專利名稱：：具有酯酶活性的蛋白質(zhì)的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有酯酶活性的蛋白質(zhì)、其功能等價物和突變體、編碼它們的核酸序列、表達盒、載體和重組微生物；以及制備所述蛋白質(zhì)的方法和其在有機酯的酶促的，特別是對映選擇性酶促的，酯水解或酯交換中的用途。
背景技術：
：酯酶和脂肪酶是可以用于工業(yè)方法中合成旋光有機化合物的水解酶，其特征在于高底物特異性。通過類似于絲氨酸蛋白酶的機制，它們可以將?；鶊F轉(zhuǎn)移至親核物質(zhì)例如羰基上或者水解斷裂酯鍵。酯酶、脂肪酶和絲氨酸蛋白酶具有相同的催化三聯(lián)體——由氨基酸Ser，His和Asp組成的序列基序，其中m^碳原子受到活性Ser的親核攻擊，并在其它兩個氨基酸的參與下導致電荷的分配。酯酶和脂肪酶也可以將?；鶊F轉(zhuǎn)移至其它親核物質(zhì)例如石危醚的石危基或活化胺上。脂肪酶水解長鏈甘油酯，其特征在于表面活化，即，活性位點只有在存在脂質(zhì)底物時才可以接近。脂肪酶在非水性有機溶劑中是穩(wěn)定的，并且可以在許多工業(yè)方法中用于外消旋物的動力學拆分，即，一種對映體比另一種以實質(zhì)上更快的速度被轉(zhuǎn)化。所述對映體可以由于不同的物理和化學性質(zhì)而隨后從反應溶液中獲得。Nakamura(Nakamura,K.等,Tetrahedron;Asymmetry9，(1999)，4429-4439)描述了通過在疏水性溶劑中借助商業(yè)可獲得的脂肪酶(AmanoAK，AHandPS;AmanoPharmaceuticalsCo.Ltd.)通過酯交換作用拆分1-炔_3_醇的外消旋物。在該反應中，對映選擇性隨著酰基供體的鏈長而增加，空間大殘基(氯代乙酸酯、苯曱酸乙烯酯)對該反應有不利影響。Yang(Yang,H.etal"J.Org.Chem.64,(1999)，1709-1712)描述了利用來自南極假絲酵母(Candidaantarctica)的脂肪酶B作為催化劑，使用乙烯基酯通過酯交換作用對映選擇性地制備旋光酸。在該例子中，乙基酯導致明顯較低的反應速率和選捧性。分離自植物伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaplantarii)(植物假單胞菌或穎殼假單胞菌)(Pseudomonasplantarii或glumae)DSM6535的脂肪酶可以利用曱氧基乙酸乙基酯對映選擇性地?；庀?Balkenhohl，F(xiàn).etal"J，prakt.Chem.339，(1997)，381-384)。酯酶對映選擇性催化酯鍵的形成和斷裂(正反應和逆反應)。優(yōu)選在該酯交換作用中使用乙烯基酯獲得旋光醇，這是因為該酯的醇官能在轉(zhuǎn)化后將因互變異構(gòu)成醛或酮而不再可用，由此可以避免逆反應。與脂肪酶不同，酯酶不是表面活化的，并且其轉(zhuǎn)化具有相對短鏈長的有機化合物。已經(jīng)從多種生物中分離到具有不同底物特異性的酯酶。因此，來自PseudocardiathermophilaFERM-BP-6275的酯酶用于7JC解旋光苯并二氫吡喃乙酸酯(chromanaceticesters)(EP-A-0892044)。來自酸熱芽孢桿菌(Bacillusacidocaldarius)的酯酶以低的對映選擇性水解窄底物范圍的西旨(Manco，G.etal.，Biochem.J.332，(1998)，203-212)。來自曲霉屬(Aspergillus)的?；D(zhuǎn)移酶1用于在有機非極性溶劑中利用乙烯基酯通過酯交換作用獲得仲醇，其中優(yōu)選轉(zhuǎn)化具有短側(cè)鏈的仲醇(Faraidos，丄etai.，Syniett4,(1997)，367-370)。已經(jīng)從熒光假單胞菌DSM50106克隆膜結(jié)合內(nèi)酯特異性酯酶(Khalameyzer，V.etal"Appl.andEnviron.Microbiol.65(2),1999，477-482)，從大腸桿菌(E.coli)Q突變體克隆乙酰酯酶(Peist，R.etal.，J.Bacteriol.179，(1997)，7679-7686)。然而，對這兩種酯酶的對映選擇性和底物特異性未有更為細節(jié)的研究。紅球菌屬(Rhodococcus)物種NCBM11216表達4種酯酶，RR1-RR4，這些酯酶具有不同的特異性。對于從萘酚和酸合成酯，RRl和RR2優(yōu)選具有短碳鏈的酸，而RR3和RR4特異地轉(zhuǎn)化具有相對長碳鏈和空間上相對大殘基的酸(Gudelj，M.etal"丄Mol.Cat.B，Enzymatic5，(1998),261-266)。6然而，直到目前，尚未有底物范圍廣、對映選擇性高和能夠用于工業(yè)過程中的酯酶可用于制備小有機分子例如具有短碳鏈的旋光醇、酸或酯。WO-A-02/18560首次描述了能夠?qū)τ尺x擇性地水解廣譜旋光酯的、具有酯酶活性的有用蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在其中被稱作酯酶。更具體地，該文獻描述了包含510個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:2)及其編碼序列(SEQII)NO:1)。本發(fā)明的一個目的在于提供具有至少一種上述性質(zhì)的、任選地活性被優(yōu)化的其它酯酶。發(fā)明概述所述目的令人驚奇地通過提供具有酯酶活性的蛋白質(zhì)或其功能性等價蛋白質(zhì)而實現(xiàn)，其中所述蛋白質(zhì)具有總長小于510個氨基酸的多肽鏈，并且其中所述鏈包含至少一個根據(jù)SEQIDNO:3的部分氨基斷列。附圖簡述圖1顯示丁炔醇I酯酶的部分氨基酸序列與來自熒光假單胞菌的內(nèi)酯特異性酯酶的部分序列的序列比對。查詢序列(Query):本發(fā)明克隆LU2898的部分序列。目標序列(sbjct):熒光假單胞菌酶的部分序列(登錄號087637)。圖2描述LU2898的克隆流程。圖3描述來自LU2898的丁炔醇酯酶基因與ERGO數(shù)據(jù)庫的比較。黑色顯示高同源區(qū)域。右側(cè)的文字欄為來自ERGO的注釋并指出了相應的E值；E值M列同源基于偶然的可能性。指出了丁炔醇酯酶基因中的Pstl切割位點的位置。為了比較，使用來自穎殼假單胞菌LU2023的非重組酶的氛基*列。圖4描述具有335個氨基酸的長度的本發(fā)明酯酶(來自克隆LU11147)的酶活性以及衍生自其的活性增加的突變體的酶活性。發(fā)明詳述1.優(yōu)選實施方案本發(fā)明的第一主題涉及具有酯酶活性的蛋白質(zhì)或其功能等價蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有總長小于510個氨基酸的多肽鏈并且其中所述鏈包含至少一個根據(jù)SEQIDNO:3的部分氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選具有可以通過參考底物丁酸丁-3-炔-2-基酯的斷裂來表征的酯酶活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)尤其還可以包含至少一個才艮據(jù)SEQIDNO:4、5或6的另外的部分氨基酸序列。所述根據(jù)SEQIDNO:3、4、5或6的部分氨基酸序列定義如下(在每一種情況下以氨基酸的單字母代碼表示，其中在每一種情況下首個氨基酸對應于具體的氨基末端)a)FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER(SEQIDNO:3)，b)IALIAPLTHTETEP(SEQIDNO:4),c)GGGMMGLRPEAFYAASSDLV(SEQIDNO:5)d)AIDAIFAPEPV(SEQIDNO:6)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)尤其可以包含總長度小于450個氛基酸，例如300至445個氨基酸，或者小于350個氨基酸，例如尤其是345至300個氨基酸，尤其是大約330至340個氨基酸，特別是335個氮基酸的多肽鏈。特別可以提及的是包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及這些新型截短酯酶的活性增強的突變體、和相似制備的包含大約510個氨基酸的WO-A-02/18560中公開的酯酶的突變體、以及它們的功能等價物。本發(fā)明尤其涉及在SEQIDNO:2或8的氨基酸序列區(qū)域12-20，185-195和258-268中的任何區(qū)域中具有至少一個功能性突變，特別是在SEQII)NO:2或8的氨基酸序列位置16、l卯和263中的任何位置中具有至少一個功能性突變的酯酶突變體。此類突變的非限制性實例是如下單獨的氨基酸替代或其任何組合8Leul6Pro，Ilel卯Thr，Ilel卯Arg和lie263Val。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以是具有大約60kDa或更少，例如56kDa或更少，或例如55.5kDa或更少的計算分子量的多肽鏈。例如，具有少于510個氨基酸的截短的丁炔醇酯酶可以具有大約56kDa至20kDa，例如大約55.5至30kDa或55.5至35kDa或55.5至40kDa或40至30kDa,或例如55.5至45kDa或38至34kDa或36.5至35.5kDa的分子量。根據(jù)SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)的突變體優(yōu)選具有大約60至40kDa、或56至50kDa或55.5至54kDa的計算分子量。根據(jù)SEQIDNO:8的蛋白質(zhì)的突變體優(yōu)選具有大約38至34kDa、37至35kDa或36.5至35.5kDa的計算分子量。優(yōu)選的蛋白質(zhì)可以從具有保藏號DSM13176(1999年12月2日由DSMZ保藏)的穎殼假單胞菌(也稱作植物伯克霍爾德氏菌)LU2023中獲得，并且，如果合適，可以隨后進行突變。具有酯酶活性的本發(fā)明蛋白質(zhì)、功能等價物和突變體還可以催化至少一個如下反應a)式I的旋光酯的對映選擇性水解，R'-COO-R2(1)，其中R1是直鏈或支鏈的、任選地單或多取代的d-do-烷基、CVd(r鏈烯基、C2-d(r炔基，I^是直鏈或支鏈的、任選地單或多取代的Crd。-烷基、C2-do-鏈烯基、C2-do-炔基、CVd5-芳烷基、或單環(huán)或多環(huán)的、任選地單或多取代的芳基；R1和/或R2包含至少一個不對稱碳；和b)式I的酯與式II的旋光醇的對映選擇性酯交換，R2畫OH(11)，其中R2具有以上含義之一并且任選地具有至少一個不對稱碳?？梢蕴峒暗倪m宜的d-Cur烷基基團實例是具有1至10個碳的直鏈或支鏈基團，例如，甲基、乙基、異丙基或正丙基、正、異、仲或叔丁基、9正戊基或異戊基；以及正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、以及它們的單分支或多分支的類似物。適宜的C2-do-鏈烯基基團實例是具有2至10個碳的上述烷基基團的單或多不飽和類似物，該類似物優(yōu)選具有1或2個可以位于碳鏈的任何位置的碳-碳雙鍵。適宜的C2-do-炔基基團實例是具有2至10個碳的上述烷基基團的單或多不飽和類似物，該類似物優(yōu)選具有1或2個可以位于碳鏈的任何位置的碳-碳三鍵。C7-d5-芳烷基優(yōu)選是苯基-d-C5-烷基或萘基-d-Cs-烷基?？梢蕴峒暗?、單環(huán)或多環(huán)、任選地單或多取代的芳基的實例是被l、2或3個相同或不同的取代基取代的苯基和萘基，取代基選自d-Cs-烷基，例如甲基、乙基、異丙基或正丙基、正、異、仲或叔丁基、正戊基或異戊基；羥基、巰基、M、硝基或囟素例如F、Br、Cl。式I的酯可以衍生自例如直鏈或支鏈的、任選地單或多不飽和的、任選地取代的C廣Cu-單羧酸?？梢蕴峒袄顼柡退?，例如曱酸、乙酸、丙酸和正丁酸及異丁酸、正戊酸及異戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一碳酸；單不飽和酸，例如丙烯酸、巴豆酸；和二不飽和酸，例如山梨酸。