于這類激酶與HIV-1蛋白酶之間的相互作用機制沒有相關(guān)的報道。我們在本專利中介紹了該類hhp2激活酶抑制蛋白酶表達的機制。第一種是hhp2通過磷酸化途徑抑制蛋白酶的表達。在另一種具體的過程中，該激酶沒有將蛋白酶磷酸化，而hhp2作為一種競爭性的拮抗劑被蛋白酶分解。在該項發(fā)明專利中我們確認了hhp2是否通過一種新的途徑來抑制HIV-1蛋白酶。41對于hhp2的證實直接表明了我們所發(fā)明的篩選過程是一個非常有效的篩選抑制因子的過程。Hhp2是裂殖酵母5000個基因中的其中一個基因(Wood,Gwilliam等，2002),而我們的篩選過程能夠從六個不同的質(zhì)粒中找到這個基因。表明這種經(jīng)典的篩選過程可以用于表達更多蛋白質(zhì)和肽化合物的基因庫里蛋白酶抑制因子的篩選。參考文獻下面所列出的所有專利、專利申請以及公開發(fā)表過的文獻資料表明了本發(fā)明領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員所具有的知識和技能水平。這些專利、專利申請以及公開發(fā)表過的文獻資料在此引入本文作為參考。專利和專利申請美國專利申請?zhí)?,384,253美國專利申請?zhí)?,399,363美國專利申請?zhí)?,466,468美國專利申請?zhí)?,543,158美國專利申請?zhí)?,580,579美國專利申請?zhí)?,629,001美國專利申請?zhí)?,641,515美國專利申請?zhí)?,725,871美國專利申請?zhí)?,756,353美國專利申請?zhí)?,780,045美國專利申請?zhí)?,804,212美國專利申請?zhí)?,792,451美國專利申請?zhí)?,043,357美國專利申請?zhí)?,613,308依法注冊的發(fā)明Hl，649公開發(fā)表的文獻資料Barbet，N.，W.J.Muriel,etal.(1992》"VersatileshuttlevectorsandgenomiclibrariesforusewithSchizosaccharomycespombe."Gene114(1):59-66-Chen，M.，R.T.Elder,etal(1999)."MutationalanalysisofVpr-inducedG2arrest,nuclearlocalization,andcelldeathinfissionyease."JVirol73(4):3236-45，Cummings,R.T.，S.P.Salowe,etal.(2002)."Apeptide-basedfluorescenceresonanceresonanceenergytransferassayforBacillusanthracislethalfactorprotease."ProcNatlAcadSciUSA99(10):6603-6.Dhillon,N.andM.F.Hoekstra(1994)."CharacterizationoftwoproteinkinasesfromSchizosaccharomycespombeinvolvedintheregulationofDNArepair."EmboJ13(12):2777-88.Dunn,B.M.，M.M.Goodenow，etal.(2002)."Retroviralproteases."GenomeBiol3(4):REVIEWS3006.Keeney，J.B.andJ.D.Boeke(1994)."EfficienttargetedintegrationatIeul-32andura4-294inSchizosaccharomycespombe."Genetics136(3):849-56.Maundrell,K.(1993)."曙Thiamine-repressibleexpressionvectorspREPandpRIPforfissionyeast."Gene123(l):127-30.Randolph,J.T.andD.A.DeGoey(2004)."PeptidomimeticinhibitorsofHIVprotease."CurrTopMedChem4(10):1079-95.Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd.MackPrintingCompany,1990.Tommasino，M.andK.Maundrell(1991)."UptakeofthiaminebySchizosaccharomycespombeanditseffectasatranscriptionalregulatorofthiamine-sensitivegenes."CurrGenet20(l-2):63-6.Wlodawer，A.andA.Gustchina(2000)."Structuralandbiochemicalstudiesofretroviralproteasesl"BiochimBiophysActa1477(l):16-34.Wood,V.，R.Gwilliam，etal.(2002)."ThegenomesequenceofSchizosaccharomycespombe."Nature415(6874):871-80.Zurlinden,A.andM.E.Schweingruber(1997)."IdentificationofaDNAelementinthefissionyeastSchizosaccharomycespombenmtl(thi3)promoterinvolvedinthiamine-regulatedgeneexpression."JBacteriol179(18"5956-8-43雖然上文中已經(jīng)詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案以及技術(shù)進步，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明的發(fā)明精神實質(zhì)和本發(fā)明權(quán)利要求書所確定的保護范圍的基礎(chǔ)上做出一些改變、替換、變更。