專利名稱：編碼n-甲基腐胺氧化酶之核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物，植物細(xì)胞或其它類細(xì)胞之分子生物學(xué)及生物堿合成。除與其它 事項相關(guān)外，該發(fā)明還涉及編碼N-甲基腐胺氧化酶(N-methylputrescine oxidase, MPO) 的核酸序列以及應(yīng)用該核酸序列改良植物中生產(chǎn)生物堿的方法，尤其是但不完全是應(yīng)用該 核酸序列在煙草植物中生產(chǎn)煙堿，及在植物細(xì)胞或其它類細(xì)胞中生產(chǎn)生物堿合成酶的方 法。
背景技術(shù)：
吡咯烷類生物堿(例如煙堿)及托烷類生物堿(例如東茛菪堿和古柯堿)是具有 多種不同藥理活性的植物天然產(chǎn)物。例如，煙堿可以促進(jìn)認(rèn)知機(jī)能，并應(yīng)用于戒煙治療中的 煙堿替代療法。托烷類生物堿是重要的抗膽堿能類藥物。古柯堿被用作局部麻醉藥。這些 化合物均從植物分離，并被作為藥物使用。人們有興趣通過遺傳工程方式來增加植物和植物細(xì)胞中吡咯烷類生物堿及托烷 類生物堿的生產(chǎn)，以便更有效地商業(yè)化生產(chǎn)這些化合物以用于藥物制造業(yè)。增加上述兩種 生物堿的生產(chǎn)可以通過選擇育種，或通過使用編碼這些生物堿合成酶基因的遺傳工程。累 積代謝途徑中間產(chǎn)物或減少生物堿終末產(chǎn)物的遺傳工程方法包括經(jīng)典或定向誘變，如定向 誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(Targeting Induced Local Lesions in Genomes，TILLING)，或 利用RNA干擾及相關(guān)技術(shù)特異性沉默編碼這些酶的基因。人們也有興趣阻斷上述生物堿合成途徑中某些特定的代謝步驟，以累積本身可 能具有高價值的代謝途徑中間產(chǎn)物，或生產(chǎn)包括修飾過或含量減少的生物堿終末產(chǎn)物的 植物。煙堿含量經(jīng)遺傳工程而減少的煙草植物可能有助于生產(chǎn)來自于植物的藥物，煙堿 含量低或無煙堿的香煙。所述香煙可以用于輔助戒煙(Benowitz et al. Clin Pharmocol Ther. 80(6) :703-14Q006))，和用于生產(chǎn)低毒性工業(yè)產(chǎn)品，食品或生物量農(nóng)作物。人們對編碼吡咯烷類生物堿及托烷類生物堿的生物合成酶的基因知之甚少，這限 制了通過遺傳工程生成這些有效化合物代謝途徑的能力。一個編碼參與吡咯烷類生物堿合成酶的已知基因的例子是喹啉磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (QPT)基因，所述的QPT基因從煙草和黃花煙草中克隆的。見美國專利6，423，520及專利 6，586，661 及 Sinclair et al. ,Plant Mol. Biol. 44 :603-17 (2000)。抑制 QPT 基因表達(dá)能 顯著降低轉(zhuǎn)基因煙草植物中煙堿含量。Xie et al. ,Recent Advances in Tobacco Science 30 :17-37(2004)。美國專利5，369，023及5，260, 205討論通過抑制腐胺甲基轉(zhuǎn)換酶(PMT)核酸序列 來降低煙堿含量。抑制內(nèi)源性PMT核酸序列降低煙堿含量，并增加去氫新煙堿含量2至6倍。Hibi et al. ,Plant Cell 6 :723-35(1994) ；Sato et al. Proc Natl Acad Sci USA 98 367-72(2001) ；Chintapakorn and Hamill, Plant Mol. Biol. 53 :87-105(2003) ；Steppuhn et al. ,PLoS Biol. 2 8 :e217 :1074-1080(2004) 煙草PMT基因在美花煙草超表達(dá)可增加 煙堿含量。(Satoet al. Proc Natl Acad Sci USA 98:367-72(2001))。抑制內(nèi)源性基因序列A622及NBBl可降低煙草植物中煙堿含量。見國際專利公 開號WO 2006/109197。已從煙草中克隆轉(zhuǎn)換煙堿為去甲煙堿的細(xì)胞色素P450單氧化酶基 @。 Siminszky B. ，et al. ,Proc Natl Acad Sci USA102 :14919-24,(2005) ；GaviIano et al. J. Agric. Food Chem. 54，9071-9078(2006)。MPO酶活性是三十年前在煙草植物根部最初檢測到，Mizusaki S et al., Phytochemistry 11 :2757-2762 (1972)，但MPO基因在本發(fā)明前并未得到確定。MPO在植物生物堿包括藥用托烷類生物堿的合成途經(jīng)中起作用。Hashimoto and Yamada, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45 :257-285(1994) ；Kutchan, In Cordell,G.A. (ed. ) ALKALOIDS (San Diego), vol. 50. Academic Press,Inc. ,San Diego,CA, USA, (1998)pp. 257-316。已從煙草，黃花煙草，天仙子，及白曼陀羅與黃花曼陀羅雜種植物根部純 化MPO酶，與氧化腐胺和尸胺相比，該酶能更有效地氧化N-甲基腐胺。Mizusaki et al. , Phytochemistry 11 :2757-2762(1972) ；Feth and Wagner, Phytochemistry 24 1653-1655(1985) ；Davies et al. , Phytochemistry 28 :1573-1578(1989) ；Hashimoto et al.Plant Physiol. 93 :216-221 (1990) ；Waltonand McLauchlan, Phytochemistry 29 :1455-1457(1990) ；Haslam and Young, Phytochemistry 31:4075-4079(1992); McLauchlan et al., Planta 19 :440-445(1993) ；Boswell et al. , Phytochemistry 52 871-878(1999)。消旋毒藜堿和新煙草靈[順_2，4娣(3-吡啶基)哌啶]含有哌啶成分，消旋 毒藜堿的哌啶成分被認(rèn)為經(jīng)由煙草中Δ-1-哌啶來自尸胺。Watson andBrown, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 :2607-2610 (1990) 雖然其親合性低于N-甲基化二氨，尸胺是二 氨氧化酶的良性底物，亦是MPO的底物。Hashimoto et al. (1990), supra ；Walton and McLauchlan, Phytochemistry 29:1455-1457(1990) ；Boswell et al. , Phytochemistry 52 :871-878(1999)。在我們申請美國臨時專利60/814,542之后，Katoh等在Plant CellPhysiol. 48(3) :550-554(2007)及 Heim 等在 Phytochemistry 68:454-463(2007)披 露了煙草中參與煙堿合成途經(jīng)的MPO基因。但是，他們在文獻(xiàn)中并未提及利用該基因在煙 草植物中改變煙堿或其它生物堿含量的方法或用途。因此，有必要持續(xù)認(rèn)定其它表達(dá)可以調(diào)節(jié)的基因，以減少或增加生物堿生物合成， 或通過改變植物中某一特定生物堿的合成來改變該植物的生物堿生成圖譜。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，其包括選自以下的核苷酸序列(a) SEQ ID NO :1表示的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO :2表示的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)與(a)，(b)或(c)的核苷酸序列至少85%相同，并編碼MPO酶的核苷酸序列；(e)與(a), (b), (c)或(d)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下 雜交，并編碼MPO酶的核苷酸序列；和(f)因遺傳密碼的簡并性而與(a)或(b)的核苷酸序 列不同并編碼MPO酶的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)MPO酶的方法，包括(a)使用包含權(quán)利要求1所 述分離的核酸分子的核酸構(gòu)建體遺傳改造細(xì)胞和；(b)在可以產(chǎn)生MPO酶的條件下培養(yǎng)所 述細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供一種重組MPO酶，其具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列或SEQ ID NO 3的變體。在一個實施例中，一種遺傳工程宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求1所述的核酸序列。在進(jìn) 一步實施例中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、藻類、綠色植物及哺乳動物細(xì)胞。在另 一個實施例中，一種植物包含所述宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供減少植物中生物堿的方法，所述方法包括相對于對照植物， 下調(diào)N-甲基腐胺氧化酶的表達(dá)。在一個實施例中，生物堿是吡咯烷類生物堿。在進(jìn)一步實 施例中，吡咯烷類生物堿是煙堿。在另一個實施例中，植物屬于菸草屬。在另一個實施例中， 植物是菸草。在另一個實施例中，通過(a)在所述植物中引入核酸序列，所述核酸序列包含 i)SEQ ID NO :1的至少21個連續(xù)核苷酸，其中所述連續(xù)核苷酸位于正義或反義方向上；和 (b)在與相似條件下培養(yǎng)的對照植物相比，所述核苷酸序列減少所述植物中N-甲基腐胺氧 化酶的水平的條件下培養(yǎng)所述植物，來下調(diào)N-甲基腐胺氧化酶的表達(dá)。在一個實施例中， 所述條件誘導(dǎo)內(nèi)源性MPO基因的共抑制。另一方面，本發(fā)明提供一種減少植物中吡咯烷類生物堿的方法，所述方法包括下 調(diào)MPO及下調(diào)NBBl、A622、QPT和PMT中的至少一種。另一方面，本發(fā)明提供一種減少植物種群中吡咯烷類生物堿的方法，其包括(a) 提供突變的植物種群；(b)檢測所述植物種群內(nèi)的靶向突變植物，其中與相似條件下提供 的對照植物相比，所述靶向突變植物的N-甲基腐胺氧化酶基因表達(dá)降低，或N-甲基腐胺氧 化酶的活性降低，所述檢測包括(i)利用根據(jù)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2設(shè)計的引物來 PCR擴(kuò)增來自突變植物種群中突變植物中的N-甲基腐胺氧化酶基因區(qū)域，(ii)確定在被擴(kuò) 增區(qū)域和野生型基因相應(yīng)區(qū)域之間導(dǎo)致N-甲基腐胺氧化酶基因的表達(dá)降低或N-甲基腐胺 氧化酶的活性降低的錯配，和(iii)確定含有所述錯配的突變植物；和(c)選擇性培育所述 靶向突變的植物，以產(chǎn)生下述植物種群，即其與相似條件下產(chǎn)生的對照植物種群相比，N-甲 基腐胺氧化酶基因的表達(dá)降低或N-甲基腐胺氧化酶的活性降低。在一個實施例中，所述吡咯烷類生物堿是煙堿。在另一個實施例中，所述植物是菸草。另一方面，本發(fā)明提供一種使用包含SEQ ID NO 1的至少21個連續(xù)核苷酸的核 苷酸序列遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其中所述連續(xù)核苷酸位于正義或反義方向上。在一個實 施例中，細(xì)胞是茄科或古柯科植物細(xì)胞。在另一個實施例中，細(xì)胞是煙草屬，曼陀羅屬，顛 茄屬，澳茄屬，天仙子屬，茄參屬，木曼陀羅屬，賽莨菪屬及紅木屬植物細(xì)胞。在另一個實施 例中，該細(xì)胞為煙草植物細(xì)胞。在進(jìn)一步實施例中，該核苷酸序列包含SEQ ID N0:1或SEQ IDNO :2。在另一個實施例中，本發(fā)明提供通過前述任一方法生產(chǎn)的生物堿減少的植物。在另一個實施例中，減少的生物堿是煙堿。在進(jìn)一步實施例中，生物堿減少的產(chǎn)品產(chǎn)自生物堿 減少的植物。在另一個實施例中，減少的生物堿是煙堿。另一方面，本發(fā)明提供一種增加植物中MPO酶的方法，包括(a)在所述植物中引入 含有編碼MPO酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體；(b)在所述核苷酸被表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述 植物，從而與相似條件下培養(yǎng)出的對照植物相比，增加所述植物中MPO酶的水平。在一個實施例中，所述植物是茄科或古柯科植物。在另一個實施例中，所述植物 是煙草屬，曼陀羅屬，顛茄屬，澳茄屬，天仙子屬，茄參屬，木曼陀羅屬，賽莨菪屬及紅木屬植 物。在另一個實施例中，托烷類生物堿被增加，所述托烷類生物堿包括東茛菪堿或古柯堿。另一方面，本發(fā)明提供一種增加植物中吡咯烷類生物堿水平的方法，其包括(a) 在所述植物中引入編碼MPO酶的核苷酸序列和編碼至少一種選自NBB1、A622、QPT和PMT的 酶的核苷酸序列；和(b)在與相似條件下培養(yǎng)出的對照植物相比，所述植物產(chǎn)生增加的水 平的N-甲基腐胺氧化酶和至少一種選自NBB1，A622，QPT和PMT的酶的條件下培養(yǎng)所述植 物。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種通過前述任一方法生產(chǎn)的生物堿增加的植物。


圖1描述吡咯烷類生物堿(煙堿)及托烷類生物堿(東茛菪堿和古柯堿)生物合 成途經(jīng)。圖2描述用RT-PCR分析本塞姆氏煙草不同組織中MPO的表達(dá)。圖3描述用定量RT-PCR (qRT-PCR)分析經(jīng)茉莉酸甲酯(MeJa)處理后本塞姆氏煙 草根部PMT及MPO的表達(dá)。圖4描述用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)在 本塞姆氏煙草沉默生成煙堿的基因，圖4標(biāo)示出這些基因片段相對于全長MPO cDNA的位置 及長度。圖5A描述用HPLC方法測定對照植物及MPO VIGS載體侵染的植物葉部煙堿含量。圖5B描述經(jīng)茉莉酸甲酯(MeJa)處理后對照植物及TRV-MPO核酸建構(gòu)物40!3B01 侵染的植物煙堿含量。圖6描述用HPLC方法測定MPO VIGS載體或含有GFP序列對照載體侵染的植物根