如果酸包含雙鍵，則其可以是順式和反式。本發(fā)明還涉及編碼上述蛋白質(zhì)、功能等價物或突變體的多核苷酸、以及所述多核苷酸的功能等價物、它們的互補多核苷酸、及可以與它們雜交的核^f列。本發(fā)明尤其涉及包含SEQIDNO:7的核酸序列中至少30個連續(xù)核苷酸殘基的核苦,列的那些多核苷酸。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其中在對應于SEQIDNO:8的tt酸位置263的區(qū)域中的密碼子選自GTT和GTC。本發(fā)明還涉及包含與至少一個調(diào)節(jié)核酸序列可操作連接的至少一個上述多核苷酸的表達盒。本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)化真核或原核宿主的重組載體，該載體包含上述多核香酸或上述表達盒。本發(fā)明還涉及用于制備上述蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)內(nèi)源性產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的微生物或轉(zhuǎn)化了上述載體的微生物，和從培養(yǎng)物分離所述蛋白質(zhì)。在此方面，適宜的方法使用具有保藏號DSM13176的穎殼假單胞菌(植物伯克霍爾德氏菌)LU2023微生物或衍生自其的微生物。本發(fā)明還涉及可以通過上述方法獲得的、如上定義的蛋白質(zhì)及其功能等價物或突變體。本發(fā)明還涉及具有保藏號DSM13176的穎殼假單胞菌(植物伯克霍爾德氏菌)LU2023及其變體和突變體。本發(fā)明還涉及帶有如上所定義的載體的微生物。本發(fā)明還涉及使用如上所定義的蛋白質(zhì)(包括功能等價物和突變體)進行對映選擇性酯水解的方法，該方法包括a)使所述蛋白質(zhì)與式I的旋光酯的立體異構(gòu)體混合物接觸；和b)從反應介質(zhì)獲得由任何所述立體異構(gòu)體的立體選擇性水解產(chǎn)生的旋光化合物和/或未水解的酯對映體。本發(fā)明還涉及用于對映選擇性酯交換的方法，包括a)在如上所定義的蛋白質(zhì)(包括功能等價物和突變體)存在下使式I的酯與式II的旋光醇的立體異構(gòu)體混合物接觸，和從反應介質(zhì)獲得未反應的醇立體異構(gòu)體；或b)在如上所定義的蛋白質(zhì)(包括功能等價物和突變體)存在下使式II的醇與式I的旋光酯的立體異構(gòu)體混合物接觸，和從反應介質(zhì)獲得包含在所述酯中的旋光醇的立體異構(gòu)體。根據(jù)該方法的一個具體變體，在酯交換中乙烯基酯用作旋光醇的?；瘎?。本發(fā)明尤其涉及如上所定義的方法，其中反應介質(zhì)是有機溶劑。2.—般術語解釋"酯酶"或"丁炔醇酯酶"或"丁炔醇I酯酶"是催化至少一種本文所述酶轉(zhuǎn)化作用的酶，尤其是至少催化參照物羧酸(特別是丁酸)的丁炔醇酯，例如丁酸丁炔醇酯，如丁酸丁-3-炔2-基酯斷裂的酶。根據(jù)本發(fā)明，除非另有指明，自具體公開的序列"衍生"的序列或與其"同源"的序列，例如衍生的M酸序列或核酸序列，是指與起始序列具有至少80%或至少90%,特別是91%,92%,93%,94%，95%,96%,97%,98%和99%，同一性的序列。兩個核酸之間的"同一性"指在核酸全長上的核香酸同一性，尤其是利用Informax的VectorNTISuite7.1軟件(USA)和Clustal方法(Higginsl)G，SharpPM.微型計算機上快速靈敏的多序列比對，ComputAppl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1)，通過設置如下參數(shù)進行比較而計算得出的同一性多重比對參數(shù)空位開放罰分10空位延伸罰分10空位分隔罰分范圍8空位分隔罰分關比對延遲的％同一性40殘基特異空位(Residuespecificgaps)關親水殘基空位關轉(zhuǎn)換權重(Transitionweighing)0成對比對參數(shù)FAST算法開K-tuple大小1空位罰分3窗口大小5最佳對角線數(shù)53.本發(fā)明的其它實施方案3.1本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明不限于具體公開的具有酯酶活性的蛋白質(zhì)和酶，而是還延伸至其功能等價物。為了本發(fā)明的目的，具體公開的酶的"功能等價物"或類似物是與所述酶不同且具有期望的生物活性如水解活性的多肽。"功能等價物"例如可以指在所用的酯酶活性測定試驗中與包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的酶的活性相比活性高或低至少1%，例如至少10%或20%，例如至少50%或75%或卯％的酶。此外，功能等價物優(yōu)選在pH4至10是穩(wěn)定的，其最適pH有利地是pH5至9，如pH6至8，且其最適溫度為15。C至80。C或20°C至70。C。酯酶活性可以利用已知的測定試驗檢測。非限制性地，可以提及使用參照底物例如丁酸丁炔醇酯，如丁酸丁-3-炔-2-基酯在標準化條件(例如，20mM底物，10mM磷酸緩沖液，pH7.4，T=20。C)下實施的測定試驗。根據(jù)本發(fā)明"功能等價物"尤其還可以指與具體提及的序列在上述氨基酸序列的至少一個序列位置上具有不同氨基酸但是仍具有上述生物活性之一的"突變體，，。由此，"功能等價物"包括可以通過一個或多個氨基酸添加、替代、缺失和/或倒置而獲得的突變體，其中對于所述修飾而言可以發(fā)生在任何序列位置，只要它們導致的突變體具有本發(fā)明的性質(zhì)譜即可。功能等價物尤其還存在于突變體和未修飾的多肽之間反應模式定性相同的情況下，即，例如，以不同的速率轉(zhuǎn)化相同的底物。適宜的tt酸替代的實例總結(jié)在下表中原始氨基酸替代實例AlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAsnGluAspGlyProHisAsn;GinlieLeu;ValLeulie;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;liePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheVallie;Leu過定義，即，SEQIDNO:2或8的氨基酸序列區(qū)域12-20,185-195和258-268，特別是SEQIDNO:2或8的氨基酸序列位置16，190和263。適宜的氨基酸替代的具體實例是Leul6Pro，Hel90Thr,Ilel卯Arg和11e263Val。其它修飾是本領域技術人員基于本發(fā)明的教導可以容易地提供的。上述意義的"功能等價物"也可以是所述多肽的"前體"以及所述多肽的"功能衍生物"和"鹽"。"前體"在此是具有或不具有期望生物學活性的、多肽的天然或合成前體。表述"鹽，，是指本發(fā)明蛋白質(zhì)分子的羧基基團的鹽以及氨基基團的酸加成鹽。氛基基團的鹽可以以本身已知的方式產(chǎn)生，包括無機鹽，例如鈉、鈣、銨、鐵和鋅鹽，和與有機堿，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等的鹽。酸加成鹽，例如與無機酸，例如鹽酸或硫酸的鹽和與有機酸14如乙酸和草酸的鹽，也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明多肽的"功能衍生物，，也可以使用已知技術在官能性氨基酸側(cè)鏈基團上或在多肽的N末端或C末端產(chǎn)生。此類衍生物包括例如羧酸基團的脂族酯、羧酸基團的酰胺(可以通過與氨或與伯或仲胺反應獲得)；游離氨基基團的N-?；苌?通過與?；鶊F反應產(chǎn)生)；或游離羥基基團的O-?；苌?通過與?；鶊F反應產(chǎn)生)。"功能等價物，，天然地還包括可以從其它生物獲得的多肽以及天然變體。例如，可以通過序列比較確立同源序列區(qū)的區(qū)域，并可以基于本發(fā)明的特定參數(shù)確定等價的酶。"功能等價物"還包括例如展示出期望生物學功能的本發(fā)明多肽的片段，優(yōu)選單個結(jié)構(gòu)域或序列基序。"功能等價物"還可以是融合蛋白，其以功能性N端或C端連接方式(即，融合蛋白的各部分相互之間無實質(zhì)上的功能損害)具有上述多肽序列之一或衍生自其的功能等價物和至少一個另外的功能不同的異源序列。該異源序列的非限制實例是例如信號肽、組氨酸錨或酶。還包括在本發(fā)明中的"功能等價物"是具體公開的蛋白質(zhì)的同源物。按照Pearson和Lipman，Proc.Natl.Aead，Sci.(XJSA)85(8)，1988，2444-2448的算法計算，其與具體公開的氨基酸序列之一具有至少60%，優(yōu)選至少75%,尤其是至少85%,例如90，91,92，93，94，95，96，97,98或99%同源性。根據(jù)本發(fā)明，同源性多肽的同源性百分數(shù)尤其是指基于本文具體公開的氨基酸序列之一的總長度的氨基酸殘基同一性百分數(shù)。在可能蛋白質(zhì)糖基化的情況下，本發(fā)明的"功能等價物，，包括以上所述類型的蛋白質(zhì)的脫糖基化形式或糖基化形式以及可以通過改變糖基化模式而獲得的修飾形式。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的同源物可以通過蛋白質(zhì)的誘變，如點突變、延伸或截短來制備。本發(fā)明蛋白質(zhì)的同源物可以通過篩選突變體(如截短突變體)組合文庫來鑒定。例如，可以在核酸水平上進行組合誘變，例如，通過酶促連接15合成的寡核苷酸的混合物，制備多樣化蛋白質(zhì)變體文庫。有大量的方法可以用于從簡并寡核苷#列產(chǎn)生潛在同源物的文庫。簡并基因序列可以在自動DNA合成儀上化學合成，然后可以將合成的基因連接入適宜的表達載體中。利用一組簡并基因可以在一個混合物中提供編碼一組期望的潛在蛋白質(zhì)序列的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法是本領域技術人員已知的(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Bioehem.53:323;Itakura等(1984)Science198:1056;Ike等(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。在現(xiàn)有技術中，已知幾種技術可以用于篩選通過點突變或截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物，和用于從cDNA文庫中篩選具有選擇的性質(zhì)的基因產(chǎn)物。這些技術可以經(jīng)改動而適應于快速篩選通過組合誘變本發(fā)明同源物而產(chǎn)生的基因文庫。最常用于篩選大型基因文庫的、基于高通量分析的技術包括在可復制表達載體中克隆基因文庫，用所得載體文庫轉(zhuǎn)化適宜細胞，和在如下條件下表達組合基因，其中在所述條件下對期望活性的檢測將利于分離包含編碼所檢測到的產(chǎn)物的基因的載體。遞歸整體誘變(RecursiveEnsembleMutagenesis,REM),—種增加文庫中功能性突變體的頻率的技術，可以與這些篩選試驗聯(lián)用以鑒定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。本發(fā)明酯酶的功能等價物的其它實例包含例如衍生自SEQIDNO:3，4,5或6的至少一個部分序列，其中與具體公開的部分序列相比一個或多個氨基酸已被替代、缺失、倒置或添加，并且其中酯酶活性與天然蛋白質(zhì)的酯酶活性相差不超^±±90%或±50%，優(yōu)選不超iti30。/。。本發(fā)明酯酶尤其可以從保藏號DSM13176的穎殼假單胞菌LU2023獲得。其它菌林變體可以例如從穎殼假單胞菌LU8093起始，通過選擇，例如在具有乙酸乙基苯基酯作為唯一碳源的極限培養(yǎng)基板上培養(yǎng)而獲得。