此外，所給出的實施范圍不限于說明書中所列出的過程、設(shè)備、結(jié)構(gòu)、物質(zhì)組成、方法、步驟的具體實施方式。從本發(fā)明申請文件公開的內(nèi)容、現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)存在的和隨后將發(fā)展的技術(shù)如過程、設(shè)備、結(jié)構(gòu)、物質(zhì)組成、方法、步驟，任何一個本領(lǐng)域技術(shù)人員可以完全實現(xiàn)與本發(fā)明相應(yīng)的實施方案相同的功能或者達到完全相同的技術(shù)效果。因此，權(quán)利要求書的作用在于確定要保護的過程、設(shè)備、結(jié)構(gòu)、物質(zhì)組成、方法、步驟的保護范圍。權(quán)利要求1、一種鑒別HIV蛋白酶抑制劑的方法，該方法包括以下步驟首先提供一種酵母細胞，所述的酵母細胞內(nèi)包含有由編碼HIV蛋白酶的基因序列組成的多聚核苷酸；然后將所述的多聚核苷酸置入候選試劑中；再評估以下的其中一項或兩項指標1)所述的酵母細胞的細胞活性和/或生長情況；其中，與缺少候選試劑的情況下的細胞進行對比，在所述的候選試劑存在的情況下細胞能夠存活的，所述的候選試劑為HIV蛋白酶抑制劑；2)HIV蛋白酶底物的酶切效果，其中能夠阻止底物被酶切的候選試劑為HIV蛋白酶抑制劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶是HIV—1蛋白酶。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶是HIV—2蛋白酶。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶的表達受到過表達調(diào)控序列的調(diào)節(jié)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制劑為多肽、多聚核苷酸、小分子、抗體，或者以上多種物質(zhì)的混合物或組合物。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的酵母為裂殖酵母。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的裂殖酵母為粟酒裂殖酵母。8、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的多聚核苷酸被整合到酵母基因組中。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的過表達調(diào)控序列為nrnll過表達調(diào)控序列、adhl調(diào)控序列、fbpl調(diào)控序列、invl調(diào)控序列或ctr4調(diào)控序列。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的多聚核苷酸中包含有至少一個能夠在細胞活性測試中減少背景生長信號的片段。11、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于所述的能夠減少背景生長信號的片段為標記物。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述的標記物為對抗生素具有抗性的標記物。13、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述的標記物為對G418或潮霉素具有抗性的標記物。14、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于所述的標記物為營養(yǎng)標記物。15、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述的標記物選自adel、ade6、arg3、CAN1、his3、his7、leul、leu2、sup3-5、ura3和ura3。16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶為人HIV蛋白酶。17、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶底物為人HIV蛋白酶底物。18、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于評估HIV蛋白酶底物的酶切效果可以為評估由第一多肽片段和第二多肽片段組成多肽的酶切效果，其中HIV蛋白酶的酶切位點位于所述的第一多肽片段和第二多肽片段之間。19、根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于第一多肽片段中為可探測的標記。20、根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于第二多肽片段為HIV蛋白酶的底物。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶的底物為HIV-1Vpr多肽。