專利名稱：具有增加產(chǎn)率的支鏈淀粉酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
01本發(fā)明涉及酶促肽支鏈淀粉酶的新型變體，編碼所述新型肽 的基因序列，包括那些基因序列的表達載體以及表達新型支鏈淀粉酶 變體的生物。而且，本發(fā)明涉及這些新型支鏈淀粉酶肽在紡織、發(fā)酵、 食品和其它工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
02支鏈淀粉酶是在許多工業(yè)應(yīng)用，特別是在食品和飲料工業(yè)中 被發(fā)現(xiàn)有用的酶。支鏈淀粉酶是淀粉脫支酶，并在淀粉水解產(chǎn)物的脫 支(用于改進面團性質(zhì))、(3-極限葡聚糖((3-limitdextmns)的脫支(用于釀 造啤酒和強麥酒(ales))以及從例如玉米、馬鈴薯、小麥、木薯和水 稻生產(chǎn)糖漿中是有效的。支鏈淀粉酶是分類為EC3.2丄41的酶，并且 這種酶的特征是它們水解例如支鏈淀粉和普魯分支葡聚糖中a-I,6-糖苷 鍵的能力。
03支鏈淀粉酶是細菌，特別是芽孢桿菌屬的產(chǎn)物。用于工業(yè)應(yīng) 用的支鏈淀粉酶的生產(chǎn)并非沒有問題。支鏈淀粉酶可被同樣由細菌產(chǎn) 生的各種蛋白酶快速降解，從而使大量支鏈淀粉酶的回收低效且昂貴。 本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)設(shè)計了方法，以通過限制培養(yǎng)物中支鏈淀粉酶的 降解來增加產(chǎn)量。例如，我們以前已經(jīng)示出，從支鏈淀粉酶生產(chǎn)菌株 刪除AprL和Mpr基因(它們表達蛋白酶)對于經(jīng)濟表達活性支鏈淀粉酶是必要的。而且，發(fā)酵時間限制在51-60小時，以限制支鏈淀粉酶產(chǎn)物
的蛋白水解性降解和活性損失。Svendsen設(shè)計了支鏈淀粉酶變體，所 述支鏈淀粉酶變體改變酶的三維構(gòu)象，以增加酶的熱穩(wěn)定性或改變酶 如何降解其底物(見美國專利6,350,599和6,838,257以及美國申請第 2004/0082028號)。
04最近，我們已經(jīng)示出，支鏈淀粉酶降解的時間被測定，結(jié)果 如下在30和50小時之間，觀察全長支鏈淀粉酶分子部分剪切成分 別缺少N-端98和102個氨基酸的截短的分子。剪切分別發(fā)生在谷氨酸 殘基E99和E103的N-末端，并且可以通過HPLC可見。意料不到地， 1-98和1-102被截短的支鏈淀粉酶分子保留支鏈淀粉酶活性，并且， 甚至更意料不到的是，表明這種活性高于全長支鏈淀粉酶的活性。51 小時后，支鏈淀粉酶分子進一步降解導(dǎo)致活性降低，最后所有活性消 失。
05盡管如此，支鏈淀粉酶肽和編碼這些肽的核苷酸序列的設(shè)計 仍有改進的余地。因此，所需要的是更高效地生產(chǎn)支鏈淀粉酶的化合 物和方法，例如，通過限制蛋白水解性降解，增加發(fā)酵滴度(fermentation titer)或增加支鏈淀粉酶活性。
發(fā)明概述
06本發(fā)明涉及支鏈淀粉酶——一種肽酶——的新的和非顯而易 見形式。本發(fā)明的支鏈淀粉酶包括新的修飾，所述新的修飾導(dǎo)致生產(chǎn) 滴度和/或耐受降解(例如，由蛋白酶引起的酶促降解)方面的優(yōu)越性能 和/或在靶向底物材料的分解中比親本("野生型")肽更具有活性。
07在這方面，本發(fā)明涉及肽SEQIDNO: 2、 SEQIDNO: 4和 SEQIDNO: 6的支鏈淀粉酶，分別如圖7(b)、 8(b)和9(b)所示。本發(fā) 明還涉及編碼氨基酸序列SEQ ID NOS: 2、 4和6的核苷酸序列。各 自的核苷酸序列還分別作為SEQ ID NOS: 1、 3禾B 5在圖7(a)、 8(a) 和9(a)中示出。如本領(lǐng)域所熟知，遺傳密碼冗余，多個核苷酸密碼子編 碼相同氨基酸。因此，本發(fā)明又涉及編碼肽SEQ ID NOS: 2、 4和6 的任何可選的核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠基于本說明書和 本領(lǐng)域知識的教導(dǎo)，確定編碼本發(fā)明肽序列的核苷酸序列。08本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明肽的表達構(gòu)建物。本發(fā)明不限于任何 特定的表達構(gòu)建物，只要其能夠表達本發(fā)明的肽。在這方面，合適的
表達構(gòu)建物的非限制性實例示意地顯示在圖4-6的(a)部分。
09如在本說明書的詳述和實施例部分中的更詳細的解釋，在一 種實施方式中，通過密碼子優(yōu)化技術(shù)來修飾編碼親本支鏈淀粉酶肽(來 自^c/〃^^ra柳:/kww)的序列，以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的核苷酸序列[SEQ ID NO: 1]，所述優(yōu)化的核苷酸序列編碼野生型(即，親本)支鏈淀粉 酶氨基酸序列[SEQIDNO: 2]的復(fù)制品。編碼氨基酸序列[SEQIDNO: 2]的核苷酸序列在兩個方向上被克隆至地衣芽孢桿菌(A //c/7em/or,》 整合載體pICatH的Xhol位點，產(chǎn)生表達構(gòu)建物的Oril (pICatH-PUL-Oril)和Ori2 (pICatH- PUL-Ori2)形式。
10在另一種實施方式中，編碼親本支鏈淀粉酶肽的序列被修飾， 以產(chǎn)生支鏈淀粉酶肽，其中N-端的104個氨基酸已被刪除。在-種實 施方式中，編碼這種新型支鏈淀粉酶的核苷酸序列也是密碼子優(yōu)化的 [SEQIDNO: 3]。由該構(gòu)建物，PULm 104表達的肽在SEQIDNO: 4 中給出(見，圖8(b))。編碼[SEQIDNO: 4]的核苷酸序列在兩個方向 上被克隆到地衣芽孢桿菌整合載體pICatH的屈ol位點，產(chǎn)生表達構(gòu) 建物的Oril(pICatH-PULml04-Oril)和Ori2 (pICatH-PULml04-Ori2)形式。
