專(zhuān)利名稱：：通過(guò)使用細(xì)菌ω-轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)拆分外消旋胺混合物制備光學(xué)活性N-保護(hù)的3-氨基吡咯烷或...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及光學(xué)活性手性胺的制備方法。
背景技術(shù)：
：手性胺在醫(yī)藥、農(nóng)藥和化學(xué)產(chǎn)業(yè)中起到非常重要的作用。它們通常作為中間體或合成單體用于制備各種諸如藥物活性物質(zhì)的生理活性物質(zhì)，例如頭孢菌素或吡咯垸衍生物。在為數(shù)眾多的手性胺的各種應(yīng)用中，只有一種特定的光學(xué)活性形式，目卩(R)或(S)對(duì)映體是有生理活性的。因此，需要提供一種光學(xué)活性形式的手性胺的制備方法。通過(guò)添加手性羧酸結(jié)晶非對(duì)映體鹽來(lái)制備手性胺，這些要求部分得到了滿足(Breueratal.,AngewandteChemie(2004)116,806-843)。其他的化學(xué)方法則是利用對(duì)映體選擇性拆分，通過(guò)分解具有C=N雙鍵的前手性的前體。此外，使用不同的酶，例如蛋白酶、酰胺酶和脂肪酶，進(jìn)行立體選擇性裂解夕卜消旋體是已矢口的(BornscheureandKazlauskas,HydrolasesinOrganicSynthesis(2005)，Wiley-VCHWeinhdm)。特定的轉(zhuǎn)氨酶，即a-轉(zhuǎn)氨酶適合用于制備光學(xué)活性的氨基酸也是已知的(Bartschetal"Appl.Environm.Microbiol.(1996)62,3794-3799,Choetal"Biotechnol.Bioeng.(2003)83,226-234，JP01153084A2(1998)，JP63304986A2(1988),EP0248357A2andZiehretal"Biotechnol.Bioeng.(1987)29,482-487)。然而，這些現(xiàn)有技術(shù)的方法具有各種缺點(diǎn)。盡管相比傳統(tǒng)的方法，酶法通常使用更為溫和的條件，并且能夠獲得合理的立體選擇性，但是，它們通常使用的酶的底物特異性、對(duì)映體選擇性和/或轉(zhuǎn)化率對(duì)于工業(yè)化的生產(chǎn)過(guò)程還不夠高。另外，使用轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)光學(xué)活性胺的一個(gè)最主要的缺陷是常常會(huì)發(fā)生底物和產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種用于制備光學(xué)活性的手性胺的改進(jìn)的方法，特別是一種底物特異性、轉(zhuǎn)化率和/或?qū)τ丑w選擇性得到提到的方法。
發(fā)明內(nèi)容通過(guò)提供一種光學(xué)活性手性胺的制備方法，本發(fā)明解決了潛在的技術(shù)問(wèn)題，該方法包括轉(zhuǎn)化一種包含一個(gè)酮基的氨基受體化合物，以及一種3-氨基吡咯烷GAP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一種均在環(huán)氮原子上結(jié)合一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，加入(R)或(S)選擇性轉(zhuǎn)氨酶，以獲得3AP或3APi的對(duì)映體。這個(gè)氨基化合物對(duì)應(yīng)于所述的氨基受體化合物，而N-保護(hù)的3-吡咯垸酮或N-保護(hù)的哌啶-3-酮?jiǎng)t是酮產(chǎn)物。本發(fā)明的方法包括(a)提供一種氨基受體和一種l-N-保護(hù)的3AP或l-N-保護(hù)的3APi的消旋混合物，例如各個(gè)胺的兩種對(duì)映體的混合物，(b)用(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化所述氨基受體以及各個(gè)胺的消旋混合物，(c)獲得一種光學(xué)活性的手性胺，一種胺產(chǎn)物和一種酮產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，在隨后的可選處理步驟中，步驟c)中獲得的光學(xué)活性的手性胺被從步驟c)獲得的反應(yīng)混合物中分離并純化。本發(fā)明的反應(yīng)根據(jù)以下反應(yīng)式進(jìn)行<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>根據(jù)本發(fā)明，所述3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物在環(huán)的第二個(gè)氮原子上都具有保護(hù)基團(tuán)，也就是在胺的手性中心的一號(hào)位的氨基，參與轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的3號(hào)位沒(méi)有受到保護(hù)。