部組織N-甲基腐胺含量。圖7描述MPO VIGS載體侵染的植物根部MPO轉(zhuǎn)錄水平。圖8描述MPO VIGS載體侵染的植物根部MPO活性。圖9描述重組MPO的底物特異性及酶動力學(xué)。
圖10描述質(zhì)譜(MS)檢測分析MPO產(chǎn)物。圖11描述氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析MPO衍生產(chǎn)物。圖12描述電泳分析MPO超表達(dá)核酸建構(gòu)物轉(zhuǎn)染的植物的PCR放大產(chǎn)物。圖13描述野生型及超表達(dá)MPO的轉(zhuǎn)基因植物葉部煙堿含量。
具體實施例方式本發(fā)明者克隆了編碼MPO的基因。MPO基因的核酸序列，序列1 (SEQ ID NO :1)，已經(jīng)確定。序列2(SEQ ID NO 2)列出序列1 (SEQ IDNO 1)中的開放讀碼區(qū)(ORF)，其編碼序 列3 (SEQ ID NO 3)中的多肽序列。根據(jù)圖1，吡咯烷類生物堿(例如煙堿)及托烷類生物堿(古柯堿和例如東茛菪 堿)的生物合成均涉及中間代謝產(chǎn)物N-甲基吡咯啉離子。很明顯，可以通過影響代謝途經(jīng) 中的酶和/或中間產(chǎn)物來調(diào)控這些生物堿的生成。MPO催化N-甲基腐胺的氧化脫胺反應(yīng)形成4-甲基氨基丁醛，后者自動環(huán)化形成 N-甲基吡咯啉離子。N-甲基吡咯啉離子是合成高價值生物堿的一個關(guān)鍵構(gòu)件分子。圖1 顯示這一關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，以及它在煙堿，古柯堿和東茛菪堿中的位置。圖1亦標(biāo) 明兩個已知酶QPT及PMT。假設(shè)有足夠的N-甲基腐胺，根據(jù)圖1，很明顯MPO含量和/或酶活性增加會增加 N-甲基吡咯啉離子含量，這會進(jìn)一步增加煙堿，古柯堿和東茛菪堿的生成。另一方面，如果 MPO含量和/或酶活性足夠地降低，煙堿，古柯堿和/或東茛菪堿生物合成亦相應(yīng)下降。在天然合成吡咯烷類生物堿的植物中，MPO基因或基因片段可以用來抑制吡咯烷 類生物堿的生物合成(例如，煙堿的生物合成)。例如，煙草屬植物(例如，煙草，黃花煙 草和本塞姆氏煙草)天然合成煙堿。煙草為高價值農(nóng)作物，其在生物科技中的應(yīng)用日益 增加。通過抑制MPO阻斷煙堿生物合成，這可以用來生產(chǎn)不含煙堿或煙堿含量低的煙草 植物，這些植物可作為低毒性產(chǎn)品平臺以生產(chǎn)來自于植物的藥物，即所謂產(chǎn)于植物的藥物 (plant-mad印harmaceuticals，PMPs)(例如，重組蛋白和抗體)，或作為工業(yè)產(chǎn)品，食品或 生物量農(nóng)作物生產(chǎn)平臺。定義本說明書所用所有技術(shù)術(shù)語在生物化學(xué)，分子生物學(xué)和農(nóng)業(yè)學(xué)中通常使用；因此， 本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通曉這些術(shù)語。那些技術(shù)術(shù)語可以在下列出版物查找到，例如 在Molecular Cloning :A Laboeatoey MMUAL3rd ed. , vol. 1~3, ed. Sambrook and Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001 ；Current Peotocols in Moleculae Biology，ed. Ausubel et al. , Greene Publishing Associates and ffiley-Interscience, NewYork, 1988 (including periodic updates) ；Shoet Peotocols in MoleculaeBiology :A COMPENDIUM OF Methods feoi Cueeent Protocols inMoleculae Biology 5th ed.，vol. 1~2, ed. Ausubel et al. , John Wiley & Sons, Inc. , 2002 ；Genome Analysis :A Laboeatoey Manual, vol. 1-2, ed. Green etal. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1997。植物生物學(xué)技術(shù)方
法在本處描述和在下列文獻(xiàn)中詳細(xì)闡述，例如 Methods inPlant Molecular BIOLOgy :A Laboratory Couese Manual, ed. Maliga etal. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1995。術(shù)語“編碼(encoding和coding) ”指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制把信息提供到細(xì)胞 里，一系列氨基酸在細(xì)胞中被裝配成特定氨基酸序列以產(chǎn)生活性酶的過程。由于遺傳密碼 的簡約性，DNA序列中某些堿基變化并不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。正如這里所使用，“表達(dá)(expression) ”指通過基因轉(zhuǎn)錄生成RNA產(chǎn)物，或經(jīng)由核 苷酸序列編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)?！俺磉_(dá)(overexpression) ”或“上調(diào)(up-regulation)，，是指相對對照細(xì)胞或植 物，在細(xì)胞或植物其及衍生后代植物通過遺傳工程增加某一基因序列或其變異的表達(dá)(例如，“ΜΡ0超表達(dá)”)。術(shù)語〃抑制(suppression)“或〃下調(diào)(down-regulation)“同義，表示相對對 照細(xì)胞或植物，在細(xì)胞或植物及其衍生后代植物通過遺傳工程降低某一基因序列或其變異 的表達(dá)(例如，“ΜΡ0下調(diào)”)?！ぁ吧飰A(alkaloid)”指植物中次級代謝生成的含氮基本化合物?！斑量┩轭惿?堿(pyrrolidine alkaloid) ”指分子結(jié)構(gòu)中含有吡咯烷環(huán)的生物堿，例如，煙堿。煙堿和相 關(guān)生物堿在已發(fā)表文獻(xiàn)中亦指吡啶烷類生物堿。“吡啶烷類生物堿(pyridine alkaloid)" 指分子結(jié)構(gòu)中含有吡啶烷環(huán)的生物堿，例如，煙堿?！巴型轭惿飰A(tropane alkaloid)“ 指分子結(jié)構(gòu)中含有雙環(huán)托烷環(huán)的生物堿，例如，東茛菪堿或古柯堿?！盁焿A類生物堿 (nicotinicalkaloid)“指煙堿或結(jié)構(gòu)上與煙堿相關(guān)的生物堿，或指煙堿合成途徑中生成 的生物堿。具有代表性的煙堿類生物堿包括，但不局限于，煙堿，去甲煙堿，去氫新煙堿，消 旋毒藜堿，新煙草靈[順-2，4娣(3-吡啶基)哌啶]，N-甲基去氫新煙堿，N-甲基消旋毒 藜堿，麥斯明，假木賊因，甲酸基去甲煙堿，二烯煙堿及古丁尼。亦有報道煙草葉中含有其它 非常次要的煙堿類生物堿，例如，Hecht，S. S. et al. ,Accounts of Chemical Research 12: 92-98(1979) ；Tso, Τ. C. , Production,Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant. Ideals he.，Beltsville，MD(1990)。正如這里所使用，“生物堿含量(alkaloid content) ”指植物中生物堿總量，例如， 以pg/g干重(Dff)或ng/mg鮮重(Fff)為單位?！盁焿A含量(nicotine content) ”指植物中 煙堿總量，例如，以mg/g Dff或FW為單位?！盁焿A含量減少的煙草植物(decreased nicotine tobacco plant) ”或“煙堿含量 下降的煙草植物”包括經(jīng)遺傳工程改良煙堿含量減少至不超過50%的煙草植物，最好煙堿 含量少于對照的同種或同類植物的10%或1%?！盁焿A含量增加的煙草植物(increased nicotine tobacco plant)”包括經(jīng)遺傳 工程改良煙堿含量多于對照的同種或同類植物10%，最好煙堿含量多于對照的同種或同類 植物的 50 %，100 % 或 200 %。"ΜΡ0酶活性(ΜΡ0 activity) ”指N-甲基腐胺經(jīng)N-甲基腐胺氧化酶(MPO)催化形 成4-甲基氨基丁醛和過氧化氫的氧化過程?！癗-甲基腐胺氧化酶(N-methylputrescine oxidase)，” “ΜΡ0” 或“ΜΡ0 酶(ΜΡ0 enzyme) ”指氧化N-甲基腐胺形成N-甲基氨基丁醛的酶。I.減少植物中生物堿生成A.通過抑制MPO減少生物堿。利用本發(fā)明中的MPO核酸序列可以以若干本領(lǐng)域已知的技術(shù)抑制內(nèi)源性MPO基因 以減少生物堿(例如，煙堿)生成，例如，RNA干擾(RNAi)技術(shù)，人工微小RNA技術(shù)，病毒誘 導(dǎo)的基因沉默(VKS)技術(shù)，反義技術(shù)，有義協(xié)同抑制技術(shù)和定向突變技術(shù)。因此，本發(fā)明提 供通過抑制MPO基因減少植物中生物堿含量的方法和核酸建構(gòu)物。抑制一個以上的MPO基 因可以進(jìn)一步減少植物中生物堿含量。B.通過抑制MPO和A622，NBB1, QPT及PMT其中至少之一減少生物堿。以往報告顯示在煙草中抑制一個以上的生物堿合成基因比僅抑制一個基因能更 有效地減少煙堿類生物堿含量。例如，同時抑制A622和NBBl要比抑制其中之一能更有效減少煙堿含量。見W0/2006/109197。因此，本發(fā)明考慮協(xié)同抑制MPO和A622，NBB1，QPT，和 PMT其中至少之一來進(jìn)一步減低生物堿含量。根據(jù)本法明的一個方面，將含有MPO和A622， NBB1, QPT及PMT其中至少之一的核酸建構(gòu)物導(dǎo)入細(xì)胞或植物中。一個有說明性的核酸建 構(gòu)物可以包括MPO和QPT。II.增加植物中生物堿生成A.通過超表達(dá)MPO增加生物堿。本發(fā)明還涉及通過在植物中超表達(dá)MPO增加生物堿相關(guān)。MPO基因或其開放讀碼 區(qū)可以用來增加藥用生物堿含量，例如，植物中的吡咯烷類生物堿(例如，煙堿)及托烷類 生物堿(例如，東茛菪堿和古柯堿)。B.通過超表達(dá)MPO和A622，NBB1, QPT及PMT其中至少之一增加生物堿。WO 2005/018307探討通過超表達(dá)生物堿合成途經(jīng)中一個以上的基因以進(jìn)一 步增力口 生物喊，如煙喊。Sato, F. , et al. Metabolic engineering of plantalkaloid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98(1) :367-72 (2001)。因此，本發(fā)明考慮超表 達(dá)MPO和至少另外一個基因如PMT，與單獨上調(diào)MPO相比，將導(dǎo)致進(jìn)一步增加生物堿含量。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，將含有MPO和A622，NBB1, QPT及PMT至少其中之一的核 酸建構(gòu)物導(dǎo)入植物細(xì)胞中。一個有說明性的核酸建構(gòu)物可以包括例如MPO和PMT。類似地， 例如，可以通過雜交超表達(dá)MPO的轉(zhuǎn)基因植物和超表達(dá)PMT的轉(zhuǎn)基因植物這一遺傳工程方 式來產(chǎn)生超表達(dá)MPO和PMT的植物。連續(xù)雜交和選擇可生成超表達(dá)MPO和PMT的植物。III.生產(chǎn) MPO 酶MPO可以導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而在先前不產(chǎn)生該酶的生物或細(xì)胞中制造MPO酶。從這 些經(jīng)遺傳工程改良的生物或細(xì)胞中可以生產(chǎn)若干系列產(chǎn)品，包括生物堿，生物堿前驅(qū)物，生 物堿類似物和生物堿合成酶。這些產(chǎn)品可以包括煙堿，煙堿前驅(qū)物，煙堿類似物和煙堿合成 酶。因為MPO催化托烷類生物堿(例如，東茛菪堿和古柯堿)合成途徑的一個關(guān)鍵步驟，含 有導(dǎo)入MPO基因的細(xì)胞可以用來生產(chǎn)托烷類生物堿，托烷類生物堿前驅(qū)物，托烷類生物堿 類似物及托烷類生物堿合成酶。有代表性的宿主細(xì)胞包括，但不局限于，綠色植物細(xì)胞，細(xì) 菌，酵母，絲狀真菌，藻類及哺乳動物細(xì)胞。生物堿合成序列已在若干植物中確定生物堿合成基因，例如煙草植物。因此，本發(fā)明包含旨在增加 生物堿合成的任何核酸，基因，多聚核苷酸，DNA, RNA, mRNA，或cDNA分子，無論它來自何種 植物的染色體或由人工合成。此外，這些生物堿合成序列在細(xì)胞如昆蟲細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生生物 堿。DNA或RNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈，亦稱為有義鏈，它也可以是非 編碼鏈，亦稱為反義鏈。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉本發(fā)明中的MPO包括序列1 (SEQ ID N0:1)和2(SEQ ID NO 2)所含序列，其中包括含至少21個連續(xù)核苷酸的片段，該片段長度足以有效沉默植物 中基因(Hamilton，AJ and Baulcombe, DCScience 286,950-952 (1999)) 本發(fā)明還由序列 KSEQ ID NO 1)和2(SEQID NO 2)的各種“變異序列”中核酸分子組成，包括在序列中刪 除，替代，插入或加入一個或多個堿基，而該“變異序列，，編碼具有生物堿合成活性的多肽。 因此，“刪除，替代，插入或加入一個或多個堿基”的序列編碼多肽，該多肽即使是在一個或 多個氨基酸被刪除，替代，插入或加入的情況下仍保持生理活性。