專利名稱：：動物用飼料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有產(chǎn)生酸性酶的能力的曲霉屬菌及含有桿菌屬細(xì)菌的動物用飼料添加劑。
背景技術(shù)：
：家畜或?qū)櫸?以下稱為動物)等的飼料雖然進(jìn)行粉碎等的加工，但由于一般不進(jìn)行加熱處理等，因此存在消化吸收率變低、飼料效率差的問題。而且，最近作為人類的疾病已知的潰瘍性結(jié)腸炎或克隆病等的炎癥性腸病在動物中也見報告，存在引起腹瀉等的癥狀的問題。此外，也已知這樣的炎癥性腸病會降低飼料的吸收或妨礙健康肥育。作為引起動物的腸內(nèi)感染癥的病原菌，已知的有病原性大腸菌、沙門氏菌屬細(xì)菌、梭菌屬細(xì)菌、彎形菌屬細(xì)菌等。已知這樣的病原菌在異常增殖時會產(chǎn)生毒素(腸毒素、細(xì)胞毒素)，在腸管粘膜引起疾病，引起軟便或劇烈的腹瀉等。此外，球蟲是寄生于雞、豬、牛等的腸管內(nèi)的原蟲，感染時會引起腹瀉、食欲不振等。為預(yù)防，治療這樣的炎癥性腸病而使用抗生素，但存在出現(xiàn)耐藥性菌等的問題。近年來，為了改善腸內(nèi)菌群的平衡、抑制腸內(nèi)病原菌的增殖而使用益生菌的技術(shù)正受到注目(專利文獻(xiàn)l、專利文獻(xiàn)2)。但是，乳酸菌或雙歧桿菌在0.3%脫氧膽酸的濃度下死亡或在pH4以下中死亡的居多，除了統(tǒng)稱為大腸菌群的細(xì)菌以外，以在膽汁酸中在對微生物具有強(qiáng)烈的抗菌性的脫氧膽酸的存在下不能生存的菌種居多。所以，人們探求在動物的消化管內(nèi)也不死亡、給宿主帶來有利的效果的菌種。另一方面，報告有通過將動物用飼料在其加工階段用酶或酶生產(chǎn)菌處理，預(yù)先某種程度分解好，由此減輕動物的胃腸負(fù)擔(dān)的技術(shù)等有助于消化器系統(tǒng)的疾病的預(yù)防或改善(專利文獻(xiàn)3)。此外，已知有一種方法，用曲霉菌使魚粉以低水分發(fā)酵來得到含有高濃度的蛋白酶、脂肪酶等的魚用魚粉發(fā)酵飼料(專利文獻(xiàn)4)。然而，這樣的技術(shù)中存在一個問題，即提高飼料中的水分含量進(jìn)行飼料的成分分解之后，需要進(jìn)行干燥并產(chǎn)品化的繁雜的工序。為成分分解而提高水分含量的飼料甚至還存在容易產(chǎn)生腐敗菌或霉等，難以維護(hù)品質(zhì)等的問題。此外，雖報告有一種將曲霉菌向動物經(jīng)口投與來改良動物的翼便的方法，但未對抑制在動物腸內(nèi)引起炎癥等的有毒細(xì)菌的增殖或促進(jìn)體重增加這樣的用途進(jìn)行過研究，也不知以使曲霉菌產(chǎn)生酸性酶的形態(tài)投與動物的情況(專利文獻(xiàn)5)。此外，記載有一種方法，在甲殼類的甲殼粉碎物中加入并混合發(fā)酵營養(yǎng)源，在其中接種選自黑曲霉、米曲霉、枯草桿菌、地衣形芽胞桿菌的1種或2種以上，并使幾丁質(zhì)或殼聚糖分解得到發(fā)酵物并給予動物(專利文獻(xiàn)6)。用該方法得到的動物的成長促進(jìn)效果一部分得到承認(rèn)，但未對抑制動物腸內(nèi)的病原菌的增殖、預(yù)防，治療腸內(nèi)感染癥進(jìn)行過研究，這樣的效果也未得到承認(rèn)。此外，混合兩種以上的微生物并投與動物這一情況，實際上并未被研究。此外，報告有枯草桿菌具有對病原性大腸桿菌等的病原菌的抗菌活性(專利文獻(xiàn)7、8)，但對經(jīng)口投與動物沒有研究。此外，已知枯草桿菌DB9011具有黃曲霉毒素分解性，阻礙真菌的發(fā)育，研究了被添加到飼料中的情況(專利文獻(xiàn)9)。然而，迄今為止尚未對組合枯草桿菌和其他系統(tǒng)的微生物并使動物攝取一事進(jìn)行研究。專利文獻(xiàn)1:日本專利特表2005-507670號公報專利文獻(xiàn)2:日本專利特表2004-523241號公報專利文獻(xiàn)3:日本專利特開2004-141147號公報專利文獻(xiàn)4:日本專利特表平6-319464號公報專利文獻(xiàn)5:日本專利特開平11-171674號公報專利文獻(xiàn)6:日本專利特開2002-238466號公報專利文獻(xiàn)7:日本專利特開平11-332555號公報專利文獻(xiàn)8:日本專利特開平11-285378號公報專利文獻(xiàn)9:日本專利第3040234號公報非專禾U文獻(xiàn)1:GeorgeA.Burdock,MadhusudanG..Soni，andLoanaG..Carabin(2001)RegulatoryToxicologyandPharmacology33,80-101非專利文獻(xiàn)2:HanyE.Morton,WalterKocholaty,RenateJunowicz-Kocholaty,andAlbertKelner(1945)J.Bacteriol50,579-58
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于提供用于輔助動物的消化活動、提高飼料效率的安全且簡便的手段。具體地講，課題在于提供這樣一種手段，通過抑制動物腸內(nèi)的病原菌或球蟲的增殖來預(yù)防，改善腸內(nèi)感染癥，并實現(xiàn)動物的體重增加。本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行專心研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉產(chǎn)生酸性酶尤其是產(chǎn)生淀粉酶的能力優(yōu)異、這些菌具有對引起腸內(nèi)感染癥的病原菌的抗菌活性以及具有對于球蟲的殺原蟲活性、以及這些作為益生菌發(fā)揮功能。此外，發(fā)現(xiàn)這些菌的酸性酶產(chǎn)生能力在以糙米為營養(yǎng)源培養(yǎng)時極其優(yōu)異。而且，發(fā)現(xiàn)通過將這些菌體和由菌體產(chǎn)生的酸性酶組合并與飼料一同使動物攝取，由此促進(jìn)消化、預(yù)防，改善腸內(nèi)感染癥、有助于動物的體重增加。此外，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌即使與上述曲霉屬菌及該菌所產(chǎn)生的酸性酶共存，也不妨礙其增殖。而且，發(fā)現(xiàn)通過將曲霉屬細(xì)菌及該菌所產(chǎn)生的酸性酶、以及枯草桿菌組合并使動物攝取，可得到更優(yōu)異的成長促進(jìn)效果、腸內(nèi)感染癥的預(yù)防-改善效果，以至完成本發(fā)明。艮P，本發(fā)明如下所述。(1)一種動物用飼料添加劑，含有選自醬油曲霉(Aspergillussojae)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、黑曲霉(Aspergillusniger)及米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一種的曲霉屬菌、含有這些菌所產(chǎn)生的酸性酶的培養(yǎng)物以及枯草桿菌(Bacillussubtilis)，其特征在于，每g飼料添加劑的酸性酶活性的總合為120U以上，枯草桿菌的濃度為2.5xl07~2xl09CFU/g。(2)如(1)記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，所述酸性酶含有酸性淀粉酶，每g詞料添加劑的酸性淀粉酶活性為1U以上。(3)如(1)或(2)記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，所述曲霉屬菌具有對引起動物腸內(nèi)感染癥的病原菌的抗菌活性及/或?qū)τ谇蛳x的殺原蟲活性。(4)如(1)~(3)的任一項記載的動物用飼料添加劑，所述曲霉屬菌是醬油曲霉及/或米曲霉。(5)如(1)~(4)的任一項記載的動物用飼料添加劑，米曲霉是IK-05074株(FERMBP-10622)及/或它們的變異株，其特征在于，是具有與所述菌株相同的酸性酶產(chǎn)生能力的菌株。(6)如(1)~(5)的任一項記載的動物用飼料添加劑，所述培養(yǎng)物含有植物性營養(yǎng)源。(7)如(6)所記載的動物用飼料添加劑，所述植物性營養(yǎng)源是糙米。(8)如(1)~(7)的任一項記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，枯草桿菌是DB9011株(FERMBP-3418)及/或它們的變異株。(9)如(1)~(8)的任一項記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，用于成長促進(jìn)。(10)如(1)~(8)的任一項記載的動物用詞料添加劑，其特征在于，用于腸內(nèi)感染癥的預(yù)防'改善。(11)一種飼料，含有0.01~1.0質(zhì)量％的(1)~(10)的任一項記載的動物用飼料添加劑。(12)—種飼料的制造方法，其特征在于，包括以下工序，在含有用于曲霉屬菌的增殖的營養(yǎng)源的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)選自醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一種的曲霉屬菌而得到培養(yǎng)物，含有該得到的培養(yǎng)物至每kg飼料的酸性酶活性的總和在12U以上的工序、和含有枯草桿菌至濃度為2.5xl06~2xl01QCFU/kg的工序。(13)—種動物的飼養(yǎng)方法，其特征在于，使動物攝取(11)所記載的詞料。具體實施例方式本發(fā)明的動物用飼料添加劑的特征為，含有選自醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一種的曲霉屬菌、含有這些菌所產(chǎn)生的酸性酶的培養(yǎng)物、以及枯草桿菌(Bacillussubtilis)細(xì)菌。本發(fā)明的動物用飼料添加劑中含有的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉在該
技術(shù)領(lǐng)域：
