專利名稱：：Dna分子和方法DNA分子和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及DNA分子以及使用所述分子向革蘭氏陽性細(xì)胞，特別是向梭菌綱(aa^nW")細(xì)胞中的DNA引入突變的方法。梭菌綱包括梭菌目(C7oWrWa/M)、鹽厭氧菌目(//a/朋aeraZ^/es)和熱厭氧桿菌目(T72ermoa"aera6a"eW"/es)。梭菌目包括梭菌禾斗(C7astnViz'aceae)，而梭菌科包括梭菌屬(C/as化/d/wm)。梭菌屬是最大的細(xì)菌屬之一，由專性厭氧的革蘭氏陽性產(chǎn)孢菌構(gòu)成。某些成員，如熱纖梭菌(C/M/rWwm決w附oce〃wm)和丙酮丁醇梭菌(C/a^Wwwweto^/^c訓(xùn))可用于化學(xué)燃料的工業(yè)級生產(chǎn)。后一梭菌種和其他良性的代表種還具有作為癌癥靶向治療劑的遞送載體的顯著潛力。然而，由于如艱難梭菌(C7asW(i/w附6i^cz7e)、肉毒梭菌(C7astnV^w附Zofw/Z"w附)禾口產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o^r^wm/w/n'"取m)的那些成員會(huì)導(dǎo)致人和家畜患病，結(jié)果使梭菌屬聲名狼藉。盡管所述菌屬具有巨大的商業(yè)和醫(yī)學(xué)重要性，但是由于對該生物體缺乏在分子生物學(xué)水平上的基本了解，所以無論是對其進(jìn)行有效開發(fā)利用的進(jìn)程，還是對抵抗其所致疾病的常規(guī)方法的研發(fā)，均受到了嚴(yán)重阻礙。這在很大程度上是缺少有效基因工具的結(jié)果。在最近幾年中已經(jīng)由包括丙酮丁醇梭菌、艱難梭菌、肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌在內(nèi)的至少一個(gè)典型株確定了所有主要種的完整基因組序列。在其他菌種中，可以以此類數(shù)據(jù)為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行更有效的疾病控制或產(chǎn)生具有改進(jìn)加工性的菌株。在此類任務(wù)中的關(guān)鍵工具是將DNA合理地整合到基因組的能力?？刹捎眉夹g(shù)(i)產(chǎn)生特異性突變體，以將其作為確定單個(gè)基因或基因簇功能的方式，這是理解生理學(xué)和發(fā)病機(jī)理的首要步驟；(ii)對調(diào)控基因或結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行插入失活，以將其作為增加所需商品的產(chǎn)量的方式；和(iii)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入編碼外源因子的基因信息。然而，目前尚沒有用于任何一種梭菌的突變研究的有效整合載體，而且仍嚴(yán)重欠缺對該菌屬進(jìn)行基因插入失活的能力。現(xiàn)有技術(shù)中對梭菌突變體的制備依賴于整合載體與宿主染色體之間的同源重組?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)氣莢膜梭菌株13、拜氏梭菌(C.Z^)'w/"ch7)NCIMB8052、丙酮丁醇梭菌ATCC824和艱難梭菌CD37中，攜帶宿主染色體區(qū)域的不能復(fù)制的質(zhì)粒(replication-minusplasmid)可通過同源重組整合進(jìn)入基因組中(Shim腿d"/(1994)/Sa"m》/.176:1616-23;WilkinsonandYoung(1994)140:89-95;Greenda/(1996)M^ra6Zo/.142:2079-2086;LiyanageW"/(2001)Mz'craWo/.67:2004-2010)。在拜氏梭菌和艱難梭菌的情況下，載體從大腸桿菌(￡.co/O供體遷移(mobilize)至拜氏梭菌和艱難梭菌中。而對于產(chǎn)氣莢膜梭菌和丙酮丁醇梭菌，則通過轉(zhuǎn)化引入質(zhì)粒。在拜氏梭菌中發(fā)生整合的頻率為每個(gè)受體l(^l(r7，這一頻率比在可復(fù)制質(zhì)粒(replicationproficientplasmid)中觀察到的轉(zhuǎn)化頻率(10-41(T5)低2個(gè)數(shù)量級(WilkinsonandYoung,1994，如上)。在艱難梭菌中，尚沒有關(guān)于獲得頻率指數(shù)的報(bào)道。在丙酮丁醇梭菌中，以每pgDNA0.8~0.9個(gè)"克隆"的頻率產(chǎn)生整合體。在上述整合體中，靶位點(diǎn)質(zhì)粒序列的側(cè)翼具有引導(dǎo)整合的DNA片段的兩個(gè)正向重復(fù)拷貝。結(jié)果導(dǎo)致質(zhì)粒序列在分離上不穩(wěn)定，例如在丙酮丁醇梭菌中的流失率為每30代1.83.0x10—3(Greene"/,1996，如上)，在拜氏梭菌中的流失率為每30代0.371.3xl(T3(WilkinsonandYoung,1994，如上)。人們認(rèn)為優(yōu)選利用等位基因交換獲得整合體。因此，在產(chǎn)氣莢膜梭菌中篩選并獲得了雙交換突變體(AwadeM/(1995)Mo/.M'crafc/oZ.15:191-202;Banname/a/(1995)Mo/.M/cra&o/.16:535-551)。然而，證實(shí)只有在用來失活靶基因的抗生素抗性基因任意一側(cè)引入相當(dāng)長(3.0kb)的同源序列時(shí)，等位基因交換才可能發(fā)生。此外，還證實(shí)即便在此條件下，突變體的分離也存在不定性(即，在io個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中，僅有兩個(gè)獲得7V/c突變體)，并且很多突變體需要長達(dá)6個(gè)月的時(shí)間進(jìn)行分離，而其他突變體可能完全不能分離。在產(chǎn)氣莢膜梭菌中可檢測到罕見的整合事件是DNA能夠高頻率地轉(zhuǎn)化入此類生物體的結(jié)果。在其他種的梭菌中產(chǎn)生雙交換突變體的努力尚未獲得成功。迄今為止，證明除產(chǎn)氣莢膜梭菌之外，很難使用經(jīng)典的同源重組在其他一系列梭菌種中產(chǎn)生突變體。因此，在丙酮丁醇梭菌中僅制備出5個(gè)突變體。其中4個(gè)(k/^:,CAC3075;/to，CAC1742;aa《CACP0162;和《漢，CACP061)通過復(fù)制缺陷型質(zhì)粒的單交換整合制備(Greenetal.，1996，如上；GreenandBennett(1996)^p;/.所oc/ze附.213，57-58;Harris&"/(2002)JBacten'o/.184,3586-3597)，而第5個(gè)突變體(spoM(CAC2071))則是由試圖通過利用復(fù)制缺陷型質(zhì)粒的相互交換來產(chǎn)生突變但沒有成功的策略分離得到的(Nairda/(1999;U5acferzW.181,319-330)。類似地，現(xiàn)已報(bào)道的在艱難梭菌中產(chǎn)生的定向突變體僅有3個(gè)。一個(gè)突變體(gWJ，CD0274)是使用復(fù)制缺陷性型質(zhì)粒產(chǎn)生的(Liyanage"a/,2001，如上)，然而此突變似乎是致死的，突變細(xì)胞不能增殖。另外兩個(gè)失活基因(gai,CD3255和^W,CD1089)通過引入攜帶所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部片段的復(fù)制缺陷型載體而獲得(O'Connorda/(2006)Mo/.Mz'cra&'o/.61,1335-1351)。后兩個(gè)質(zhì)粒的引入似乎在"有些困難"的情況下獲取的，而且在分離出整合體的同時(shí)并沒有記錄分離的頻率。實(shí)際上，在這兩種生物體中難以對使用現(xiàn)有突變方法的效率做出評價(jià)，這是因?yàn)橥ǔ２淮嬖谕蛔凅w產(chǎn)生頻率的指標(biāo)。就丙酮丁醇梭菌而言，所述突變體產(chǎn)生頻率的指標(biāo)為(Thomas(2005)MetabolicengineeringofsoventogenicClostridia.In:Diirre,P.HandbookonClostridia,CRCPress,pp813-830)"每ng質(zhì)粒DNA可產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體少于1個(gè)"。此外，由于這些突變體中的大部分是由單交換插入產(chǎn)生的，因而由于質(zhì)粒切除而不具有穩(wěn)定性。例如，艱難梭菌突變體的Southern印記顯示在細(xì)胞群的一些細(xì)胞中存在由"環(huán)凸"(loopedout)自主復(fù)制的質(zhì)粒。經(jīng)設(shè)計(jì)，目前越來越多的技術(shù)可利用包含移動(dòng)性遺傳元件的系統(tǒng)對細(xì)菌基因組進(jìn)行更為有效的修飾。乳酸乳球菌的II型內(nèi)含子Ll丄trB是通過內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶(LtrA)以及切下的套索RNA來介導(dǎo)其自身移動(dòng)性的元件。此外，實(shí)際上可能通過對內(nèi)含子RNA的修飾使其重新靶向任何所需的DNA序列(Guoda/(2000)5We"ce289:452-457;Mohrda/(2000)Dev.14:559-573)。因此，通過對內(nèi)含子的參與靶向的15bp區(qū)域中的單個(gè)堿基進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐蛔?，Karberg等人(iVa^^所ofec/2.(2001)19:1162-1167)能夠以0.122%間的頻率在數(shù)個(gè)不同大腸桿菌基因內(nèi)的不同指定位點(diǎn)定向插入所述元件。中斷這些基因之一^yj產(chǎn)生具有天然三甲氧芐二氨嘧啶抗性的克隆。因此，可通過在存在三甲氧芐二氨嘧啶的條件下進(jìn)行培養(yǎng)來篩選整合體。其他基因的整合體通過篩選單克隆中是否存在L1丄trB內(nèi)含子來鑒定。用于中斷大腸桿菌Aj^基因的質(zhì)粒也被用于中斷弗氏志賀氏菌(S.^ex^n')和鼠傷寒沙門氏菌(S.Cy//2/m腦'訓(xùn))中的A^4基因。獲得三甲氧節(jié)二氨嘧啶抗性克隆的頻率分別為1%和0.3%。乳酸乳球菌的II型內(nèi)含子Ll,LtrB用于在產(chǎn)氣莢膜梭菌的p/c基因中產(chǎn)生敲除(Chen""/(2005)J;;/M/craWo/.71:7542-7)。此外，通過電穿孔向產(chǎn)氣莢膜梭菌中導(dǎo)入包含設(shè)計(jì)為靶向;^基因的修飾Ll丄trB內(nèi)含子的氯霉素抗性質(zhì)粒。使用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化體，并通過PCR檢測在p/c基因中插入的存在。在經(jīng)檢測的38個(gè)克隆中，大部分為陰性插入，但有兩個(gè)克隆同時(shí)包含野生型和內(nèi)含子插入型;^基因。認(rèn)為后兩個(gè)克隆是由單個(gè)轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)生的，其產(chǎn)生發(fā)生插入的子代和不發(fā)生插入的子代。來自這些混合克隆的細(xì)菌可產(chǎn)生純克隆，其中10%的純克隆包含內(nèi)含子插入型/^基因。因此，除使用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化體之外，可通過兩輪篩選鑒定插入突變體，而無需使用抗生素培養(yǎng)進(jìn)行篩選。實(shí)際上，沒有向染色體中引入任何抗生素抗性基因可作為此方法的特別優(yōu)點(diǎn)。作者特別指出，使用攜帶不同修飾Ll丄trB內(nèi)含子的相同穿梭質(zhì)?？稍谕患?xì)菌細(xì)胞中造成多個(gè)基因中斷。產(chǎn)氣莢膜梭菌具有高轉(zhuǎn)化頻率，大約比其他梭菌種類高出2個(gè)數(shù)量級。此外，基因敲除(在;^中)得到易于檢測的表型，其可容易地在瓊脂板上觀察到。Yao等人(iWJ(2006)12:1-11)使用Ll丄trB破壞金黃色葡萄球菌(Stap/zj/ococcwflwew)中的基因，而無需對基因進(jìn)行選擇。使用鎘誘導(dǎo)型啟動(dòng)子引導(dǎo)Ll丄trB內(nèi)含子在金黃色葡萄球菌中的表達(dá)；鎘誘導(dǎo)有利于獲得一個(gè)基因的插入突變體。在制備另一個(gè)基因的突變體時(shí)，所有經(jīng)檢測的克隆在缺少鎘的條件下均為內(nèi)含子插入陽性。Zhong等人(V"c/e/cAr/A7M.(2003)31:1656-64)描述了對II型內(nèi)含子的重新靶向進(jìn)行陽性篩選的方法，包含在II型內(nèi)含子中插入"逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座激活的選擇性標(biāo)記"或由包含T4噬菌體W內(nèi)含子的三甲氧芐二氨嘧啶(Tp)抗性盒組成的RAM。所述Tp抗性基因編碼II型二氫葉酸還原酶。所述W內(nèi)含子是I型內(nèi)含子，即能夠在其正確方向上對其所在的RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行自我剪接的自我催化型RNA元件。7^插入7)/的方向使得在基因轉(zhuǎn)錄時(shí)所述元件不會(huì)被剪接。因此，所得mRNA仍為突變體，而不會(huì)產(chǎn)生Tp抗性所需的蛋白質(zhì)。當(dāng)II型元件在重新靶向期間被轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)，RAM中的反向鏈以RNA的形式存在。在這種情況下，W元件的方向正確，并被剪接。結(jié)果，II型元件重新靶向染色體時(shí)，T)/基因已缺失其W插入，并具有功能性。結(jié)果，已成功發(fā)生重新對其進(jìn)行直接篩選。此方法已應(yīng)用于大腸桿菌細(xì)胞。梭菌通常具有三甲氧芐二氨嘧啶(trimethoprim)抗性，從而使得基于Tp抗性盒的RAM難以使用。例如，在Swenson等人的研究(Swenson""/(1980)J"^m'cra6.O^woAw.18:13—19)中，經(jīng)檢測的絕大部分分離菌均具有抗性。非致病性工業(yè)使用菌株也普遍具有抗性。實(shí)際上，在Jennert(2000)M/cra&o/ogv.146:3071-80中，纖維素分解梭菌(C.ce〃w/o/"/cMm)的內(nèi)在抗性構(gòu)成了基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)使用的接合方法的基礎(chǔ)。Sigma-Aldrich出售名為"TargeTronGeneKnockoutSystem"(TargeTronTM基因敲除系統(tǒng))的基于由卡那霉素抗性(KnO盒組成的RAM進(jìn)行基因敲除(主要在大腸桿菌中)的試劑盒。梭菌具有天然的卡那霉素抗性，因此在梭菌中不能將卡那霉素抗性作為選擇性標(biāo)記使用。無法通過交換標(biāo)記對梭菌基因組中的指定基因進(jìn)行敲除是對梭菌綱，特別是梭菌屬成員進(jìn)行商業(yè)開發(fā)的主要障礙。這對所有領(lǐng)域均有影響。因此，認(rèn)為目前尚不能應(yīng)用代謝工程產(chǎn)生具有改良發(fā)酵特征的工業(yè)菌株(例如，丙酮丁醇梭菌和丙酮-丁醇發(fā)酵過程)；不能產(chǎn)生在染色體上攜帶有用于癌癥治療的基因的菌株(臨床試驗(yàn)的先決條件，例如產(chǎn)孢梭菌(C^omge"M)和梭菌引導(dǎo)的酶前藥治療)；致病機(jī)理的基礎(chǔ)信息極少(例如艱難梭菌和需要住院治療的感染)，而這是設(shè)計(jì)有效對策的首要步驟。不應(yīng)將本說明書對在先公開文件的列出或討論視為所述文件是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或所述文件是公知常識(shí)。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了能夠?qū)NA有效地插入梭菌或其他梭菌綱細(xì)菌的基因組中，從而使所述基因組的基因產(chǎn)生靶向突變的DNA分子和方法。本發(fā)明的第一方面提供了DNA分子，其包含經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子，其不表達(dá)內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶，但在相對于經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的反方向上包含經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因，其中所述選擇性標(biāo)記基因包含選擇性標(biāo)記的編碼區(qū)域和可操作性地連接到所述區(qū)域的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子能夠?qū)е掠蓡慰截愡x擇性標(biāo)記基因編碼的選擇性標(biāo)記的表達(dá)，其表達(dá)量足以使所述選擇性標(biāo)記改變梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞的表型，從而使其能夠區(qū)別于不含所述選擇性標(biāo)記基因的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞；和10用于所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可操作性地與所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子相連；并且其中所述含經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因包含I型內(nèi)含子，從而中斷所述選擇性標(biāo)記的表達(dá)，其中所述I型內(nèi)含子位于相對于所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的正方向；和其中所述DNA分子容許從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本中除去所述I型內(nèi)含子，從而獲得所述選擇性標(biāo)記的編碼區(qū)域，并容許在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中DNA分子內(nèi)的位點(diǎn)插入所述RNA轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)。II型內(nèi)含子是在真細(xì)菌和細(xì)胞器中發(fā)現(xiàn)的移動(dòng)性遺傳元件。在自然界中，它們利用由核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物介導(dǎo)的遷移機(jī)制(稱作"逆轉(zhuǎn)錄歸巢"(retrohoming))，其中所述RNP復(fù)合物包含內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶(IERT)和切下的內(nèi)含子套索RNA。人們認(rèn)為切下的內(nèi)含子套索RNA通過逆剪接反應(yīng)直接插入到雙鏈DNA靶位點(diǎn)的一條鏈中，同時(shí)IERT也位點(diǎn)特異性地切割相對的另一條鏈，并將經(jīng)切割鏈的3'-末端用于插入的內(nèi)含子RNA的靶DNA引導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄(TPRT)。結(jié)果，將內(nèi)含子(以及經(jīng)修飾內(nèi)含子中攜帶的任意核酸)插入到耙DNA中。