3.2編碼核酸序列本發(fā)明還涉及編碼具有酯酶活性的酶的核酸序列。優(yōu)選包含SEQIDNO:7的序列的核酸序列；或衍生自SEQIDNO:8的氨基酸序列的核,列。本文中提及的所有核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)均可以以本身已知的方式，通過從核香酸結(jié)構(gòu)單元化學合成的方式，例如，通過雙鏈的重疊互補的各單個核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮合來產(chǎn)生。寡核苷酸的化學合成可以例如以已知方式，通過亞磷酰胺法(Voet，Voet，2ndedition,WileyPress,NewYork,pages896-897)進行。收集合成的寡核苷酸、利用DNA聚合酶的KIenow片段補平缺口、和連接反應、以及一般的克隆技術描述在Sambrook等(1989)，MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中。本發(fā)明還涉及可以例如使用人工核苷酸類似物獲得的、編碼上述任何多肽和其功能等《介物的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cI)NA和mRNA)。本發(fā)明不僅涉及編碼本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)或其生物活性片段的分離的核酸分子，還涉及可以用作例如雜交探針或引物用于鑒定或擴增本發(fā)明編碼核酸的核酸片段。本發(fā)明核酸分子還可以包括來自編碼遺傳區(qū)3，和/或5，末端的非翻譯序列。從本發(fā)明核苷酸序列可以制備探針和引物用于鑒定和/或克隆其它細胞類型和生物中的同源序列。此類探針和引物一般包含在"嚴緊"條件(見下述)下與本發(fā)明核酸序列之有義鏈或相應的反義鏈中的至少大約12個，優(yōu)選至少大約25個，例如大約40、50或75個連續(xù)核苷酸雜交的核苷^列區(qū)。"分離的"核酸分子與其天然來源中存在的其它核酸分子相分離，并且如果其通過重組技術生產(chǎn)則還可以基本上不含有其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者如果通過化學合成則還可以不含化學前體或其它化學藥品。息分離。例如，可以從適宜的cDNA文庫，使用具體公開的完整序列之-17或其片段作為雜交探針，并利用標準雜交技術(見例如Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch,E.F.andManiatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中所述)，分離cDNA。此夕卜，可以使用基于所公開的序列之一構(gòu)建的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應分離包含該序列或其片段的核酸分子。可以將以此方式擴增的核酸克隆入適宜載體，并可以通過DNA序列分析進行表征。本發(fā)明的寡核苷酸也可以通過標準合成方法，例如^f吏用自動DNA合成4義制備。本發(fā)明核酸序列，例如SEQIDNO:7或其衍生物、這些序列的同源物或部分，可以例如通過通常的雜交技術或PCR技術從其它細菌，例如通過基因組或cDNA文庫分離。這些DNA序列將在標準條件下與本發(fā)明序列雜交。"雜交"是指多核苷酸或寡核苷酸能夠在標準條件下與幾乎互補的序列結(jié)合，而在這些條件下非互補的配偶體之間不發(fā)生非特異性結(jié)合。為此，序列可以具有90-100%互補性。互補序列能夠彼此特異性結(jié)合的性質(zhì)可以用于例如Northern印跡或Southern印跡中或用于PCR或RT-PCR的引物結(jié)合中。短寡核苦酸的保守區(qū)可以有利地用于雜交。然而，也可以使用本發(fā)明核酸的更長片段或完整序列用于雜交。這些標準條件因所用核酸(寡核苷酸、較長的片段或完整序列)或因用于雜交的核酸的類型——DNA或RNA——而異。例如，對于DNA:DNA雜交體，解鏈溫度比具有相同長度的DNA:RNA雜交體的解鏈溫度低大約10°C.例如，取決于具體核酸，標準條件可以意味著在具有0.1至5xSSC(1XSSC=0.15MNaCl,15mM檸檬酸鈉，pH7.2)濃度的水性緩沖溶液中，或者額外地還存在50。/。甲酰胺的情況下，42至58。C的溫度，例如，在5xSSC，50。/。甲酰胺中42。C。有利地，對于DNA:DNA雜交體，雜交條件是0.1xSSC和大約20至45X:，優(yōu)選地大約30至45。C。.對于DNA:RNA雜交體，雜交條件有利地是0.1xSSC和大約30。C至55。C,優(yōu)選地大約45°C至55°C.。上述雜交溫度是針對長度大約100個核苷酸且具有50%G+C含量的核酸在不存在曱酰胺的情況下計算的解鏈溫度值的實例。DNA雜交的實驗條件描述在相關遺傳教科書中，例如，Sambrook等，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989，并且可以4吏用本領域才支術人員已知的公式，例如，根據(jù)核酸的長度、雜交體的類型或G+C含量計Ausubel等(eds),1985,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork;Hames和Higgins(eds),1985，NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(ed)，1991，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。"雜交，，尤其可以使用嚴緊條件進行。該雜交條件例如描述在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.，Maniatis,T.，in:MolecularCloning(A■LaboratoryManual),第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，9.31-9.57頁或CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。"嚴緊"雜交條件尤其指在由50。/。甲酰胺，5xSSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt溶液，10%硫酸葡聚糖和20g/ml變性剪切的鮭精DNA組成的溶液中42。C溫育過夜，之后用().lxSSC于65。C洗滌雜交濾膜。本發(fā)明還涉及具體公開的或可衍生的核酸序列的衍生物。因此，本發(fā)明的其它核酸序列可以例如從SEQIDNO;7衍生并可以與其相差一個或多個核苷酸的添加、替換、插入或缺失，但仍編碼具有期望性質(zhì)譜的多肽。本發(fā)明還涵蓋包含"沉默"突變或與具體公開的序列相比根據(jù)特定來源或宿主生物的密碼子使用已發(fā)生改變的核酸序列，以及天然變體，例如其剪接變體或等位基因變體。本發(fā)明還涉及可以通過保守核苷酸替代(即，目的氨基酸被具有相同19電荷、大小、極性和/或溶解性的氨基酸置換)獲得的序列。傳多態(tài)性可以因自然變異而存在于一個群體的個體之間。這些天然變異通常在一個基因的核苷酸序列中造成1至5%的變異。具有本發(fā)明SEQIDNO:7序列的核酸序列的衍生物是指例如在衍生的氨基酸的水平上、在全長序列范圍上、具有至少60。/。同源性、優(yōu)選地至少80%同源性、非常特別優(yōu)選地至少卯％同源性(關于氨基酸水平上的同源性，應參考以上就多肽給出的細節(jié)描述)的等位基因變體。有利地，同源性在序列的部分區(qū)域可以更高。此外，衍生物也應理解為指本發(fā)明核酸序列，尤其是SEQIDNO:7序列的同源物，例如真菌或細菌同源物、截短序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。例如，SEQIDNO:7的同源物可以在DNA水平上、在SEQIDNO:7的全長DNA區(qū)域上，具有至少40%、優(yōu)選地至少6()%、特別優(yōu)選地至少70%、非常優(yōu)選地至少80%同源性。此外，衍生物應理解為還指例如與啟動子的融合物。位于所述核苷酸序列上游的啟動子可以通過至少一個核苷酸改變、至少一個插入、倒置和/或缺失進行改變而不損害啟動子的功能性或功效。而且，可以通過改變啟動子的序列或者將其完全置換成更有效的啟動子(甚至不同屬生物的啟動子)，增加啟動子的功效。3.3本發(fā)明構(gòu)建體本發(fā)明還涉及表達構(gòu)建體，其包含在調(diào)節(jié)核酸序列的遺傳控制下的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列；并涉及包含至少一個所述表達構(gòu)建體的載體。根據(jù)本發(fā)明，"表達單位"是指具有表達活性的核酸，其包含本文所定義的啟動子并且在與待表達的核酸或基因功能性連接后可以調(diào)節(jié)該核酸或該基因的表達，即，轉(zhuǎn)錄和翻譯。在本文中，因此，其也稱作"調(diào)節(jié)核酸序列，，。除了啟動子外，還可以存在其它調(diào)節(jié)元件例如增加子。根據(jù)本發(fā)明，"表達盒"或"表達構(gòu)建體"是指與待表達的核酸或待表達的基因功能性連接的表達單位。因此，與表達單位不同，表達盒不僅20包含調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸序列還包含應作為轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果表達為蛋白質(zhì)的核^列。在本發(fā)明中，術語"表達"或"過表達"是指^:生物中由相應DNA編碼的一種或多種酶的細胞內(nèi)活性的出現(xiàn)或增加。為此，可以例如將基因插入基因組、將現(xiàn)有基因置換成另一基因、增加(一個或多個)基因的拷貝數(shù)、使用強啟動子或使用編碼具有高活性的相應酶的基因、以及任選地可以將這些手段組合。優(yōu)選地，本發(fā)明構(gòu)建體包含位于相應編碼序列5，上游的啟動子和3，下游的終止序列、以及任選地其它有用的調(diào)節(jié)元件，其中所有元件均與編碼序列可操作連接。"啟動子"、"具有啟動子活性的核酸"或"啟動子序列"在本發(fā)明中是指與待轉(zhuǎn)錄的核酸功能性連接并調(diào)節(jié)該核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸。"功能性，，或"可操作，，連接在此是指例如具有啟動子活性的核酸之序列以及例如終止子順序排列，該排列方式導致每一個調(diào)節(jié)元件都可以在核酸序列的轉(zhuǎn)錄過程中實現(xiàn)其功能。這并不一定要求化學意義上的直接連接。例如，遺傳控制序列，如增強子序列，也可以從距乾序列較遠的位置或者甚至從其它DNA分子上對耙序列產(chǎn)生作用。優(yōu)選的排列方式是待轉(zhuǎn)錄的核酸序列位于啟動子序列的下游(即，3，端)以便兩個序列彼此共價連接。啟動子序列和待轉(zhuǎn)基因表達的核^列之間的距離可以小于200堿基對、或小于100堿基對或小于50堿基對。除了啟動子和終止子外，可以提及的其它調(diào)節(jié)元件的實例是引導序列、增強子、多腺苷酸化信號、選擇標記、擴增信號、復制起點等。適宜的調(diào)節(jié)序歹廿描述在例^口Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。本發(fā)明核酸構(gòu)建體尤其可以包含SEQIDNO:7的序列或其衍生物和同源物以及可以衍生自SEQIDNO:8的核酸序列，有利地這些序列已經(jīng)與用于控制如增加基因表達的一個或多個調(diào)節(jié)信號可操作地或功能性地連接。