11在另一種實施方式中，編碼親本支鏈淀粉酶肽的序列被改變， 以將99和103位上的氨基酸殘基從谷氨酸(E)置換為谷氨酰胺(Q)，從
而使所產(chǎn)生的肽更能抵抗在這些位置的蛋白水解降解。在一種實施方 式中，編碼這種新型支鏈淀粉酶的核苷酸序列也是密碼子優(yōu)化的[SEQ ID NO: 5]。由該核酸序列PUL—E99Q—E103Q表達的肽在SEQIDNO: 6中給出。編碼[SEQIDNO: 6]的核苷酸序列在兩個方向上被克隆到地 衣芽孢桿菌整合載體pICatH的Xhol位點，產(chǎn)生表達構(gòu)建物的Oril (pICatH-PUL—E99Q—E103Q-Oril) 禾B Ori2 (plCat-
PUL—E99Q—E103Q-Ori2)形式。
12本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的表達構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到適合的宿主生 物。本發(fā)明不限于任何具體宿主生物。宿主生物可以是，例如，微生 物、真核細胞或組織培養(yǎng)物、植物細胞或組織培養(yǎng)物、或真菌細胞或 組織培養(yǎng)物。在優(yōu)選的實施方式中，宿主生物為微生物。優(yōu)選的宿主
7生物包括但不限于芽孢桿菌種(B"C,7/W (特別是枯草芽孢桿菌
(Bac〃/i^ w6"to)、 i也衣芽 包桿菌(及//c/ze"i/^/7m'i0禾口及deram折"'cflmO， 埃希氏大腸桿菌，里氏木霉，啤酒酵母或黑曲霉。在最優(yōu)選的實施方 式中，宿主生物是地衣芽孢桿菌。
13本發(fā)明涉及從培養(yǎng)本發(fā)明的宿主生物的培養(yǎng)基中分離和純化 本發(fā)明的肽。在這點上，本發(fā)明不限于任何特定的分離和純化技術(shù)， 只要其產(chǎn)生10%的最低純度。在更優(yōu)選的實施方式中，分離和純化的 肽的最低純度為25%，在甚至更優(yōu)選的實施方式中，分離和純化的肽 的最低純度為50%。還在更優(yōu)選的實施方式中，分離和純化的肽的最 低純度為75%。在最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明分離和純化的肽的最 低純度為90 %。最低純度可通過總干重百分比或本領(lǐng)域已知的其它適 合的方法測量。
14本發(fā)明不限于任何分離和純化本發(fā)明的肽的具體純化方法。 本領(lǐng)域已知的任何肽純化方法都是適合的。合適的純化方法非限制性 實例包括親和層析、沉淀、大小排阻層析、薄層層析、電泳、大小過 濾等。
15本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到本發(fā)明的支鏈淀粉酶生物學 活性片段可用于替代本發(fā)明上下文中的全長序列或等價物。"生物學 活性片段"意圖包括本發(fā)明序列的任何類似物、模擬、平截、缺失和/ 或置換。本發(fā)明的支鏈淀粉酶的模擬肽和支鏈淀粉酶活性結(jié)構(gòu)域可應(yīng) 用結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行計算機設(shè)計，如本領(lǐng)域已知的。另外，在本發(fā)明一種 實施方式中，考慮本發(fā)明支鏈淀粉酶核苷酸序列的類似物和突變可通 過定向分子進化產(chǎn)生。所述定向分子進化的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的 (見，例如，Stemmer等人的美國專利第5,605,793號或Short的美國專 利第6,537,776號，其通過引用在此并入)。與本發(fā)明的肽相比，由定向 分子進化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將具有更小、更大或相同的作為支鏈淀粉酶起 作用的能力。
16在本發(fā)明另一種實施方式中，本發(fā)明的肽被用作融合蛋白， 其具有例如，其它的結(jié)構(gòu)性或功能性肽結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域可以，例 如，賦予融合蛋白其它的酶促能力或?qū)㈦南薅ㄔ诒砻妗?br> 17本發(fā)明的肽還包括那些由于存在多個基因、可選的轉(zhuǎn)錄事件、可選的RNA剪接事件和可選的翻譯和翻譯后事件而出現(xiàn)的肽。多肽可 在體系例如培養(yǎng)的細胞中表達，當表達的支鏈淀粉酶在天然細胞中表 達時所述體系導(dǎo)致出現(xiàn)基本上相同的翻譯后修飾，或在這樣的體系中 表達，當在天然細胞中表達時所述體系導(dǎo)致出現(xiàn)的翻譯后修飾刪除。
18本發(fā)明還包括組合物，所述組合物包括一種或多種支鏈淀粉
酶肽(或編碼它的核酸)和一種或多種另外的成分，例如載體、稀釋劑 或溶劑。所述另外的成分可以是使組合物可用于體外、體內(nèi)、制藥或 獸醫(yī)應(yīng)用的成分。
19在另一方面，本發(fā)明提供基本上純的核酸，所述核酸具有或 包括編碼肽的核苷酸序列，其氨基酸序列包括或者是本發(fā)明支鏈淀粉 酶肽的序列。
20在優(yōu)選的實施方式中，本主題支鏈淀粉酶核酸將包括轉(zhuǎn)錄調(diào)
控序列，例如，轉(zhuǎn)錄啟動子或轉(zhuǎn)錄增強子序列中的至少一個，其可操 作地連接至支鏈淀粉酶基因序列，例如使支鏈淀粉酶基因序列適合用 作表達載體。