TPRT系統(tǒng)僅需要IERT和切下的內(nèi)含子RNA(參見SaldanhaWa/(1999)B/oc/^m/W^38,9069-卯83)。關(guān)于II型內(nèi)含子的詳細(xì)資料可在Karberga/(2001)A^/we所otec/mo/ogy19，1162-1167中找到，該文件通過弓I用并入本文，并在本文引用的參考文獻(xiàn)中。本領(lǐng)域中也將正RT稱作內(nèi)含子編碼的蛋白質(zhì)(IEP)。IEP(IERT)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性以及核酸內(nèi)切酶和成熟酶活性，能夠?qū)?nèi)含子克隆插入到DNA中。切割DNA底物并將其插入核酸分子的過程包括RNP復(fù)合物中II型內(nèi)含子RNA與DNA底物中特異區(qū)域的堿基配對。其他的相互作用發(fā)生在內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶和識(shí)別位點(diǎn)側(cè)翼的DNA底物區(qū)域之間。II型內(nèi)含子RNA通常具有兩條序列(EBS1和EBS2)，這兩條序列能夠與DNA底物上鏈中的兩個(gè)內(nèi)含子RNA結(jié)合序列(IBS1和IBS2)雜交。通常，II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶與底物識(shí)別位點(diǎn)的第一序列元件以及第二序列元件結(jié)合。II型內(nèi)含子RNA通常插入到DNA底物上鏈的切割位點(diǎn)。識(shí)別位點(diǎn)的第一序列元件位于推定切割位點(diǎn)IBS1序列以及IBS2序列的上游。所述第一序列元件包含約10約12個(gè)核苷酸對。識(shí)別位點(diǎn)的第二序列元件位于推定切割位點(diǎn)的下游，且包含約10約12個(gè)核苷酸如本文所示，位于切割位點(diǎn)上游的核苷酸相對所述切割位點(diǎn)的位置為負(fù)(-),位于切割位點(diǎn)下游的核苷酸相對所述切割位點(diǎn)的位置為正(+)。因此，所述切割位點(diǎn)位于雙鏈DNA底物上鏈中(-1)(+1)位核苷酸之間。相對所述切割位點(diǎn)，IBS1序列和IBS2序列位于由約(-1)位延伸至約(-14)位的識(shí)別位點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。EBS1通常位于II型內(nèi)含子RNA的域沖，并包含能夠與底物中IBS1序列的核苷酸雜交的約57個(gè)核苷酸。EBS2通常位于II型內(nèi)含子RNA的EBS1上游的域I中，并包含能夠與底物中的IBS2序列核苷酸雜交的約57個(gè)核苷酸。為了有效切割底物，優(yōu)選與II型內(nèi)含子RNA中EBS1的第一個(gè)核苷酸緊鄰的核苷酸或序列與底物上鏈的(+l)位核苷酸互補(bǔ)。本發(fā)明DNA分子中包含的經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子不表達(dá)IERT。優(yōu)選II型內(nèi)含子不包含功能性的正RT開放讀碼框。優(yōu)選地，通常包含IERT的II型內(nèi)含子的域IV被部分切除，從而使II型內(nèi)含子不含IERT。已知有多種II型內(nèi)含子可用于實(shí)施本發(fā)明。這些內(nèi)含子包括細(xì)菌內(nèi)含子，例如在綜述(DiaandZimmerly(2002)iVwc/efcJc/A30:1091-1102)中討論的真細(xì)菌內(nèi)含子，還包括在綜述(Zimmerly，HausnerandWu(2001)M/c/e/cA油i^29:1238-1250)中引用的線粒體內(nèi)含子和葉綠體內(nèi)含子。優(yōu)選所述II型內(nèi)含子為乳酸乳球菌的II型內(nèi)含子Ll丄trB(Mohr"fl/(2000)，如上)。此II型內(nèi)含子中的IERT是LtrA蛋白質(zhì)。釀酒酵母(&cc/MfrawyceycewvWae)的核苷整合酶all和al2也是適合的。另一個(gè)選擇是來自梭菌接合轉(zhuǎn)座子Tn5397的II型內(nèi)含子(Roberts""/(2001)J.BacteWo/.183:1296-1299)。LtrARNP復(fù)合物包含乳酸乳球菌LtrB基因的切下的野生型或切下的經(jīng)修飾的Ll丄trB型II型內(nèi)含子RNA(下文稱為"Ll丄trB內(nèi)含子"RNA)，以及野生型或修飾的Ll丄trB內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶(稱作LtrA蛋白)。Ll丄trB內(nèi)含子RNA的EBS1包含7個(gè)核苷酸，并位于457463位。野生型Ll丄trB內(nèi)含子RNA的EBS1序列具有5'-GUUGUGG(SEQIDNo.1)的序列。Ll丄trB內(nèi)含子RNA的EBS2包含6個(gè)核苷酸，并位于401406位(包含406位)。野生型Ll丄trB內(nèi)含子RNA的EBS2序列具有5'AUGUGU(SEQIDNo.2)的序列。本發(fā)明DNA分子中的II型內(nèi)含子經(jīng)過修飾而包含經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因是能夠向表達(dá)所述基因的細(xì)菌細(xì)胞賦予不同于不表達(dá)所述基因的細(xì)菌細(xì)胞的變化表型的任意基因。所述經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因是通過包含中斷所述選擇性標(biāo)記表達(dá)的I型內(nèi)含子而被修飾的(與未經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因相比)。術(shù)語"未經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因"包括包含啟動(dòng)子和基因編碼區(qū)的基因，其中所述啟動(dòng)子不是天然存在的基因的啟動(dòng)子。"未經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因"還包括其中所述啟動(dòng)子是天然存在基因的啟動(dòng)子的情況。下文描述了對選擇性標(biāo)記基因進(jìn)行修飾的更多詳細(xì)資料，但其本質(zhì)在于I型內(nèi)含子的存在阻止選擇性標(biāo)記的表達(dá)，但是切除I型內(nèi)含子獲得的核酸(即，未經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因)能夠表達(dá)所述選擇性標(biāo)記。優(yōu)選所述選擇性標(biāo)記基因位于II型內(nèi)含子的域IV中。可以理解，只要I型內(nèi)含子的存在能阻止選擇性標(biāo)記的表達(dá)，則所述I型內(nèi)含子可位于所述選擇性標(biāo)記基因內(nèi)的任何位置?？梢岳斫?，所述I型內(nèi)含子可位于如在啟動(dòng)子內(nèi)，例如位于啟動(dòng)子元件的(-10)(-35)位之間，位于啟動(dòng)子和編碼區(qū)之間，或位于編碼區(qū)內(nèi)?？蓪琁型內(nèi)含子的選擇性標(biāo)記基因(即，經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因)視為被逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座激活的標(biāo)記(RAM)。I型內(nèi)含子是自我剪接的內(nèi)含子，對其剪切可能需要或不需要例如蛋白質(zhì)的輔助因子。已知可用于實(shí)施本發(fā)明的多種I型內(nèi)含子包括噬菌體內(nèi)含子(SandegranandSj6berg(2004)乂5"/.C/^肌279:22218-22227)，和四膜蟲I型內(nèi)含子(Roman(1998)祝oc/2em.95:2134-2139)。優(yōu)選不需要輔助因子即可對其剪接的I型內(nèi)含子。優(yōu)選所述I型內(nèi)含子是來自噬菌體T4的I型內(nèi)含子td(EhrenMand(1986)淑/.加d5W.園83:5875-5879).可以理解，DNA分子中各個(gè)成分的方向非常重要。因此，由圖2可見，經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因在n型內(nèi)含子中存在的方向與n型內(nèi)含子相反。此外，i型內(nèi)含子在n型內(nèi)含子中存在的方向與選擇性標(biāo)記基因相反，而與ii型內(nèi)含子相同。如果i型內(nèi)含子與選擇性標(biāo)記基因的方向相同，那么無論包含選擇性標(biāo)記的ii型內(nèi)含子是否已重新靶向到染色體中，所述內(nèi)含子都將能夠從所述選擇性標(biāo)記基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本中切除掉，并出現(xiàn)由選擇性標(biāo)記基因賦予的表型。因此，I型內(nèi)含子和選擇性標(biāo)記基因的方向必須相反。如果選擇性標(biāo)記基因的方向與n型內(nèi)含子相同，按照上述邏輯，i型內(nèi)含子的方向必須與II型內(nèi)含子相反。然而，在這個(gè)方向上I型內(nèi)含子將不會(huì)從mRNA轉(zhuǎn)錄本上切除，這樣即便II型內(nèi)含子確實(shí)重新靶向到染色體，也不會(huì)出現(xiàn)可選擇的表型。只有各個(gè)成分的方向如圖2所示時(shí)，n型內(nèi)含子重新靶向到染色體才是選擇性標(biāo)記表型表達(dá)的充要條件。將本發(fā)明的DNA分子用于向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中的DNA分子的位點(diǎn)引入核酸分子時(shí)(如下文詳述)，I型內(nèi)含子從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本中被除去，獲得編碼所述選擇性標(biāo)記的區(qū)域，并將所得的RNA轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)引入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中DNA分子內(nèi)的位點(diǎn)。這樣被引入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞的DNA分子中的核酸具有能夠在所述細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)所述選擇性標(biāo)記的選擇性標(biāo)記基因。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的側(cè)翼具有外顯子，其中外顯子允許對I型內(nèi)含子RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行剪接。所述選擇性標(biāo)記基因的啟動(dòng)子能夠引起由單拷貝選擇性標(biāo)記基因編碼的選擇性標(biāo)記的表達(dá)，其表達(dá)量足以使所述選擇性標(biāo)記改變梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞的表型，從而使其能夠區(qū)別于不含所述選擇性標(biāo)記基因的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞。例如，所述啟動(dòng)子可以是，在以單拷貝存在于細(xì)菌染色體并且可操作性地連接到選擇性標(biāo)記的編碼區(qū)時(shí)，以可檢測的量表達(dá)所述選擇性標(biāo)記的一個(gè)啟動(dòng)子。所述選擇性標(biāo)記基因的啟動(dòng)子是，在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中具有功能性，并如上所述，在以單拷貝存在時(shí)能夠引發(fā)充分表達(dá)的一個(gè)啟動(dòng)子。優(yōu)選所述啟動(dòng)子在梭菌中具有功能性。適合的啟動(dòng)子包括產(chǎn)氣莢膜梭菌的/血基因的啟動(dòng)子(Takamizawad(2004)iVote/wEx;/mw7'o"P,ycaft'ow36:70-75);丙酮丁醇梭菌的/^、決/和"A啟動(dòng)子(Tummala"a/(1999)々取￡"v/ra".Af/craWo/.65:3793-3799)以及產(chǎn)氣莢膜梭菌的c/e啟動(dòng)子(Melville,LabbeandSonenshein(1994)/w/ec^waw//wmwmXv62:5550-5558)，以及丙酮丁醇梭菌的硫解酶啟動(dòng)子(Winzerda/(2000)JMo/.M/cra6/o/.所ofec^wo/.2:531-541)。優(yōu)選所述選擇性標(biāo)記基因的啟動(dòng)子是丙酮丁醇梭菌的A/啟動(dòng)子。為了檢測啟動(dòng)子是否可能作為本發(fā)明選擇性標(biāo)記的有效啟動(dòng)子，可將RAM的剪接變體(g卩，在I型內(nèi)含子被除去后編碼選擇性標(biāo)記)置于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控下，并以低拷貝數(shù)引入到待耙定的梭菌中，其中優(yōu)選其拷貝數(shù)與染色體的拷貝數(shù)相等。這可以通過使用低拷貝數(shù)質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)，例如在Swinfield"(1990)Gene87:79-90中描述的質(zhì)粒pAM(31的低拷貝衍生物，或更理想地，使用接合轉(zhuǎn)座子，方法如Mullany等(戶/osmW(1994)31:320-323)和Roberts等人(/M/cra&o/MeAoA(2003)55:617-624)所述。為了實(shí)現(xiàn)后者，將剪接的RAM與待評估的啟動(dòng)子一起克隆到不能在革蘭氏陽性菌中復(fù)制，但攜帶抗生素抗性基因(例如cWP)以及衍生自接合轉(zhuǎn)座子(例如Tn9M)的DNA片段的載體中。隨后，將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因組中帶有適合的接合轉(zhuǎn)座子(Tn976)的枯草芽孢桿菌(5acz7/^w^7&)細(xì)胞中，并在包含氯霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化體。由于所述質(zhì)粒不能復(fù)制，能產(chǎn)生氯霉素抗性克隆的唯一途徑是通過Tn976與質(zhì)粒攜帶的同源區(qū)之間的同源重組將所述質(zhì)粒整合進(jìn)入基因組。其結(jié)果在基因組中產(chǎn)生了單拷貝的、攜帶剪接的RAM以及待檢測啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)座子::質(zhì)粒共合體(cointegrate)。此時(shí)，可將獲得的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接合子(transconjugant)用作與待靶定梭菌接合的供體。在此類接合配對(mating)中，可基于獲得甲砜氯霉素抗性篩選轉(zhuǎn)入了轉(zhuǎn)座子::質(zhì)粒共合體的梭菌受體。一旦獲得具有所述抗性的梭菌受體，轉(zhuǎn)移接合子即可通過RAM編碼的抗性(例如紅霉素抗性)進(jìn)行檢測。調(diào)控經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可以是在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中具有功能的任何適合的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?？蓪φT導(dǎo)型啟動(dòng)子去阻遏化，這樣即可以組成型的方式驅(qū)動(dòng)表達(dá)。在實(shí)施例中描述的特定試驗(yàn)中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與組成型表達(dá)相比，經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的調(diào)控表達(dá)并沒有給予高內(nèi)含子插入頻率的優(yōu)點(diǎn)。然而，在其他情況下，能夠調(diào)控經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的表達(dá)可能是有用的。普通技術(shù)人員能夠進(jìn)行試驗(yàn)以確定特定的啟動(dòng)子是否能夠獲得滿意的內(nèi)含子插入率。Girbald(2003)」p;/.Af/craWo/.69:4985畫4988描述了優(yōu)選的丙酮丁醇梭菌的木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是基于木糖葡萄球菌(Stap/^/ococc^的木糖操縱子啟動(dòng)子-阻遏物調(diào)控系統(tǒng)。適合的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可由IPTG或木糖誘導(dǎo)。例如，將所述DNA分子用于梭菌細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子是受大腸桿菌/"c操縱子的lac操縱區(qū)調(diào)控的巴斯德梭菌(C.15;^Wem^m^)鐵氧化還原蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域，這非常方便。便利的是，所述DNA分子可進(jìn)一步包含大腸桿菌的/^/基因。調(diào)控經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子。技術(shù)人員可以理解，通常所有啟動(dòng)子均受到某種條件的調(diào)控，即便該條件尚不為人知。因此，我們希望將"組成型啟動(dòng)子"廣義地解釋為包括在重新靶向方法采用的正常培養(yǎng)條件下，在梭菌細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子，而無需添加試劑以激活所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。對初級代謝非常重要的基因的啟動(dòng)子可以是適合的"組成型啟動(dòng)子"。例如，實(shí)施例中描述的硫解酶啟動(dòng)子A/可以是適合的啟動(dòng)子。其他適合的啟動(dòng)子是丙酮丁醇梭菌的啟動(dòng)子Md、cW、W/4、e(/B和6c^(AlsakerandPapoutsakis(2005)J5acfen'o/187:7103-7118)。被認(rèn)為適合驅(qū)動(dòng)RAM中經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記表達(dá)的啟動(dòng)子也是適合的。使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠在將RAM重新靶向到細(xì)菌染色體后，關(guān)閉II型內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄，其中所述II型內(nèi)含子包含被I型內(nèi)含子破壞的選擇性標(biāo)記基因(可稱為RAM)。當(dāng)從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄RAM時(shí)，選擇性標(biāo)記的表達(dá)是無效的。這可能是因?yàn)樵趶娜旧w轉(zhuǎn)錄的編碼鏈轉(zhuǎn)錄本以及從DNA分子轉(zhuǎn)錄的非編碼鏈轉(zhuǎn)錄本之間形成雙鏈的緣故。