專利名稱：微量mRNA的擴增方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微量mRNA的擴增方法及其應(yīng)用，更具體地說，用于cDNA 文庫(library)的制作、mRNA的正義(sense )鏈的擴增、編碼mRNA的正 義鏈的標識探針的制作以及階段性減影(subtraction)等的微量mRNA的擴 增方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一直以來，作為基因的分析方法，眾所周知例如分析cDNA文庫等的方 法。cDNA文庫是通過從生物細胞提煉出mRNA，并由該mRNA合成cDNA 來制作的。此時，從細胞提煉的mRNA通常是極微量的。當(dāng)從生體內(nèi)存在的 許多種細胞提煉mRNA時，如果用于mRNA提煉的細胞數(shù)多，就能獲得合 成cDNA文庫所必需的足量mRNA。但是，由生體內(nèi)只存在極少的細胞(例 如千細胞或生殖細胞等)提煉mRNA等情況下，會對可用于合成cDNA文庫 的mRNA量產(chǎn)生很大的限制。在這種情況下，為了合成cDNA,需要擴增提 煉的mRNA。于是，以往開發(fā)了對極微量的mRNA進行擴增的方法。
作為上述那樣的mRNA的擴增方法， 一般有采用PCR來擴增mRNA的 方法。mRNA的具體擴增方法如下。首先，由細"包提煉mRNA。其次，通過 逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)來調(diào)制cDNA。接著，以該cDNA為模板，通過DNA聚合酶來調(diào) 制雙鏈(double-stranded) DNA。然后，利用PCR來擴增該雙鏈DNA。最 后，使RNA聚合酶作用于擴增后的雙鏈DNA，調(diào)制mRNA，獲得擴增的mRNA (例如，參照專利文獻l)。
專利文獻1:日本特開2002 - 238575號公報(2002年8月27日公開)
但是，如上述專利文獻1所記栽的利用PCR來擴增mRNA的方法，存 在不能以相同的效率擴增短的mRNA和長的mRNA的問題。
具體說明則如下。PCR具有可有效率地擴增較短的g序列但不能有效 率地擴增較長的g序列的特性。因此，如專利文獻l那樣利用PCR來擴增 作為mRNA模板的擴增用雙鏈DNA的方法，可有效率地擴增具有較短g
4序列的擴增用雙鏈DNA,但無法有效率地擴增具有較長堿基序列的擴增用雙 鏈DNA。即，在合成mRNA時作為模板的擴增用雙鏈DNA的擴增量因擴增 用雙鏈DNA4tt序列的長度而異。因此，在以利用上述PCR來擴增的用雙 鏈DNA為模板擴增mRNA的場合，可有效率地擴增較短的mRNA,但存在 不能以相同的效率擴增較長的mRNA的問題。該缺點在想要制作多樣性高的 cDNA文庫時會成為很大的問題。即，上述傳統(tǒng)的方法存在這樣的問題，即 在作為cDNA文庫最為重要的mRNA (cDNA)的量分布在得到擴增后，會 廣泛崩解的問題。.
故，強烈要求開發(fā)不受堿基序列長度的影響，不管短的mRNA還是長的 mRNA都可同樣有效率地擴增的微量mRNA的擴增方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于上述傳統(tǒng)技術(shù)的問題構(gòu)思而成，其目的在于提供不受堿基序 列長度的影響而不論是短的mRNA還是長的mRNA都可同樣有效率地擴增 的微量mRNA的擴增方法及其應(yīng)用方法。
為了解決上述問題，本發(fā)明人認真進行研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)擴增對象的 mRNA在反應(yīng)液中僅存在極孩t量的場合，向反應(yīng)液添加虛擬RNA ( dummy RNA)并合成擴增用雙鏈DNA,從而能夠?qū)U增用雙鏈DNA量增加至RNA 聚合酶的最宜基質(zhì)濃度(亳摩(mM)左右)，能夠顯著提升至今為止因基質(zhì) 濃度低而反應(yīng)速度極慢的RNA合成反應(yīng)速度，并可有效率地擴增mRNA。 又，依據(jù)該技術(shù)，證實了由于不需要經(jīng)過利用PCR來擴增雙鏈DNA的工序， 可不受其堿基序列長度影響而有效率地擴增mRNA,并完成了本發(fā)明。本發(fā) 明基于該新穎的知識而完成，并包含以下的發(fā)明。
即，為了解決上述問題，本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法的特征在于包 含在包含微量mRNA的溶液中添加虛擬RNA來制作混合溶液的第一工序； 根據(jù)使用混合溶液作為才莫板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)，合成反義(anti-sense) DNA的 第二工序；對于合成后的反義DNA合成互補的正義DNA,形成由正義DNA 和反義DNA組成的雙鏈DNA的第三工序；在所形成的雙鏈正義DNA的正 義DNA的5，末端側(cè)連接RNA聚合酶的啟動子(promoter)序列制作擴增用 雙鏈DNA的第四工序；以及通過RNA聚合酶，由擴增用雙鏈DNA擴增RNA
5的第五工序。
依據(jù)上述構(gòu)成，能夠通過向微量mRNA添加虛擬RNA來增加混合溶液 中的RNA量。其結(jié)果，與混合溶液中的RNA只是微量mRNA的場合相比， 所制作出的擴增用雙鏈DNA的量增加，此時，擴增用雙鏈DNA的量調(diào)制為 RNA聚合酶的最宜基質(zhì)濃度。其結(jié)果，能夠進行基于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)印反 應(yīng)，因此不受M序列長度影響，不管是短的mRNA還是長的mRNA都可 同樣有效率地擴增。
即，依據(jù)本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法，能夠通過利用虛擬RNA增 加起始RNA濃度來解決因起始RNA的量少而雙鏈DNA量變少，從而難以 進行轉(zhuǎn)印反應(yīng)的問題。本發(fā)明的特征在于此。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述第四工序最好包含在 第三工序中形成的雙鏈DNA的兩末端側(cè)連接啟動子序列，再僅切斷連接在雙 鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)的啟動子序列的第六工序。
依據(jù)上述構(gòu)成，可以只將孩吏量mRNA及虛擬RNA的正義鏈選擇性轉(zhuǎn)印， 結(jié)果能夠只擴增正義鏈。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述第四工序最好在雙鏈 DNA的正義DNA的3，末端側(cè)形成限制酵素位點，以^i巨夠在第三工序中 形成的雙鏈DNA ^兩末端側(cè)連接了啟動子序列時，只切斷連接在雙鏈DNA 的正義DNA的3'末端側(cè)的啟動子序列。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述第四工序最好包含除 去切斷的啟動子序列及虛擬RNA的第七工序。