21而在進一步優(yōu)選的實施方式中，編碼本發(fā)明支鏈淀粉酶肽的 核酸，在嚴格條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQ ID NOS: 1、3或5的至少12個連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選地對應(yīng)于SEQ ID NO: 1、 3或5的至少20個連續(xù)核苷酸。
22本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式提供本文描述的支鏈淀粉酶在 多種工業(yè)裝置中的應(yīng)用。例如，本發(fā)明涉及本發(fā)明的新型支鏈淀粉酶 變體在食品原料(包括，但不限于各種生面團和糖漿)、飲料(包括且不 限于各種釀造飲料，如啤酒和強麥酒)、生物乙醇和眾多本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員已知的其它產(chǎn)品的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
附圖簡述
23

圖1顯示在本方案中設(shè)計的支鏈淀粉酶方法和支鏈淀粉酶變 體的示意圖。
24圖2示出存在于本發(fā)明制造的支鏈淀粉酶表達菌株中的構(gòu)建 體的分子結(jié)構(gòu)，其與菌株BMP 139中的支鏈淀粉酶表達構(gòu)建物相比較。25圖3示出pICatH載體的示意圖。pICatH載體包含溫度敏感
9的復(fù)制起點(oripE194，用于在芽孢桿菌Cgacz'〃w力中復(fù)制)、ori pBR322
(用于在大腸桿菌(￡.中擴增)、用于篩選的新霉素抗性基因和具
有重復(fù)的天然地衣芽孢桿菌(及/z'c/^m/om^)氯霉素抗性基因(cat)—
一用于篩選、染色體整合和盒擴增。
26圖4示出pICatH-PUL0ril構(gòu)建物的示意圖。
27圖5示出pICatH-PULml04Oril構(gòu)建物的示意圖。
28圖6示出pICatH-PUL—E99Q_E103Q Ori構(gòu)建物的示意圖。
29圖7A-B示出密碼子優(yōu)化的"野生型"支鏈淀粉酶(PUL)
的(a)核酸序列[SEQIDNO: l]和(b)氨基酸序列[SEQ ID NO: 2]。
30圖8A-B示出PULml04支鏈淀粉酶的(a)核酸序列[SEQ ID
NO: 3]和(b)氨基酸序列[SEQIDNO: 4]。
0031圖9A-B示出PUL_E99Q—E103Q支鏈淀粉酶的(a)核酸序
歹U[SEQIDNO: 5]和(b)氨基酸序列[SEQIDNO: 6]。
定義部分
32應(yīng)當注意，如本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形 式"一"(a) 、 "一" (an)和"該"("the")包括復(fù)數(shù)指代物， 除非上下文另外明確說明。因此，例如，提及含有"化合物"("a compound")的組合物包括兩種或多種化合物的混合物。還應(yīng)注意， 術(shù)語"或"通常使用的意義包括"和/或"，除非上下文另有明確說明。
33術(shù)語"支鏈淀粉酶"是指一種特定種類的葡聚糖酶，降解普 魯分支葡聚糖的淀粉分解內(nèi)酶。它是由例如克雷伯菌屬 的革蘭氏陰性細菌作為細胞外的細胞表面錨定脂蛋白產(chǎn)生的。但是， 革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生支鏈淀粉酶作為分泌蛋白。I型支鏈淀粉酶特定地 攻擊a-l，6鍵，而II型支鏈淀粉酶也能夠水解oc-l，4鍵。它還可由某些
其它細菌和古細菌產(chǎn)生。支鏈淀粉酶在生物技術(shù)中用作去污劑。支鏈 淀粉酶(EC 3.2丄41)還被稱為普魯分支葡聚糖-6-葡聚糖水解酶(脫支 化酶)。普魯分支葡聚糖被認為是由a-l,6-糖苷鍵連接的麥芽三糖單位的 鏈。支鏈淀粉酶水解切割普魯分支葡聚糖(a-葡聚糖多糖)。
34術(shù)語"密碼子優(yōu)化"是指提高表達水平的技術(shù)，其通過用編 碼相同氨基酸但被宿主生物更有效處理的密碼子置換編碼序列中的核苷酸密碼子進行。不同物種之間的密碼子偏好性可顯著不同。為提高 外源蛋白在特定表達系統(tǒng)(細菌、真菌、酵母、昆蟲、植物或哺乳動物 細胞)中的表達水平，很重要的是調(diào)整外源蛋白密碼子的頻率，以匹配 宿主表達系統(tǒng)密碼子的頻率。 一個典型的實例是GFP(綠色熒光蛋白，
green fluorescent protein)，其被優(yōu)化以在哺乳動物細胞中獲得高水平表 達。因此，可將密碼子優(yōu)化用于在多種宿主生物中表達本發(fā)明蛋白一 一在所述宿主生物中這種序列可能不能有效表達，如果進行表達的話。35術(shù)語"表達載體"如本文使用是指重組DNA分子，其含有 所期望的編碼序列和適合的核酸序列，它們對于可操作連接的編碼序 列在具體宿主生物中表達是必需的。原核生物表達所必需的核酸序列 包括啟動子，任選地，操作子序列，核糖體結(jié)合位點和可能的其它序 列。
36如本文使用的"異源啟動子"是指天然地不與基因或純化的 核酸連接的啟動子。術(shù)語"啟動子"、"啟動子元件"或"啟動子序 列"如本文使用是指當連接至感興趣的核苷酸序列時，能夠控制感興 趣的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA的DNA序列。啟動子典型地，雖然不 是必要地，位于感興趣的核苷酸序列的5，(即上游)，啟動子控制到 mRNA的轉(zhuǎn)錄并提供用于RNA聚合酶特異結(jié)合的位點和用于轉(zhuǎn)錄起始
的其它轉(zhuǎn)錄因子。