除了上述調(diào)節(jié)序列外，這些序列的天然調(diào)節(jié)作用仍可以存在于實際結(jié)構(gòu)基因的上游，任選地可以進行遺傳改變以便關閉天然調(diào)節(jié)作用和增加基因的表達。然而，核酸構(gòu)建體也可以具有較簡單的設計，即，在編碼序列(例如SEQIDNO:7或其同源物)的上游不插入任何額外的調(diào)節(jié)信號并且不除去天然啟動子及其調(diào)解作用。相反地，可以突變天然調(diào)解序列以使調(diào)解作用不再發(fā)生和增加基因表達。有利的是，優(yōu)選的核酸構(gòu)建體還可以包含一個或多個與啟動子功能性連接的上述增強子序列，以允許增加核酸序列的表達。也可以將其它有利的序列，例如其它調(diào)解元件或終止子，插在DNA序列的3，末端。構(gòu)建體中可以包含本發(fā)明核酸的一個或多個拷貝。構(gòu)建體也可以包含其它標記，例如抗生素抗性或輔源營養(yǎng)互補基因，任選地用于構(gòu)建體的選擇。適宜調(diào)節(jié)序列的實例包含在啟動子中，所述啟動子例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、X-PR或k-Pt啟動子，它們可以有利地用于革蘭氏陰性細菌中。其它有利的調(diào)節(jié)序列包含在例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02中，以及酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。也可以將人工啟動子用于調(diào)節(jié)。例如，有利地，將核酸構(gòu)建體插入宿主生物的載體中，例如質(zhì)?；蚴删w，以允許基因在宿主中最佳表達。除了質(zhì)粒和噬菌體外，載體還應理解為指本領域技術人員已知的所有其它載體，即，例如，病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、質(zhì)粒、粘粒、和線性或環(huán)狀I)NA。這些載體可以在宿主生物中自主復制或可以隨染色體復制。這些載體是本發(fā)明的再一實施方案。適宜的質(zhì)粒例如是，在大腸桿菌(E.coli)中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN-III113-Bl、XgtllorpBdCI;在鏈霉菌(Streptomyces)中，pI,T101，pIJ364，pIJ702或pIJ361;在芽孢桿菌(Bacillus)中，pUB110，pC194或pBD214;在棒狀桿菌(C()rynebacterium)中，pSA77或pAJ667;在真菌中，pALSl，pIL2或pBB116;在酵母中，2aM，pAG-l，YEp6，YEpl3或pEMBLYe23;或在植物中，pLGV23，pGHlac+,pBIN19，pAK2004或pDH51。上述質(zhì)粒是可選的可能質(zhì)粒的一小部分。其它質(zhì)粒是本領域技術人員熟知的，并且可以參見例如教科書克隆載體(Eds.PouwelsP.H.等Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。在載體的再一實施方案中，包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或本發(fā)明核酸的載體也可以有利地以線性DNA的形式引入微生物中并通過異源或同源重組整合在宿主生物的基因組中。該線性DNA可以包含線性化的載體例如質(zhì)?；騼H僅是本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸。為了異源基因在生物中的最佳表達，有利的是依據(jù)生物的具體密碼子使用來改變核酸序列。密碼子使用可以容易地通過計算機評價所述生物的其它已知基因來確定。本發(fā)明表達盒可以基于適宜啟動子與適宜編碼核苷酸序列以及終止信號或多腺苷酸化信號的融合而制備。為此，可以使用通常的重組和克隆技術，這些技術描述在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989);以及T丄Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984);以及A訓bel,F.M.etal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中。有利地，可以將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體插入用于在適宜宿主生物中表達的宿主特異性載體中，這樣使得基因可以在宿主中獲得最佳表達。載體是本領域技術人員熟知的并可以參見例如"CloningVectors"(PouwdsP.H.etal"Publ.Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)。3.4可以用于本發(fā)明的微生物23根據(jù)上下文，術語"微生物"是指起始微生物(野生型)或遺傳修飾性重組微生物，或兩者。利用本發(fā)明載體，可以制備轉(zhuǎn)染了例如至少一個本發(fā)明載體并可以用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的重組微生物。有利地，可以將上述本發(fā)明重組構(gòu)建體插入適宜的宿主系統(tǒng)并表達。優(yōu)選地，可以使用本領域技術人員熟知的一般克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如，共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，以便在特定表達系統(tǒng)中實現(xiàn)所述核酸的表達。適宜的系統(tǒng)描述在例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等，Publ.WileyInterscience，NewYork1997，或Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中。原則上，任何原核或真核生物均可以考慮用作本發(fā)明核酸或核酸構(gòu)建體的重組宿主生物。有利地，使用微生物，例如細菌、真菌或酵母作為宿主生物。有利的是，使用革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，優(yōu)選腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單月包菌禾牛(Pseudomonadaceae)、才艮瘤菌科(Rhizobiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)或諾卡氏菌科(Nocardiaceae)的細菌，特別優(yōu)選埃希氏桿菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或紅球菌屬(Rhodococcus)的細菌。極其特別優(yōu)選物種大腸桿菌。也可以在以下組中找到其它有利的細菌a-變形菌綱(proteobacteria)，|3-變形菌綱或y-變形菌綱。在此，本發(fā)明宿主生物(一個或多個)優(yōu)選包含至少一個編碼如上所定義的具有酯酶活性的酶的本發(fā)明所述核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體。依據(jù)宿主生物，可以以本領域技術人員已知的方式培養(yǎng)或培育用于本發(fā)明方法中的生物。通常，在包含碳源(通常為糖的形式)、氮源(通常為有機氮源形式如酵母提取物或鹽的形式如硫酸銨)、痕量元素如鐵、錳和鎂鹽以及如果合適的話維生素的液體培養(yǎng)基中，在0。C至100。C，優(yōu)選地10°C至60。C,充氧培養(yǎng)微生物。液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH可以維持在固定值，即，在培養(yǎng)過程中可以調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。可以分批、半分批或連續(xù)地進行培養(yǎng)。養(yǎng)分可以在發(fā)酵開始時提供或者可以隨后、半連續(xù)地或連續(xù)地提供。酮可以在培養(yǎng)過程中，或者有利地在培養(yǎng)后，直接加入?？梢酝ㄟ^實施例中描述的方法從生物體分離酶，或者可以在反應中使用粗提取物形式的酶。3.5酯酶的重組生產(chǎn)本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)多肽生產(chǎn)性微生物、酌情誘導多肽表達和從培養(yǎng)物中分離多肽，重組生產(chǎn)本發(fā)明多肽或其生物學活性功能片段的方法。如果期望，也可以以此方式工業(yè)規(guī)^莫生產(chǎn)所述多肽。可以連續(xù)地或在分批工藝中或在補料分批或重復補料分批工藝中分批地培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明制備的微生物。已知培養(yǎng)方法的綜述參見Chmiel著的教科書(Bioprocesstechnik1.Einftihrungindie!3ioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag，Stuttgart,1991))或參見Storhas著的教科書(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994》。所用培養(yǎng)基必須以合適方式滿足具體菌林的需要。有關用于不同微生物的培養(yǎng)基的描述可以參見美國生物技術學會的手冊"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"(WashingtonD.C.，USA，1981)。可用于本發(fā)明的這些培養(yǎng)基一般包含一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和/或痕量元素。優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、淀粉或纖維素。糖也可以通過復雜化合物，例如糖蜜或糖精煉的其它副產(chǎn)物，加入培養(yǎng)基。也可能有利的是，添加多種碳源的混合物。其它可能碳源是油和脂肪，例如大豆油、葵花油、花生油和可可油，脂肪酸例如棕櫚酸、石更脂酸或亞油酸，醇例如甘油、曱醇或乙醇，和有才幾酸例如乙酸或乳酸。氮源通常是有機或無機氮化合物或包含這些化合物的物質(zhì)。氮源的實例包括氨氣或銨鹽，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸、或復雜氮源，例如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其它。這些氮源可以單獨地或以混合物形式使用?？梢源嬖谟谂囵B(yǎng)基中的無機鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。無機含石克化合物，例如，硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物，以及有機硫化合物，例如硫醇(mercaptans及thiols),可以用作At源。磷酸、磷酸二氫鉀、或磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽可以用作磷源?？梢詫Ⅱ蟿┘尤肱囵B(yǎng)基以將金屬離子保持在溶液中。特別適宜的螯合劑包括二羥基苯酚類，例如，兒茶酚或原兒茶酸酯，或有機酸如檸檬酸。本發(fā)明所用發(fā)酵培養(yǎng)基通常也包含其它生長因子，例如維生素或生長促進劑，包括例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長因子和鹽常常來自培養(yǎng)基的復雜成分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。