依據(jù)上述構(gòu)成，在根據(jù)RNA聚合酶擴增RNA時，RNA聚合酶不會結(jié)合 到切斷的啟動子序列上，而可以僅由連接在上述雙鏈DNA的正義DNA的5， 末端側(cè)的啟動子序列轉(zhuǎn)印RNA。因而，可以有效率地轉(zhuǎn)印正義鏈的微量 mRNA和虛擬RNA。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述虛擬RNA的序列最 好包含聚腺苷酸(polyA)。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述虛擬RNA的序列最 好是由序列號4、序列號6或序列號16所示的g序列。
依據(jù)上述構(gòu)成，微量mRNA和虛擬RNA都具有聚腺苷酸序列。因而，在逆轉(zhuǎn)印微量mRNA和虛擬RNA時，可以采用包含寡聚核苷酸(oligo) dT 序列的相同引物(primer)來同時逆轉(zhuǎn)印。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述虛擬RNA最好被生 物素化(biotin)。
依據(jù)上述構(gòu)成，被生物素化的虛擬RNA可特異性結(jié)合到鏈酶親合素 (streptoavidin)。因而，通過使用鏈酶親合素柱(column)等，可從反應(yīng)溶 液特異性僅除去虛擬RNA。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述RNA聚合酶優(yōu)選T7 聚合酶、T3聚合酶或SP6聚合酶。
依據(jù)上述構(gòu)成.，可有效率地轉(zhuǎn)印微量mRNA和虛擬RNA。
此外，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，上述混合溶液中的虛擬 RNA的濃度優(yōu)選0.5 ~ 10pg/nL。
依據(jù)上述構(gòu)成，可制作出適合RNA聚合酶反應(yīng)的濃度的擴增用雙鏈 DNA。其結(jié)果，能夠擴增本來因轉(zhuǎn)印反應(yīng)速度慢而不能擴增的微量mRNA。
為了解決上述問題，本發(fā)明的cDNA文庫的制作方法的特征在于其中一 個工序包含上述微量mRNA的擴增方法。
依據(jù)上述構(gòu)成，即侵爽始mRNA量為微量也可有效率地擴增mRNA。故， 可從微量mRNA制作cDNA文庫。
為了解決上述問題，本發(fā)明的探針制作方法的特征在于其中一個工序包 含上述微量mRNA的擴增方法。
依據(jù)上述構(gòu)成，即便起始mRNA量為孩i:量也可有效率地擴增mRNA。故， 可從微量mRNA制作探針。
為了解決上述問題，本發(fā)明的階段性減影方法的特征在于其中一個工序 包含上述孩么量mRNA的擴增方法。
依據(jù)上述構(gòu)成，即侵起始mRNA量為微量也可有效率地擴增mRNA。故， 可從微量mRNA實施階段性減影方法。
本發(fā)明其它的目的、特征及優(yōu)點，以下借助附圖理解的關(guān)于本發(fā)明的詳 細說明將給出清晰闡述。


圖1 (a)是本發(fā)明特征的示意圖。 圖1 (b)是本發(fā)明特征的示意圖。
圖2表示本發(fā)明的實施方式，是表示本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法的
各工序的流程圖。
圖3表示本發(fā)明的實施方式，是虛擬RNA制作方法的示意圖。
圖4表示本發(fā)明的實施方式，是表示本發(fā)明的cDNA文庫的制作方法的
各步驟的流程圖。
圖5是在實施例中制作的用于制作虛擬RNA的載體(vector)的模式圖。
圖6 (a)是表示探討實施例中虛擬RNA的最佳量的結(jié)果的電泳圖。
圖6 (b)是表示探討實施例中虛擬RNA的最佳量的結(jié)果的圖表。
圖7 (a)是奉示實施例中可擴增的微量mRNA的量的電泳圖。
圖7 (b)是表示實施例中可擴增的微量mRNA的量的電泳圖。
圖7 (c)是表示實施例中可擴增的微量mRNA的量的電泳圖。
圖8是表示實施例中cDNA文庫的片段(insert)長度分布的圖表。
圖9 (a)是表示擴增的mRNA的尺寸分布的圖表。
圖9 (b)是表示擴增的mRNA的尺寸分布的圖表。
圖10 (a)是表示擴增的mRNA的尺寸分布之比較結(jié)果的圖表。
圖10 (b)是表示擴增的mRNA的尺寸分布之比較結(jié)果的圖表。
圖ll是表示實施例中針對一種RNA的擴增效果的電泳圖。
擴增效果的電泳圖。
圖13是表示實施例中熒光色素交換實驗結(jié)果的圖表。 圖14是表示實施例中cDNA文庫的制作工序的流程圖
具體實施例方式
以下，根據(jù)圖1 (a)、圖1 (b) 、 2及5，就本發(fā)明的一個實施方式進 行說明。首先，對于本發(fā)明的基本原理， 一邊與傳統(tǒng)技術(shù)做比較一邊進行說 明。
如上所述，作為傳統(tǒng)的擴增RNA的方法，有對利用擴增用雙鏈DNA和 RNA聚合酶的RNA進行擴增的方法，其中擴增用雙鏈DNA上連接了 RNA
8聚合酶的啟動子序列。但是，在上述方法存在如果擴增用雙鏈DNA的量多就 能擴增RNA，但如果擴增用雙鏈DNA的量少就不能擴增RNA的問題。
可由米式方程式(Michaelis Menten equation)容易理解這種擴增用雙鏈 DNA的量少時不能擴增RNA的理由。即，眾所周知用于cDNA文庫制作的 RNA聚合酶等酵素的最宜基質(zhì)濃度為毫摩(mM)程度。上述最宜基質(zhì)濃度 (米氏(Michaelis)常數(shù)Km值)由米式方程式(參照式(1))獲得。還 有，在式(1)中，Km= (K2 + K3)/K1， Vmax表示最大反應(yīng)速度，[S]表示 基質(zhì)濃度。
V = Vmax[S〗/ (Km + [S])……(1)
當(dāng)[S]-Km時，V = Vmax/2。此時，Vmax為全部酵素形成與基質(zhì)的復(fù)合體 時的反應(yīng)速度。由上述式(1)可了解到[S]極少時，酵素反應(yīng)幾乎不進行。 還有，上述式(1)中的[S]相當(dāng)于擴增用雙鏈DNA的濃度，利用上述式(l) 算出反應(yīng)速度的酵素相當(dāng)于RNA聚合酶。
因此，在專利文獻1那樣的傳統(tǒng)方法中，通過利用PCR對擴增用雙鏈 DNA進行擴增，然后使RNA聚合酶作用于該擴增用雙鏈DNA而擴增微量 mRNA,來解決上述問題。
但是，利用上述PCR的方法中不能對短的mRNA和長的mRNA都同樣 有效率地擴增。對此參考圖1 (a)進行具體說明。圖1 (a)是例示了模板采 用具有3種長度的擴增用雙鏈DNA，并使聚合酶作用于該擴增用雙鏈DNA 的PCR。在這種PCR中，規(guī)定時間內(nèi)最長的模板會擴增1次，次長的模板會 擴增3次，最短的才莫板會擴增6次。其結(jié)果，通過上述PCR來擴增的擴增用 雙鏈DNA中短的雙鏈DNA多且長的雙鏈DNA少。使RNA聚合i^t用于這 種因序列長度而以不同量擴增的擴增用雙鏈DNA調(diào)制出mRNA，結(jié)果存在 所得到的mRNA也是短的mRNA多且長的mRNA少的缺點。