保護(hù)基團(tuán)的存在使得所述被保護(hù)的胺，即l-N-保護(hù)的3AP或3APi，更有效地轉(zhuǎn)化為所需的光學(xué)活性手性胺。因此，保護(hù)基團(tuán)的存在，獲得了所需的光學(xué)活性手性胺的高得率。相比之下，環(huán)上的氮原子沒(méi)有保護(hù)基團(tuán)的起始胺的效率較低。所以，本發(fā)明提供了一種酶解l-N-保護(hù)的胺的方法，通過(guò)使用至少一種(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，將l-N-保護(hù)的手性胺的對(duì)映體混合物中一種特定的對(duì)映體上的一個(gè)氨基轉(zhuǎn)移到一種氨基受體上，從而形成所需的光學(xué)活性產(chǎn)物。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"胺的酶解"或"消旋混合物的酶解"是指利用立體選擇性酶轉(zhuǎn)化消旋混合物的一種對(duì)映體的光學(xué)分解。根據(jù)(R)-或(S)-選擇轉(zhuǎn)氨酶的對(duì)映體偏好性，一種所需光學(xué)構(gòu)型的光學(xué)活性手性胺，g卩(R)-或(S)-對(duì)映體就獲得了。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在酶解合成中使用一種(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，去除消旋混合物中的(S)-對(duì)映體，并生成手性胺的所需的光學(xué)活性的(R)-對(duì)映體；而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在酶解合成中使用(R)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，去除消旋混合物中的(R)-對(duì)映體，并生成所需的光學(xué)活性的(S)-對(duì)映體。除了所需的光學(xué)活性手性胺外，該反應(yīng)還從消旋混合物的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中產(chǎn)生了一種酮產(chǎn)物，來(lái)自所使用的氨基受體的一種胺產(chǎn)物，以及部分未分解的不需要的對(duì)映體和未轉(zhuǎn)化的氨基受體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述保護(hù)基團(tuán)是一個(gè)叔丁氧羰基(Boc)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述保護(hù)基團(tuán)是一個(gè)芐基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述保護(hù)基團(tuán)是一個(gè)芐氧羰基(Cbz)。在本發(fā)明的上下文中，一種轉(zhuǎn)氨酶是磷酸吡眵醛依賴性的轉(zhuǎn)氨酶，其催化氨基的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)氨酶被分類(lèi)在E.C.2.6丄X。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)氨酶是一種(R)-或(S)-選擇性的轉(zhuǎn)氨酶，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，特別的是一種"-轉(zhuǎn)氨酶。在本發(fā)明的上下文中，(R)_或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶是一種分類(lèi)號(hào)為E.C.2.6丄18的酶。這些氨基轉(zhuǎn)氨酶的特征在于，它們主要利用初級(jí)的胺作為底物。這些酶的進(jìn)一步的特征就是顯示出的(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)的平衡常數(shù)大于1，本發(fā)明可以使用的(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶已有描述，例如在Iwasakietal.,Biotechnol.lett.(2003)25，1843-1846,Shinetal.,Biotechnol.Bioeng.(1997)55,348-358，ShinandKim,BookofAbstracts,217thACSNationalMeeting,Anaheim,Calif"March21-25,(1999)180,ShinandKim,Biosc.Biotechnol.Biochem.