此外，適宜的前體可以加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中化合物的精確組成強烈地取決于具體實驗，并且必須針對每一個具體情況單獨地確定。有關培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可以參見教科書"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury，IRLPress(1997)p.53-73，ISBN0199635773)。生長培養(yǎng)基也可以從供應商，例如Standard1(Merck)或BHI(Brainheartinfusion,DIFCO)等獲得。所有培養(yǎng)基成分均通過加熱(20min,1.5bar,121。C)或通過過濾除菌進行滅菌。這些成分可以一起滅菌，或者如果必要的話分開滅菌。所有培養(yǎng)基成分都可以在培養(yǎng)開始時存在，或者任選地可以連續(xù)地或以分批補料的方式添力口。培養(yǎng)溫度通常為15。C至45。C，優(yōu)選20。C至40。C,并且可以在實驗過程中保持恒定或者可以變化。培養(yǎng)基的pH應當在5至8.5的范圍，優(yōu)選大約7.0。用于生長的pH可以在生長過程中通過添加堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，進行控制?？梢允褂孟輨?，例如脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫形成。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中加入具有選擇性作用的適宜物質(zhì)，例如抗生素。將氧氣或含氧氣的氣體混合物，例如空氣，加入培養(yǎng)基以維持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常為20。C至45。C?？梢赃B續(xù)培養(yǎng)直至形成最多的期望產(chǎn)物。通常這在10小時至160小時內(nèi)達到。然后，進一步加工發(fā)酵液。取決于需要，可以從發(fā)酵液中通過分離技術，例如離心、過濾、潷析或這些方法的組合，完全地或部分地分離出生物質(zhì)，或者可以將生物質(zhì)完全留在發(fā)酵液中。如果多肽不分泌至培養(yǎng)基中，則也可以將細胞石皮碎并且而可以從裂解物中通過已知用于分離蛋白質(zhì)的技術獲得產(chǎn)物?？梢匀芜x地利用高頻超聲、利用高壓，例如，在弗氏壓碎器中，利用滲透裂解作用、利用去污劑、溶解酶或有機溶劑的作用、利用勻漿器、或利用所列幾種方法的組合，破碎細胞?？梢允褂靡阎膶游龇椒?，例如分子篩層析(凝膠過濾)、Q-Sepharose層析、離子交換層析和疏水層析、以及利用其它常規(guī)方法例如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳，純化多肽。適宜的方法描述在例如Cooper,F.G"BiochemischeArbeitsmethoden,VerlagWalterdeGruyter，Berlin,NewYork或者Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中。為了分離重組蛋白，可以有利地利用以確定的核苷^列延長cDNA并由此編碼修飾多肽或融合蛋白的載體系統(tǒng)或寡核苷酸，它們可以用于例如簡化純化。適宜的此類修飾是例如，起錨作用的所謂的"標簽"，例如，稱作六組氨酸錨的修飾，或者可以被抗體識別為抗原的表位(參見例如Harlow,E.andLane,D.，1988，Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press)。這些錨可以提供蛋白質(zhì)在(例如用于裝柱的)固相支持物，例如聚合物基質(zhì)上的附著，或者可以用在微量滴定板上或一些其它支持物上。同時，這些錨還可以用于蛋白質(zhì)的識別。為了識別蛋白質(zhì)，也可以使27用普通標記，例如熒光染料和在與底物反應后形成可檢測反應產(chǎn)物的酶標記、或放射性標記，這些標記可以單獨使用或者與錨聯(lián)用以衍生化蛋白質(zhì)。3.6本發(fā)明酯酶的應用本發(fā)明還涉及使用酯酶進行對應選擇性酯水解的方法，該方法包括使酯酶與式I的旋光酯的立體異構(gòu)體混合物接觸和從反應介質(zhì)中獲得由兩種立體異構(gòu)體之任一的立體選擇性水解產(chǎn)生的旋光化合物和/或未水解的酯對映體。然而，酯酶也可以水解非旋光性的式I酯。本發(fā)明還涉及用于對映選擇性酯交換的方法，該方法包括在酯酶存在下使式II的旋光醇的立體異構(gòu)體混合物與式I的酯接觸，和從反應介質(zhì)中獲得未反應的醇立體異構(gòu)體，或者在所述酯酶存在下使式I的旋光酯的立體異構(gòu)體混合物與式II的醇接觸，和從反應介質(zhì)中獲得包含在所述酯中的旋光醇的立體異構(gòu)體。在酯交換中乙烯基酯優(yōu)選用作旋光醇的酰化劑。這是有利的，原因是在轉(zhuǎn)化后，乙烯基酯的醇官能將由于互變異構(gòu)作用不再可用于逆反應。酯酶也可以催化其中酯和醇均無旋光性的酯交換作用。酯水解的優(yōu)選底物是乙醇、丙醇、丁醇，特別優(yōu)選地丁炔醇(丁炔醇酯，l-甲基-丙-2-炔醇的酯)與羧酸，例如，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、乳酸、2-乙基己酸、3-曱基丁酸、甲氧基乙酸、2-曱基丙酸、2-丁烯酸、3-氯代丙酸和2-甲基戊酸，的酯。特別優(yōu)選丁酸丁炔酯和甲基丁酸丁炔酯。在酯交換中優(yōu)選的醇是乙醇、丙醇和丁醇，尤其優(yōu)選丁炔醇。在酯交換中優(yōu)選的酯是乙烯基酯，例如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯。用于以上方法的反應介質(zhì)是有機溶劑，例如，烷、醚、甲苯、二噁烷、曱基異丁基酮、甲基叔丁基醚(MTBE)等。在酯水解中，也可以使用從所用的緩沖溶液和有機溶劑，例如MTBE和庚烷或曱苯制成的混合物。外消旋物的拆分，即，對映選擇性，和反應速率可以通過酸部分的大小和疏水性來影響。本發(fā)明反應優(yōu)選在室溫在pH6至9，特別優(yōu)選pH7.0至7.4進行。酯28酶可以以分離的或純化的酶形式、以表達酯酶的^:生物細胞形式、以所述微生物的培養(yǎng)物上清液、細胞裂解物或提取物的形式、或以固定化酯酶的形式使用?？梢詮姆磻芤褐型ㄟ^本領域技術人員已知的化學或物理分離方法，分離反應產(chǎn)物。可以從反應混合物中通過膜過濾分離酯酶。可以利用聚丙烯酰胺、褐藻酸或角叉菜聚糖固定酯酶。也可以通過已知方法使酯酶共價結(jié)合或吸附在適宜載體上。優(yōu)選通過在硅藻土上凍干或通過發(fā)u酸銨沉淀，固定酯酶。實驗部分除非另行指明，在本發(fā)明范圍內(nèi)實施的克隆步驟，例如，限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、核酸向硝酸纖維素和尼龍膜的轉(zhuǎn)移、DNA片段的連接、微生物的轉(zhuǎn)化、微生物的培養(yǎng)、噬菌體的繁殖和重組I)NA序列分析，可以按照Sambrook等(1989)，如上引文所述進行。實施例1選擇表達酯酶的穎殼假單胞菌突變體篩選的起點是產(chǎn)生脂肪酶的菌林穎殼假單胞菌(伯克霍爾德氏菌)LU8093。利用由所述菌林產(chǎn)生的脂肪酶可以實施許多有意義的反應(Balkenhohl，F(xiàn).etal"J.prakt.Chem.339,(1997)，381-384)。然而，乳酸酯、曱基丁酸酯和苯乙酸酯不是該脂肪酶的底物，并且不能被所述菌林以任何其它方式水解。然而，這些水解產(chǎn)物可以用作碳源。因此，尋找能水解所述酯并能夠使用水解產(chǎn)物作為碳源生長的LU8093的突變體。因此，具有新酯酶活性的突變體應當可以通過在所述酯上的生長而彰顯出自己。選擇條件:將LU8093在培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時，離心收獲。細胞用鹽水洗滌2次。將106個細胞種在含有0.5或1.0g/1苯乙酸乙酯作為唯一碳源的極限培養(yǎng)基平板上。然而，最初并沒有生長。僅在4至6天后可以識別出單菌落。它們的數(shù)目在隨后的天數(shù)里進一步增加。從以此方式獲得的酯酶陽性突變體中，選擇出突變體LU2023。令人驚奇地，該新酯酶活性也適用于選擇性水解小的有機分子。例如，已經(jīng)證實對丁炔醇酯的選擇性水解。實施例2穎殼假單胞菌LU2023的發(fā)酵為了獲得酯酶，以14-1的頻^莫培養(yǎng)穎殼假單胞菌LU2023，收獲活性生物質(zhì)。在實驗室，在具有M12礦物鹽培養(yǎng)基和lg/1EPA的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)穎殼假單胞菌LU2023，28。C溫育36至48小時。然后4。C貯存平板4周。在Inforsxxy141發(fā)酵罐中進行菌抹發(fā)酵。對于預培養(yǎng)，接種250ml培養(yǎng)基2至3Pt環(huán)，200rpm和28。C孵育24小時。主培養(yǎng)在以下條件下進行溫度28。C供氣71/min攪拌600rpm發(fā)酵運行時間大約24h內(nèi)置pH和p02測量用于預培養(yǎng)和主培養(yǎng)的培養(yǎng)基15g/1Springer酵母自溶物65%1.6g/l硫酸鎂x7水0.02g/I氯化4丐x2水3.5g/l磷酸二氬鉀3.5g/l磷酸氫二鉀5g/l磷酸氫二銨6mlPluriolP2000消泡劑將以上成分溶解在去離子水中，用25%濃度的氨溶液調(diào)整溶液至pH6.5。單獨地對5ml/1痕量元素溶液和2g/l葡萄糖進行過濾除菌。30在滅菌和完全培養(yǎng)基后，將0.5g/1苯乙酸乙酯加入發(fā)酵罐中。添加PluriolP2000控制在發(fā)酵過程中出現(xiàn)的泡沫。當發(fā)酵罐中的p02再次增加至高于85%時，終止發(fā)酵。然后在低于15。C的溫度以大約卯OO至10OOOg離心發(fā)酵罐內(nèi)容物，棄去清澈的流出物。將細胞物質(zhì)冷凍在-16。C。實施例3從穎殼假單胞菌LU2023純化酯酶在玻璃砂磨機(IOOml玻璃珠，直徑0.5mm)中4。C和3000rpm裂解穎殼假單胞菌(LU2023)細胞(100ml，濕重50g)。離心(IOOOOrpm，30min)并洗滌玻璃珠后，對上清液(300ml)進行氯化錳沉淀(pH7至7.5;終濃度50mM)。再次離心后，調(diào)整上清液至pH8.0，以50mM濃度加入EDTA。以Q-Sepharose(300ml)層析純化該體積。加樣后，用50mMTris/HCl洗滌柱子。收集目的級分，并超濾(IOOkDa)濃縮。通過分子篩層析(直徑5cm，高卯cm;物質(zhì)S-300)從非特異性酯酶中分離丁炔醇水解酯酶。所得活性級分是混濁的，再次濃縮。明顯地，該酯酶是膜結(jié)合性的。然后首先通過蛋白酶(胰蛋白酶，重量比1:50至1:100)消化該膜級分。這造成除了在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的少數(shù)條帶外其它所有蛋白均自該膜級分中消失。活性被保留下來。所述條帶通過非變性凝膠電泳(0.4。/。SDS)彼此分離，活性測定試驗在該非變性凝膠中鑒定到所述酯酶。從凝膠中洗脫該酯酶，然后該酯酶在變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示為一條清晰條帶。通過印跡將以此方式純化的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并測序，或者在胰蛋白酶切割后通過反向HPLC分離肽并測序。由于蛋白質(zhì)的氨基端被封閉，故僅獲得胰蛋白酶消化肽段。多個氨基^列顯示出與來自洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的黏康酸環(huán)化異構(gòu)酶EC5.5丄1以及來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的內(nèi)酯酯酶具有弱同源性。具有序列AIDAIFAPEGV的肽顯示出與果膠酯酶(EC3.1.1.11)同源。圖1顯示本發(fā)明序列的部分M酸序列與來自熒光假單胞菌的內(nèi)酯特異性酯酶的部分序列的序列比對。實施例4酯酶的固定化使用多種方法進行固定。1.在硅藻土存在下用丙酮沉淀以實質(zhì)性失活酯酶。將25mg蛋白質(zhì)與3.5g硅藻土(Merck)混合，力口入1.41丙酮(-20。C)10分鐘。然后通過G3玻璃吸濾器移出荷載了的支持物，用冷丙酮洗滌過濾殘留物并干燥。2.酯酶不結(jié)合Accurd(Akzo)。3.可以通過凍干將酯酶(2.3單位/g,EPA測定法)固定在硅藻土上。為此，將酶溶液與硅藻土混合，-8(TC冷凍。隨后，凍干法干燥固體物質(zhì)。4.利用硫酸銨沉淀固定酯酶(454毫單位/g，EPA測定法)。為此，以80%飽和硫酸銨在珪藻土存在下沉淀該酶。實施例5使用來自穎殼假單胞菌LU2023的酯酶進行外消旋物拆分操作過程(標準方法)在攪拌下在磷酸緩沖液(200ml，10mM，pH7.4)中使100單位酯酶與20mmol丁酸丁炔醇酉旨(丁酸l-曱基丙-2-炔基酉旨)反應。連續(xù)測量pH并通過添加氫氧化鈉溶液保持在大約pH7.4。在表l所示時間，取樣并用甲基叔丁基醚(MTBE)提取兩次，并通過GC(ChiraldexGTA)分析有機相?？梢酝ㄟ^膜過濾從反應混合物中移出該酯酶。隨著較不優(yōu)選的酯對映體的濃度增加，有越多的該對映體被轉(zhuǎn)化。在大約45分鐘后，這造成反應混合物中S-丁炔醇的ee的下降。該產(chǎn)物的ee在大約30至40分鐘后達到其最大值，84%(83-97.9%)。在卯分鐘的過程中底物的ee增加至超過99%。ee(對映體過量)定義為以百分數(shù)表示的優(yōu)選轉(zhuǎn)化的對映體的量減去以百分數(shù)表示的較不優(yōu)選轉(zhuǎn)化的對映體的量。在大多數(shù)情況下，這相應于光學純度。在30分鐘內(nèi)pH的下降是線性的。從大32約100分鐘以后，pH的改變可忽略不計。提取后，水相中殘余的酯酶活性仍為大約50%。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表1顯示酯酶轉(zhuǎn)化丁酸丁炔醇酯時的時間依賴性對映體過量。根據(jù)Cahn，Prelog和Ingold的R/S約定，R和S構(gòu)型定義手性分子的兩種對映體。該轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化的酯在反應混合物中的比例。實施例6酯酶特異性對酯的酸部分的大小和疏水性/電荷的依賴性標準方法在攪拌下在磷酸緩沖液(200ml，10mM，pH7.4)中使100單位酯酶與2()mmo1丁炔醇酯反應。連續(xù)測量pH,并通過連續(xù)滴定將其4呆持在pH7.0。取出的樣品用曱基叔丁基醚(MTBE)提取兩次，通過GC(ChiraldexGTA)分析有機相。結(jié)果外消旋物拆分的質(zhì)量和反應速度取決于酸部分的大小和疏水性。丁炔醇酯酶的最佳底物是丁酸丁炔醇酯和甲基丁酸丁炔醇酯。脂肪酶對于這些底物是無活性的。對于長鏈酯，例如正癸酸丁炔酯，這也是事實。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表2顯示酯酶的酯轉(zhuǎn)化的對映體過量取決于轉(zhuǎn)化的酯的酸部分。實施例7使用酯酶在有機介質(zhì)中進行酯交換將lOmmol外消旋-丁炔醇和5mmo1丁酸乙烯基酯溶解在50ml曱基叔丁基醚(MTBE)中，與硅藻土支持物上的9單位酯酶(3.3^混合，室溫振蕩混合物24小時。過濾后，除去溶劑，通過GC表征產(chǎn)物混合物。以47。/。轉(zhuǎn)化率，剩余(R)-丁炔醇(18。/。ee)和(S)-丁炔醇的丁酸酯(45。/。ee)。在曱基異丁基酮中，以43%轉(zhuǎn)化率獲得了具有16%ee的(R)-丁炔醇和具有52%ee的(S)-丁炔醇的丁酸酯。表3顯示以酯酶轉(zhuǎn)化酯時的對映體過量取決于轉(zhuǎn)化的酯的酸部分表3<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>物編號[oq溶液[mmol/l8正癸酸丁炔酯7.0RT磷酸IO無54.3714正戊酸丁炔酯7.0RT磷酸IO無80.40152-乙基己酸丁炔酯7.0RT磷酸10無81.7716丁酸丁炔酯7.0RT磷酸IO無83.卯17丁酸丁炔酯7.0RT磷酸IO0.5%Triton80.8318正己酸丁炔酯7.0RT磷酸IO0.5%Triton78.6319正辛酸丁炔酯7.0RT磷酸IO0.5%Triton74.7020丁酸丁炔酯7.0RT褲酸IO10%正丙醇87.4721丁酸丁炔酯7.0RT磷酸101MNaCl85.7023正戊酸丁炔酯7.0RT磷酸IO0.5%Triton84.4024丁酸丁炔酯6.0RT褲酸10無85.3725丁酸丁炔酯8.0RTTris10無85.3326丁酸丁炔酯7.010磷酸IO無85.卯27丁酸丁炔酯7.037磷酸IO無75.67283-甲基丁酸丁炔酯7.0RT磷酸IO無卯.5029甲氧基乙酸丁炔酯7.0RT轔酸10無76.3331丁酸丁炔酯7.0RT磷酸10無85.0032丁酸丁炔酯7.0RT磷酸IO2-相體系84.93333-甲基丁酸丁炔酯7.0RT磷酸102-相體系92.70342-曱基丙酸丁炔酯7.0RT磷酸10無89.17352-丁烯酸丁炔酯7.0RT磷酸IO無76.03363-氯代丙酸丁炔酯7.0RT磷酸IO無71.13402-甲基戊酸丁炔酯7.0RT磷酸10無85.931)S-丁炔醇的ee的3個最佳值的平均值實施例8:制備菌林LU2023的基因文庫和克隆LU2898a)獲得染色體DNA:在100mlFP培養(yǎng)基(BectonDickinsonGmbH)中28。C和180rpm培養(yǎng)LU2023(參見以上實施例1和2)24小時。離心(2000rpm/5min)收獲細胞，重懸浮于5ml裂解緩沖液l(0.41M蔗糖，0.01MMgS04*7H20,50ml/LM12培養(yǎng)基(10x濃度)，10ml/L10%KH2P04pH6.7，2.5mg/ml溶35菌酶[臨用前加入)中，37。C溫育大約4小時。離心(2000rpm/20min)后，在無溶菌酶的5ml裂解緩沖液l中洗滌所得的原生質(zhì)體(2000rpm/20min)，重懸浮于10mMTRIS-HC1pH8.0中。用10mMTRIS-HC1pH8.0(3000rpm/5min)再次洗滌后，沉淀重懸于4mlTE緩沖液(IOmMTRIS-HC1,1mMEDTA，pH8)中，與SDS(10%w/v)和NaCl(5M)各0.5ml混合。之后加入100fil蛋白酶K溶液(200pg/ml),37。C溫育16小時。之后，向溶液中加入TE緩沖液至終體積10ml。該溶液與苯酚l:l混合。離心(4000rpm/5min)后，移出上相，與苯酚、氯仿和異戊醇(12:12:1)的混合物混合。移出上相，與一體積氯仿異戊醇(24:1)混合。重復該過程直至上相清澈。通過加入2體積乙醇和1/50體積CH3COONa(3M)在-20。C從上相沉淀DNA(持續(xù)時間大約30min)，離心(12000rpm，30min，4。C)沉淀，重懸于TE緩沖液中。37°C以RNase(1ml的20jtig/ml溶液)水解RNA1小時。然后在TE緩沖液中4。C透析該溶液3次，每次1小時。通過添加乙醇(2體積加1/3體積LiCl,2M)并在-20。C溫育30分鐘，在每0.4ml的等分試樣中沉淀DNA。離心(15000rpm，30min，4。C)沉淀DNA，然后干燥。將0.4ml等分試樣的DNA重懸在0.5mlTE緩沖液中。b)DNA的限制性消化和克隆用120UPstl于37。C消化lpg染色體DNA180min。用160UPstl限制性消化0.4pg的pUC19(如，NewEnglandBiolabs)(lh，37。C)，之后用堿性磷酸酶脫磷酸化(lh，37。C加上65。C滅活15分鐘)。使用快速連接試劑盒(Roche)連接DNA片段(室溫2h)。根據(jù)廠商信息，用連接混合物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(Stratagene)。在IPTG/X-GalFP(含有100]ng/ml氨千青霉素的FP培養(yǎng)基)平板上劃線培養(yǎng)細胞，37。C溫育16小時。在含有氨芐青霉素的新鮮FP平板上劃線培養(yǎng)白色菌落。c)基因文庫篩選使用無菌絨墊將菌落轉(zhuǎn)移至Whatman濾紙上。將濾膜置于2.5ml試驗溶液(10mMTRIS*HC1，pH7.5，0.01。/。溴曱酚紫，0.1%外消旋酯[外消旋-乳酸曱酉旨(MEE)或外消旋-甲基丁酸乙酯或外消旋-苯乙酸乙酯)中。細胞具有酯酶活性的菌落在5分鐘內(nèi)由藍色變成黃色。分析的2卯0個菌落中，有一個造成強烈的顏色變化。該菌林稱作LU2898。圖2顯示了LU2898的克隆策略的示意圖。實施例9LU2898的重組DNA的序列分析來自LU2898的質(zhì)粒具有7.7kb插入物。大腸桿菌LU2898的包含丁炔醇酯酶基因的質(zhì)粒被完全測序。在DNA數(shù)據(jù)庫中的第一次檢索獲得了一個開》文閱讀框(位置1394至2923)，其中該插入物與水解酶同源。用LU2898丁炔醇酯酶的DNA序列檢索ERGO數(shù)據(jù)庫(IntegratedGenomics,Inc.1999-2004，Chicago,USA)。發(fā)現(xiàn)僅來自該丁炔醇酯酶基因的1384-2397bp的區(qū)域與已知水解酶有同源性。來自1384_2397bp的區(qū)域明顯地是期望的丁炔醇酯酶的DNA。另一個良好的指示是GXSXG基序，該基序是絲氨酸羧基酯酶所典型的，其位于LU2023丁炔醇酯酶的氨基酸位置127-131中。LU2898丁炔醇酯酶基因與洋蔥伯克霍爾德氏菌(B.cepacia)水解酶之間的良好相符性自大約位置2400起終止。該閱讀框再往下與NADP還原酶的3，端有非常明顯的同源性。這些結(jié)果顯示在附圖3中。圖3總結(jié)了ERGO分析結(jié)果。LU2898丁炔醇酯酶中同源性的突然轉(zhuǎn)變與Pstl切割位點相重合。對于所選的克隆策略，Pstl限制性酶的切割位點是預料之外的。該酶纟皮用于完全切割LU2023染色體DNA以制備質(zhì)粒文庫。在完全水解后，應不再存在內(nèi)部的Pstl識別位點。在LU2898質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)Pstl切割位點可能可以通過如下進行解釋由所述PstI限制性消化產(chǎn)生的不同基因片段在質(zhì)粒構(gòu)建過程中彼此連接并最終連入pUC19的Pstl切割位點中，這意味著定為丁炔醇酯酶的該閱讀框可能僅是穎殼假單胞菌LU2023中的實際基因的一部分。該丁炔醇酯酶基因已在PstI位點處被中斷，隨后與NADP還原酶基因的片段連接。37該假設得到蛋白質(zhì)測序數(shù)據(jù)的支持。已經(jīng)純化了穎殼假單胞菌LU2023丁炔醇酯酶。通過Edman降解法確定了該蛋白質(zhì)的氨基酸序列。除了少數(shù)N端和C端氨基酸外，整個序列是已知的。其對應于衍生自LU2898的DNA數(shù)據(jù)的丁炔醇酯酶的第一部分的^J^酸序列。實驗確定的丁炔醇酯酶的分子量，41.3kDa,明顯地低于源自重組LU2898丁炔醇酯酶基因的DNA序列的值。根據(jù)該DNA序列數(shù)據(jù)，丁炔醇酯酶應具有55kDa的分子量。利用數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)了該丁炔醇酯酶未被全長克隆的證據(jù)。來自LU2898的質(zhì)粒不包含該丁炔醇酯酶基因的3，端。實施例10發(fā)現(xiàn)包含截短的335AA丁炔醇酯酶突變體的克隆LU11147利用來自LU2898的質(zhì)粒的序列數(shù)據(jù)設計以下PCR引物/"http://ncflll已reu08":GGCGAGAAGCTTAGAAATCATGATCGTCCA(SEQIDN〇:20)幼alBreu0812:GGATCCTCTAGAGTCTCACTGCAGCGCGCC(SEQIDN〇:21)使用這些寡核苷酸通過PCR擴增來自LU2898的與酯酶具有上述同源性的DNA。l)CR條件5^11(^Taq聚合酶緩沖液125ng引物Breu0811125ng引物Breu08122|uldNTP(10mM)50ng來自LU11147的質(zhì)粒DNA2.5jul匪SO添加50pLH20熱啟動使用0.5UTaq-DNA聚合酶(RocheDiagnostics)38PCR溫度程序5min，950C，45s，550C,，3min，72°C，[(30個循環(huán))30s,95。C，J45s，55。C，10min，72。C，oo，4。C用Hindlll和Xbal限制性消化后，將PCR產(chǎn)物連接入適宜制備的pUC19(如NewEnglandBiolabs)中。以此方式制備的質(zhì)粒載體之后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1blue。根據(jù)廠商信息，用連接混合物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(Stratagene)。在IPTG/X-GalFP板(含有100照/ml氨節(jié)青霉素的FP培養(yǎng)基)上劃線培養(yǎng)細胞，37。C溫育16小時。從轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA(Birnboimetal.,NucleicAcidsResearch,1979，Z，1513),利用Hindlll和Xbal的對照限制性消化，檢查該PCR產(chǎn)物的成功插入。實施例11表達截短的335AA丁炔醇酯酶隨后，使用Ndel和Hindlll切割位點，將該酯酶基因克隆入載體pDHE1650(描述于WO-A-2004/050877)。為此，首先使用以下正向和反向引物，擴增該酯酶基因Breul499TATACATATGATCGTCCAACTGATCGCCATCGTG,之后使用Ndel和Hindlll限制性消化。將插入物連接入事先已經(jīng)用相同的限制性酶(Ndel和Hindlll)進行過預消化的pDHE1650載體。以相同的方式，以本發(fā)明的酯酶基因置換pDHE1650中存在的占據(jù)該位置的基因。分離兩個轉(zhuǎn)化體，以本身已知的方法通過DNA沉淀提取質(zhì)粒。所述質(zhì)粒稱為pDHE1650-Est2和pDHE1615-Est4。為了表達蛋白質(zhì)，利用TSS法([ChungCT，NiemdaSL和MillerRH，1989.—步制備感受態(tài)大腸桿菌在相同溶液中轉(zhuǎn)化和儲存細菌細胞.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:2172-2175),用帶有酯酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI(DSMZNo.6056)。分離單菌落，在5ml的LB/Amp/Tet/Spec/Cm培養(yǎng)基(=根據(jù)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecularcloning:ALaboratoryManual.2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989的LB培養(yǎng)基加上100pg/ml氨千青霉素，10pg/ml四環(huán)素，100^ig/ml鏈霉素和20pg/ml氯霉素)中37。C，250rpm繁殖過夜。向補加有10ml/1痕量元素溶液的100ml的LB/Amp/Tet/Spec/Cm培養(yǎng)基中接種500pi過夜培養(yǎng)物，并在37。C和200rpm繁殖。(痕量元素溶液的組成如下FeS04*H20200mg/l，ZnS04*7H2010mg/1,MnCl2*4H203mg/l，H3B0330mg/l，CoCl2*6H2020mg/1,CuCl2*6H201mg/l，NiCl2*6H202mg/l，Na2Mo04*2H203mg/l，TitriplexIII500mg/l)。一旦OD,值達到0.5至0.6，用ImML-鼠李糖誘導蛋白表達。溫度降低至30。C，而轉(zhuǎn)動速度保持在200rpm。過夜培養(yǎng)培養(yǎng)物。隨后，離心(15min，4。C，3220g)細胞，在-20。C貯存細胞沉淀過夜。將細胞沉淀(50ml的TB培養(yǎng)物)重懸在磷酸鈉緩沖液(25mM，離子強度154mM，pH7.5)中，以破壞細胞。勻漿(1500bar,兩下(2passages))破碎細胞。離心(30min，4°C，20817g)除去細胞碎片。將上清液上樣至Protein200PlusLabchip,并使用Agilent2100Bioanalyzer分析蛋白質(zhì)。將移出的細胞碎片重懸在8M尿素中，之后離心(30min,4。C，20817g)以除去不溶顆粒。將清澈的上清液(膜級分)上樣至Protein200Plus-Labchip，并利用Agilent2100Bioanalyzer分析蛋白質(zhì)。實施例12制備丁炔醇酯酶(335AA)突變體a)材料所用的所有材料均適用于分析目的，或具有更高的品質(zhì)，并購自40Sigma-AldrichChemie,Taufkirchen，Germany,Applichem(Darmstadt,Germany)和CarlRoth(Karlsruhe,Germany)。熱循環(huán)儀(Mastercyclergradient,Eppendorf，Hamburg,Germany)和薄壁PCR管(Multi-Ultra管；0.2ml;CarlRoth)用于所有PCR實驗。PCR體積在所有情況下均為5(Hil;通過多個5(HilPCR混合物，制備更大體積。所用DNA的量通過NanoDrop光度i十(NanoDropTechnologies,Wilmington,DE)定量。b)將丁炔醇酯酶基因克隆至pASK-IBA7載體中利用如下引物擴增pASK-IBA7載體(IBAGmbH,G6ttingen,Germany)(SEQIDNO:19，用于表達具有N端Strep-標簽的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒)正向引物5，TttttGCCCTCGTTATCTAGATTT-3'(seqIDNO:9)反向引物5，-CCGGAATTCCGGTATCTAACTAAGCTTGACCTG-3，(SEQIDNO:10)50piPCR混合物(95。C3min;1個循環(huán)〃95。C30s,56.2°C45s，72。C7min;30個循環(huán)〃72。C10min;1個循環(huán))包含20pmol正向引物，20pmol反向引物,每種dNTP(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)各0.2mM,150ng的pASK-IBA7質(zhì)粒和2.5UPfuDNA聚合酶(FermentasGmbH,St.Leon-Rot,Germany)。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany),通過凝膠純化產(chǎn)物，在此在與上述相同的條件下擴增。凝膠純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen)后，用40U的EcoRI(NewEnglandBiolabsGmbH,Frankfurt,Germany)在100pi反應混合物中37。C消化2jigDNA產(chǎn)物4小時。使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)PCR純化消化后的產(chǎn)物。使用以下引物擴增丁炔醇酯酶基因正向引物5，-[PhosjGACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3，(SEQIDNO:ll)反向引物5，-CCGGAATTCCGGTCACTGCAGCGCGCCGGCCTG-3，(SEQIDNO:12)。50|iilPCR混合物(95。C2min;1個循環(huán)〃95。C30s，59。C45s,72。C3min;30個循環(huán)〃72。C10min;1個循環(huán))包含20pmol正向引物，20pmol反向引物，每種dNTP(RocheDiagnosticsGmbH)各0.2mM;150ng質(zhì)粒LU11147(pUC19載體，帶有丁炔醇酯酶基因)，0.02%DMSO和2.5UPfuDNA聚合酶(Fermentas)。凝膠純化(QIAquick凝膠純化試劑盒，Qiagen)后，用40UEcoRI(NewEnglandBiolabsGmbH,Frankfurt,Germany)在100jnl反應混合物中37。C消化2jngDNA產(chǎn)物4小時。消化后的產(chǎn)物利用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)進行PCR純化。將該丁炔醇酯酶基因使用平端和EcoRI切割位點連接入載體。反應混合物(20^il)包含20ng載體、120ng插入物和2UT4DNA連接酶(RocheDiagnosticsGmbH)。首先室溫溫育反應混合物1小時，之后在冰箱中過夜溫育。所得質(zhì)粒稱作。ASK-IBA7酯酶。c)制備第一丁炔醇酯酶突變體文庫首先利用易錯PCR(95。C2min;1個循環(huán)〃95。C30s，59。C45s，72。C3min;40個循環(huán)〃72。C10min)擴增丁炔醇酯酶基因。使用如下引物正向引物5，-CGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAA-3，(SEQIDNO:13)反向引物5，-TTCACTTCACAGGTCAAGCTTAGTTAG-3，(SEQIDNO:14).反應混合物(50^1)包含20pmol正向引物，20pmol反向引物，每種dNTP(RocheDiagnosticsGmbH)各0.2mM，100ng質(zhì)粒pASK-IBA7酯酶，0.02%DMSO，0.1mMMnCl2和2.5UTaqDNA聚合酶(Qiagen)。凝膠純化(QIAquick凝膠純化試劑盒；Qiagen)后，用40UEcoRI(NewEnglandBiolabsGmbH)和30UXbal(NewEnglandBiolabsGmbH)雙重消化4pgI)NA。PCR純化產(chǎn)物(QIAquickPCR純化試劑盒；Qiagen),之后，將產(chǎn)物連接入EcoRI-和Xbal-預先消化的pASK-IBA7質(zhì)粒中。使用TSS法[ChungCT,NiemelaSL和MillerRH，1989.—步制備感受態(tài)大腸桿菌在相同溶液中轉(zhuǎn)化和貯存細菌細胞.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:2172-2175.，用突變體文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL2BlUe(Stratagene，Amsterdam)。d)表達丁炔醇酯酶突變體文庫使用牙簽挑取LBamp平板(=根據(jù)Sambrook，丄，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989的LB培養(yǎng)基加上10g/1瓊脂和100pg/mL氨千青霉素)上的菌落，轉(zhuǎn)移至含有l(wèi)5()JU1LBamp培養(yǎng)基的96孔孩史量滴定板。在微量板搖床(MultitronII;InforsGmbH,Einsbach，Germany;37。C,900rpm和70。/。濕度)上培養(yǎng)后，使用systemDuetz(Kiihner，Birsfelden，Switzerland)將每個培養(yǎng)物各5jul轉(zhuǎn)移至具有2ml孔的板子中，所述孔包含550jiilTB培養(yǎng)基和100jug/ml氨節(jié)青霉素(BectonDickinsonGmbH)。在MultitronII搖床(InforsGmbH;30。C和500rpm及70。/。濕度)中培養(yǎng)克隆8小時。通過每孔加入含有2.4嗎/ml無水四環(huán)素(IBAGmbH)的50plTB,誘導蛋白質(zhì)表達。在MultitronII搖床(InforsGmbH;30。C和500rpm)中再培養(yǎng)克隆6小時。e)pH指示試驗(96-孔格式)使用Multimek96-道自動移液器(BeckmanCoulter,Krefeld，Germany),將每孔的50piTB培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至96孔試驗板。使用Multimek96(BeckmanCoulter),在試驗板的每孔中加入lOOjil底物溶液(25mMNaH2P04緩沖液，pH7.5,用NaCl調(diào)整至離子強度154mM,包含0.05%TritonX-100,7.5照/ml熒光素鈉和285mM丁酸丁-3-炔-2-基酯)，起始水解反應。底物溶液在使用前劇烈攪動5分鐘。使用TecanSafire(TecanGmbH,Crailsheim，Germany)觀察熒光信號降低的動力學(消光化5nm，發(fā)射520nm)lO分鐘。從起始斜率確定活性。篩選930個克隆后，鑒定到克隆8H1為改良突變體。43f)第二丁炔醇酯酶突變體文庫除了使用8H1作為親本基因外，在與上述完全相同的條件下，產(chǎn)生第二丁炔醇酯酶突變體文庫。如上所述表達和篩選文庫。篩選1116個克隆后，鑒定到8C9克隆是改良突變體。g)在氨基酸位置l卯和263的飽和誘變使用如下改良的QuikChange方案(Stratagene),在氨基酸位置l卯和263進行飽和誘變。對于M酸位置190使用如下誘變引物5，-GGCATCCCGATCATG麗NCTGCAAAGCCGCAAG-3'(SEQIDNO:15)5,-CTTGCGGCTTTGCAGNNNCATGATCGGGATGCC-3，(SEQIDNO:16)對于氨基酸位置263使用如下誘變引物5'-GGGCGCCAGGACGCGN麗CTCGATTTCCACAAG-3'(SEQIDNO:17)5，-CTTGTGGAAATCGAGNNNCGCGTCCTGGCGCCC畫3，(SEQIDNO:18)50plPCR混合物(95。C30s;1個循環(huán)〃95。C30s，55。C1min,68。C4min45s;18個循環(huán))包含每種引物各20pmol的混合物，每種dNTP(RocheDiagnosticsGmbH)各0.2mM，50ng質(zhì)粒8C9(起始DNA)和2.5UPfuTurboDNA聚合酶(Stratagene)。PCR后，使用40UDpnl(NewEnglandBiolabsGmbH)37"C消化甲基化的和半甲基化的親本DNA2至3小時。產(chǎn)物進行PCR純化(QIAquickPCR純化試劑盒；Qiagen),然后使用TSS法[ChungCT,同上引文].轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL2Blue(Stratagene)。以和上述相同的方式表達和篩選兩個文庫。每個文庫各篩選186個克隆后，鑒定到兩個克隆是改良突變體。其被命名為Estl卯-1B2和Est263-2D6。h)在搖瓶中表達蛋白質(zhì)挑取新鮮轉(zhuǎn)化的菌落，使用Multitron-II搖床(InforsGmbH;37。C，250rpm)，在5mlLBamp培養(yǎng)基中生長過夜培養(yǎng)物。用所述過夜培養(yǎng)物800^1接種100mlTBamp培養(yǎng)基，在Multitron-II搖床(InforsGmbH;37。C，200rpm)中培養(yǎng)。一旦01)600值達到0.5至0.6，加入25^1無水四環(huán)素(0.2mg/ml在DMF中的貯存液)，誘導蛋白質(zhì)表達。再培養(yǎng)培養(yǎng)物12小時44(Multitron-II搖床，InforsGmbH;30oC，200rpm)。3220g在4。C離心S0min移出細胞，測定濕細胞量。-20°(:貯存細胞沉淀直至進一步表征前。i)4吏用pHstat表征蛋白質(zhì)4吏用pHstat(716DMSTitrino，DeutscheMetrohmGmbH&Co.,Filderstadt，Germany)測量丁炔醇酯酶的水解活性。首先將細胞沉淀重懸于適宜體積的磷酸鈉緩沖液(25mM磷酸二氫鈉緩沖液，pH7.5,用NaCl調(diào)整離子強度至154mM),以獲得O.lg濕細胞量/ml的細胞濃度。預備20ml底物溶液，其包含磷酸鈉緩沖液(25mMNaH2P04緩沖液pH7.5,NaCl調(diào)整離子強度至154mM)，0.05%TritonX-100和350mM丁酸丁-3-炔-2-基酯。底物溶液在使用前劇烈攪動5分鐘。開始水解反應前，用INNaOH調(diào)整底物溶液(20ml)的pH至pH7.5。通過加入0.01g濕細胞量，開始反應。在生物轉(zhuǎn)化過程中用0.1NNaOH滴定，維持pH7.5。水解活性與NaOH的滴定速度(每單位時間加入的體積)相關。結(jié)果描述在附圖4中。分析了下表中所列的酶和突變體。關于氨基酸序列和核酸序列中的具體突變的信息同樣可以在下表中找到。氨基酸位置16190263克隆pASK-IBA7-酯酶"g(L)att(I)ate(I)8H1ccg(P)act(T)ate(I)8C9ccg(P)act(T)gtc(V)Estl卯-1B2ccg(P)cgc(R)gtc(V)Est263-2D6ccg(P)act(T)gtt(V)4權利要求1.具有酯酶活性的蛋白質(zhì)或其功能等價蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有總長小于510個氨基酸的多肽鏈，并且其中所述鏈包含至少一個根據(jù)SEQIDNO3的部分氨基酸序列。2.權利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有能夠通過斷裂丁酸丁-3-炔-2-基酯來表征的酯酶活性。3.根據(jù)前述權利要求之一的蛋白質(zhì)，其還包含至少一個根據(jù)SEQIDNO:4,5或6的另外的部分氨基酸序列。4.根據(jù)前述權利要求之任一的蛋白質(zhì)，其包含總長小于450或小于350個氨基酸的多肽鏈。5.根據(jù)前述權利要求之任一的蛋白質(zhì)，其包含總長大約335個氨基酸的多肽鏈。6.根據(jù)權利要求5的蛋白質(zhì)，其包含根據(jù)SEQIDNO:8的氨基蔣列。7.在SEQIDNO:2或8的氨基酸序列區(qū)域12-20、185-195和258-268中的任何區(qū)域中具有至少一個功能性突變的酯酶突變體。8.權利要求7的突變體，其在SEQIDNO:2或8的絲,列位置16、190和263中的任何位置中包含至少一個功能性突變。9.權利要求8的蛋白質(zhì)，其包含以下氨基酸替代中的至少一個—t，—ifkAnn，___ir，—"irv"i____t，_—，lcuiorrt)，iiciyuinr，uci，u/vrg"厶ojviu。10.根據(jù)前述權利要求之任一的蛋白質(zhì)，其包含具有大約60kDa或更少的計算分子量的多肽鏈。11.根據(jù)前述權利要求之任一的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)可以從具有保藏號DSM13176的穎殼假單胞菌(植物伯克霍爾德氏菌)Lu2023起始獲得。12.根據(jù)前述權利要求之任一的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)催化至少一個以下反應a)式I的旋光酯的對映選擇性水解，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，W是直鏈或支鏈的、任選地單或多取代的d-do-烷基、C2-d。-鏈烯基、C2-do-炔基，r2是直鏈或支鏈的、任選地單或多取代的d-Cjo-烷基、C2-do-鏈烯基、C2-d。-炔基、CVd5-芳烷基、或單環(huán)或多環(huán)的、任選地單或多取代的芳族基團，W和/或i^包含至少一個不對稱碳；和b)式I的酯和式II的旋光醇的對映選擇性酯交換，r2-oh(ii)，其中w具有如上含義之一且任選地具有至少一個不對稱碳。13.編碼前述權利要求之任一的蛋白質(zhì)的多核苷酸及其功能等價物、其互補多核苷酸、和可以與其雜交的核酸序列。14.權利要求13的多核普酸，其包含SEQIDNO:7的核酸序列中至少30個連續(xù)核苷酸殘基的核苷酸序列。15.權利要求14的多核苷酸，其中相應于SEQIDNO:8的氨基酸位置263的區(qū)域中的密碼子選自GTT和GTC。16.包含與至少一個調(diào)節(jié)核酸序列可操作連接的、至少一個權利要求13-15之任一的多核苦酸的表達盒。17.用于轉(zhuǎn)化真核或原核宿主的重組載體，其包含權利要求13至15iAr,丄々_Ljv"Vi!"ir/>Jt、U>"C,'jo;丄■z,丄、_!X々,|:r一"J夕修賞吸我々WJ文f10H"、J恭X^i。18.制備權利要求1-12之任一的蛋白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)內(nèi)源性產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的微生物或轉(zhuǎn)化了權利要求17的載體的微生物和從培養(yǎng)物中分離所述蛋白質(zhì)。19.權利要求18的方法，其中微生物是具有保藏號DSM13176的穎殼假單胞菌(植物伯克霍爾德氏菌)Lu2023。20.可以通過權利要求18或19的方法獲得的蛋白質(zhì)。21.具有保藏號I)SM13176的穎殼假單胞菌(植物伯克霍爾德氏菌)Lu2023及其變體和突變體。22.微生物，其中所述微生物帶有權利要求17的載體。23.使用權利要求1至12之任一的蛋白質(zhì)進行對映選擇性酯水解的方法，該方法包括a)使所述蛋白質(zhì)與式I的旋光酯的立體異構(gòu)體混合物接觸；和b)從反應介質(zhì)中獲得由所述立體異構(gòu)體之任一的立體選擇性水解產(chǎn)生的旋光化合物和/或未水解的酯對映體。24.用于對映選擇性酯交換的方法，該方法包括a)在權利要求1-12之任一的蛋白質(zhì)存在下使式II的旋光醇的立體異構(gòu)體混合物與式I的酯接觸，和從反應介質(zhì)中獲得未反應的醇立體異構(gòu)體5或b)在權利要求1-12之任一的蛋白質(zhì)存在下使式I的旋光酯的立體異構(gòu)體混合物與式II的醇接觸，和從反應介質(zhì)中獲得包含在所述酯中的旋光醇的立體異構(gòu)體。25.權利要求24的方法，其包括在酯交換中使用乙烯基酯作為旋光醇的?；瘎?。26.權利要求23-25之任一的方法，其包括使用有機溶劑作為反應介質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及具有酯酶活性的新蛋白質(zhì)及其突變體、編碼它們的核酸序列、表達盒、載體和重組微生物。本發(fā)明還涉及用于制備所述蛋白質(zhì)的方法和其用于有機酯的酶促的，尤其是對映選擇性的，酯水解或酯交換中的用途。文檔編號C12P41/00GK101501189SQ200780029473公開日2009年8月5日申請日期2007年6月26日優(yōu)先權日2006年6月27日發(fā)明者B·豪爾,M·布羅伊爾,T·S·翁,U·施瓦內(nèi)貝格申請人:巴斯夫歐洲公司