另一方面，在本發(fā)明中，在調(diào)制擴增用雙鏈DNA時，預(yù)先混合虛擬RNA 和擴增對象的mRNA。其結(jié)果，具有即使擴增對象的mRNA少的情況下也會 增加逆轉(zhuǎn)印酵素的反應(yīng)速度，可有效地合成擴增用雙鏈DNA的特征。更具體 地說，在本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法中，首先，向微量mRNA加入虛 擬RNA，從而增加全部RNA的量，顯著提高基質(zhì)濃度(米氏常數(shù)Km值)。 由于利用該基質(zhì)RNA制作擴增用雙鏈DNA，其結(jié)果制作的擴增用雙鏈DNA的量可調(diào)制為RNA聚合酶的最宜基質(zhì)濃度。其結(jié)果，即使mRNA的量少的 情況下可進行本來沒有進行的轉(zhuǎn)印反應(yīng)。
此外，本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法的由RNA聚合酶擴增mRNA的 前階段不需要使用PCR。因此，不依賴堿基序列的長度，而能夠?qū)⒍痰膍RNA 和長的mRNA同樣有效率地擴增。關(guān)于這一點借助圖1 (b)進行說明。在圖 1 (b)中示出利用RNA聚合酶來擴增RNA的工序。該圖中，模板采用具有 3種長度的擴增用雙鏈DNA,并使RNA聚合酶作用于該擴增用雙鏈DNA， 來擴增RNA。此時，在規(guī)定時間內(nèi)，最長的模板會擴增6次，次長的模板會 擴增6次，最短的模板也擴增6次。即，在本發(fā)明的mRNA的擴增方法中， 規(guī)定時間內(nèi)擴增的次數(shù)不依賴擴增用雙鏈DNA的長度。故，可將短的mRNA 和長的mRNA同樣有效率地擴增。
如上所述，本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法是根據(jù)與傳統(tǒng)mRNA的擴 增方法完全不同的原理，在不受堿基序列長度影響的情況下，而可將短的 mRNA和長的mRNA同樣有效率地擴增的劃時代的方法。以下，就本發(fā)明的 微量mRNA的擴增方法的各工序進行詳細說明。 [微量mRNA的擴增方法〗
本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法包括以下工序即可，即包括向包含微 量mRNA的溶液添加虛擬RNA制作混合溶液的第一工序；根據(jù)使用混合溶 液作為模板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)，合成反義DNA的第二工序；對合成后反義DNA 合成互補的正義DNA,形成由正義DNA和反義DNA組成的雙鏈DNA的第 三工序；在所形成的雙鏈DNA的正義DN的5，末端側(cè)連接RNA聚合酶的 啟動子序列制作擴增用雙鏈DNA的第四工序；以及通過RNA聚合酶，由擴 增用雙鏈DNA擴增RNA的第五工序。對于其它的材料、工序、條件、使用 器具等具體構(gòu)成沒有特別限定。以下對各工序進行詳細說明。
<第一工序>
上述第一工序是向包含微量mRNA的溶液添加虛擬RNA制作混合溶液 的工序。
在本說明書中"微量mRNA"的"微量"指的是由該mRNA合成擴增用 雙鏈DNA的場合，后段的第五工序中，以上述擴增用雙鏈DNA為模板進行 基于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)印反應(yīng)時導(dǎo)致轉(zhuǎn)印反應(yīng)速度極慢程度的mRNA的量。此外，可由本說明書容易理解到即使進行mRNA的量較多的基于RNA聚合 酶的轉(zhuǎn)印反應(yīng)的情況下，能夠通過使用虛擬RNA來進一步增加轉(zhuǎn)印反應(yīng)速 度。
此外，在本說明書中"虛擬RNA，，指的是通過加入到想要擴增的RNA， 至少在逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)時以及后萃爻的連接酶(ligase)反應(yīng)時，可增加成為逆轉(zhuǎn)印 酵素的基質(zhì)的RNA量及成為連接酶的基質(zhì)的RNA量的RNA。
上述mRNA可為從動物、植物或微生物等的細胞或組織等提煉的mRNA, 或者，可為合成的mRNA,并沒有特別限定。此外，微量mRNA的提煉方法 也沒有特別限定，可采用合適、公知的方法進行提煉。
虛擬RNA的序列沒有特別限定，但最好包含聚腺苷酸序列。能夠通過使 虛擬RNA具有聚腺苷酸序列，使用相同引物逆轉(zhuǎn)印mRNA和虛擬RNA。例 如，上述引物可列舉出聚核苷酸dT引物。
此外，上述聚腺苷酸序列的長度為可使聚核苷酸dT引物特異性退火 (annealing)而逆轉(zhuǎn)印的長度即可，沒有特別限定。例如，上述聚腺苷, 列可至少由18個腺苷酸(adenylic acid)組成。
更具體地說，虛擬RNA的序列優(yōu)選序列號4、序列號6或序列號16所 示的堿基序列。如上所述，能夠通過使虛擬RNA具有聚腺苷酸序列，利用包 含聚核苷酸dT序列的相同的引物同時逆轉(zhuǎn)印微量mRNA和虛擬RNA。
虛擬RNA的制作方法沒有特別限定，可采用合適且公知的方法。例如， 虛擬RNA可由結(jié)合了包含虛擬RNA的序列的雙鏈DNA的載體體現(xiàn)虛擬 RNA來制作。利用載體制作虛擬RNA的方法構(gòu)筑一次載體就無論幾次都可 制作虛擬RNA，因此具有可低價大量制作虛擬RNA的優(yōu)點。具體地說，在 合成對虛擬RNA的堿基序列進行編碼的正義鏈DNA和反義鏈DNA之后， 進行退火而形成雙鏈DNA。然后，將該雙鏈DNA結(jié)合到體現(xiàn)載體等，可通 過公知的RNA聚合酶來轉(zhuǎn)印并制作。還有，上述體現(xiàn)栽體并沒有特別限定， 只要具有RNA聚合酶的啟動子序列即可，以便可從結(jié)合的雙鏈DNA轉(zhuǎn)印 RNA。
此外，虛擬RNA也可通過公知的方法來合成并制作。通過合成來制作虛 擬RNA的方法與利用載體制作的方法相比，成本高，但具有可對虛擬RNA 進行生物素化等各式各樣的化學(xué)修飾的優(yōu)點。例如，將虛擬RNA生物素化時，該虛擬RNA可特異性結(jié)合到鏈酶親合素。即，通過生物素/鏈酶親合素法， 可從反應(yīng)混合液等中只特異性除去上述虛擬RNA。
此外，虛擬RNA最好被生物素化。由于虛擬RNA被生物素化，例如可 從反應(yīng)混合液中只特異性除去虛擬RNA。例如，在將虛擬RNA生物素化后， 能夠通過生物素/鏈酶親合素法來只特異性除去虛擬RNA。將虛擬RNA生物 素化的方法并沒有特別限定，可采用合適且公知的方法。
上述混合溶液中的虛擬RNA的濃度優(yōu)選0.5 ~ 10pg/nL。此外，上述混合 溶液中的虛擬RNA的濃度更優(yōu)選0.5 2.5ng4iL,若為lpg/nL則將更好。還 有，這些優(yōu)選的濃度范圍是在后述實施例中發(fā)明人重點研究后獨自確定的濃 度范圍。由于虛擬RNA的濃度為上述濃度，可將混合溶液中的全部RNA量 調(diào)制為毫摩(mM)程度。其結(jié)果，從混合溶液制作的擴增用雙鏈DNA的濃 度也成為毫摩(mM)程度。由于RNA聚合酶的最宜基質(zhì)濃度為毫摩(mM) 程度，其結(jié)果，能夠有效率地進行本來因擴增用雙鏈DNA的量少而難以進行 的轉(zhuǎn)印反應(yīng)。
包含上述微量mRNA和虛擬RNA的混合溶液的溶々某，只要不阻礙后段 的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)即可，沒有特別限定。例如可適當(dāng)采用用于水或Tris-HCl等 緩沖液的適合的材料。
<第二工序>
第二工序是根據(jù)使用混合溶液作為模板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)，合成反義DNA的 工序。