(2001)65，1782-1788和ShinandKim,Biotechnol.Bioeng.(1998)60,534-540。6所以，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的方法所使用的(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶是來(lái)源于河流弧菌(W6n'oywv/fl/^)、特別是菌株JS17，反硝化產(chǎn)堿菌tfemYr訴cam)、特別是菌株Y2K-2，肺炎桿菌(《/eZw/e〃a/"e畫(huà)羅.cre)、特另ll是菌株YS2F，或者是蘇蕓金桿菌(6鎖.〃w"/z訓(xùn)'"g〖e腦's)、特別是菌株JS64(關(guān)于菌株的鑒定請(qǐng)見(jiàn)上述的ShinandKim，1998)。當(dāng)然，本發(fā)明也可以理解為術(shù)語(yǔ)(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶是有機(jī)體的提取物，例如含有一種(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的微生物或細(xì)胞，或者是自身包含有(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的活體或死的細(xì)胞和微生物。這樣一種微生物或細(xì)胞或提取物或轉(zhuǎn)氨酶可以采用固定或非固定的形式，所述(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶也可以是重組產(chǎn)生、自然生成或遺傳修飾的(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，這些酶部分或完全地由核酸序列編碼，或者是它們的衍生物，包含于一種上述的有機(jī)體和它們的等同物中。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"光學(xué)活性手性胺"與術(shù)語(yǔ)"對(duì)映體活性手性胺"涉及同樣的主題。這些術(shù)語(yǔ)特別的是指一種制備物，在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，其基本上不含不需要的對(duì)映體。因此，光學(xué)活性手性胺主要是包含一種過(guò)量的對(duì)映體或者甚至是僅由一種對(duì)映體組成。特別的，在本發(fā)明的上下文中，光學(xué)活性手性胺的光學(xué)純度至少為70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8。％，特另ij是至少為99.9%。在本發(fā)明中，光學(xué)純度用一種對(duì)映體超過(guò)另一種對(duì)映體的百分比來(lái)表示，所以，光學(xué)純度的百分比是(R)-和(S)-對(duì)映體的濃度之差與兩種對(duì)映體的總濃度的商(八的光學(xué)純度％=([A]-[B]):([A]+[B])X100，其中A和B代表(R)-和(S)-對(duì)映體濃度，或相反)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述手性胺的消旋混合物轉(zhuǎn)化成所需的光學(xué)活性手性胺的轉(zhuǎn)化率至少為30、40、45、46、47、48、49%，特別是50%,分析光學(xué)純度的濃度和轉(zhuǎn)化率可以通過(guò)使用例如HPLC、氣相色譜(GC)，光度或熒光的方法來(lái)確定。本發(fā)明顯示，保護(hù)基團(tuán)對(duì)于轉(zhuǎn)化率有著積極的作用，因而使得使用(s)-特異性轉(zhuǎn)氨酶的(R)-3-氨基吡咯烷的得率得到提高。另外，保護(hù)基團(tuán)還顯示了(雖然不明顯)對(duì)于3-氨基吡咯烷的轉(zhuǎn)化率的影響，并且對(duì)于酶的選擇性有積極作用。在本發(fā)明的上下文中，氨基受體是一種分子，其含有一個(gè)酮基，并且，通過(guò)(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，能夠接受來(lái)自一個(gè)氨基供體的氨基，例如，在目前的情況下，來(lái)自胺的消旋混合物的一種胺。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述氨基受體是一個(gè)a-酮酸。在本發(fā)明的一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，所述氨基受體選自苯丙酮酸，其鹽，丙酮酸，其鹽，乙醛酸，其鹽，苯乙酮，2-酮戊二酸，其鹽，丙酮，3-氧代丁酸，其鹽，和2-丁酮。