此外，可能由于基因產(chǎn)物翻譯后修飾或MPO基因的多態(tài)性，MPO能以多種形式存在。本發(fā)明的范圍涵蓋含有這樣修 飾且能編碼生物堿合成酶的核苷酸序列。例如，可刪除多聚腺苷酸尾鏈，刪除5 ‘-或3 ‘-端，刪除非翻譯區(qū)和刪除堿基 在一定程度導(dǎo)致刪除氨基酸。只要不導(dǎo)致移碼突變，堿基也可以被替代。也可以通過“加 入”堿基加入氨基酸。但任何改變不應(yīng)導(dǎo)致生物堿合成酶活性的丟失。在這個意義上， 可以通過改變本發(fā)明中DNA堿基序列來修飾DNA以達(dá)到在某些特定位點替代，刪除，插入 或加入氨基酸，或通過定向突變加入氨基酸，見hller & Smith, Nucleic Acid Res. 10 6487-500(1982)。也可以用適當(dāng)?shù)膲A基從頭開始合成生物堿合成序列，例如，引用我們在這里披露 的蛋白質(zhì)序列來制造DNA分子，雖然不同于天然DNA序列，合成的DNA分子可以編碼產(chǎn)生具 有相同或相似氨基酸序列的蛋白質(zhì)。這類合成DNA分子有益于將DNA序列導(dǎo)入非植物細(xì)胞， 編碼外源蛋白，由于不同的(非植物)密碼子利用頻率，如果不修飾而應(yīng)用，會導(dǎo)致宿主細(xì) 胞翻譯效率低效。在這里所說的“分離的”核酸分子是指從天然環(huán)境分離的核酸分子，DNA或RNA。 例如，包含在DNA建構(gòu)物中的重組DNA分子在本發(fā)明中被認(rèn)為是分離的核酸分子。其它例 子包括外源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或在溶液中部分或大部分純化的DNA分子。分離的 RNA分子包括本發(fā)明中DNA分子體外轉(zhuǎn)錄的RNA。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子也包括合成 產(chǎn)生的分子?！扒逗虾怂帷卑ň幋a序列或片段，其連接到與細(xì)胞中天然核苷酸編碼序列不同的 核苷酸序列?！爱愒葱院怂帷敝笇?dǎo)入細(xì)胞(或祖先細(xì)胞)中的核酸，DNA或RNA，該異源性核酸不 是所導(dǎo)入細(xì)胞中天然核酸序列的拷貝。該異源性核酸可以包含其導(dǎo)入細(xì)胞中天然核酸序列 的部分拷貝，或包含其部分片段?！皟?nèi)源性核酸”或“內(nèi)源性序列”指將通過經(jīng)遺傳工程改變的植物或生物中“天然 的，”即固有的，核酸序列。它將通過經(jīng)遺傳工程改變的植物或有機(jī)體之基因組中存在的核 酸，基因，多核苷酸，DNA, RNA, mRNA,或cDNA分子?！巴庠葱院怂帷敝溉藶閷?dǎo)入細(xì)胞(或祖先細(xì)胞)中的核酸，DNA或RNA0該外源性核 酸片段可以是其導(dǎo)入細(xì)胞中天然核酸序列的部分拷貝或是天然核酸序列的部分片段。除非另外標(biāo)明，這里所有通過DNA分子測序確定的核苷酸序列均用DNA自動測序 儀(例如Model 3730x1, Applied Biosystems, Inc.)確定。因此，作為本領(lǐng)域的一個常識， 使用這種自動測序方式確定的任何DNA序列可能含有差錯，這里確定的任何核苷酸序列也 可能含有差錯。自動測定的核苷酸序列典型地與所測序的DNA分子實際序列至少95%同 序，更典型地至少與所測序的DNA分子實際序列96%到99. 9%同序。DNA分子實際序列可 以通過其它方式更為準(zhǔn)確地確定，例如，通過本領(lǐng)域所熟知的人工DNA測序。也正如本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員所熟知，與實際序列相比，插入或刪除一個確定的核苷酸序列，在翻譯該核苷 酸序列時會導(dǎo)致移碼；因此，根據(jù)某一確定核苷酸序列預(yù)測的氨基酸序列，其可能與被測序 的DNA分子實際編碼的氨基酸序列從插入或刪除點起開始完全不同。為實現(xiàn)本發(fā)明，兩個序列在雜交液中雜交形成雙鏈復(fù)合物，雜交液含有6X SSC, 0. 5% SDS, 5X Denhardt氏溶液和100 μ g非特異性載體DNA。見Ausubel et al.上述，及部分2. 9，補充27(1994)。序列在“中雜交嚴(yán)格度”雜交，中雜交嚴(yán)格度指在溫度60°C使用 上述雜交液進(jìn)行雜交。在“高雜交嚴(yán)格度”雜交，溫度升至68°C。在中雜交嚴(yán)格度下雜交反 應(yīng)后，在室溫下用2X SSC加0.05% SDS溶液清洗核苷酸5次，而后在60°C用0. IX SSC加 0. SDS溶液清洗核苷酸1小時。高雜交嚴(yán)格度雜交反應(yīng)后，清洗核苷酸在68°C條件下進(jìn) 行。為實現(xiàn)本發(fā)明，雜交核苷酸是指用lng，比放射性為10，OOOcpm/ng的放射標(biāo)記探針能檢 測到的雜交核苷酸，其中在_70°C X-射線膠片曝光不超過72小時雜交核苷酸清晰可見。在有兩個多核苷酸(核酸)或多肽序列的情況下，“序列同源性”或“同源性”指在 某一特定區(qū)域比對兩個序列時殘基相同。當(dāng)序列同源性百分比指蛋白質(zhì)時，人們認(rèn)識到殘 基的不同源通常通過保守氨基酸替代不同來體現(xiàn)，既氨基酸殘基被具有相似化學(xué)特性(例 如，電荷及疏水性)的其它氨基酸殘基代替，而該分子的功能特性不改變。當(dāng)序列在保守替 代上不同時，可以上調(diào)序列同源性百分比以糾正替代的保守性。具有該種保守替代不同的 序列可以說具有“序列相似性”或“相似性”。調(diào)整序列同源性百分比的方法為本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所熟知。這典型地涉及給保守性替代作為部分而不是完全錯配評分，從而增加同 源性百分比，例如，一個同源氨基酸給1分，非保守性替代氨基酸給0分，保守性替代氨基酸 則介乎于0到1分。例如，保守性替代氨基酸評分通過裝載有Meyers & Miller算法的程 序 PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View, California, USA)計算，Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4 :11-17(1988)。本說明書所使用的序列同源性百分比是指通過在某一比較窗口內(nèi)比較兩個最佳 比對序列值，兩個最佳比對序列在比較窗口內(nèi)的多核苷酸序列部分與參照序列(其不含加 入或刪除)比較可能含有加入或刪除(即空位)。序列同源性百分比的計算是通過確定兩 個序列中同源核酸堿基或氨基酸殘基發(fā)生的數(shù)量以產(chǎn)生匹配殘基數(shù)量，匹配殘基數(shù)量再除 以比較窗口內(nèi)全部殘基數(shù)量，其結(jié)果再乘以100以產(chǎn)生序列同源性百分比。本發(fā)明中的核酸序列應(yīng)與序列1_2(SEQ ID NO :1_2)的核酸序列至少60%，65%， 70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 % 同源，最好應(yīng)與序列 1-2 (SEQ ID NO :1-2)的核酸序列至少 95%，96%，97%，98%，99%或 100% 同源。兩個核 酸序列間的差異可以發(fā)生在參照核苷酸序列5’或3’末端部位，或兩末端間的任何部位，或 單獨分散在參照序列的核苷酸中，或在參照序列中簇集。從實用方面講，任何特定的核酸分子與參照核苷酸序列是否至少85 %，90%， 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %同源是通過使用本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)算法比較兩個分子，并 可以利用公開的計算機(jī)程序如BLASTN程序來確定。見Altschul et al.，Nucleic Acids Res. 25 :3389-402(1997)。本發(fā)明進(jìn)一步提供含序列1 (SEQ ID NO 1)和序列2 (SEQ ID NO 2)中核苷酸序列 的核酸分子，其編碼具活性的生物堿合成酶，該酶的氨基酸序列相對于序列3 (SEQ ID N0 3)，并且本發(fā)明中的蛋白質(zhì)包括未改變生物堿合成酶功能的氨基酸替代，加入和刪除?！白儺愋蛄小敝概c標(biāo)準(zhǔn)或某一給定基因或蛋白質(zhì)的核苷酸或氨基酸序列有差異的 核苷酸或氨基酸序列。術(shù)語"同種異形"，“同種異體"和"類似物"亦指核苷酸或氨基 酸序列的“變異序列?！蓖ㄟ^加入，刪除，或替代一個或多個氨基酸而改變的氨基酸序列，或 發(fā)生改變的核苷酸序列，可以被認(rèn)為是“變異序列?！薄白儺愋蛄小币部梢允?保守性"改變， 即一個氨基酸被結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性類似的氨基酸所替代，例如，異亮氨酸替代亮氨酸?！白儺愋蛄小币部赡苡捎?非保守性"改變，例如，色氨酸替代苷氨酸。類似次要序列變異也可包 括刪除和/或插入氨基酸?？梢岳帽绢I(lǐng)域所熟知的計算機(jī)程序所提供的指南，如Vector NTI SuitednforMax,MD)軟件，來確定哪些氨基酸殘基可以被替代，插入或刪除?！白儺愋?列”也可指如Maxygen公司專利中所描述的那些"重排基因”(例如，美國專利6，602，986 號)。減少生物堿的方法在一方面，本發(fā)明提供減少MPO活性和生物堿含量的方法和核酸建構(gòu)物，也提供 生產(chǎn)生物堿含量減少的植物的方法和核酸建構(gòu)物。雖然其它方法也可以用來減少生物堿含 量，本發(fā)明主要應(yīng)用反義技術(shù)，有義協(xié)同抑制技術(shù)，RNA干擾(RNAi)技術(shù)，人工微小RNA技 術(shù)，病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VKS)技術(shù)，反義技術(shù)，有義協(xié)同技術(shù)和定向突變技術(shù)。RNAi技術(shù)利用RNAi質(zhì)粒建構(gòu)物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Helliwell andffaterhouse, Methods Enzymo 1. 392 :24-35 Q005))。該質(zhì)粒由反向重復(fù)結(jié)構(gòu)中要被沉默的靶基因片段組 成。DNA間區(qū)，通常是內(nèi)含子，隔離反向重復(fù)結(jié)構(gòu)。由適當(dāng)啟動子驅(qū)動的RNAi建構(gòu)物，例如， 花椰菜鑲嵌(花葉)病毒(CaMV) 35S啟動子，其整合在植物基因組中，驅(qū)動轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄合 成RNA分子，后者通過堿基配對形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAQiairpin RNA,hpRNA)。植物識別該 雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，并將其切為小片段RNAs (長約21個核苷酸)，即小片段干擾RNAs (siRNAs)。 siRNAs與蛋白質(zhì)復(fù)合物RISC相結(jié)合，RISC直接引導(dǎo)降解靶基因mRNA。人工微小RNA(amiRNA)技術(shù)利用可以沉默植物和其它真核細(xì)胞內(nèi)源性基因的微 小 RNA(miRNA)途徑(Schwab et al.，Plant Cell 18 :1121-33(2006) ；Alvarez et al, Plant Cell 18 :1134-51(2006)).該方法使用大約由21個核苷酸組成的沉默基因片段，將 其導(dǎo)入先質(zhì)miRNA基因以形成先質(zhì)amiRNA構(gòu)建物。后者通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知 的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)移至植物基因組。先質(zhì)人工微小RNA(ft~e-amiRNA)轉(zhuǎn)錄后經(jīng)加工生成人工微 小RNA (amiRNA)靶基因，其與人工微小RNA序列的21個核苷酸同序。RNAi沉默技術(shù)中，兩個因素可能影響所用片段的長度。片段越短，基因沉默成功 的可能性越小，但是發(fā)夾結(jié)構(gòu)很長會增加其在細(xì)菌宿主細(xì)胞重組的機(jī)會。沉默的有效性似 乎也依賴于靶基因，這可能反映靶mRNA的可接近度，或在該基因活躍的細(xì)胞中靶mRNA和 hpRNA的相對多寡。長度為100到800的堿基對片段，最好是300和600堿基對之間，通常 適于以最大程度增加沉默的有效性。另外一個考慮是靶基因所在部位，在5’ -非翻譯區(qū)， 編碼區(qū)和3’ -非翻譯區(qū)沉默基因均可取得良好效果。由于沉默的機(jī)制取決于序列同源性， 有可能交叉沉默相關(guān)mRNA序列。如果不想這樣，應(yīng)選擇與其它序列同源性低的區(qū)域，例如， 5’-或3’-非翻譯區(qū)。避免交叉沉默同源性序列的一條規(guī)則是在核酸建構(gòu)物和非靶基因序 列間的同源性少于20個堿基。這些原則大部分也適用于設(shè)計amiRNAs時靶區(qū)域的挑選。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGQ技術(shù)利用植物天然抗病毒機(jī)制，其類似于RNAi技術(shù)。 VIGS重組病毒含有宿主DNA片段，感染植物后導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默。在一個實施 例中，可以使用基于VIGS系統(tǒng)的煙草脆裂病毒(TRV)。有關(guān)該系統(tǒng)的描述參見如下文獻(xiàn)， Baulcombe D.C.，Curr. Opin. Plant Biol. 2 :109-113(1999) ；Lu R, et al.，Methods 30 296-303(2003) ；RatcliffF. et al.，The Plant Journal 25 :237-245(2001)；及美國專利 7，229，829。反義技術(shù)將能與靶基因產(chǎn)生的信使RNA (mRNA)結(jié)合的反義寡核苷酸導(dǎo)入植物。該“反義”寡核苷酸的堿基序列與靶基因mRNA的序列，即“有義”序列，互補。反義mRNA片段 阻止有義mRNA片段的活性，從而有效地滅活該基因的表達(dá)。有關(guān)應(yīng)用反義技術(shù)沉默植物基 因更詳盡的描述參見 Mam et al.，Plant J. 21 :27-42(2000)。