在圖2的步驟1中模式地示出本工序。在本工序中，如圖2的步驟1所 示，根據(jù)使用混合溶液中的微量mRNA和虛擬RNA作為模板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)， 合成上述孩i量mRNA及上述虛擬RNA的反義DNA。在本工序中所使用的逆 轉(zhuǎn)印酵素沒有特別限定，只要適當(dāng)使用公知的逆轉(zhuǎn)印酵素即可。
此外，引物只要能對微量mRNA和虛擬RNA進行退火即可，沒有特別 限定，但微量mRNA和虛擬RNA都有聚腺苷酸序列的場合，最好采用聚核 苷酸dT引物。通過聚核苷酸dT引物，可同時對雙方的RNA進行逆轉(zhuǎn)印， 其結(jié)果，能夠減少復(fù)雜操作或經(jīng)費。
<第三工序>
第三工序是對第二工序中合成的反義DNA合成互補的正義DNA，形成由正義DNA和反義DNA組成的雙鏈DNA的工序。
在圖2的步驟2中模式地示出本工序。本工序中，如圖2的步驟2所示， DNA聚合酶只要可以對反義DNA合成互補的正義DNA即可，可適當(dāng)采用 公知的DNA聚合酶。
此外，第三工序最好包括這樣的步驟，即，作為DNA聚合酶合成正義
DNA的前階段，通過RNase,將上述第二工序中合成反義DNA時作為模板
使用的微量mRNA和虛擬RNA分解的步驟。上述RNase只要能分解微量
mRNA和虛擬RNA即可，沒有特別限定。例如，上述RNase可采用RNase II。 <第四工序>
第四工序是在由第三工序中形成的雙鏈DNA的正義DNA的5，末端側(cè) 連接RNA聚合酶的啟動子序列而制作擴增用雙鏈DNA的工序。
上述第四工序只要是其結(jié)果為僅在第三工序中形成的雙鏈DNA的正義 DNA的5，末端側(cè)連接RNA聚合酶的啟動子序列的工序即可，其方法沒有 特別限定。
例如，上述第四工序最好包括在第三工序中形成的雙鏈DNA的兩末端連 接包含RNA聚合酶的啟動子序列的擴增適配器(asapter)之后僅切斷連接在 雙鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)的擴增適配器的第六工序。僅切斷連接 在雙鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)的擴增適配器的方法，沒有特別限定， 但最好使用限制酵素進行切斷。在利用限制酵素進行切斷的場合，最好在雙 鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)形成限制酵素位點，以便在第三工序中形 成的雙鏈DNA的兩末端連接了啟動子序列時，能夠只切斷連接在雙鏈DNA 的正義DNA的3，末端側(cè)的啟動子序列。此時上述限制酵素只要不在雙鏈 DNA的正義DNA的5，末端側(cè)即可，沒有特別限定。此外，上述限制酵素 位點最好結(jié)合到聚核苷酸dT引物內(nèi)。
在圖2的步驟3中模式地示出本工序。在步驟3中，首先，在步驟2中
器。此時，僅在上述雙鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)連接了擴增適配器 時，制作聚核苷酸dT引物，以便在該3，末端側(cè)形成NotI位點。因而，如果 由NotI處理連接擴增適配器后的雙鏈DNA，就能只切斷連接在上述雙鏈DNA 的正義DNA的3，末端側(cè)的擴增適配器。此外，也可只切斷連接在上述雙鏈
13DNA的5，末端側(cè)的擴增適配器。如此，通過切斷連^t妄的一方擴增適配器， 可有選擇地只擴增正義RNA或反義RNA。
此外，上述第四工序最好包含除去切斷的擴增適配器及虛擬RNA的第七 工序。在第七工序中，通過除去切斷的擴增適配器及虛擬RNA，不會在后段 的第五工序中通過RNA聚合酶擴增RNA時出現(xiàn)切斷的擴增適配器及虛擬 RNA上結(jié)合RNA聚合酶的情況，可使RNA聚合酶只與連接在上述雙鏈DNA 的正義DNA的5，末端側(cè)的擴增適配器結(jié)合。因而，不4又可有效率地轉(zhuǎn)印微: 量mRNA和虛擬RNA，可減少容易在微量mRNA的擴增工序中發(fā)生的各式 各樣的干擾(noise)。
上述第七工序只要能除去切斷的擴增適配器及虛擬RNA即可，沒有特別 限定。例如，上述第七工序可采用使用凝膠(gel)過濾柱的尺寸分度法。此 外，上述凝膠過濾柱沒有特別限定，根據(jù)所要分度的尺寸采用適當(dāng)公知的柱 即可。若采用使用上述凝膠過濾柱的尺寸分度法，可同時除去切斷的擴增適 配器及虛擬RNA這雙方。此外，在虛擬RNA^皮生物素化的情況下，上述第 七工序可包括基于生物素/鏈酶親合素法等的虛擬RNA除去工序。眾所周知 生物素對鏈酶親合素特異性結(jié)合。因而，如果使反應(yīng)溶液通過鏈酶親合素柱 等，就可特異性地除去被生物素化的虛擬RNA。
在上述擴增適齒己器中包含RNA聚合酶的啟動子序列。上述啟動子序列只 要是結(jié)合RNA聚合酶，并能轉(zhuǎn)印位于該啟動子序列下游的堿基序列即可，沒 有特別限定。例如上述啟動子序列可列舉出包含T7啟動子序列、T3啟動子 序列或SP6啟動子序列的g序列，但并不限定于此。若例示上述各啟動子 序列的具體堿基序列，則可如下
T7啟動子序列5， - TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3，(序列 號l);
T3啟動子序列5， - AATTAACCCTCACTAAAGGG - 3，(序列號2); SP6啟動子序列5， -ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3，(序列 號3)。
將上述啟動子序列連接于雙鏈DNA的場合，優(yōu)選使包含上述啟動子序列 的序列和該序列的互補鏈DNA退火而形成擴增適配器后，使該擴增適配器連 接于雙鏈DNA。還有，上述啟動子序列和該啟動子序列的互補DNA鏈的制作方法沒有特別限定，可采用公知的方法合成。
此外，將上述擴增適配器連接于雙鏈DNA的場合，最好采用DNA連接 酶來連接。上述DNA連接酶只要能夠?qū)U增適配器連接于雙鏈DNA即可，
沒有特別限定。 <第五工序>
第五工序是通過RNA聚合酶，由擴增用雙鏈DNA擴增RNA的工序。 如圖2的步驟4所示，第五工序是利用上述第四工序中形成的擴增用雙 鏈DNA和RNA聚合酶擴增微量mRNA和虛擬RNA的工序。上述RNA聚 合酶只要是與在擴增用雙鏈DNA連接的擴增適配器中的啟動子序列結(jié)合，并 能夠由位于該啟動子序列下游的DNA轉(zhuǎn)印RNA即可，就沒有特別限定。例 如上述RNA聚合酶最好是T7聚合酶、T3聚合酶或SP6聚合酶。還有，上述 啟動子序列最好采用可通過各RNA聚合酶受轉(zhuǎn)印控制的啟動子序列。 [cDNA文庫的制作方法]
本發(fā)明的DNA文庫的制作方法只要一個工序包含本發(fā)明的微量mRNA 的擴增方法即可，對于其它的材料、工序、條件、使用器具等的具體構(gòu)成沒 有特別限定。
具體地說，本發(fā)明的cDNA文庫的制作方法最好包括這樣的工序，即由 本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法獲得的擴增的mRNA制作雙鏈DNA，然后， 將該雙鏈DNA導(dǎo)入到栽體的工序。其作成方法也沒有特別限定，可適當(dāng)采用 公知的方法制作(例如參照"生物人工系列(六4才7-工7V")卩一X)2 基因文庫的作成法"，(野島博編)羊土社，1994或"基礎(chǔ)生化學(xué)實驗 法，，(大島泰郎編)第四巻、核酸/基因?qū)嶒?1、東京化學(xué)同人，2000)。