此外，在另一個(gè)實(shí)施例中，3-氧代吡咯垸(3-OP)，(3-吡啶基)甲酮(3-PMK)，3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)，或3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)也可以用作氨基受體。根據(jù)本發(fā)明，由氨基受體苯丙酮酸轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為苯丙氨酸。由氨基受體丙酮酸轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為丙氨酸。由氨基受體乙醛酸轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為甘氨酸。由氨基受體苯乙酮轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為l-苯乙胺。由氨基受體2-酮戊二酸轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為谷氨酸。由氨基受體丙酮轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為異丙胺。由氨基受體3-氧代丁酸轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為3-氨基丁酸。由氨基受體2-丁酮轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為仲丁胺。由氨基受體3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為3-氨基丁酸。由氨基受體3-氧代戊酸乙酯(3-OPME)轉(zhuǎn)化獲得的胺產(chǎn)物為3-氨基戊酸甲酯。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所獲得的需要的光學(xué)活性手性胺依賴于所使用的(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，或者是所述手性胺的(R)-或(S)-對(duì)映體。根據(jù)本發(fā)明，本方法所獲得的酮為l-N-保護(hù)的3-吡咯垸酮或者是l-N-保護(hù)的哌啶-3-酮。本發(fā)明的方法包括使用一種(S)-或(R)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶以及一種氨基受體轉(zhuǎn)化l-N-保護(hù)的3AP的消旋混合物，以獲得光學(xué)活性(R)-或(S)-1-N-保護(hù)的3AP。本發(fā)明的方法也包括使用一種(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶以及一種氨基受體轉(zhuǎn)化l-N-保護(hù)的3APi的消旋混合物，以獲得光學(xué)活性(S)-或(R)-1-N-保護(hù)的3APi。根據(jù)本發(fā)明的方法，所獲得的l-N-保護(hù)的3AP或l-N-保護(hù)的3APi中的保護(hù)基團(tuán)可以使用現(xiàn)有技術(shù)已知的任意去保護(hù)的方法去除。一種使用濃縮的鹽酸和丙酮去除叔丁氧羰基(Boc)的方法例如在Coffeyetal.,Org.Proc.Res.Dev.,8(6)(2004),pages945-947中有報(bào)道。8在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述氨基受體和胺的消旋混合物在水介質(zhì)、例如生理緩沖液中通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行反應(yīng)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的pH控制在59，特別是78.5。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述反應(yīng)的溫度控制在1065°C，優(yōu)選2050。C，特別是1825。C，優(yōu)選室溫或3439°C，特別是37'C。在本發(fā)明的一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，所述氨基受體和胺的消旋混合物的摩爾比為1:11:10，特別是l:11:4。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述酶活力可以是從120.000pmol/min。