專利名稱：：蛋白、編碼該蛋白的核酸和相關(guān)的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多肽、編碼該多肽的核酸、免疫特異性結(jié)合該多肽的才元體以及相關(guān)的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：響應(yīng)外部損傷和內(nèi)部退化，機(jī)體的細(xì)胞必須修復(fù)包圍每一單個(gè)細(xì)胞的膜，以維持其有機(jī)體的功能和健康。細(xì)胞修復(fù)外膜能力的缺陷與多種疾病和病理疾患相關(guān)，例如;f申經(jīng)退^f亍性疾病(3口巾白金才絮病)、心臟病發(fā)作、心臟衰竭、月幾肉萎縮癥、褥療、沖唐尿病性潰瘍、氧化性損傷和組織損傷，如由于給予化療藥物的副作用而產(chǎn)生的鼻竇炎。此外，與多種疾病相關(guān)的"幾無(wú)力和萎縮，以及正常的衰老過(guò)程也與膜修復(fù)改變相關(guān)。為了在急性損傷時(shí)修復(fù)其膜，這些細(xì)胞利用4立于細(xì)月包內(nèi)吾M爾為嚢泡的小膜袋(smallpacketofmembrane)。這些嚢泡通常位于細(xì)胞內(nèi)部，但細(xì)胞膜損傷時(shí)，這些嚢泡移至損傷部位形成補(bǔ)片(patch)而維持細(xì)月包完整性。如果沒(méi)有這項(xiàng)必要功能，細(xì)胞可能死亡，而該細(xì)胞損傷的累積效應(yīng)可能最終可1起組織或器官的功能障礙。很多公司對(duì)改善多種組織再生能力的方法感興趣。例如，預(yù)期到2009年4又創(chuàng)傷-修復(fù)市場(chǎng)就將超過(guò)110億美元。因此，對(duì)用于治療與急性和'ft性細(xì)胞和組織損傷相關(guān)疾患的細(xì)胞膜〗奮復(fù)過(guò)程的藥物調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)存在持續(xù)的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及與細(xì)胞膜損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白的驚人的意外發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明總體上涉及核酸，并包括由本發(fā)明的核酸編碼的多肽。更具體地，本發(fā)明涉及例如核酸的組合物，用于抑制靶核酸轉(zhuǎn)錄或翻"^;編碼胞質(zhì)、核、膜結(jié)合多肽以及分泌型多肽的核酸；以及載體、宿主細(xì)胞、抗體、重組蛋白、假肽、融合蛋白、化合物以及用于生成這些物質(zhì)的方法。在某些方面，本發(fā)明還涉及作為疾患和病癥的治療和預(yù)防的療法非常有用的組合物。本發(fā)明的治療性組合物包括核酸，包括干擾性核酸，和編碼對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1(本文中，"MG53")蛋白的多肽的核酸、MG53多肽、其同系物及其部分、MG53^f叚肽、MG53肽類4以物和MG534以肽；以及能夠調(diào)節(jié)MG53活〗生或涉及MG53的分子間相互作用的化合物，以及例如小窩蛋白-3(SEQIDNO.8)。如本文中所述，MG53介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞膜損傷的修復(fù)，因此，靶向和調(diào)節(jié)MG53基因表達(dá)、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用，成為纟且織l奮復(fù)的新型治療性干預(yù)。在某些其他方面，本發(fā)明涉及與組織損傷相關(guān)的組合物和方法。在某些示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明包括例如給予有效量的本發(fā)明的治療組合物，用于促進(jìn)傷口愈合；用于緩解手術(shù)創(chuàng)傷，用于治療和/或預(yù)防組織修復(fù)中作為衰老過(guò)程固有副作用而發(fā)生的年齡相關(guān)的缺陷；用于治療和/或預(yù)防任何類型肌組織的損傷，如患心血管疾病和/或運(yùn)動(dòng)相關(guān)損傷的個(gè)體中發(fā)生的損傷；以及由于化妝或個(gè)人護(hù)理應(yīng)用所致的才幾體組織的^,復(fù)和再生。此夕卜，本發(fā)明涉及核酸，包括干擾性核酸，以及編碼MG53相互作用蛋白的多肽，如小窩蛋白-3(SEQIDNO.8)多肽及其同系物；假肽和擬肽；以及可以調(diào)節(jié)小窩蛋白-3的活性或其與MG53的分子間相互作用的化合物。因此，在其他方面，本發(fā)明包括用于耙向小窩蛋白-3基因表達(dá)、活性和/或分子間相互作用的方法，用于治療和/或預(yù)防患者疾患或病癥，例如用于促進(jìn)上述組織^,復(fù)。前述一^:應(yīng)用領(lǐng)域zf又作為例子而給出，并非為了限制本發(fā)明和所附權(quán)利要求的范圍。根據(jù)本權(quán)利要求、說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通4支術(shù)人員將能理解本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)。這些其他目的和優(yōu)點(diǎn)清楚地包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。圖1:MG53是TRIM蛋白家族的一種肌肉特異性成員。不同生物MG53蛋白序列的比3寸(見(jiàn)SEQIDNo:1、3、5、9-16)表明該蛋白是TRIM家族的成員。功能結(jié)構(gòu)域以灰色框出，箭頭表示該結(jié)構(gòu)域延伸至序列的另一行上。圖2:示出了某些同源性蛋白的示例性結(jié)構(gòu)域比較，這些同源性蛋白包含存在于MG53中的一種或多種保守三聯(lián)基元。MG53在多種形式損傷后易位至細(xì)胞膜損傷部位的能力方面比較獨(dú)特，并介導(dǎo)受損膜的修復(fù)-這是一種所列出的其他TRIM家族蛋白未表現(xiàn)出的功能。圖3:MG53包含獨(dú)特的TRIM和SPRY基元(或基序，motif),主要在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。A.MG53的基元結(jié)構(gòu)的示意圖。根據(jù)cDNA克隆和同源性:溲索的結(jié)果，在MG53中才企測(cè)到了示出的幾個(gè)基元序列。兔和小鼠MG53cDNA的序列已經(jīng)分別以編號(hào)AB231473和AB231474儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中。B.蛋白印跡分析示出了骨骼肌和心肌中MG53的特異性表達(dá)。利用抗小鼠MG53多克隆抗體分析小鼠組織(肺、腎、骨骼肌、肝臟、心臟、腦)裂解物(20昭總蛋白/泳道)。C.小鼠骨骼肌細(xì)胞的縱向橫截面的免疫熒光染色。比例尺是25[ojti。ii樣結(jié)構(gòu)(或絲足樣結(jié)構(gòu))。A.蛋白印跡分析示出了MG53在C2C12成肌細(xì)胞(左圖)和CHO(中圖)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)水平，還示出了GFP-MG53和MG53-GFP(右圖)在C2C12成月幾細(xì)月包中的過(guò)表達(dá)水平(20嗎總蛋白/泳道)。B.轉(zhuǎn)染了GFP(左圖)或GFP+MG53(右圖)的CHO(上圖)和C2C12成月幾細(xì)月包(下圖)的典型共聚焦圖4象，顯示出MG53過(guò)表達(dá)后的filapodia樣結(jié)構(gòu)(或絲足樣結(jié)構(gòu))。C.CHO細(xì)胞(上圖)和C2C12成肌細(xì)胞(下圖)表達(dá)的GFP-MG53(左圖)和MG53-GFP(右圖)的共聚焦圖像，表明MG53的膜耙向和細(xì)胞內(nèi)嚢泡分布以及filapodia樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。比例尺是5jmi。D.放大的共聚焦圖像，示出了細(xì)胞內(nèi)嚢泡、質(zhì)膜上的出芽嚢泡(左圖)和細(xì)月包外嚢泡(右圖)。比例尺是lpm。圖5:MG53通過(guò)調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化而促進(jìn)骨骼肌的肌形成。A.蛋白印跡分析顯示，shRNA介導(dǎo)了CHO細(xì)胞中MG53的下調(diào)。