在圖4中模式地示出本發(fā)明的一例cDNA文庫的制作方法。還有，本發(fā) 明顯然不限于以下說明。
圖5的步驟1是根據(jù)使用本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法的第五工序中 擴增的mRNA作為才莫板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)，合成反義DNA的步驟。該方法跟隨 本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法的第二工序，亦可。還有，在上述第五工序 中擴增的mRNA中包含擴增的微量mRNA和擴增的虛擬RNA。
圖5的步驟2是對上述步驟1中合成的反義DNA合成互補的正義DNA, 形成由正義DNA和反義DNA組成的雙鏈DNA的步驟。該方法按照本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法的第三工序進行，亦可。
義DNA5，末端側(cè)連接連接適配器的步驟。上述DNA連接酶只要能將連接適 配器連接到雙鏈DNA的兩末端側(cè)即可，沒有特別限定。
此外，上述連接適配器只要能連接到雙鏈DNA的兩末端側(cè)即可，沒有特 別限定。上述聚核苷酸dT引物的堿基序列最好在連接適配器連接在雙鏈DNA 的兩末端側(cè)的場合，可通過限制酵素僅切斷一方連接適配器。上述限制酵素 沒有特別限定。例如，圖5的步驟3中例示了上述限制酵素為Notl的場合。 此外，上述連接適配器最好制作成沒有連接到雙鏈DNA的一側(cè)為限制酵素位 點。上述限制酵素位點沒有特別限定。例如，在圖5的步驟3中例示了上述 限制酵素位點為BgIII位點的場合。其結(jié)杲，在步驟3中由Notl處理后的雙 鏈DNA的兩末端側(cè)存在BgIII位點及NotI位點，因此能夠容易結(jié)合到載體中。
在上述步驟3之后，為了除去切斷的連接適配器和擴增的虛擬RNA,最 好包含步驟4。步驟4只要能除去切斷的連接適配器和擴增的虛擬RNA即可， 沒有特別限定。例如，步驟4可采用使用凝膠過濾柱的尺寸分度法。還有， 不受上述凝膠過濾柱的限定，而根據(jù)想要分度的尺寸采用適當(dāng)公知的柱也可。 此外，上述步驟4最好進行多次。通過將步驟4進行多次，可有效率地除去 切斷的連接適配器和擴增的虛擬RNA。
使用DNA連接酶，將經(jīng)過上述步驟1 ~ 4提煉的雙鏈DNA結(jié)合到載體， 從而能夠制作cDNA文庫。上述載體沒有特別限定，可采用適當(dāng)公知的載體。 例如，可采用質(zhì)粒載體(plasmid vector)、粘粒載體(cosmid)或噬菌體載 體(phage vector)等公知栽體。 [探針的制作方法]
本發(fā)明的探針的制作方法只要一個工序包含本發(fā)明的微量mRNA的擴增 方法即可，對于其它的材料、工序、條件、使用器具等具體構(gòu)成沒有特別限 定。
具體地說，本發(fā)明的探針的制作方法是使用根據(jù)本發(fā)明的微量mRNA的 擴增方法擴增的mRNA，來制作探針的方法。本說明書中"探針"指的是RNA 探針及DNA探針。'由mRNA制作RNA探針或DNA探針的方法沒有特別限 定，可根據(jù)適當(dāng)公知的方法(例如參照"生物人工系列(,《4才7--了》、〉l)一;C) 2基因文庫的作成法"，(野島博編)羊土社，1994或"基 礎(chǔ)生化學(xué)實驗法，，(大島泰郎編)第四巻、核紛基因?qū)嶒濱I、東京化學(xué)同 人，2000)來制作。
本發(fā)明的探針的制作方法例如可制作cDNA微陣列(Microarray)用的探針。liL的10x第二鏈緩 沖液、7.5pL的O.IMDTT、以及3pL的第二鏈核苷混合物。然后，加入冰冷 卻后水，《吏全量成為200pL。10) 還將上述溶液在冰中進行5分鐘的保冷。11) 向上述溶液加入1.5pL (2單元)的RNnase H (夕力，乂《4才社制) 和10pL (50單元)的E.coliDNA聚合酶I (夕力，乂《4才社制)。12) 使上述溶液在16。C中反應(yīng)150分鐘。13 )對于上述溶液加入200nL的苯酚/三氯甲烷溶液并均勻攪拌后，進行 了離心分離(15,000rpm， 3min， 4°C )。將上清液移至新的管中進行乙醇沉 淀(在-80°C中進行10分鐘以上)后，用70°/。乙醇清洗沉淀物。14 )向上述沉淀物加入10pL的10 x T4 DNA聚合酶緩沖液、5pL的2.5mM dNTP混合物以及水，使全量成為100^iL。向該溶液加入3.5pL(大致5單元) 的T4DNA聚合酶，使之在37。C中反應(yīng)30分鐘。接著，加入lOOfiL的苯酚/ 三氯曱烷溶液進行攪拌后，進行了離心分離。然后，將上清液移至新的管中 進行乙醇沉淀(在-80。C中進行10分鐘以上)后，用70%乙醇清洗了沉淀物。 通過該工序得到平滑末端化的雙鏈DNA。15 )向上述平滑末端化的雙鏈DNA (沉淀物)加入2pL的10 x連接酶 緩沖液、2pL的lOmMrATP及兩種適配器(全量lpL, 0.35嗎)，然后，加 水使全量成為20pL。還有，上述適配器的一方是由具有連接多個以下序列號 12所示的Bamffl(Bgin) - Smal斷片的序列的雙鏈DNA構(gòu)成的適配器。此 外，上述適配器的另一方是由具有連接多個以下序列號13所示的Smal斷片 的序列的雙鏈DNA構(gòu)成的適配器。BamHI(Bgm) -Smal斷片5， — GATCCCCGGG-3，(序列號12) Smal斷片 5， -CCCGGG-3，(序列號13)還有，該適配多的制作方法是按照由上述的正義T7和反義T7構(gòu)成的擴 增適配器的制作方法來進行的。16) 向上述溶液加入1.5pL (大致4單元)的T4 DNA連接酶后，使之 在8。C中反應(yīng)一晚。17) 對于上述溶液在70。C進行30分鐘的加熱處理，從而使連接酶失去 活性。接著，進行5秒的離心分離提煉出上清。18 )向上述溶液加擴27jliL的Notl緩沖液添加劑及3jiL的Notl，使之在 37°C中反應(yīng)90分鐘。在反應(yīng)后，加入5pL的10 x STE及2jig的tRNA。然后， 使用CHROMA SPIN-400,根據(jù)上述的方法，除去殘留的虛擬RNA等。還 有，除去了虛擬RNA等之后的雙鏈DNA以沉淀物的方式通過乙醇沉淀來回 收。19) 向上述沉淀物加入3pL的10x連接酶緩沖液、3nL的10mMrATP、 及l(fā)pL ( 100ng ~ 300ng)的pAP3neo栽體(由Notl及BgIII來完成切斷)。 然后，加水^^全量成為30nL。20) 向上述溶、^口入1pL (4單元)的T4DNA連接酶后，在12。C中反 應(yīng)了一晚反應(yīng)。20 )將上述溶液在70。C中加熱30分鐘。21) 在加熱后，向上述溶^i口入70pL的TE、以及加擴100nL的苯酚/ 三氯甲烷溶液并進行攪拌后，進行了 l分鐘的離心分離(15000rpm)。在離 心分離后，回收了 100nL的上清。利用過慮器(；卩求7社制UFCP3TK50), 并使上述上清無菌化。22) 借助電穿孔(dectroporation)法，將上述無菌化的溶液(5pL )導(dǎo) 入大腸菌(GIBCO.