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種方法，用于制備如上所述的光學(xué)活性手性胺，根據(jù)該方法，在第一步a)提供一種氨基受體以及3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一種均在環(huán)氮原子上具有保護(hù)基團(tuán)；在第二步b)使所述手性胺的消旋混合物和所述氨基受體通過(guò)至少一種co-轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化；在第三步c)獲得一種光學(xué)活性手性胺，一種胺產(chǎn)物，以及一種酮產(chǎn)物；在下一步d)在步驟c)獲得的酮產(chǎn)物和/或胺產(chǎn)物被從獲得的反應(yīng)混合物中去除，也就是通過(guò)酶解，特別是使用選自于脫羧酶、合酶、脫氫酶中的一種酶酶解。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，所述酮和/或胺產(chǎn)物可以利用蒸發(fā)或萃取去除。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，所獲得的酮產(chǎn)物也可以通過(guò)自發(fā)的脫羧作用去除。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟c)中獲得的所述酮產(chǎn)物通過(guò)與一種乙醇脫氫酶(ADH)反應(yīng)而被去除，所述乙醇脫氫酶例如乳酸菌發(fā)酵得到的酸乳酒ADH，能將苯乙酮降解為l-苯乙醇。在本發(fā)明的一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟c)中獲得的所述酮和/或胺產(chǎn)物被連續(xù)地從反應(yīng)混合物中去除，優(yōu)選的是通過(guò)連續(xù)萃取。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述酮產(chǎn)物可以使用一種兩相系統(tǒng)或酶-膜反應(yīng)器通過(guò)連續(xù)萃取的方式被去除。這些特別優(yōu)選的實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)是獲得了理想的轉(zhuǎn)化率，因?yàn)樽鳛楸痉椒ǖ母碑a(chǎn)物的酮被從平衡反應(yīng)中去除。這個(gè)反應(yīng)由于受到產(chǎn)物導(dǎo)向的制約，因此可以高立體選擇性地轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物。去除酮產(chǎn)物是特別有利的，因?yàn)檫@使得產(chǎn)物抑制最小化。本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施例是從屬權(quán)利要求的主題。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更為詳細(xì)的描述。實(shí)施例1:酶解(R,S)-B3AP本實(shí)施例中，來(lái)自河流弧菌(ra^/oyZwv/a/^)(JulichChemicalSolutions,德國(guó))的(S)co-轉(zhuǎn)化酶(以下稱為T(mén)A7)，以及來(lái)自反硝化產(chǎn)堿菌"/cd扭"Mflfe"/的ycww)(JulichChemicalSolutions,德國(guó))的(S)co-轉(zhuǎn)化酶(以下稱為T(mén)A7)(以下稱為T(mén)A8)被用于反應(yīng)混合物中，在pP^7的50mMTris-HCl中的終濃度為4U/ml。以10mM(終濃度)的(R,S)-B3AP(N-l叔丁氧羰基氨基吡咯烷)消旋混合物溶液(20nmol)作為起始反應(yīng)物，使用TA7或TA8，以終濃度為10mM的丙酮酸鹽作為氨基受體，在反應(yīng)混合物中于37T:轉(zhuǎn)化15小時(shí)。反應(yīng)15小時(shí)后，使用TA7(S)(d-轉(zhuǎn)化酶得到的光學(xué)活性的胺(R)-B3AP的光學(xué)純度為62.5±0.5%，轉(zhuǎn)化率為39.0±5%。TA8(S)cd-轉(zhuǎn)化酶在15小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間后得到的光學(xué)活性的胺(S)-B3AP的光學(xué)純度為97.5±0.5%，轉(zhuǎn)化率為47.6±5%。很明顯，獲得的光學(xué)純度較高或者甚至是很高，而且接近于理想的立體選擇性酶的值。需要注意的是，對(duì)于TA7，光學(xué)純度相對(duì)較低主要是由于轉(zhuǎn)化率較低。實(shí)施例2:酶解(R,S)-l-N-Boc-3-哌啶對(duì)于酶解(R,S)-1-N-Boc-3-哌啶的消旋混合物，用丙酮酸(終濃度10mM)作為氨基受體；使用(S)co-轉(zhuǎn)化酶TA8于50mM的磷酸鈉緩沖液中，pH7.5。在TA8酶濃度為2U/ml的條件下，于37"C反應(yīng)72小時(shí)后，獲得的光學(xué)活性的(R)-1-N-Boc-3-哌啶的光學(xué)純度為70±5%，轉(zhuǎn)化率為54±0.5%。在相同的反應(yīng)條件下，使用20U/ml的TA8獲得的光學(xué)活性的(R)-1-N-Boc-3-哌啶的光學(xué)純度為98.5±0.5%，轉(zhuǎn)化率為72±5%。實(shí)施例3:通過(guò)消旋裂解制備光學(xué)活性的(R)-B3AP230mg(0.85mmo1)消旋(R,S)-B3AP，終濃度為10mM，用0.8U/ml的(S)。-轉(zhuǎn)化酶TA8處理。終濃度為lOmM的丙酮酸用作氨基受體。反應(yīng)在pH=8的磷酸鉀緩沖溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度37"C。過(guò)量的對(duì)映體通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)。反應(yīng)7小時(shí)反應(yīng)后，獲得的89.4mg光學(xué)活性(R)-B3AP的光學(xué)純度為98.7±0.5%，得率為39±5%(0.33mmo1)。反應(yīng)結(jié)束后，用5N的鹽酸調(diào)節(jié)pH值到5。生成的B30P4用二氯甲烷提取四次，每次75ml。薄板層析未在反應(yīng)溶液中檢測(cè)到B30P。然后，用KOH調(diào)節(jié)pH值至13，用二氯甲烷提取3次，每次100ml。薄板層析只檢測(cè)到一條B3AP的條帶。合并含有B30P和B3AP的有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，隨后增溶劑被蒸發(fā)。然后進(jìn)行'H和。C核磁共振譜檢測(cè)。得到103.6mg作為酮產(chǎn)物的Boc-3-吡咯烷酮，轉(zhuǎn)化率44±5%。另外還得到了胺產(chǎn)物丙氨酸。選擇性地除去胺產(chǎn)物丙氨酸，例如用丙氨酸脫氫酶的反應(yīng)，被證實(shí)是非常有用的，因?yàn)檫@使得生成的丙氨酸所引起的產(chǎn)物抑制最小化，隨之而來(lái)的是，這也能使用更高濃度的胺作為起始反應(yīng)物。使用丙酮的情況也是如此。使用丙酮作為氨基受體可以提高轉(zhuǎn)化率，丙酮在轉(zhuǎn)化為胺產(chǎn)物異丙胺后，可以在減壓條件下從反應(yīng)產(chǎn)物中去除。實(shí)施例4:河流弧菌(W6n'o/m;/afo)轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)拆分l-N-芐基-3-氨基吡咯烷(Be3AP)的消旋混合物在一個(gè)1.5ml的反應(yīng)管中裝入lOpl(R,S)-Be3AP溶液于DMSO中(終濃度5mM)20磷酸吡口多醛，10mM(終濃度0.2mM)100pl丙酮酸鹽，100mM(終濃度10mM)830inl磷酸鈉緩沖液，50mM，pH8加入40pl的河流弧菌(W6n'oyZm^fo)轉(zhuǎn)氨酶啟動(dòng)反應(yīng)。對(duì)應(yīng)的酶濃度為7U/ml。分別在反應(yīng)開(kāi)始后O分鐘，IO分鐘，30分鐘和60分鐘取樣。反應(yīng)的進(jìn)程和光學(xué)純度在表1中列出。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[%eeR]:(R)對(duì)映體過(guò)量的百分比。數(shù)據(jù)顯示，河流弧菌(W6n'oym^to)轉(zhuǎn)氨酶對(duì)轉(zhuǎn)化Be3AP有很高的活性。實(shí)施例5:河流弧菌(W6n'o/7m^fe)轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)拆分(R，S)-Cbz-3-氨基吡咯垸(C3AP)的消旋混合物在一個(gè)1.5ml的反應(yīng)管中裝入10jil(R，S)-C3AP溶液于DMSO中(終濃度5mM),20fil磷酸吡R^醛，10mM(終濃度0.2mM).100fil丙酮酸鹽，100mM(終濃度10mM)830pl的磷酸鈉緩沖溶液，50mM，pH8加入40iul的河流弧菌(f^n'o/7m^fc)轉(zhuǎn)氨酶啟動(dòng)反應(yīng)。對(duì)應(yīng)的酶濃度為7U/ml。分別在反應(yīng)開(kāi)始后O分鐘，IO分鐘，30分鐘和60分鐘取樣。10分鐘后即在樣品中檢測(cè)到(R)-C3AP對(duì)應(yīng)體過(guò)量，(R)對(duì)映體過(guò)量的百分比為97.3%eeR。30分鐘后已檢測(cè)不到(S)對(duì)映體。實(shí)施例6:河流弧菌()^)n'o/7im'flfe)轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)拆分(R,S)-1-N-boc-3-氨基哌啶(B3APi)的消旋混合物在一個(gè)1.5ml的反應(yīng)管中裝入lOO[il(R,S)-B3APi鹽酸溶液于水中(終濃度5mM)20磷酸卩比眵醛，10mM(終濃度0.2mM)100(il的丙酮酸鹽，pH8，100mM(終濃度10mM)580pl的磷酸鈉緩沖液，50mM，pH8加入200)til的河流弧菌(W^/oyZwv/afe)轉(zhuǎn)氨酶啟動(dòng)反應(yīng)。對(duì)應(yīng)的酶濃度為35U/ml。分別在反應(yīng)開(kāi)始后IO分鐘，30分鐘，60分鐘，2小時(shí)，4小時(shí)和18小時(shí)取樣。4小時(shí)后獲得的對(duì)應(yīng)體過(guò)量的百分比為96.3%ees。轉(zhuǎn)化率為55±5%。盡管需要使用大量的酶，但足以證明河流弧菌(附Woy7謂》fe)轉(zhuǎn)氨酶可以用于光學(xué)拆分(R,S)-B3APi。權(quán)利要求1、一種制備光學(xué)活性手性胺的方法，其特征在于包括a)提供一種氨基受體以及一種3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一種均在環(huán)氮原子上具有一個(gè)保護(hù)基團(tuán)；b)以(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化所述氨基受體以及所述胺的消旋混合物；c)獲得光學(xué)活性手性胺，一種胺產(chǎn)物以及一種酮產(chǎn)物。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述保護(hù)基團(tuán)是芐基、叔丁氧羰基(Boc)或芐氧羰基(Cbz)。3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述氨基受體選自苯丙酮酸，其鹽，丙酮酸，其鹽，乙醛酸，其鹽，苯乙酮，2-酮戊二酸，其鹽，丙酮，3-氧代丁酸，其鹽，2-丁酮，3-氧代吡咯垸(3-OP)，(3-吡啶基)甲酮(3-PMK)，3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)，和3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)。4、如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述獲得的胺產(chǎn)物是一種初級(jí)胺或氨基酸。5、如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶是來(lái)自河流弧菌(yim'"/")，反硝化產(chǎn)堿菌(力cfl"ge""dem'fr訴co/M)，月市炎桿菌(A7efe/e〃apwewmom'ae)，或蘇蕓金桿菌(tec/〃MSAwn'"g/e"^)的(R)-或(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶。6、如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在步驟c)獲得的所述胺產(chǎn)物和/或酮產(chǎn)物進(jìn)一步在步驟d)中，通過(guò)酶反應(yīng)、自發(fā)的脫羧反應(yīng)、萃取或蒸發(fā)被從反應(yīng)混合物中去除。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在步驟d)中使用的所述酶是脫羧酶、合酶或脫氫酶。8、如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述酶是乙醇脫氫酶(ADH)。9、如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在步驟c)或d)獲得的所述光學(xué)活性手性胺被從在步驟c)或d)獲得的反應(yīng)混合物中去除。10、如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在步驟C)或d)獲得的所述l-N-保護(hù)的3AP或l-N-保護(hù)的3APi的保護(hù)基團(tuán)通過(guò)去保護(hù)的方法被去除。11、一種使用權(quán)利要求110中任一項(xiàng)所述的方法制備生理活性化合物的方法，所述生理活性化合物選自3-氨基吡咯烷衍生物，頭孢菌素，頭孢菌素的衍生物，雜環(huán)硼酸，L-二羥基苯丙氨酸(L-多巴)，a-甲基多巴，D-苯甘氨酸，(3-羥基苯甘氨酸，草胺磷，氨基比林衍生物，以及吡咯烷酮衍生物。全文摘要本發(fā)明涉及光學(xué)活性胺的制備方法，所述光學(xué)活性胺可以用作合成例如藥用產(chǎn)品的中間體。文檔編號(hào)C12P17/10GK101512005SQ200780032912公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2006年9月6日發(fā)明者烏韋·博恩朔伊爾,卡倫·羅賓斯,馬蒂亞斯·赫內(nèi)申請(qǐng)人:龍沙股份有限公司