本發(fā)明的DNA分子優(yōu)選能夠在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。更優(yōu)選能夠進(jìn)行條件復(fù)制。便利的是，所述DNA分子包含適合的復(fù)制起點(diǎn)，以及在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制所必須的任何復(fù)制基因(即適合的rw基因)。優(yōu)選所述DNA是質(zhì)粒。所述DNA也可以是線性的，或者可以是如M13的絲狀噬菌體。便利的是所述DNA分子是穿梭載體，其可以在如大腸桿菌的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制并增殖，并可以在革蘭氏陽性細(xì)胞中復(fù)制，特別是梭菌綱，更特別是梭菌屬的細(xì)胞。此外或可選地，本發(fā)明的DNA分子包含容許從一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的區(qū)域。特別優(yōu)選DNA分子包含容許在大腸桿菌和梭菌綱細(xì)菌之間，更特別地在大腸桿菌和梭菌屬細(xì)菌之間進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的區(qū)域。例如，DNA分子可包含onT(轉(zhuǎn)移起點(diǎn))區(qū)，包括fraJ基因。Davis,I,Carter,GYoung,MandMinton，NP(2005)"GeneCloninginC7ostnW/a"，In:HandbookonC7osfnV^a(DurreP,ed)37-52頁,CRCPress,BocaRaton，USA提供了對梭菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化和接合的方法。選擇性標(biāo)記可以是能夠在梭菌綱細(xì)胞中表達(dá)，并能夠用于篩選包含選擇16性標(biāo)記的梭菌綱細(xì)胞的任何適合的選擇性標(biāo)記。適合的選擇性標(biāo)記包括對毒素解毒的酶，例如前藥轉(zhuǎn)化酶。選擇性標(biāo)記還包括原養(yǎng)基因(在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型突變體中使用)。優(yōu)選選擇性標(biāo)記是向表達(dá)所述選擇性標(biāo)記的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞提供生長優(yōu)勢的標(biāo)記。因此，在給定生長條件下，與不表達(dá)選擇性標(biāo)記的同類細(xì)胞相比，表達(dá)選擇性標(biāo)記的細(xì)菌細(xì)胞通常能夠生長(或生長較快)。合適的選擇性標(biāo)記包括抗生素抗性因子。因此，合適的選擇性標(biāo)記基因是向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞賦予抗生素抗性的基因。并非所有的抗生素抗性基因均可用于所有梭菌綱細(xì)胞中。例如，梭菌具有天然的卡那霉素抗性，并常具有三甲氧芐二氨嘧啶抗性。因此，優(yōu)選選擇性標(biāo)記基因不是卡那霉素抗性基因或三甲氧芐二氨嘧啶抗性基因，特別是在所述細(xì)菌細(xì)胞是梭菌屬的情況下。適合用于梭菌細(xì)胞(例如梭菌)的抗生素抗性基因包括紅霉素抗性基因(例如五rm)和氯霉素抗性基因(例如mW)。另一種適合的抗生素抗性基因是te^M，例如來自糞腸球菌(五wferacocc^Tn916接合轉(zhuǎn)座子的fdM(Roberts""/(2001)M/craZ)/o/.147:1243-1251)。另一種廣泛用于梭菌綱細(xì)菌的適合的抗生素抗性基因是壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶aafif(Charpentierd(2004)々p/.￡"v/ra".M^raWo/.70,6076-6085)。本發(fā)明的方法和DNA分子也可用于研究功能未知的基因。例如，對本發(fā)明的DNA分子進(jìn)行改造以包含將被引入到梭菌綱細(xì)胞DNA中的獨(dú)特寡核苷酸序列(稱作標(biāo)簽)?？杀憷禺a(chǎn)生分別包含不同標(biāo)簽序列的多個(gè)本發(fā)明DNA分子。當(dāng)所述DNA插入到細(xì)菌染色體時(shí)，標(biāo)簽存在于基因組DNA中，并可通過如擴(kuò)增、與標(biāo)記寡核苷酸探針雜交而被檢測出來，其中所述標(biāo)記寡核苷酸探針的一部分具有與所述標(biāo)簽的一部分互補(bǔ)的序列。適合的標(biāo)簽、探針以及擴(kuò)增和雜交方法描述于Hensel"(1995)5We"ce269:400-403中。通過本發(fā)明的方法可產(chǎn)生大量突變體，其中每個(gè)突變體都具有插入到不同基因中的DNA，并且每個(gè)突變體都可通過其獨(dú)特的標(biāo)簽鑒定。通常，各個(gè)不同的重新靶向核酸都包含使其靶向梭菌綱細(xì)胞DNA中的不同基因的靶向部分?？蓪⒍鄠€(gè)突變體引入到環(huán)境中一段時(shí)間內(nèi)。隨后，從所述環(huán)境中回收突變體。在回收的突變體庫中檢測各個(gè)標(biāo)簽的能力產(chǎn)生了關(guān)于特定突變體是否能夠與其他突變體一樣地生長或生存的指標(biāo)。這樣，可能鑒定出在所述環(huán)境中生長或生17存所需的基因。Hensel等人(1995;如上)使用類似的方法鑒定了沙門氏菌的毒力基因。在改進(jìn)的上述方法中，可產(chǎn)生具有相同的標(biāo)簽但不同的隨機(jī)II型內(nèi)含子靶向部分以及相應(yīng)的外顯子序列的本發(fā)明DNA分子，收集并將其用于制備細(xì)菌突變體。WO01/29059描述了具有隨機(jī)耙向部分的II型內(nèi)含子。大部分DNA分子不會(huì)插入到細(xì)菌基因組的任何位置。然而，在靶向部分序列的控制下，一些DNA分子可能會(huì)插入到細(xì)菌基因組中的未知位點(diǎn)。在本方法中可使用足夠大的本發(fā)明DNA分子庫，從而獲得DNA插入到其染色體的一個(gè)或多個(gè)克隆?？珊Y選出單個(gè)克隆?？墒褂镁哂胁煌?dú)特標(biāo)簽的本發(fā)明DNA分子庫重復(fù)該過程，從而獲得具有獨(dú)特標(biāo)簽的另一個(gè)單突變細(xì)菌克隆。這樣，可產(chǎn)生分別具有獨(dú)特標(biāo)簽的多個(gè)細(xì)菌突變體。如上所述，可將多個(gè)突變體暴露于環(huán)境中，從而鑒定影響在所述環(huán)境中生長或生存的特定突變。隨后，表征由此篩選鑒定的突變體，從而鑒定DNA插入到哪個(gè)基因中。下文給出了關(guān)于編碼經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記的基因的更多細(xì)節(jié)，其中所述基因包含破壞所述選擇性標(biāo)記表達(dá)的I型內(nèi)含子。選擇性標(biāo)記基因或其編碼區(qū)可與DNA區(qū)域連接，例如在其側(cè)翼具有容許在并入到染色體后切除選擇性標(biāo)記基因或其編碼區(qū)的DNA區(qū)域。因此，可篩選出表達(dá)選擇性標(biāo)記的突變梭菌細(xì)胞克隆，并對其進(jìn)行操作從而除去選擇性標(biāo)記基因?？墒褂弥亟M酶切除所述DNA區(qū)域。重組酶通常識(shí)別位于被切除區(qū)域側(cè)翼的特定DNA序列。Cre重組酶或FLP重組酶是優(yōu)選的重組酶。也可以使用具有極罕見切割位點(diǎn)的限制性酶，從而在限制位點(diǎn)切割的DNA分子，其中將所述限制位點(diǎn)引入到選擇性標(biāo)記基因或其編碼區(qū)的側(cè)翼。優(yōu)選的限制性酶是I-SceI。已將選擇性標(biāo)記基因切除的突變細(xì)菌細(xì)胞保留了II型內(nèi)含子插入。因此，具有選擇性標(biāo)記基因的插入或不具有選擇性標(biāo)記基因的插入的突變細(xì)胞，具有相同的表型。由于此類突變細(xì)菌細(xì)胞在于RAM中不含選擇性標(biāo)記基因，可通過本發(fā)明的方法對其進(jìn)行進(jìn)一步的突變。盡管本發(fā)明DNA分子中的經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子不表達(dá)IERT，該DNA分子可方便地在其他位點(diǎn)包含能夠表達(dá)IERT的基因。如果待插入II型內(nèi)含子的梭菌細(xì)胞使用的遺傳密碼不同于所述II型內(nèi)含子以及其相關(guān)n型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選對n型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的序列進(jìn)行修飾，使其包含與宿主細(xì)胞遺傳密碼對應(yīng)的密碼子。在本發(fā)明的特別理想的實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的n型內(nèi)含子包含耙向部分。所述靶向部分通常容許將經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本插入到梭菌細(xì)胞的DNA分子內(nèi)的位點(diǎn)中。所述位點(diǎn)通常是經(jīng)選擇的位點(diǎn)，并且對所述經(jīng)修飾的n型內(nèi)含子的靶向部分進(jìn)行選擇，使其耙向所述經(jīng)選擇的位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述經(jīng)選擇的位點(diǎn)位于梭菌細(xì)胞的染色體DNA中。所述經(jīng)選擇的位點(diǎn)通常位于特定基因中，或位于影響特定基因表達(dá)的DNA部分中。在此類位點(diǎn)插入經(jīng)修飾的n型內(nèi)含子通常會(huì)中斷基因的表達(dá)并導(dǎo)致表型的改變。出于代謝工程的目的，可選擇進(jìn)行突變的基因。例如，在如熱解糖梭菌(T7z^7W6)a"aero6ac&n'MW■sacc/wrofydcww)或具有類"[以f^i;IK乍用的梭菌綱其他成員的生物體中，可通過刪除乳酸脫氫酶或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶分別阻止乳酸鹽(酯)或乙酸鹽(酯)的形成，從而用于提高乙醇的水平(Desai"a/.(2004)如/緣油'o/胸gc/mo/.65:600-5)。在生產(chǎn)溶劑的梭菌(例如丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌)中，可以特異性地刪除編碼負(fù)責(zé)產(chǎn)生溶劑和酸的酶的基因，以此作為使丙酮和丁醇最大化生產(chǎn)的方式(參見JonesandWoods(1986)M/cro^'o/iw.50:484-524)。因此，通過刪除負(fù)責(zé)產(chǎn)生乙酸鹽(酯)的酶(磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和/或乙酸激酶)、產(chǎn)生丁酸鹽(酯)的酶(磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶和/或丁酸激酶)、產(chǎn)生丁醇的酶(丁醇脫氫酶A和/或丁醇脫氫酶B)和/或產(chǎn)生丙酮的酶(乙酰乙酸脫羧酶和/或乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶)，從而產(chǎn)生僅生成丙酮或丁醇的菌株。此外，通過向染色體中添加基因可拓展所述菌株的發(fā)酵能力，這樣即可降解新的底物(糖、木質(zhì)纖維素、半纖維素等)和/或制備新的終產(chǎn)物(異丙醇、1,3-丙二醇等)?？蛇x擇性地突變基因，從而測定其編碼產(chǎn)物在毒力中的作用，這是開發(fā)疫苗及其他對策的先決條件。例如，在艱難梭菌中，由于此前不能產(chǎn)生等基因突變體，尚不確定毒素A和毒素B(CdtA和CdtB)的相對作用(BongaertsandLyerly(1994)A//cra6/"/17:1-12)。某些菌株(Perellea/(1994)/^k^/wmww.65:1402-1407)還產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白特異的ADP核糖轉(zhuǎn)移酶CDT(CdtA和CdtB)。毫無疑問，其他因子也會(huì)產(chǎn)生毒力，特別是在初始定植過程中。現(xiàn)己提出有多個(gè)基因產(chǎn)物參與(Tasteyred"/(2001)/w/e"/附/m/"69:7937—7940;Calabi"a/(2002)/"/e"/附mw"70:5770-5778;Calabid(2001)/"々"/附ww"69:2144"2153)，包括與粘附、S層蛋白(SplA)以及遷移性(FliC和FliD)有關(guān)的那些基因。迄今為止，尚不能通過產(chǎn)生突變體獲得這些因子參與疾病的明確證據(jù)。梭菌綱中很多細(xì)菌的基因組DNA序列是已知的。例如，丙酮丁醇梭菌(ATCC824(GenBank登錄號AE001437))、艱難梭菌(GenBank登錄號AM180355)、破傷風(fēng)梭菌(C.^towOE88(GenBank登錄號AEO15927)以及產(chǎn)氣莢膜梭菌13(GenBank登錄號BA000016)和肉毒梭菌的基因組DNA序列都是己知的。產(chǎn)孢梭菌的基因組序列是部分已知的，并且與肉毒梭菌的基因組序列非常類似。據(jù)此信息能夠容易地確定插入位點(diǎn)，例如在開放讀碼框之內(nèi)確定插入位點(diǎn)。優(yōu)選本發(fā)明的DNA分子包含具有靶向部分的經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子，所述DNA分子將所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)靶向到這些細(xì)菌之一的基因組的基因中。如上所述，天然的II型內(nèi)含子包含將所述內(nèi)含子耙向到靶DNA中特異序列的區(qū)域。因?yàn)橥ㄟ^DNA底物的識(shí)別位點(diǎn)與RNP復(fù)合物中切下的II型內(nèi)含子RNA的堿基配對，可以部分地識(shí)別DNA底物的識(shí)別位點(diǎn)，所以能夠控制DNA底物中的核酸插入位點(diǎn)。這可以通過對EBS1序列、EBS2序列或S序列或其組合進(jìn)行修飾而完成。由此類經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子產(chǎn)生的RNP復(fù)合物能夠在基因組中的新識(shí)別位點(diǎn)切割DNA底物并插入核酸分子。例如，可參考圖1A和圖lB所示的乳酸乳球菌的II型內(nèi)含子Ll丄trB，修飾EBS1、EBS2和S，從而允許經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本與靶位點(diǎn)進(jìn)行堿基配對。Mohr"(2000)&Z)eve/o;we"f14，559-573描述了II型內(nèi)含子Ll丄trB的、能夠?qū)⑺鰞?nèi)含子重新靶向到特異DNA序列的DNA靶位點(diǎn)識(shí)別規(guī)則，所述文件通過引用并入本文。Perutka"a/(2004)JAfo/.歷o/.336,421-429還描述了靶向部分的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，所述文件通過引用并入本文。俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)(OhioStateUniversityResearchFoundation)的WO01/29059描述了基于篩選的方法，其中將期望的DNA靶位點(diǎn)克隆到受體載體中，使其位于無啟動(dòng)子的tef基因的上游，所述文件通過引用并入本文。從具有隨機(jī)靶向部分(EBS和5)以及IBS外顯子序列的組合供體庫中篩選插入到所述位點(diǎn)的內(nèi)含子。經(jīng)修飾的Ll丄trB內(nèi)含子包含異源啟動(dòng)子，這樣當(dāng)所述內(nèi)含子插入到受體載體的靶位點(diǎn)時(shí)，tetR基因可得到轉(zhuǎn)錄，包含所述載體的細(xì)菌細(xì)胞即可被篩選出來?？赏ㄟ^PCR確定經(jīng)修飾的內(nèi)含子的序列。因此，可分離出能夠插入到梭菌細(xì)胞的耙DNA位點(diǎn)的經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子DNA。在II型內(nèi)含子Ll丄trB的情況下，認(rèn)為5區(qū)域與耙DNA中5'區(qū)域的相互作用對II型內(nèi)含子的有效逆轉(zhuǎn)錄歸巢并不重要。然而，內(nèi)含子RNA中EBS2和EBS1之間的相互作用，以及靶DNA中IBS2和IBS1之間的相互作用，則更為重要。將II型內(nèi)含子從RNA轉(zhuǎn)錄本切除時(shí)，認(rèn)為所述II型內(nèi)含子與側(cè)翼外顯子RNA的部分進(jìn)行瞬時(shí)的堿基配對。特別地，EBS2和EBS1區(qū)域分別與5'外顯子的IBS2和IBS1區(qū)域發(fā)生堿基配對。因此，優(yōu)選修飾5'外顯子的IBS2和IBS1區(qū)域，從而增強(qiáng)其與內(nèi)含子RNA中經(jīng)修飾的EBS2和EBS1區(qū)域的堿基配對。這有利于從其RNA轉(zhuǎn)錄本中有效地切除II型內(nèi)含子?？煞奖愕乩帽绢I(lǐng)域已知的任何適合的定點(diǎn)誘變方法進(jìn)行EBS2和EBS15位點(diǎn)以及IBS2IBS1位點(diǎn)的修飾，例如使用寡核苷酸定點(diǎn)誘變法或基于PCR的方法。本發(fā)明的DNA分子通常能夠表達(dá)不同于選擇性標(biāo)記的抗生素抗性標(biāo)記。例如，如果選擇性標(biāo)記基因是第一抗生素抗性基因，則所述DNA包含第二抗生素抗性基因。特別優(yōu)選兩個(gè)抗生素抗性基因都是能夠在梭菌細(xì)胞中產(chǎn)生抗生素抗性的基因。例如，所述DNA分子中的選擇性標(biāo)記基因可以是紅霉素抗性基因，并且所述DNA分子還包含氯霉素抗性基因(反之亦然)。所述DNA分子用于梭菌時(shí)，特別優(yōu)選任意的抗生素抗性基因選自紅霉素抗性基因(例如wmS)或氯霉素抗性基因(例如c"W)?？梢岳斫猓M管可以方便地使本發(fā)明的DNA分子本身包含能夠表達(dá)IERT的基因，但也可以在單獨(dú)的DNA分子上提供。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明第一方面的DNA分子以及能夠表達(dá)IERT的單獨(dú)的DNA分子的試劑盒。所述DNA分子通常是質(zhì)粒，優(yōu)選可以兼容質(zhì)粒?？梢岳斫?，所述試劑盒還可包含能夠表達(dá)lac阻遏蛋白的DNA分子(通常是質(zhì)粒)。在本發(fā)明的DNA分子包含可操作性地連接到II型內(nèi)含子的IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，但本發(fā)明的DNA分子不包含/""基因的情況下，這是有用的。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了將核酸分子引入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中的DNA分子的位點(diǎn)的方法，所述方法包括以下歩驟(i)向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞提供本發(fā)明的DNA分子以及能夠表達(dá)II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA分子；和(ii)培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)條件容許從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本中除去I型內(nèi)含子，并將包含選擇性標(biāo)記基因的所述RNA轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)插入到所述位點(diǎn)。優(yōu)選在容許表達(dá)選擇性標(biāo)記的條件下培養(yǎng)梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞。通?；谶x擇性標(biāo)記賦予的變化表型來選擇已經(jīng)將核酸分子引入到細(xì)胞內(nèi)DNA分子的位點(diǎn)的梭菌目細(xì)菌細(xì)胞(即突變細(xì)胞)。便利地，所述選擇性標(biāo)記是抗生素抗性標(biāo)記，并基于在存在相關(guān)抗生素的條件下的生長能力選擇突變的梭菌細(xì)胞。便利地，克隆所選的細(xì)胞并獲得細(xì)胞的單克隆。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了將核酸分子靶向到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中DNA分子的選定位點(diǎn)的方法，所述方法包括向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞提供本發(fā)明的DNA分子以及能夠表達(dá)II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA分子，其中在本發(fā)明的DNA分子中，經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子包含靶向部分；并培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)條件容許從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本中除去I型內(nèi)含子，并將包含選擇性標(biāo)記基因的所述RNA轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)插入到所述位點(diǎn)內(nèi)?？梢岳斫猓@樣可能在梭菌綱(例如梭菌)細(xì)菌細(xì)胞的DNA(例如基因組)中產(chǎn)生定點(diǎn)突變。通過本發(fā)明的方法獲得的梭菌綱的突變細(xì)菌細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分?？梢岳斫猓诒景l(fā)明的所有方面中，優(yōu)選的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞是梭菌。特別優(yōu)選梭菌細(xì)胞是熱纖梭菌、丙酮丁醇梭菌、艱難梭菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、產(chǎn)孢梭菌、拜氏梭菌、破傷風(fēng)梭菌、C."http://"(>;"^附或腐敗梭菌(CM/^^m)。梭菌細(xì)胞也可以是熱解糖梭菌，這是用于工業(yè)乙醇生產(chǎn)的重要菌種。術(shù)語"梭菌"還包含羅斯氏菌屬(i^W"n'a)，例如益生菌io^)訓(xùn)'a/teW>^to。因此，優(yōu)選本發(fā)明DNA分子中的選擇性標(biāo)記基因是能夠用于在這些菌種中進(jìn)行篩選的基因(例如，紅霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四22環(huán)素抗性基因或壯觀霉素抗性基因)。還優(yōu)選本發(fā)明的DNA分子包含復(fù)制起點(diǎn)，以及在這些菌種中進(jìn)行復(fù)制所必須的任何復(fù)制基因。本發(fā)明的一個(gè)特別特點(diǎn)是經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因包含中斷所述選擇性標(biāo)記表達(dá)的I型內(nèi)含子。所述選擇性標(biāo)記是能夠在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，并可用于篩選梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞，特別是梭菌細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。特別優(yōu)選所述選擇性標(biāo)記是可用于篩選梭菌的抗生素抗性基因。本發(fā)明的另一方面提供了包含經(jīng)修飾的紅霉素抗性基因的DNA分子，其中所述經(jīng)修飾的紅霉素抗性基因包含I型內(nèi)含子。本發(fā)明的另一方面提供了包含經(jīng)修飾的氯霉素抗性基因的DNA分子，其中所述經(jīng)修飾的氯霉素抗性基因包含I型內(nèi)含子。本發(fā)明的另一方面提供了包含經(jīng)修飾的四環(huán)素抗性基因的DNA分子，其中所述經(jīng)修飾的四環(huán)素抗性基因包含I型內(nèi)含子。本發(fā)明的另一方面提供了包含經(jīng)修飾的壯觀霉素抗性基因的DNA分子，其中所述經(jīng)修飾的壯觀霉素抗性基因包含I型內(nèi)含子。本發(fā)明還包含存在于宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌或梭菌綱細(xì)胞)中的這些DNA分子。優(yōu)選I型內(nèi)含子存在的方向與抗生素抗性基因的方向相反。I型內(nèi)含子可以出現(xiàn)在抗生素抗性基因內(nèi)的任何位置，例如在編碼區(qū)，從而中斷翻譯，或在編碼區(qū)上游，從而中斷轉(zhuǎn)錄或翻譯。I型內(nèi)含子在抗生素抗性基因內(nèi)的存在形式使得所述內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后，能夠?qū)⑵浔旧韽腞NA轉(zhuǎn)錄本上切除(剪接)?？蓪⒈景l(fā)明的I型內(nèi)含子取代為能夠以方向依賴的方式從較大RNA上自我剪接的任何自催化RNA?？蛇m宜地使用"IStron"，人們認(rèn)為這是I型內(nèi)含子與IS元件的融合體(HaselmayerWa/(2004)^"aeraZe10:85-92;Bannam"a/(2000)Mo/.Mk油'o/.36:1447-1459)。為了避免疑問，處于本發(fā)明的所有方面的目的，認(rèn)為能夠以方向依賴的方式從較大RNA上自我剪接的任何自催化RNA均為I型內(nèi)含子，無論其是否需要輔助因子。優(yōu)選不需要輔助因子的I型內(nèi)含子。優(yōu)選I型內(nèi)含子不編碼內(nèi)含子編碼的蛋白質(zhì)，例如內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶。這一特征防止切下的I型內(nèi)含子重新插入到細(xì)菌基因組內(nèi)的其他位點(diǎn)。23應(yīng)注意到，I型內(nèi)含子(例如噬菌體T4的td內(nèi)含子)的剪接通常依賴于插入點(diǎn)側(cè)翼的外顯子序列。因此，本發(fā)明的經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因(以及特別是在本發(fā)明此方面中，編碼紅霉素抗性和氯霉素抗性和四環(huán)素抗性和壯觀霉素抗性的經(jīng)修飾的抗生素抗性基因)包含的I型內(nèi)含子被插入到側(cè)翼為適合的外顯子序列的位點(diǎn)，從而容許將所述I型內(nèi)含子從RNA轉(zhuǎn)錄本切除，并且其中所得的剪接轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)編碼有功能的選擇性標(biāo)記(例如，功能性紅霉素抗性或氯霉素抗性)。適合于I型內(nèi)含子的側(cè)翼序列是已知的。例如，就噬菌體T4的I型內(nèi)含子td而言，內(nèi)含子之前通常為G殘基(即，出現(xiàn)在內(nèi)含子的5')，而內(nèi)含子之后通常為5'-ACCCAAGAGA-3'序列(SEQIDNo.3)(即出現(xiàn)在內(nèi)含子的3')。內(nèi)含子之后也可以是5'-ACCCAAGAA-3'序列(SEQIDNo.4)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記(例如，紅霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因或壯觀霉素抗性基因)的編碼區(qū)在內(nèi)含子的側(cè)翼包含適合的序列。就td內(nèi)含子以及組合的5'和3'側(cè)翼序列5'-GACCCAAGAGA-3'(SEQIDNo.5)而言，取決于讀碼框，側(cè)翼能夠編碼多種氨基酸序列(如實(shí)施例中更為詳細(xì)的解釋)。在框1中編碼氨基酸序列DPRD/E(SEQIDNo.6);在框2中編碼氨基酸序列R/GPKR(SEQIDNo.7)，并且在框3中編碼氨基酸序列"X"TQE"Z"(SEQIDNo.8)，其中X可以是G、E、A、V、L、S、W、P、Q、R、M、T或K中的任意一個(gè)，Z可以是K、S、R、I、M、T或N中的任意一個(gè)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記基因的編碼區(qū)編碼具有上述氨基酸序列的一段肽。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，內(nèi)含子的3'外顯子序列存在于選擇性標(biāo)記編碼序列5'末端的適合的讀碼框中，這樣，在缺失內(nèi)含子時(shí)，編碼序列編碼有功能的選擇性標(biāo)記，其中在選擇性標(biāo)記多肽的N-末端包含連接肽。所述連接肽通常是420個(gè)，優(yōu)選415個(gè)，通常為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸殘基的肽，所述肽的一部分可由內(nèi)含子側(cè)翼的外顯子編碼序列編碼。連接肽的存在基本不干擾抗生素的抗性活性。換而言之，由I型內(nèi)含子切除后產(chǎn)生的核酸分子表達(dá)產(chǎn)生的多肽具有抗生素的抗性活性。也可以安排I型內(nèi)含子的側(cè)翼序列，從而使I型內(nèi)含子的插入中斷選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄。例如，可將其置于啟動(dòng)子元件的(-35)(-10)之間。還可以安排I型內(nèi)含子的側(cè)翼序列，從而使I型內(nèi)含子的插入干擾選擇性標(biāo)記基因的翻譯。例如，可將其置于核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之間?？梢岳斫?，可使用如在Sambrookda/,"Molecularcloning:Alaboratorymanual",2001,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY中描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備本發(fā)明的DNA分子?，F(xiàn)在將參考以下非限制性實(shí)施例和附圖描述本發(fā)明。圖1A:II型內(nèi)含子Ll丄trB的二級結(jié)構(gòu)模型。預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)由6個(gè)域(I-VI)組成。虛線表示在未剪接的前體RNA中，內(nèi)含子與側(cè)翼外顯子之間EBS2/IBS2、EBS1/IBS1和5-S，的相互作用。在未經(jīng)修飾的Ll丄trB內(nèi)含子中，編碼LtrA蛋白的開放讀碼框存在于標(biāo)示為IV域的非結(jié)構(gòu)性環(huán)中。B:II型內(nèi)含子Ll丄trB識(shí)別DNA靶位點(diǎn)的機(jī)制。LtrA蛋白與II型內(nèi)含子Ll丄trBRNA結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物。從前mRNA中切除內(nèi)含子，釋放核糖核蛋白顆粒。核蛋白顆粒定位到細(xì)胞內(nèi)的靶DNA序列。未經(jīng)修飾的核蛋白的耙DNA序列是沒有內(nèi)含子的//rfi基因拷貝，其序列如SEQIDNo.9所示。內(nèi)含子RNA插入到上鏈的插入位點(diǎn)(IS)。隨后在切割位點(diǎn)(CS)切割下鏈，LtrA從切割的DNA引導(dǎo)，并逆轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子RNA。由宿主的修復(fù)活性完成整合過程。通過LtrA與靶序列內(nèi)核苷酸之間的相互作用，以及內(nèi)含子RNA中的EBS2和EBS1與耙序列中的互補(bǔ)序列IBS2和IBS1之間的相互作用的組合介導(dǎo)對靶標(biāo)的識(shí)別。灰色陰影表示被LtrA蛋白識(shí)別的最重要的核苷酸。圖2由重新靶向核酸衍生的突變體的陽性篩選。A:來自位于質(zhì)粒的重新靶向核酸的選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄不產(chǎn)生抗性，這是因?yàn)樗a(chǎn)生的mRNA保留了插入的I型內(nèi)含子W，由此使選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)被中斷。由于轉(zhuǎn)錄方向的錯(cuò)誤，W元件不能從mRNA剪切下來。B.通過添加IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生II型內(nèi)含子Ll丄trARNA，導(dǎo)致從梭菌啟動(dòng)子/^開始的轉(zhuǎn)錄。選擇性標(biāo)記基因中的I型內(nèi)含子W以正確的方向轉(zhuǎn)錄，并且WRNA從所產(chǎn)生的RNA中切除。C.將Ll丄trARNA和選擇性標(biāo)記基因插入到染色體中的靶位點(diǎn)。選擇性標(biāo)記基因不包含I型內(nèi)含子W，因此選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)沒有受到干擾。因此，所述細(xì)胞表現(xiàn)出與選擇性標(biāo)記的表達(dá)相關(guān)的表型，所以可被篩選出來。圖3pMTL5401Fcat在產(chǎn)孢梭菌和丙酮丁醇梭菌中的誘導(dǎo)性表達(dá)(a)大腸桿菌/梭菌穿梭質(zhì)粒pMTL5401Fcat。(b)顯示處于對數(shù)生長早期的包含pMTL5401Fcat的產(chǎn)孢梭菌克隆，(c)顯示處于對數(shù)生長早期的包含pMTL5401Fcat的丙酮丁醇梭菌克隆，在使用1mMIPTG誘導(dǎo)后(■)或不進(jìn)行誘導(dǎo)(▲)時(shí)，在細(xì)胞裂解液中監(jiān)測CAT活性。圖4適合于選擇性標(biāo)記基因的用于成功剪接I型內(nèi)含子W的序列在核苷酸系列(SEQIDNos.132-134)上顯示三個(gè)翻譯讀碼框中的任意一個(gè)所需的氨基酸序列(SEQIDNos.6-8)。'X，位的氨基酸可以是G、E、A、V、L、S、W、P、Q、R、M、T或K。'Z，位的氨基酸可以是K、S、R、I、M、T或N。圖5使用連接子添加到ermB基因上的RAM功能(a)將包含W內(nèi)含子及其外顯子的連接子插入到erm^ORF及其啟動(dòng)子(SEQIDNo.lO)之間，阻止紅霉素抗性的表達(dá)。從反向鏈切除W內(nèi)含子產(chǎn)生編碼功能性蛋白質(zhì)的修飾wm5基因(SEQIDNo.il)，其中所述蛋白質(zhì)在其N-端具有12個(gè)額外氨基酸(SEQIDNo.12)。將ErmBtdRAMl的enwB啟動(dòng)子替換成ErmBtdRAM2中的啟動(dòng)子。(b)使用多個(gè)模板以及引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Rl進(jìn)行PCR，其中所述引物位于ErmBtdRAMl中W內(nèi)含子的側(cè)翼。第1道ErmBtdRAMlDNA;第2道ErmBtdRAMlSEDNA;第3道由RNA合成的cDNA，其中所述RNA是在IPTG誘導(dǎo)后從包含pMTL201acZTTErmBtdRAMl的細(xì)胞分離出來的；第4道cDNA合成之前同一RNA制備物。(c)使用多個(gè)模板以及引物Thio-Fl和ErmB-Rl進(jìn)行PCR，其中所述引物位于ErmBtdRAM2中W內(nèi)含子的側(cè)翼。第1道產(chǎn)孢梭菌^oft4突變體的基因組DNA;第2道pMTL007::Csp-^oO4-249s質(zhì)粒DNA;第3道野生型產(chǎn)孢梭菌的基因組DNA;第4道水。圖6ErmB/^/RAMl的特征和序列ErmBtdRAMl序歹U(SEQIDNo.13)圖7ErmB似RAMl在大腸桿菌中被剪接的直接證據(jù)從表達(dá)pMTL201acZTTErmB^RAMl的細(xì)胞制備RNA，從而檢測在誘導(dǎo)II型內(nèi)含子RNA表達(dá)后，I型內(nèi)含子W是否已經(jīng)從ErmBtdRAMl切除。使用位于W插入位點(diǎn)側(cè)翼的引物進(jìn)行RT-PCR。在對照反應(yīng)中，使用相同的引物通過PCR擴(kuò)增ErmB/(iRAMl和經(jīng)剪接的相同ErmBf(iRAMlSEDNA。第l道DNA對照；第2道ErmBWRAMl的PCR產(chǎn)物；第3道ErmBWRAMISE的PCR產(chǎn)物；第4道包含pMTL201acZTTErmB^/RAMl的細(xì)胞的總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；和第5道RT-PCR的陰性對照。圖8pBRR3中多克隆位點(diǎn)的構(gòu)建質(zhì)粒pBRR3-LtrB的克隆位點(diǎn)序列(SEQIDNo.14)和質(zhì)粒pCR2.1-TOPO的克隆位點(diǎn)序列(SEQIDNo.15)。將所述的多克隆位點(diǎn)片段(SEQIDNo.16)插入到經(jīng)切割的pBRR3-LtrB，從而制備出所述pBRR3-MCSl(SEQIDNo.17)，其包含在pCR2.1-TOPO質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的限制性位點(diǎn)。圖9幼御論/2啟動(dòng)子的序列顯示溈/啟動(dòng)子序列(SEQIDNo.18)以及決/2啟動(dòng)子序列(SEQIDNo.19)與共有啟動(dòng)子(SEQIDNo.20)的比較。"x"表示與共有序列相比發(fā)生取代的核苷酸。在各個(gè)序列中標(biāo)出了位于(-10)~(-35)元件之間的間隔。圖10ErmB^fRAM2的特征和序列ErmBtdRAM2序列(SEQIDNo.21)圖llpMTL007的特征和序列最終的梭菌重新靶向系統(tǒng)(說明性實(shí)施例是重新靶向/"cZ的修飾衍生物)的質(zhì)粒圖譜和序列(SEQIDNo.22)。圖12pMTL5401F的構(gòu)建指出了每個(gè)步驟中使用的限制性位點(diǎn)。使用T4DNA聚合酶進(jìn)行DNA末端的平端化。圖13pMTL5402F和pMTL5402F-lacZTTErmBtdRAMl的構(gòu)建指出了每個(gè)步驟中使用的限制性位點(diǎn)。使用T4DNA聚合酶進(jìn)行DNA末端的平端化。圖14pMTL007的構(gòu)建指出了每個(gè)步驟中使用的限制性位點(diǎn)。圖15突變體篩選和表征的實(shí)例(a)質(zhì)粒pMTL007。(b，c)使用內(nèi)含子特異性通用引物EBS以及基因特異性引物Cd-spo0A-R2(小箭頭)進(jìn)行PCR，從而對艱難梭菌^04基因中存在的內(nèi)含子插入進(jìn)行初步篩選。第l道水；第2道艱難梭菌親株的基因組DNA;第3道pMTL007::Cd"/oO4-178a質(zhì)粒DNA;第4~6道來自隨機(jī)選擇的3個(gè)EmK艱難梭菌克隆的DNA，其中所述克隆是使用pMTL007::Cd"jwO4-178a產(chǎn)生的。(d)使用針對的探針對艱難梭菌Wo04和/7,F突變體進(jìn)行Southern印記。此探針與預(yù)先存在(無功能性)的染色體em^ORF雜交使第二帶在親本的泳道中也可以觀察到。在woft4突變體的&^RV降解物中，兩條帶的大小類似。對丙酮丁醇梭菌(e)和產(chǎn)孢梭菌(f)進(jìn)行同樣的Southern印記。圖16s/^A4突變體不形成孢子艱難梭菌、丙酮丁醇梭菌以及產(chǎn)孢梭菌的^oft4突變體和親株在固體培養(yǎng)基上分別生長14天、4天或3天時(shí)的相差顯微鏡照片。以百分比的形式顯示三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均產(chǎn)孢頻率。實(shí)施例l:可由IPTG誘導(dǎo)的'fac'啟動(dòng)子的研發(fā)此前已經(jīng)描述過攜帶人工啟動(dòng)子'/"c'的大腸桿菌/梭菌穿梭載體(pMTL540F)的應(yīng)用。該質(zhì)粒通過將大腸桿菌/acZ操縱子的操作基因插入到緊鄰巴斯德梭菌鐵氧化還原蛋白基因啟動(dòng)子的下游部位衍生而來(Foxetal(1996)Ge"e772^:3:173-178)。盡管曾將該啟動(dòng)子元件用于指導(dǎo)異源基因在梭菌中的高水平表達(dá)，但尚未證明具有受調(diào)控的轉(zhuǎn)錄。因此，構(gòu)建了新型的大腸桿菌/梭菌穿梭載體pMTL5401F，其特征是具有/"c啟動(dòng)子、受丙酮丁醇梭菌磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(A6)基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的/^/阻遏物基因，以及質(zhì)粒RK2的on丁區(qū)域，從而促進(jìn)向產(chǎn)孢梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌的接合轉(zhuǎn)移。為了檢測pMTL5401F，我們插入了沒有啟動(dòng)子的pC194c^基因拷貝，這樣在所得質(zhì)粒pMTL5401Ft^f圖3)中該基因的轉(zhuǎn)錄受到/w啟動(dòng)子的調(diào)控。隨后，我們使攜帶pMTL5401R^的產(chǎn)孢梭菌或丙酮丁醇梭菌細(xì)胞在存在或不存在外源IPTG的條件下生長，并分析其裂解物中CW基因產(chǎn)物的酶活性。在這兩種生物中均觀察到誘導(dǎo)現(xiàn)象，但是不存在IPTG的產(chǎn)孢梭菌中觀察到顯著的轉(zhuǎn)錄抑制(圖3)，在丙酮丁醇梭菌中觀察到顯著的基礎(chǔ)水平表達(dá)(圖3)。盡管能夠?qū)MTL5401F引入到艱難梭菌，但是在這種梭菌宿主中，28pCB102復(fù)制子的功能相對不足(PurdyW(2002)Mo/.Af/cra&'o/.46:439-452)，不能支持其轉(zhuǎn)移接合子在添加了抗生素的液體培養(yǎng)基中生長。因此不能進(jìn)行相同的誘導(dǎo)試驗(yàn)。實(shí)施例2:作為梭菌選擇性標(biāo)記的ErmB似的研發(fā)I型內(nèi)含子W的剪接依賴于插入位點(diǎn)側(cè)翼的外顯子序列。被噬菌體T4的I型內(nèi)含子W識(shí)別的靶位點(diǎn)是5，-GACCCAAGAA-3，(SEQIDNo.23)，并且在第一個(gè)'G'后插入內(nèi)含子。然而，也可將I型內(nèi)含子W插入到位點(diǎn)5，-GACCCAAGAGA-3，(SEQIDNo.5)(SigmaAldrichTargeTronTM基因敲除系統(tǒng))。評估目前在梭菌中使用的抗生素基因序列是否具有這些序列，但未對并入這些序列的基因進(jìn)行鑒定。如果蛋白質(zhì)的編碼區(qū)存在剪接位點(diǎn)5，-GACCCAAGAGA-3，(SEQIDNo.5)，那么該編碼區(qū)編碼的氨基酸序列將取決于其讀碼框。圖4顯示了剪接位點(diǎn)可能編碼的氨基酸序列(對應(yīng)于3個(gè)可能的框)。對已知賦予梭菌抗性的所有蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行篩選，但沒有鑒定出任何包含期望氨基酸序列的候選蛋白質(zhì)。因此，對編碼選擇性標(biāo)記的基因進(jìn)行工程改造，使其包含I型內(nèi)含子^的插入位點(diǎn)。這將形成梭菌RAM的基礎(chǔ)。選擇糞腸球菌質(zhì)粒pAMpl的天然wmB基因(賦予紅霉素抗性)作為選擇性標(biāo)記基因，因?yàn)樵摶蛞呀?jīng)廣泛用于構(gòu)建大腸桿菌/梭菌穿梭載體(Diirre,P.HandbookonClostridia.2005.TaylorandFrancis,CRCPress.)。設(shè)計(jì)包含所需剪接位點(diǎn)的連接子序列，并將其融合到^m5基因編碼區(qū)的5'末端，實(shí)際上使所述蛋白質(zhì)的N末端延長了12個(gè)氨基酸(圖5)。在該序列的設(shè)計(jì)中，盡可能選擇編碼惰性和可溶性氨基酸的讀碼框，從而最大程度地減小對ErmB蛋白質(zhì)功能的不利影響。框l(DPRD;SEQIDNo.6)為最佳選擇，因?yàn)槠浒瑧?yīng)當(dāng)有利于溶解的3個(gè)帶電殘基(Asp-ve，Arg+ve)。希望電荷的混合有助于阻止與蛋白質(zhì)其他部分的強(qiáng)相互作用。連接子的其他部分由小惰性殘基Gly和Ala構(gòu)成，并帶有一個(gè)Ser以避免出現(xiàn)可能降低蛋白質(zhì)溶解性的疏水殘基長鏈。此外，所選擇的氨基酸序列引入了梭菌密碼子的使用，從而最大程度地減少可能出現(xiàn)的任何表達(dá)問題。如下所述，使用以下表l所示的寡核苷酸引物，通過SOEingPCR構(gòu)建了兩個(gè)構(gòu)建物ErmBWRAMl(包含在圖6所示位點(diǎn)插入的W內(nèi)含子的修飾em^基因)(SEQIDNo.13)，和經(jīng)剪接的等價(jià)物Splicedequivalent,SE)，其中不存在W內(nèi)含子。將ErmB^RAMl和ErmB^RAMlSE分別克隆到高拷貝質(zhì)粒pMTL5402F中，其方向與/ac啟動(dòng)子相反(這樣，由RAM或SE本身的啟動(dòng)子賦予抗性)。表h寡核苷酸引物序歹ij(5'—3')序列號ErmB-Pro-F3ErmB-Pro-RA連接子l-ErmB-FlErmB國RlErmB-Pro-RBtdGpI-FltdGpI-RlThio畫FlThio-R-RAMCTACGCGTGGAAATAAGACTTAGAA24GCAAACTTAAGAGTGTGCAGAAGCACCAGCATCTCTTGGGTC25CATGTAATCACTCCTTCTTAATTACAAATTTTTAGCATCACCCAAGAGATGCTGGTGCTTCTGG26TGCTGGTATGAACAAAAATATAAAATATTCTCAAAACTTTTTAACGAGTGGAACGCGTGCGACTCATAGAATTATT27TCCTCCCGGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTG28AACATAATGCCATGTAATCACTCCTTCTTAATTACAAATTTTTAGCATCGCATTATGTTCAGATAAGGTCGTTAA29TCTTACCCCCCAGAAGCACCAGCATCTCTTGGGT30TAATTGAGGCCTGAGTATAAGCTACTAGTACGCGTTATATTGATAAA31AATAATAATAGTGGGCCTTATCTGAACATAATGCCATATGA32ATCCCTCCTAATTTATACGTTTTCTC按照以下方式制備ErmB^RAMlSE。使用引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Pro-RA，通過PCR從pMTL5402F擴(kuò)增出ermS啟動(dòng)子。使用引物連30接子1-ErmB-Fl和ErmB-Rl，通過PCR從pMTL5402F擴(kuò)增出ORF。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并在使用外側(cè)引物(outerprimer)ErmB-Pro-F3和ErmB-Rl的SOEingPCR中將其作為模板使用。將編碼ErmBtdRAMlSE的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-TOPO中。從pCR2.1::ErmBtdRAMlSE切下///"dlll/lol片段ErmBtdRAMlSE，并將其連接到使用相同酶線性化的pMTL5402F中。這使得在所得的質(zhì)粒pMTL5402F::ErmBtdRAMlSE中，ErmBtdRAMlSE的放置方向與/ac啟動(dòng)子的方向相反。按照以下方式制備ErmBAiRAMl構(gòu)建物。使用引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Pro-RB，通過PCR從pMTL5402F擴(kuò)增出em5啟動(dòng)子。使用引物連接子1-ErmB-Fl和ErmB-Rl，通過PCR從pMTL5402F擴(kuò)增出erwSORF。使用引物tdGpI-Fl和tdGpI-Rl，通過PCR從pACD4K-C擴(kuò)增出被消弱的I型內(nèi)含子W及其外顯子。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并在使用外側(cè)引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Rl的三向SOEingPCR中將其作為模板使用。將編碼ErmBtdRAMl的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-TOPO中。從pCR2.1::ErmBtdRAMl切下///"dlll/^ol片段ErmBtdRAMl,并將其連接到使用相同酶線性化的pMTL5402F中。攜帶pMTL5402F::ErmB^RAMl的大腸桿菌對500lig/ml和125lig/ml的紅霉素敏感(37。C過夜不生長)。攜帶pMTL5402F::ErmBAiRAMlSE的大腸桿菌對500)ig/ml和125ng/ml的紅霉素具有抗性(37。C過夜生長)。這些試驗(yàn)證明經(jīng)修飾的e^^基因賦予大腸桿菌紅霉素抗性，同樣重要的是還證明插入W使所述基因失活。實(shí)施例3:在大腸桿菌中驗(yàn)證選擇性標(biāo)記ErmBtd將pACD4K-C的重新耙向核酸成分M7d(平端)片段亞克隆到pMTL20(Chambersda/(1988)68:139-149)的i7/w/III和Smfll位點(diǎn)之間，再次證明fecZm新靶向區(qū)域能夠敲除大腸桿菌宿主HMS174(DE3)中的/"cZ基因。然后，將pMTL20/acZTT中的ii:朋RAM替換為MiJ片段ErmBWRAM1。收集攜帶pMTL201acZTTErmB^RAMl的大腸桿菌細(xì)胞并制備RNA，從而檢測在誘導(dǎo)II型內(nèi)含子RNA表達(dá)后I型內(nèi)含子W是否已經(jīng)從ErmBtdRAMI剪接出來。隨后，使用位于W插入位點(diǎn)側(cè)翼的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。作為對照，對ErmBWRAMl和ErmB^/RAMISE(ErmBWRAMl的剪接等價(jià)物)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR。如圖7所示，從經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的RNA樣品中獲得的主要產(chǎn)物具有對應(yīng)于SE基因的較小大小。這清楚地說明W從ErmBWRAMI中的經(jīng)修飾wm5基因的RNA中剪接出來。盡管已經(jīng)發(fā)生了證明ErmBWRAMl剪接的事實(shí)，但是在將IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞平鋪到添加了500)ig/ml、250)ig/ml或125lag/ml紅霉素的瓊脂培養(yǎng)基后，并未獲得紅霉素抗性菌落。由于大腸桿菌對較低水平的抗生素具有天然的抗性，不可能進(jìn)一步降低抗生素的濃度。不能獲得紅霉素抗性菌落可能是由于拷貝數(shù)目的影響。因此，插入到基因組的單拷貝可能不足以產(chǎn)生高于野生型大腸桿菌通常固有的低水平抗性的抗生素抗性。為了檢測這種可能性，使攜帶ErmB^RAMlSE的DNA片段與經(jīng)切割的pACYC184連接，將連接混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并將其平鋪到包含四環(huán)素或紅霉素的2YT培養(yǎng)基上，其中四環(huán)素或紅霉素有3種不同的濃度，500pg/ml、250pg/ml和125pg/ml。在Erml25和Tet上生長的克隆數(shù)目相似，但在Erm250上生長的克隆數(shù)目比其低若干倍，僅有少數(shù)克隆在Erm500上生長。此對照試驗(yàn)將篩選pACYC184中存在的ErmB^RAMlSE的遺傳性的操作限值設(shè)定為125嗎/ml。在確定篩選大腸桿菌中ErmB^RAMlSE所需的紅霉素水平后，使用引物/acZtarget-F(ACGAATTCCGGATAATGCGAACAGC-GCACGG;SEQIDNo.33)和/acZtarget隱R(TGCGATCGCACCGCCGA畫CGGCACGCTGATTG;SEQIDNo.34)，通過PCR擴(kuò)增包含耙向區(qū)域的/"cZ區(qū)域，將其克隆到pCR2.1TOPO中，隨后亞克隆到pACYC184中，而pACYC184在大腸桿菌細(xì)胞中以數(shù)個(gè)拷貝存在。隨后，通過將pMTL201acZTTErmBMlAMl引入到攜帶pACYC184::/^Z的大腸桿菌細(xì)胞中，重復(fù)所述重新靶向試驗(yàn)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，將細(xì)胞平鋪到包含紅霉素的培養(yǎng)基上。與之前的試驗(yàn)相反，獲得了適當(dāng)數(shù)量的抗性菌落。在診斷PCR中使用適合的引物確認(rèn)發(fā)生了II型內(nèi)含子向pACYC184中/^Z基因的重新耙向。因此，ErmB^/RAMlSE以單拷貝存在時(shí)，ErmB的表達(dá)不足以賦予紅霉素抗性，但以多拷貝存在時(shí)，ErmB的表達(dá)量足以賦予抗性表型。實(shí)施例4:使用選擇性標(biāo)記ErmBtd構(gòu)建梭菌重新靶向系統(tǒng)在確認(rèn)ErmB^RAMl能夠取代Sigma-AldrichII型內(nèi)含子中的AT"nRAM后，將整個(gè)元件與重新靶向/"cZ的區(qū)域一起從pMTL201acZTTErmB^RAMl(歷"dlII/5bcI和5^I/M^I片段)亞克隆到梭菌表達(dá)載體pMTL5402F(經(jīng)歷mini-M2el切割)中，從而得到pMTL5402FlacZTTErmB^/RAMl。結(jié)果使II型內(nèi)含子的表達(dá)在/""c啟動(dòng)子的控制之下。II型內(nèi)含子的表達(dá)可被IPTG調(diào)控。檢測該載體重新靶向大腸桿菌中pACYC184::/^Z上的/^rZ基因的能力。在IPTG誘導(dǎo)并平鋪到紅霉素板上后，證實(shí)了成功的重新靶向。實(shí)施例5:含ErmBWRAMl的II型內(nèi)含子重新耙向效率的測定為了評估與X朋RAM相比，ErmB^RAMl是否影響II型內(nèi)含子的重新靶向效率，我們使用Karberg等人研發(fā)的雙質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行了若干遷移性試驗(yàn)(Karbergda/,2001，如上)。IPTG誘導(dǎo)后，1I型內(nèi)含子從pACD2重新耙向到pBRR3-LtrB(攜帶其天然耙標(biāo)LtrB)，結(jié)果激活后一個(gè)質(zhì)粒中的Tet基因。因此，可基于四環(huán)素抗性的獲得檢測單個(gè)重新靶向事件。因此，通過在載體的唯一MwI位點(diǎn)插入ErmB^RAMl或i^wRAM，修飾質(zhì)粒pACD2。隨后，將這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到包含pBRR3-LtrB(即，帶有野生型靶序列的受體質(zhì)粒)的HMS174(DE3)細(xì)胞中。在篩選供體質(zhì)粒后，使用500^MIPTG誘導(dǎo)細(xì)胞1小時(shí)，將細(xì)胞重新懸浮于LB中，使其恢復(fù)l小時(shí)，隨后將經(jīng)過不同稀釋的細(xì)胞懸液平鋪到多個(gè)選擇性平板上。對于那些包含RAM的構(gòu)建物，首先將TetK克隆重新劃線到Tet平板上，隨后再劃線到包含適當(dāng)抗生素的平板上，從而檢測RAM剪接。結(jié)果顯示于表2中。此試驗(yàn)證明KanRAM和ErmB^RAMl對內(nèi)含子效率具有相似的影響，這可能主要起因于內(nèi)含子大小的增加。重要的是，數(shù)據(jù)表明兩種RAM剪接的效率類似。供體質(zhì)粒結(jié)果內(nèi)含子遷移效率*RAM剪接效率卞pACD2(空)100n/apACD2::KanRAM10-318/20pACD2::ErmBtdRAM~10-318/20*內(nèi)含子遷移效率Te^克隆/AmpKCmK克隆卞RAM剪接效率=KanR或ErmR的重劃線TetR克隆/所有的重劃線TetR克隆通過最初的抗生素抗性均不能檢測到兩個(gè)RAM的剪接，僅在重劃線TetR克隆時(shí)才可檢測到。實(shí)施例6:有效的梭菌重新靶向序列的鑒定為了評價(jià)ErmB^RAMl的重新耙向，從3中不同梭菌種中選出8個(gè)不同的測試基因。它們是產(chǎn)孢梭菌;,F、^o似、cMrmSOM9，艱難梭菌/,Ff基因組注釋號CD3592)和^oft4f基因組注釋號CD1214)，丙酮丁醇梭菌f基因組注釋號CAC2652)和wo04。在http:〃www.sigma-a:enosvs.com/targetron/對各個(gè)基因進(jìn)行分析，并鑒定容許重新靶向的合適改變。按照Sigma-AldrichTargeTronTM基因敲除系統(tǒng)使用指南的指示，使用適合的引物進(jìn)行PCR，從而產(chǎn)生恰當(dāng)?shù)慕?jīng)修飾的n型內(nèi)含子。每次PCR需要獨(dú)特的IBS、EBS2和EBSld引物以及EBS通用引物，其中所述獨(dú)特的IBS、EBS2和EBS1d引物均經(jīng)過設(shè)計(jì)以修飾II型內(nèi)含子的靶向部分或其5'外顯子。以下表3和表4給出了各個(gè)基因的靶定插入位點(diǎn)序列和引物序列。34表3:重新靶向核酸的預(yù)測靶定插入位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a靶用生物體、ORF和插入位點(diǎn)表示。靶定插入位點(diǎn)經(jīng)過選擇，這樣從ORF起點(diǎn)開始所表示數(shù)目的堿基后以正義方向(s)或反義方向(a)插入內(nèi)含子。表4:用于產(chǎn)生重新靶向的PCR產(chǎn)物的寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>為了確保經(jīng)修飾的n型內(nèi)含子能夠重新靶向所選定的梭菌基因，首先使用已知可有效作用的質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌中進(jìn)行試驗(yàn)。所使用的系統(tǒng)是實(shí)施例5所述的Karberg等人(2001)研發(fā)的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)，將工程改造的II型內(nèi)含子放置到一個(gè)質(zhì)粒(pACD2)上，并將其靶點(diǎn)(在此情況下為克隆的梭菌基因)放置到第二質(zhì)粒(pBRR3)上。1I型內(nèi)含子從pACD2到pBRR的重新靶向造成后一質(zhì)粒上Tet基因的活化。因此，可基于四環(huán)素抗性的獲得檢測單個(gè)重新靶向事件。將部分細(xì)菌平鋪到非選擇性瓊脂板上，從而獲得活細(xì)菌總量的指標(biāo)，并將部分細(xì)菌平鋪到包含四環(huán)素的瓊脂板(Tet板)上?；诰哂兴沫h(huán)素抗性的活細(xì)菌總量的比例評價(jià)重新靶向的效率。為了促進(jìn)靶基因從pCR2.1/pCRI1TOPO質(zhì)粒到pBRR3質(zhì)粒的亞克隆，向pBRR3-LtrB中引入多克隆位點(diǎn)，從而制備pBRR3-MCSl。這是通過在pBRR3-LtrB的A^II和五coRI位點(diǎn)之間插入多克隆位點(diǎn)片段而完成的，所述多克隆位點(diǎn)片段包含在質(zhì)粒pCR2.1-TOPO中發(fā)現(xiàn)的限制性位點(diǎn)。圖8顯示了克隆位點(diǎn)的序列。圖8所示的多克隆位點(diǎn)片段是由寡核苷酸MCSlaCTCGAGGTACCATGCATAGGCCTGAGCTCA-CTAGTGCGGCCGCG(SEQIDNo.68)和寡核苷MCSlbAATTC-GCGGCCGCACTAGTGAGCTCAGGCCTATGCATGGTACCTCGAGACGT(SEQIDNo.69)制備的。使用雙質(zhì)粒內(nèi)含子遷移性試驗(yàn)評估了4個(gè)重新靶向核酸(分別用于插入產(chǎn)孢梭菌基因p,F、^poft4、codF和S(9M)中的一個(gè))。所有4個(gè)核酸均表現(xiàn)出遠(yuǎn)高出預(yù)期的有效重新靶向。因此，選擇鋪Tet板的稀釋度并不理想，其位于進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)的范圍之內(nèi)，所以與使用較少細(xì)菌鋪板的情況相比，此時(shí)所給出的效率的準(zhǔn)確性較差。還評價(jià)了另外4個(gè)重新靶向核酸(分別用于插入艱難梭菌基因p"f和^o04或丙酮丁醇梭菌基因p^F和woft4中的一個(gè))。通過將細(xì)菌平鋪到Tet板來評價(jià)重新靶向事件。在此初步試驗(yàn)中，SONO沒有產(chǎn)生En^克隆。結(jié)果顯示于表5中。表5:內(nèi)含子遷移性試驗(yàn)的結(jié)果供體質(zhì)粒受體質(zhì)粒內(nèi)含子迀移效率*pACD2::Cs畫spoOA-249sTRpBRR3::Cs-spoOAAS2frag~15%pACD2::Cs-codY-417sTRpBRR3::Cs-codYAS2frag~20%pACD2::Cd畫pyrF國97aTRpBRR3::Cd-pyrF-97target~100%pACD2::Cd-spoOA國178aTRpBRR3::Cd畫spo0A曙178target200/0pACD2::Cs陽pyrF-595sTRpBRR3::Cs畫pyrF2%pACD2::Ca畫pyrF-345sTRpBRR3::Ca-pyrF~0.2%pACD2::Ca-spoOA-242aTRpBRR3::Cs畫spoOA20%pACD2::Cs-SONO誦492sTRpBRR3::Cs-SONO、、ND*內(nèi)含子遷移效率=1^11克隆/紐1101/克隆，Cs:產(chǎn)孢梭菌；Ca:丙酮丁醇梭菌；Cd:艱難梭菌。數(shù)字是指在正義方向(s)或反義方向(a)上，內(nèi)含子插入位點(diǎn)相對于基因起點(diǎn)的位置。TR=重新靶向核酸實(shí)施例7:在梭菌中評價(jià)重新靶向核酸將前4個(gè)新型重新靶向核酸(分別用于插入產(chǎn)孢梭菌基因p,F、^oft4、codr和SCWO之一)亞克隆到原型載體pMTL5402FTTErmB^RAMl中，并將所得重組質(zhì)粒引入大腸桿菌供體CA434中，由此將其與作為受體的產(chǎn)孢梭菌或艱難梭菌用于接合試驗(yàn)。在后一種情況下，沒有獲得轉(zhuǎn)移接合子。在產(chǎn)孢梭菌的情況下，使用兩個(gè)質(zhì)粒均獲得了轉(zhuǎn)移接合子。將單個(gè)轉(zhuǎn)移接合子接種到添加了250pg/ml環(huán)絲氨酸以及7.5pg/m甲砜氯霉素(后者保證質(zhì)粒的保持)的適合生長培養(yǎng)基中，并在37"C下厭氧溫育過夜，從而使其生長至穩(wěn)定期。將150nl此培養(yǎng)物接種到相同類型并包含相同添加物的1.5ml新鮮肉湯中，隨后在37。C下厭氧溫育。一旦能夠在培養(yǎng)物中觀察到生長物(通常在l小時(shí)后)，即使用lmMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并溫育1小時(shí)。在7000rpm離心1分鐘，收集2ml經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞，通過重懸于PBS中進(jìn)行清洗，并按上述方式收集細(xì)胞。將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮在等量(2ml)的不含添加物的適合生長培養(yǎng)基中，并在37t:下厭氧溫育l小時(shí)。隨后，在l小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后將培養(yǎng)物的系列稀釋物平鋪到添加l-10pg/ml紅霉素的適合的固體生長培養(yǎng)基上，并在37i:下厭氧溫育。2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)并未獲得紅霉素抗性克隆。實(shí)施例8:關(guān)于天然ermB啟動(dòng)子的功能太差，以至于不能驅(qū)動(dòng)足以使ErmB發(fā)揮選擇性標(biāo)記作用的表達(dá)的證據(jù)對實(shí)施例7中所述的不能檢測到重新靶向核酸的重新靶向作用的一種解釋是ermB啟動(dòng)子的功能太差，從而不能使細(xì)胞染色體中的單拷貝基因賦予細(xì)胞紅霉素抗性。對糞腸球菌質(zhì)粒pAMpi的ermB啟動(dòng)子序列的分析表明，啟動(dòng)子-35和-10區(qū)域之間的間隔為21bp。革蘭氏陽性啟動(dòng)子的最佳長度是17土lbp。將ErmB/c/RAMlSE以相對于/ac/^兩個(gè)不同的方向克隆至UpMT5402F中。只有所述基因在/^的控制之下時(shí)，攜帶ErmBf^MlSE的質(zhì)粒才能向產(chǎn)孢梭菌宿主賦予紅霉素抗性。盡管^777￡存在于多拷貝質(zhì)粒上，但由于在相反的方向上，wmB編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄依賴于其本身的啟動(dòng)子，所以其表達(dá)不足以產(chǎn)生抗性。實(shí)施例9:具有強(qiáng)啟動(dòng)子的梭菌ErmBtdRAM的研發(fā)丙酮丁醇梭菌基因的啟動(dòng)子是公認(rèn)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)引物從而將ErmB/6/RAMl啟動(dòng)子替換為啟動(dòng)子。這將刪除位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的非必需序列，并在起始密碼子處插入iV&I位點(diǎn)，從而39容許在必要時(shí)再次簡單地變更啟動(dòng)子。為了防止fW啟動(dòng)子過強(qiáng)的可能性，通過將-35和-10之間的間隔改為16nt并對-35和-10元件進(jìn)行微小改動(dòng)，設(shè)計(jì)出突變啟動(dòng)子W2'。圖9顯示了啟動(dòng)子和啟動(dòng)子-35和-10元件間的序列，并將其與革蘭氏陽性共有生長性啟動(dòng)子進(jìn)行比較。圖10中顯示了位于ErmB^RAM2序列的15-84位的啟動(dòng)子的完整序列。啟動(dòng)子的完整序列僅在圖9所述區(qū)域中與啟動(dòng)子的序列不同。使用SOEingPCR和克隆步驟將A/啟動(dòng)子和啟動(dòng)子與ErmB^RAMl和ErmB^RAMlSE的起始密碼子融合，產(chǎn)生各包含啟動(dòng)子的ErmB/^RAM2和ErmBWRAM2SE，以及各包含啟動(dòng)子的ErmB^RAM3和ErmB^RAM3SE。獲取序列正確RAM2和RAM3克隆，并亞克隆至pACD2和pMTL201acZTT中進(jìn)行評估。圖10描述了ErmB^RAM2的特征和序列。如下表6所示，使用包含RAM2部分和RAM3部分的質(zhì)粒測定這些部分賦予大腸桿菌TOP10細(xì)胞紅霉素抗性的能力。表6:具有新型構(gòu)建物的TOP10克隆對紅霉素的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在除SETOPO質(zhì)粒之外的所有質(zhì)粒中，erm5基因都被I型內(nèi)含子中斷，因此預(yù)期不能產(chǎn)生抗性。在SETOPO質(zhì)粒中基因沒有被中斷，因此，如果的啟動(dòng)子足夠強(qiáng)，則應(yīng)該獲得抗性表型。出乎意料的是，RAM2TOPO克隆向大腸桿菌賦予紅霉素抗性。在這種情況下，極強(qiáng)的決/啟動(dòng)子和極高的拷貝數(shù)似乎克服了I型啟動(dòng)子的存在，這可能是通過在天然ATG發(fā)生極少的翻譯起始造成的。僅在基因存在于TOPO時(shí)觀察到這種效應(yīng)。在插入到用于重新靶向的相關(guān)質(zhì)粒(例如pACD2和pMTL201acZTTRAM時(shí))，大腸桿菌細(xì)胞沒有紅霉素抗性。RAM3表現(xiàn)的抗性情況與預(yù)期一致。因此，每個(gè)啟動(dòng)子似乎都能夠在梭菌重新靶向核酸中驅(qū)動(dòng)選擇性標(biāo)記的表達(dá)。實(shí)施例10:在pACD2/pBRR3系統(tǒng)中評價(jià)ErmBtdRAM2和ErmBtdRAM3使用實(shí)施例5所述的重新耙向系統(tǒng)評價(jià)ErmB^RAM2和ErmB^/RAM3的重新靶向效率。結(jié)果顯示于下表7中。表7:內(nèi)含子遷移性試驗(yàn)的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*內(nèi)含子遷移效率=1^11克隆/八11^110^克隆卞RAM剪接效率=Kai^或ErmR的重劃線TeP克隆/所有的重劃線Te^克隆RAM2和RAM3的剪接是有效的(90%)，并且與原始RAM(RAMI)相當(dāng)。實(shí)施例11:在大腸桿菌中的pMTL201acZTT系統(tǒng)中評價(jià)ErmBtdRAM2和ErmBtdRAM3如前所述，使用Ery5。o或Eryu5時(shí)，兩個(gè)RAM都不能用于檢測II型內(nèi)含子至大腸桿菌HMS174(DE3)基因組中/acZ的重新靶向。RAM2而非RAM3產(chǎn)生了大量的EryR克隆，但PCR顯示，它們不包含重新靶向/"cZ基因的II型內(nèi)含子。推測產(chǎn)生這些克隆的原因是由于質(zhì)粒賦予的微弱抗性。實(shí)施例12:圖11顯示了載體pMTL007(也稱作pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM2)的基本成分。此II型內(nèi)含子經(jīng)過修飾以使其重新靶向lacZ基因。可對其進(jìn)行修飾以使其重新靶向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞的基因。所述質(zhì)粒的基本成分是引起重新靶向核酸元件表達(dá)的梭菌啟動(dòng)子，在本說明性實(shí)例中其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/M?？墒褂猛ㄟ^操作子的方式進(jìn)行誘導(dǎo)的類似的其他啟動(dòng)子，例如/""。為了介導(dǎo)誘導(dǎo)作用，所述質(zhì)粒還攜帶了受梭菌啟動(dòng)子控制的大腸桿菌/""基因，在本實(shí)例中所述梭菌啟動(dòng)子為丙酮丁醇梭菌內(nèi)6基因(編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶)的啟動(dòng)子。可使用組成型啟動(dòng)子替代誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述質(zhì)粒還攜帶質(zhì)粒pMTL20E的ColEl復(fù)制子，從而容許在大腸桿菌中保持所述質(zhì)粒，還攜帶酪酸梭菌(C/asmW/Mw^i)r/cMw)質(zhì)粒pCB102的復(fù)制區(qū)，從而容許在梭菌種中保持所述質(zhì)粒。此外，還通過包含^/P基因以保證在大腸桿菌(通過向培養(yǎng)基中添加氯霉素)和梭菌(通過向培養(yǎng)基中添加紅霉素)中篩選所述質(zhì)粒，從而保持所述質(zhì)粒。所述載體還攜帶了質(zhì)粒RP4的owr區(qū)，這樣除進(jìn)行轉(zhuǎn)化之外，還提供了通過接合將所述質(zhì)粒引入梭菌受體的可能性。所有這些元件都可以與其他來源的其他等價(jià)因子互換。因此，可將ColEl替換成能夠在大腸桿菌中復(fù)制的其他復(fù)制子，例如pl5a、pVWOl或噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(例如M13)。可將c^P取代為其他適合的抗生素抗性基因，例如te/M或^^/。類似地，可采用能夠在靶定梭菌或革蘭氏陽性細(xì)菌宿主中復(fù)制的任何復(fù)制子，例如pIM13、pIP404、pAMM、pCD6、pC194、pE194、pT181、pCB101、pBPl。也可以采用具有復(fù)制缺陷的復(fù)制子，包括條件型復(fù)制的復(fù)制子，例如溫度敏感型或依賴外源因子進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制子。也可以采用缺少在革蘭氏陽性菌中進(jìn)行復(fù)制所必需的任何條件的質(zhì)粒，即僅攜帶了ColEl復(fù)制子的自殺載體。也可以采用操縱子與阻遏物基因的其他組合。另一個(gè)候選者的代表為在接合轉(zhuǎn)座子Tn5397上鑒定出的受四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子(Roberts,PhDthesis,UCL)。也可以是最近發(fā)現(xiàn)在丙酮丁醇梭菌中起作用的，來自木糖葡萄球菌的木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Girbal"(2003)々少/五"vz'ra"M'craWo/.69:4985-8)。另一個(gè)候選者是在枯草芽孢桿菌中開發(fā)的受W調(diào)控的啟動(dòng)子(GeissendorferandHillen(1990)Jp//.M/craZn'o/.5/otec/2wo/,33:657-63)。它是通過在強(qiáng)啟動(dòng)子矽/的(-35)~(-10)位之間添加W操縱子(WO)序列而構(gòu)建的(GeissendorferandHillen,19卯，如上)。在存在Wi基因(編碼阻遏物)的條件下，亞致死濃度Tet的誘導(dǎo)能夠100倍地誘導(dǎo)衍生化啟動(dòng)子。通過添加第二fef操縱子能夠完全消除所得的基礎(chǔ)水平表達(dá)，盡管該添加導(dǎo)致表達(dá)水平的整體下降。因此，該啟動(dòng)子在金黃色葡萄球菌中得到了廣泛應(yīng)用(BatemandW(2001)/w/e"/畫亂69:7851-7;Ji"a/(2001)5We膨293:2266-2269)，其中證明僅有單個(gè)操縱子是必需的。受^"周控的啟動(dòng)子是我們研發(fā)的/^//^/系統(tǒng)的理想選擇。因此，我們能夠使用用于表達(dá)/"c/的同一啟動(dòng)子(丙酮丁醇梭菌pA啟動(dòng)子)來表達(dá)fe^。在枯草芽孢桿菌中，誘導(dǎo)的程度在整個(gè)測試范圍內(nèi)均具有劑量依賴性。然而，枯草芽孢桿菌對抗生素敏感，因而不能添加高濃度的Tet。對于具有該抗生素抗性的梭菌(例如艱難梭菌)則沒有類似的應(yīng)用限制。為了檢測此系統(tǒng)的可行性，我們將重新合成/"c，將(-35)(-10)間的區(qū)域替換成tert9。若果在不存在Tet的條件下觀察到高的基礎(chǔ)水平表達(dá)，可添加第二操作子。還可進(jìn)一步添加合成的/"c(9序列，以用于增強(qiáng)LacI對啟動(dòng)子的阻遏作用(Muller"W(1996)JMo/所o/.257:21-9)。pMTL007的構(gòu)建下表8中顯示了在構(gòu)建中使用的寡核苷酸引物表8:寡核苷酸引物弓物序列(5'-3')序列號Iacl-PlGTGGTGCATATGAAACCAGTAACG70lacI-P2GAATTCCTAACTCACATTAATTGCGTTGCG71ptb-PlGAATTCAGGGAATTAAAAGAATGTTTACCTG72ptb-P2ACTCATATGTTGCACCTCTACTTTAATAATTTTTAAC73tdGpI隱FlGCATTATGTTCAGATAAGGTCGTTAATCTTACCCC29CatPFwdCAGCTGACCGGTCTAAAGAGGTCCCTAGCGCCCGGTCATGCTGTAGGTACAAGGTAC74CatPSOER75CatPRevCAGCTGACCGGTCTCTGAAAATATAAAAACCACAGATTGATAC76CatPSOEFGTACCTTGTACCTACAGCATGACCG77Thio-FlCTACTAGTACGCGTTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG78Thio誦R隱RAMCCTTATCTGAACATAATGCCATATGAATCCCTCCTAATTTATACGTTTTCTC79從酪酸梭菌質(zhì)粒pCB102(MintonandMorris(l術(shù))/Ge打M.c油'o/127:325-33)中分離1.627kb的hp/-///mini片段并使用Klenow聚合酶進(jìn)行平端化。使用M^I切割復(fù)制子克隆載體pMTL21E(Swinfield"(1990)87:79-89)，使用Klenow聚合酶進(jìn)行平端化，并與分離的pCB102復(fù)制子片段連接。如圖12所示，所得質(zhì)粒被命名為pMTL540E(TDavis，PhDThesis,TheOpenUniversity,1989)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子元件來自于巴斯德梭菌鐵氧化還原蛋白基因的啟動(dòng)子。現(xiàn)命名為々c，其創(chuàng)建過程包括在緊鄰鐵氧化還原蛋白基因啟動(dòng)子+1位之后添加大腸桿菌的/"c操縱子，并將緊鄰鐵氧化還原蛋白結(jié)構(gòu)基因ATG起始密碼的序列變成CAT，從而產(chǎn)生A^el限制性位點(diǎn)(CATATG)(Minton"a/(1990)VectorsystemsforthegeneticanalysisofC/oWnV^'wmIn:JwaeraZ)es/"http://wm朋Afei/c/"e朋d/"血s吵(edsPBoriello&JHardie),WrightsonPublishing,Petersfield,UKpp.187-206)。在此特定實(shí)例中，/ac操縱子的插入方向與/^啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向相反。然而，這并不影響其功能性，Lacl蛋白仍能夠結(jié)合并抑制從啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄。隨后，將/"c啟動(dòng)子的7Wfel和五coRI限制性片亞克隆到質(zhì)粒pMTL1003(Brehm"G/(1991)^7//.所otec/2"o/.36,358-363)的相同位點(diǎn)間，產(chǎn)生質(zhì)粒pMTL1006。該亞克隆步驟有效地除去了pMTL1003的frp啟動(dòng)子，并將/acZ，的表達(dá)置于經(jīng)修飾的/d啟動(dòng)子的控制之下。隨后，對質(zhì)粒pMTL1006進(jìn)行fig/I酶切，并分離所得兩個(gè)片段中較大的一個(gè)。類似地，使用Bg/I切割質(zhì)粒pMTL500E(Oultramda/(1988)F五MSM/cra6/。/丄""56:83-88)，分離所得兩個(gè)片段中較大的一個(gè)，并將其與從pMTL1006分離的較大片段相連接。所得質(zhì)粒被命名為pMTL500F(Fox"a/,1996，如上)盡管pMTL500F能夠在梭菌中充分復(fù)制，但是我們發(fā)現(xiàn)基于pAMpi的穿梭載體向梭菌的轉(zhuǎn)移效率相對不足。因此，我們選擇將復(fù)制子更換成pCB102的復(fù)制子。因此，使用Sg/I切割pMTL540E和pMTL500F，并將pMTL540E的較大片段與pMTL500F的較小片段連接。所得質(zhì)粒被命名為pMTL540F(Fox"a/,1996，如上)。為了簡明起見，將pMTL500E片段和pMTL1006片段的連接，以及pMTL540E片段和pMTL500F片段的連接表示為圖12中pMTL540E和pMTL1006的單個(gè)連接。為了在轉(zhuǎn)化尚未得到證實(shí)的情況下確保質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，我們選擇向所述質(zhì)粒提供質(zhì)粒RP4的on丁(轉(zhuǎn)移起點(diǎn))。這樣，使用五coRV和從pEoriT(Purdy&a/.,2002)切下RP4W7丁區(qū)，并將其亞克隆到pMTL540F的五coRV限制性位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pMTL5400F(參見圖12)。為了引起LacI阻遏蛋白的產(chǎn)生，使用引物lacI-Pl和lacI-P2，通過PCR從pNM52(Gilbertd"/(1986)M/cra&b/.132:151-160)擴(kuò)增出約1.0kbAWel-五coRI片段無啟動(dòng)子的大腸桿菌/"c/基因拷貝。同時(shí)，使用引物ptb-Pl和ptb-P2，通過PCR擴(kuò)增丙酮丁醇梭菌pA(磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶)基因的啟動(dòng)子區(qū)域。這使基因限定為578bp的i^oRI-iV^I片段。分離所述兩個(gè)片段，并與經(jīng)五coRI切割的pMTL20E連接，從而將/"c堪因置于/^啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下，并將經(jīng)修飾的基因限定為可移動(dòng)的^:②Ri片段。從產(chǎn)生的質(zhì)粒切除該片段，使用Klenow聚合酶進(jìn)行平端化，并與經(jīng)五coRV切割的pMTL5400F連接。如圖12所示，將獲得的質(zhì)粒命名為pMTL5401F。質(zhì)粒pMTL5401F攜帶作為選擇性標(biāo)記的wm基因。因此，它與ErmRAM不相容。因此將erw基因替換為pJIR418的基因(Sloan"(1992)尸/畫W27:207-219)。完成此過程的步驟包括使用J緒額IIl切割pMTL5401F，使用Klenow聚合酶對DNA進(jìn)行平端化，隨后把使用J/^I和^//zml酶切pMTL5401F產(chǎn)生的的兩個(gè)片段中較大的一個(gè)連接到攜帶pJIR418c^戶基因的l.lkb/VwII片段上。該操作的結(jié)果是完全刪除wm^并除去大部分Wfl基因。如圖13所示，將獲得的質(zhì)粒命名為pMTL5402F。在此取代之前，通過破壞fi^Gl回文的序列突變除去片段中的SwGl位點(diǎn)，，而不改變ca^的編碼序列。使用引物CatPSOEF和CatPSOER，通過片段拼接延伸(SewingOverlapExtension,SOE)PCR(Horton""/.，1990)進(jìn)行此歩驟。此夕卜，經(jīng)設(shè)計(jì)所使用的側(cè)翼引物CatPFwd和CatPRev包含位點(diǎn)和內(nèi)在的^gel位點(diǎn)。引入前者是為了隨后將所述質(zhì)粒插入pMTL5401F，而引入后者則有利于將來某時(shí)將最終質(zhì)粒pMTL007中的c^尸取代為其他可選的標(biāo)記。按照以下步驟構(gòu)建pMLT007:TargetronTM質(zhì)粒pACD4K-C購自于Sigma，并根據(jù)提供的方案利用試劑盒提供的對照引物使其重新靶向大腸桿菌的/^Z基因，與試劑盒提供方案的不同之處在于，首先克隆PCR產(chǎn)物，并在將HindlII/BsrGI片段亞克隆到pACD4K-C之前，驗(yàn)證其序列。如圖13所示，切下重新耙向lacZ的核酸區(qū)域(5099bpNael片段)，并將其連接到pMTL20的2412bp片段上，其中，預(yù)先使用HindIII和SmaI酶切，并使用T4聚合酶使HindlII末端平端化，從而產(chǎn)生pMTL20的2412bp片段。傾向選擇HindIII和NheI位點(diǎn)位于重新靶向核酸區(qū)域的側(cè)翼的構(gòu)建物。如圖13所示，使用MluI切除KanRAM，并替換為包含ErmBtdRAM2的1259bpMlul片段。隨后將包括ErmRAM的完整的重新靶向lacZ的核酸區(qū)域切割為3.3kbp的HindlII/SacI片段和1.8kbp的SacI/Nhel片段，將其一起連接到經(jīng)HindIII和Nhel酶切的pMTL5402F中。所得質(zhì)粒被命名為pMTL5402FLacZTTErmBtdRAMl。使用引物Thio-Fl和Thio-R-RAM，通過PCR從pSOS95(Tummala"a/(2003)/^rfm'o/.185:1923-1934)擴(kuò)增丙酮丁醇梭菌ATCC824的啟動(dòng)子。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并與來自ErmBtdRAMl構(gòu)建物的I型內(nèi)含子W的PCR產(chǎn)物一起，作為使用外側(cè)引物Thio-Fl和tdGpI-Rl的SOEingPCR的模板。從該P(yáng)CR產(chǎn)物切下143bpSpeLW^I片段的A/啟動(dòng)子和部分W內(nèi)含子。從pCR2.1::ErmBtdRAMl切下剩余W內(nèi)含子和e/mSORF(7V^I/A^1片段)。在三向連接中將這些片段連接到經(jīng)S/7el和A^rt線性化的pCR2.1::ErmBtdRAMlSE中，獲得質(zhì)粒pCR2.1::ErmBtdRAM2。如圖14所示，將包含RAM的pCR2.1::ErmBtdRAM2的Mw7/廁w7片段與pMTL201acZTT的較大Mm〃Mm7片段連接，從而形成pMTL201acZTTErmBtdRAM2。如圖14所示，將包含RAM的pMTL201acZTTErmBtdRAM2的萬^G/Z^詔/片段亞克隆到經(jīng)5^67/6^5/切割的？]^11^402713021丁￡111131(111^1中，從而產(chǎn)生pMTL007。pMTL007最初被命名為pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM2，而有時(shí)被稱為pMTL5402FlacZTTErmRAM2、pMTL5402FlacZTTRAM2或pMTL5402FlacZTTR2。一旦經(jīng)過重新耙向，所述質(zhì)粒即被命名為以"靶向區(qū)域"(TR)的標(biāo)志為后綴的pMTL007(或pMTL5402FTTErmBtdRAM2、pMTL5402FTTErmBRAM2或pMTL5402FTTRAM2)。TR是位于重新耙向PCR所產(chǎn)生的序列中HindIII和BsrGI位點(diǎn)之間的整個(gè)區(qū)域。例如，一旦通過克隆加入適合TR片段(Hindm/BsrGI片段)，從而使所述質(zhì)粒重新耙向艱難梭菌630的^oO4基因(sjw04ORF的178位)，所述質(zhì)粒即被命名為pMTL5402FTTErmBtdRAM2::Cd誦spoOA-178aTR。實(shí)施例13:評價(jià)pMTL5402FlacZTT系統(tǒng)中ErmBMRAM2和ErmBWRAM3對產(chǎn)孢梭菌中MrfF的作用在產(chǎn)生能夠賦予梭菌紅霉素抗性的新型RAM后，構(gòu)建了包含具有靶向部分的II型內(nèi)含子的梭菌重新靶向核酸，經(jīng)設(shè)計(jì)使其將內(nèi)含子靶向到產(chǎn)孢梭菌的cc^y。構(gòu)建負(fù)載RAM2或RAM3的兩個(gè)質(zhì)粒，并分別命名為pMTL5402FCs-codY隱417sTT::RAM2和pMTL5402FCs-codY陽417sTT::RAM3。除了II型內(nèi)含子的重新靶向部分以及IBS序列經(jīng)過設(shè)計(jì)以容許重新靶向產(chǎn)孢梭菌的c/F而不是大腸桿菌的lacZ之外，RAM2的形式與圖10中說明的相同。將兩個(gè)質(zhì)粒分別接合到產(chǎn)孢梭菌中。通過PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)移接合子，并都顯示出對Eryu5的敏感性。隨后使用IPTG誘導(dǎo)各個(gè)RAM的選定轉(zhuǎn)移接合子，通過離心清洗除去誘導(dǎo)物，隨后恢復(fù)3小時(shí)，再平鋪到包含一定濃度范圍的紅霉素的瓊脂板上。下表9顯示了獲得的克隆數(shù)。表9:重新靶向試驗(yàn)的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>這些數(shù)據(jù)證明了充分的誘導(dǎo)期的重要性，并且與RAM3相比，使用RAM2獲得更高的效率。實(shí)施例14:其他突變體的產(chǎn)生我們選擇靶向兩個(gè)基因，這兩個(gè)基因的失活將導(dǎo)致易于檢測的表型。它們是p^F和^o似。前者的失活將導(dǎo)致尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型，而后者的中斷將導(dǎo)致無孢子株。將pMTL007重新耙向產(chǎn)孢梭菌的^oO4基因，并在IPTG誘導(dǎo)后，容易地獲得了數(shù)百個(gè)EmK產(chǎn)孢梭菌克隆。從4個(gè)隨機(jī)克隆提取DNA，并將其作為PCR的模板使用。在所有情況下，對RAM特異的引物均產(chǎn)生了與W內(nèi)含子缺失后的大小一致的DNA片段(圖15)。在使用pMTL007::Csp-^oft4-249s證明了RAM的明顯功能性后，我們利用方法部分指出的方案，進(jìn)一步在所有3種梭菌中生成兩個(gè)基因(p^F和^o似)的突變體。En^克隆的PCR篩選(圖15b、圖15c)顯示向目標(biāo)染色體位點(diǎn)的極高頻率的插入(表10)，這證明使用本方法能夠容易地獲得整合子。在分離后，通過甲砜氯霉素敏感表型篩選質(zhì)粒丟失的單個(gè)整合子克隆，發(fā)現(xiàn)消除所述質(zhì)粒的克隆占所有這些不能額外繼代的生物的絕大部分。通過跨過內(nèi)含子-外顯子連接的測序確定了插入位點(diǎn)(表10)，并利用針對RAM的探針，通過Southern印記確認(rèn)了單拷貝插入元件的存在(圖15d、圖15e和圖15f)。利用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)孢梭菌表達(dá)pMTL007::Csp-s/7oft4-249s中的內(nèi)含子使插入頻率增加了100倍，這與來自pMTL5401Fc^的報(bào)告數(shù)據(jù)一致。表10:調(diào)控內(nèi)含子在產(chǎn)孢梭菌中的表達(dá)對插入頻率的影響質(zhì)粒IPTGa插入頻率b相對插入頻率epMTL007::Csp匪^oO4-249s-^1.31士0,34x10-91pMTL007::Csp,oO4-249s+1.63±0.72xl(T7124pMTL007::Csp-^oO4-249sA/ac/-1.95±0.54xl(T61489M吏用lmMIPTG(+)或使用水代替IPTG(-)誘導(dǎo)內(nèi)含子表達(dá)。b在恢復(fù)期后，將細(xì)胞平鋪到添加或未添加紅霉素的TYG環(huán)絲氨酸平板上。插入頻率表示為EmRc.f.u./ml/總c.f.u./ml。e相對插入頻率為相對于使用pMTL007::Csp-^oO4-249s并使用水代替IPTG的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行歸一化后的插入頻率。為了確定內(nèi)含子的受控表達(dá)是否賦予任何超出組成型表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，我們向pMTL007::Csp-spoOA-249s中的toc/基因引入移碼突變，從而使/ac啟動(dòng)子去阻遏。觀察到插入頻率進(jìn)一步增加了10倍以上(表IO)，說明內(nèi)含子的受控表達(dá)沒有賦予超出組成型表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。我們使用pMTL007::Cac-^oO4-242a在丙酮丁醇梭菌中進(jìn)行了等效試驗(yàn)，并觀察到添加IPTG后整合頻率沒有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。與pMTL5401Fc^報(bào)告的數(shù)據(jù)一致，此生物中由啟動(dòng)子起始的內(nèi)含子的基礎(chǔ)表達(dá)顯然足以獲取易檢測的整合頻率。與pMTL5401F類似，pMTL007在艱難梭菌中很不穩(wěn)定而不能支持其轉(zhuǎn)移接合子生長在添加了抗生素的液體培養(yǎng)基中(Purdy"(2002)Mo/.M'craWo/.46:439-452)。因此，不能進(jìn)行類似于產(chǎn)孢梭菌中進(jìn)行的IPTG誘導(dǎo)試驗(yàn)。然而，在艱難梭菌和丙酮丁醇梭菌中，可以簡單地將轉(zhuǎn)移接合子克隆重新劃線到包含紅霉素且沒有添加IPTG的培養(yǎng)基上，從而容易地獲得EmK整合子。與預(yù)期一致，所有的^w04突變體均不能形成孢子(圖16)。發(fā)現(xiàn)除非添加50pg/L尿嘧啶，否則所有的p,F突變體均不能在基本培養(yǎng)基上生長。我們使所有3中梭菌突變體在沒有紅霉素選擇的液體豐富培養(yǎng)基中生長，隨后將其平鋪到帶有或沒有尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上，由此嘗試選擇尿嘧啶原養(yǎng)型的回復(fù)突變體。在至少3個(gè)試驗(yàn)中，都未能在缺少尿嘧啶的培養(yǎng)基上檢測到回復(fù)突變體。通過與添加了尿嘧啶的培養(yǎng)基上的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較，估計(jì)每個(gè)細(xì)胞的回復(fù)突變頻率為艱難梭菌小于9.36X10—9，丙酮丁醇梭菌小于9.60X10—7，產(chǎn)孢梭菌小于5.50X10—9。這些發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)吻合(Frazieretal(2003)^p//.Mz'cra&o/.69:1121-1128)，表明這些內(nèi)含子的整合子極為穩(wěn)定，這是非常理想的突變體特征。實(shí)施例15:評估ErmB』^AM2系統(tǒng)對其他耙標(biāo)的作用如下所述，現(xiàn)已開發(fā)出用于在梭菌中進(jìn)行重新靶向的標(biāo)準(zhǔn)程序。1.主要根據(jù)Sigma在TametronTM試劑盒中提供的方法，產(chǎn)生針對目的基因的內(nèi)含子重新靶向序列Sigma網(wǎng)站「http:〃www.sisma-genosvs.com/targetron/1提{共了用于在目的基因序列中確定可能的內(nèi)含子靶，并設(shè)計(jì)PCR引物的計(jì)算機(jī)算法。隨后，根據(jù)SigmaTargetron的實(shí)驗(yàn)方案使用這些引物以及SigmaTargetron試劑盒提供的PCR試劑，產(chǎn)生353bpPCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物對應(yīng)于內(nèi)含子的一部分并且包括經(jīng)修飾的IBS、EBSld和EBS2序列，這樣可將內(nèi)含子重新靶向到目的基因。將此PCR產(chǎn)物克隆到例如pCR2.1的恰當(dāng)?shù)目寺≥d體中，并確定其序列。也可以將其直接亞克隆到pMTL007中。2.主要根據(jù)Sigma在TametrcmTM試劑盒中提供的方法，對原型梭菌重新靶向質(zhì)粒pMTL5402FlacZTTR2進(jìn)行重新靶向如果將步驟1的PCR產(chǎn)物克隆到克隆載體中，則使用限制性酶///Mdin和SwGI酶切質(zhì)粒，從而切下所需的重新耙向序列，并將其克隆到使用相同酶進(jìn)行酶切的pMTL5402FlacZTTR2中。在任意一種情況下均通過限制性分析和/或測序確定所得構(gòu)建物。3.將成功進(jìn)行重新靶向的梭菌重新靶向質(zhì)粒轉(zhuǎn)入靶生物中可通過基于電轉(zhuǎn)化或接合的標(biāo)準(zhǔn)DNA轉(zhuǎn)移法將重組質(zhì)粒引入到梭菌宿主中。這兩種方法均在Davis,I,Carter,GYoung,MandMinton，NP(2005)"GeneCloninginClostridia"HandbookonClostridia(DurreP，ed)37-52頁,CRCPress,BocaRaton,USA中列出。在我們的試驗(yàn)中，通過接合將質(zhì)粒從大腸桿菌供體引入到艱難梭菌和產(chǎn)孢梭菌中。與此不同，通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒引入到丙酮丁醇梭菌中。4.通過使用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化子實(shí)現(xiàn)重新靶向核酸的表達(dá)以及隨后的整合將單個(gè)轉(zhuǎn)化子克隆接種到1.5ml添加了25(Vg/ml環(huán)絲氨酸和7.5pg/ml甲砜氯霉素(后者保證質(zhì)粒的保持)的適合生長培養(yǎng)基中，并在37t:下厭氧溫育過夜，從而使其生長至穩(wěn)定期。將150pl此培養(yǎng)物接種到相同類型并包含相同添加物的1.5ml新鮮肉湯中，隨后在37。C下厭氧溫育。一旦能夠在培養(yǎng)物中觀察到生長物(通常在1小時(shí)后)，即使用ImMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并溫育3小時(shí)。5.將細(xì)胞平鋪到選擇性固體培養(yǎng)基并溫育后，使用恢復(fù)步驟檢測并分離重新靶向核酸整合子在7000rpm離心1分鐘，收集2ml經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞，通過重懸于PBS中進(jìn)行清洗，并按上述方式收集。將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮在等量(2ml)的不含添加物的適合生長培養(yǎng)基中，并在37'C下厭氧溫育3小時(shí)。隨后將培養(yǎng)物的系列稀釋物平鋪到添加l-10pg/ml紅霉素的適合的固體生長培養(yǎng)基上，并在37。C下厭氧溫育。在1848小時(shí)后，可從平板上挑出紅霉素抗性克隆(重新靶向核酸整合子)，所需時(shí)間取決于使用的生物和紅霉素的濃度。可任選地再將培養(yǎng)物的系列稀釋物平鋪到無添加的固體生長培養(yǎng)基，或添加15^g/ml甲砜氯霉素(替代紅霉素)的固體生長培養(yǎng)基上，由此測定整合發(fā)生的頻率。表11中簡要說明了用于制備梭菌突變體的標(biāo)準(zhǔn)程序。表ll:梭菌突變體<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>如果重新靶向核酸已經(jīng)插入到靶基因中，診斷PCR引物將會(huì)給出具有預(yù)期大小的產(chǎn)物。a在若干克隆群中證實(shí)了期望突變體的存在b篩選出若干個(gè)發(fā)生期望突變的單個(gè)克隆有時(shí)重新靶向是無效的。因此，推薦嘗試不止一個(gè)靶向部分，從而破壞給定的任意基因。此外，在進(jìn)行組合批次PCR篩選之前，可將菌落混合。例如，如果將10或100個(gè)菌落組合，并且產(chǎn)生了針對重新靶向突變體的期望大小的PCR產(chǎn)物，然后可對各個(gè)菌落進(jìn)行單獨(dú)篩選。實(shí)施例16:其他突變體的產(chǎn)生為了進(jìn)一步確認(rèn)本方法的效用，我們分別從3個(gè)種中選擇了數(shù)個(gè)其他基因，并重復(fù)了所述突變產(chǎn)生的程序。表12列出了靶基因，表4或表13顯示了根據(jù)針對pMTL007的II型內(nèi)含子修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的寡核苷酸引物。在各個(gè)情況下均獲得了期望的整合子。通過PCR篩選確認(rèn)各個(gè)插入，并通過核苷酸測序確定插入位點(diǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表13:寡核苷酸引物<image>imageseeoriginaldocumentpage54</image>實(shí)施例17:基于catP的RAM的構(gòu)建構(gòu)建了包含可選的經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因的RAM(即c"W)，其可賦予氯霉素抗性或甲砜氯霉素抗性。使用弓I物連接子-catP-F5'-ATACTCAGGCCTCAATTAAC-CCAAGAGA-AGTTGGAACAG^'(SEQIDNo.130)和catP-MluI-Rl5，-ATACGC-GTTTAACTATTTATCAATTCCTGCAATTCGTTTACAAAACGGC-3'(SEQIDNo.131)，通過PCR從pMTL5402F質(zhì)粒DNA模板擴(kuò)增caf尸ORF,其中利用引物延伸在cWPORF的5'添加連接子和"內(nèi)含子的一小部分。使用5"M和Mwl酶切PCR產(chǎn)物。從pCR2.1::ErmBtdRAM2切下Spel/StuI片段ErmBtdRAM2部分，其包含A/啟動(dòng)子、連接子和I型內(nèi)含子W的大部分。將兩個(gè)限制性片段一起連接到經(jīng)和M"I線性化的pCR2.1::ErmBtdRAM2中，獲得包含新型RAM元件RAM-Cl的質(zhì)粒pCR2.1::RAM隱Cl。RAM-Cl中緊鄰ca^ORF的序列與ErmBtdRAM2中緊鄰ORF的序列相同，包含決/啟動(dòng)子、連接子和I型內(nèi)含子^。完整RAM-Cl元件的側(cè)翼為位點(diǎn)，從而有利于將其亞克隆到Ll丄trB內(nèi)含子的Mwl位點(diǎn)，以作為RAM使用?？蓪AM-Cl或其衍生物作為RAM元件在pMTL007的類似質(zhì)粒中使用，以基于獲得的甲砜氯霉素抗性或氯霉素抗性來篩選梭菌中的重新靶向事件?？梢岳斫?，在宿主中保持質(zhì)粒所需的選擇性標(biāo)記賦予宿主的試劑抗性必須與RAM賦予宿主的抗性不同。因此，可將pMTL007的c"W選擇性標(biāo)記替換成在梭菌中有效的不同選擇性標(biāo)記(例如wm5)，從而對其進(jìn)行修飾。這樣修飾的質(zhì)?？捎糜谥匦掳邢蛩缶?。如本文所述，可操作性地連接到選擇性標(biāo)記編碼區(qū)的啟動(dòng)子必須能夠引起單拷貝選擇性標(biāo)記基因編碼的選擇性標(biāo)記的表達(dá)，其表達(dá)量足以使所述選擇性標(biāo)記改變梭菌細(xì)胞的表型，這樣才能夠使所述梭菌細(xì)胞與不含所述選擇性標(biāo)記的梭菌細(xì)胞區(qū)分開。如果RAM-C1元件中的A/啟動(dòng)子不能滿足此規(guī)則，可使用本文公開的方法將其替換或修飾。類似地，如果I型內(nèi)含子^的位置不恰當(dāng)，使其不能在存在于RAM中時(shí)抑制選擇性標(biāo)記的表達(dá)，或從RAM中切除后容許選擇性標(biāo)記的表達(dá)，都可以對其位置進(jìn)行變更。可使用Karberg等人(2001)研發(fā)的雙質(zhì)粒系統(tǒng)檢測RAM的元件的功能(參見實(shí)施例5)。綜上所述，RAM-Cl或其衍生物可用于在梭菌中產(chǎn)生重新靶向突變體。權(quán)利要求1.DNA分子，其包含經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子，其不表達(dá)內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶，但在相對于經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的反方向上包含經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因，其中所述選擇性標(biāo)記基因包含編碼選擇性標(biāo)記的編碼區(qū)域和可操作性地連接到所述區(qū)域的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子能夠引起由單拷貝選擇性標(biāo)記基因編碼的選擇性標(biāo)記的表達(dá)，其表達(dá)量足以使所述選擇性標(biāo)記改變梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞的表型，從而使其能夠區(qū)別于不含所述選擇性標(biāo)記基因的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞；和用于所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可操作性地與所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子相連；和其中所述經(jīng)修飾的選擇性標(biāo)記基因包含I型內(nèi)含子，從而破壞所述選擇性標(biāo)記的表達(dá)，其中所述I型內(nèi)含子位于相對于所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的正方向；和其中所述DNA分子容許從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本中除去所述I型內(nèi)含子，從而獲得編碼所述選擇性標(biāo)記的編碼區(qū)域，并容許在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中的DNA分子內(nèi)位點(diǎn)插入所述RNA轉(zhuǎn)錄本(或其DNA拷貝)。2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的側(cè)翼有外顯子，其中所述外顯子容許對II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行剪接。3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA分子，其中所述經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子包含靶向部分。4.如權(quán)利要求3所述的DNA分子，其中所述靶向部分容許將經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本插入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞DNA分子內(nèi)的位點(diǎn)。5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其中所述位點(diǎn)是選定的位點(diǎn)。6.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其中所述DNA分子是質(zhì)粒。7.如權(quán)利要求6所述的DNA分子，其中所述質(zhì)粒是大腸桿菌-梭菌穿梭載體。8.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其還包含容許從大腸桿菌向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的編碼基因。9.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其中可操作性地與選擇性標(biāo)記的編碼區(qū)相連的所述啟動(dòng)子是丙酮丁醇梭菌A/、內(nèi)6或^fc基因的啟動(dòng)子，或產(chǎn)氣莢膜梭菌/血或基因的啟動(dòng)子。10.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其中，與不含所述選擇性標(biāo)記的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞相比，所述選擇性標(biāo)記賦予表達(dá)所述選擇性標(biāo)記基因的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞生長優(yōu)勢。11.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其中所述選擇性標(biāo)記賦予梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞紅霉素抗性或氯霉素抗性。12.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其中所述I型內(nèi)含子位于所述選擇性標(biāo)記編碼區(qū)之內(nèi)或選擇性標(biāo)記編碼區(qū)的上游。13.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其中可操作性地與II型內(nèi)含子相連的所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。14.如權(quán)利要求13所述的DNA分子，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。15.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的DNA分子，其還包含編碼II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的開放讀碼框，其中所述開放讀碼框可操作地與啟動(dòng)子連接但不在經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子之內(nèi)。16.試劑盒，其包含權(quán)利要求114中任意一項(xiàng)所述的DNA分子以及能夠表達(dá)II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA分子。17.將核酸分子引入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞DNA分子內(nèi)的位點(diǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(i)向梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞提供權(quán)利要求114中任意一項(xiàng)所述的DNA分子以及能夠表達(dá)II性內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA分子；和(ii)培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞，其培養(yǎng)條件容許從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本中除去I型內(nèi)含子，并容許將包含選擇性標(biāo)記基因(或其DNA拷貝)的所述RNA轉(zhuǎn)錄本插入到所述位點(diǎn)。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其還包括在容許所述選擇性標(biāo)記表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其還包括基于所述選擇性標(biāo)記賦予的變化表型篩選所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其還包括分離源自權(quán)利要求17獲得的細(xì)胞的單克隆細(xì)胞的步驟。21.如權(quán)利要求1720中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述能夠表達(dá)II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA分子與權(quán)利要求114中任意一項(xiàng)所述的DNA分子相同。22.如權(quán)利要求115中任意一項(xiàng)所述的DNA分子，或如權(quán)利要求1721中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞是梭菌屬細(xì)菌細(xì)胞。23.如權(quán)利要求22所述的DNA分子，或如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述屬是梭菌屬，所述細(xì)胞是熱纖梭菌、丙酮丁醇梭菌、艱難梭菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、拜氏梭菌、破傷風(fēng)梭菌、(^."http://"/>^/附或腐敗梭菌。24.如權(quán)利要求115、22或23中任意一項(xiàng)所述的DNA分子，或如權(quán)利要求1723中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞DNA分子內(nèi)的位點(diǎn)位于基因之內(nèi)或位于影響基因表達(dá)的DNA部分之內(nèi)。25.如權(quán)利要求115或2224中任意一項(xiàng)所述的DNA分子，或如權(quán)利要求1724中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述位點(diǎn)位于細(xì)菌基因組之內(nèi)。26.如權(quán)利要求17~24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中向所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞提供權(quán)利要求1~15中任意一項(xiàng)所述的DNA分子的方式包括將所述DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)移到所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⑺鯠NA分子從供體細(xì)菌細(xì)胞接合轉(zhuǎn)移到所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。27.將核酸分子靶向到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中DNA分子的選定位點(diǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(i)向所述梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞提供權(quán)利要求3所述的DNA分子以及能夠表達(dá)II型內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA分子；和(ii)培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞，其培養(yǎng)條件容許從經(jīng)修飾的II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本中除去I型內(nèi)含子，并將包含選擇性標(biāo)記基因(或其DNA拷貝)的所述RNA轉(zhuǎn)錄本插入到所述的選定位點(diǎn)。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述DNA分子的選定位點(diǎn)是基因或影響基因表達(dá)的DNA部分。29.突變的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞，其通過權(quán)利要求17~27中任意一項(xiàng)所述的方法獲得。30.包含經(jīng)修飾的紅霉素抗性基因的DNA分子，其包含中斷所述紅霉素抗性基因表達(dá)的I型內(nèi)含子。31.包含經(jīng)修飾的氯霉素抗性基因的DNA分子，其包含中斷所述氯霉素抗性基因表達(dá)的I型內(nèi)含子。32.包含經(jīng)修飾的四環(huán)素抗性基因的DNA分子，其包含中斷所述四環(huán)素抗性基因表達(dá)的I型內(nèi)含子。33.包含經(jīng)修飾的壯觀霉素抗性基因的DNA分子，其包含中斷所述壯觀霉素抗性基因表達(dá)的I型內(nèi)含子。34.如權(quán)利要求3033中任意一項(xiàng)所述的DNA分子，其中所述DNA分子是質(zhì)粒。35.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求30~34中任意一項(xiàng)所述的DNA分子。36.權(quán)利要求115或3034中任意一項(xiàng)所述的DNA分子在制備突變的梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中的用途。37.如本文所述的任意新型DNA分子。38.如本文所述的將核酸分子引入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中DNA分子內(nèi)的任意新型方法。39.如本文所述的將核酸分子靶向到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中DNA分子的選定位點(diǎn)的任意新型方法。全文摘要本發(fā)明公開了包含II型內(nèi)含子的DNA分子，其中所述II型內(nèi)含子不表達(dá)內(nèi)含子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶但包含經(jīng)修飾的反向的選擇性標(biāo)記基因，其中所述標(biāo)記基因包含正向的I型內(nèi)含子，從而在梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中引起表達(dá)，并且其中所述DNA分子包含容許將所述II型內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)錄本插入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞的基因組中的序列。本發(fā)明還提供了將核酸分子引入到梭菌綱細(xì)菌細(xì)胞中的DNA分子的位點(diǎn)的方法。所述DNA分子和方法可用于在梭菌中產(chǎn)生突變。文檔編號C12N15/74GK101506367SQ200780031195公開日2009年8月12日申請日期2007年6月21日優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日發(fā)明者奈杰爾·彼得·明頓,約翰·蒂莫西·希普申請人:莫沃斯技術(shù)有限公司