-BRL社制的ElectroMAXDHI2S Cells)。還有，電穿孔 法以2.5kv、 129歐姆的條件下進行。在SOC培養(yǎng)基中施加電壓后的大腸菌， 在37。C且培養(yǎng)1小時。23 )將上述大腸菌移至lOOmL的LB培養(yǎng)基(包含50mg/L濃度的氨節(jié) 青霉素(ampicillin))。將lOpL或100piL的含有大腸菌的LB培養(yǎng)基，巻 到分別含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)上，并在37'C中培養(yǎng)一 夜，算出大腸菌的形質(zhì)轉(zhuǎn)換效率。此外，殘留的大腸菌含有LB培養(yǎng)基直到 達到OD6oo-1.0為止在37。C中培養(yǎng)數(shù)小時。在培養(yǎng)后，向大腸菌含有LB培 養(yǎng)基加入DMSO，將該溶液在-80。C中凍結(jié)保存。還有，關(guān)于文年的制作，可參考通常的cDNA文庫制作協(xié)議(例如參照"生物人工系列("？才7--7凡-:> 卩一x) 2基因文庫的作成法，，，(野島博編)羊土社，1994或"J^出生化學(xué)實驗法"(大島泰郎編)第四巻、核^/基因?qū)嶒瀗、東京化學(xué)同人，2000)而制作。還有，關(guān)于結(jié)果在后，根據(jù)〔結(jié)果3〕進行說明?！步Y(jié)果1〕在圖6 (a)及圖6 (b)示出虛擬RNA的最佳量的研討結(jié)果。還有，在 本實施例中，關(guān)于虛擬RNA的研討效果，以GAPDH的cDNA化的效率為指 標。但是，GAPDH只是一例指標，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，能夠容易理解 虛擬RNA對于其它基因的cDNA化也具有與GAPDH同樣的效果。如圖6 (a)及圖6 (b)所示，能夠確認對想要文庫化的大致lng的微量 mRNA (大概源自100個細胞)加入0.5、 1.0、 2.5、 5.0或lO.Opg的虛擬RNA 的場合，cDNA都比沒有加入虛擬RNA的場合有效率地合成。此外，如圖6.U)及圖6 (b)所示，在向樣t量mRNA加入了虛擬RNA 的場合，可最有效率地合成cDNA。 〔結(jié)果2〕在圖7 (a)、圖7 (b)及圖7 (c)中示出研討可擴增的微量mRNA量 的電泳圖。如圖7 (a)及圖7 (b)所示，能夠確認無論在微量mRNA (源自293T 細胞)的量大致為O.lng，還是微量mRNA的量大致為O.Olng,都有效率地 合成cDNA。此外，如圖7 (c)所示，能夠確認即使源自Hela細胞的微量mRNA (O.Olng),也有效率地合成cDNA。 〔結(jié)果3〕在圖8中示出cDNA文庫的片段長度的分布。還有，在上述實施例中， 得到6.6x I05cfii的群體。對于該群體研討片段的插入率的結(jié)果為38.8% (23 庫侖/60庫侖)。此外，在23庫侖之中，插入的人的基因為15庫侖，在該 15庫侖中，只有2庫侖插入了相同的基因(表1的抽樣3)。如圖7所示，可確認在本發(fā)明的方法中制作的cDNA文庫被插入較長的 片段。還有，上述片段的平均長為0.75kb。此外，在表l示出讀出cDNA文庫的片段的序列的結(jié)果。Accession*_基因名
麗-021103 hymosin beta 10 (TMSB10) 畫—021104 rjbosomal protein L41 (RPL41)
NM— 170784 MeKusick - Ksufman syndrome (MKKS ) , transcript variant 2 NM-00薩 ribosomal protein S5 (RPS5)
DC007845 lysosomal — associated membrane protein 1 mRNA (cDNA clone MAGE: 4128923 ) NM一001042465 prosaposin (variant Gaucher disease and variant metachromatic leukodystrophy)
(PSAP)
麗一079423
雨-002291
Nm —007173
NM-032937
麗-.003757
麗一.002018
固-.003589
畫- 018462
而且，比較了由本發(fā)明的方法制作的cDNA文庫的品質(zhì)和利用從100萬 個293T細胞抽取的mRNA通過傳統(tǒng)方法(Kobori M ct al., Genes Cells, 1998; 3: 459 - 475 )來制作的cDNA文庫的品質(zhì)。
具體地說，對于任意選擇的28基因，利用PCT法研討該基因是否屬于上 述文庫進行研究。
表2是利用本發(fā)明的方法來制作的cDNA文庫以及通過傳統(tǒng)方法來制作 的cDNA文庫這兩方所包含的基因。 表2
Accession#_碁因名_
XM—165877 oxogliitarate (alpha - ketoglutarate) dehydrogenase (lipoamide) (OGDH)
NM — 023018 NAD kinase (NADK)
CR598431 GRB2 - related adaptor protein 2 (GRAP2)
NM — 005238v - ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian) (ETS1) 麗—004383c - sre tyrosine kinase (CSK)
NM — 016263fizzylceli division cycle 20 related 1 (Drosophila) (FZR1 ) AF02908214-3-3 sigma U20972 14-3-3 ensiron
NM一002350 v - yes - 1 Yamaguchi s肌oina viral related oneogene homolog (LYN) NM—001030 ribosomal protein S27 (meta liopanstimolin 1) (RPS27)NM一001157 NM—0010I6 畫_021149 畫一001006 畫—004707 NM一003794 NM—OO翻 BC016148 NM—005534 雨—004396 (DDX5) 雨—007104 麗—012433 畫—005737 雨一014338 畫016505
annexin AU (ANXA11) ribosomal protein S12 (RPS12) coactosin - like 1 (Dictyostelium) (COTL1) ribosomal protein S3A (RPS3A ) APG12 autophagy 12 like (S.corevisiae) (APG12L) sorting nexin 4 ( SNX4) ribosomal protein, large, pi (RPLP1) integral membrane protein 2B (ITM2B )
interfcrun gsmmu receptor 2 (interferon gamma transducer 1) (IFNGR2) DEAD/H (Asp - Glu - Aia - Asp/His) box polypeptide 5 (RNA helicase, 68kDa)