22、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的HIV蛋白酶底物的酶切位點可以為DSQNYPIVQ(SEQIDNO:3)、DSFNSTQIT(SEQIDNO:4)、VSQNYPIVQN(SEQIDNO:8)、KARVLAEAMS(SEQIDNO:9)、SATIMMQRGN(SEQIDNO:10)、RPGNFLQSRP(SEQIDNO:ll)、VSPNFPQITL(SEQIDNO:12)、CTLNFPISPI(SEQIDNO:13)、GAETFYVDG(SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(SEQIDNO:15)。23、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于所述的可探測的標記為綠色熒光蛋白、翠綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白或者青色熒光蛋白。24、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法還進一步包括將治療有效劑量的所述抑制劑輸送到感染HIV病毒或者患有AIDS的個體的步驟。25、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法還進一步包括將有效劑量的所述抑制劑輸送到可能感染HIV病毒或可能患上AIDS的個體來作為預(yù)防的步驟。26、治療感染了HIV病毒或者患有AIDS的個體的方法，該方法包括將治療有效劑量的包含有hhp2的藥物組合物輸送到所述的個體的步驟。27、根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述的hhp2為多肽。28、根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述的hhp2為編碼hhp2多肽的多聚核苷酸。29、一種酵母細胞，其特征在于該酵母細胞內(nèi)包含有由編碼HIV蛋白酶的基因序列組成的多聚核苷酸。30、根據(jù)權(quán)利要求29所述的酵母細胞，其特征在于所述的HIV蛋白酶為HIV-1蛋白酶。31、根據(jù)權(quán)利要求29所述的酵母細胞，其特征在于所述的HIV蛋白酶為HIV-2蛋白酶。32、根據(jù)權(quán)利要求29所述的酵母細胞，其特征在于所述的多聚核苷酸的表達受到過表達調(diào)控序列的調(diào)節(jié)。33、根據(jù)權(quán)利要求29所述的酵母細胞，其特征在于所述的多聚核苷酸優(yōu)選標記物。34、根據(jù)權(quán)利要求33所述的酵母細胞，其特征在于所述的標記物優(yōu)選對抗生素具有抗性的標記物。35、根據(jù)權(quán)利要求33所述的酵母細胞，其特征在于所述的標記物優(yōu)選營養(yǎng)標記物。36、根據(jù)權(quán)利要求29所述的酵母細胞，其特征在于所述的酵母細胞內(nèi)包含有由編碼第一多肽片段的第一序列和編碼第二多肽片段的第二序列組成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位點位于第一多肽片段和第二多肽片段之間。37、根據(jù)權(quán)利要求36所述的酵母細胞，其特征在于所述的第一多肽片段為可探測的標記。38、根據(jù)權(quán)利要求37所述的酵母細胞，其特征在于所述的可探測的標記為綠色熒光蛋白、翠綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白或者青色熒光蛋白。39、根據(jù)權(quán)利要求36所述的酵母細胞，其特征在于所述的第二多肽片段為HIV-1Vpr多肽。40、根據(jù)權(quán)利要求29所述的酵母細胞，其特征在于所述的酵母細胞可以為酵母細胞培養(yǎng)物或者酵母細胞集落。41、一種治療和/或預(yù)防感染HIV和/或患上AIDS的藥物組合物試劑盒，其特征在于該試劑盒包含有裝在合適的容器中的編碼hhp2的多聚核苷酸或hhp2多肽。42、根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含有藥學上可以接受的賦型劑。43、一種用于篩選一個或多個HIV蛋白酶抑制劑的試劑盒，該試劑盒包含有權(quán)利要求29中所述的酵母細胞。44、根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，其特征在于所述的酵母細胞內(nèi)還包含有由編碼第一多肽片段的第一序列和編碼第二多肽片段的第二序列組成的多聚核苷酸，其中HIV蛋白酶的酶切位點位于第一多肽片段和第二多肽片段之間。全文摘要本發(fā)明涉及一種鑒別蛋白酶抑制劑的酵母篩選方法，特別涉及HIV-1蛋白酶和/或HIV-2蛋白酶抑制劑的酵母篩選方法。例如，若在粟酒裂殖酵母中，HIV-1蛋白酶過量表達會導(dǎo)致細胞死亡，但是當存在具有蛋白酶抑制活性的候選抑制劑時，細胞能夠存活，這一發(fā)現(xiàn)為發(fā)明鑒別蛋白酶抑制劑的方法提供了基礎(chǔ)。更具體地，本發(fā)明提供了體內(nèi)蛋白酶活性檢測方法，如利用HIV-1蛋白酶特異性酶切位點，這一方法可以與細胞活性測定方法聯(lián)合使用、也可以替代細胞活性測定方法單獨使用來鑒別蛋白酶抑制劑。更進一步地，還可以利用篩選出來的抑制劑來治療感染HIV病毒或者患有AIDS的病人。文檔編號C12Q1/37GK101501210SQ200780029436公開日2009年8月5日申請日期2007年6月8日優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日發(fā)明者羅伯特·T·艾德,趙玉琪申請人:蘇州圣諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司