37應(yīng)用于調(diào)控元件的術(shù)語"細胞類型特異的"或"宿主生物特 異的"或等同術(shù)語是指這樣的調(diào)節(jié)元件，其能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸 序列在特定類型的細胞或生物中選擇性表達——所述相同的感興趣核 苷酸序列在不同類型細胞或生物中、相同組織內(nèi)相對地沒有表達。當 被應(yīng)用于調(diào)節(jié)元件時，術(shù)語"細胞類型特異的"或"宿主生物特異的" 也指這樣的調(diào)控元件，其能夠促進感興趣的核苷酸序列分別在單一組 織或生物內(nèi)的區(qū)域中選擇性表達。
38肽的"分離"、"純化制備"或"基本上純的制備物"如本 文使用是指這樣的多肽，其已被鑒定并從至少一種通常與其天然狀態(tài) 結(jié)合或從其實際來源獲得的污染物中分離。所述至少一種其它污染物 可以是，例如，與其一起天然發(fā)生的其它蛋白、脂肪和核酸。優(yōu)選地， 多肽還從例如抗體或凝膠基質(zhì)的物質(zhì)分離，所述凝膠基質(zhì)例如聚丙烯
ii酰胺，用于純化所述多肽。優(yōu)選地，多肽占純化制備物干重的至少10、
20、 50、 70、 80或95%。優(yōu)選地，制備物包含足夠的多肽用于蛋白 測序；至少l、 10或100毫克的多肽；至少l、 10或100毫克的多肽。
39"純化的細胞制備物"如本文使用是指在植物或動物細胞的 情況下，細胞的體外制備物而不是全部完整的植物或動物。在培養(yǎng)的 細胞或微生物細胞的情況下，其由至少10%和更優(yōu)選地50%的目標 細胞制備物組成。
40"基本上純的核酸"，例如，基本上純的DNA，是指這樣 的核酸，其是如下的一種或兩種不與一個或兩個序列例如編碼序列 直接鄰近，其與所述編碼序列在核酸所來源的生物的天然發(fā)生的基因 組中直接鄰近(即， 一個在5'端而一個在3'端)；或其基本上沒有這樣的 核酸序列^其在所述核酸來源的生物中存在。術(shù)語包括，例如，重 組DNA，其整合到載體中，例如，整合到自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《局?， 或到原核生物或真核生物的基因組DNA中，或作為獨立于其它DNA 序列的單獨分子(例如，由PCR或限制內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因 組DNA片段)存在。另外，術(shù)語"分離的"，當用于涉及核酸時，如 在"分離的核酸序列"中是指這樣的核酸序列，其被鑒定并從至少--種通常與其以天然狀態(tài)結(jié)合或從其實際來源獲得的污染物核酸中分 離。分離的核酸是以不同于在自然中發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置存在的核酸。 相反地，未分離的核酸是指核酸例如DNA和RNA，它們以天然狀態(tài) 存在。例如，給定的DNA序列(例如，基因)在宿主細胞染色體上發(fā)現(xiàn)， 與比鄰基因(neighboring gene)相鄰；RNA序列，如編碼特定蛋白的 特定mRNA序列，在細胞中發(fā)現(xiàn)，作為與眾多編碼眾多蛋白質(zhì)的其它 mRNA—起的混合物。然而，包含例如SEQIDNO:l的分離的核酸序 列包括，例如，在細胞中的核酸，所述細胞通常含有SEQ ID NO:l， 其中所述核酸序列在不同于天然細胞的染色體內(nèi)或染色體外位置，或 另外地，由與在自然中發(fā)現(xiàn)的核酸序列不同的核酸序列側(cè)翼。分離的 核酸序列可以單鏈或雙鏈形式存在。當分離的核酸序列被用于表達蛋 白質(zhì)時，所述核酸序列將包含(最少)有義或編碼鏈的至少一部分(即， 核酸序列可以是單鏈的)。可選地，它可包含有義和反義鏈(即，核酸 序列可以是雙鏈的)。41"同源"如本文使用是指兩個多肽分子之間或兩個核酸分子 之間的序列相似性。當兩個對比序列的一個位置被相同堿基或氨基酸
單體亞單位占據(jù)時，例如，如果兩個DNA分子中的每個DNA分子的
一個位置被腺嘌呤占據(jù)，那么，在那個位置上分子同源。兩個序列之 間的同源性百分比是兩個序列共有的匹配或同源位置的數(shù)目除以對比
位置的數(shù)目xl00的函數(shù)。例如，如果在兩個序列中10分之6的位置匹 配或同源，那么兩個序列是60%同源。例如，DNA序列ATTGCC和 TATGGC具有50。/。同源性。通常，比較在比對兩個序列時進行，以 給出最大同源性。
42術(shù)語"肽(一個或多個)"、"蛋白(一種或多種)"和"多 肽(一種或多種)"于此可互換使用。
43術(shù)語"蛋白酶"是指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)域或多肽， 它們源于微生物例如真菌、細菌，或源于植物或動物，并且具有催化 蛋白骨架上一個或多個不同位置上的肽鍵的切割的能力。
44優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的支鏈淀粉酶蛋白是分離的或純化的。 純化或分離的意思是由于將支鏈淀粉酶從某些或所有自然發(fā)生的、與 其自然結(jié)合的組分中分離，支鏈淀粉酶蛋白從其自然狀態(tài)發(fā)生改變。 這種分離或純化的完成可以通過本領(lǐng)域公認的分離技術(shù)，例如離子交 換層析、親和層析、疏水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或其 它蛋白質(zhì)鹽沉淀、離心、大小排阻層析、過濾、微過濾、在梯度上的 凝膠電泳或分離進行，從而去除在最終組合物中不期望的完整細胞、 細胞碎片、雜質(zhì)、外來蛋白或酶。進一步可能的是隨后將組分加入到 含有支鏈淀粉酶的組合物，這可提供額外優(yōu)勢，例如，活化劑、抗抑 制劑、希望的離子、控制pH的化合物或其它酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明 的支鏈淀粉酶蛋白通過重組方法產(chǎn)生。