ribosomal protein L10a (RPL10A) splicing factor 3b, subunil 1 ， 155kDa ( SF3B1) ADP - ribosylation factor - like 4C (ARL4C) phosphutidylserine dcearboxylasc (PLSD) putative SI RNA binding domain protein (PS1D)
如表2所示，28基因中的25基因包含在兩方文庫。
此外表3中示出僅存在用傳統(tǒng)方法來制作的cDNA文庫的基因。
表3
Accession^ description_
AL117596 cDNA DKFZp564C2163
XM—371848 chromosome 6 open reading frame 115 (C6orfl 15) NM一004798 kinesin family member 3B (KIF3B )
由表1 ~表3可明顯確認按照本發(fā)明的方法制作的CDNA文庫中插入了多
樣性富余的片段。此外，可確認根據(jù)本發(fā)明的方法制作的cDNA文庫中還插
入了細胞內(nèi)體現(xiàn)量低的基因。
即，根據(jù)本發(fā)明的方法制作的文庫具有不遜色于利用多量的mRNA制作 的文庫的復(fù)雜度、梯入效率及平均鏈長。 〔結(jié)果4〕
關(guān)于通過虛擬RNA來擴增的cDNA組合(pool)的尺寸偏移以及mRNA 擴增效率的上升效果，采用可進行微量mRNA的正確分析的安捷倫(Agilent) 社制的Bioanalyzer2100進行了評價。
具體地說，利用虛擬RNA進行第一次mRNA的擴增，然后，通過PCR 法來確認了 GAPDH的擴增。又，利用擴增的mRNA和虛擬RNA,進行第二
29次mRNA的擴增，然后，調(diào)查虛擬RNA的mRNA的擴增效果。
首先根據(jù)上述的協(xié)議制作擴增用雙鏈DNA后，利用熒光色素(Cy5)進 行了標識(label)化cRNA的擴增。然后，用電泳圖語(electroferrogram) (疊加)來表示實驗結(jié)果。
其結(jié)果，如圖9(a)所示，可觀察到利用虛擬RNA進行擴增的cRNA與 沒有加入虛擬RNA的擴增相比，其擴增上升到6倍以上。為了避免偶然情況， 即使采用其它熒光.色素(Cy3)進行同樣的實驗的情況下，也確認采用虛擬 RNA的場合(藍線)中具有30倍以上的擴增效果(參照圖9(b))。
綠線表示RNA指針的峰，可知加入虛擬RNA的兩條藍線與沒有加入虛 擬RNA的相比，在4kb以上的范圍內(nèi)有效率地轉(zhuǎn)印擴增。該結(jié)果表示因添加 虛擬RNA而針對少數(shù)mRNA的基于逆轉(zhuǎn)印酵素的cDNA化和基于T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)印擴增中的酵素反應(yīng)，對mRNA沒有偏重而廣泛進行。這一點表 示采用虛擬RNA的技術(shù)比無法避免擴增偏重的PCR法優(yōu)越。 〔結(jié)果5〕
關(guān)于利用虛擬RNA制作的納米cDNA文庫的mRNA的種類，為了調(diào)查 是否包含使擴增有偏重的基因，利用安捷倫(Agilent)社的cDNA微陣列(2 色法，Dyeswap法)進行了 '瞼證。
具體地說，將利用虛擬RNA從相當(dāng)于10個HcLa細胞的極微量RNA擴 增的納米cDNA文庫(+dRNA)和采用源于100萬個左右HcLa細胞的大量 mRNA并根據(jù)傳統(tǒng)方法制作的cDNA文庫(+dRNA)進行比較。
首先，利用源自兩方cDNA文庫的質(zhì)粒DNA,由T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)印 mRNA，然后利用RNase自由基(free)的DNase對上述mRNA進行了處理。
以上述mRNA為試料，根據(jù)上述的協(xié)議制作擴增用雙鏈DNA后，利用 熒光色素(Cy5)進行了標識化cRNA的擴增。分別測定RNA濃度的結(jié)果， 納米cDNA文庫為0.06mg/ml、通常的納米cDNA文庫為0.53mg/ml。此外利 用Bioanalyzer2100評價它們的的尺寸分布的結(jié)果，顯示無論在Cy5標識(參 照圖10 (a))的情況下還是在Cy3標識(參照圖10 (b))的情況下，其獲 取率和尺寸分布都大致相同。
接著，以這些標識RNA為探針，利用承栽44,000個cDNA的cDNA微 陣列(Agilent社制的"agilent HuMK")進行了熒光色素交換實驗(DyeSwap )。還有，該焚光色素交換實驗的實驗結(jié)杲是通過(-dRNA/Cy3: +dRNA/Cy5) / ( +dRNA/Cy3: - dRNA/Cy3 )來求出。具體地說，1塊陣列上，使由Cy3 及Cy5分別標識的兩種抽樣以竟?fàn)幏绞诫s交，求出實驗結(jié)果。
圖13中示出熒光色素交換實驗的結(jié)果。還有，圖13中以中央?yún)^(qū)域的黑色 來表示具有相同熒光強度的基因群，以上側(cè)濃的灰色表示加入虛擬RNA (dRNA)的場合增加雜交強度的基因群，以下側(cè)淺的灰色表示通過加入虛擬 RNA來減少雜交強度的基因群。
W針比較已雜交的cDNA的強度分布的結(jié)果，兩者中僅僅數(shù)個基因不 同以外，圖案大致一致。這啟示兩者具有cDNA文庫的品質(zhì)大致相同的cDNA 種分子。即，越來越明顯利用虛擬RNA，以相當(dāng)于10個HcLa細胞的極孩t量 的RNA為出發(fā)點制作的納米cDNA文庫為高品質(zhì)。 〔結(jié)果6〕
上述的例子研討了從細胞提煉的mRNA，即對包含各式各樣種類的mRNA 的mRNA混合物進行擴增的情況。因此，研究了對一種mRNA，本發(fā)明的方 法是否也能有效率地進行擴增。
作為一種mRNA，采用了人體GAPDH的mRNA。人體GAPDH的mRNA 是通過使用下述的GAPDH S引物及GAPDH AS引物的PCR法來從HeLa cDNA文庫中無性生殖的。
GAPDH S: 5， — ACAGTCAGCCGCATCTTCTT - 3，(序列號14) GAPDHAS: 5' -
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGAGCACAGGGTA
CTTTATTG - 3，(序列號15 )
抽M目當(dāng)于人體GAPDH的DNA斷片(大致1300bp)后，利用TA-無 性生殖法，將該DNA斷片插入pT7Blue載體(invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)。
通過BamlII處理來使所獲得的栽體成為串鏈狀之后提煉。在提煉后，用 MEG Ascript (Amt)ion社制)轉(zhuǎn)印了 RNA (在37°C中4小時)。然后，加入 TURBODNA-free (Ambion社制)，在37。C中處理1小時。然后，提煉出 轉(zhuǎn)印的RNA。
利用上i4A體GAPDH的mRNA，根據(jù)上述的〔3:雙鏈DNA的制作〕~
31〔6:擴增用雙鏈DNA的制作〕制作了擴增用雙鏈DNA。還有，在本實施例 中使用的人體GAPDH的mRNA的量為4.9、 0.49、 0.049或0.0(H9fg。此外， 在本實施例中使用的虛擬RNA是序列號6所示的虛擬RNA。