有義協(xié)同抑制技術(shù)將高度表達(dá)的有義轉(zhuǎn)基因?qū)胫参?，造成該轉(zhuǎn)基因及內(nèi)源性基 因表達(dá)的下降(D印icker and van Montagu, Curr Opin Cell Biol9 :373-82 (1997))。其 效果取決于轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源性基因之間的序列同源性。可以利用諸如定向局部病變的誘發(fā)基因組(TILLING)及快速中子撞擊“刪除基 因”等定向突變技術(shù)敲除植物基因(Henikoff, et al.，Plant Physiol 135 =630-6(2004)； Li et al. Plant J. 27 =235-242 (2001)) TILLING使用誘變劑處理種子或個體細(xì)胞以引發(fā) 點突變，使用檢測單個核苷酸突變的敏感方法可以發(fā)現(xiàn)靶基因中的點突變。可以用諸如PCR 方法檢測所需突變(例如，導(dǎo)致靶基因產(chǎn)物滅活的突變)。例如，可以預(yù)備根據(jù)靶基因設(shè)計 的寡核苷酸引物，也可以通過PCR在誘變植物群體放大靶基因區(qū)域。經(jīng)放大的誘變基因與 野生基因退火，從而可以發(fā)現(xiàn)誘變基因與野生基因間的錯配。檢測到的基因序列差異可以 溯源于含有誘變基因的植物，從而顯露哪些突變植物會有所需的表達(dá)(例如，靶基因的沉 默)。這些植物可以通過選擇育種來產(chǎn)生具備所需表達(dá)的植物群體。TILLING可以提供包 括錯義和敲除突變等使靶基因表達(dá)下降的等位基因系列，它被視為是一種不需要導(dǎo)入轉(zhuǎn)基 因就可能敲除基因的方法，更可能被消費者所接受。快速中子撞擊在植物基因組引發(fā)突變， 即基因刪除，這可以通過與TILLING相似的方式用PCR檢測到。核酸建構(gòu)物根據(jù)本發(fā)明的一個方面，抑制生物堿合成的序列被加入適合導(dǎo)入植物或細(xì)胞內(nèi)的 核酸建構(gòu)物。因此，該類核酸建構(gòu)物可以用于在植物或細(xì)胞中抑制ΜΡ0，并抑制A622，NBB1， PMT及QPT中至少之一。另一方面，增加生物堿合成的序列被加入適合導(dǎo)入植物或細(xì)胞內(nèi)的核酸建構(gòu)物。 因此，該類核酸建構(gòu)物可以用于在植物中超表達(dá)MPO和可選擇地超表達(dá)例如A622，NBB1, PMT及QPT中至少之一以及在細(xì)胞中表達(dá)MPO和表達(dá)例如A622，NBB1，PMT及QPT中至少之
ο可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建重組核酸建構(gòu)物。例如，可以用限制性內(nèi)切酶切割載體中 含有供轉(zhuǎn)錄用DNA序列的相關(guān)片段。供轉(zhuǎn)錄用DNA序列也可以通過退火和連接人工寡核苷 酸，或經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)利用人工寡核苷酸在DNA末端生成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶切割位點。然 后，將該DNA序列克隆入含有適當(dāng)調(diào)控元素例如上游啟動子和下游終止子的載體。本發(fā)明的一個重要方面是對核酸建構(gòu)物的利用，其中生物堿合成酶編碼序列與一 個或多個調(diào)控序列操縱聯(lián)結(jié)，在不影響正常發(fā)育或生理的情況下，這些調(diào)控序列驅(qū)動生物 堿合成酶編碼序列在某些細(xì)胞類型，器官或組織的表達(dá)?！皢幼印敝皋D(zhuǎn)錄起始點上游參與識別和結(jié)合RNA聚合酶及其它蛋白質(zhì)以啟動轉(zhuǎn)錄 的DNA區(qū)域?！敖M成型啟動子”指在植物中終生活躍和在絕大多數(shù)環(huán)境條件下活躍的啟動 子。組織特異的，組織優(yōu)先的，細(xì)胞類型特異的和可誘導(dǎo)啟動子構(gòu)成所謂的“非組成型啟動 子?！?“操縱聯(lián)結(jié)”指啟動子與第二個序列在功能上聯(lián)結(jié)，啟動子序列啟動和介導(dǎo)第二個DNA 序列的轉(zhuǎn)錄。通常，“操縱聯(lián)結(jié)”意味著聯(lián)結(jié)的核酸序列是連續(xù)的。組成型啟動子有助于導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸序列的表達(dá)，以減少或增加MPO，A622，ΝΒΒΙ,ΡΜΤ，或QPT的表達(dá)，例如，香石竹(康乃馨)蝕環(huán)病毒(CERV)啟動子，花椰菜鑲嵌(花 葉)病毒(CaMV) 35S啟動子，或更特別的雙重增強(qiáng)的CaMV啟動子，其由兩個CaMV 35S啟動 子串聯(lián)排列組成(稱為"雙35S"啟動子)。組織特異的，組織優(yōu)先的，細(xì)胞類型特異的和 可誘導(dǎo)啟動子可能適用于某些情況。例如，在不影響在其它組織表達(dá)的情況下，組織特異的 啟動子允許上述蛋白質(zhì)在某些組織中超表達(dá)。組織優(yōu)先的啟動子包括在根部組織活躍的啟動子，例如，煙草RB7啟動子(Hsu et al. Pestic. Sci. 44 :9-19(1995)；美國專利號 5，459，252)，玉米 CRffAQ81 啟動子(美 國公開專利申請 20050097633)；擬南芥 ARSKl 啟動子(Hwang and Goodman, Plant J 8 37-43 (1995))，玉米MR7啟動子(美國專利號5，837，848)，玉米ZRP2啟動子(美國專利 號 5，633，363)，玉米 MTL 啟動子(美國專利號 5，466，785 和 6，018, 099)，玉米 MRS1，MRS2， MRS3，和MRS4啟動子(美國專利申請20050010974)，擬南芥隱蔽性啟動子(美國專利申請 20030106105)和在導(dǎo)致煙堿生物合成酶表達(dá)升高的條件下激活的啟動子，例如，煙草RD2 啟動子(美國專利號 5，837，876)，PMT 啟動子(Shoji T. et al. ,Plant Cell Physiol. 41 831-39 (2000b), W02002/038588)；或 A622 啟動子(Shoji Τ. et al.，Plant Mol Biol. 50 427-40(2002))ο本發(fā)明中的載體也可以含有終止序列，其位于本發(fā)明涵蓋的核酸分子的下游，終 止mRNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致聚腺苷酸序列的加入。此類終止子的例子包括根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶終 止子(Tnos)，根癌農(nóng)桿菌甘露堿合酶終止子(Tmas)和CaMV 35S終止子(T35Q。根據(jù)本發(fā) 明，尤為優(yōu)先使用的終止區(qū)域包括豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亞基終止區(qū)(Trbd)或Tnos 終止區(qū)。表達(dá)載體也可以含有增強(qiáng)子，起始密碼子，剪接信號序列及靶序列。本發(fā)明中的載體也可以含有選擇標(biāo)記，以便于識別培養(yǎng)細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化細(xì)胞。該選 擇標(biāo)記可以和外源核酸分子結(jié)合，即該基因與啟動子操縱聯(lián)結(jié)。正如在此所使用的，“標(biāo)記” 指編碼某一特征或表型的基因，其允許選擇或篩選含有該標(biāo)記的植物或細(xì)胞。例如，植物中 編碼對抗菌素或除草劑有抗性的標(biāo)記基因，其允許選擇被轉(zhuǎn)化細(xì)胞。合適的選擇性標(biāo)記包括腺苷脫氨酶，二氫葉酸還原酶，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸苷激 酶，黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，草甘膦和草銨膦抗性及氨基糖苷3’ -0-磷酸轉(zhuǎn)移酶 (卡那霉素，新霉素和G418抗性)。這些標(biāo)記可以包括對G418，潮霉素，博來霉素，卡那霉素 和慶大霉素抗性。核酸建構(gòu)物也可以含有選擇性標(biāo)記基因Bar，其提供對除草劑草丁膦類似 物如草銨膦的抗性。Thompson et al.，EMBO J. 9 :2519-23 (1987)。亦有其它合適的選擇性 標(biāo)記。也可以使用可視標(biāo)記，如綠色熒光蛋白(GFP)。根據(jù)控制細(xì)胞分裂來確定或選擇轉(zhuǎn) 化植物的方法亦有描述。見WO 2000/052168和WO 2001/059086。也可以包括源于細(xì)菌或病毒的復(fù)制序列，以便在細(xì)菌或噬菌體宿主克隆載體。優(yōu) 選地，使用源自原核細(xì)胞宿主范圍廣的復(fù)制序列?？梢栽诩?xì)菌中放入合適的選擇性標(biāo)記以 選擇含有所需核酸建構(gòu)物的細(xì)菌細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞選擇性標(biāo)記也包括抗菌素如卡那霉 素或四環(huán)素抗性。正如本領(lǐng)域所熟知的，載體也可含有編碼其它功能的核酸序列。例如，根癌農(nóng)桿菌 為宿主時，可以加入T-DNA序列以易化隨后向植物染色體的轉(zhuǎn)移和整合。該類基因建構(gòu)物活性的篩選可以通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染宿主植物及篩選改變的生物堿水平?？梢赃m當(dāng)?shù)貜腉enbank 核苷酸數(shù)據(jù)庫獲取基因核苷酸序列，并尋找核酸內(nèi)切酶 不能切割的位點?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法給這些基因加入上述位點，如用PCR引物或通過亞克 隆加入上述位點。優(yōu)選地，核酸建構(gòu)物包含在載體內(nèi)，最為合適的是，其包含在能在適合表達(dá)的合適 宿主(植物)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體內(nèi)。任一能夠產(chǎn)生含有導(dǎo)入DNA序列植物的載體均可達(dá)到 這一目的。這些合適的載體為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知，并在普通技術(shù)參考書中 有 描 述，如 Pouwels et al. , Cloning Vectors. A Laboratory Manual, Elsevier, Amsterdam(1986)。尤為合適的載體包括Ti質(zhì)粒載體。遺傳工程和選擇本發(fā)明包括通過導(dǎo)入編碼生物堿合成酶的多聚核苷酸序列來遺傳操縱植物或細(xì) 胞，以達(dá)到調(diào)控生物堿合成的目的。因此，本發(fā)明提供在植物中減少或增加生物堿合成的方 法和核酸建構(gòu)物。此外，本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞如細(xì)菌，酵母，絲狀真菌，藻類，綠色植物及 哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)生物堿及其關(guān)聯(lián)化合物的方法?！斑z傳工程”包括將核酸或特定突變導(dǎo)入生物宿主的任何方法。例如，植物遺傳工 程包括在植物中轉(zhuǎn)染能抑制某一靶基因表達(dá)的多聚核苷酸序列，以達(dá)到和對照植物相比降 低該靶基因表達(dá)的目的。植物遺傳工程也包括在植物中導(dǎo)入多聚核苷酸序列以表達(dá)某一新 基因，或增加植物中天然存在基因產(chǎn)物的含量。在本申請文件中，“遺傳工程”包括轉(zhuǎn)基因 植物和植物細(xì)胞，以及通過定向誘變生成的植物和植物細(xì)胞，例如，通過使用嵌合RNA/DNA 寡核苷酸，描述見 Beetham et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8774-8778(1999)和 Zhu et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 96 :8768-8773 (1999)，或所謂的“重組誘導(dǎo)寡聚核堿基，” 描述見PCT申請WO 2003/013226。類似地，植物遺傳工程也包括在植物或植物細(xì)胞導(dǎo)入修 飾過的病毒，后者導(dǎo)致宿主遺傳改變，正如這里所描述的那樣，產(chǎn)生類似于轉(zhuǎn)基因植物的結(jié) 果。見，例如，美國專利號4，407，956。此外，也可以通過簡單的(即不涉及外源核苷酸序 列)方法導(dǎo)入僅從宿主同類植物或性匹配植物獲得的核酸序列，生成經(jīng)遺傳工程改變的植 物或植物細(xì)胞。例如，見美國公開專利申請?zhí)?004/0107455。A.植物“植物”一詞包括整個植物，植物器官(例如，根，蓮，葉等)，種子，分化或未分化植 物細(xì)胞及其子代。植物物質(zhì)不受限地包括種子懸浮培養(yǎng)物，胚胎，分生組織，愈傷組織，葉， 根，莖，芽，果，配子體，孢子體，花粉及小孢子?？梢栽诒景l(fā)明中應(yīng)用的植物種類通常與可以 接受遺傳工程技術(shù)改變的高等植物的范圍一樣廣，包括單子葉植物和雙子葉植物以及裸子 植物。生產(chǎn)煙堿較好的植物包括茄科中的煙草屬，澳茄屬，茄屬，花燭屬，和蛾蝶花屬或菊科 中的鱧腸屬和百日菊屬?！盁煵?或“煙草植物”指煙草屬中任何產(chǎn)生煙堿的物種，包括但不局限于如 下成員叢生煙草(Nicotiana acaulis)，漸尖葉煙草(Nicotiana acuminata)，漸尖 葉煙草(Nicotiana acuminata var. Multzjlora),非洲煙草(Nicotianaafricana), 花煙草(Nicotiana alata)，抱蓮煙草(Nicotiana amplexicaulis)，阿倫特氏煙草 (Nicotiana arentsii),漸狹葉煙草(Nicotiana attenuata),貝納米特氏煙草(Nicotianabenavidesii)，本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)，畢基勞氏煙草(Nicotiana bigelovii),博內(nèi)里煙草(Nicotiana bonariensis),洞生煙草(Nicotiana cavicola), 克利夫蘭式煙草(Nicotiana clevelandii)，心葉煙草(Nicotiana cordifolia)，傘狀 煙草(Nicotiana corymbosa),迪勃納氏煙草(Nicotiana debneyi),高煙草(Nicotiana excelsior),福爾吉特氏煙草(Nicotiana forgetiana),香煙草(Nicotiana fragrans), 粉藍(lán)煙草(Nicotianaglauca)，粘煙草(Nicotiana glutinosa)，古特斯皮德氏煙草 (Nicotianagoodspeedii),胃胃 ft 胃(Nicotiana gossei), M ☆ 胃(Nicotiana hybrid)，，因古兒巴煙草(Nicotiana ingulba)，川上煙草(Nicotiana kawakamii)，奈 特氏煙草(Nicotiana knightiana)，藍(lán)格斯多夫煙草(Nicotiana langsdorf i)，狹葉煙 草(Nicotiana linearis),長花煙草(Nicotiana longiflora)，海濱煙草(Nicotiana maritima),擬似煙草(Nicotiana megalosiphon)，摩西煙草(Nicotiana miersii), 夜花煙草(Nicotiana noctiflora)，裸莖煙草(Nicotiananudicaulis)，耳狀煙草 (Nicotiana obtusifolia),西方煙草(Nicotianaoccidentalis),西方 subsp. Hesperis 煙草(Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis)，耳狀煙草(Nicotiana otophora)， 圓錐煙草(Nicotiana paniculata)，少花煙草(Nicotiana pauczjlora)，碧東煙草 (Nicotiana petunioides)，藍(lán)茉莉葉煙草(Nicotiana plumbaginifolia)，四科煙草 (Nicotiana quadrivalvis)，雷蒙德氏煙草(Nicotiana raimondii)，殘波煙草(Nicotiana repanda)，蓮座葉煙草(Nicotiana rosulata),蓮座葉 subsp. Ingulba 煙草(Nicotiana rosulata subsp. Ingulba),圓葉煙草(Nicotiana rotundifolia),黃花煙草(Nicotiana rustica)，賽特式煙草(Nicotiana setchellii)，特大管煙草(Nicotiana simulans), ^jp 葉煙草(Nicotiana solanifolia)，斯佩格茨煙草(Nicotiana spegauinii)，斯托克通氏 (Nicotiana stocktonii)，#舌甘: 胃(Nicotiana suaveolens),(Nicotiana
sylvestris)，普通煙草(Nicotiana tabacum),藍(lán)煙草(Nicotianathyrsiflora),絨毛 煙草(Nicotiana tomentosa)，絨毛狀煙草(Nicotianatomentosifomis)，三角葉煙草 (Nicotiana trigonophylla)， Ρ胃(Nicotianaumbratica), ^ Bf jg ^ (Nicotiana undulata),亶員毛煙草(Nicotiana velutina),序煙草(Nicotiana wigandioides),禾口 Sanderae 煙草(Nicotiana χ sanderae)?！盁煵莓a(chǎn)品”指含有煙草植物物質(zhì)的產(chǎn)品，包括例如用于戒煙的尼古丁膠姆糖和尼 古丁貼片，卷煙煙葉，膨化煙葉和再造煙葉，雪茄煙葉，煙斗煙，卷煙，雪茄，和所有類型的無 煙煙葉如嚼煙，鼻煙葉，唇齒煙和尼古丁含片。古柯科為開花植物，由4個屬和大約240種組成，其最著名成員為古柯。曾有 報道，被標(biāo)記的4-甲胺基丁醛縮二乙醇(N-甲基吡咯啉離子的乙縮醛二乙醇衍生物) 加入古柯葉中后，標(biāo)記物參入到古柯堿的托烷類生物堿部分。LeethPlanta Med. 56 339-352(1990)。因此，可以有理由地推測本發(fā)明中的MPO基因參與古柯堿的形成。正如本領(lǐng)域所熟知的，有若干種方式可以將基因和基因建構(gòu)物導(dǎo)入植物，植物轉(zhuǎn) 染和組織培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合已成功地成為創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物有效策略不可缺少的一部分。本發(fā)明中可使用的這些方法已在它處描述(Potrykus，Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol. 42 :205-225(1991) ；Vasil, Plant Mol. Biol. 5 :925-937 (1994)； Walden and Wingender, Trends Biotechnol. 13 :324-331 (1995) ；Songstad et al.,Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40 :1-15 (1995))，并為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 所熟知。例如，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，通過真空浸滲(Bechtold et al. , C. R. Acad. Sci. Ser. Ill Sci. Vie，316 1194-1199 (1993))或有傷接種(Katavic et al. , Mol. Gen. Genet. 245 :363-370(1994))根癌農(nóng)桿菌能夠介導(dǎo)擬南芥的轉(zhuǎn)染；此外，利用根癌農(nóng)桿菌 Ti-質(zhì)粒同樣可以介導(dǎo)其它植物或作物的轉(zhuǎn)染(例如，下胚軸(DeBlock et al. , Plant Physiol. 91 :694-701(1989))或子葉柄傷口感染(Moloney et al.，Plant Cell Rep. 8 238-242(1989))，亦可以利用顆粒撞擊/生物彈道法(Sanford et al. , J. Part. Sci. Technol. 5 :27-37(1987) ；Nehra. et al.，Plant J. 5 :285-297(1994) ；Becker et al.， Plant J. 5 :299-307(1994))或聚乙烯乙二醇輔助的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法(Rhodes et al., Science240 :204-207(1988) ；Shimamoto et al. , Nature 335:274—276(1989))。發(fā)根農(nóng)桿菌可以用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物發(fā)根培養(yǎng)物，包括煙草，正如所描述的那樣， 例如，Guillon et al.，Curr. Opin. Plant Biol. 9 :341-6^006)?！盁煵莅l(fā)根”指煙草根部 含有來自發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒并整合到基因組的T-DNA，其在不補充生長素和其它植物激素 情況下能培養(yǎng)生長。煙草發(fā)根和完整煙草植物根部一樣能夠生產(chǎn)煙堿。此外，可以用根瘤菌屬，中華根瘤菌屬，或中慢生根瘤菌屬轉(zhuǎn)染植物(Broothaerts et al.，Nature 433 :629-633(2005))。植物或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，已整合所需DNA的植物或植物可以通過如下方法篩選， 抗生素抗性，殺草劑抗性，氨基酸類似物耐性，或表型標(biāo)記?？梢杂萌舾煞N方法如Northern雜交或定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)確定植物細(xì)胞是 否發(fā)生基因表達(dá)改變。完整轉(zhuǎn)基因植物可以通過常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生。這樣的轉(zhuǎn)基因 植物可以繁殖和自花授粉來產(chǎn)生純合株系。這些植物產(chǎn)生種子，后者含有編碼引入特征的 基因，可以生長具有產(chǎn)生選擇表型的植物。通過本發(fā)明實現(xiàn)的生物堿成分改良可以和其它令人感興趣的性狀相結(jié)合，如疾病 抗性，害蟲抗性，高產(chǎn)量，或其它性狀。例如，含有改良生物堿成分的適合的轉(zhuǎn)基因的遺傳工 程生成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物，可以被用來將改良生物堿成分的性狀滲入到一個商業(yè)上可以接受 的遺傳背景中，從而獲得既含有改良生物堿成分又具有所需遺傳背景的品種。例如，遺傳工 程生成的煙堿含量減少的煙草植物，可以將煙堿含量減少的性狀滲入到具有抗病性如TMV， 煙草黑脛病菌，或青霉抗性的煙草品種中。此外，可以將能夠賦予其它性狀的核酸建構(gòu)物轉(zhuǎn) 染至本發(fā)明中含有改良生物堿成分植物的細(xì)胞中。B.細(xì)胞本發(fā)明考慮用編碼生物堿合成酶的核酸序列來經(jīng)由遺傳工程生成細(xì)胞。例舉的 細(xì)胞包括，但不局限于植物細(xì)胞，例如顛茄，莨菪葉，擬南芥，及昆蟲，哺乳動物細(xì)胞，酵母， 真菌，藻類或細(xì)菌細(xì)胞。有關(guān)適用的宿主細(xì)胞的進(jìn)一步討論見Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY :METH0DS INENZYMOLOGY 185，Academic Press, San Diego，Calif(1990)?！袄ハx細(xì)胞”指任何可以被編碼生物堿合成酶的基因轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞，其表達(dá)的酶 或其產(chǎn)物在產(chǎn)量上足以被回收。有說明性的昆蟲細(xì)胞包括Sf9細(xì)胞(ATCC CRL 1711)?！罢婢?xì)胞”指任何可以被編碼生物堿合成酶的基因轉(zhuǎn)染的真菌細(xì)胞，其表達(dá) 的酶或其產(chǎn)物在產(chǎn)量上足以被回收。有說明性的真菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞如啤酒酵母 (Baldari,et al.，1987. EMBO J. 6 :229-234)和甲醇酵母(例如，Invitrogen 提供的 KM714甲醇酵母)。也可以使用絲狀真菌細(xì)胞如曲霉菌和木霉。Archer，et al.，Antonie van Leeuwenhoek 65 :245-250(2004)?！凹?xì)菌細(xì)胞”指任何可以被編碼生物堿合成酶的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)菌細(xì)胞，其表達(dá)的酶 或其產(chǎn)物在產(chǎn)量上足以被回收。有說明性的細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿菌，如QIAGEN商業(yè)上提供 的M15/r印4大腸桿菌?！安溉閯游锛?xì)胞”指任何可以被編碼生物堿合成酶的基因轉(zhuǎn)染的哺乳細(xì)胞，其表 達(dá)的酶或其產(chǎn)物在產(chǎn)量上足以被回收。有說明性的哺乳動物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)或COS細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞也可以包括導(dǎo)入編碼生物堿合成酶序列的受精卵細(xì)胞或 胚胎干細(xì)胞。該類宿主細(xì)胞可以用來制造人以外的轉(zhuǎn)基因動物。應(yīng)用在哺乳動物細(xì)胞調(diào)控 蛋白表達(dá)的系統(tǒng)的例子包括Clontech公司的Tet-Off及Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和其它類似 系統(tǒng)。Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:55475551(1992)。“藻類細(xì)胞”指在不影響藻類正常發(fā)育或生理的情況下任何可以被編碼生物 堿合成酶的基因轉(zhuǎn)染的藻類細(xì)胞。有說明性的藻類細(xì)胞包括萊茵衣藻(Mayfield and Franklin, Vaccine 23 :1828-1832(2005)。由于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)生物堿可能對昆蟲的生長和發(fā)育產(chǎn)生不利影響，使用誘導(dǎo) 表達(dá)系統(tǒng)可以減輕這些副作用。例如，昆蟲細(xì)胞可以先在非誘導(dǎo)條件下生長至所需狀態(tài)，然 后再誘導(dǎo)酶表達(dá)。此外，可以給表達(dá)生物堿合成酶基因的細(xì)胞提供前驅(qū)物質(zhì)以增加煙堿合成底物的 可利用度。也可以給細(xì)胞提供前驅(qū)物質(zhì)類似物，后者可以參合到天然煙堿類生物堿的類似 物中。根據(jù)本發(fā)明，可以利用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)將核酸建構(gòu)物導(dǎo)入細(xì)胞，這些技術(shù)包括根癌農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染，顆粒撞擊，電穿孔和聚乙烯乙二醇融合，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染，DEAE-葡 聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。在不使用選擇性或可視標(biāo)記的情況下，可以使用本發(fā)明中的核酸建構(gòu)物對該類細(xì) 胞施行遺傳工程，所生成的轉(zhuǎn)基因生物可以通過檢測導(dǎo)入的核酸建構(gòu)物來識別。例如，可以 測量一個特定細(xì)胞中的蛋白，多肽或核酸來確定一個細(xì)胞是否被成功轉(zhuǎn)染。正如在本行業(yè) 常規(guī)進(jìn)行的，例如，可以通過PCR或其它適當(dāng)方法檢測特定核酸序列或多肽序列以確定導(dǎo) 入的核酸建構(gòu)物的存在。此外，可以通過與在相似條件下生長的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞對比來識別生 長率的差異或形態(tài)學(xué)特征上的差異以確定經(jīng)遺傳工程改良的細(xì)胞。見W02004/076625。IV.定量測定生物堿含量A.生物堿含量下降在本發(fā)明的一個方面，遺傳工程生成的植物和細(xì)胞以生物堿含量下降為特征。有若干方法可以定量檢測生物堿水平的減少，例如根據(jù)氣液色譜法，高效液相色 譜法，放射免疫法及酶聯(lián)免疫法定量測量生物堿水平。本發(fā)明使用Waters公司的沈95型 分離模塊進(jìn)行高效液相色譜分析測量生物堿水平，該分離模塊在色譜柱溫度60°C條件下裝 備有 Waters X-Terra RP18 5 μ m4. 6X 150mm 預(yù)柱。等度洗脫系統(tǒng)由 80% A :20% B 組成， 溶劑A成份為50mM檸檬酸，IOmM辛基磺酸(pH 3. 0) (pH由三乙胺調(diào)節(jié))及5% MeOH ；溶劑 B成份為甲醇；流速為Iml/分鐘，共15分鐘。注射容積為20μ1。用光電二極管陣列檢測 法在^lnm檢測煙堿。
在描述本發(fā)明中植物時，“生物堿含量減少的植物”或“生物堿含量下降的植物”一 語包括生物堿含量是同種或同品種對照植物的50%以下，最好是所述對照植物的10%或
以下的植物。B.生物堿含量增加在本發(fā)明的一個方面，遺傳工程生成的植物和細(xì)胞以生物堿含量增加為特征。類 似地，遺傳工程生成的細(xì)胞以生物堿含量增加為特征。在描述本發(fā)明中植物時，“生物堿含量增加的植物”一語包括生物堿含量是同種或 同品種對照植物的10%以上，最好是所述對照植物的50%，100%或200%以上的植物。遺傳工程生成的細(xì)胞以煙堿類生物堿合成為特征。例如，遺傳工程發(fā)明的細(xì)胞比 對照細(xì)胞能生產(chǎn)更多的煙堿。有若干方法可以定量檢測生物堿水平的增加，例如根據(jù)氣液色譜法，高效液相色 譜法，放射免疫法及酶聯(lián)免疫法定量測量生物堿水平。本發(fā)明使用裝備有上述逆相色譜柱 和光電二極管陣列檢測儀的高效液相色譜法檢測生物堿水平。產(chǎn)物MPO基因可以用于在宿主細(xì)胞生產(chǎn)ΜΡ0。此外，可利用重組MPO的活性生產(chǎn)產(chǎn)物。 例如，重組MPO可以用來合成或部分合成生物堿。MPO作用于部分N-甲基腐胺類似物產(chǎn)生 非天然產(chǎn)物。見 Boswell et al.，Phytochemistry 52 :855-869(1999) ；Boswell et al.， Phytochemistry 52 :871-878 (1999)。因此，重組MPO有助于生產(chǎn)生物堿類似物，包括煙堿 類似物。為此目的，有若干種方法生產(chǎn)大規(guī)模或商業(yè)化數(shù)量的ΜΡ0，包括從遺傳工程生成的 植物，細(xì)胞或培養(yǎng)系統(tǒng)提取重組酶，這包括，但不局限于，發(fā)根培養(yǎng)物，昆蟲，細(xì)菌，真菌，植 物，藻類，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)和體外翻譯系統(tǒng)。下列例子利用功能基因組學(xué)闡釋MPO基因在吡咯烷類生物堿(例如，煙堿)和托 烷類生物堿(例如，東茛菪堿和古柯堿)生物合成中的重要作用。從模本植物本塞姆氏煙 草通過測定消減cDNA文庫序列獲得表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)，該文庫富含茉莉酸甲酯處理過 的本塞姆氏煙草根部表達(dá)的基因。分析EST數(shù)據(jù)集以確定編碼煙堿生物合成酶DNA序列的 存在。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGQ技術(shù)沉默候選基因，參與煙堿生物合成基因的沉默 導(dǎo)致煙堿水平顯著降低。本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)顯示從本塞姆氏煙草分離出的基因，其編碼參與煙堿生物合成的 N-甲基腐胺氧化酶(MPO)。這些結(jié)果表明被克隆的MPO屬于胺氧化酶超家族，在原核細(xì)胞 和真核細(xì)胞廣泛存在，其含有結(jié)合緊密的CuII和來自酪氨酸的6-羥基多巴醌(TPQ)成份。下述這些例子只是說明而已，不應(yīng)解讀為對本發(fā)明的限制。例1.消減cDNA文庫的建立，EST序列測定和MPO候選基因的選擇。煙堿生物合成在煙草根部進(jìn)行(Dawson RF, Science 94 :396-397 (1941))，通 過昆蟲傷害，創(chuàng)傷和施用茉莉酮酸酯(MeJa)誘導(dǎo)煙堿生物合成(WinzRA et al.，Plant Physiol. 125 :2189-2202 Q001))。為了識別編碼煙堿生物合成酶的基因，采用MeJa誘導(dǎo)的 本塞姆氏煙草根部ESTs序列測定與利用VIGS功能分析相結(jié)合的新方式。本塞姆氏煙草的無基質(zhì)栽培本塞姆氏煙草(茄科)秧苗在無基質(zhì)栽培條件下生長，營養(yǎng)液為0.2hHOagland氏溶液，其配有螯合鐵溶劑，并用起泡器加入氧氣。在3周大的植物根部加入MeJa至最后的 濃度為11 μ Μ，分別在處理前(t = 0)和處理后1，4，和7小時取樣分析。利用RNeasy Midi 試劑盒Oliagen)分離全部RNA，即從未處理的葉和根部，各450mg，分離RNA，以及從MeJa處 理1，4，和7小時的根部，各150mg，分別分離RNA，并將其合并。我們構(gòu)建了三個不同的消減 cDNA文庫NBREL2，用合并的MeJa處理的根部mRNA做檢測子和未處理的根部mRNA做驅(qū)趕 子；NBLEL3，用合并的MeJa處理的根部mRNA做檢測子和未處理的葉部mRNA做驅(qū)趕子；及 NBREL4，用合并的MeJa處理的根部mRNA做檢測子和驅(qū)趕子。消減VIGS-cDNA文庫的建立利用PCR選擇消減cDNA文庫試劑盒(Clontech)進(jìn)行cDNA合成，并作出部分改 良。簡單地，約 250 μ g 全體 RNA 與 300 μ 1 Oligo (dT) 25Dynabeads (Dynal Biotech)在結(jié) 合液(20mM Tris-HCl pH 7. 5，IM LiCl,2mM EDTA)中混合。孵育 10 分鐘后，用洗液 B (IOmM Tris-HCl pH 7.5,0. 15M LiCl, ImM EDTA)洗滌微球3次，再用一鏈緩沖液洗2次。洗滌后 含有mRNA的微球重新懸浮于40 μ 1 cDNA合成液(8μ1 5Χ—鏈緩沖液，4μ1 IOmM dNTPs, 24 μ 1不含RNA酶的水和4μ 1 (8U)AMV反轉(zhuǎn)錄酶)，并在42°C孵育1. 5小時。加入120 μ 1 二鏈合成液(32 μ 1 5Χ次鏈緩沖液，3. 2 μ 1 IOmM dNTPs, 8 μ 1 20Χ混合酶和77 μ 1不含RNA 酶的水)進(jìn)行二鏈合成，并在16°C孵育2小時，而后加入4 μ 1 (12U) T4DNA聚合酶，孵育30分 鐘。加入20 μ 1 0. 5Μ EDTA終止反應(yīng)。磁性分離微球，除去上清液，將微球再懸浮于500 μ 1 洗液(5mM Tris-HCl pH 7. 5,0. 5mM EDTA，IM NaCl, 1% SDS 和 10 μ g/ml 糖原)，在 75°C加 熱 15 分鐘。用洗液(5mM Tris-HCl pH 7. 5,0. 5mM EDTA, IM NaCl 和 200 μ g/mlBSA)洗滌 微球3次，再用RsaI液洗滌2次。將微球懸浮于84 μ 1 H20,10 μ 1 IOx RsaI液，3 μ 1 (30U) Rsal，在37°C過夜孵育。通過磁性分離微球來分離未結(jié)合的cDNA，并根據(jù)廠家的說明，將 cDNA用于適配器連接，雜交和初次PCR。第2次PCR使用的引物為5 ’ -CGGGATCCTCGAGCGGC CGCCCGGGCAGGT-3，(BamHl 位點底部劃有橫線)和 5’ -CGGAATTCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’ ( EcoRl位點底部劃有橫線)。用EcoRI和BamHI消化PCR選擇放大的cDNA片段(700ng)和 TRV-RNA2 載體 pYL156，將消化產(chǎn)物連接(Liu Y，et al. ,PlantJ. 30 :415-429,2002) 將聯(lián) 結(jié)產(chǎn)物經(jīng)電穿孔導(dǎo)入DHlOB大腸桿菌以生成初級文庫。將其在瓊脂平板放大，經(jīng)電穿孔分 離質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染C58根癌農(nóng)桿菌。連接效率經(jīng)菌落PCR確定為98%。消減VIGS-cDNA文庫EST測序和確定MPO候選基因用如下載體弓丨物5，一GTTACTCAAGGAAGCACGATGAG — 3，禾口 5，-CAGTCGAGAATGTCAATCTCGTAG-3，進(jìn)行PCR來放大cDNA插入物以用于序列測定，并隨機(jī) 選擇根癌農(nóng)桿菌菌落作為模版。生成的PCR產(chǎn)物用Big Dye Terminators測序試劑盒和引 物 5，-GTTACTCAAGGAAGCACGATGAG-3，直接進(jìn)行測序。分別從 NBREL2，NBLEL3 和 NBREL4 測 定了 2016，1920和1920個ESTs序列。去除質(zhì)量不良的序列后，把3個數(shù)據(jù)集合并后共獲 得3480個特異轉(zhuǎn)錄體，包括606鄰接片段和觀74單例片段。全部VIGS-EST數(shù)據(jù)集通過經(jīng) BLASTX與NCBI非冗贅數(shù)據(jù)庫比較來注解。已證明N-甲基腐胺氧化酶(MPO)是煙堿和其它生物堿生物合成的主要酶蛋 白(圖1)，其為含銅的醌蛋白，氧化N-甲基腐胺形成N-甲基氨基丁醛(Mizusaki S. et al. ， Phytochemistry 11 :2757-2762, (1972) ；Davies HM et al. ， Phytochemistry 28 1573-1578(1989))。N-甲基氨基丁醛自動環(huán)化形成N-甲基吡咯啉離子。利用主題詞查找BLASTX結(jié)果，我們確定7個被注解為銅胺氧化酶的ESTs。7個克隆形成2個簇(CL181鄰接 片段1，3個成員；CL547鄰接片段1，2個成員)和3個單例片段(表1)。例2.克隆N-甲基腐胺氧化酶候選基因全長度cDNAcDNA片段用于EST測序和VIGS分析，因此有必要利用RACEPCR獲得全長度cDNA 序列。N-甲基腐胺氧化酶候選基因全長度cDNA RACE PCR根據(jù)生產(chǎn)商說明，利用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)對5μ g MeJa處理的本塞 姆氏煙草根部全體RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以獲取MP05，cDNA末端。使用PCR程序(95°C 2分鐘；循 環(huán)；35 次，950C 30 秒，580C 30 秒，66°C 30 秒，72°C 1 分鐘；72°C 10 分鐘)和 Pfu Turbo 聚合 酶(Stratagene)以 GeneRacer 5’ 引物和基因特異引物(5’ -CTTGAGCATCTATGGGTGGC-3’ ) 進(jìn)行5’RACE PCR的反應(yīng)，。使用同一 PCR程序以GeneRacer 3’引物和基因特異引物 (5，-AGCAATGCGTGACTGTGATCCG-3，)進(jìn)行3，RACE反應(yīng)。形成的平端PCR產(chǎn)物被克隆至 pCR4Blunt-T0P0 載體 Qnvitrogen)，并從兩端測序。MPO基因全長2738堿基對(bp)，編碼2379bp的開放讀碼區(qū)(ORF)。該MPO基因序 列列于SEQ ID NO :1。MPO開放讀碼區(qū)序列(ORF)列于SEQ ID NO :2。預(yù)測的氨基酸序列 列于 SEQ ID NO :3ο根據(jù)對一級氨基酸序列的計算機(jī)分析(SEQ ID No 3)，煙草MPO含有若干個具有 銅胺氧化酶特征的功能區(qū)。氨基酸殘基96-141形成銅胺氧化酶Ν2區(qū)，氨基酸殘基221-325 形成銅胺氧化酶Ν3區(qū)。MPO氨基酸514為保守的酪氨酸，其被翻譯后修飾為氧化還原因子 6-羥基多巴醌(TPQ)。在562，564和7 位點保守的組氨酸殘基可能行使與銅結(jié)合的功 能。因此，很顯然，來自某一對應(yīng)物種的MPO可能在這些區(qū)域更為高度保守并含有類似的功 能區(qū)。物種間這些功能區(qū)的高度同源性提供了煙草MPO基因靶區(qū)域，其核苷酸序列有助于 在其它相關(guān)植物制備干擾RNA或其它基因沉默建構(gòu)物。例3. MPO候選基因表達(dá)分析正如腐胺甲基轉(zhuǎn)換酶(PMT)和催化煙堿生物合成的其它酶蛋白在煙草根部特異 性表達(dá)所證明的，煙堿生物合成發(fā)生在煙草根部(Sinclair SJ et al. ,Functional Plant Biol. 31 :721-729, (2004))。為確定克隆的MPO是否在根部表達(dá)，并為MeJa誘導(dǎo)，我們使用 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCIi)測量MPO轉(zhuǎn)錄體的水平。RT-PCR分析MPO和PMT在本塞姆氏煙草不同組織的表達(dá)使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)測定MPO在本塞姆氏煙草不同組織的表達(dá)，并將其與PMT 相比較，已知后者參與煙堿生物合成，并作用于緊接MPO上游的一步(圖1)。利用RNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen)，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明，從本塞姆氏煙草組織(嫩葉，老葉，莖， 主根部，側(cè)根部和整個幼苗)分離RNA。根據(jù)superscript III—鏈RT-PCR合成系統(tǒng)所描 述的步驟(Invitrogen)，從1. 7 μ g全體RNA合成一鏈cDNA，隨后進(jìn)行PCR放大2 μ 1 cDNA， 反應(yīng)容積為50 μ 1，使用PCR程序(95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 50秒，循環(huán)30次)和Taq聚 合酶。肌動蛋白引物為 5，-CTACAATGAGCTTCGTGTTGC-3，和 5，-TGCTGAGGGAAGCCAAGATA-3，； PMT 引物為 5’ -TCATGCTCTTTGAGTCAGCAA’ -3，和 5’ -CACCAGTGTTCATTGTTCACT-3，；ΜΡ0 引物 為 5，-AGGTGGACATCACAGAGGAA-3，和 5，-AGTCGTTTCAACTCCTCCCGTA-3，。各反應(yīng)的一部分經(jīng) 含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳分析。