45如本文使用的"微生物"是指細菌、真菌、病毒、原生動物 和其它微生物或微小生物。在本發(fā)明中，微生物用作外源肽表達的宿 主。
46如本文使用的"衍生物"、"變體"或"修飾的肽、多肽或 蛋白質(zhì)"表示來源于前體蛋白(例如天然蛋白)的蛋白質(zhì)，其是通過在 C-和N-端的任一端或兩端加入一個或多個氨基酸，在氨基酸序列的一
13個或多個不同位點置換一個或多個氨基酸，在蛋白質(zhì)任一端或兩端或 者在氨基酸序列中的一個或多個位點缺失一個或多個氨基酸，或在氨 基酸序列中的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸而得到。優(yōu)選地 如下獲得支鏈淀粉酶衍生物制備物修飾編碼天然蛋白的DNA序列，
將該DNA序列轉(zhuǎn)化至適合的宿主，并且表達修飾的DNA序列以形成 支鏈淀粉酶衍生物。本發(fā)明的"衍生物"包括肽，其包括與前體氨基 酸序列(例如野生型或天然狀態(tài)的支鏈淀粉酶)相比改變了的氨基酸序 列，其中所述肽保留前體支鏈淀粉酶特有的支鏈淀粉酶性質(zhì)，但是在 某些具體方面具有改變的性質(zhì)。例如，支鏈淀粉酶衍生物可具有增加 的最適pH，對酶促降解或其它降解增加的抗性，增加的酶促有效性， 增加的溫度或氧化穩(wěn)定性，但保留其特有的酶促修飾活性。類似地， 根據(jù)本發(fā)明的衍生物包括蛋白質(zhì)、或其它底物、結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其已被 添加或修飾以改變其底物結(jié)合能力?？煽紤]的是根據(jù)本發(fā)明的衍生物 源于編碼支鏈淀粉酶衍生物的DNA片段，其中表達的支鏈淀粉酶衍生 物的功能性活性被保留。衍生物進一步包括改變支鏈淀粉酶特性的化 學修飾。
47通常地，支鏈淀粉酶衍生物將具有至少約50%、 "70。/?；?5 %氨基酸序列同一性，優(yōu)選地至少約85 %氨基酸序列同一性，更優(yōu) 選地至少約90 %氨基酸序列同一性，甚至更優(yōu)選地至少約95 %氨基 酸序列同一性，還更優(yōu)選地98%氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，任何氨 基酸置換是使用L-氨基酸的"保守氨基酸置換"，其中一種氨基酸被 另一種生物學相似的氨基酸置換。保守氨基酸置換是保持被取代氨基 酸的通常的電荷、疏水性/親水性、和/或空間排列體積(stericbulk)的 那些置換。保守置換的實例是在下列組之間的那些Gly/Ala， Val/Ile/Leu， Lys/Arg， Asn/Gln， GIu/Asp， Ser/Cys/Thr和Phe/Trp/Tyr。 衍生物可例如只有l(wèi)至10個氨基酸殘基不同，如6-10個，只有5個、 只有4、 3、 2或甚至1個氨基酸殘基不同。表1于此示例性說明在本 領(lǐng)域公認的氨基酸置換。
48如在此使用的，支鏈淀粉酶的"天然序列"或支鏈淀粉酶的"野 生型"序列包括多肽，其具有與源于天然的親本菌株的支鏈淀粉酶相同 的氨基酸序列，或與來自從其制備修飾或衍生支鏈淀粉酶的支鏈淀粉酶相同的氨基酸序列，例如，由本發(fā)明的親本菌株R deram折cara (BMP 139)表達的支鏈淀粉酶。這種天然序列的支鏈淀粉酶可從自然界分離或 可通過重組或合成方法產(chǎn)生。在一種實施方式中，術(shù)語"野生型，，或"天 然序列"的支鏈淀粉酶是指這樣的支鏈淀粉酶肽，其中本發(fā)明變體從其 衍生，并且為圖7b中的SEQIDNO: 2。
49如此處使用的，關(guān)于此處鑒定的氨基酸或核苷序列的"百分 比(％)序列同一性"被定義為候選序列中與支鏈淀粉酶序列中的氨基酸 殘基或核苷相同的氨基酸殘基或核苷的百分比，如有必要，在經(jīng)過比 對序列和引入空位(gap)后，以獲得最大百分比序列同一性，并且不 考慮將任何保守置換作為序列同一性的部分。進行序列比對和確定序 列同一性的方法是普通技術(shù)人員己知的，其可以進行而無不適當?shù)膶?驗，并且同一性數(shù)值的計算可以明確獲得。參見，例如，Ausubel等人， eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology,第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience ， New York);禾卩ALIGN程序(Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)。許多算法可用于對 比序列和確定序列同一性，并且包括，例如同源性比對算法，Needleman 等人，(1970)J.MoI.Biol.48:443;局部同源性算法，Smith等人，(1981) Adv. Appl. Math. 2:482;搜索相似方法'Pearson等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444; Sm池-Waterman算法(Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997);以及BLASTP、 BLASTN和BLASTX算法(見Altschul等人， (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)。使用這些算法的計算程序也是可用 的，包括但不限于ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件，或 WU-BLAST-2 (Altschul等人，Meth. Enzym., 266:460-480 (1996));或 GAP、 BESTFIT、 BLAST (Altschul等)，見上文，F(xiàn)ASTA和TFASTA， 可獲自Genetics Computing Group (GCG) package, Version 8, Madison, Wis., USA;禾Q Intelligenetics， Mountain View, Calif的PC/Gene程序中 的CLUSTAL。