如圖11所示，只要是本實施例的方法，也能對0.49 fg/mL這種微量濃度 的mRNA進行擴增。還有，在圖11中采用PCR法來確認人體GAPDH的 mRNA的擴增，此時PCR法的擴增次數(shù)為40次。 〔結(jié)果7〕
根據(jù)上述的〔3:雙鏈DNA的制作〕~ 〔6:擴增用雙鏈DNA的制作〕， 使用lng的序列號16所示的虛擬RNA,對從10個293T細胞提煉的mRNA (大致0.1ng)進行了擴增。以下示出虛擬RNA的M序列。還有，在圖12 中由"NotI-dRNA"表示虛擬RNA。
虛擬RNA: 5， -
AATCTGTCGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA - 3,(序 列號16)
如圖12所示，依據(jù)本實施例的方法，即使使用具有不同序列的虛擬RNA 的場合，也能對mRNA進行擴增。還有，在圖12中，利用PCR法確認人體 GAPDH的mRNA的擴增，此時PCR法的擴增次數(shù)為40次。
此外本發(fā)明并不限定于以上所說的各構(gòu)成，可在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進行各 種變更，通過適當(dāng)組合不同實施方式或?qū)嵤├髯怨_的技術(shù)方案獲得的 實施方式或?qū)嵤├?，也被本發(fā)明的技術(shù)范圍所涵蓋。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法包括向包含微量mRNA的溶液添加虛 擬RNA制作混合溶液的第一工序；根據(jù)使用混合溶液作為模板的逆轉(zhuǎn)印反 應(yīng)，合成反義DNA的第二工序；對合成后的反義DNA合成互補的正義DNA， 形成由正義DNA和反義DNA組成的雙鏈DNA的第三工序；在所形成的雙 鏈DNA的正義DNA的5，末端側(cè)連接RNA聚合酶的啟動子序列制作擴增用 雙鏈DNA的第四工序；以及通過RNA聚合酶，由擴增用雙鏈DNA擴增RNA 的第五工序。
依據(jù)上述方法，在擴增雙鏈DNA時不使用PCR,因此起到不受擴增的微量mRNA的堿基序列長度的影響，而能夠?qū)Χ痰膍RNA和長的mRNA都同 樣有效率地擴增的效果。故，能夠用于cDNA文庫、探針的制作或階段性減 影的實施等情形。
如上所述，本發(fā)明中使微量mRNA與虛擬RNA—起擴增，因此可有效率 地擴增微量mRNA，且擴增的mRNA上沒有偏重。因此，本發(fā)明不僅能夠用 于RT - PCR、 cDNA微陣列、cDNA文庫的制作、mRNA的擴增(例如，SPIA 等)、采用mRNA的標識探針的制作、以及階段性減影，而且可廣泛用于需 要微量mRNA的擴增工序的領(lǐng)域。
此夕卜?，F(xiàn)在的研究趨勢已進入了以1個細胞到數(shù)個細胞為對象的納米級的 分析，只要能夠從極少量的mRNA有效率地合成cDNA，就能得到對應(yīng)的詳 細數(shù)據(jù)。由于本發(fā)明可以只采取少數(shù)細胞，可用于基因水平的分析較遲的干 細胞研究或采用患者患部組織的病因分析中。此外，通過結(jié)合本發(fā)明和多臺 階減法，可進行由1個細胞特異地體現(xiàn)的基因的總括地單離。
權(quán)利要求
1. 一種微量mRNA的擴增方法，其特征在于包括向包含微量mRNA的溶液添加虛擬RNA制作混合溶液的第一工序；根據(jù)使用混合溶液作為模板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)，合成反義DNA的第二工序；對合成后的反義DNA合成互補的正義DNA，形成由正義DNA和反義DNA組成的雙鏈DNA的第三工序；在所形成的雙鏈DNA的正義DNA的5’末端側(cè)連接RNA聚合酶的啟動子序列制作擴增用雙鏈DNA的第四工序；以及通過RNA聚合酶，由擴增用雙鏈DNA擴增RNA的第五工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的微量mRNA的擴增方法，其特征在于所述第 四工序包含在由第三工序中形成的雙鏈DNA的兩末端側(cè)連接啟動子序列， 再只切斷連接在雙鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)的啟動子序列的第六工 序。
3. 如權(quán)利要求2所述的微量mRNA的擴增方法，其特征在于所述第 四工序中在雙鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)形成限制酵素位點，以在由 第三工序中形成的雙鏈DNA的兩末端連接了啟動子序列時，能夠只切斷連 接在雙鏈DNA的正義DNA的3，末端側(cè)的啟動子序列。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的微量mRNA的擴增方法，其特征在于所 述第四工序包含除去切斷的啟動子序列及虛擬RNA的第七工序。
5. 如權(quán)利要求1 ~ 4中任一項所述的微量mRNA的擴增方法，其特征 在于所述虛擬RNA的序列包含聚腺苷酸序列。
6. 如權(quán)利要求1 ~ 5中任一項所述的微量mRNA的擴增方法，其特征 在于所述虛擬RNA的序列是由序列號4、序列號6或序列號16所表示的 堿基序列。
7. 如權(quán)利要求1 ~6中任一項所述的微量mRNA的擴增方法，其特征 在于所述虛擬RNA被生物素化。
8. 如權(quán)利要求1 ~ 7中任一項所述的微量mRNA的擴增方法，其特征 在于所述RNA聚合酶是T7聚合酶、T3聚合酶或SP6聚合酶。
9. 如權(quán)利要求1 ~ 8中任一項所述的微量mRNA的擴增方法，其特征在于所述混合溶液中的所述虛擬RNA的濃度為0.5 ~ 10(ig4iL。
10. —種cDNA文庫的制作方法，其特征在于該制作方法的一個工序 包含權(quán)利要求1 ~ 9中任一項所述的微量mRNA的擴增方法。
11. 一種探針的制作方法，其特征在于該制作方法的一個工序包含權(quán) 利要求1 ~ 9中任一項所述的微量mRNA的擴增方法。
12. —種階段性減影方法，其特征在于該階^:性減影方法的一個工序 包含權(quán)利要求1 ~ 9中任一項所述的微量mRNA的擴增方法。
全文摘要
本發(fā)明為了提供不受堿基序列長度的影響而不論是短的mRNA還是長的mRNA都可同樣有效率地擴增的微量mRNA的擴增方法及其應(yīng)用方法，本發(fā)明的微量mRNA的擴增方法包括向包含微量mRNA的溶液添加虛擬RNA制作混合溶液的第一工序；根據(jù)使用混合溶液作為模板的逆轉(zhuǎn)印反應(yīng)，合成反義DNA的第二工序；對合成后的反義DNA合成互補的正義DNA，形成由正義DNA和反義DNA組成的雙鏈DNA的第三工序；在所形成的雙鏈DNA的正義DNA的5’末端側(cè)連接RNA聚合酶的啟動子序列制作擴增用雙鏈DNA的第四工序；以及通過RNA聚合酶，由擴增用雙鏈DNA擴增RNA的第五工序。
文檔編號C12N15/00GK101535475SQ20078003339
公開日2009年9月16日 申請日期2007年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月11日
發(fā)明者東岸任弘, 奧崎大介, 野島博 申請人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué)