專利名稱：專一性寡核苷酸和其在核酸擴(kuò)增與檢測中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請案涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，具體來說其包括采用聚合酶鏈反應(yīng)(一般稱為PCR)的擴(kuò)增。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增技術(shù)和分析為人所熟知。某些擴(kuò)增DNA的反應(yīng)是等溫的，例如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。其它技術(shù)采用熱循環(huán)，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。采用使用PCR的擴(kuò)增的擴(kuò)增和分析闡述于(例如)美國專利第4,683,202號、第4,683,195號和第4,965,188號中，并且概述于PCR方案，方法和應(yīng)用的引導(dǎo)(PCR PROTOCOLS, aguide to Methods and Applications),英尼斯(INNIS)等人編輯，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)(圣地亞哥，CA(USA) 1990)中，所述各文獻(xiàn)都是全文以引用方式并入本文中。PCR擴(kuò)增一般設(shè)計為對稱性，也就是說通過使用等摩爾或大致等摩爾濃度的匹配引物對(也就是說具有相等熔融溫度(Tm's)的正向引物和反向引物)來制備雙鏈產(chǎn)物(或
"擴(kuò)增子")。已發(fā)現(xiàn)在用PCR擴(kuò)增反應(yīng)直接大量制備單鏈擴(kuò)增子中具有有限應(yīng)用的技術(shù)是闡述于以下文獻(xiàn)中的"不對稱PCR":吉倫斯頓(Gyllensten)和厄里克(Erlich)，
"通過聚合酶鏈反應(yīng)生成單鏈DNA和其在HLA- DQA基因座直接測序中的應(yīng)用(Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and ItsApplication to Direct S叫uencing of the HLA- DQA Locus)"，國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl.Acad. Sci.) (USA) 85: 7652-7656 (1988);和美國專利第5線584號。不對稱PCR是不對稱PCR擴(kuò)增方法，其與對稱PCR的不同之處在于將引物中的一種稀釋至五分之一至百分之一濃度，以使其以其它三種引物濃度1-20%的有限量存在。因此，擴(kuò)增由指數(shù)期和隨后的線性擴(kuò)增組成，在指數(shù)期中兩種引物延伸生成雙鏈擴(kuò)增子，并且在線性擴(kuò)增中僅保留一種引物，其生成單鏈擴(kuò)增子。
較新的不對稱PCR擴(kuò)增方法是"指數(shù)后線性擴(kuò)增PCR" (LATE-PCR)，其以不同濃度使用各引物但其中所述引物并不像對稱PCR和不對稱PCR中那樣是"匹配的"。桑切斯(Sanchez)等人(2004)，國家科學(xué)院學(xué)報(USA) 101 :1933-1938，公開的國際專利申請案WO 03/054233 (2003年7月3日)，和皮爾斯(Pierce)等人(2005)，國家科學(xué)院學(xué)報(USA) 102， 8609-8614，上述所有文獻(xiàn)都是全文以引用方式并入本文中。DNA擴(kuò)增方法可通過以下方式用于RNA耙首先實施逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，然后通過(例如)上述PCR方法中的一種對其實施擴(kuò)增。
可以各種方式實施核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析?？墒褂迷谇度腚p鏈DNA后或在與雙鏈DNA交互作用后發(fā)熒光的染料來監(jiān)測雙鏈擴(kuò)增子，例如SYBR綠或SYBR金。例如，可參見美國專利第5,994,056號?？蓪U(kuò)增子實施測序反應(yīng)，例如習(xí)用雙脫氧測序或焦磷酸測序、實時測序-合成方法。雜交探針通常用于檢測中。探針可經(jīng)標(biāo)記或未經(jīng)標(biāo)記。雜交探針的檢測可通過以下方式來進(jìn)行物理特征，例如尺寸；在諸如成色反應(yīng)等后續(xù)事件中的參與；或檢測施用至探針的標(biāo)記，例如放射活性或熒光標(biāo)記。經(jīng)標(biāo)記探針的實例是在引物延伸期間解離的5'核酸酶探針(美國專利第5，210，015號、第5,487,972號和第5,538,848號)、分子信標(biāo)探針(美國專利第5,925,517號、第6,103，476號和第6，365，729號)、尹-楊(Yin-Yang)雙鏈探針(李(Li)，Q.等人(2002)，核酸研究(Nucl. Acid Res.)， 30:e5)禾HFRET探針對。
所有上述基于PCR的擴(kuò)增方法都依賴自細(xì)菌來源回收的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用。在其天然形式中，這些酶是具有若干個結(jié)構(gòu)域和若干種活性的單一多肽包括3'-5'聚合酶、5'-3'外切核酸酶、和3'-5'編輯功能(商用酶中缺失此功能)。包括熱啟動形式在內(nèi)的T叫DNA聚合酶(來自水生棲熱菌(7^"m^a^a"o^))使用最為廣泛，但TfiDNA聚合酶(英杰(Invitrogen)公司，產(chǎn)品編號30342-011)是另一種所述酶。除了這些熱穩(wěn)定DNA聚合酶外，存在若干種熱穩(wěn)定DNA聚合酶，其也可實施使RNA變?yōu)镈NA的逆轉(zhuǎn)錄，以及DNA鏈的聚合和某些5'末端的外切核酸酶解離。這些酶包括Z05聚合酶和嗜熱棲熱菌(77^rmM (TTH)聚合酶。
已使用Taq聚合酶對在熱穩(wěn)定DNA聚合酶中所發(fā)現(xiàn)的5'-3'外切核酸酶活性實施充分研究。例如，此外切核酸酶活性是結(jié)合對稱PCR使用的所謂5'核酸酶分析的基礎(chǔ)。5'核酸酶分析使用兩種引物和一種探針。探針是線性或不規(guī)則螺旋DNA寡核苷酸，其具有與一個末端核苷酸共價連接的熒光團(tuán)和與另一個末端核苷酸共價連接的非熒光性猝滅劑。其與兩個靶鏈中結(jié)合兩個引物之一的一條鏈雜交。5'核酸酶探針的熔融溫度高于其上游引物，因此探針位于延伸引物的下游。具有5'-3'外切核酸酶活性的Taq聚合酶遇到并解離探針的5'末端，同時所述酶的3'-5'聚合酶結(jié)構(gòu)域延伸引物的3'末端。如果探針在其5'末端具有熒光性部分，那么所述部分和其共價連接的核苷酸通過解離與寡核苷酸的其余部分分離。如果寡核苷酸的剩余部分仍與靶序列結(jié)合，;那么通過上述聚合酶的5'外切核酸酶再次對其實施解離。此為探針的引物依賴性解離。
探針的引物依賴性解離具有以下特征1)引物的3'末端必須具有未封閉(或未加帽)3'-OH基團(tuán)。因此，向所述3'-OH加成-P04或其它化學(xué)部分或移除所述3'-OH可阻止解離。2)引物必須前進(jìn)至和/或"侵入"探針的5'末端。因此，除下文所述情況外，如果引物未前進(jìn)至探針的5'末端，那么一或多個來自引物依賴性反應(yīng)的核苷三磷酸的缺失可阻止解離。此規(guī)則的例外情況是可設(shè)計具有3'-OH的引物，其不發(fā)生額
外延伸即可侵入探針的5'末端。3)如果引物的3'末端己侵入探針的5'末端，那么所述3'末端必須與靶序列互補。因此，即使3'-OH未經(jīng)加帽，在引物3'末端的2個或更多個核苷酸的非互補3'延伸(臂)也可阻止探針的引物依賴性解離。移除T叫聚合酶的5'-3'結(jié)構(gòu)域可生成稱為斯托費爾(Stoffd)片段的酶。采用斯托費爾片段的PCR擴(kuò)增不能使用5，核酸酶(TAQMAN,羅氏分子系統(tǒng)(Roche Molecular Systems)的商標(biāo))探針。在諸如分子信標(biāo)等探針的整個長度上使用某些經(jīng)修飾核苷酸(例如2'鄰甲基核苷酸)來構(gòu)造探針可阻止探針的引物依賴性解離。
萊明查(Lyamichev)等人(生物化學(xué)(Biochemistry) (2000) 39: 9523-9532)基于這三個寡核苷酸結(jié)構(gòu)特征闡述了特征為探針的引物依賴性解離的侵入性信號擴(kuò)增反應(yīng)。其報導(dǎo)"通過在高溫下進(jìn)行反應(yīng)，下游寡核苷酸循環(huán)發(fā)生與靶的結(jié)合和分離，從而使每個耙分子在沒有溫度循環(huán)的情況下發(fā)生多次解離事件"。
同樣已知熱穩(wěn)定DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性可對探針-靶雜合體實施非引物依賴性解離。已使用發(fā)夾形靶分子對此反應(yīng)進(jìn)行研究，所述分子具有16個堿基對的莖部、4個核苷酸的環(huán)、和經(jīng)P"-P04標(biāo)記的5'末端。發(fā)夾的兩個臂等長(即其具有平頭末端)，或3'臂延伸超過5'末端，或5'末端延伸超過3'末端。使用具有此設(shè)計的分子可顯示Taq聚合酶的非引物依賴性5'-3'外切核酸酶活性具有以下特征1)萊明查，V.等人(科學(xué)(Science)260， 778-783 (1993))報導(dǎo)，在無引物情況下，Taq聚合酶的5'-3'核酸酶在底物鏈與靶鏈的最后兩個堿基對之間解離發(fā)夾底物的凹陷5'末端。2)萊明査等人((國家科學(xué)院學(xué)報)96: 6143-6148 (1999))證實，完整Taq聚合酶(TaqNP)的5'-3'外切核酸酶活性不能有效解離3'末端凹陷6個核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的5'末端。這些作者得出結(jié)論"解離的低效可能是由于此酶的聚合酶結(jié)構(gòu)域與雙螺旋的末端結(jié)合，其類似于模板-引物復(fù)合體"。其未測試與靶雜交探針而非靶雜交引物類似的底物。
對于某些擴(kuò)增目的和某些檢測目的來說，業(yè)內(nèi)已知的擴(kuò)增方法和檢測方法不合適或具有局限性。例如，多重PCR分析只能通過發(fā)不同顏色熒光的探針來區(qū)分5或6
個耙。同樣，在含有高豐度等位基因的樣品中極難檢測到稀有等位基因。

發(fā)明內(nèi)容
在一實施例中，本發(fā)明提供包括使用低溫線性DNA雜交探針來實施信號擴(kuò)增的不對稱PCR方法，對所述探針進(jìn)行修飾以使其相對于其相應(yīng)的未經(jīng)修飾對應(yīng)物對熱穩(wěn)定DNA聚合酶的非引物依賴性5'外切核酸酶活性敏感。
在另一實施例中，本發(fā)明提供包括檢測低溫線性DNA雜交探針的雜交的不對稱PCR方法，對所述探針實施修飾以使其可抵抗熱穩(wěn)定DNA聚合酶的非引物依賴性5'外切核酸酶活性。
在另一實施例中，本發(fā)明提供選擇性阻斷一種靶或等位基因的擴(kuò)增的PCR方法。


圖l展示不同類型探針的示意圖。
圖2展示圖1中所示探針的各種解離機(jī)制的示意圖。
圖3展示低溫探針相對于引物和耙的最佳Tm關(guān)系的示意圖。
圖4Z05解離各種探針結(jié)構(gòu)的能力。
圖5A: Z05聚合酶，將用TET EXO-R探針檢測的H5和用FAM EXO-R探針檢測的H3擴(kuò)增10,000份拷貝。圖5B:圖5A的熔融曲線。
圖5C:鉑Taq聚合酶，將用TET EXO-R探針檢測的H5和用FAM EXO-R探針檢測的H3擴(kuò)增10,000份拷貝。圖5D:圖5B的熔融曲線。
圖6展示EXO-R探針與實例3和圖7中所用各引物對的關(guān)系的示意圖。
圖7A:在用高Tm引物對實施的實時LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的95'C分析。
圖7B:在用高Tm引物對實施的實時LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的45i:分析。
圖7C:在使用高Tm引物對實施的LATE-PCR中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的終點熔融曲線分析。
圖7D:在用中Tm引物對實施的實時LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的95'C分析。
圖7E:在用中Tm引物對實施的實時LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的45'C分析。
圖7F:在用中Tm引物對實施的LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的終點熔融曲線分析。
圖7G:在用低Tm引物對實施的實時LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的95'C分析。
圖7H:在用低Tm引物對實施的實時LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的45'C分析。
圖71:在用低Tm引物對實施的LATE-PCR分析中EXO-R寡核苷酸下游BG探針的終點熔融曲線分析。
圖8:在5'末端使用FAM的EXO-S探針。
圖9:在5'末端使用BHQ1的EXO-R探針。圖10:使用EXO-R ROX探針來檢測7500份拷貝的新城(Newcastle) DNA擴(kuò)增子。
圖ll:在等溫條件對振蕩條件下EXO-S探針的解離速率。
圖12: EXO-S探針與其互補靶3'末端的距離影響解離速率。
圖13:在45"C至7(TC振蕩期間探針5'末端與靶發(fā)生單堿基配對錯配時的不同信
號生成速率(情況l)。
圖14:在45。C至7(TC振蕩期間探針5'末端與耙發(fā)生單堿基配對錯配時的不同信
號擴(kuò)增速率(情況2)。
圖15:在30分鐘內(nèi)于等溫條件(5(TC)下的信號擴(kuò)增速率。
圖16:在振蕩條件下(45'C至7(TC)的信號擴(kuò)增速率。
圖17:增加探針5'臂的長度可影響到其是EXO-S探針還是EXO-R探針。
具體實施方式
A.定義
本文所用"樣品"可為任一待測試材料，例如生物或環(huán)境樣品。生物樣品可自任一有機(jī)體獲得。在一實施例中，可自諸如人類等哺乳動物、伴侶動物、或家畜來獲得樣品。也可自其它動物獲得樣品，例如鳥類。在一實施例中，來自動物的樣品包含鼻咽抽出液、血液、唾液、糞便、尿、或任何其它體液。在另一實施例中，可自任何環(huán)境獲得環(huán)境樣品，例如土壤、水、人造結(jié)構(gòu)的環(huán)境和表面。
本文所用"擴(kuò)增靶序列"、"靶序列"與"核酸靶序列"可互換，其意指為通過擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR擴(kuò)增技術(shù))復(fù)制提供模板的DNA序列。擴(kuò)增靶序列可為單鏈或雙鏈。如果起始材料是RNA (例如信使RNA)，那么通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生互補DNA (cDNA)來產(chǎn)生DNA擴(kuò)增靶序列，并且擴(kuò)增靶序列是cDNA分子。因此，在RNA的PCR分析中，雜交探針與cDNA擴(kuò)增靶序列雜交并由此表現(xiàn)cDNA擴(kuò)增靶序列的復(fù)制，間接表明存在通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含擴(kuò)增靶序列的cDNA分子的RNA。整個長度的擴(kuò)增耙序列的兩端通常是一對用于其擴(kuò)增的引物。不論是雙鏈或是單鏈，延伸產(chǎn)物或"擴(kuò)增子"都由引物對界定。擴(kuò)增靶序列可為單一核酸序列。然而，在某些情況下，其可含有等位基因變異或突變且因此不是單一序列。
本文所用"Tm"是指在一半標(biāo)的核酸物質(zhì)以雙鏈形式存在并且剩余部分為單鏈時的溫度。在歷史上，引物、探針或擴(kuò)增子的Tm是在引物和鹽濃度的標(biāo)準(zhǔn)條件下使用"％GC"法(懷特瑪(Wetmar)， J.G. (1991)， "DNA探針核酸雜交原理的應(yīng)用(DNAProbes: Applications of the Principles of Nucleic Acid Hybridization)"，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究評論(Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.) 26:227-259)或"2(A+T)力n 4(G+Q"法計算得到的數(shù)值，這兩種方法都為人所熟知。然而，通過使用"最近鄰"方法(桑塔露琪亞(SantaLucia), J. (1998) PNAS (USA) 95:1460-1465) ， LATE-PCR在確定Tm時考慮實際引物和探針起始濃度(桑切斯(Sanche)等人(2004)， PNAS (USA) 101:1933-1938，和皮爾斯(Pierce)等人(2005)， PNAS (USA) 102: 8609-8614)，其使用 下式來計算Tm: Tm=AH/(AS+R & (C/2))+12.5 log[M]-273.15 (里諾沃(Le Novere),N. (2001)，"熔融，計算核酸雙螺旋的熔融溫度(MELTING, Computing the Melting Temperature of Nucleic Acid Duplex)"，生物信息學(xué)(Bioinformatics) 17: 1226-7) 。 AH 是焓并且AS是熵(AH與AS計算是基于阿拉維(Allawi)，H.T.和桑塔露琪亞，生物化 學(xué)期刊(J. Biochem.) (1997) 36:10581-10594) ， C是寡核苷酸的濃度，R是普適氣體 常數(shù)，并且[M]是單價陽離子的摩爾濃度(在實例中為0.07)。根據(jù)此公式，寡核苷 酸的核苷酸堿基組成(含于術(shù)語AH和AS中)、單價鹽濃度、和寡核苷酸的濃度(含 于術(shù)語C中)可影響Tm。然而，盡管PCR緩沖液中所用鎂或其它二價陽離子的濃度 未包括于此式中，但已知二價陽離子可提高Tm。通常使用3 mM鎂可將探針Tm提 高約5。C。因此，如果期望Tm是5(TC，并且使用3mM鎂，那么上述不使用鎂的Tm 最近鄰公式應(yīng)得出45'C的Tm，然后根據(jù)經(jīng)驗對其進(jìn)行檢驗，并且根據(jù)需要對探針長 度和組成進(jìn)行最小調(diào)整。已發(fā)現(xiàn)來自DNA Software (安阿伯，MI)的授權(quán)軟件Visual OMP (6丄9版)軟件包括對最近鄰公式的此一調(diào)整，并且所產(chǎn)生結(jié)果接近根據(jù)經(jīng)驗 確定的結(jié)果。除非另外說明，否則本文中在提及引物或探針的Tm時意指考慮到鎂濃 度的數(shù)值。
本文所用"等位基因識別"和"序列特異性"二者都是指探針(或者在某些情況 下指引物)與完全互補的靶序列選擇性雜交并且強烈排斥具有一個或幾個錯配堿基的 緊密相關(guān)序列的能力。本文所用"錯配耐受性"是指探針(或者在某些情況下指引物) 與完全互補序列和具有一或多個錯配堿基的部分互補序列雜交的能力。
本文所用"單管"是指包含至少兩個操作(例如樣品制備、擴(kuò)增或測序)的系列 的方法，在實施時可不將樣品自一個容器(試管、反應(yīng)孔、微流體器件中的室、玻璃 載玻片、或能容納反應(yīng)混合物的任何其它裝置)轉(zhuǎn)移至另一個容器中。
本文所用"外切核酸酶活性"是指PCR擴(kuò)增中所用包括TaqDNA聚合酶在內(nèi)的 熱穩(wěn)定聚合酶的酶特性之一。外切核酸酶活性是指不同于3'-5'消化的5'-3'消化，其 可視為酶的校對閱讀功能。外切核酸酶活性并不意欲表示精確解離DNA糖-磷酸酯骨 架的模式或定位，具體來說解離發(fā)生在與5'末端連接的部分與末端5'核苷酸之間，或 發(fā)生在末端與倒數(shù)第二位5'核苷酸之間，或發(fā)生在3'末端下游的一或多個核苷酸之 間。除非另外說明，否則用途闡述于本文中的所有聚合酶都應(yīng)理解為單獨包括外切核 酸酶結(jié)構(gòu)域，或同時包括將堿基對加成至上游引物3'末端的聚合酶結(jié)構(gòu)域。
本文所用"引物依賴性"解離是指雜交寡核苷酸在其引物的延伸期間遇到聚合酶 后解離。已知引物依賴性解離需要延伸鏈上存在3'末端-OH。甚至在不存在dNTP的 情況下，本文所用"引物依賴性"解離也包括在上游寡核苷酸的3'-OH替代下游寡核 苷酸(例如雜交探針)的5'末端時引發(fā)的解離。例如磷酸根基團(tuán)的化學(xué)加成(加帽) 和末端2'3'雙脫氧核苷酸的存在是阻止引物依賴性解離的已知途徑，如同下游寡核苷酸中某些非天然核苷酸和非天然核苷酸間連接一般。
本文所用"非引物依賴性"解離是指雜交寡核苷酸通過聚合酶的5'-3'外切核酸 酶活性發(fā)生的5'-3'解離，其與引物依賴性解離不同。在此情況下，聚合酶直接結(jié)合 寡核苷酸/靶雜合體并解離所結(jié)合寡核苷酸的5'末端。不涉及引物或引物延伸。
本文所用"LATE-PCR"意指采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法的不對稱DNA擴(kuò)增，其 利用相對于一種引物("限制引物")至少過量5倍的另一種寡核苷酸引物("過量引 物")，限制引物本身以至多200 nM的低濃度使用，以便在大致足夠的PCR循環(huán)中 耗盡以產(chǎn)生熒光可檢測雙鏈擴(kuò)增子，其中在擴(kuò)增開始時限制引物的濃度調(diào)節(jié)熔融溫度 Tm[(^比擴(kuò)增開始時過量引物的濃度調(diào)節(jié)熔融溫度T^o,低不超過5°C ，優(yōu)選地至少一 樣高并且更優(yōu)選地高3-l(TC;并且其中在限制引物耗盡后繼續(xù)實施多個循環(huán)的熱循環(huán) 以產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物，即過量引物的延伸產(chǎn)物，有時稱作"過量引物鏈"。
本文所用術(shù)語"低Tm探針"意指在與靶雜交后發(fā)出信號的經(jīng)標(biāo)記雜交探針，其 在LATE-PCR中是通過延伸過量引物生成的過量引物鏈，并且其Tm[()]p比與過量引物 鏈雜交并沿過量引物鏈延伸的引物(在LATE-PCR中為限制引物)的T叫o]低至少5 。C并且更優(yōu)選地低至少l(TC。本文所用低Tm探針是線性探針。 B.實施方式
本文闡述修飾后在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中用于特定目的的經(jīng)標(biāo)記探針和未經(jīng)標(biāo)記寡核 苷酸，和其在擴(kuò)增期間或在擴(kuò)增后檢測期間達(dá)成特定效應(yīng)的用途。DNA擴(kuò)增反應(yīng)(例 如PCR擴(kuò)增)包括通過DNA聚合酶進(jìn)行的引物延伸。如本文所述，探針-靶結(jié)構(gòu)包 含在3'方向上比5'方向上的雜交探針長的模板鏈。因此，探針在耙鏈的單鏈3'末端 凹進(jìn)不同數(shù)量的核苷酸，并且探針具有可完全匹配靶鏈的5'末端或具有不同長度的經(jīng) 延伸5'臂。具有這些結(jié)構(gòu)特征的單分子發(fā)夾分子可用于模擬根據(jù)本文所述構(gòu)造的這些分子。
在某些實施例中，DNA聚合酶必須是未顯示非靶依賴性探針解離的熱穩(wěn)定聚合 酶或用于組成可導(dǎo)致表現(xiàn)非靶依賴性探針解離的反應(yīng)混合物中。"表現(xiàn)非靶依賴性探 針解離"意指當(dāng)寡核苷酸含有末端發(fā)夾(具有長3-5個核苷酸的環(huán)和長2-5個核苷酸 的莖部)時，在將其在比酶的最佳延伸溫度低至多2(TC的溫度下培養(yǎng)10min后，在
無耙序列存在時所述酶解離所述寡核苷酸的能力。存于具有^11!++的二甘氨酸緩沖液
中的Z05聚合酶是表現(xiàn)非耙依賴性探針解離的酶的實例。相反，存于含有Mg—并且 經(jīng)Tris鈉緩沖的反應(yīng)混合物中的Taq DNA聚合酶是未顯示非靶依賴性探針解離的酶 的實例。本文所述方法應(yīng)理解為包括未顯示非靶依賴性探針解離的聚合酶的應(yīng)用。可 通過使用探針5'末端具有5'核苷酸延伸的探針來確認(rèn)酶是否表現(xiàn)非靶依賴性探針解 離，其中所述延伸通過在7(TC以上溫度下自退火來形成具有長2-5個核苷酸的莖部的 發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在實時PCR、或終點等溫、或終點振蕩溫度條件下，未顯示非靶依賴性探 針解離的酶不能解離這些發(fā)夾探針。
本文所述探針是結(jié)構(gòu)上經(jīng)修飾且與位于引物中間的耙擴(kuò)增子鏈雜交的線性或不規(guī)則螺旋DNA雜交探針，并且是低溫探針，其Tm[。]比包括所述探針的擴(kuò)增反應(yīng)中的 平均引物退火溫度低至少5°C，優(yōu)選地低至少l(TC。如果擴(kuò)增反應(yīng)是(例如)三溫 PCR反應(yīng)，那么除非在擴(kuò)增結(jié)束時或在某些擴(kuò)增循環(huán)期間(例如在LATE-PCR的線 性擴(kuò)增期間)增加低溫步驟，否則探針不會發(fā)生雜交。未解離探針是具有熒光團(tuán)的雙 重標(biāo)記熒光探針，當(dāng)探針在溶液中游離時所述熒光團(tuán)優(yōu)選地與非熒光猝滅劑發(fā)生猝 滅，例如DABCYL、黑洞(BlackHole)猝滅劑或諸如QSY7或9等另一種猝滅劑。黑 洞猝滅劑是百奧知(Biosearch Technologies)公司，諾瓦托(Novato)， CA (USA)的專賣猝 滅劑。QSY猝滅劑可自英杰公司，卡爾斯巴德(Carlsbad)， CA(USA)購得。經(jīng)解離探 針也可以是雙重標(biāo)記探針，但其并非必須是雙重標(biāo)記探針。對于經(jīng)解離探針來說，只 需要以任何方式來檢測經(jīng)解離探針片段，檢測方式是藉助片段上的標(biāo)記或是藉助片段 的某些特性，例如重量或尺寸或?qū)嵤┛蓹z測功能的能力，所述可檢測功能例如是引起 成色。在上述最后一種情況下，對解離的檢測是間接檢測。
本文所述封閉寡核苷酸是與引物下游(3')雜交并且未經(jīng)標(biāo)記的經(jīng)修飾線性寡核苷酸。
一類經(jīng)修飾雜交探針是結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾而在擴(kuò)增前添加至PCR反應(yīng)混合物中時可增 強等溫非引物依賴性5'-外切核酸酶解離的探針。將此一探針稱作"外切敏感性"探 針或簡稱為EXO-S探針。其為線性或不規(guī)則螺旋DNA探針，其Tm比使用所述探針 的擴(kuò)增反應(yīng)中的平均引物退火溫度低至少5。C，優(yōu)選地低至少1(TC。在經(jīng)受等溫非引 物依賴性解離條件時，其解離速度比對應(yīng)未經(jīng)修飾探針快至少兩倍、優(yōu)選地快至少五 倍、并且更優(yōu)選地快至少十倍。
在一實施例中，可賦予探針外切敏感性的修飾涉及至少一個標(biāo)記部分的共價連 接，例如熒光團(tuán)或非熒光猝滅劑與探針5'末端通過包括至少三個、優(yōu)選地三個以上、 并且最優(yōu)選地六個連續(xù)亞甲基(CH2)的鏈共價連接。在與5'核苷酸連接的末端，所述 亞甲基鏈不能位于羧基、胺、酰胺、或另一龐大化學(xué)基團(tuán)之后，但預(yù)計所述連續(xù)亞甲 基鏈可位于(在與5'核苷酸連接的末端)醚基(-O-)之后。在另一實施例中，在探針5' 末端處的修飾包括與緊鄰雜交探針上游(3')的靶核苷酸不互補的經(jīng)加成核苷酸。此修 飾也可稱作位于探針5'末端的單堿基"臂"。EXO-S探針可不具有5'臂，也就是說 不具有與靶不互補的核苷酸，或至多具有不超過5個核苷酸、優(yōu)選地不多于一個核苷 酸的短臂。EXO-S探針應(yīng)設(shè)計為可在距其靶鏈3'末端超過六個核苷酸處、優(yōu)選地距3' 末端10-30個核苷酸處形成雜合體。距離末端超過40個核苷酸的雜合體并非優(yōu)選雜 合體，因為其可減慢探針的非耙依賴性等溫解離。正如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，相 對于特定EXO-S探針特異性靶的3'末端對其實施定位的最佳位置可取決于采用所述 探針的擴(kuò)增反應(yīng)的確切條件和組成；其中最重要的因素是EXO-S探針上游限制引物 的長度和欲探測靶序列的堿基組成。然而，在所有情況下，在限制引物耗盡前，EXO-S 探針的5'末端都不應(yīng)與靶鏈上限制引物3'末端所雜交的位置重疊。換句話說，靶鏈上 與限制引物3'末端互補的堿基應(yīng)距離探針5'末端上游至少兩個堿基，或距離EXO-S探針5'末端臂的5'末端至少兩個堿基。
本文所述方法包括在外切敏感性探針存在下擴(kuò)增至少一個DNA耙序列，其中擴(kuò)
增過程不包括可使探針發(fā)生雜交的低溫步驟，也就是說在可延伸生成與探針互補的擴(kuò)
增子鏈的引物耗盡之前不包括在比探針Tm低的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)用于PCR擴(kuò)增中時， 在不具有低溫檢測步驟的循環(huán)期間EXO-S探針不與擴(kuò)增子雜交。不對稱PCR方法在 限制引物耗盡后的擴(kuò)增循環(huán)中(也就是說在生成與探針互補的單鏈過量引物擴(kuò)增子鏈 的循環(huán)中)包括低溫檢測步驟，其可導(dǎo)致探針以非引物依賴性方式發(fā)生雜交和解離， 由此擴(kuò)增探針?biāo)傻男盘?。如果僅包括擴(kuò)增后低溫檢測步驟，那么來自含有熒光團(tuán) 和猝滅劑(優(yōu)選地為非熒光猝滅劑)的雙重?zé)晒鈽?biāo)記探針的信號也可在30 min或更 長時間內(nèi)繼續(xù)產(chǎn)生，此表明在所述終點檢測以及在實時檢測期間發(fā)生重復(fù)雜交和解 離。由于此原因，應(yīng)在預(yù)定時間后、優(yōu)選地在至少1 min后、并且更優(yōu)選地在至少2 min 后實施終點閱讀。例如，如果探針經(jīng)熒光團(tuán)和猝滅劑標(biāo)記，那么重復(fù)雜交和解離可使 未猝滅片段和擴(kuò)增熒光信號的產(chǎn)量增加。所述方法包括對探針解離的均相檢測。
本文所述另一類探針是結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾而在擴(kuò)增前添加至PCR反應(yīng)中時可抵抗非引 物依賴性5'-核酸酶解離的探針。將所述探針稱為"外切抗性"探針或簡稱為EXO-R 探針。外切抗性探針是低溫探針。外切抗性探針不必對引物依賴性外切核酸酶解離具 有抗性。然而某些實施例對非引物依賴性5'外切核酸酶解離和引物依賴性5'外切核酸 酶解離二者都具有抗性。外切抗性探針抵抗非引物依賴性解離的程度如下所述如果 所述探針經(jīng)熒光團(tuán)和猝滅劑標(biāo)記、與互補靶鏈雜交、并且經(jīng)受等溫非引物依賴性5' 核酸酶解離條件，那么在25分鐘時間內(nèi)熒光不發(fā)生顯著增加(不超過10%)。如下 所述，某些實施例甚至在經(jīng)受圍繞探針-靶Tm的快速熱振蕩時仍保持抗性，而其它實 施例可通過所述振蕩發(fā)生解離而生成擴(kuò)增信號。外切抗性探針是線性或不規(guī)則螺旋雜 交探針，其未經(jīng)修飾的結(jié)構(gòu)是經(jīng)標(biāo)記或未經(jīng)標(biāo)記DNA寡核苷酸。 一種可賦予探針外
切抗性的修飾是通過除亞甲基鏈以外的方式將標(biāo)記部分(例如熒光團(tuán)或非熒光猝滅 劑)連接至5'末端核苷酸。另一種賦予探針外切抗性的修飾是加成5'末端臂，其包含 二至七個不與探針的耙雜交的核苷酸。另一種賦予探針外切抗性的修飾是向探針5' 末端加成核苷酸延伸，其中所述延伸通過在7(TC以上溫度下自退火形成具有長2-5個 核苷酸的環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些5'發(fā)夾也可抵抗振蕩溫度引發(fā)的解離。
本文所述方法包括在外切抗性探針存在下通過不對稱PCR擴(kuò)增方法(優(yōu)選地 LATE-PCR方法)擴(kuò)增至少一個DNA耙序列，其中在限制引物耗盡之前擴(kuò)增過程不 包括可使探針發(fā)生雜交的低溫步驟。當(dāng)用于PCR擴(kuò)增中時，在不含低溫檢測步驟的 循環(huán)期間EXO-R探針不與擴(kuò)增子雜交。在擴(kuò)增后或(對于不對稱方法來說)在限制 引物耗盡后包括低溫檢測步驟的PCR方法可產(chǎn)生經(jīng)雜交探針。如果檢測是等溫檢測， 也就是說不圍繞探針的Tm進(jìn)行快速溫度振蕩，那么探針可不發(fā)生解離，并且其信號 僅為得自雜交的信號。在所述實施例中，探針在雜交后必須發(fā)射可檢測信號。如果檢 測是終點檢測并且包括圍繞探針Tm的快速熱振蕩(例如自Tm以上5'C至Tm以下5°C，或優(yōu)選地自Tm以上10。C至Tm以下l(rC，其中每次振蕩循環(huán)耗時30秒或更短 時間)，那么某些實施例可以上述非引物依賴性方式解離，但其它實施例可不發(fā)生解 離。通過快速振蕩以非引物依賴性方式解離可提高探針信號生成的速率。在這些實施 例中，如上文對外切敏感性探針?biāo)觯怆x可直接或間接生成信號。在任一給定時間 點的信號強度可取決于反應(yīng)中的解離速率和探針總量。例如，如果探針經(jīng)熒光團(tuán)和猝 滅劑標(biāo)記，那么重復(fù)振蕩可導(dǎo)致含有未猝滅熒光團(tuán)的片段和經(jīng)擴(kuò)增熒光信號的產(chǎn)量增 加直至所有可用探針都發(fā)生解離。所述方法包括對探針雜交或探針解離的均相檢測。
本文同樣闡述結(jié)構(gòu)上經(jīng)修飾的寡核苷酸，其與互補鏈雜交并形成對引物依賴性5' 核酸酶解離和非引物依賴性5'核酸酶解離二者都具有抗性的雜合體。有時將所述寡核 苷酸稱作EXO-N寡核苷酸。EXO-N是線性寡核苷酸，其Tm高至足以在使用所述寡 核苷酸的PCR擴(kuò)增反應(yīng)(對稱PCR擴(kuò)增或不對稱PCR擴(kuò)增)中于引物延伸步驟期間 與一引物下游的靶鏈雜交。由于其在引物延伸期間未被聚合酶解離，因此其抑制與其 雜交的鏈延伸，由此使所述鏈的擴(kuò)增無效。 一種使線性寡核苷酸變?yōu)镋XO-N寡核苷 酸的修飾是向線性寡核苷酸5'末端加成與所述寡核苷酸的靶不互補的寡核苷酸延伸， 并且所述延伸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其具有長為2-5個核苷酸的莖部并且Tm為至少70°C 。
本文所述方法包括在EXO-N寡核苷酸存在下實施對稱或不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)，' 所述EXO-N寡核苷酸對一個原本可通過所用引物對擴(kuò)增的可能靶等位基因具有特異 性，由此促進(jìn)一或多個在引物延伸期間不與EXO-N寡核苷酸雜交的替代等位基因變 體序列擴(kuò)增。本文所述方法同樣包括在期望時間點將EXO-N寡核苷酸插入對稱PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中，也就是說在兩次或更多次熱循環(huán)后插入，以使一個鏈(正鏈或負(fù)鏈)的 擴(kuò)增無效，并由此在后續(xù)循環(huán)中促進(jìn)另一鏈的擴(kuò)增。
本文闡述通過用于DNA擴(kuò)增靶序列(包括cDNA序列)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 方法、尤其諸如不對稱PCR和LATE-PCR等不對稱PCR方法實施的DNA擴(kuò)增，其 中一個引物(過量引物)相對另一個引物(限制引物)以大幅度過量存在，其比率為 至少5:1并且優(yōu)選地為至少10:1。優(yōu)選擴(kuò)增方法為LATE-PCR，但可使用其它方法。
在某些實施例中，所述方法使用經(jīng)修飾低溫DNA雜交探針。DNA雜交探針是 不可延伸DNA寡核苷酸，其與由PCR擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生擴(kuò)增子中的靶互補，在此情況 下所述耙是過量引物(過量引物鏈)延伸產(chǎn)物中的DNA序列。未經(jīng)修飾探針是一段 DNA或含有所述DNA段，即探針的靶互補序列。探針的靶互補序列可與反應(yīng)中可產(chǎn) 生的過量引物鏈完全互補，與反應(yīng)中可產(chǎn)生的至少一個過量引物鏈不完全互補，或兩 種情況都存在。探針與完全互補靶的Tm (在LATE-PCR情況下為Tm[Q])可高于其 與不完全互補耙的Tm例如，如果探針設(shè)計為與完全互補靶的Tm為55°C，那么其 與含有一或多個錯配堿基(核苷酸缺失或核苷酸插入)的靶的Tm有時可低l(TC或更 多。此使得探針可通過所形成雜合體的Tm來區(qū)別各靶。在所有實施例中探針都是低 溫探針。
采用探針的不對稱PCR方法在起始擴(kuò)增反應(yīng)混合物中包括探針，其也包括引物、dNTP、緩沖液、熱穩(wěn)定DNA聚合酶，并且如果核酸起始材料是RNA，那么其也包 括逆轉(zhuǎn)錄酶。任何在擴(kuò)增期間或在擴(kuò)增結(jié)束時不解離的探針都可作為在雜交后發(fā)射可 檢測熒光信號的雙重?zé)晒鈽?biāo)記探針。適宜標(biāo)記方案為業(yè)內(nèi)所熟知。優(yōu)選標(biāo)記是一個末 端與熒光團(tuán)共價連接并且另一個末端與非熒光猝滅劑共價連接，但也可使用其它標(biāo)記 方法。業(yè)內(nèi)已知多種猝滅劑，包括DABCYL、 DABMI、黑洞猝滅劑、QSY猝滅劑、 市售深黑(DeepDark)猝滅齊U、和其它猝滅劑。任何在檢測期間解離的探針可經(jīng)類似方 式標(biāo)記,但其并非必須經(jīng)標(biāo)記。對于此一探針來說，所需要的只是解離應(yīng)可檢測，因 此可用可檢測標(biāo)記對探針進(jìn)行單一標(biāo)記，或其可不經(jīng)標(biāo)記。
所用探針可為線性或不規(guī)則螺旋DNA雜交探針，對其進(jìn)行修飾以在PCR擴(kuò)增 期間與耙雜交時(也就是說在實時檢測中)或在擴(kuò)增后(也就是說在終點檢測中)增 強或基本消除其非引物依賴性等溫5'核酸酶解離。如上所述，將具有增強可解離性的 探針稱作外切敏感性或EXO-S探針，并且將對解離具有抗性的探針稱作外切抗性或 EXO-R探針。在等溫非引物依賴性解離條件下保持25分鐘后，EXO-R探針基本上保 持未解離。某些EXO-R探針可通過圍繞探針-靶雜合體Tm進(jìn)行快速溫度振蕩來解離， 而其它探針甚至可抵抗所述振蕩。在限制引物耗盡后實施檢測，因此所發(fā)生的任何解 離都?xì)w因于非引物依賴性5'核酸酶活性。EXO-S和EXO-R探針是低溫探針。
使不規(guī)則螺旋DNA探針成為EXO-S探針的修飾是加成與探針靶不互補的5'核 苷酸，和通過具有至少三個并且優(yōu)選地六個亞甲基的亞甲基鏈將標(biāo)記部分(優(yōu)選地?zé)?光部分)與探針的5'核苷酸連接。
使不規(guī)則螺旋DNA探針成為EXO-R探針的修飾可根據(jù)其5'末端的結(jié)構(gòu)修飾分 為三類
第(l)類將某些非核酸化學(xué)部分加成至寡核苷酸探針的5'末端，所述探針的5' 末端與完全互補靶序列雜交；
第(2)類將一或多個非互補核苷酸加成至寡核苷酸探針的5'末端，以使所述探針 的5'末端與靶序列不互補并且由此形成延伸一或多個堿基的單鏈"臂"；
第(3)類將多個非互補核苷酸加成至寡核苷酸探針的5'末端，以使位于5'末端的 單鏈"臂"形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有3-5個核苷酸的莖部并且自退火Tm > 70 。C。
圖1展示每一類EXO-R探針的實例以及用于比較的實例性5'核酸酶探針。圖2 展示第(l)-(3)類探針的實例性解離機(jī)制。
例如在Taq系統(tǒng)中，某些第(1)類和第(2)類EXO-R探針可通過引物依賴性解離來 解離，其中探針-靶雜合體的Tm未低至足以避免探針結(jié)合在引物延伸路徑上。相反，,. 如果探針-靶雜合體的Tm未低至足以避免引物延伸路徑上的探針結(jié)合，那么第(3)類探 針不會被延伸引物解離，并且可使引物延伸無效。
為確定經(jīng)特定修飾的不規(guī)則螺旋探針是EXO-S還是EXO-R探針,可在施加PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件之后施加等溫非引物依賴性解離條件，此時將其可解離性與對應(yīng)未經(jīng)修飾探針的可解離性進(jìn)行比較。為確定EXO-R探針是否可通過圍繞其Tm進(jìn)行快速溫 度振蕩來解離，可將其解離繪制為溫度循環(huán)時間或次數(shù)的函數(shù)。
如上所述，EXO-S和EXO-R探針方法是增加了對雜交探針的檢測或?qū)?jīng)解離探 針片段的檢測的不對稱PCR擴(kuò)增。如果探針由于雜交或由于解離發(fā)射可檢測信號(例 如熒光信號)，那么可在擴(kuò)增反應(yīng)期間(實時)或在反應(yīng)完成后(終點)借助于可包
括或不包括振蕩的低溫檢測步驟來實施檢測。用所述探針實施檢測也可包括生成探針 -靶雜合體的熔融曲線。
以下說明闡釋如何將具有相同或不同標(biāo)記的若干個EXO-S探針或若干個EXO-R 探針添加至多重PCR反應(yīng)中以增加所述反應(yīng)生成的信息量?？赏ㄟ^在同一反應(yīng)中組 合EXO-S探針與EXO-R探針來達(dá)成類似結(jié)果。
可構(gòu)建多重不對稱PCR反應(yīng)來使用若干對引物，每一對引物用于不同的靶序列。 可通過以下方式對所得每個單鏈擴(kuò)增子實施檢測在反應(yīng)期間或在反應(yīng)結(jié)束時降低溫 度以使一或多個EXO-S探針與其在所述單鏈靶擴(kuò)增子中的互補序列雜交。如果每個 EXO-S探針都經(jīng)不同顏色熒光團(tuán)或具有獨特分子量或電子特征的不同部分標(biāo)記，那么 每個探針-擴(kuò)增子雜合體都能生成其自身所特有的信號。然而，兩個EXO-S探針也可 經(jīng)相同信號基團(tuán)標(biāo)記，前提是其在不同溫度下形成探針-擴(kuò)增子雜合體。類似地， EXO-S探針可與具有相同顏色但Tm顯著不同的EXO-R探針一起使用，在此情況下 如果EXO-R探針可通過溫度振蕩來解離，那么差異可變大，因為在探針和擴(kuò)增子的 等溫培養(yǎng)期間所述探針中只有一種發(fā)生解離，第二種探針在隨后的或之前的溫度振蕩 期間解離。
可使用EXO-S探針生成不同信號的可能靶集合可通過使用克萊默(Kramer)(美 國專利第6，150，097號)闡述的"顏色三聯(lián)體編碼(Color Triplet Coding)"原理來進(jìn)一 步擴(kuò)大。在此情況下每個擴(kuò)增子(唯一序列或等位基因變體)可用其自身的經(jīng)兩個或 三個不同5'標(biāo)記標(biāo)記的EXO-S探針來靶向。因此，在探針-擴(kuò)增子雜合體形成并解離 時，兩個或三個標(biāo)記通過解離而釋放。根據(jù)克萊默所述，可采用多種方式將多個標(biāo)記 組合為各組具有兩個或三個標(biāo)記的群組。
類似地，可構(gòu)建多重不對稱PCR反應(yīng)，其使用若干對引物來生成多個單鏈擴(kuò)增 子，在反應(yīng)期間或在反應(yīng)結(jié)束時溫度降低，此時可用多個EXO-R探針對所述擴(kuò)增子 進(jìn)行檢測。在此情況下，可用不同顏色熒光團(tuán)對每個EXO-R探針進(jìn)行標(biāo)記。此外， 根據(jù)其長度，每個EXO-R探針都可為序列特異性(即等位基因識別)或錯配耐受性。 在此情況下，區(qū)分探針-擴(kuò)增子雜交的最佳方式是實施熔融曲線分析，其中使反應(yīng)溫 度自預(yù)設(shè)低溫逐漸降低或逐漸升高。在這些情形下，每個EXO-R探針都表現(xiàn)其自身 特有的熔融曲線，并且兩個具有相同顏色的EXO-R探針的組合可產(chǎn)生復(fù)合熔融曲線。 此外，對溫度振蕩具有抗性的EXO-R探針和對溫度振蕩具有敏感性的EXO-R探針可 為多重曲線，因為在所述探針中溫度振蕩只可改變其中一種的信號。
可使用EXO-R探針生成不同信號的可能靶集合可通過使用克萊默(美國專利第6,150,097號)所述的"顏色三聯(lián)體編碼"原理來進(jìn)一步擴(kuò)大。在此情況下每個擴(kuò)增 子(唯一序列或等位基因變體)可用其自身的經(jīng)兩個或三個不同5'標(biāo)記標(biāo)記的EXO-R 探針來靶向。因此，在探針-擴(kuò)增子雜合體形成和熔融時，其以兩種或三種顏色生成 相同熔融曲線。根據(jù)克萊默所述，可采用多種方式將多個標(biāo)記組合為各組具有兩個或 三個標(biāo)記的群組。
使用EXO-S和EXO-R探針的另一種方式涉及將其在單一多重不對稱PCR反應(yīng) 中組合。在此情況下，通過熔融曲線分析或解離分析不同探針可檢測不同單鏈擴(kuò)增子。 例如，在反應(yīng)溫度下降時，錯配耐受性EXO-R探針可經(jīng)生成獨特熔融曲線的彩色熒 光團(tuán)標(biāo)記。 一旦EXO-R探針與其耙在低溫下達(dá)成最大結(jié)合，反應(yīng)溫度可進(jìn)一步下降 以使可具有相同顏色的EXO-S探針與其靶達(dá)成雜交和等溫或振蕩溫度依賴性解離， 且其Tm低于EXO-R探針與其靶的Tm。可在低溫下實施對EXO-S探針解離產(chǎn)物的 檢測，但優(yōu)選地在較高溫度下實施，例如70'C，在此溫度下EXO-S探針和EXO-R 探針都不與其靶雜交。由于在每個所述線性探針上都存在猝滅劑，因此在較高溫度下 只有自EXO-S探針5'末端解離出的熒光團(tuán)可生成高于本底的信號。
鄉(xiāng)
實例l (圖4)
此實例顯示，在此處所用條件下，聚合酶Z05不能表現(xiàn)非引物依賴性抗性。
擴(kuò)增反應(yīng)各自含有1 xRT-PCR緩沖液(羅氏診斷(Roche Diagnostic))、50 mM 二 甘氨酸/KOH， pH8.2(25。C)、 115mMK-乙酸鹽、8呢甘油(v/v)、和3 mM乙酸錳(Mn OAc2)。 Z05聚合酶濃度為200單位/反應(yīng)，探針為0.5 并且互補靶為1.5 pM。反 應(yīng)為等溫反應(yīng)并在52。C下進(jìn)行。以20秒的間隔收集15分鐘的熒光數(shù)據(jù)。使用ABI 7700 熱循環(huán)機(jī)來進(jìn)行反應(yīng)。
使用以下探針和其互補靶
探針名稱 序列(5'-3')
線性FT (無臂)Fam墨CCATGATACAAGCTTCC-BHQl
線性FTBHQ5， BHQ1-CCATGATACAAGCTTCC-Fam
線性FT (5'3，臂) Fam-TTTTTTCCATGATACAAGCTTCCTTTTTT-BHQ1
0—4-0 MW-BG Fam-CGGTGAAACCGCGCCTGCAATATACAGC-BHQ1
靶名稱
FT革巴 ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACC BG革巴 AAAAAAGCTGTATATTGCAGGCGAAAAAA
測試以下探針-耙組合(每種測試兩次)。具有最快切割速率的兩條線(41)是FT 耙+線性FT探針，所述探針具有6個非互補核苷酸(都是T)的5'3'臂。具有第二 快切割速率的兩條線(42)(紅線)是FT靶+線性FT探針，所述探針不具有5'3'臂。 兩條線(43)是BG耙+ 0-4-0 MW-BG探針，所述探針含有具有4-bp莖部和3堿基環(huán) 的5'發(fā)夾。上述所有三種探針都具有5'FAM熒光團(tuán)。兩條線(44)是FT靶+線性FT探針，所述探針不具有5'3'臂，但黑洞猝滅劑1 位于5'末端。
兩條虛線(45)是具有5'發(fā)夾的0-4-0 MW-BG探針，但未將BG靶添加至反應(yīng)中。 圖4中所示結(jié)果顯示，在這些條件下，甚至在不存在BG靶的情況下，聚合酶 Z05也可解離具有5'發(fā)夾的0-4-0 W-BG探針。所有其它探針在其靶序列不存在的情 況下都不發(fā)生解離(結(jié)果未顯示)。因此，這些結(jié)果顯示，在這些條件下聚合酶Z05 表現(xiàn)非靶依賴性探針解離。以下事實可支持此結(jié)論在這些條件下，當(dāng)具有6個非互 補核苷酸(都是T) 5'3'臂的線性FT探針與其FT靶結(jié)合時，即使此EXO-R探針未 被Taq聚合酶解離，聚合酶Z05也可解離所述探針。 實例2 (圖5(A-D))
在此實例中顯示，表現(xiàn)非靶依賴性探針解離(實例1)的酶Z05聚合酶解離EXO-R 探針，而未顯示非耙依賴性探針解離的鉑Taq聚合酶不解離EXO-R探針。圖5展示 檢測H5和H3流感基因的四個實驗的結(jié)果，每次檢測都始于10,000份拷貝并且在相 同反應(yīng)條件下進(jìn)行，其中僅改變聚合反應(yīng)中所用酶。H5基因是通過5'TETEXO-R探 針(實線)來檢測并且H3基因是通過5'FAMEXO-R探針來檢測(混列線)。NTC 值顯示為虛線。
圖5 A展示使用Z05酶實施LATE-PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中(51)是TET探針熒光，. (52)是FAM探針熒光，并且(53)是使用TET和FAM兩種探針的NTC結(jié)果。
圖5B展示探針的熔融，其中(54)是TET探針熒光，(55)是FAM探針熒光，并且 (56)是FAM和TET兩種探針的NTC結(jié)果。圖5C展示使用鉑T叫聚合酶作為酶的LATE-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中(57)是TET 探針熒光，(58)是FAM探針熒光，并且(59)是NTCTET和FAM探針熒光。
圖5D展示探針的熔融，其中(510)是TET探針熒光，(511)是FAM探針熒光， 并且(512)是NTC TET和FAM探針熒光。
LATE-PCR似乎在Z05實例(圖5A)中更有效，其中兩種基因的Ct值都為29， 而在鉑Taq (圖5C)中Ct值為30 (H5)和33 (H3)。然而，兩條熔融曲線并未顯示此 情形。TET探針(54)在Z05反應(yīng)中被完全切割并將游離TET釋放至反應(yīng)物中，而FAM 探針(55)只被Z05部分切割。此可參見圖6B,其中在Z05反應(yīng)探針熔融曲線中，當(dāng) 探針不再與靶結(jié)合時，探針熒光(54、 55)達(dá)到NTC熒光值(56)。此也會在擴(kuò)增中導(dǎo) 致較低Ct值。在鉑Taq反應(yīng)(圖5D)中結(jié)果顯著不同，其中當(dāng)探針不再與靶結(jié)合時， 探針熔融曲線不顯示游離TET (510)或FAM (511)。因為未檢測到游離FAM或TET， 因此Ct值較低(圖5C)。
EXO-R探針
5， TET-CACTAGGGAACTCGCTG -BHQ1 3' ， Tm=52.7 (H5) 5， FAM-CGTTTCTCGAGGTCCTGCG-BHQ1 3，， Tm=54.5(H3)
限制引物Tm=66.8 (H5) Tm=67.9(H3)
5， AAGGATAGACCAGCTACCATGATTGCC 3，， 5， CGTTGTATGACCAGAGATCTATTTTAGTGTCCT 3，，
過量引物
5' ATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGG 3 ， ，Tm=63.6(H5)
Tm=62.7(H3)
以微升0lL)表示體積)
2.5 4 0.625 |A 1.5 nL 0.125 |iL 0.250 |iL 1.25 1.50 >iL 9.375
1.0/0.25最終單位 12.625 或13.375 |aL
25.0 |A
5' CCATCAGATTGAAAAAGAATTCT 3，， 反應(yīng)條件(以毫摩爾(mM)或微摩爾(nM)表示濃度， lOxPCR緩沖液 lx 10 mM dNTP 250 |iM
50 mM Mg++ 3 mM
10pM限制引物 2x lOO(aM過量引物 2x 10 |_iM探針500 nM 2 x
10pMC3引物安全(Primesafe)500nM
總混合物
ZO-5(5單位)，鉬TAQ (1.25單位)
水
DNA擴(kuò)增子(在IO，OOO份拷貝/pL下為2) 總體積
熱條件(退火ZO-5-58。C， Taq=62°C) 階段l: 95"C/3:00分鐘
階段2: (95°C/10秒58。C或62。C保持15秒72。C保持30秒)重復(fù)20次 階段3: (95°C/10秒-58。C或62°C/15秒-72°C/30秒-45°C/20秒)重復(fù)30次 階段4:熔融35r-94。C
實例3 (圖7A-I)
在引物依賴性和非引物依賴性LATE-PCR反應(yīng)中的EXO-N探針 在此實例中顯示，在LATE-PCR循環(huán)的初始循環(huán)中5'發(fā)夾EXO-R探針未被TAQ
聚合酶以引物依賴性方式解離，并且當(dāng)限制引物耗盡時未以非引物依賴性方式解離。
此外，根據(jù)所用LATE-PCR引物對的Tm， EXO-R探針可使BG靶的擴(kuò)增無效。結(jié)果
展示于圖7A-I中。
圖7A-C展示高Tm引物對的結(jié)果圖7A是在95'C下進(jìn)行的實時分析，圖7B 是在45。C下進(jìn)行的實時分析，圖7C是終點熔融曲線分析((73)是探針-耙，(74)只有 探針)。圖7D-F展示中Tm引物對的結(jié)果圖7D是在95i:下進(jìn)行的實時分析，圖 7E是在45。C下進(jìn)行的實時分析，圖7F是終點熔融曲線分析((77)是探針-靶，(78)只 有探針)。圖7G-I展示低Tm引物對的結(jié)果圖7G是在95'C下進(jìn)行的實時分析， 圖7H是在45'C下進(jìn)行的實時分析，圖71是終點熔融曲線分析((711)是探針-耙，(712) 只有探針)。圖7A、 7D、 7G顯示，在95。C下50個循環(huán)內(nèi)使用任一引物對時探針信號都不改 變。此結(jié)果表明，EXO-R探針不以引物依賴性機(jī)制被切割，并且進(jìn)一步顯示，在 LATE-PCR期間EXO-R探針不以非引物依賴性解離被切割。圖7B、 7E、 7H展示在 72。C下實施三個引物對的延伸步驟后，45。C下探針熒光的實時結(jié)果。在高Tm引物對 (圖7B)情況下，EXO-R探針不發(fā)生結(jié)合并且不阻斷擴(kuò)增。在中Tm引物對(圖7E) 情況下，EXO-R探針開始阻斷擴(kuò)增，其表現(xiàn)為Q的延遲和信號強度的降低。在低Tm 引物對(圖7H)情況下，EXO-R探針顯著抑制擴(kuò)增，其表現(xiàn)為Ct的顯著延遲和信號 強度的顯著降低。圖7C、 7F、 7I展示每個引物實例的EXO-RFAM探針35C-94C熔 融曲線。在7C中顯示最大量的PCR產(chǎn)物，同時7F中由于EXO-R探針的阻斷能力而 顯示較小量，并且在(7I)中幾乎未產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。由于熔融曲線是在LATE-PCR后繪 制，因此未檢測到游離FAM表明探針未以引物依賴性或非引物依賴性方式被切割。 黑色實線表示使用10,000份拷貝BG起始拷貝的反應(yīng)，而黑色虛線表示NTC。 序列
限制引物
TGCGTTCTGACTGAACAGTGATCGAG ， TTCTGACTGAACAGCTGATCGAG ，
Tm=72°C (高Tm引物對) Tm=64°C (中Tm引物對) Tm=61°C (低Tm引物對)
TGACTGAACAGCTGATCGAG ，
過量引物
CCCTCTTG AAATTCCCG AATGG ， TCTTGA AATTCCCG AATGG ， TTGAAATTCCCGAATGG ， EXO-R探針04017:
5， FAM-CGCTGAAAGCGCGCCTGCAATTTACAGC-BHQl， 3， Tm=60°C
反應(yīng)條件微升(pL)
Tm=66°C (高Tm引物對) Tm=6rC (中Tm引物對) Tm=58°C (低Tm引物對)
10 x 10 mM 50函 10 一 10 一 10岸 10 nM 1.25 U
PCR緩沖液
dNTP
Mg++
限制引物
過量引物
EXO-N探針
引物安全9-3DD
鉬TAQ
水
BG革巴
1 x
250 |iM 3 mM 50 nM ■ nM 100 nM 500 nM
1Q4拷貝/)aL
2.5 |uL 0.625 (iL 1.5 nL 0.125 0.250 (aL 0.250 1.250 0.250
17.25 1.0
25熱條件
階段l: 95t:保持5min。
階段2:重復(fù)50次以下循環(huán)95t:保持10秒，6rC/58'C保持15秒，72"C保持 20秒，并且45。C保持20秒。
階段3:熔融35。C-94。C 實例4 (圖8)
在5'末端使用FAM的EXO-S探針
實例4的圖8展示在LATE-PCR反應(yīng)完成后通過振蕩15分鐘實施的EXO-S探 針信號擴(kuò)增。反應(yīng)條件為45輪95'C下IO秒、6(C下10秒和72'C下20秒的循環(huán)。 最終試劑濃度存于25微升0iL)體積中的lx英杰PCR緩沖液、3mMMg++、和1.25 單位英杰Taq聚合酶、200 nM dNTP、 50納摩爾(nM) FT 2號限制引物、1000 nM FT 2 號過量引物和0.6 x引物安全tm 022號(引物安全是可自史密斯檢測(Sm池s Detection) 公司獲得的試劑)和300nMFTMBs叫4。
FT2號限制引物的序列為 5 ， GG A AGTGT A AG ATT AC AATGGC AGGCTCC AG A3,。
FT 2號過量引物的序列為5' GTTGCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA 3'。 FTMBs叫4EX0陽S探針為5'FAM-CATGATACAAGCTTC-BHQ1 3，。 在PCR完成后；實施45輪45'C (10秒)至65'C (20秒)的振蕩。在65。C下 收集熒光。線條(81)是含有FTMBseq4探針和經(jīng)擴(kuò)增FT產(chǎn)物二者的復(fù)制物，而線條 (82)是無模板對照樣品。 實例5 (圖9)
在5'末端上使用BHQ1的EXO-R探針
在此實例中顯示，(1)用5' BHQ-1猝滅劑替代Exo-S探針的5'熒光團(tuán)可使Exo-S 探針轉(zhuǎn)化為不再以非引物依賴性方式被TAQ DNA聚合酶解離的Exo-R探針，以及(2) 與通過LATE-PCR生成的單鏈DNA結(jié)合的Exo-R探針不以非引物依賴性方式被TAQ DNA聚合酶解離。圖xx展示此實例的結(jié)果。圖A展示在不存在(線條91)或存在
(線條92) TAQ DNA聚合酶的情況下Exo-S探針的探針/靶雜合體的熔融曲線。此 特定Exo-S探針由5' HEX熒光團(tuán)和3' BHQ-1猝滅劑構(gòu)成。線條93對應(yīng)于無模板對 照樣品的本底熒光信號。反應(yīng)是以25nL體積實施并且由以下組成1XPCR緩沖液
(英杰，卡爾斯巴德，CA) 、 3mMMgCl2、 150nM合成靶(見下文)、500 nM Exo-S 探針(見下文)和(在具有TAQDNA聚合酶的樣品的情況下)1.25單位TAQDNA 聚合酶(英杰，卡爾斯巴德，CA)。對于無模板對照樣品來說，其包括TAQ DNA 聚合酶并且靶序列經(jīng)10 mM Tris-Cl pH 8.3替代。在95'C下將樣品培養(yǎng)IO秒然后在 2(TC下培養(yǎng)20分鐘以使得形成Exo-S探針/靶雜合體。然后在樣品溫度以rC的間隔 自2(TC升高至95。C時收集熒光信號，每次間隔長90秒。對于不含TAQDNA聚合酶 的樣品(線條91)來說，探針熒光信號與在65t:以上溫度下來自無模板對照的探針熒光信號相匹配，在此溫度范圍內(nèi)探針與靶完全熔融。相反，對于具有TAQDNA聚 合酶的樣品來說，在65'C以上探針熒光信號強于來自無模板對照的熒光信號，此顯 示探針中HEX熒光團(tuán)與BHQ-1猝滅劑的解離和分離。此結(jié)果顯示，與合成靶結(jié)合的 Exo-S探針易于以非引物依賴性方式被TAQ DNA聚合酶解離。 序列
Exo-S探針5' HEX AGCATACGGTTCAGTT 3' BHQ1
合成靶
5， AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3，
加下劃線的序列對應(yīng)于探針靶位點。
對上述相同探針序列進(jìn)行修飾以使其具有5' BHQ-1猝滅劑和3' HEX熒光團(tuán)。5' BHQ-1部分的存在將探針轉(zhuǎn)變?yōu)閷AQ DNA聚合酶的非引物依賴性解離方式具有 抗性的Exo-R探針。圖B展示在TAQ DNA聚合酶存在下所述Exo-R探針-靶雜合體 的熔融曲線(線條94)。線條95對應(yīng)于在TAQDNA聚合酶存在下探針自身/無模板 對照樣品的本底熒光信號。反應(yīng)條件由存于25 的最終體積中的1 X PCR緩沖液(英 杰，卡爾斯巴德，CA) 、 3mMMgCl2、 150nM合成靶、500 nM Exo-R探針(見下 文)和1.25單位TAQDNA聚合酶(英杰，卡爾斯巴德，CA)組成。對于無模板對 照樣品來說，靶序列經(jīng)10 nM Tris-Cl Ph 8.3替代。在2(TC下將樣品培養(yǎng)20分鐘以使 得形成Exo-R探針/靶雜合體，并且隨后在樣品溫度以rC的間隔自2(TC升高至95'C 時收集熒光信號，每次間隔長90秒。對于具有Exo-R探針/靶雜合體的樣品(線條94) 來說，熒光信號與在65'C以上溫度下來自無模板對照樣品的熒光信號相匹配，在此 溫度范圍內(nèi)探針與耙完全熔融(線條95)。此結(jié)果表明，(1)與合成靶結(jié)合的Exo-R 探針對TAQ DNA聚合酶的非引物依賴性解離方式具有抗性，以及(2)用5' BHQ-1 猝滅劑替代5' HEX熒光團(tuán)可使Exo-S探針轉(zhuǎn)變?yōu)镋xo-R探針。
序列
Exo-R探針5， BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3， HEX
合成靶(與上文所示相同)
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3，
加下劃線序列對應(yīng)于探針靶位點。
圖C顯示，當(dāng)與通過LATE-PCR生成的單鏈DNA結(jié)合時，上述Exo-R探針也 對TAQ DNA聚合酶有抗性。含有上述Exo-R探針靶序列的單鏈DNA產(chǎn)物是在Exo-R 探針存在下通過LATE-PCR生成。在擴(kuò)增結(jié)束時，溫度下降至20'C并且將其培養(yǎng)20 min以使得形成Exo-R/單鏈擴(kuò)增子雜合體。此圖展示Exo-R探針/單鏈擴(kuò)增子雜合體 的PCR后熔融曲線分析(線條96)。線條97對應(yīng)于探針自身/無模板對照樣品的本 底熒光信號。與雜合至合成靶的Exo-R探針(圖B)類似，Exo-R探針-擴(kuò)增子雜合體 在65'C以上溫度下完全熔融，導(dǎo)致本底熒光信號等效于無模板對照樣品的熒光信號。 此結(jié)果表明，與通過PCR生成的耙結(jié)合的Exo-R探針對TAQ DNA聚合酶的非引物依賴性解離方式具有抗性丄ATE-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是存于25 ^最終體積中的1 X PCR緩沖液(英杰，卡爾斯巴德，CA) 、 3 mM MgCl2, 250 nM dNTP混合物(dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) 、 25 nM 9-22DD引物安全、500 nM 9-C3引物安全、1.25單位 TAQDNA聚合酶(英杰，卡爾斯巴德，CA) 、 50 nM限制引物、1 過量引物、 500 nM Exo-R探針、1000基因組當(dāng)量的人類DNA (康奈爾細(xì)胞庫(Cornell Cell Repository),卡姆登(Camden)， NJ,目錄號；NA07348)。熱循環(huán)方案為95。C保持3 min， 70次95'C保持10秒、64'C保持10秒、和72'C保持20秒的循環(huán)，然后在20 'C下保持20分鐘并實施熔融步驟，其中以1'C的間隔自2(TC至95'C收集熒光，每次 間隔長90秒。 序列
限制引物
5' CCATTTCTTCCTCCTCCTCATAAGCATGGTACCTAT 3'
過量引物
5， CCCGCTGGTTCAATAATGTCTTTAA 3'
Exo-R探針(與上文所示相同)
5， BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3， HEX
圖A -在合成靶上測試的Exo-S探針的實例此圖展示在不存在(線條91)或 存在(線條92) TAQ DNA聚合酶的情況下Exo-S探針-靶雜合體的熔融曲線分析。 線條93對應(yīng)于在TAQ DNA聚合酶存在下探針自身/無模板對照樣品的本底熒光信 號。對于不含TAQDNA聚合酶的樣品(線條91)來說，在65°C以上溫度下探針-靶 雜合體的完全熔融可導(dǎo)致本底熒光信號等效于無模板對照樣品的熒光信號。對于具有 TAQ DNA聚合酶的樣品來說，由于探針中HEX熒光團(tuán)與BHQ-1猝滅劑的解離和分 離，在65'C以上溫度下探針-靶雜合體的完全熔融可導(dǎo)致熒光信號比未結(jié)合探針的熒 光信號強。此結(jié)果表明，與合成靶結(jié)合的Exo-S探針易于以非引物依賴性方式被TAQ DNA聚合酶解離。在95'C下對熒光信號實施標(biāo)準(zhǔn)化以幫助復(fù)制樣品的對比。
圖B:在合成耙上測試的Exo-R探針的實例此圖展示在TAQ DNA聚合酶存 在下Exo-R探針-耙雜合體的熔融曲線分析(線條94)。線條95對應(yīng)于在TAQ DNA 聚合酶存在下探針自身/無模板對照樣品的本底熒光信號。盡管存在TAQ DNA聚合 酶，但探針-靶雜合體的熔融可導(dǎo)致本底熒光信號等效于未結(jié)合探針的熒光信號。此 結(jié)果表明，與合成靶結(jié)合的Exo-R探針對TAQDNA聚合酶的非引物依賴性解離方式 具有抗性。在95i:下對熒光信號實施標(biāo)準(zhǔn)化以幫助復(fù)制樣品的對照。
圖C:在PCR產(chǎn)物上測試的Exo-R探針的實例在結(jié)合通過LATE-PCR生成 的單鏈DNA時，上述Exo-R探針對TAQ DNA聚合酶的解離具有抗性。含有上述 Exo-R探針耙序列的單鏈DNA產(chǎn)物是在Exo-R探針存在下通過LATE-PCR來生成。 在擴(kuò)增結(jié)束時，溫度降低至2(TC并且將其培養(yǎng)20 min以使得形成Exo-R/擴(kuò)增子雜合 體。此圖展示Exo-R探針/擴(kuò)增子雜合體的PCR后熔融曲線分析(線條95)。線條96對應(yīng)于探針自身/無耙樣品的本底熒光信號。與雜合至合成靶的Exo-R探針類似， Exo-R探針-擴(kuò)增子雜合體的熔融可導(dǎo)致本底熒光信號等效于無模板對照樣品的熒光 信號。此結(jié)果表明，與通過PCR生成的靶結(jié)合的Exo-R探針對TAQ DNA聚合酶的 非引物依賴性解離方式具有抗性。在95'C下對熒光信號實施標(biāo)準(zhǔn)化以幫助復(fù)制樣品 的對照。 實例6 (圖10)
在此實例中展示LATE-PCR反應(yīng)，其使用EXO-R ROX探針來檢測7500份拷貝 的新城DNA擴(kuò)增子，其中在LATE-PCR擴(kuò)增期間未觀察到ROX EXO-R探針降解。
圖10A展示7500份拷貝新城病毒擴(kuò)增子的LATE-PCR擴(kuò)增(線條101)和ROX EXO-R探針熔融曲線(實線)與NTC (線條102)的相對關(guān)系。在熔融曲線圖10B 中未觀察到探針降解，因為當(dāng)探針在高溫下未結(jié)合時，所有探針熒光(線條103)和 NTC熒光(線條104)重疊，此表明不存在游離ROX熒光。
序列
限制引物
5'GCATCAAATTCCCCACTGAGCCTC 3，， Tm: 67.9°C
過量引物
5， CCTGGTATTTATTCCTGTTTGAG3'， Tm: 63.2。C
探針序列
5'ROX-ATTTTGCGATATGATACCC-BHQ2 3，， Tm: 56°C
原液濃度:
最終濃度
1 x
250 nM 3 mM
10xPCR緩沖液 10 mM dNTP 50 mM Mg++ 10(^M限制引物 lOOiiM過量引物 10nM探針500 nM2x 10pMC3-12B引物安全300nM
總混合物
PtTAQ (1.25單位) 水
DNA擴(kuò)增子 (在750、 7,500份拷貝爾L下為2)
總體積 熱循環(huán)條件
階段l: 95。C/3:00分鐘
階段2: (95°C/0:10秒—58°C/62°C/0:15秒
在25 uL分析中的體積(uL)
2.5 (A
0.625 nL
1.5 nL 0.125
0.250 (iL
1.25 |iL
.750 pL
8.25 0.25
14.5 nL
2.0 (aL 25.0 (A
72。C/0:30秒)重復(fù)20次階段3: (95°C/0:10秒-58。C/62°C/0:15秒-72。C/0:30秒-45°C/0:20秒墨25°C
/0:20秒)重復(fù)20次 階段4:保持25'C/2:00分鐘 階段5:熔融25'C-94t: 實例7 (圖ll)
在等溫條件對振蕩條件下EXO-S探針的解離速率
在5(TC等溫條件下或在5(TC至7(TC溫度振蕩條件下保持5分鐘，比較信號擴(kuò)增 速率。探針和互補耙濃度都為0.5 最終試劑濃度為lx英杰PCR緩沖液、3mM Mg"+、和1.25單位英杰T叫聚合酶。線條(111)是在振蕩條件下的復(fù)制物，而線條(112) 是在等溫條件下的復(fù)制物。
E9L探針 FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3，BHQ1
具有12個堿基對的3'和5'突出端的E9L靶
3， ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5' 實例8 (圖12)
EXO-S探針與其互補靶3'末端的距離可影響解離速率。
以0.2 nM使用E9L探針而以0.05 使用兩種靶；最終試劑濃度為1 x英杰PCR 緩沖液、3mMMg++、和1.25單位英杰Taq聚合酶。線條(121)是相對于探針-靶雜合 體復(fù)合物末端具有12個堿基對的5'和3'突出端的復(fù)制物。而線條(122)是相對于探針 -靶雜合體復(fù)合體5'末端具有44個堿基對的3'突出端的復(fù)制物。 E9L探針 FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3，BHQ1 具有12個堿基對的3'和5'突出端的E9L靶
3， ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5' 具有44個堿基對的3'突出端的E9L耙
3 ， ACCT AC ACGTTG AG AATCGGCTTCCC AT ACTC ATATCTCGT GATAAAGATTTAGGGTAGTCTGG 5， 實例9 (圖13)
在45'C至7(TC振蕩期間探針5'末端與靶發(fā)生單堿基配對錯配時的不同信號生成 速率(情況l)。
探針濃度為0.2 pM rs498，靶濃度為0.05 最終試劑濃度為1 x英杰PCR緩 沖液、3 mM Mg++、和1.25單位英杰Taq聚合酶，并且在7(TC下進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。線 條(131)是含有A-A錯配的復(fù)制物，線條(132)是具有A-T匹配的復(fù)制物。線條(133) 是僅具有探針的復(fù)制物。
rs498探針FAM 5， AGACATGTTCCCTACT 3'BHQ1 。
具有末端堿基錯配的靶(粗體) CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC
完全匹配的革巴CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC實例10 (圖14)
在45'C至7(TC振蕩期間探針5'末端與耙發(fā)生單堿基配對錯配時的不同信號擴(kuò)增 速率(情況2)。
探針濃度為0.2 rs498，而靶濃度為0.05 ^M，試劑與上文所述相同并在70°C 下實施數(shù)據(jù)收集。線條(141)是含有C-A錯配的復(fù)制物，線條(142)是含有C-T錯配的 復(fù)制物，線條(143)是含有C-C錯配的復(fù)制物，線條(144)是含有C-G堿基配對匹配的 復(fù)制物。而線條(145)是僅含有探針的復(fù)制物。rs498探針序列為3' FAM CGACATGTTCCCTACT BHQ 1 5，。在耙鏈內(nèi)位于探針序列末端的5， T與其互補序列 (加下劃線)的3'末端錯配(粗體)
5， CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC 3，， 5， CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC 3，， 5， CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCCGCCATAGGTTTC 3，， 或在耙鏈內(nèi)與其互補序列(加下劃線)的3'末端錯配(非粗體)。 5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCGGCCATAGGTTTC 3，。 實例ll (圖15)
在等溫條件(50。C)下保持30分鐘的信號擴(kuò)增速率。FT探針為0.5 并且其互補 耙為1.0 )aM;最終試劑濃度為1 x英杰PCR緩沖液、3 mM Mg++、和1.25單位英杰 Taq聚合酶。線條(151)是FT探針和其互補靶的復(fù)制物，而線條(152)僅為FT探針。 FT探針的序列為5'CCATGATACAAGCTTCC 3'并且互補序列為5， ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT3，。 實例12 (圖16)
在振蕩條件(45。C至7(TC)下的信號擴(kuò)增速率。FT探針為0.5 pM并且其互補 靶為0.5最終試劑濃度為1 x英杰PCR緩沖液、3 mM Mg++、和1.25單位英杰 Taq聚合酶。線條(161)是FT探針和其互補靶的復(fù)制物，而線條(162)僅為FT探針。 FT探針的序列為5' CCATGATACAAGCTTCC 3'，并且互補序列為5' ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAACCT 3，。 實例13 (圖17)
探針5'臂長度的增加可影響到其是EXO-S還是EXO-R探針。圖17 A至C展示 在存在或不存在Taq聚合酶的情況下，將探針和其互補靶于5(TC下等溫培養(yǎng)30分鐘 后實施的熔融分析?？膳c不含Taq的樣品達(dá)到相同熒光值的含T叫樣品指示EXO-R 探針。將所有熒光值都標(biāo)準(zhǔn)化至7(TC。在圖17A中，線條(171)是不含T叫聚合酶的 FT探針(無修飾)靶復(fù)合體的復(fù)制樣品。線條(172)是含有FT探針和靶以及T叫聚 合酶的復(fù)制樣品。而線條(173)僅為FT探針。在圖17B中，線條(174)是在靶存在下在 探針5，末端具有與靶不互補的單堿基的FT(lbp)探針復(fù)制樣品，且其不含T叫聚合酶。 線條(175)是含有FT (1 bp)探針和靶以及Taq聚合酶的復(fù)制樣品。而線條(176)僅為FT (lbp)探針。在圖17C中，線條(177)是在靶存在下在探針5'末端具有與靶不互補的五個堿基的FT(5bp)探針復(fù)制樣品，且其不含Taq聚合酶。線條(178)是含有FT (5 bp) 探針和耙以及Taq聚合酶的復(fù)制樣品。而線條(179)僅為FT (5 bp)探針。
FT探針序列為5'CCATGATACAAGCTTCC 3'; FT (1 bp)探針序列為 5'ACCATGATACAAGCTTCC 3，； FT (5 bp)探針為5TTTTTCCATGATACAAGCTTCC 3 ， 。 FT革巴為3， TCCAAGATTCACGGTACTATGTTCGAAGGGTTAATGATTCA5 ，。
權(quán)利要求
1、一種不對稱聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和檢測方法，其包含(a)通過包括引物退火溫度的重復(fù)熱循環(huán)對反應(yīng)混合物實施熱循環(huán)，所述反應(yīng)混合物含有第一脫氧核糖核酸(DNA)擴(kuò)增靶序列、第一過量引物和第一限制引物、dNTP、未顯示非靶依賴性探針解離的熱穩(wěn)定DNA聚合酶、和低溫第一雜交探針，所述第一雜交探針的濃度調(diào)節(jié)熔融溫度比所述第一限制引物的濃度調(diào)節(jié)熔融溫度低至少5℃并且為線性DNA寡核苷酸，其對非引物依賴性5’外切核酸酶解離的敏感性已通過對所述寡核苷酸的結(jié)構(gòu)修飾而改變；(b)使所述探針與第一擴(kuò)增子鏈雜交，所述第一擴(kuò)增子鏈?zhǔn)窃谒鱿拗埔锖谋M后所述過量引物于第一溫度下的延伸產(chǎn)物；和(c)檢測所述探針的雜交。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述探針的結(jié)構(gòu)修飾能夠增強非引物依賴性 5'核酸酶解離，并且其中檢測包括檢測所述探針是否已解離。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)修飾選自由以下組成的群組不與 所述擴(kuò)增子鏈的對應(yīng)核苷酸互補的5'核苷酸，和具有通過包括至少三個連續(xù)亞甲基的 鏈與其連接的標(biāo)記部分的5'核苷酸。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述鏈包括三個以上連續(xù)亞甲基。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述鏈包括六個連續(xù)亞甲基。
6、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物含有第二DNA擴(kuò)增靶序列、 用于所述第二 DNA擴(kuò)增靶序列的第二過量引物和第二限制引物、和用于通過所述第 二過量引物的延伸形成的第二擴(kuò)增子鏈的第二雜交探針，其中檢測包括在第二溫度下 檢測所述第二探針是否已雜交。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第一和第二探針是經(jīng)相同熒光團(tuán)標(biāo)記的 雙重標(biāo)記熒光探針。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第二探針是低溫探針，其濃度調(diào)節(jié)熔融 溫度比所述第一限制引物的濃度調(diào)節(jié)熔融溫度低至少5'C，并且與所述第一溫度相差 至少5。C。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第二溫度比所述第一溫度低至少1(TC。
10、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第二探針通過使所述反應(yīng)溫度圍繞其熔 融溫度快速振蕩而解離。
11、 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第二溫度比所述第一溫度高至少l(TC。
12、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的結(jié)構(gòu)修飾能夠防止等溫非引物依 賴性5'核酸酶解離。
13、 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)修飾選自由以下組成的群組由2-7個不與所述第一擴(kuò)增子鏈雜交的核苷酸構(gòu)成的5'末端臂、具有通過除3個或更多 個連續(xù)亞甲基的鏈以外的方式與其連接的標(biāo)記部分的5'末端核苷酸、和位于所述探針 5'末端且由于在7(TC以上溫度下自退火而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非互補核苷酸，所述發(fā)夾結(jié) 構(gòu)具有長為2-5個核苷酸的莖部。
14、 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述探針對通過在所述探針Tm附近溫度 下熱振蕩引發(fā)的解離無抗性，并且檢測包括圍繞所述探針-擴(kuò)增子雜合體之熔融溫度 對其進(jìn)行快速熱振蕩以產(chǎn)生探針解離。
15、 一種在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增中阻止DNA耙鏈延伸的方法，其包含向含 有與所述鏈雜交的引物和DNA聚合酶的PCR反應(yīng)混合物中添加與所述引物下游(5') 的所述靶鏈雜交并且通過所述DNA聚合酶阻止所述引物延伸的寡核苷酸，所述DNA 聚合酶在所述混合物中未顯示非靶依賴性探針解離。
16、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸包括5'末端寡核苷酸發(fā)夾， 所述發(fā)夾不與所述靶鏈雜交并且具有含2-5個核苷酸的莖部，且其熔融溫度為至少70 。C。
17、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸與至少兩個可能等位基因之 一雜交，所述兩個等位基因原本都會受到擴(kuò)增。
18、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述PCR反應(yīng)混合物是對稱PCR反應(yīng)混 合物，其中所述引物是平衡引物對中的一個，并且其中所述寡核苷酸在兩個或更多個 熱循環(huán)后被添加至所述反應(yīng)混合物中以阻止所述引物的延伸。
全文摘要
本文闡述可用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的經(jīng)標(biāo)記探針和未經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸。對這些探針和寡核苷酸加以修飾以相對于其相應(yīng)的未經(jīng)修飾對應(yīng)物改變其對熱穩(wěn)定DNA聚合酶非引物依賴性5’外切核酸酶活性的敏感性。本文也闡述采用這些經(jīng)標(biāo)記探針和未經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸的不對稱聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和檢測方法。本文也闡述包括經(jīng)標(biāo)記探針和未經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸的核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒。
文檔編號C12N9/00GK101506384SQ200780031026
公開日2009年8月12日 申請日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月17日
發(fā)明者勞倫斯·J·王 申請人:布蘭迪斯大學(xué)