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定用于測定比對的適合參數(shù)， 包括為獲得被比較的序列長度上的最大比對所需的算法。優(yōu)選地，使 用由程序確定的默認參數(shù)測定序列同一性。具體地，可通過 Smith-Waterman同源性搜索算法測定序列同一性(Meth. Mol. Biol.70:173-187 (1997))，如使用仿射空位搜索在MSPRCH程序(Oxford Moecuar)中執(zhí)行的，所述仿射空位搜索具有下列搜索參數(shù)空位開放 罰分(gap open penalty )為12并且空位延伸罰分(gap extension penalty) 為1。優(yōu)選地，成對氨基酸比較可使用Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis.的GCG序列分析軟件包的GAP程序進行，使用 blosum62氨基酸置換矩陣，其空位量為12并且長度量為2。對于兩個 氨基酸序列的最適比對，變體氨基酸序列的連續(xù)片段相對于參考氨基 酸序列可具有額外的氨基酸殘基或缺失的氨基酸殘基。用于與參考氨 基酸序列比較的連續(xù)片段包括至少20個連續(xù)的氨基酸殘基，并可以是 30、 40、 50或更多個氨基酸殘基。與衍生物的氨基酸序列中包括空位 有關(guān)的增加的序列同一性的修正可通過指定空位罰分進行。
50如本文使用，"表達構(gòu)建物"(或"表達載體")是指DNA 構(gòu)建物，其包括被可操作連接到適合的控制序列的DNA序列，所述 適合的控制序列能夠影響DNA在合適宿主內(nèi)的表達。這種控制序列 可包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操作子序列、編碼 mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序 列。本發(fā)明不限于使用任何具體表達構(gòu)建物。不同細胞類型優(yōu)選地使 用不同的表達載體。例如，用于枯草芽孢桿菌的載體的優(yōu)選啟動子是 AprE啟動子；用于5a"7/"5 oferam訴cam的載體的優(yōu)選啟動子是amyL 啟動子；用于大腸桿菌(￡. //)的優(yōu)選啟動子是Lac啟動子；用于啤酒 酵母的優(yōu)選啟動子是PGK1;用于黑曲霉的優(yōu)選啟動子是glaA;以及用 于里氏木霉的優(yōu)選啟動子是cbhl。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體?；騼H僅 是可能的基因組插入。
51
一旦被轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)至適合的宿主，表達構(gòu)建物可不依賴 于宿主基因組進行復(fù)制和發(fā)揮功能，或者可以在適合的條件下，整合 到宿主本身的基因組中。在本說明書中，術(shù)語"質(zhì)粒"、"載體"和 "表達構(gòu)建物(一種或多種)"有時互換使用。然而，本發(fā)明意圖包 括其它形式的表達載體，其發(fā)揮等同功能并且其是或成為本領(lǐng)域已知 的。因此，大量的宿主/表達載體組合可用于表達本發(fā)明的DNA序列。
本說明書的其它地方未提及的對本發(fā)明有用的表達載體，例如，可由 染色體片段、非染色體和合成的DNA序列組成，例如各種已知的SV40衍生物和已知的細菌質(zhì)粒，例如，來自大腸桿菌(eco")的質(zhì)粒，其
包括colEl、 pCRl、 pBR322、 pMb9、 pUC19和其衍生物;更寬宿主范 圍的質(zhì)粒，例如RP4;噬菌體DNA，例如噬菌體X的眾多衍生物，例 如NM989;其它DNA噬菌體，例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體； 酵母質(zhì)粒，例如2d質(zhì)?；蚱溲苌?，用于真核細胞的載體，例如用于 動物細胞的載體和源于質(zhì)粒和噬菌DNA組合的載體，如被修飾從而使 用噬菌體DNA或其它表達控制序列的質(zhì)粒。
52使用本發(fā)明表達載體的表達技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并通常描述 在，例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第二版，Cold Spring Harbor Press (1989)。通常，包括本發(fā) 明DNA序列的這種表達載體被轉(zhuǎn)化至單細胞宿主，其通過整合事件直 接插入至特定物種的基因組中進行(參見，例如Bennett & Lasure， MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI， Academic Press, San Diego， pp. 70-76 (1991)和其引用的描述靶向基因組插入到真菌宿主的 文章)。
53術(shù)語"可操作連接"、"可操作組合"和"可操作順序"如 本文使用是指連接核酸序列，以使它們發(fā)揮它們預(yù)期的功能。例如， 可操作連接啟動子序列至感興趣的核苷酸序列是指連接啟動子序列和 感興趣的核苷酸序列，以使啟動子序列能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列 的轉(zhuǎn)錄和/或感興趣的核苷酸序列編碼的多肽的合成的方式進行。類似 地，將具有年齡-相關(guān)調(diào)節(jié)活性的核酸序列可操作連接到啟動子序列和 到感興趣的核苷酸序列是指，連接具有年齡-相關(guān)調(diào)節(jié)活性的核酸序列、 啟動子序列和感興趣的核苷酸序列，以使具有年齡-相關(guān)調(diào)節(jié)活性的核 酸序列能夠在一段時間改變感興趣的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄至mRNA的水平 和/或由感興趣的核苷酸序列編碼的多肽的合成的方式進行。
54如本文使用"宿主生物"、"宿主菌株"或"宿主細胞"是 指對于包括根據(jù)本發(fā)明DNA的表達載體適合的宿主。用于本發(fā)明的宿 主細胞通常是原核或真核宿主，其包括任何可轉(zhuǎn)化的微生物，其中可 獲得表達。在本發(fā)明的內(nèi)容中，例如，宿主菌株可以是枯草芽孢桿菌 (5ac/〃w sm6///^) 、 Bac/〃ws oferamz/toam (或其它芽孢桿菌種)、埃希 氏大腸桿菌(￡^eWc/z/a co//)、里氏木霉(7Wc/wo^ma陋e/)、啤酒酵母(Sacc/wromyces cereWw'ae)或黑曲霉(^5/ erg/〃1^ w'ger)。以應(yīng)用重組 DNA技術(shù)構(gòu)建的載體來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。這種轉(zhuǎn)化的宿主細胞能 夠復(fù)制編碼支鏈淀粉酶和其衍生物或變體(突變體)的載體或表達所期 望的肽產(chǎn)物或二者兼有。
55術(shù)語"培養(yǎng)"或"培養(yǎng)條件(一種或多種)"當用于生長宿 主生物群體時，是指培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，其適合宿主生物 的生長，并且在用本發(fā)明核苷酸序列及其變體轉(zhuǎn)染的宿主生物的情況 下，適合產(chǎn)生本發(fā)明的支鏈淀粉酶。本發(fā)明不限于任何具體培養(yǎng)或培 養(yǎng)條件，只要前述是令人滿意的。
56如本文使用，"功能性附著"或"可操作連接"是指調(diào)節(jié)區(qū)，例 如啟動子、終止子、分泌信號或增強子區(qū)，其附著到或連接至結(jié)構(gòu)基 因并控制該基因的表達。
57如本文使用，物質(zhì)(例如多核苷酸或蛋白質(zhì))"源自"微生物是 指該物質(zhì)是該微生物本身的。
58"木霉(7Wc/zot/wwa)"或"木霉種(Tn'cWe畫^.)" 是指任何真菌菌株，其以往被分類為木霉(7Wc/w&，a)或目前被分 類為木霉(7Wc/2o&ma)。優(yōu)選地，該物種是長柄木霉(7Wc/7^fe，a /o"g/6rac/z/af畫)、里氏木霉 (7h'c/2ocfer腿麼緒.)或綠色木霉 (7Wc/7oArmavzW^)。在本發(fā)明中，木霉種可作為本發(fā)明的宿主生物 使用。
59如本文所述，本發(fā)明的一個方面以"基本上純的"(或重組的) 核酸和/或這種核酸的等價物為特征，所述核酸包括編碼支鏈淀粉酶多 肽的核苷酸序列。術(shù)語核酸如本文使用可包括片段和等價物。術(shù)語"等 價物"是指編碼功能上等同的多肽或功能上等同的蛋白質(zhì)的核苷酸序 列。等同的核苷酸序列包括由于一個或多個核苷酸置換、添加或缺失 而不同的序列，例如等位變體，并且包括與SEQ ID NO: l中示出的 支鏈淀粉酶的核苷酸序列不同的序列，原因在于遺傳密碼的簡并性。
60除非另有所述，本發(fā)明實踐采用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分 子生物學、轉(zhuǎn)基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)， 其在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。這種技術(shù)描述于文獻中。于此引用的所 有出版物、專利和專利申請通過引用為所有目的全部引入于此。見例
18如Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I或II (D. N. Glover編輯，1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed.， 1984); Mullis等，美國專利號4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames禾Q S. J. Higgins編輯，1984); Transformation And Translation (B. D. Hames禾口 S. J. Higgins編輯， 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal， A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos編輯，1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu等人，編輯)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer禾口 Walker編輯，Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell,編輯， 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpringHarbor,N. Y.， 1986)。同樣，關(guān)于蛋白酶的制備、表 達、分離和使用方法的信息可通過美國專利第6,768,001號獲得，其于 此通過引用完整引入。
61在下列具體描述和權(quán)利要求中，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將 明顯可見。
發(fā)明詳述
62本發(fā)明現(xiàn)僅使用下述定義和實例，通過引用方式詳述于此。 所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物內(nèi)公開的所有序列，于 此明確地通過引用而并入。
63除非于此另外定義，如本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有 本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton等人 的 DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.， John Wiley和Sons, New York (1994)和Hale & Marham， THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY ，
19Harper Perennial, NY (1991)提供給技術(shù)人員在本發(fā)明中使用的許多術(shù) 語的通用字典。雖然任何類似或等同于那些在此所述的方法和材料可 在本發(fā)明的實踐或測試中使用，但是優(yōu)選的方法和材料被描述。數(shù)值 范圍包括定義該范圍的數(shù)值。除非另有所述，分別地，核酸以5'至3' 方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左向右書寫。 對本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，專業(yè)人員可具體注意Sambrook等人，1989 和Ausubel FM等人，1993。應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法、 方案和試劑，因為這些可變化。
64數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)值。
65除非另有所述，分別地，核酸以5'至3'方向從左向右書寫； 氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左向右書寫。
66本文提供的標題不限制本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓绞?，其?br> 通過作為整體參考說明書而理解。因此，緊接在下面定義的術(shù)語通過 作為整體參考說明書而被更充分地定義。
分子生物學
67在一種實施方式中，本發(fā)明提供在amyL啟動子控制下異源 基因的表達。因此，本發(fā)明依賴于重組遺傳領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。公開用 于本發(fā)明的普通方法的基本文本包括Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)禾口 Ausubel等人編車葺，Current Protocols in Molecular Biology (1994))。
68包括絲狀真菌的纖維素酶基因啟動子序列的異源基因，在被 轉(zhuǎn)化到里氏木霉細胞用于復(fù)制和/或表達之前，通常被克隆到中間載體 中。這些中間載體典型地是原核載體，例如質(zhì)?；虼┧筝d體。
69為了獲得克隆基因的高水平表達，異源基因優(yōu)選地位于與自 然發(fā)生纖維素酶基因距啟動子的距離大約相同的距離上。但是，如本 領(lǐng)域已知的，該距離的一些變化可允許而不損失啟動子功能。
70本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可意識到自然啟動子可通過置換、取 代、添加或去除一種或多種核苷而不改變其功能來修飾。本發(fā)明實踐 包括并不限于這種對啟動子的改變。71表達載體/構(gòu)建物典型地包含轉(zhuǎn)錄單位或表達盒，所述轉(zhuǎn)錄 單位或表達盒包含所有異源序列表達所需的附加元件。因此，典型的 表達盒包含可操作地連接至異源核酸序列的啟動子和轉(zhuǎn)錄物有效多聚 腺嘌呤化作用所需的信號，核糖體結(jié)合位點和翻譯終止。所述盒的附
加元件可包括增強子和，如果基因組DNA用作結(jié)構(gòu)基因，具有功能
性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。
72本發(fā)明的實踐不受遺傳構(gòu)建物中啟動子的選擇的限制。但是， 示例性啟動子是里氏木霉cbhl、 cbh2、 egl、 eg2、 eg3、 eg5、 xlnl和 xln2啟動子。
73除啟動子序列之外，表達盒還應(yīng)包含結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū) 下游，以提供有效終止。終止區(qū)可從與啟動子序列相同的基因獲得， 或可從不同基因獲得。
74雖然任何真菌終止子在本發(fā)明中可能具有功能，但優(yōu)選的終 止子包括來自構(gòu)巢曲霉(」^ e/^7/wmWM/"ra) trpC基因的終止子 (Yelton,M.等人，(1984) PNAS USA 81 :1470-1474; Mullaney, E丄等人， (1985) MGG 199:37-45)，泡盛曲霉(A; erg/〃Ms awomon')或黑曲霉
"^e，7/M "/ger)葡糖淀粉酶基因(Nunberg， J.H.等(1984) Mol. Cell Biol. 4:2306, Boel, E.等(1984) EMBO J. 3:1581-1585)和米黑毛霉 (MMcorm/e/2e/)羧基蛋白酶基因(EPO
發(fā)明者B·S·米勒, C·弗勒門, G·英格蘭德, M·孔克曼 申請人:美國丹尼斯克有限公司杰能科子公司