中根據(jù)通常用于曲霉菌的種類鑒別的方法分類時，是分別被分類在上述這些種中的菌。菌種的鑒別，也可以參照如"H.Murakami,TheJournalofGeneralandAppliedMicrobiology,17,p.281-309，(1971)"、"村上英也，日本釀造協(xié)會志，第74巻，第12號，p.849陽853，(1979)，，、"Nikkuni，S.,etal,TheJournalofGeneralandAppliedMicrobiology,44，p.225-230,(1998)"等。醬油曲霉是見于土壤、曲等中的絲狀不完全菌的一種，是用于醬油、醬的釀造的菌。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，只要是具有產(chǎn)生以下詳述的酸性酶中至少一種、優(yōu)選具有產(chǎn)生酸性淀粉酶的能力的、在動物攝食這一點(diǎn)上安全的醬油曲霉，則可以無特別限制地使用。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以使用市售的菌株，作為這種菌可以優(yōu)選使用醬油曲霉AOK210株(株式會社秋田今野商店)。溜曲霉是見于土壤、曲、食品等中的絲狀不完全菌的一種，是用于醬油、醬的釀造的菌。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，只要是具有產(chǎn)生以下詳述的酸性酶中至少一種、優(yōu)選具有產(chǎn)生酸性淀粉酶的能力的、在動物攝食這一點(diǎn)上安全的溜曲霉，則可以無特別限制地使用。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以使用市售的菌株，作為這種菌可以優(yōu)選使用溜曲霉AOK43株(株式會社秋田今野商店)。臭曲霉是見于土壤、曲、谷物糟粕等中的絲狀不完全菌的一種，是用于醬、醬油的釀造的菌。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，只要是具有產(chǎn)生以下詳述的酸性酶中至少一種、優(yōu)選具有產(chǎn)生酸性淀粉酶的能力的、在動物攝食這一點(diǎn)上安全的臭曲霉，則可以無特別限制地使用。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以使用市售的菌株，作為這種菌可以優(yōu)選使用臭曲霉AOKN4586株(株式會社秋田今野商店)。黑曲霉是見于土壤、曲、谷物糟粕等中的絲狀不完全菌的一種，是在酒類制造、食品加工、糖的制造或醫(yī)藥的制造等各種場合中使用的菌。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，只要是具有產(chǎn)生以下詳述的酸性酶中至少一種、優(yōu)選具有產(chǎn)生酸性淀粉酶的能力的、在動物攝食這一點(diǎn)上安全的黑曲霉，則可以無特別限制地使用。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以使用市售的菌株，作為這種菌可以優(yōu)選使用黑曲霉AOKB650株(株式會社秋田今野商店)。此外，也可以使用AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株的變異株。變異株可以使這些菌株自然變異、或可以從用化學(xué)變異劑、或紫外線等進(jìn)行變異處理而得到的菌株中挑選并得到分別與AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株一樣地具有產(chǎn)生酸性酶的能力的菌株。此外，還優(yōu)選使用，除了產(chǎn)生酸性酶的能力之外進(jìn)一步具有與上述菌株相同抗菌活性、殺原蟲活性、耐膽汁酸性、耐酸性的至少一個的上述菌株的變異株。此外，進(jìn)一步優(yōu)選使用上述以外的菌學(xué)性質(zhì)也和AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株一樣的變異株。米曲霉是見于土壤、曲等中的絲狀不完全菌的一種，是用于醬油、醬的釀造的菌。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，只要是具有產(chǎn)生以下詳述的酸性酶中至少一種、優(yōu)選具有產(chǎn)生酸性淀粉酶的能力的、在動物攝食這一點(diǎn)上安全的米曲霉，則可以無特別限制地使用。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以使用市售的菌株，作為這種菌可以優(yōu)選使用米曲霉IK-05074株。IK-05074株是自各種發(fā)酵食品中分離得到的株，于平成18年2月15日以保藏編號FERMP-20798保存于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566，日本國茨城縣筑波巿東1丁目1番地1中央第6)中，于平成18年6月20日根據(jù)布達(dá)佩斯條約移交國際保藏，所受保藏編號為FERMBP-10622。IK-05074株的菌學(xué)性質(zhì)如下。(1)菌落的性狀(Czapek-DoX瓊脂培養(yǎng)基(25。C下培養(yǎng)7天))大小為直徑5060mm、顏色從黃到綠、隨著時間的經(jīng)過變化成帶有褐色的顏色。菌絲體不明顯，背面是無色。(2)形態(tài)分生孢子柄薄壁厚壁、滑面稍微粗糙面、直徑20nm以下、長度2mm以下、頂囊(頂O5)為直徑405(Him、8(Him以下的球形。?；诖蟛糠执蟮姆稚咦颖写嬖冢L度12^m以下。瓶梗安瓿型、長度為812pm、具有短的頸部。分生孢子直徑5~6|um的球形、顏色從黃至綠，表面滑面微細(xì)的粗糙面。根據(jù)以上，推定IK-05074株歸屬于米曲霉(Aspergillusoryzae)。此外，在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以使用IK-05074株的變異株。IK-05074株的變異株可以是使IK-05074株自然變異、或者從用化學(xué)變異劑或紫外線等進(jìn)行變異處理而得到的菌株中挑選得到與IK-05074株一樣地具有產(chǎn)生酸性酶的能力的菌株。此外，也優(yōu)選除了產(chǎn)生酸性酶的能力之外進(jìn)一步具有與IK-05074株相同的抗菌活性、殺原蟲活性、耐膽汁酸性、耐酸性的至少一個的IK-05074株的變異株。此外，進(jìn)一步優(yōu)選使用上述以外的菌學(xué)性質(zhì)也和IK-05074株一樣的變異株。此外，在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，也可以在例如從土壤、曲、食品、谷物等中離析的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉中將具備產(chǎn)生酸性酶的能力的菌株分離來使用。產(chǎn)生酸性酶的能力是指在培養(yǎng)菌體而得到的培養(yǎng)物中以可以檢測到酸性酶活性的程度產(chǎn)生酸性酶。培養(yǎng)物的酸性酶活性的測定可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所含有的酸性酶優(yōu)選上述菌所產(chǎn)生的消化酶，只要是在胃腸內(nèi)的酸性條件下不失活并具有活性的酶，則無特別限制，尤其優(yōu)選具有2.5~5.5的最適pH的酶。例如，可以舉例如酸性的a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、高峰淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、核糖核酸酶、核酸酶、木聚糖酶、果膠酶、脂肪酶等。本發(fā)明的動物用飼料添加劑含有這些當(dāng)中的一種或兩種以上。這其中尤其優(yōu)選含有分解家畜的飼料成分中主要成分之一的淀粉的酸性淀粉酶。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所含有的酸性淀粉酶只要是水解淀粉的酸性酶則無特別限制，可舉例如a-淀粉酶、P-淀粉酶、葡糖淀粉酶等。這其中可以優(yōu)選舉例為在3附近具有最適pH的耐酸性a-淀粉酶。本發(fā)明的動物用飼料添加劑只要含有醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉所產(chǎn)生的酸性酶中的至少一種即可，但也可以進(jìn)一步含有其他菌種或其他生物種來源的酶。本發(fā)明的動物用飼料添加劑的酸性酶活性只要使之在以下范圍內(nèi)即可。每g動物用飼料添加劑的酸性酶活性的總和在120U以上，優(yōu)選170U以上，進(jìn)一步優(yōu)選220U以上，進(jìn)一步優(yōu)選2705400U。酸性酶活性的總和優(yōu)選是酸性淀粉酶活性、酸性蛋白酶活性及酸性羧基多肽酶活性的總和。此外，每g動物用飼料添加劑的酸性酶淀粉酶活性優(yōu)選1U以上，進(jìn)一步優(yōu)選5U以上，進(jìn)一步優(yōu)選10U以上，再優(yōu)選20400U。此外，每g動物用飼料添加劑的酸性蛋白酶和酸性羧基多肽酶活性的總和優(yōu)選100U以上，進(jìn)一步優(yōu)選150U以上，進(jìn)一步優(yōu)選200U以上，再優(yōu)選250~5000U。酸性淀粉酶、酸性蛋白酶及酸性羧基多肽酶的活性只要按照國稅廳規(guī)定分析法(第3次修改稅廳訓(xùn)令第1號)的固體曲的分析法的葡糖淀粉酶活性測定法、a-淀粉酶活性測定法、耐酸性(x-淀粉酶活性測定法、酸性蛋白酶活性測定法及酸性羧基多肽酶活性測定法進(jìn)行測定即可。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所含有的選自醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的至少一種的曲霉屬菌、以及含有這些菌所產(chǎn)生的酸性酶的培養(yǎng)物的濃度只要調(diào)節(jié)至詞料添加劑的酸性酶活性在上述范圍內(nèi)即可。通常，只要將使用充分量的糙米等的植物性營養(yǎng)源在28'C下7天左右培養(yǎng)上述菌而得到的培養(yǎng)物，在0.25~20質(zhì)量％、優(yōu)選0.5~10質(zhì)量%、進(jìn)一步優(yōu)選1~5質(zhì)量％的范圍內(nèi)添加即可。此外，本發(fā)明中使用的上述曲霉屬菌優(yōu)選對引起動物腸內(nèi)感染癥的病原菌具有抗菌活性。上述病原菌通常屬于腸內(nèi)細(xì)菌科。具體地舉例有屬于病原性大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎形菌(Campylobacter)、梭菌屬(Clostridium)的細(xì)菌或金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等。作為病原性大腸桿菌，舉例有產(chǎn)生腸毒素的大腸桿菌(產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌、enterotoxigenicE.coli(ETEC))、產(chǎn)生浮腫病或0157等的志賀樣(vero)毒素的腸出血性大腸桿菌(Verotoxin-producingE.coli(VTEC)、腸出血性大腸桿菌)等。作為屬于沙門氏菌屬的細(xì)菌，舉例有雞白痢沙門氏菌、雞沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、德爾俾沙門氏菌、都柏林沙門氏菌等。作為屬于彎形菌屬的細(xì)菌，舉例有空腸彎形菌、大腸彎曲桿菌、胎兒彎曲菌等。作為屬于梭菌屬的細(xì)菌舉例有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌等。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所含有的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉特別對沙門氏菌屬細(xì)菌、尤其是腸炎沙門氏菌以及梭菌屬細(xì)菌、尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌、浮腫病菌等的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有很高的抗菌活性。對病原菌具有抗菌活性是指和病原菌一起接種在同一培養(yǎng)基時，具有抑制病原菌的增殖的能力。具有抗菌活性的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉可以通過如將土壤、曲等的分離源添加到接種了腸炎沙門氏菌(SE)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(CP)、大腸桿菌(EC)、金黃色葡萄球菌(SA)等的病原菌的瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)之后，分離已形成抑菌圈的菌體來得到。這樣得到的菌由于具有抑制上述的病原菌的增殖的能力，因此可以通過向動物投食來預(yù)防，治療動物的腸內(nèi)感染癥。此外，引起動物的腸內(nèi)感染癥的病原菌的增殖被抑制是可以通過如測定動物的盲腸內(nèi)容物或糞便中的病原菌的菌體濃度(生菌數(shù))等來確認(rèn)。此外，本發(fā)明中使用的上述曲霉屬菌優(yōu)選對引起動物的腸內(nèi)感染癥的病原菌的球蟲具有殺原蟲活性。球蟲是指屬于孢子蟲類(Sporozoasida亞綱)的原蟲。具體舉例有艾美耳球蟲屬、等孢屬、弓形蟲屬、隱孢子蟲屬等。作為屬于艾美耳屬的原蟲舉例有柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲等。作為屬于等孢屬的原蟲舉例有豬等孢球蟲、貝氏等孢球蟲、人等胞子球蟲(I.hominis)等。作為屬于弓形蟲屬的原蟲舉例有剛地弓形蟲等。作為屬于隱孢子蟲屬的原蟲舉例有微小隱孢子蟲等。本發(fā)明的動物用飼料添加劑尤其適宜用于柔嫩艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲引起的感染癥。對球蟲具有殺原蟲活性指使球蟲的卵囊和菌的培養(yǎng)物共存時具有抑制卵囊的發(fā)芽-增殖的能力，優(yōu)選具有減少卵囊的能力。具體地是指具有使卵囊的細(xì)胞壁變形、溶解、使卵囊損壞的能力。卵囊的損壞或細(xì)胞壁的狀態(tài)用顯微鏡觀察即可。具有對球蟲的殺原蟲活性的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉例如可以通過以下方法來得到。將土壤、曲等的分離源添加到裝有使柔嫩艾美耳球蟲或邱氏艾美耳球蟲的卵囊懸濁的滅菌水的培養(yǎng)皿中，37'C中培養(yǎng)，觀察17天。在己確認(rèn)卵囊變形或溶解的培養(yǎng)皿中分離菌體，將此再添加到裝有使柔嫩艾美耳球蟲或邱氏艾美耳球蟲的卵囊懸濁的滅菌水的培養(yǎng)皿中，37'C中培養(yǎng)，確認(rèn)卵囊的變形或溶解。這樣培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中所含的菌，通過分別挑選屬于醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的菌，可以得到用于本發(fā)明的曲霉屬菌。通過向動物投與這樣得到的菌，可以、預(yù)防'治療動物的腸內(nèi)球蟲感染癥。此外，對球蟲的增殖被抑制與否，可以通過如顯微鏡下觀察動物的盲腸內(nèi)容物或糞便中的球蟲的卵囊等來進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所含有的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉優(yōu)選具有對胃酸或膽汁酸的耐性。由此，即便在動物的腸內(nèi)，菌體也產(chǎn)生有用的酸性酶、酸性酶引起的消化輔助的功能得以持續(xù)。此外，這些曲霉屬菌具有對上述這樣的病原菌的抗菌活性時，抑制引起動腸內(nèi)感染癥的病原菌的增殖，也有助于改善腸內(nèi)菌群的平衡。對胃酸或膽汁酸具有耐性是指，菌在通常的消化器官內(nèi)的條件下沒有死亡，而是到達(dá)至腸。通常，動物的胃內(nèi)部在空腹時pH2或有時達(dá)至其以下，但在攝取食物的狀態(tài)下胃內(nèi)部的pH為3.56的范圍，高于空腹時的pH。因此，具有可以用于本發(fā)明的動物用詞料添加劑的耐酸性的菌株可以通過例如在pH3.5中將分離源處理2小時左右時挑選具有生存能力的菌株來獲得。再有，通過在脫氧膽酸濃度10g/l的存在下將這樣選擇的菌處理24小時左右，并挑選具有生存能力的菌株，可以得到適合用于本發(fā)明的飼料添加劑的具有對對胃酸或膽汁酸的耐性的菌株。此外，菌沒有死亡而到達(dá)至腸可以通過如測定動物排泄物中的菌體的濃度等來確認(rèn)。本發(fā)明的動物用飼料添加劑在上述菌種中可以單獨(dú)含有一種菌株，也可以將兩種以上菌株組合含有。尤其優(yōu)選含有醬油曲霉及米曲霉的至少一種。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所含有的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的菌體濃度只要是在將飼料添加劑向動物投與時菌體不在消化器官內(nèi)死亡的范圍即可，通常將對制造具有上述酸性酶活性的詞料添加劑適當(dāng)濃度的菌體接種在培養(yǎng)基并培養(yǎng)，最終將酸性酶活性的調(diào)節(jié)到上述值即可。用于本發(fā)明的動物用飼料添加劑的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉通過在通常的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來產(chǎn)生酸性酶。如，培養(yǎng)溫度可以在25'C4(TC下進(jìn)行，通常優(yōu)選在28'C32'C下培養(yǎng)。此外，培養(yǎng)方法可以使用利用往復(fù)運(yùn)動式振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)等的液體培養(yǎng)法或固體培養(yǎng)法，但在上述菌體所具有的產(chǎn)生酸性酶的基因中也存在僅在固體培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的基因，因此本發(fā)明中優(yōu)選使用固體培養(yǎng)法。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分可以使用動物性或植物性的任一種，但優(yōu)選含有植物性的營養(yǎng)源，例如優(yōu)選含有糙米、糠、米糠、大豆、大麥等。尤其，特別優(yōu)選糙米作為營養(yǎng)源。由此，可以提高酸性淀粉酶等的酸性酶的產(chǎn)生效率。此外，也可以作為其他的炭源添加葡萄糖、蔗糖、糖蜜等的糖類、或作為氮源添加氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等的銨鹽或硝酸鹽等。如上操作得到的曲霉屬菌的培養(yǎng)物優(yōu)選干燥而放置。此外，也優(yōu)選進(jìn)行再添加用于提高保存性的任意成分等的加工來提高品質(zhì)穩(wěn)定性。干燥方法無特別限定，可以利用如通風(fēng)干燥、自然干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等來進(jìn)行，尤其優(yōu)選采用通風(fēng)干燥。此外，也可以使用冷凍干燥，但此時也可以添加防護(hù)劑。防護(hù)劑的種類無特別限定，優(yōu)選從脫脂乳、谷氨酸鈉及糖類挑選一種或兩種以上來使用。此外，使用糖類時其種類無特別限定，但優(yōu)選使用葡萄糖或海藻糖。再有，優(yōu)選干燥后在得到的干燥物中加入脫氧劑、脫水劑，并放入氣密性鋁袋中密封，從室溫至低溫下保藏。由此，可以長時間以活的狀態(tài)保存菌體。用于本發(fā)明的動物用飼料添加劑的枯草桿菌只要是在伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(Bergey，smanualofDeterminativeBacteriology)第9版(1994)中被分類到"枯草桿菌(BacillusSubtilis)"的細(xì)菌，則無特別限制。作為這樣的菌，可以使用枯草桿菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株等。DB9011株于1991年5月21日以FERMBP-3418存放在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、亍305-8566，日本國茨城縣筑波巿東1丁目1番地1中央第6)。還有，DB9011株保存時被分類為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，但之后確認(rèn)歸屬于枯草桿菌。此外，NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株是被登記在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評價技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)的生物遺傳資源部門(NBRC)的株。DB9011株的菌學(xué)性質(zhì)如下所述。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>形態(tài)菌體寬0.70.8pm的桿菌。橢圓形的芽孢在略微中央，菌體無膨脹。有運(yùn)動性，形成R型菌落。厭氧性條件下不繁殖。各培養(yǎng)基中的繁殖狀態(tài)(1)DHL瓊脂培養(yǎng)基不繁殖。(2)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不發(fā)育。(3)甘露醇食鹽培養(yǎng)基發(fā)育良好。有光澤。菌落表面無褶皺、菌落色黃。(4)普通瓊脂培養(yǎng)基發(fā)育良好。無光澤。菌落表面有褶皺、菌落色白。(5)心浸液瓊脂培養(yǎng)基發(fā)育良好。無光澤。菌落表面有褶皺、菌落色白。(6)血液瓊脂培養(yǎng)基(加10%綿羊血)發(fā)育良好。無光澤。菌落表面有褶皺、菌落色白。(7)PDA培養(yǎng)基發(fā)育良好。無光澤。菌落表面有褶皺、菌落色白。生理學(xué)性質(zhì)革蘭氏反應(yīng)+明膠試驗繁殖狀態(tài)；全面液化明膠液化；+石蕊牛乳反應(yīng)；酸狀態(tài)；凝固硝酸鹽還原+脫氮反應(yīng)-MR試驗-吲哚的生成硫化氫的生成檸檬酸的利用(Christensen):+尿素酶-氧化酶+過氧化氫酶+繁殖的范圍pH;4~9溫度；25~50°COF試驗發(fā)酵及產(chǎn)生氣體(由于葡萄糖分解引起)糖類的利用性氣體產(chǎn)生酸生成L-阿拉伯糖-+D-木糖-+D-葡萄糖++D-甘露糖-+D-果糖-+D-半乳糖-+麥芽糖(maltose)-+蔗糖(sucrose)乳糖(lactose)海藻糖D-山梨糖醇O-甘露醇肌醇甘油淀粉6-l3-a-葡萄糖苷的分解+丙二酸的利用精氨酸的分解+賴氨酸的脫碳酸反應(yīng)+尿素分解±黃曲霉毒素分解+鳥氨酸的脫碳酸反應(yīng)-凝血酶-溶血性+氯化鈉的耐性10%以下氰化鉀的耐性可以發(fā)育卵磷脂酶-此外，本發(fā)明的動物用飼料添加劑中也可以使用這樣的菌株，是使枯草桿菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株自然變異、或者從用化學(xué)變異劑或紫外線等發(fā)生變異而得到的菌株中挑選具有與各菌株相同菌學(xué)性質(zhì)的菌株。作為枯草桿菌DB9011株的變異株優(yōu)選挑選使用具有上述菌學(xué)性質(zhì)的菌株。在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，枯草桿菌的濃度為2.5xl07~2xl09CFU/g，優(yōu)選5xl07~lxl09CFU/g，進(jìn)一步優(yōu)選lxl08~5xl08CFU/g。此外，在本發(fā)明的動物用飼料添加劑中，枯草桿菌的濃度也可以作成每顯示1U的酸性酶活性總和的動物用飼料添加劑中為2.0x103~5xl06CFU，優(yōu)選1.0xl04~1.0xl06CFU，每顯示1U的酸性淀粉酶活性的動物用飼料添加劑中為1.0xl05~2.5xl08CFU，優(yōu)選5.0xl05~5.0xl07CFU，每顯示1U的酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的總和的動物用飼料添加劑中為2.0xl03~5.0xl06CFU，優(yōu)選L0xl04~1.0xl06CFU。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所使用的枯草桿菌優(yōu)選具有在上述曲霉屬菌及該菌所產(chǎn)生的酸性酶的存在下增殖的能力。本發(fā)明的動物用飼料添加劑所使用的枯草桿菌優(yōu)選有耐膽汁酸性。"耐膽汁酸性"是指在含有高濃度的膽汁酸的培養(yǎng)基中形成具有發(fā)芽'增殖的能力的孢子。膽汁酸是指在哺乳類、鳥類、爬蟲類、兩棲類、魚類的膽汁中廣泛可見的4環(huán)結(jié)構(gòu)的類固醇，包含膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸以及熊去氧膽酸。通常，膽汁酸在動物體內(nèi)的膽汁中以與甘氨酸或?；撬徇M(jìn)行酰胺鍵合的接合形存在，為鈉鹽。本說明書中僅稱"膽汁酸"時包括上述膽汁酸和這些鹽以及這些接合體。含有高濃度的膽汁酸的培養(yǎng)基是如含有將新鮮膽汁以10倍濃縮'干固的膽汁粉末(Oxgall、Difco制造)的培養(yǎng)基，舉例有膽汁末的濃度為0.3質(zhì)量％以上、優(yōu)選1質(zhì)量％以上、進(jìn)一步優(yōu)選3質(zhì)量％以上的培養(yǎng)基。此外，"具有發(fā)芽*增殖的能力"是指在含有如上所述高濃度的膽汁酸的培養(yǎng)基中接種孢子，并將膽汁酸濃度以外的條件設(shè)定為適宜培養(yǎng)枯草桿菌的條件時，細(xì)菌發(fā)芽、重新進(jìn)行增殖分裂，形成菌落。耐膽汁酸的枯草桿菌可以如下進(jìn)行得到。將含有枯草桿菌的分離源在適于形成孢子的條件下培養(yǎng)，使之形成孢子。得到的孢子接種于上述添加高濃度的膽汁酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)之后，分離所形成的菌落。在該菌落之中挑選具有枯草桿菌的菌學(xué)性質(zhì)的菌。用于本發(fā)明的動物用飼料添加劑的枯草桿菌進(jìn)一步優(yōu)選有耐酸性。通過使用這樣的細(xì)菌，細(xì)菌即便在胃內(nèi)部也不會死亡而是到達(dá)至腸。"耐酸性"是指向動物投與細(xì)菌時，即便在胃內(nèi)部的條件下(攝取食物的狀態(tài)下通常pH3.5~6)也不會死亡而到達(dá)至腸時，仍維持可增殖的程度的菌數(shù)?？莶輻U菌的孢子通常是耐酸性，因此使用孢子時尤其不成問題。本發(fā)明的動物用詞料添加劑可以單獨(dú)含有枯草桿菌的一種菌株，也可以將2種以上的菌株組合來含有。這其中，特別優(yōu)選單獨(dú)使用DB9011，或與其他菌株組合使用。培養(yǎng)用于本發(fā)明的動物用飼料添加劑的枯草桿菌的方法無特別限制，可以在依據(jù)細(xì)菌的性質(zhì)的適當(dāng)?shù)臈l件下按照常規(guī)方法進(jìn)行。例如，培養(yǎng)溫度可以在204(TC下進(jìn)行，但通常優(yōu)選3037'C下培養(yǎng)。此外，培養(yǎng)方法可以使用利用靜置培養(yǎng)、往復(fù)運(yùn)動式振蕩培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動式振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)等的液體培養(yǎng)法或固體培養(yǎng)法。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分也無特別限制，作為炭源可以使用葡萄糖、半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、淀粉水解物、糖蜜等的糖類、檸檬酸等的有機(jī)酸類、甘油等的醇類，作為氮源可以使用氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等的銨鹽類或硝酸鹽類，此外，可以使用氯化鈉、氯化鉀、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硝酸鈣、氯化錳、硫酸亞鐵等的無機(jī)鹽類、胨、大豆粉、脫脂大豆粕、肉提取物、酵母提取物等。用于本發(fā)明的動物用飼料添加劑的枯草桿菌從保存穩(wěn)定性、耐酸性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選是孢子的狀態(tài)。孢子的狀態(tài)下由于耐熱、耐干燥，因此可以在制造飼料添加劑時使之充分干燥，保存穩(wěn)定性提高。為了在細(xì)菌中形成孢子，只要在培養(yǎng)周期中將培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濕度、培養(yǎng)時的氧濃度等的培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)至適合形成孢子的條件即可。作為這樣的方法，如舉例有SchaefferP.,J.Millet,J.P.Aubert，"美國國家科學(xué)院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofScience)"美國，1965年，第54巻，p704711中記載的方法等。此外，從保存穩(wěn)定性的觀點(diǎn)來看，按照上述方法得到的枯草桿菌的培養(yǎng)物或孢子優(yōu)選做成干燥粉末來放置。干燥優(yōu)選例如使水分含量成為20質(zhì)量％以下。干燥及保存的方法與曲霉屬菌的培養(yǎng)物的干燥相同。本發(fā)明的動物用飼料添加劑可以混合上述的醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一種的曲霉屬菌、以及含有該菌所產(chǎn)生的酸性酶的全部或一部分培養(yǎng)物和枯草桿菌的菌體而得到。此外，本發(fā)明的動物用飼料添加劑可以進(jìn)一步添加任意成分。這些任意成分作為詞料成分其安全己得到認(rèn)可，只要是不使上述曲霉屬菌以及枯草桿菌死亡且不使酸性酶活性失活的，則無特別限制地使用。例如，優(yōu)選舉例有f3-葡聚糖、葡糖甘露糖膠、甘露糖膠低聚糖、海藻等的免疫活化劑、葡糖酸、，氨基酪酸、檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、泛酸、丁酸等的有價酸等。本發(fā)明的動物用詞料添加劑通過使動物攝取來促進(jìn)動物的體重增加，因此可以作為促進(jìn)成長用的動物用詞料添加劑。此時，尤其優(yōu)選調(diào)制成每g飼料添加劑的酸性酶活性的總和在270U以上、酸性淀粉酶活性在20U以上、酸性蛋白酶和酸性羧基多肽酶活性的總和在250U以上、枯草桿菌的濃度為lxl08CFU/g以上。本發(fā)明的動物用飼料添加劑通過使動物攝取來預(yù)防腸內(nèi)感染癥等，因此可以作為腸內(nèi)感染癥的預(yù)防'改善用的動物用飼料添加劑。此時，尤其優(yōu)選調(diào)制成每g飼料添加劑的酸性酶活性的總和在540U以上、酸性淀粉酶活性在40U以上、酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的總和在500U以上、枯草桿菌的濃度為2.5xl08CFU/g以上。此外，本發(fā)明的動物用飼料添加劑從安全性的觀點(diǎn)來看優(yōu)選曲酸的含有濃度低。通常曲酸的含有濃度優(yōu)選0.1mg/1以下、進(jìn)一步優(yōu)選0.01mg/l以下。本發(fā)明的飼料的特征在于，相對于飼料總量，含有干燥狀態(tài)下0.01~1.0質(zhì)量％、優(yōu)選0.02~0.5質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選0.04~0.25質(zhì)量％的本發(fā)明的動物用飼料添加劑。此外，每kg本發(fā)明的飼料的酸性酶活性的總和為12U以上、優(yōu)選17U以上、進(jìn)一步優(yōu)選22U以上、再優(yōu)選27~54000U。此外，枯草桿菌的濃度為2.5xl06~2.0xl01GCFU/kg、優(yōu)選5.0xl06~1.0xl010CFU/kg、進(jìn)一步優(yōu)選1.0xl07~5.0xl09CFU/kg。此夕卜，每kg飼料的酸性淀粉酶活性優(yōu)選為0.1U以上、進(jìn)一步優(yōu)選0.5U以上、再優(yōu)選1U以上、再優(yōu)選2~4000U。此外，每kg飼料的酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的總和優(yōu)選為IOU以上、進(jìn)一步優(yōu)選15U以上、再優(yōu)選20U以上、再優(yōu)選25~50000U。本發(fā)明的飼料可以通過將本發(fā)明的動物用飼料添加劑添加到通常使用的飼料成分中來制造。只要本發(fā)明的動物用飼料添加劑中所含的菌體不死亡、且酸性酶不失活，則詞料的種類或成分無特別限制，通常在家畜飼料或?qū)櫸锸称贰游镉锰砑游锏茸鳛閯游镲暳鲜褂玫奈锲分刑砑?混合即可。此外，本發(fā)明的詞料也可以將動物用飼料添加劑以干燥狀態(tài)添加到飼料成分中進(jìn)行混合，但為了使混合容易，也可以以液狀或凝膠狀的形態(tài)來使用。此時，可以將水、大豆油、菜籽油、玉米油等的植物油、液體動物油、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸等的水溶性高分子化合物作為液體載體來使用。此外，為保持飼料中的菌體濃度的均一性，也優(yōu)選混合藻酸、藻酸鈉、蒼耳烷膠、酪蛋白鈉、阿拉伯膠、愈瘡膠、羅望子種子多糖類等的水溶性多糖類。此外，為防止雜菌的繁殖，還優(yōu)選混合有機(jī)酸。此外，本發(fā)明的詞料還可以通過以下所述來制造，在含有用于曲霉屬菌的增殖的營養(yǎng)源的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)選自醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉的至少一種曲霉屬菌，將所得的培養(yǎng)物以及枯草桿菌分別與飼料成分混合，將調(diào)節(jié)飼料的酸性酶活性以及枯草桿菌的濃度至上述范圍內(nèi)。本發(fā)明的飼料可以作為用于促進(jìn)動物的成長的詞料。此外，當(dāng)上述的曲霉屬菌進(jìn)一步具有針對引起動物的腸內(nèi)感染癥的病原菌的抗菌活性以及/或針對球蟲的殺原蟲活性時，可以作為用于預(yù)防'治療病原菌以及/或球蟲引起的腸內(nèi)感染癥的飼料。攝取本發(fā)明的飼料的動物種類無特別限制，可舉例的有哺乳類、鳥類、爬蟲類、兩棲類、魚類等。這其中，特別合適地用于家禽、家畜。作為家禽合適的有雞、鴨、鵪鶉、火鳥等，作為家畜合適的有豬、牛、羊、兔等。使動物攝取的飼料的量可以根據(jù)動物的種類、體重、年齡、性別、使用目的、健康狀態(tài)、詞料的成分等適當(dāng)調(diào)節(jié)。攝取飼料的方法也可以根據(jù)動物的種類采取通常采用的方法。實施例<1〉曲霉屬菌的培養(yǎng)調(diào)節(jié)馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基的pH為5，在121'C下殺菌15分鐘。該瓊脂培養(yǎng)基的溫度降到60'C時，以每1L培養(yǎng)基為10g的濃度添加脫氧膽酸鈉，接種保存在株式會社秋田今野商店(日本國秋田縣大仙市刈和野248)的曲霉屬菌，結(jié)果醬油曲霉(Aspergillussojae)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、黑曲霉(Aspergillusniger)在培養(yǎng)基中繁殖良好。醬油曲霉AOK210株、溜曲霉AOK43株、臭曲霉AOKN4586株及黑曲霉AOKB650株尤其繁殖良好。在和上述一樣含有脫氧膽酸鈉的培養(yǎng)基中將各種發(fā)酵食品作為分離源接種很多曲霉屬菌，在培養(yǎng)基中繁殖的菌株中挑選繁殖最好的株。將該株作為米曲霉IK-05074株，保存在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。IK-05074株的菌學(xué)性質(zhì)如上所述。將糙米作為固體培養(yǎng)基，進(jìn)行了醬油曲霉AOK210株、溜曲霉AOK43株、臭曲霉AOKN4586株、黑曲霉AOKB650株以及米曲霉IK-05074株的培養(yǎng)。艮P，在水中浸泡糙米一晝夜使之膨脹之后，以2厘米的厚度放入在蓋上帶有無菌過濾器、直徑14厘米、深10厘米的聚碳酸酯制的容器中，用高壓滅菌器在12rC下殺菌15分鐘。在該容器接種上述各菌體，28'C下培養(yǎng)5天，制造種菌。然后，將和上述一樣膨脹的糙米在30X40X10cm的不銹鋼容器中以1.5cm厚度層疊，蓋上具有以20X25厘米的過濾器覆蓋的通氣口的蓋子，放入大型高壓滅菌器在121。C下殺菌25分鐘。冷卻該容器之后，接種已事先培養(yǎng)好的全部上述種菌。將該容器放入28'C的孵卵器中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后，35'C下通風(fēng)干燥、用噴射式粉碎機(jī)粉碎，針對各個菌種得到固體培養(yǎng)物。測定了每lg各個固體培養(yǎng)物的耐酸性a-淀粉酶活性、以及酸性蛋白酶活性和酸性羧基多肽酶活性的總和。每lg各固體培養(yǎng)物的上述酶活性在表2表示。還有，上述酸性酶的測定按照國稅廳規(guī)定分析法(第3次修改稅廳訓(xùn)令第1號)的固體曲的分析法的耐酸性a-淀粉酶活性測定法、酸性蛋白酶活性測定法及酸性羧基多肽酶活性測定法進(jìn)行測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><2〉曲霉屬菌的培養(yǎng)物的抗菌活性的測定通過將醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株和細(xì)菌共同培養(yǎng)，試驗了這些曲霉屬菌對細(xì)菌的抗菌活性。對腸炎沙門氏菌(SE)，在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)37'C下進(jìn)行24小時的需氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在1L容量的三角燒瓶中制作500ml腦心浸液肉湯"日水"，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至SE的最終濃度成為約1.0xl04~1.0xl05CFU/ml。將各個醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物各5g無菌性投入到三角燒瓶中，作為試驗例1及2，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37'C的恒溫器中在需氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。對產(chǎn)其莢膜梭菌(CP)，用Anaeropackkenki(三菱瓦斯化學(xué)(株)制造)在加蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)中37'C下進(jìn)行24小時的厭氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在1L容量的三角燒瓶中制作500ml腦心浸液肉湯"日水"，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至CP的最終濃度成為約.0xl04~1.0xl05CFU/ml。將醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物每種各5g無菌性地投入到三角燒瓶中，作為試驗例3及4，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37。C的恒溫器中用Anaeropackkenki在厭氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。試驗開始后，在第0天、3天、7天實施SE及CP的生菌數(shù)測定。SE的生菌數(shù)測定方法是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋IO倍之后，將各個稀釋階段液的0.1ml涂布在X-SAL瓊脂培養(yǎng)基"日水"，進(jìn)行37'C、24小時的需氧培養(yǎng)，計數(shù)己發(fā)育的特征性的菌落。CP的生菌數(shù)測定方法是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的O.lml涂布在加蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)，用Anaeropackkenki進(jìn)行37'C、24小時的厭氧培養(yǎng)，計數(shù)已發(fā)育的特征性的菌落。在表3顯示SE的生菌數(shù)，在表4顯示CP的生菌數(shù)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如試驗例1及2所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物顯示出對于SE的抗菌活性。還有，在對照區(qū)中可見到試驗第7天為止菌數(shù)上升，在第7天顯示為2.9x108CFU/ml。如試驗例3及4所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物顯示出對于CP的抗菌活性。在對照區(qū)中可見到試驗第7天為止菌數(shù)上升，在第7天顯示為1.2xl06CFU/ml。對大腸桿菌Escherichiacoli(EC)，在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)37'C下進(jìn)行24小時的需氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在1L容量的三角燒瓶中制作500ml腦心浸液肉湯"日水，，(日水制藥(株)制造)，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至EC的最終濃度成為約1.0xl0S1.0xl()SCFU/ml。將醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物每種各5g無菌性投入到三角燒瓶中，作為試驗例5及6，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37'C的恒溫器中在需氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。對金黃色葡萄球菌(SA)，在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)37'C下進(jìn)行24小時的需氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在1L容量的三角燒瓶中制作500ml腦心浸液肉湯"日水"(日水制藥(株)制造)，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至SA的最終濃度成為約1.0xl05~1.0xl06CFU/ml。將醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)每種各5g無菌性投入至三角燒瓶中，作為試驗例7及8，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37'C的恒溫器中在需氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。試驗開始后，在第0天、3天、7天實施EC及SA的生菌數(shù)測定。EC的生菌數(shù)測定方法是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的0.1ml涂布在ChromocultColiform瓊脂"默克"(默克制造)之后，進(jìn)行37。C、24小時的需氧培養(yǎng)，計數(shù)已發(fā)育的特征性的菌落。SA的生菌數(shù)測定方法是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的O.lml涂布在加蛋黃的甘露醇食鹽培養(yǎng)基"榮研"(榮研器材(株)制造)之后，進(jìn)行37'C、24小時的需氧培養(yǎng)，計數(shù)已發(fā)育的特征性的菌落。在表5顯示EC的生菌數(shù)，在表6顯示SA的生菌數(shù)。[表5]表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如試驗例5及6所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物顯示出對于EC的抗菌活性。還有，在對照區(qū)中在試驗第3天可見到最高的菌數(shù)，在第3天顯示為4.3x108CFU/ml、第7天顯示為1.7xl07CFU/ml。如試驗例7及8所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物顯示出對于SA的抗菌活性。在對照區(qū)中在試驗第3天可見到最高的菌數(shù)，在第3天顯示為4.2xl08CFU/ml、第7天顯示為7.2x107CFU/ml。對枯草桿菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株，在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)37'C下進(jìn)行24小時的需氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在1L容量的三角燒瓶中制作500ml腦心浸液肉湯"日水"(日水制藥(株)制造)，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的最終濃度成為約1.0xl04~1.0xl05CFU/ml。將每種醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物各5g無菌性投入到三角燒瓶中，作為試驗例918，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37。C的恒溫器中在需氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。試驗開始后，在第O天、3天、7天實施DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的生菌數(shù)以及孢子數(shù)測定。上述株的生菌數(shù)測定方法是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的0.1ml涂布在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)之后，進(jìn)行37°C、48小時的需氧培養(yǎng)，計數(shù)己發(fā)育的特征性的菌落。上述株的孢子數(shù)測定方法如下。首先，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍，進(jìn)行7(TC下的30分鐘加熱處理。冷卻后，用滅菌生理鹽水階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的0.1ml涂布在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)之后，進(jìn)行37'C、48小時的需氧培養(yǎng)，計數(shù)已發(fā)育的特征性的菌落。將DB9011株的生菌數(shù)在表7、孢子數(shù)在表8表示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>[表14]表14<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如試驗例9~18所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物沒有顯示出對枯草桿菌DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的抗菌活性。對嗜酸乳桿菌(LA)，用Anaeropackkenki(三菱瓦斯化學(xué)(株)制造)在力BBCP的平板計數(shù)瓊脂(日水制藥(株)制造)中37'C下進(jìn)行72小時的厭氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在1L容量的三角燒瓶中制作500mlGAM肉湯(日水制藥(株)制造)，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至LA的最終濃度成為約1.0xl03~1.0xl04CFU/ml。將每個醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物各5g無菌性地投入到三角燒瓶中，作為試驗例19及20，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37'C的恒溫器中用Anaeropackkenki在厭氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。對短雙歧桿菌(BB)，用Anaeropackkenki(三菱瓦斯化學(xué)(株)制造)在BL瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)中37'C下進(jìn)行48小時的厭氧培養(yǎng)。挑取平板上發(fā)育的菌落，使之懸浮在滅菌生理鹽水中。在lL容量的三角燒瓶中制作500mlGAM肉湯(日水制藥(株)制造)，高壓滅菌器殺菌之后，無菌性地投入至BB的最終濃度成為約1.0xl04~1.0xl05CFU/ml。將每種醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物各5g無菌性地投入到三角燒瓶中，作為試驗例21及22，將未加曲菌培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對照區(qū)。各個三角燒瓶在37。C的恒溫器中用Anaeropackkenki在厭氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。試驗開始后，在第0天、3天、7天實施LA及BB的生菌數(shù)測定。LA的生菌數(shù)測定方法是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的0.1ml涂布在加BCP的平板計數(shù)瓊脂"日水"(日水制藥(株)制造)之后，使用Anaer叩ackkenki進(jìn)行37'C、72小時的厭氧培養(yǎng)，計數(shù)已發(fā)育的特征性的菌落。BB的生菌數(shù)測定是，用滅菌生理鹽水將采取的培養(yǎng)液階段稀釋10倍之后，將各個稀釋階段液的O.lml涂布在BL瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)之后，使用Anaeropackkenki進(jìn)行37。C、48小時的厭氧培養(yǎng)，計數(shù)已發(fā)育的特征性的菌落。表17中表示LA的生菌數(shù)、在表18表示BB的生菌數(shù)。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如試驗例19及20所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物沒有顯示出對LA的抗菌活性。如試驗例21及22所示，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株的固體培養(yǎng)物沒有顯示出對BB的抗菌活性。從以上結(jié)果可知，醬油曲霉AOK210株及米曲霉IK-05074株雖然對病原性細(xì)菌大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌顯示出抗菌活性，但對可作為益生菌的枯草桿菌或理想的腸內(nèi)細(xì)菌嗜酸乳桿菌以及短雙歧桿菌沒有顯示出抗菌活性。因此，通過將醬油曲霉AOK210株及/或米曲霉IK-05074株與枯草桿菌進(jìn)行組合，能夠開發(fā)出如下新的動物用飼料添加劑，其能夠在不使枯草桿菌喪失能力的情況下發(fā)揮功效，同時不給作為腸內(nèi)細(xì)菌有用的嗜酸乳桿菌以及短雙歧桿菌帶來壞影響。<3>曲霉屬菌的培養(yǎng)物的殺原蟲活性的測定(1)防治柔嫩艾美耳球蟲試驗收集自然感染柔嫩艾美耳球蟲的雞糞，在實體顯微鏡下分離卵囊，用生理鹽水清洗。在直徑9cm的培養(yǎng)皿中添加5ml生理鹽水，投入已清洗的卵囊至約成為4000個/ml。在每個培養(yǎng)皿中投入AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株及IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物各50mg，各自設(shè)定為試驗例2327。此外，將未加曲菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為對照區(qū)。將各個培養(yǎng)皿在37'C中振蕩(150rpm)。7天后，在實體顯微鏡下測定卵囊的個數(shù)、觀察細(xì)胞壁的變形或溶解狀態(tài)，算出卵囊的減少率以及溶解變性率。結(jié)果在表19中顯示。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>I)第7天殘留的卵囊中的比例如試驗例23~27所示，已知AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株及IK-05074株的固體培養(yǎng)物使柔嫩艾美耳球蟲的卵囊數(shù)減少，顯示卵囊溶解變性活性。尤其在AOK210株以及IK-05074株，通過處理柔嫩艾美耳球蟲的卵囊，得到了極高的卵囊減少率及溶解變性率。(2)防治邱氏艾美耳球蟲試驗收集感染邱氏艾美耳球蟲的牛腹瀉糞便，在實體顯微鏡下分離卵囊，用生理鹽水清洗。在直徑9cm的培養(yǎng)皿中添加5ml生理鹽水，投入已清洗的卵囊至約成為2000個/ml。在每個培養(yǎng)皿中各投入AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株及IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物50mg，各自設(shè)定為試驗例2832。此外，將未加曲菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為對照區(qū)。將各個培養(yǎng)皿在37'C中振蕩(150rpm)。7天后，在實體顯微鏡下測定卵囊的個數(shù)、觀察細(xì)胞壁的變形或溶解狀態(tài)，算出卵囊的減少率以及溶解變性率。結(jié)果在表20中顯示。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>1)第7天殘留的卵囊中的比例如試驗例28~32所示，已知AOK210株、AOK43株、AOKN4586株或AOKB650株及IK-05074株的固體培養(yǎng)物使邱氏艾美耳球蟲的卵囊數(shù)減少，還顯示很高的卵囊溶解變性活性。尤其在AOK210株以及IK-05074株，通過處理邱氏艾美耳球蟲的卵囊，得到了極高的卵囊減少率及溶解變性率。從以上推測，上述曲霉屬菌對球蟲的防治也有效。<4〉枯草桿菌的培養(yǎng)使用下述所示組成的孢子形成培養(yǎng)基，分別在37'C下72小時液體培養(yǎng)枯草桿菌DB卯ll株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株。離心分離得到的培養(yǎng)液，收集菌體。將得到的菌體冷凍干燥之后粉碎，得到孢子粉末。DB9011株、NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株的孢子密度各自為1.01xlO"CFU/g、1.21xlO"CFU/g、1.15xlO"CFU/g、1.06xlO"CFU/g、1.09xlO"CFU/g。將得到的孢子粉末用滅菌水稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，?(TC下加熱30分鐘，依此僅殺滅營養(yǎng)細(xì)胞之后接種到普通瓊脂培養(yǎng)基，計數(shù)所形成的菌落數(shù)，由此測定孢子密度。還有，枯草桿菌DB9011株以FERMBP-3418保存在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。此外，NBRC3009株、NBRC3025株、NBRC3108株及NBRC3336株是被分別登記在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評價技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)的生物遺傳資源部門(NBRC)的株。孢子形成培養(yǎng)基成分"Difco營養(yǎng)肉湯8.0gKC1l.OgMgS04-7H200.25gMnCl2-4H200.002g調(diào)節(jié)pH為7.0、總量1,000ml高壓滅菌器滅菌后，分別添加滅菌完的CaCl2溶液以及FeS04溶液至成為5xlO—4M以及l(fā)xl(T6M1)SchaefferP.，J.Millet,J.P.Aubert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,54,704~711(1965)<5>飼養(yǎng)試驗-l(1)飼料添加劑的制造將上述<1>中得到的醬油曲霉AOK210株的粉碎固體培養(yǎng)物、米曲霉IK-05047株的粉碎固體培養(yǎng)物、DB9011株以及NBRC3009株的孢子并分別用乳糖稀釋來制作不同濃度的飼料添加劑(制造例1~4)。此外，將AOK210株或IK-05047株的培養(yǎng)物與、DB9011株或NBRC3009株的孢子分別組合并分別用乳糖稀釋來制作不同濃度的飼料添加劑(制造例5~8)。每個詞料添加劑中的固體培養(yǎng)物以及枯草桿菌的添加量在表21顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>DB9011株或NBRC3009株1.0x108CFU/g以上的制造例5(BG)、制造例6(BG)、制造例7(BG)及制造例8(B~G)時，可見到體重顯著增加的效果。由此知道，通過將曲霉屬菌的培養(yǎng)物和枯草桿菌組合，可以用比單獨(dú)使用各自的有效成分時相比低的濃度促進(jìn)雛雞的體重增加。(3)仔豬飼養(yǎng)試驗在仔豬飼料中混合制造例1~8的飼料添加劑至其相對于仔豬飼料的總質(zhì)量(SD仔豬人工乳前后期用標(biāo)準(zhǔn)飼料、日本混合飼料(株)制造、未加抗菌性物質(zhì)的飼料)中為0.1質(zhì)量％。將3周齡的仔豬(商品名大約克夏)8頭為一組，每組以不斷給飼料35天，自由給水來進(jìn)行成長試驗。此外，將僅混合0.1質(zhì)量％的乳糖的飼料作為對照區(qū)，同樣進(jìn)行成長試驗。35天后測定各組的仔豬的體重，算出各組的平均值。結(jié)果在表23表示。表23制<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>給予含有15質(zhì)量％以上的、醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的培養(yǎng)物的制造例l(E~G)以及制造例2(EG)的飼料添加劑的仔豬與對照區(qū)的仔豬相比，可見到顯著的體重增加。給予含有1.5xl08CFU/g以上的枯草桿菌DB9011株的制造例3(EG)以及含有1.5xl08CFU/g以上的NBRC3009株的孢子的制造例4(E~G)的伺料添加劑的仔豬與對照區(qū)的仔豬相比，可見到顯著的體重增加。另一方面，使動物攝取分別組合AOK210株或IK-05047株的培養(yǎng)物1.0質(zhì)量％以上和DB卯ll株或NBRC3009株的孢子1.0xl08CFU/g以上的制造例5(BG)、制造例6(B~G)、制造例7(B~G)及制造例8(B~G)時，可見到體重顯著增加的效果。由此知道，通過將曲霉屬菌的培養(yǎng)物和枯草桿菌組合，可以用比單獨(dú)使用各自的有效成分時相比低的濃度促進(jìn)仔豬的體重增加。<6〉飼養(yǎng)試驗-2(1)飼料添加劑的制造將上述<1>中的得到的AOK210株或IK-05074株的培養(yǎng)物、與DB9011株或NBRC3009株的孢子組合并用乳糖稀釋，制作了以不同的比例含有各成分的飼料添加齊IJ(制造例9~12)。各個飼料添加劑中的固體培養(yǎng)物、枯草桿菌的添加量在表24表示。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固體培養(yǎng)物與DB9011株或NBRC3009株的比例最適范圍是4質(zhì)量。/。lxl08CFU/g~l質(zhì)量％:4xl08CFU/g(制造例9(BF)、制造例10(BF))、制造例11(BF)、制造例12(BF))。由此知道，每1U顯示耐酸性(X-淀粉酶活性的飼料添加劑的枯草桿菌濃度最適范圍是0.5xl06~2.0xl07CFU/g。此外，每IU顯示酸性蛋白酶及酸性羧基多肽酶的總和的飼料添加劑的枯草桿菌濃度最適范圍是4.5xl04~8.5xl05CFU/g。(2)仔豬飼養(yǎng)試驗在仔豬飼料中混合制造例9~12的飼料添加劑至其相對于仔豬飼料總質(zhì)量(SD仔豬人工乳前后期用標(biāo)準(zhǔn)詞料、日本混合飼料(株)制造、未加抗菌性物質(zhì)的飼料)中為0.1質(zhì)量％。將3周齡的仔豬(商品名大約克夏)8頭為一組，每組以不斷給上述飼料35天，自由給水來進(jìn)行成長試驗。此外，將僅混合0.1質(zhì)量％的乳糖的飼料作為對照區(qū)，同樣進(jìn)行成長試驗。35天后測定各組的仔豬的體重，算出各組的平均值。結(jié)果在表26顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固體培養(yǎng)物與DB9011株或NBRC3009株的比例最適范圍是4質(zhì)量。/。lxl08CFU/g~l質(zhì)量％:4xl08CFU/g(制造例9(BF)、制造例10(BF))、制造例11(BF)、制造例12(BF))。<7>對雛雞的病原菌攻擊試驗(1)腸炎沙門氏菌攻擊試驗在雛雞飼料中混合制造例1~8的飼料添加劑至其相對于雛雞飼料總質(zhì)量(SDBroiler前后期用、日本混合飼料(株)制造、未加抗菌性物質(zhì)的飼料)中為0.1質(zhì)量％。將從Broiler種雞(商品名于卞y年一)來源的種蛋孵化的雛雞12只為一組，以不斷給飼料35天、自由給水喂食14天。將僅混合O.l質(zhì)量％的乳糖的飼料作為對照區(qū)，同樣進(jìn)行試驗。7天大時，每只經(jīng)口投與2.3xl07CFU的腸炎沙門氏菌(SE)。14天大時用棉棒擦拭盲腸內(nèi)容物和總排泄腔來采取糞便。盲腸內(nèi)容物的SE生菌數(shù)根據(jù)以下方法測定，算出感染指數(shù)及防御指數(shù)。向盲腸內(nèi)容物lg加入滅菌磷酸緩沖生理鹽水稀釋為10倍，充分混合制作試樣原液。接著，用滅菌生理鹽水將試樣原液階段稀釋為10倍，制作階段稀釋液。將試樣原液及階段稀釋液分別在SS瓊脂平板培養(yǎng)基"日水"(日水制藥(株)制造)以及亮綠瓊脂平板培養(yǎng)基(DifcoLaboratories制造)中各涂抹0.1ml，37。C中培養(yǎng)24小時，測定各平板培養(yǎng)基上繁殖的典型的SE菌落數(shù)。再有，挑取菌落接種于賴氨酸脫碳酸試驗用的SIM瓊脂培養(yǎng)基"日水"(日水制藥(株)制造)以及TSI瓊脂培養(yǎng)基"日水"(日水制藥(株)制造)，37°C中培養(yǎng)24小時，確認(rèn)性狀。其中，在被認(rèn)為是SE的菌落數(shù)乘以稀釋液的稀釋倍率來算出每lg盲腸內(nèi)容物的SE生菌數(shù)。以該結(jié)果為基礎(chǔ)，如下算出感染指數(shù)及防御指數(shù)。感染指數(shù)是指顯示病原菌的感染率的高低的值，防御指數(shù)是指與投與了對照區(qū)的詞料的情況相比較時顯示各個飼料防御病原菌感染的能力的值。感染指數(shù)各個體的盲腸內(nèi)容物的SE生菌數(shù)的對數(shù)平均值(1ogCFU/g的平均值)防御指數(shù)對照區(qū)的感染指數(shù)/各試驗區(qū)的感染指數(shù)關(guān)于從總排泄腔采取的糞便，通過根據(jù)如下方法對各個體進(jìn)行定性培養(yǎng)來確認(rèn)SE的形狀。即，將附著在棉棒上的糞便懸濁于10ml的滅菌磷酸緩沖生理鹽水中，做成試樣原液之后，將此在SS瓊脂平板培養(yǎng)基以及亮綠瓊脂平板培養(yǎng)基中各涂抹0.1ml，37'C中培養(yǎng)24小時，判定各平板培養(yǎng)基上有無繁殖的典型的SE菌落的形成。再有，挑取菌落接種于LIM瓊脂培養(yǎng)基"日水"(日水制藥(株)制造)、SIM瓊脂培養(yǎng)基以及TSI瓊脂培養(yǎng)基中，37'C中培養(yǎng)24小時來確認(rèn)形狀。感染指數(shù)示于表27、防御指數(shù)示于表28、采取總排泄腔糞便的SE的檢測個體數(shù)示于表29。表27<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表28<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表29<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固體培養(yǎng)物在單獨(dú)20質(zhì)量％以上添加到飼料添加劑時，盲腸內(nèi)容物的SE的菌體濃度變低，顯示了較低的SE的感染指數(shù)(制造例KF、G)、制造例2(F、G))。枯草桿菌DB9011株或NBRC3009株在單獨(dú)2.0x109CFU/g以上添加到飼料添加劑時，盲腸內(nèi)容物的SE的菌體濃度變低，顯示了較低的SE的感染指數(shù)(制造例3(F、G)、制造例4(F、G))。然而，在醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株、與枯草桿菌DB9011株或NBRC3009株的組合中，將AOK210株或IK-05047株的培養(yǎng)物以2.5質(zhì)量％以上、將DB9011株或NBRC3009株以2.5xl08CFU/g以上添加到飼料添加劑時，得到的SE的防治效果的程度與將AOK210株或IK-05047株單獨(dú)以20質(zhì)量％以上添加到飼料添加劑時或?qū)B9011株或NBRC3009株單獨(dú)以2.0xl09CFU/g以上添加到飼料添加劑時相同(制造例5(CG)、制造例6(CG)制造例7(CG)、制造例8(CG))。再有，在給予將AOK210株或IK-05047株以20質(zhì)量％以上、將DB9011株或NBRC3009株以2.0xl(^CFU/g以上組合而成的詞料添加劑時，完全可以防治SE(制造例5(G)、制造例6(G)、制造例7(G)、制造例8(G))。由此可知，通過將醬油曲霉或米曲霉、與枯草桿菌組合而喂食給雛雞，具有以比各個有效成分單獨(dú)使用的情況更低的濃度預(yù)防SE感染癥的效果。(2)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊試驗使用上述制作的飼料添加劑，與上述同樣處理來飼養(yǎng)雛雞。7天大時向每只經(jīng)口投與5.0xlOtFU的產(chǎn)氣莢膜梭菌(CP)。14天大時用棉棒擦拭盲腸內(nèi)容物和總排泄腔來采取糞便。盲腸內(nèi)容物的CP生菌數(shù)根據(jù)以下方法測定，算出感染指數(shù)及防御指數(shù)。向盲腸內(nèi)容物lg加入滅菌磷酸緩沖生理鹽水稀釋為10倍，充分混合制作試樣原液。接著，用滅菌生理鹽水將試樣原液階段稀釋為10倍，制作階段稀釋液。將試樣原液及階段稀釋液分別在測定梭菌綱(Clostridia)用培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)中各涂抹O.lml,用Anaeropackkenki35'C中厭氧培養(yǎng)24小時，測定各平板培養(yǎng)基上繁殖的黑色菌落數(shù)。再有，挑取菌落接種于加蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)，35T:中需氧以及厭氧培養(yǎng)2448小時，確認(rèn)形狀。其中，被認(rèn)為是CP的菌落數(shù)乘以稀釋液的稀釋倍率來算出每lg盲腸內(nèi)容物的CP生菌數(shù)。以該結(jié)果為基礎(chǔ)，與上述同樣地算出感染指數(shù)及防御指數(shù)。關(guān)于從總排泄腔采取的糞便，通過根據(jù)以下方法對各個體進(jìn)行定性培養(yǎng)來確認(rèn)CP的形狀。S卩，將附著在棉棒上的糞便懸濁于10ml的滅菌磷酸緩沖生理鹽水中，作為試樣原液之后，將此在測定梭菌綱用培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)中各涂抹0.1ml,用Anaeropackkenki35'C中厭氧培養(yǎng)24小時，判定各平板培養(yǎng)基上有無繁殖的黑色菌落的形成。再有，挑取菌落接種于加蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制造)，35。C中需氧以及厭氧培養(yǎng)24~48小時來確認(rèn)性狀。感染指數(shù)示于表30、防御指數(shù)示于表31、采取總排泄腔糞便的CP的檢測個體數(shù)示于表32。表31<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固體培養(yǎng)物在單獨(dú)20質(zhì)量％以上添加到飼料添加劑時，盲腸內(nèi)容物的CP的菌體濃度變低，顯示了較低的CP的感染指數(shù)(制造例KF、G)、制造例2(F、G))?？莶輻U菌DB9011株或NBRC3009株在單獨(dú)2.0x109CFU/g以上添加到詞料添加劑時，盲腸內(nèi)容物的CP的菌體濃度變低，顯示了較低的CP的感染指數(shù)(制造例3(F、G)、制造例4(F、G))。然而，在醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株與枯草桿菌DB90U株或NBRC3009株的組合中，將AOK210株或IK-05047株以2.5質(zhì)量％以上、將DB9011株或NBRC3009株以2.5xl08CFU/g以上添加到飼料添加劑時，得到的CP的防治效果的程度與將AOK210株或IK-05047株單獨(dú)以20質(zhì)量％以上添加到飼料添加劑時或?qū)B9011株或NBRC3009株單獨(dú)以2.0xl09CFU/g以上添加到飼料添加劑時相同(制造例5(CG)、制造例6(CG)制造例7(CG)、制造例8(CG))。再有，在將AOK210株或IK-05047株以20質(zhì)量°/。以上、將DB9011株或NBRC3009株以2.0xl09CFU/g以上添加于詞料添加劑時，完全可以防治CP(制造例5(G)、制造例6(F、G)、制造例7(G)、制造例8(G))。由此可知，通過將醬油曲霉A0K210株或米曲霉IK-05047株與枯草桿菌DB9011株或NBRC3009株組合，具有比各個有效成分單獨(dú)使用的情況更低的濃度預(yù)防CP感染癥的效果。<8〉對仔豬的浮腫病菌攻擊試驗在仔豬詞料中混合上述巳制造的制造例1~8的飼料添加劑至其相對于仔豬飼料的總質(zhì)量(SD仔豬人工乳前后期用標(biāo)準(zhǔn)飼料、日本混合飼料(株)制造、未加抗菌性物質(zhì)的飼料)中為0.1質(zhì)量％。將3周齡的仔豬(商品名大約克夏種)8頭為一組，每組以不斷給飼料、自由給水來喂食14天。將僅混合0.1質(zhì)量％的乳糖的詞料作為對照區(qū)，同樣進(jìn)行試驗。將豬浮腫病菌大腸桿菌Escherichiacoli(EC)在胰酶大豆肉湯(DifcoLaboratories制造)中37。C下培養(yǎng)4小時。4'C下離心分離(3,000rpm,15分鐘)將顆粒放入腸溶性膠囊中。4周齡時將4.5xl()SCFU的EC用腸溶性膠囊向每頭強(qiáng)制經(jīng)口投與，1日1次，連續(xù)3天。將生理鹽水替代浮腫病菌放入腸溶性膠囊中，同樣強(qiáng)制經(jīng)口投與，作為無接種例，同樣進(jìn)行試驗。飼養(yǎng)至5周齡之后測定體重，算出各組的增加體重的平均值。此外，從強(qiáng)制經(jīng)口投與開始至試驗完結(jié)為止，每天進(jìn)行糞便性狀以及眼周圍浮腫的臨床觀察，按每個個體算出試驗期間中的糞便性狀分?jǐn)?shù)以及眼周圍浮腫分?jǐn)?shù)的合計，算出各組的分?jǐn)?shù)的平均值。試驗期間中的增加體重示于表33、糞便性狀分?jǐn)?shù)示于表34、眼周圍浮腫分?jǐn)?shù)示于表35。表33<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表35<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>眼周圍浮腫分?jǐn)?shù)0.無、1.輕度、2.中度、3.重度醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株的粉碎固體培養(yǎng)物單獨(dú)通過以15質(zhì)量％以上添加到飼料添加劑時，顯示所增體重與無接種例相同程度的值(制造例1(EG)、制造例2(EG))?？莶輻U菌DB卯ll株或NBRC3009株通過單獨(dú)15xl08CFU/g以上添加到飼料添加劑，顯示所增體重與無接種例相同程度的值(制造例3(EG)、制造例4(EG))。關(guān)于糞便性狀分?jǐn)?shù)、眼周圍浮腫分?jǐn)?shù)，也顯示了相同的傾向。然而，在醬油曲霉AOK210株或米曲霉IK-05047株與枯草桿菌DB9011株或NBRC3009株的組合中，通過將AOK210株或IK-05047株以2.5質(zhì)量％以上、將DB9011株或NBRC3009株以2.5xl08CFU/g以上添加到飼料添加劑，顯示所增體重與無接種例相同程度的值(制造例5(CG)、制造例6(CG)制造例7(CG)、制造例8(CG))。關(guān)于糞便性狀分?jǐn)?shù)、眼周圍浮腫分?jǐn)?shù)，也顯示了相同的傾向。由此可知，通過將醬油曲霉或米曲霉與枯草桿菌組合，具有以比各個有效成分單獨(dú)使用的情況相比更低的濃度預(yù)防浮腫病菌感染的效果。<9>對仔牛的鼠傷寒沙門氏菌攻擊試驗將出生后1周齡的公仔牛(Holstein種)4頭為一組，將市售哺乳期仔牛用代用乳(7口SA夕、日本混合飼料(株))早晚2次、每次各2L喂食至7周齡為止。自由給水、干草和市售人工乳(X—八。一〖5V、〈千一k、;/卜、全農(nóng))不斷喂食。將上述中制造的制造例1~8的飼料添加劑混合代用乳每天每頭投與25g。僅將25g乳糖混合于代用乳作為對照區(qū)，同樣進(jìn)行試驗。2周齡時每頭經(jīng)口投與懸浮在10%NaHCO350ml的5.0xl06CFU的鼠傷寒沙門氏菌(ST)。飼養(yǎng)至7周齡，測定體重，算出各組的增加體重的平均值。此外，從強(qiáng)制經(jīng)口投與開始至試驗完結(jié)為止，每天進(jìn)行糞便性狀的觀察，按每個個體算出試驗期間中的糞便性狀分?jǐn)?shù)的合計，算出各組的分?jǐn)?shù)的平均值。試驗期間中的增加體重示于表36、糞便性狀分?jǐn)?shù)示于表37。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>產(chǎn)業(yè)上的利用可能性將本發(fā)明的包含曲霉屬菌和該菌所產(chǎn)生的酸性酶的培養(yǎng)物、以及枯草桿菌的動物用飼料添加劑與飼料混合而使動物攝取，促進(jìn)營養(yǎng)吸收、飼料效率上升。具體地，曲霉屬菌產(chǎn)生的酸性酶顯示對腸內(nèi)的病原菌等的抗菌活性，枯草桿菌活化免疫，結(jié)果預(yù)防'改善動物的腸內(nèi)感染癥，有助于動物的體重增加。本發(fā)明的飼料可以適用于雞、豬、牛等的家畜的飼養(yǎng)。權(quán)利要求1.一種動物用飼料添加劑，含有選自醬油曲霉(Aspergillussojae)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、黑曲霉(Aspergillusniger)及米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一種的曲霉屬菌、含有這些菌所產(chǎn)生的酸性酶的培養(yǎng)物以及枯草桿菌(Bacillussubtilis)，每1g飼料添加劑的酸性酶活性的總和為120U以上，枯草桿菌的濃度為2.5×107～2×109CFU/g。2.如權(quán)利要求1記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，所述酸性酶含有酸性淀粉酶，每lg詞料添加劑的酸性淀粉酶活性為1U以上。3.如權(quán)利要求1或2記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，所述曲霉屬菌具有對引起動物腸內(nèi)感染癥的病原菌的抗菌活性及/或?qū)τ谇蛳x的殺原蟲活性。4.如權(quán)利要求1~3的任一項記載的動物用飼料添加劑，所述曲霉屬菌是醬油曲霉及/或米曲霉。5.如權(quán)利要求1~4的任一項記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，米曲霉是IK-05074株(FERMBP-10622)及/或它們的變異株，是具有與所述菌株相同的酸性酶產(chǎn)生能力的菌株。6.如權(quán)利要求1~5的任一項記載的動物用飼料添加劑，所述培養(yǎng)物含有植物性營養(yǎng)源。7.如權(quán)利要求6所記載的動物用飼料添加劑，所述植物性營養(yǎng)源是糙米。8.如權(quán)利要求1~7的任一項記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，枯草桿菌是DB9011株(FERMBP-3418)及/或它們的變異株。9.如權(quán)利要求1~8的任一項記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，用于促進(jìn)成長。10.如權(quán)利要求1~8的任一項記載的動物用飼料添加劑，其特征在于，用于腸內(nèi)感染癥的預(yù)防'改善。11.一種飼料，含有0.01-1.0質(zhì)量％的權(quán)利要求110的任一項記載的動物用飼料添加劑。12.—種詞料的制造方法，其特征在于，包括以下工序，在含有用于曲霉屬菌的增殖的營養(yǎng)源的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)選自醬油曲霉、溜曲霉、臭曲霉、黑曲霉及米曲霉的至少一種曲霉屬菌而得到培養(yǎng)物，含有該得到的培養(yǎng)物至每kg飼料的酸性酶活性的總和在12U以上的工序、和含有枯草桿菌至濃度為2.5xl06~2.0xl01QCFU/kg的工序。13.—種動物的飼養(yǎng)方法，其特征在于，使動物攝取權(quán)利要求ll所記載的飼料。全文摘要本發(fā)明提供用于輔助動物的消化活動、提高飼料效率的安全且簡便的手段。具體地講，提供通過抑制動物腸內(nèi)的病原菌或球蟲的增殖來預(yù)防·治療感染癥，并實現(xiàn)動物的體重增加的手段。將選自醬油曲霉(Aspergillussojae)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、黑曲霉(Aspergillusniger)及米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一種的曲霉屬菌、含有這些菌所產(chǎn)生的酸性酶的培養(yǎng)物、以及枯草桿菌(Bacillussubtilis)以規(guī)定量以上向動物投與。文檔編號C12N1/20GK101677595SQ20078003144公開日2010年3月24日申請日期2007年8月9日優(yōu)先權(quán)日2006年8月24日發(fā)明者望月正己申請人:出光興產(chǎn)株式會社