如圖2所示，MPO在本塞姆氏煙草植物的細(xì)側(cè)根部表達(dá)最高。在主根部和包括根 部和葉組織的整個幼苗均檢測到MPO轉(zhuǎn)錄體。因此，MPO在根部的特異性表達(dá)支持其在煙 堿生物合成的作用。qRT-PCR分析MPO和PMT在MeJa處理的本塞姆氏煙草根部的表達(dá)我們利用定量RT-PCR(qRT-PCR)測定MeJa對MPO的誘導(dǎo)。我們使用和在RT-PCR 分析MPO在不同組織表達(dá)相同的PCR引物。分別在處理前和加入Meja(ll μ Μ)到無基質(zhì) 溶液后1，4，和7小時提取無基質(zhì)栽培生長的根部組織全體RNA。無基質(zhì)栽培條件已在 例 1 中詳述。利用 RNeasy Plant Mini 試劑盒 ^!iagen)分離 RNA。根據(jù) Superscript IIIPlatinum SYBR Green兩步qRT-PCR試劑盒(Invitrogen)所描述的步驟，我們使用 iCycler iQ Real-Time測定系統(tǒng)(BioRad)進(jìn)行qRT-PCR。簡單地，在20 μ 1反應(yīng)容積中使 用1. 7 μ g全體RNA進(jìn)行一鏈cDNA合成，隨后在96孔光學(xué)PCR板(BioRad)對1 μ 1 cDNA 進(jìn)行實時PCR放大，反應(yīng)容積為25 μ 1，反應(yīng)條件為95°C 30秒，58°C 15秒，72°C 50秒，循環(huán) 40次。用肌動蛋白作為轉(zhuǎn)錄體標(biāo)準(zhǔn)化的參考基因，靶基因表達(dá)水平的變化根據(jù)Ramakers et al. (Neuroscience Letters 339 :62-66(2003))描述的方法確定。圖3顯示MeJa誘導(dǎo)的PMT和MPO表達(dá)的改變。和誘導(dǎo)前水平相比，MeJa增加MPO 表達(dá)23倍。MPO表達(dá)跟隨PMT的表達(dá)，雖然MeJa導(dǎo)致后者轉(zhuǎn)錄體水平發(fā)生更為戲劇性的增 加。例4.利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGQ技術(shù)在植物沉默MPO表達(dá)。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGQ技術(shù)檢測沉默候選MPO基因?qū)焿A生物合成的 作用。VIGS是功能性基因組學(xué)工具，可在植物進(jìn)行快速功能缺失或下降實驗(Baulcombe D. C. ,Curr. Opin. Plant Biol. 2 :109-113 (1999) )。VIGS 的優(yōu)缺點已有論述(Lu R, et al.， Methods 30 :296-303(2003)) 含MPO片段的VIGS沉默建構(gòu)物我們檢測了 3個代表MPO不同區(qū)域獨立的VIGS建構(gòu)物降低煙堿水平的能力。圖4 標(biāo)明這些片段相對于MPO ORF的位置。VIGS建構(gòu)物214D11長度為378bp，對應(yīng)于全長度MPO cDNA核苷酸754-1132。214D11與煙草脆裂病毒(TRV)外殼蛋白反方向(反義方向)排列。 VIGS建構(gòu)物317A08長度為25^p，對應(yīng)于全長度MPO cDNA核苷酸1521-1772。317A08亦 逆向排列。VIGS建構(gòu)物40;3B01長度為277bp，對應(yīng)于全長度MPO cDNA核苷酸11四_1405。 403B01相對于TRV外殼蛋白正義方向排列。VIGS 方法本塞姆氏煙草植物在可控環(huán)境箱生長，白天23°C，16小時；黑夜，20° C，8小時； 光強(qiáng)度約為 100ymol/m2/s。含有 TRV-RNAl 質(zhì)?；?TRV-RNA2 建構(gòu)物(pYL156) (Liu et al, 2002)的C58根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物在過夜生長。離心后，將細(xì)菌懸浮于含有ImM MES (pH 5), IOmMMgCl2和100 μ M乙酰丁香酮的滲透液，OD600 = 1，在滲透前置于室溫3_6小時。 TRV-RNAl和TRV-RNA2建構(gòu)物懸液1 1混合，并用Iml注射器將其滲透至年齡為3_4周植 物上方葉子的底部。僅用緩沖液或含無功能的綠色熒光蛋白(GFP)TRV-RNA2建構(gòu)物滲透陰 性對照植物。植物生長3周后用離子對-HPLC法測定葉子中煙堿含量。 離子對-HPLC法分析煙堿 從各植物切割年幼( 3-5cm)葉子的一半作為樣品。測定樣品鮮重后，加入200 μ 1鋯微球和300 μ 1 50mM檸檬酸緩沖液(ρΗ 3)甲醇(70 30)。用Beadbeater使樣 品均質(zhì)，超聲水浴10分鐘。所產(chǎn)生的提取液在4°C過夜孵育，離心和過濾(0. 45 μ m, Spin-X) 以澄清提取液。使用Waters公司的沈95型分離模塊進(jìn)行離子對-HPLC，該分離模塊在色 譜柱溫度60°C條件下裝備有Waters X-Terra RP18 5ym 4. 6X 150mm預(yù)柱。等度洗脫系 統(tǒng)由80% A 20% B組成，溶劑A成份為50mM檸檬酸，IOmM辛基磺酸pH3.0(pH由三乙胺 調(diào)節(jié))及5% MeOH,溶劑B成份為甲醇，流速為Iml/分鐘，共15分鐘。注射容積為20 μ 1。 用光電二極管陣列檢測法在^lnm檢測煙堿。標(biāo)準(zhǔn)曲線(r20. 999)通過注入1040 μ g/ml到 10. 4μ g/ml真正煙堿溶液獲得，通過與該標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，利用峰區(qū)面積進(jìn)行煙堿定量。3個MPO VIGS建構(gòu)物在被感染的植物中均導(dǎo)致煙堿水平降低(圖5)。TRV-GFP 對照植物的煙堿水平與只用緩沖液處理的植物的煙堿水平相似。這表明TRV感染對煙堿 生物合成幾乎沒有影響。我們對VIGS建構(gòu)物4(X3B01進(jìn)行進(jìn)一步檢測。MeJa(0.1% (ν/ν) 溶解于含有0. 1 % (v/v) Tween-20的水中，我們測定給葉子噴灑MeJa前和噴灑5天后感染 有40;3B01的植物的煙堿含量(圖4)。MeJa誘導(dǎo)的煙堿水平在MPO被沉默，感染有建構(gòu)物 403B01的植物中與TRV-GFP對照相比降低了 77%。MPO被沉默植物N-甲基腐胺水平的測定用Minocha SC et al.，(J. Chromatography 511 :177-183(1990))描述的方法測 量MPO被沉默的植物根部的多胺。簡單地，用液氮冷凍根部組織并將其磨成細(xì)粉末狀。確 定樣品鮮重后，加入200 μ 1鋯微球和300 μ 1含lOOnmol/ml 1,7- 二氨基庚烷(DAH)的冰 冷5%高氯酸，用Beadbeater使樣品均質(zhì)。離心和過濾(0. 45 μ m，Spin-Χ)以澄清提取液。 50 μ 1樣品中加入100 μ 1飽和碳酸鈉，再加入100 μ 1丹磺酰氯(10mg/ml)。渦激振動混 合樣品，在暗處60°C孵育1小時。加入50 μ 1脯氨酸(100mg/ml溶解在5%高氯酸)和剩 余的丹磺酰氯反應(yīng)。用400 μ 1甲苯提取反應(yīng)物，渦激振動，離心分離有機(jī)相。用SpeedVac 烘干200 μ 1甲苯層，殘余物懸浮于Iml乙腈。使用Waters公司的沈95型分離模塊進(jìn)行 離子對-HPLC，該分離模塊在色譜柱溫度40°C條件下裝備有Waters X-Terra RP18 5ym 4.6X150mm預(yù)柱。洗脫劑由乙腈(溶劑Α)和IOmM辛基磺酸(ρΗ 3. 0) (ρΗ由磷酸調(diào)節(jié)) 及10%乙腈(溶劑B)。30% A到100% A梯度30分鐘，而后100% A 3分鐘。注射容積為 10 μ 1，流速為Iml/分鐘。通過Waters 2475熒光檢測器在340nm激發(fā)和在5IOnm發(fā)射檢 測多胺。N-甲基腐胺在感染有TRV-MPO沉默建構(gòu)物214D11的本塞姆氏煙草植物根部聚集 (圖6)。MPO底物在這些植物中的聚集進(jìn)一步支持我們的結(jié)論，即我們用VIGS方法識別出 在煙堿生物合成中發(fā)揮功能的MPO酶的基因。N-甲基腐胺也在TRV-GFP對照植物中低水平 地檢測出。感染MPO-VIGS建構(gòu)物之植物MPO表達(dá)的測定qRT-PCR被用于檢測MPO在感染有TRV-MP0建構(gòu)物214D11或TRV-PMT建構(gòu)物的植 物根部的表達(dá)。根部從緩沖液或TRV-GFP對照植物取樣。RNA分離，cDNA合成和qRT-PCR 條件，包括引物序列，前面已有描述。與緩沖液對照植物相比，MPO和PMT在TRV-GFP植物 中表達(dá)增加，(圖7)而TRV-MPO介導(dǎo)的沉默大大減少了 MPO轉(zhuǎn)錄體的水平。感染MPO-VIGS建構(gòu)物之植物MPO活性的測定從緩沖液對照組植物根部及TRV-GFP和TRV-MPO(214D11)感染植物根部制備蛋白質(zhì)提取液。按 Hashimoto Τ. et al. (Plant Physiol. 93 :216-221 (1990))描述的方法進(jìn) 行提取。簡單地，Ig根部組織在液氮中磨碎，并懸浮在20ml提取緩沖液中，該緩沖液含有 IOOmM 磷酸鉀，(pH 7. 5)，0. 25M 蔗糖，5mM EDTA，0. 3%抗壞血酸和 10% PVPP0 在 500g 離心 30分鐘，上清液在11，OOOg再次離心30分鐘。用20%和40%硫酸銨兩度沉淀上清液，將沉 淀物懸浮于Iml水中，然后用2升緩沖液過夜透析，緩沖液含有20mM磷酸鉀，(pH 7. 5)，ImM DTT及20%甘油。用DC蛋白試劑盒(BioRad)測定蛋白質(zhì)濃度。用Amplex紅過氧化氫/ 過氧化物酶試劑盒(Molecular Probes)檢測N-甲基腐胺氧化后的MPO生成的H2O2。簡單 地，50 μ 1反應(yīng)中含有8 μ g蛋白粗提物，ImM N-甲基腐胺和20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 5) 與50 μ 1 H2O2檢測劑混合，該檢測劑含有0. ImM Amplex紅和0. 2U/ml過氧化物酶?；旌?物在30°C孵育30分鐘后，用微板螢光光度計(Victor3UV多標(biāo)記光度計，PerkinElmer)在 530-560nm激發(fā)和在590nm發(fā)射的設(shè)定中讀取熒光強(qiáng)度。如圖8所示，感染TRV-MPO的植物根部MPO活性低于緩沖液對照和TRV-GFP植物。例5.重組MPO催化活性分析。為確實證明所克隆的基因編碼MPO酶，我們闡述其生物化學(xué)特性并確定MPO與 N-甲基腐胺孵育后生成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。重組MPO表達(dá)與純化在大腸桿菌表達(dá)本塞姆氏煙草MPO 0RF,純化重組酶蛋白以用于生物化學(xué)分析。設(shè) 計引物 5，-ATGGCCACTACTAAACAGAAAG-3，和 5，-TAGTTTAGCGGCCGCTCAAAGCTTGGCCAGCAAGC T-3，以放大MPO 0RF。利用一鏈cDNA為模版，用Pfu (Stratagene)放大cDNA克隆，PCR條 件為95°C 30秒，580C 30秒72°C 2. 5分鐘，循環(huán)35次。產(chǎn)物與Taq聚合酶在72°C孵育15 分鐘加入附加的“A”堿基。將生成的PCR產(chǎn)物克隆至pCR8/GW/T0P0載體(Invitrogen)以 生成(Gateway入門載體，其與目的載體pHIS8GW通過(Gateway LR克隆酶(Invitrogen)重 組生成表達(dá)克隆 PHIS8GW-MP0。用 pHIS8GW_MP0 載體轉(zhuǎn)染 Rosetta (DE3) pLysS (Novagen)大 腸桿菌菌株，PHIS8GW-MP0載體N-末端含有由8個組氨酸組成的融合標(biāo)簽。將單一菌落接 種于100ml隔夜自我誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Novagen)，其含有50 μ g/ml卡那霉素和34 μ g/ml氯霉 素，在過夜振蕩孵育。使用Talon Superflow金屬親合樹脂(Clontech)純化重組ΜΡ0。 隔夜細(xì)菌培養(yǎng)物離心后，將細(xì)菌懸浮于IOml裂解緩沖液，后者含有50mM磷酸鈉緩沖液(pH 8. 0), 150mM NaCl，0. 1 % Triton-XlOO，5mM 咪唑和混合蛋白酶抑制劑(Novagen)。聲納處 理細(xì)胞懸液2分鐘以裂解細(xì)菌。裂解物在12，OOOrpm離心15分鐘，將上清液加入200 μ 1 Talon樹脂交換柱。交換柱用30ml洗滌液洗滌，洗滌液成份為50mM磷酸鈉(pH 7. 0)，150mM NaCl和IOmM咪唑，然后用IOml洗脫液洗脫，洗脫液成份為50mM磷酸鈉(pH 7. 0)，150mM NaCl和200mM咪唑。聚積含有MPO的部分，用2L儲藏液透析，儲藏液成份為50mM磷酸鉀 (pH 7. 5)和50%甘油。用DC蛋白試劑盒(BioRad)測定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE電泳 (BioRad)分析MPO純度。100ml隔夜細(xì)菌培養(yǎng)物可生成Img可溶性ΜΡ0。重組MPO酶功能測定底物選擇我們使用前述的Amplex紅系統(tǒng)檢測重組ΜΡ0，在此處還使用了 1 μ gTalon純化的 MPO0為測量MPO動力學(xué)參數(shù)，在30°C 30分鐘我們對N-甲基腐胺從IOmM到0. OlmM進(jìn)行了 2倍系列稀釋。用ImM N-甲基腐胺，腐胺，1，3_ 二氨基丙烷，尸胺，精胺及精脒進(jìn)行上述的底物特異性實驗。N-甲基腐胺Km值被確定為100 μ Μ。重組MPO優(yōu)選采用N-甲基腐胺作底物(圖
9)。在ρΗ為6.5，7. 0，7. 5，8. 0，8. 5and 9. 5的范圍內(nèi)，用20mM磷酸鉀緩沖液和0. 5mM N-甲 基腐胺確定MPO的最佳ρΗ為7. 5。陽離子電噴霧離子阱質(zhì)譜法(ESI-MS)分析MPO反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)譜(MQ和氣相色譜法-質(zhì)譜(GC-MQ方法確定重組MPO氧化N-甲基腐胺形 成的催化產(chǎn)物。在容積為50 μ 1的反應(yīng)中，1 μ g純化MPO，2mM N-甲基腐胺和20mM磷酸鉀緩沖液 (ρΗ 7. 5)在30°C孵育1小時，而后進(jìn)行質(zhì)譜分析以確定產(chǎn)物成份。亦使用蛋百儲藏液代替 MPO溶液作為對照反應(yīng)。利用配有充氣式電噴霧離子源(Z-sprayJicromass)的串聯(lián)四極 體質(zhì)譜儀(Quattro LC，Micromass，UK)通過電噴霧離子阱質(zhì)譜法(ESI-MQ進(jìn)行MS分析。 利用流速為20 μ L/分鐘的二元溶劑泵和自動進(jìn)樣器(1100系列，Hewlettfackard)通過流 動注射加入樣本。載體溶劑由50 50v/v甲醇/水組成，含有0. 蟻酸。反應(yīng)產(chǎn)物在m/z 84Da產(chǎn)生峰形，相應(yīng)于預(yù)期的N-甲基吡咯啉離子的大小(圖
10)。GC-MS (ESI-MS)分析 MPO 反應(yīng)產(chǎn)物按Hashimotoet al.，(Plant Physiol. 93 :216-221(1990))描述的進(jìn)行氰化物捕 集N-甲基吡咯啉陽離子和GC-MS分析。N-甲基吡咯啉離子與KCN反應(yīng)產(chǎn)生1_甲基_2_氰 吡咯烷，GC-MS可以分離和分析后者。簡單地，MPO反應(yīng)混合物與10 μ 1 10% KCN溶劑混 合，在室溫孵育30分鐘，加入ΙΟΟμΙ氯仿。渦激振動后，GC-MS分析氯仿液相。用KCN處 理真正的N-甲基吡咯啉陽離子，產(chǎn)生1-甲基-2-氰吡咯烷作為參照化合物。用Agilent 5973質(zhì)譜選擇性檢測儀進(jìn)行GC-MS分析，該檢測儀與配備有30_m X 0. 25_mmDB5MS色譜柱 且膜厚度為0. 25ym(J&W Scientific)的Agilent 6890N氣相色譜儀偶聯(lián)。由G1701DA MSD ChemMati0n軟件控制該系統(tǒng)。色譜分析條件包括色譜柱分流進(jìn)樣QO 1)，氦流速 為0.細(xì)1/分鐘，初始溫度為70°C 1分鐘，隨后溫度以10°C/分鐘速度升高至300°C。質(zhì)譜 選擇性檢測儀在標(biāo)準(zhǔn)電子轟擊條件(70eV)下運行，有效掃描范圍為40至700m/z，速度為 2. 26掃描/秒。GC-MS分析顯示氰化物捕集N-甲基吡咯啉離子產(chǎn)生的1_甲基_2_氰吡咯烷參 照物在6. 1分鐘及m/z 109產(chǎn)生峰形。MPO反應(yīng)混合物亦產(chǎn)生具有相同保留時間(6. 1 分鐘)和質(zhì)譜的峰形。每一峰形的質(zhì)譜亦有與Hashimoto et al.，Plant Physiol. 93 216-221(1990)報道的N-甲基吡咯啉離子的質(zhì)譜相對映的具有相同診斷性意義的離子。該 產(chǎn)物的檢測核實重組MPO催化N-甲基腐胺氧化形成N-甲基吡咯啉離子。例6. MPO超表達(dá)建構(gòu)物對植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染用MPO超表達(dá)建構(gòu)物對本塞姆氏煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)計引物 5， -ATGGCCACTACTAAACAGAAAG-3，和 5’ -TAGTTTAGCGGCCGCTCAAAGCTTGGCCAGCAAGCT-3’ 以 放大MP00RF。利用一鏈cDNA為模版，用Pfu (Stratagene)放大cDNA克隆，PCR條件為 950C 30秒，58°C 30秒72°C 2. 5分鐘，循環(huán)35次。產(chǎn)物與Taq聚合酶在72°C孵育15分鐘 加入附加的“A”堿基。將生成的PCR產(chǎn)物克隆至pCR8/GW/T0P0載體(Invitrogen)以生 成(Gateway入門克隆，其與目的載體pK7GWG2通過(Gateway LR克隆酶(Invitrogen)重組生成表達(dá)克隆PK7GWG2-MP0。將該克隆經(jīng)電穿孔導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(C58)，并用葉碟法轉(zhuǎn) 染植物(Draper et al，1988)。轉(zhuǎn)基因植物在含卡那霉素的選擇性瓊脂培養(yǎng)基再生，并用 PCR分析核實轉(zhuǎn)基因狀態(tài)，PCR分析所用引物被涉及用來放大MPO轉(zhuǎn)基因和啟動子融合區(qū)域 (5，-ACTCCTCCCGTAAAATTTGTGA-3，及 5，-GCGGCCGCACTAGTGATATC-3，)(圖 1 。在土壤生 長Tl種子，用前述的離子對-HPLC法檢測葉子中煙堿水平。在含有3個葉碟( 50mg Fff) 的樣品而不是基于鮮重檢測煙堿。 篩選含MPO超表達(dá)建構(gòu)物的轉(zhuǎn)基因植物以識別MPO轉(zhuǎn)錄體和酶含量高的植物，以 識別MPO的活性。使用Northern雜交，RT-PCR或?qū)崟rqRT-PCR等方法確定轉(zhuǎn)染植物MPO轉(zhuǎn) 錄體的含量。利用MPO蛋白特異性抗體通過Western印跡法檢測MPO酶含量，或使用其它 定量蛋白質(zhì)的方法，包括蛋白質(zhì)組學(xué)分析，檢測MPO酶含量。以N-甲基腐胺為底物測定MPO 超表達(dá)植物中MPO酶活性含量的生物化學(xué)方法亦可用來確定含MPO轉(zhuǎn)基因的植物是否生產(chǎn) 更高含量的MPO蛋白質(zhì)。與野生植物或只轉(zhuǎn)染載體建構(gòu)物的對照植物相比，MPO轉(zhuǎn)錄體，蛋 白和酶活性較高的植物有助于增加生物堿的種類。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其包括選自以下的核苷酸序列a)SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列；b)SEQID NO 2表示的核苷酸序列；c)編碼具有SEQID NO :3表示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；d)與(a)，(b)或(c)的核苷酸序列至少85%相同，并編碼MPO酶的核苷酸序列；e)與(a)，(b)，(c)或(d)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交，并編碼MPO酶的核苷酸序 列；和f)因遺傳密碼的簡并性而與(a)或(b)的核苷酸序列不同并編碼MPO酶的核苷酸序列。
2.一種生產(chǎn)MPO酶的方法，其包括a)使用包含權(quán)利要求1所述分離的核酸分子的核酸構(gòu)建體遺傳改造細(xì)胞和；b)在可以產(chǎn)生MPO酶的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
3.一種重組MPO酶，其具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列或SEQ IDNO 3的變體。
4.一種遺傳工程宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1所述的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、藻類、綠 色植物和哺乳動物細(xì)胞。
6.一種植物，其包含權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞。
7.一種減少植物中生物堿的方法，其包括相對于對照植物，下調(diào)N-甲基腐胺氧化酶的 表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物堿是吡咯烷類生物堿。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中通過a)在所述植物中引入核酸序列，所述核酸序列包含i)SEQID NO 1的至少21個連續(xù) 核苷酸，其中所述連續(xù)核苷酸位于正義或反義方向上；和b)在與相似條件下培養(yǎng)的對照植物相比，所述核苷酸序列減少所述植物中N-甲基腐 胺氧化酶的水平的條件下培養(yǎng)所述植物，來下調(diào)N-甲基腐胺氧化酶表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其中所述吡咯烷類生物堿是煙堿。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物屬于菸草屬。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物是菸草。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述條件誘導(dǎo)內(nèi)源性MPO基因的共抑制。
14.一種減少植物中吡咯烷類生物堿的方法，其包括下調(diào)MPO及下調(diào)NBB1、A622、QPT 和PMT中的至少一種。
15.一種減少植物種群中吡咯烷類生物堿的方法，其包括a)提供突變的植物種群；b)檢測所述植物種群內(nèi)的靶向突變植物，其中與相似條件下提供的對照植物相比，所 述靶向突變植物的N-甲基腐胺氧化酶基因表達(dá)降低，或N-甲基腐胺氧化酶的活性降低，所 述檢測包括(i)利用根據(jù)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2設(shè)計的引物來PCR擴(kuò)增來自突變植 物種群中突變植物中的N-甲基腐胺氧化酶基因區(qū)域，(ii)確定在被擴(kuò)增區(qū)域和野生型基 因相應(yīng)區(qū)域之間導(dǎo)致N-甲基腐胺氧化酶基因的表達(dá)降低或N-甲基腐胺氧化酶的活性降低 的錯配，和(iii)確定含有所述錯配的突變植物；和C)選擇性培育所述靶向突變的植物，以產(chǎn)生下述植物種群，即其與相似條件下產(chǎn)生的 對照植物種群相比，N-甲基腐胺氧化酶基因的表達(dá)降低或N-甲基腐胺氧化酶的活性降低。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述吡咯烷類生物堿是煙堿。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述植物是菸草。
18.一種使用包含SEQ ID NO :1的至少21個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列遺傳工程化的 宿主細(xì)胞，其中所述連續(xù)核苷酸位于正義或反義方向上。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是茄科或古柯科植物細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是煙草屬，曼陀羅屬，顛茄屬，澳茄屬， 天仙子屬，茄參屬，木曼陀羅屬，賽莨菪屬或紅木屬植物細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是菸草屬植物細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是菸草植物細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO :1或SEQ ID NO 。
24.一種由權(quán)利要求7-17所述的任一方法產(chǎn)生的生物堿減少的植物。
25.一種由權(quán)利要求24所述的植物產(chǎn)生的生物堿減少的產(chǎn)品。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物堿減少的植物，其中減少的生物堿是煙堿。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的生物堿減少的產(chǎn)品，其中減少的生物堿是煙堿。
28.一種增加植物中MPO酶的方法，其包括a)在所述植物中引入含有編碼MPO酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體；b)在所述核苷酸被表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物，從而與相似條件下培養(yǎng)出的對照植物 相比，增加所述植物中MPO酶的水平。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述植物是茄科或古柯科植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述植物是煙草屬，曼陀羅屬，顛茄屬，澳茄屬， 天仙子屬，茄參屬，木曼陀羅屬，賽莨菪屬或紅木屬植物。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中托烷類生物堿水平被增加，且所述托烷類生物 堿包括東莨菪堿或古柯堿。
32.—種增加植物中吡咯烷類生物堿水平的方法，其包括a)在所述植物中引入編碼MPO酶的核苷酸序列和編碼至少一種選自 NBB1、A622、QPT和PMT的酶的核苷酸序列；和b)在與相似條件下培養(yǎng)出的對照植物相比，所述植物產(chǎn)生增加的水平的N-甲基腐胺 氧化酶和至少一種選自NBB1，A622，QPT和PMT的酶的條件下培養(yǎng)所述植物。
33.一種由權(quán)利要求28-32所述的任一方法產(chǎn)生的生物堿增加的植物。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼N-甲基腐胺氧化酶(MPO)的基因及其核酸建構(gòu)物，包括獨自調(diào)控MPO表達(dá)的方法，或與調(diào)控其它生物堿合成基因相結(jié)合調(diào)控MPO表達(dá)以調(diào)節(jié)植物和宿主細(xì)胞中生物堿的生成。MPO基因或其片段因而有助于減少或增加植物吡咯烷類生物堿或托烷類生物堿的生成和在宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)MPO酶。
文檔編號C12N9/02GK102083987SQ200780030894
公開日2011年6月1日 申請日期2007年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月19日
發(fā)明者喬納森·E·佩奇, 劉恩武 申請人:加拿大國家研究委員會