裂解物制備自CHO細(xì)胞，該細(xì)胞用MG53表達(dá)載體以及針對(duì)MG53的shRNA或4普酉己(scrambled)shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。免疫印跡是利用多克隆抗小鼠MG53抗體(上圖)或單克隆a-actin抗體(下圖)而實(shí)施。B.C2C12細(xì)胞在不同分化天數(shù)的代表性熒光顯微鏡圖像(第0天，上圖；第5天，中圖；第10天，下圖)，表明與錯(cuò)配shRNA對(duì)照(左圖)相比，用抗MG53的shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(右圖)中沒(méi)有肌管形成。比例尺是50[im。C.與對(duì)照相比，MG53在第5天或第10天抑制肌管形成的下調(diào)的統(tǒng)計(jì)分析(t4企驗(yàn)，*p<0.01和**pO.OOl)。將綠色肌管與全部綠色細(xì)胞的比值定義為肌管的百分比。數(shù)據(jù)是以均值和SEM表示。圖6:MG53與小窩蛋白-3之間的功能性相互作用調(diào)節(jié)骨骼肌中的動(dòng)態(tài)膜出芽過(guò)程。A.C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中，在分化誘導(dǎo)后的指定時(shí)間(第0、2、5、8、10天)，MG53(上圖)、小窩蛋白-3(中圖)和小窩蛋白-1(下圖)的表達(dá)水平的蛋白印跡分析。B.將來(lái)自小鼠腓腸肌骨骼肌的總細(xì)胞裂解物利用抗MG53(兔多克隆抗體)、抗小窩蛋白-3(小鼠單克隆抗體)、正常兔IgG(作為陰性對(duì)照)和細(xì)胞裂解物(作為陽(yáng)性對(duì)照)進(jìn)行co-IP(免疫共沉淀)。C.共聚焦圖l象，示出了與成月幾細(xì)月包(左圖)相比，C2C12月幾管形成(右圖)過(guò)程中filapodia樣結(jié)構(gòu)的消失?？勺⒁獾?，在轉(zhuǎn)染的C2C12肌管中仍然存在對(duì)GFP-MG53為陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)嚢泡。D.小窩蛋白-3在C2C12成月幾細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)阻止了MG53i秀導(dǎo)的filapodia樣結(jié)構(gòu)的形成。CHO細(xì)胞(上圖)或C2C12成肌細(xì)胞(下圖)用pCDNA-Cav-3和GFP-MG53(10:1)共轉(zhuǎn)染(右圖)，或用pcDNA載體和GFP-MG53(10:1)共轉(zhuǎn)染作為對(duì)照(左圖)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)獲取共聚焦圖像。比例尺是10pm。E和F.對(duì)C和D的統(tǒng)計(jì)分才斤。3夸表JE見(jiàn)出filapodia樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞與全部綠色細(xì)胞的比值定義為filapodia樣結(jié)構(gòu)百分比。凄t才居以均4直禾口SEM表示(t4企馬全，*p<0.01)。圖7:shRNA介導(dǎo)的小窩蛋白-3表達(dá)抑制影響肌管的形成。A.用針對(duì)小窩蛋白-3的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后(分化6天后)，通過(guò)蛋白印跡分析C2C12肌管中小窩蛋白-3的下調(diào)水平。用錯(cuò)配shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對(duì)照。B.與對(duì)照shRNA相比(左圖)，利用shRNA下調(diào)小窩蛋白-3(右圖)抑制肌管形成。紅色熒光指示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在分化誘導(dǎo)后6天獲取焚光顯孩"竟圖4象。比例尺是20pm。C.統(tǒng)計(jì)分片斤表明，第6天時(shí)，與對(duì)照相比，小窩蛋白-3的下調(diào)顯著抑制"幾管形成(t^r-驗(yàn)，*p<0.001)。紅色熒光力幾管與全部紅色熒光細(xì)胞的比值作為肌管百分比。數(shù)據(jù)以均值和SEM表示。D.共表達(dá)GFP-MG53和4f對(duì)小窩蛋白-3的shRNA的C2C12成肌細(xì)胞的共聚焦圖像(右圖)表明，與對(duì)照shRNA(左圖)相13比，其對(duì)GFP-MG53所誘導(dǎo)的filapodia樣結(jié)構(gòu)或GFP-MG53的分布沒(méi)有影響。比例尺是5(im。圖8:用曱基-P-環(huán)糊精處理細(xì)胞引起GFP-MG53在C2C12成肌細(xì)胞中的胞吐和增溶。A.代表性共聚焦圖像，示出了在指定時(shí)間點(diǎn)(O分鐘，左圖；15分鐘，右圖)的自發(fā)嚢泡融合以及從膜出芽脫落。比例尺是5)am。B.共聚焦圖像，示出了在用10mMM-pCD處理后，在指定時(shí)間點(diǎn)(O秒，左圖；16秒，中圖；32秒，右圖)GFP-MG53誘導(dǎo)的嚢泡迅速?gòu)哪こ鲅棵撀?。C.共聚焦圖像，示出了在用10mMM-pCD在室溫下進(jìn)行1小時(shí)的延長(zhǎng)處理(右圖)之后，與處理前的相同細(xì)胞(左圖)相比，GFP-MG53的增溶作用。比例尺是5(am。圖9:MG53敲除小鼠對(duì)心臟損傷易感。來(lái)自未估支運(yùn)動(dòng)(unexercised)的野生型小鼠的心力幾石蠟包埋切片表現(xiàn)為正常形態(tài)(左)，無(wú)埃文斯藍(lán)染色(右)。相比之下，11^53-/-小鼠表現(xiàn)為埃文斯藍(lán)滲入肌細(xì)胞，表明mg53-A心臟的膜完整性存在顯著缺陷。圖10:由于細(xì)胞膜損傷增加，mg53-A骨骼肌中觀察到惡化病狀。A.蘇木素和伊紅染色(H/E)示出了，在老齡11^53-/-肌肉(10m)對(duì)比幼齡(3m)野生型(wt)或mg53-A小鼠中其中央核數(shù)量增加(箭頭)。B.與老齡(8-10個(gè)月)野生型對(duì)照(黑色，n=562)相比，老齡(8-10個(gè)月)mg53-A小鼠(藍(lán)色，n=541)中肌纖維直徑減小，^f旦幼齡(3-5個(gè)月)wt(n=765)與mg53-A(n=763)月幾肉相比則不存在差異。與wt相比，顯示mg53-Z-骨骼肌中中央核的肌纖維百分比隨年齡而增加。數(shù)據(jù)以均值士s.e.m.表示，利用ANOVA，*p<0.005。C,按照所述步驟，利用體外電壓刺激法評(píng)價(jià)對(duì)從經(jīng)過(guò)30分鐘下坡跑運(yùn)動(dòng)的小鼠中得到的完整比目魚(yú)肌收縮性能進(jìn)行的多艮蹤記錄。黑色3艮蹤代表wt月幾肉，藍(lán)色3艮蹤則對(duì)應(yīng)于mg53V-月幾肉。14D.疲勞刺激前(前，空心柱)，最大強(qiáng)直收縮力，以g/mg總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，在老齡肌肉(_^悉)中與W(Z^)相比顯著較低(n=4)。疲勞刺激后6分鐘(后，實(shí)心柱)，wt肌肉的恢復(fù)顯著好于mg53-A肌肉。利用ANOVA,*p<0.005。E.與wt月幾肉中才及^f氐染色相比，強(qiáng)的埃文斯藍(lán)染色表明經(jīng)歷下坡跑的mg53-A骨骼肌中存在重度損傷。F.運(yùn)動(dòng)后，利用曱酰胺從老齡mg53-A(藍(lán)色)和wt(黑色)骨膝肌中提取的埃文斯藍(lán)染料量的圖。數(shù)據(jù)表示埃文斯藍(lán)的平均值(ng)/g月幾肉士s.e.m。n=8-12。通過(guò)Student'st-才企馬全，*p<0.005。圖11:去除MG53可引起肌細(xì)胞膜修復(fù)功能缺陷。(a)分離的wtFDB纖維中MG53的免疫染色顯示它們?cè)趽p傷部位共定位。這些是分離時(shí)出現(xiàn)損傷的20種以上不同肌纖維的代表性圖像。(b)激光誘導(dǎo)肌纖維膜損傷后，從wt小鼠中分離的FDB肌纖維中不透膜性FM-143熒光染料的排除。(c)激光誘導(dǎo)性損傷后，F(xiàn)M-143熒光染料進(jìn)入從mg53-A小鼠中分離的FDB肌纖維。指出了激光損傷后的時(shí)間。(d)在由激光損傷肌纖維膜引起的FDB肌纖維內(nèi)FM-143的時(shí)間依賴性蓄積。數(shù)據(jù)為均值士s.e.m.，從wt小鼠獲得的纖維數(shù)n=30以及從mg53V-小鼠中獲得的纖維凄tn=18。圖12:物理?yè)p傷后，含MG53的嚢泡在質(zhì)膜中形成補(bǔ)片。A.利用樣i量加液器損傷C2C12成月幾細(xì)月包月莫，引起GFP-MG53在損傷部位(箭頭)快速蓄積。圖像代表11=40的單個(gè)細(xì)胞。B.成熟C2C12肌管響應(yīng)重度損傷例如細(xì)胞膜分離時(shí)的恢復(fù)，與GFP-MG53向愈合吾IM立^卜充才目關(guān)(n=28)。圖13:TRIM和SPRY結(jié)構(gòu)i或在一奪MG53輩巴向月幾細(xì)月包的細(xì)月包表膜過(guò)程中的作用。A.MG53缺失融合蛋白構(gòu)建體(GFP融合于N畫(huà)末端或C-末端)的示意圖。參考SEQIDNO.l,"TRIM"代表a.a.l-287，"SPRY"代表a.a.288-477，且包括PRY和SPRY兩個(gè)基元。B.代表性共聚焦圖像，示出了每一種缺失構(gòu)建體在C2C12細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)定位。比例尺為5|am。C.MG53通過(guò)TRIM基元與小窩蛋白-3相互作用。來(lái)自用GFP-MG53或GFP-TRIM和pcDNA-Cav-3共4爭(zhēng)染的CHO細(xì)月包的細(xì)月包裂解物，用才元小窩蛋白-3(小鼠單克隆抗體)進(jìn)4亍IP。(泳道1，混合的細(xì)"包裂解物作為陽(yáng)性對(duì)照；泳道2，正常小鼠IgG作為陰性對(duì)照；泳道3，來(lái)自過(guò)表達(dá)GFP-MG53的細(xì)胞的裂解物；泳道4,來(lái)自過(guò)表達(dá)GFP-TRIM的細(xì)^^的裂解物)。圖14:TRIM和SPRY結(jié)構(gòu)域在將MG53靶向在非肌肉CHO細(xì)胞中的細(xì)胞表膜過(guò)程中的作用。代表性共聚焦圖像顯示，GFP-MG53表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)嚢泡、膜耙向和出芽，然而在天然狀態(tài)下MG53-GFP主要為可溶性(上圖)；SPRY-GFP和GFP-SPRY是胞漿(中圖)；TRIM-GFP和GFP-TRIM主要為細(xì)胞內(nèi)嚢泡，并且不耙向于質(zhì)膜(下圖)。"TRIM，，代表a.a.l-287，"SPRY，，代表a.a.288-477，且包含PRY和SPRY兩個(gè)基元。比例尺為5jim。圖15:重組TAT-MG53和突變構(gòu)建體的純4匕。(a)TAT-MG53重組蛋白構(gòu)建體和相關(guān)缺失構(gòu)建體的示意圖。(b)變性膠考馬斯藍(lán)染色示出了TAT-MG53的純化步驟。凝膠泳道用分子量標(biāo)志物(Marker)(M)、》矣希氏大腸4干菌上清(Sup)、免疫親和4主流出液(FT)、洗液(Wl、W2)和洗脫餾分(El-5)上樣。(c)從埃希氏大腸桿菌分離的重組突變體TAT-MG53蛋白的考馬斯染色變性膠。圖16:產(chǎn)生表達(dá)RFP-MG53的穩(wěn)定HEKMS(人胚腎)細(xì)胞系。(a)穩(wěn)定表達(dá)RFP(紅色熒光蛋白)對(duì)照蛋白的細(xì)胞系表現(xiàn)為胞漿表達(dá)才莫式。(b)在僅表達(dá)RFP的HEK293細(xì)胞中，樣i電極損傷未引起RFP易位至損傷部位(箭頭)。RFP熒光部分褪色則由于胞外緩沖16液(*)的過(guò)量進(jìn)入而發(fā)生。(c)穩(wěn)-定表達(dá)RFP-MG53的HEK293細(xì)月包表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)嚢泡定位。(d)表達(dá)RFP-MG53的HEK293細(xì)月包的損傷引起MG53在少于90秒以內(nèi)大量易位至損傷部位(箭頭)。質(zhì)膜迅速修復(fù)限制緩沖液進(jìn)入細(xì)胞，從而防止RFP-MG53熒光的褪色。圖17:重組人類TAT-MG53(參見(jiàn)HIV-1TAT蛋白，SEQIDNO.17)可穿透不同來(lái)源的細(xì)胞。HL-1心肌細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞與4或8|ig/mL的重組人類TAT-MG53于37。C一起孵育15分鐘。將細(xì)胞在緩沖鹽溶液中洗滌三次，然后裂解進(jìn)行蛋白印跡分析。蛋白印跡表明對(duì)照細(xì)胞(對(duì)照)不含有內(nèi)源性MG53,然而那些與TAT-MG53—起孵育的纟田月包則包含充足的細(xì)月包內(nèi)TAT-MG53。可注意到，由于該蛋白添加了TAT細(xì)胞穿透肽，因此從骨骼肌提取物(月幾肉)可見(jiàn)TAT-MG53略大于MG53。圖18:MG53的重組表達(dá)。(a)利用Ni-NTA柱從Sf9細(xì)胞分離的重組人類MG53蛋白(箭頭)餾分的考馬斯藍(lán)染色凝膠。Input=細(xì)月包^是取物，F(xiàn)T:流出液，M-標(biāo)志物，E—先脫液標(biāo)號(hào)。(b)乂人Sf9細(xì)胞分離的重組人類TAT-MG53(箭頭)的考馬斯藍(lán)染色凝膠。(c)從E.coli中分離的重組小鼠TAT-MG53(箭頭)的考馬斯藍(lán)染色凝膠。圖19:MG53通過(guò)與磷脂酰絲氨酸結(jié)合而與細(xì)胞膜相互作用以介導(dǎo)嚢泡運(yùn)llr。(A)PIP2-Strip脂斑點(diǎn)雜交分對(duì)斤顯示，重組MG53(l昭/ml)特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸(PS)而不結(jié)合其他膜脂質(zhì)，包括鞘氨醇-l-P、磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和多種磷酸肌醇代謝物。(B)膜聯(lián)蛋白-V-GFP(—種已確定能夠結(jié)合PS的分子)轉(zhuǎn)染入C2C12成肌細(xì)胞(左)，在微電極(箭頭)引起細(xì)胞創(chuàng)傷后，表現(xiàn)出極低的易位，而膜聯(lián)蛋白-V-GFP與RFP-MG53共表達(dá)(右)則引起膜聯(lián)蛋白-V-GFP的蓄積加速。數(shù)據(jù)表示均值士s.e.m。通過(guò)學(xué)生氏t檢驗(yàn)，*p<0.01。圖20:示意圖，示出了本發(fā)明人目前對(duì)MG53所介導(dǎo)的膜修復(fù)的機(jī)制的假說(shuō)。盡管不受任何特定理論的限制，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，MG53可能由于與含磷脂酰絲氨酸的嚢泡結(jié)合而定位于質(zhì)膜的內(nèi)表面。在正常條件下，MG53可能為單體，且由于與小窩蛋白-3結(jié)合而多價(jià)螯合于膜表面附近。細(xì)胞膜損傷后，將MG53(通常處于還原形式)暴露于局部的氧化環(huán)境，該環(huán)境觸發(fā)二-克交聯(lián)一建形成和分子間MG53寡聚化。MG53寡聚化使得含磷脂酰絲氨酸的嚢泡聚集于損傷部位。隨后，該脂質(zhì)嚢泡能夠貼補(bǔ)受損膜-可能由簡(jiǎn)單的疏水力介導(dǎo)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供新型核苷酸以及由其編碼的多肽。本發(fā)明還包括新型核酸序列及其編碼的多肽。本文中所述序列統(tǒng)稱為"MG53核酸"或"MG53多核普酸"，所編碼的相應(yīng)多肽稱為"MG53多肽，，或"MG53蛋白"。除非另有指明，"MG53"指本文所4皮露新型序列中的任何一個(gè)。動(dòng)態(tài)膜修復(fù)不僅對(duì)于長(zhǎng)期保持細(xì)胞完整性而且對(duì)于急性細(xì)胞損傷恢復(fù)都是必需的。膜修復(fù)缺陷與多種疾病狀態(tài)包括肌萎縮、心臟衰竭和神經(jīng)退行有關(guān)。細(xì)胞膜修復(fù)需要細(xì)胞內(nèi)嚢泡運(yùn)送，其與質(zhì)膜處的囊泡累積有關(guān)。本發(fā)明涉及一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即在急性膜修復(fù)的過(guò)程中，嚢泡融合受mitsugumin53(MG53)(SEQIDNO.l)驅(qū)動(dòng)，而MG53是一種新型月幾肉特異性三4關(guān)基元(TRIM)家族蛋白。MG53表達(dá)對(duì)于允i午細(xì)月包內(nèi)嚢泡運(yùn)輸至質(zhì)膜并與其融合是必需的。細(xì)胞膜急性損傷引起含MG53的嚢泡補(bǔ)充至損傷部位以貼補(bǔ)在膜上。無(wú)MG53的細(xì)胞在響應(yīng)多種應(yīng)激的膜修復(fù)方面表現(xiàn)出缺陷，所述應(yīng)激包括激光誘導(dǎo)的損傷、運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉損傷以及疲勞后肌收縮功能的恢復(fù)不足。因此，MG53是嚢泡輸送事件中的關(guān)鍵組分，而嚢泡輸送是細(xì)胞膜急性修復(fù)和重塑的基礎(chǔ)。本發(fā)明部分基于對(duì)編碼新型多肽的核酸序列的發(fā)現(xiàn)。本文中，該襟斤型4亥酸和多肽稱、為MG534亥酉吏和多肽。一方面，本發(fā)明提供一種分離的編碼一種MG53多肽的MG53核酸分子，該MG53多肽包含一種核酸序列，該序列與SEQIDNO:2、4和6中4皮露的核酸具有30%、40%、50%、60°/。、70%、80%、90%或100%的一致性。在某些實(shí)施方式中，在嚴(yán)格條件下，該分離的MG53核酸分子雜交于與一種核酸分子互補(bǔ)的一種核酸序列，其中該核酸分子包含一種MG53核酸序列的蛋白編碼序列。本發(fā)明還包括編碼MG53多肽或其片,殳、同系物、類似物、融合蛋白、假肽、擬肽或書(shū)f生物的分離核S交。例如，該核酸可編石馬一個(gè)多肽，其與包含SEQIDNO:1、3、5和7的氨基酸序列的多肽具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的一致性。該核酸可以為例如包含SEQIDNO:2、4和6中4壬何一個(gè)氨基酸序列的基因組DNA片,殳或cDNA分子。本發(fā)明還包含寡核苦酸，例如包含MG53核酸(如SEQIDNO:2、4和6)中至少6個(gè)相鄰核苷酸的寡核苷酸或者所述寡核苷酸的互補(bǔ)物。本發(fā)明還包含基本純化的MG53多肽(SEQIDNO:1、3、5和7)。在某些實(shí)施方式中，該MG53多肽包括的氨基酸序列基本等同于人類MG53多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的特征還在于與MG53多肽或其片段、同系物、類似物、假肽、擬肽或衍生物免疫選擇性結(jié)合的抗體。另一方面，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含治療或預(yù)防有效量的一種治療劑和藥用載體。該治療劑可以為例如MG53核酸如肽核酸、cDNA或RNA如抑制性小RNA;MG53多肽；或?qū)G53多肽具有特異性的抗體。另外一方面，本發(fā)明包括存在于一種或多種容器中的治療或預(yù)防有效量的該藥物組合物。另一方面，本發(fā)明包括通過(guò)在適于由該DNA編碼的MG53多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞而生成多肽的方法，該細(xì)胞包含內(nèi)源性或外源性表達(dá)的MG53核酸。如果需要，隨后可收集該MG53多肽。另一方面，本發(fā)明包括通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞而生成多肽的方法，該細(xì)月包包含位于外源性啟動(dòng)子上游或下游的內(nèi)源性MG53核酸。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)同源重組、《連斷裂或4晉配4,復(fù)才幾制將該外源性啟動(dòng)子結(jié)合入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。另一方面，本發(fā)明包括才企測(cè)樣品中MG53多肽存在情況的方法。在該方法中，在適于該多肽與該4匕合物之間形成復(fù)合物的條4牛下，使樣品與一種選擇性結(jié)合于該多肽的化合物接觸。檢測(cè)該復(fù)合物，如果存在，則確定才羊品內(nèi)有MG53多肽。本發(fā)明還包括基于MG53核酸、多肽或MG53融合多肽表達(dá)而鑒定特異細(xì)胞或組織類型的方法。例如，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有"標(biāo)簽"或指示劑部分和MG53部分的融合蛋白。在某些方面，該標(biāo)簽或指示劑部分可以為適于純化目的的肽，例如FLAG標(biāo)簽、6xHis標(biāo)簽等。在其他方面，該標(biāo)簽肽包括適于一是供信號(hào)的肽例如抗體表位或熒光肽。另外的方面包括MG53與適用于介導(dǎo)亞細(xì)胞定位或跨細(xì)胞膜易位的一種肽的融合，例如來(lái)自HIV病毒的TAT融合蛋白。本發(fā)明也包括4企測(cè)一種樣品內(nèi)MG53核酸分子的存在的方法在內(nèi)，其通過(guò)4吏該才羊品與MG53核酸4果4f或引物4妄觸并才企測(cè)才羊品內(nèi)是否存在結(jié)合于MG53核酸分子的核酸探針或引物。另一方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)使包含MG53多肽的細(xì)胞樣品與結(jié)合該MG53多肽的一種4匕合物相沖妄觸而調(diào)節(jié)MG53多肽活性的方法，其中該化合物的量足以調(diào)節(jié)所述多肽的活性。該化合物可以為例如小分子如核酸、肽、多肽、擬肽、石友水化合物、脂質(zhì)或其他有機(jī)(含碳)或無(wú)機(jī)分子，如本文進(jìn)一步闡述的。治療劑在制造用來(lái)治療或預(yù)防病癥或綜合^正的藥劑中的應(yīng)用也包4舌在本發(fā)明中，這些病癥或綜合4正包括，例如，心血管疾病、心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、先天性心臟缺損、主動(dòng)脈瓣狹窄、房間隔缺損(ASD)、房室(A-V)通道缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管、肺動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)月永瓣下狹窄、室間隔缺損(VSD)、瓣月莫病、高凝、血友病、潰瘍、創(chuàng)傷、傷痕(lesion)、割傷、擦傷、氧化性損傷、老年性組織變性、手術(shù)相關(guān)損傷、燒傷、肌無(wú)力、肌萎縮、結(jié)締組織病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、心臟衰竭、由心臟衰竭和高血壓引起的繼發(fā)病癥、j氐血壓、心絞痛、心月幾梗塞、結(jié)節(jié)性;更化癥、》更皮癥、移才直、自身免疫病、紅斑狼療、病毒性/細(xì)菌性/寄生蟲(chóng)感染、多發(fā)性硬化癥、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、免疫缺陷、移才直物:阮宿主病、哮喘、肺氣腫、ARDS、炎癥和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、病毒所致病癥、衰老相關(guān)病癥、Thl炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性石更化癥、炎性腸病、AIDS、創(chuàng)傷+f復(fù)、心臟病發(fā)作、心臟衰竭、月幾肉萎縮癥、褥瘡、糖尿病性潰瘍、氧化性損傷和組織損傷如鼻竇炎或粘膜炎、皺紋、濕滲或皮炎、干性皮月夫、月巴胖癥、#唐尿病、內(nèi)分泌疾病、厭食癥、食欲過(guò)盛、腎動(dòng)脈狹窄、間質(zhì)性腎炎、腎小球腎炎、多嚢性腎病、全身性(systemic)、腎小管性酸中毒、IgA腎病、腎病、高鈣血癥、萊施-尼漢綜合4正(Lesch-Nyhansyndrome)、4木島(VHL)綜合^正(VonHippel-Lindausyndrome)、夕卜4另、再生(體夕卜和體內(nèi))、先天性巨結(jié)腸癥(希爾施普龍病)、克隆病(克羅恩病)、闌尾炎、子宮內(nèi)膜異位癥、喉炎、4艮屑病、光化性角化病、痤瘡、毛發(fā)生長(zhǎng)/脫落、殼發(fā)(allopecia)、色素沉著病、重癥肌無(wú)力、a-甘露糖香過(guò)多癥、P甘露糖苷過(guò)多癥、其他貯積病、過(guò)氧化小體病如澤韋格綜合4正(Zellwegersyndrome)、嬰兒期雷夫敘姆病(infantilerefsumdisease),肢根軟骨發(fā)育不全(點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良、肢根)和高哌啶酸血癥、骨質(zhì)疏松癥、肌紊亂病、尿潴留、奧爾布賴特遺傳性骨發(fā)育不全(AlbrightHereditaryOstoeodystrophy)、潰瘍、阿爾茨f每f犬氏病、中風(fēng)、帕金森病、亨廷頓病、腦性麻痹、癲癇、萊萘二氏綜合征、多發(fā)性硬化癥、共濟(jì)失調(diào)型毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、行為障礙、成癮性、焦慮癥、疼痛、神經(jīng)保護(hù)、中風(fēng)、無(wú)晶狀體、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)育性缺陷、與腦內(nèi)GRK2作用和趨化因子受體調(diào)節(jié)相關(guān)的疾患、腦脊髓炎、焦慮癥、精神分裂癥、躁郁癥、譫妄、癡呆、重度精神發(fā)育遲緩和運(yùn)動(dòng)障礙、抽動(dòng)穢語(yǔ)綜合征、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、癌癥、乳腺癌、CNS癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰J^癌、腎癌、結(jié)腸癌、前列&泉癌、神經(jīng)母細(xì)力包瘤和宮頸癌、贅生物；腺癌、淋巴瘤；子宮癌、良性前列腺肥大、生育、生長(zhǎng)和發(fā)育/分化控制相關(guān)的功能例如但不限于成熟、哺乳期和青春期、生殖一幾能障；尋和/或其^也類^以疾患和病癥。22在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療性組合物包括例如MG53核酸；結(jié)合MG53編碼核酸的核酸；MG53多肽、肽類似物、以其為基礎(chǔ)的4艮肽或擬肽；MG53或MG53蛋白-蛋白相互作用的小分子調(diào)節(jié)劑；或MG53特異性抗體或其生物活性衍生物或片段。如本文所述，MG53介導(dǎo)細(xì)胞膜損傷的修復(fù)。因此，對(duì)這些核酸、多肽和其同系物的表達(dá)和/或活性的導(dǎo)向性將提供多種與組織修復(fù)相關(guān)的急性和'隄性疾患和病癥的新型療法。在某些其他方面，本發(fā)明包括用于治療或緩解與組織損傷和/或與組織損傷相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要該療法的患者有效量的本發(fā)明組合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于治療組織損傷或創(chuàng)傷如割傷、擦傷、傷痕、潰瘍、燒傷、褥瘡、牙齦疾病、粘膜炎等的方法，包括給予需要該療法的患者有效量的本發(fā)明的治療纟且合物。在另外一些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用作手術(shù)佐劑的治療組合物。在本文所述任一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的手術(shù)輔助組合物可作為單獨(dú)的治療劑直4妄地4吏用或應(yīng)用于手術(shù)部位或其可與手術(shù)或醫(yī)療器具結(jié)合為整體，例如，本發(fā)明的治療劑可結(jié)合于聚合物基支架、管或其他植入性裝置，使得該治療劑以可控方式彌散入作用部位以促進(jìn)愈合和/或?qū)⑶秩胄允中g(shù)操作造成的創(chuàng)傷降到最低。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療組合物作為例如醫(yī)療器具的膜或涂層而應(yīng)用，因此該治療劑彌散入血流或周?chē)M織內(nèi)和/或逐漸減少，乂人而直4妄遞送至組織損傷部位；將由于采用手術(shù)器具發(fā)生的細(xì)^4員傷程度降到最低或?qū)⒏纳圃摀p傷程度。在另外一些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于治療和/或預(yù)防組織修復(fù)缺陷的方法，該組織修復(fù)缺陷作為衰老過(guò)程的固有副作用而發(fā)生(例如，皮膚年輕化、牙齦退縮、骨退化、關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海23默、帕金森等)。在該實(shí)施方式的某些方面中，本發(fā)明包括對(duì)那些在組織修復(fù)能力、組織完整性和/或組織彈性方面具有與年齡相關(guān)的缺陷的個(gè)體給予有效量的本發(fā)明的治療組合物。在某些實(shí)施方式中，該與年齡相關(guān)的在夾陷為皺紋、魚(yú)尾紋、面部皺紋、斑(potmarks)、瘢痕、纖維瘤、曬扭王等中的至少一種或其《且合。此外，由于內(nèi)源性MG53基因表達(dá)的肌肉特異性本質(zhì)，本發(fā)明涵蓋用于治療和/或預(yù)防任何類型的肌肉或脈管細(xì)胞/組織損傷(例如由于心血管疾病如心月幾梗塞而發(fā)生的《且織損傷；或由于劇烈體力活動(dòng)而發(fā)生的組織損傷如運(yùn)動(dòng)相關(guān)損傷)的方法，包括給予需要該治療的患者有效量的本發(fā)明治療劑。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包括對(duì)于機(jī)體組織的修復(fù)、再生或恢復(fù)非常有用的化妝組合物，其包含本發(fā)明的治療劑和化妝用載體或賦形劑。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，本發(fā)明涵蓋了改善皮膚外觀的方法，該方法包括以化妝品形式給予個(gè)體有效量的本發(fā)明的治療組合物。在本發(fā)明的任何一個(gè)方面，本發(fā)明的治療組合物可以為任何藥用形式，并可通過(guò)任何藥用途徑而給藥，例如，該治療組合物可作為口服劑型(單日劑量或單元?jiǎng)┝啃问?而給予，用于治療由于心肌梗塞、骨石更化損傷(scleroticlesion)引起的肌肉損傷或由于運(yùn)動(dòng)相關(guān)的活動(dòng)引起的肌肉撕裂，以促進(jìn)受損肌肉組織的再生和修復(fù)。這些藥用載體和賦形劑以及給予方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)是顯而易見(jiàn)的。此外，本發(fā)明涉及包括干4尤性核酸的核酸以及編碼MG53相互作用蛋白的多肽，如小窩蛋白-3(SEQIDNO.8)多肽及其同系物；々i肽和擬肽；以及可調(diào)節(jié)小窩蛋白-3活性或其與MG53的分子間相互作用的化合物。因此，在另外的方面，本發(fā)明涵蓋導(dǎo)向小窩蛋白-3基因表達(dá)、活性和/或分子間相互作用的方法，用于治療和/或預(yù)防患者疾患或病癥，例如用于促進(jìn)上述組織修復(fù)。例如，本發(fā)明的組合物將對(duì)于治療患上文披露的疾患和病癥和/或其他類似疾患和病癥的患者具有有效性。該多肽可作為免疫原而產(chǎn)生用于本發(fā)明的特異抗體并可作為疫苗。其還可用來(lái)篩查可能的激動(dòng)劑和拮抗劑復(fù)合物。此外，編碼MG53的cDNA可用于基因治療中，且當(dāng)給予需要該治療的個(gè)體時(shí)，MG53是有用的。通過(guò)非限制性實(shí)例，本發(fā)明的組合物^)尋^"于治療患上文4皮露的疾患和病癥和/或其〗也類似疾患和病癥的患者具有有效性。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于篩選疾病或綜合征調(diào)節(jié)劑的方法，這些疾病或綜合征包括，例如上文4皮露的疾患和病癥和/或其他類似的疾患和病癥。該方法包括"使受試化合物與MG53多肽4妄觸并確定該受"^/f匕合物是否與所述MG53多肽結(jié)合。該受"^/f匕合物與該MG53多肽的結(jié)合表明該受試化合物是活性調(diào)節(jié)劑、或上述疾病或綜合征潛伏期或易感性的調(diào)節(jié)劑。一種用于篩選活性調(diào)節(jié)劑、或疾患或綜合征(包括例如上文拔:露的疾患和病癥和/或其他類似疾患和病癥)的潛伏期和易感性的調(diào)節(jié)劑的方法，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該方法通過(guò)將受試化合物纟會(huì)予對(duì)上文所提到的病癥或綜合4正的增加風(fēng)險(xiǎn)的受試動(dòng)物。該受試動(dòng)物表達(dá)由MG53核酸編碼的重組多肽。隨后測(cè)定受試動(dòng)物中的MG53多肽的表達(dá)或活性，同時(shí)測(cè)定只于照動(dòng)物中該蛋白的表達(dá)或活性，該對(duì)照動(dòng)物重組表達(dá)MG53多肽且患該病癥或綜合^正的風(fēng)險(xiǎn)并未增力口。接下來(lái)，比4交受試動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中MG53多肽的表達(dá)。受試動(dòng)物中MG53多肽相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物的變化表示該受試化合物是該病癥或綜合征潛伏期的調(diào)節(jié)劑。25另一方面，本發(fā)明包括用于確定一個(gè)個(gè)體(如人類個(gè)體)體內(nèi)是否存在或者易感與MG53多肽、MG53核酸或二者7jc平改變相關(guān)的疾病的方法。該方法包4舌測(cè)定來(lái)自該個(gè)體的受試^羊品中MG53多肽的量，并比舉交該受試才羊品中該多肽的量與對(duì)照才羊品中存在的MG53多肽的量。與對(duì)照樣品相比，受試樣品中MG53多肽水平的改變表示個(gè)體中存在一種疾病或乂于該疾病具有易感性。^尤選;也，該易感性包括例如上文4皮露的疾患和病癥和/或其他類似的疾患和病癥。而且，本發(fā)明的新型多肽的表達(dá)7jC平可用在用于篩查多種疾病以及確定#爭(zhēng)定疾病階^殳的方法中。另一方面，本發(fā)明包括通過(guò)給予個(gè)體MG53多肽、MG53核酸或針對(duì)個(gè)體(例如人類個(gè)體)的MG53特異性抗體(其量足以緩解或預(yù)防該病態(tài))來(lái)治療或預(yù)防與哺乳動(dòng)物中病癥相關(guān)的病態(tài)的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該病癥包括例如上文4皮露的疾患和病癥和/或其4也類4以疾患和病癥。另外一方面，本發(fā)明可用于一種方法中，以通過(guò)本4頁(yè)J或中通常釆用的多種技術(shù)中任何一種來(lái)鑒定本發(fā)明的細(xì)胞受體和下游效應(yīng)物。交系統(tǒng)、親和純4匕、共沉淀'除非另有定義，本文中應(yīng)用的全部才支術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。盡管與但下文將描述恰當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。所有的出版物、專利申?qǐng)、專利和本文提到的其他參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考。如果出現(xiàn)矛盾，將以本i兌明書(shū)包括的定義為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)例僅僅是示例性的而非為了限制的目的。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"MG53拮抗劑"或拮抗劑"MG53"通常用來(lái)指能夠直接或間接抑制MG53表達(dá)、翻譯和/或活性的試劑。此夕卜，如本文中使用的，"MG53受體"通常是指它的能夠結(jié)合MG53蛋白的任何蛋白或其片段。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"小窩蛋白拮抗劑"通常用來(lái)指能夠直接或間接抑制小窩蛋白表達(dá)、翻譯和/或活性的試劑。此外，如本文中使用的，"小窩蛋白受體"通常是指它的能夠與小窩蛋白結(jié)合的任何蛋白或其片段。在某些方面，MG53活性的調(diào)節(jié)可如下實(shí)現(xiàn)例如通過(guò)采用或調(diào)節(jié)MG53結(jié)合伴侶(即結(jié)合MG53并中和其生物活性的因子如中和性抗MG53)、MG53受體(例如，或小窩蛋白-3)、MG53受體片4殳和MG53受體類似物；采用MG53受體拮抗劑，例如抗小窩蛋白-3抗體、-假肽、肽類似物或結(jié)合并石皮壞MG53-受體相互作用的擬肽；采用抑制MG53活性或分子間相互作用或者改變MG53的正常構(gòu)型或者抑制能生產(chǎn)的MG53-MG53-受體結(jié)合的小分子；或采用來(lái)自MG53基因和/或MG53受體基因的核香酸序列，包括編碼、非編碼和/或調(diào)節(jié)性序列以通過(guò)例如反義分子、核酶和/或三鏈螺i走法來(lái)防止或降^f氐MG53表達(dá)。另一方面，本發(fā)明的特點(diǎn)還在于一種核酸分子，例如誘何RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、」微小RNA、適配體、反義核酸分子，其下調(diào)編碼MG53或MG53受體如小窩蛋白-3的一種序列的表達(dá)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子經(jīng)改造用以治療和/或預(yù)防組織損傷并促進(jìn)組織修復(fù)。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子具有內(nèi)切酶活性或是沖亥酸酶復(fù)合體的一個(gè)組分，并切割具有MG53或MG53受體核酸序列的RNA。27在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子包括12-100個(gè)堿基，其互#卜于具有MG53或MG53受體沖亥酸序列的RNA。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子包括14-24個(gè)堿基，其互補(bǔ)于具有MG53或MG53受體核酸序列的RNA。在本文所述的<壬<可一種實(shí)施方式中，該核酸分子可4安照本領(lǐng)i或中熟知的方法化學(xué)合成。另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括恰當(dāng)容器、能夠以藥用形式置于該容器中的能夠抑制MG53活性、表達(dá)或結(jié)合的活性劑以及其^f吏用"i兌明書(shū)。在另一方面，本發(fā)明涉及用于"i貪斷或監(jiān)測(cè)病癥或疾患或進(jìn)展的方法，包括通過(guò)4企測(cè)MG53或MG53受體基因或蛋白或二者的表達(dá)水平，而才企測(cè)MG53或與疾病相關(guān)的MG53受體結(jié)構(gòu)基因中的核苦酸多態(tài)性存在情況。多態(tài)性已經(jīng)^皮確定與疾病嚴(yán)重性相關(guān)(見(jiàn)Zhong等,SimultaneousdetectionofmicrosatelliterepeatsandSNPsinthemacrophagemigrationinhibitoryfactor(MG53)genebythin-filmbiosensorchipsandapplicationtoruralfieldstudies.A^/c/e/c爿c/(is1Aes.2005Aug2;33(13》el21;Donn等，Afunctionalpromoterhaplotypeofmacrophagemigrationinhibitoryfactorislinkedandassociatedwithjuvenileidiopathicarthritis.JW/2Wto2004May;50(5》1604-10;為了所有的目的，其全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考)。如本文中使用的，"MG53或MG53受體基因"或"MG53或MG53受體結(jié)構(gòu)基因"包4舌5'UTR、3'UTR、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、MG53或MG53受體基因的內(nèi)含子和外顯子DNA以及MG53或MG53受體基因mRNA或cDNA序列。如普通4支術(shù)人員將能理解的，與組織<多復(fù)病癥相關(guān)乂人而可用作根據(jù)本發(fā)明方法的診斷標(biāo)志物的MG53或MG53受體基因多態(tài)性，可存在于之前才是到的核酸區(qū)域中的4壬4可一個(gè)中。用于多態(tài)性鑒定和監(jiān)測(cè)的技術(shù)在本領(lǐng)域中已經(jīng)為人所知，并在4受予Wohlgemuth的美國(guó)專利第6,905,827號(hào)中詳細(xì)論述，為了所有的目的，該專利全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考。本發(fā)明的某些方面涵蓋通過(guò)一個(gè)或多個(gè)DNA分子沖企測(cè)基因表達(dá)或多態(tài)性的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)DNA分子具有一個(gè)可4企測(cè)對(duì)應(yīng)于序列表中所示寡核苦酸的基因的表達(dá)的核芬酸序列。在一種形式中，該寡核苷酸檢測(cè)一種被差異表達(dá)的基因的表達(dá)。該基因表達(dá)系統(tǒng)可以為候選文庫(kù)、i貪斷試劑、i貪斷寡核苷酸集或診斷纟果針集。該DNA分子可以為基因《且DNA、RNA、蛋白沖亥酉吏(PNA)、cDNA或合成的寡核苷酸。遵照本文教導(dǎo)的操作步驟，人們可鑒定感興趣的基因，用于分析基因表達(dá)或多態(tài)性。這些序列可以預(yù)測(cè)疾病狀態(tài)。本發(fā)明的診斷性寡核苷酸如本文中^f吏用的，術(shù)語(yǔ)"核酸分子"包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、利用核香酸類似物生成的DNA或RNA類々乂物、和其書(shū)亍生物、片,殳和同系物。該核酸分子可以為單鏈或雙鏈，4旦優(yōu)選包含》又鏈DNA。在某些方面，本發(fā)明涉及i貪斷性寡核苦酸和一種或多種"^斷性寡核香酸集，因此在一個(gè)個(gè)體的#1康狀態(tài)與該個(gè)體RNA表達(dá)或?qū)?yīng)于該核苷酸序列的蛋白產(chǎn)物之間存在一種關(guān)耳關(guān)性。在某些情況下，對(duì)于該檢測(cè)，〗又需要一個(gè)寡核苦酸。i貪斷性寡核香酸集(組，set)的成員可利用任何能夠檢測(cè)RNA或蛋白產(chǎn)物的表達(dá)或多態(tài)性的方式進(jìn)行鑒定，包括但不限于差異表達(dá)篩選、PCR、RT-PCR、SAGE分析、高通量測(cè)序、微陣列、脂質(zhì)或其他陣列、基于蛋白的方法(例29^口蛋白印跡、蛋白質(zhì)纟且學(xué)、質(zhì)"i普和本文中描述的其^也方法)和凄丈才居挖掘方法，如本文中進(jìn)一步描述的。在本發(fā)明中，按照熟知的分子生物學(xué)技術(shù)處理核酸和/或蛋白。用于大量這種才喿4乍的詳細(xì);充禾呈在例:^口Ausubel等.CurrentProtocolsinMolecularBiology(supplementedthrough2000)JohnWiley&Sons:NewYorkC'Ausubel");Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual(2ndEd.),Vol.1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989("Sambrook"),以及Berger禾口KimmelGuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.("Berger")中力口以闡述?；蚍中统吮磉_(dá)譜和臨床資料的關(guān)聯(lián)之外(或者與其結(jié)合)，常常需要將表達(dá)模式與個(gè)體在一個(gè)或多個(gè)基因位點(diǎn)的基因型相聯(lián)系，或?qū)蓚€(gè)表達(dá)譜和基因位點(diǎn)與臨床數(shù)據(jù)相聯(lián)系。所選位點(diǎn)可以為例如對(duì)應(yīng)于4矣選文庫(kù)中一個(gè)或多個(gè)成員的染色體位點(diǎn)、標(biāo)志物yf立點(diǎn)的多態(tài)性等^f立基因，或者已4口為一種疾病(或疾病才示準(zhǔn))或^^人與疾病(疾病標(biāo)準(zhǔn))相關(guān)的替代性疾病相關(guān)位點(diǎn)。事實(shí)上，應(yīng)該理解，如果一個(gè)位點(diǎn)的(多態(tài)性)等4立基因與一種疾病(或?qū)σ环N疾病的易感性)相關(guān)，則該等位基因的存在本身可作為一種疾病標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)已存在多種熟知的方法用于評(píng)估個(gè)體的基因型，除了多種其他有用的方法之外，還包括DNA印跡分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析(例如通過(guò)PCR、Taqman或分子信標(biāo))。多種這些梯:作步驟容易針對(duì)高通量和/或自動(dòng)化(或半自動(dòng))樣品制備和分析方法進(jìn)行調(diào)整。才羊品中^1欠集的沖亥酸沖羊品上實(shí)施。示例性4支術(shù)在例如上述Sambrook和Ausubel中有所4苗述。本發(fā)明的特點(diǎn)還在于核酸分子，例如酶性核酸分子、反義核酸分子、誘餌、雙鏈RNA、三鏈寡核苷酸和/或適配體，以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，例如調(diào)節(jié)編石馬MG53蛋白的基因、MG53蛋白或MG53受體結(jié)合蛋白或MG53受體蛋白的基因表達(dá)。特別地，本發(fā)明的特點(diǎn)在于基于核酸的分子以及用來(lái)調(diào)節(jié)MG53蛋白或MG53受體蛋白表達(dá)的方法。本發(fā)明的特點(diǎn)在于一種或多種基于酶性核酸的分子以及獨(dú)立或聯(lián)合地調(diào)節(jié)編碼MG53蛋白的一種或多種基因、MG53蛋白或MG53受體結(jié)合蛋白和/或MG53受體蛋白例如小窩蛋白-3的表達(dá)的方法。下文對(duì)多個(gè)方面和實(shí)施方式的描述參照示例性MG53和MG53受體基因而^是供。然而，這些多個(gè)方面和實(shí)施方式也涉及這樣的基因，其編碼其他MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因的同系物、直系同源和旁系同源，且包括所有的異構(gòu)體、剪4妄變體和多態(tài)性?？衫盟鲇糜贛G53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因的方法來(lái)分析那些其他基因的耙位點(diǎn)。因此，這些其他基因的才中制以及這種4中制的歲丈應(yīng)可^r本文所述而實(shí)施。"下調(diào)"的意思是，基因的表達(dá)或者RNA、或編碼一種或多種蛋白的等歲文RNA的水平、或者一種或多種蛋白(例如MG53和MG53受體基因)的活性，降至不存在本發(fā)明核酸分子時(shí)觀察到的水平以下。在一種實(shí)施方式中，用酶性核酸分子的抑制或下調(diào)優(yōu)選低于在31存在酶失活或減弱分子時(shí)觀察到的水平，其中，所述酶失活或減弱分子能夠結(jié)合到靶RNA上的相同位點(diǎn)但不能切割該RNA。在另一種實(shí)施方式中，用反義寡核普酸抑制或下調(diào)優(yōu)選^f氐于在存在例如含錯(cuò)配序列或含錯(cuò)S己的寡核苷酸時(shí)觀察到的水平。在另一種實(shí)施方式中，用本發(fā)明的核酸分子對(duì)MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因的抑制或下調(diào)，在該核酸分子存在時(shí)，與其不存在時(shí)相比更強(qiáng)。"上調(diào)"的意思是，基因的表達(dá)或者RNA、或編碼一種或多種蛋白亞單位的等效RNA的水平、或者一種或多種蛋白亞單位(例如MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因)的活性，高于不存在本發(fā)明核酸分子時(shí)觀察到的水平。例如，可以增加基因如MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因的表達(dá)，以治療、預(yù)防、緩解或調(diào)節(jié)由于基因表達(dá)缺乏或水平較低而？1起或加劇的病態(tài)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種通過(guò)上調(diào)MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因的表達(dá)、釋放和/或活性而用于治療或預(yù)防力旁力光過(guò)度活動(dòng)癥的方法。"調(diào)節(jié)"的意思是，基因表達(dá)、RNA或編碼一種或多種蛋白的等效RNA的水平、或者一種或多種蛋白的活性，-故上調(diào)或下調(diào)，從而使得該表達(dá)、水平或活性高于或低于不存在本發(fā)明核酸分子時(shí)觀察到的水平。"基因"是指編碼RNA的核酸例如，包括f旦不限于編碼多肽的區(qū)段的核酸序列。"互補(bǔ)性"指的是核酸通過(guò)傳統(tǒng)Watson-Crick或其他非傳統(tǒng)類型與另一個(gè)RNA序列形成一個(gè)或多個(gè)氫4建的能力。通過(guò)"RNA"表示包含至少一個(gè)核糖核苦酸殘基的分子。通過(guò)"核糖核普酸"或"2，-OH"表示在D-核-p夫喃糖部分的2'位具有羥基的核香酸。通過(guò)"核苷酸"表示與磷酸化糖形成N-糖苷鍵的雜環(huán)含氮堿基。在本領(lǐng)域中，可認(rèn)為核苷酸包含天然石威基(標(biāo)準(zhǔn))以及本領(lǐng)域中熟知的》務(wù)飾》咸基。這些;咸基通常位于核苦酸糖部分的r位。核芬酸通常包括堿基、糖和磷酸基團(tuán)。該核香酸在糖、磷酸和/或堿基部分可為未^f多飾或^fif飾的(也可互換:地稱為核苦酸類似物、<奮飾的核普酸、非天然核苦酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷g交等；見(jiàn)例如上文的Usman和McSwiggen;Eckstein等，InternationalPCTPublicationNo.WO92/07065;Usman等，InternationalPCTPublicationNo.WO93/15187;Uhlman&Peyman,其全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考)。本領(lǐng)域中已知存在幾個(gè)》務(wù)飾的核酸石咸基的實(shí)例，如由Limbach等，1994，NucleicAcidsRes.22,2183所總結(jié)的?？梢霙_亥酸內(nèi)的經(jīng)4匕學(xué)1多飾和其4也天然核酸堿基的一些非限制性實(shí)例包括例如肌普、。票呤、嘧咬-4-酮、嘧咬-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三曱氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-曱基胞苷)、5-烷基尿香(例如核糖胸核苷)、5-卣素尿核苷(例如5-溴尿核苷)或6-氮雜嘧。定或6-烷基嘧"定(例如6-曱基尿苷)、丙炔、Q核苷酸(quesosine)、2-石克尿核普、4國(guó)石克尿核香、wybutosine、wybutoxosine、4-乙酰替丁(4-acetyltidine)、5-(羧基羥曱基)尿核*、5，-羧曱基氨曱基-2-疏尿核苷、5-羧曱基氨曱基尿核苷、P-D-半乳糖Q核苷、l-曱基腺苷、l-曱基肌苷、2，2-二曱基鳥(niǎo)苷、3-甲基胞苷、2-曱基腺苷、2-曱基鳥(niǎo)苷、N6-曱基腺苷、7-曱基鳥(niǎo)苦、5-甲氧氨曱基-2-硫尿核苷、5-曱基氨曱基尿核苷、5-曱基羰曱基尿核苷、5-曱氧基尿核苷、5-曱基-2-硫尿核苷、2-曱硫基-N6-異戊烯腺苷、(3-D-甘露糖Q核香、尿苷-5-氧基乙酸、2-巰基胞苷、蘇氨酸衍生物等(上文Burgin等，1996，Biochemistry,35,14090;Uhlman&Peyman)。在該方面，通過(guò)"修飾石威基"表示r位除腺。票呤、鳥(niǎo)噤呤、胞嘧咬和尿嘧咬之外的核苷酸^咸基或其等價(jià)物；這些堿基可用于任何位置，例如，位于酶性核酸分子的4崔〗匕中心和/或該核酸分子的底物結(jié)合區(qū)。通過(guò)"酶性核酸分子"表示一種核酸分子，其在底物結(jié)合區(qū)與特定的基因靶標(biāo)具有互補(bǔ)性，且還具有或介導(dǎo)一種酶活性，而該活性可有效的特異性切割耙RNA。即，該酶性核酸分子能夠單獨(dú)或作為酶復(fù)合體的一個(gè)組成部分在分子間切割RNA，從而滅活耙RNA分子。這些互補(bǔ)區(qū)可l吏該酶性核酸分子與輩巴RNA充分雜交,人而實(shí)現(xiàn)j切割。優(yōu)選100%的互補(bǔ)性，但低至50-75%的互補(bǔ)性在本發(fā)明中也有用(見(jiàn)例如Werner和Uhlenbeck,1995，NucleicAcidsResearch,23，2092-2096;Hammann等，1999,AntisenseandNucleicAcidDrugDev.,9，25-31)。該核S吏可在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)處加以修飾。術(shù)語(yǔ)"酶性核酸"可與術(shù)語(yǔ)如核并唐酶(或核酶，ribozymes)、催化性RNA、酶性RNA、催4匕性DNA、適配核酶(aptazyme)或適配體結(jié)合的核酶、可調(diào)控核酶、催化性寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、脫氧核酶酶(DNAzyme)、RNA酶、siRNA、孩i小RNA、小發(fā)夾RNA、內(nèi)切核沖唐氺亥酸酶、RNA"i秀導(dǎo)的沉,默復(fù)合體、內(nèi)切核酸酶、小酶、導(dǎo)酶(leadzyme)、寡聚酶(oligozyme)或DNA酶互換4吏用。所有這些技術(shù)均描述了具有酶活性的核酸分子。本申請(qǐng)中描述的特異性酶性核酸分子在本發(fā)明中是非限制性的，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明的酶性核酸分子中非常重要的是其具有一個(gè)特異的底物結(jié)合位點(diǎn)，其與一個(gè)或多個(gè)靶核酸區(qū)域互補(bǔ)，且在該底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部或周?chē)渚哂锌蒮武予該分子34以核酸切割和/或連4妄活性的核苷酸序列(Cech等，美國(guó)專利第4,987,071號(hào)；Cech等，1988,260JAMA3030)。目前已々口酶,I"生RNA的幾種變體。每一種均可在生-里條^f牛下反式催化RNA磷酸二酯^:的水解(從而可切割其他RNA分子)。通常，酶性核酸通過(guò)首先結(jié)合于靶RNA而發(fā)揮作用。這種結(jié)合通過(guò)酶性核酸的耙結(jié)合部分(其緊鄰于該分子中可用來(lái)切割靶RNA的酶部分)而發(fā)生。因此，該酶性核酸首先識(shí)別靶RNA然后通過(guò)互補(bǔ)石咸基配對(duì)結(jié)合到該耙RNA，一旦結(jié)合于正確位點(diǎn)，則通過(guò)酶解作用切割該耙RNA。這種革巴RNA的策略性切割將破壞其直接合成所編碼蛋白的能力。酶性核酸已經(jīng)結(jié)合并切割其RNA輩巴后，則/人該RNA釋》丈以尋莧另一個(gè)草巴標(biāo)，且可重復(fù)結(jié)合并切割新耙標(biāo)。因此，單個(gè)核酶分子能夠切割多個(gè)靶RNA分子。此外，該核酶是基因表達(dá)的高度特異性抑制劑，該抑制特異性不僅依賴于結(jié)合至靶RNA的堿基配對(duì)機(jī)制，而且依賴于靶RNA切割機(jī)制。切割位點(diǎn)附近的單一錯(cuò)配或堿基替換可完全消除核酶的催化活性。如本文中使用的，通過(guò)"核酸分子"表示含有核苷酸的分子。該4t酸可以為單鏈、雙鏈或多鏈，且可包含{奮飾或未#~飾的一亥香酸或非核苷酸或其多種混合物或組合物。通過(guò)MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因的"等效"或"相關(guān)"RNA表示其包括那些與MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因具有同源性(部分或全部)的天然RNA分子，其在多種生物(包括人類、嚙齒類、靈長(zhǎng)類、兔、豬、原生動(dòng)物、真菌、才直物以及其4tM效生物和寄生蟲(chóng))中編石馬與MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和MG53受體基因具有類似功能的蛋白。除了編碼區(qū)外，該等效RNA序列還包括諸如5'-非翻i奪區(qū)、3，-非翻譯區(qū)、內(nèi)含子、內(nèi)含子-外顯子交界處等的區(qū)域。通過(guò)"同源性"表示兩個(gè)或多個(gè)核酸35分子的核苷酸序列部分或完全等同。在某些實(shí)施方式中，同源核酸與MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的同源性。通過(guò)"反義核酸"表示借助于RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸；Egholm等，1993Nature365，566)相互作用而結(jié)合耙RNA并改變?cè)撦叞蚏NA活性的非酶性核酸分子(綜述參見(jiàn)Stein和Cheng,1993Science261,1004以及Woolf等,美國(guó)專利第5,849,902號(hào))。典型地，反義分子沿著該反義分子中單條鄰接序列與革巴序列互補(bǔ)。然而，在某些實(shí)施方式中，反義分子可結(jié)合底物，乂人而^吏得該底物分子形成一個(gè)環(huán)或發(fā)夾，和/或反義分子可結(jié)合乂人而4吏得該反義分子形成一個(gè)環(huán)或發(fā)夾。因而，該反義分子可互補(bǔ)于兩個(gè)(或者，甚至更多個(gè))非相鄰底物序列，或者一個(gè)反義分子的兩個(gè)(或者，甚至更多個(gè))非相鄰序列部分可互補(bǔ)于一個(gè)耙序列，或者二者均存在。為了回顧現(xiàn)有的反義策略，參見(jiàn)Schmajuk等，1999,J.Biol.Chem.，274,21783-21789;Delihas等，1997，Nature,15,751-753;Stein等，1997，AntisenseN.A.DrugDev.,7，151;Crooke，2000，MethodsEnzymol"313，3-45;Crooke,1998,Biotech.Genet.Eng.Rev.，15，121-157;Crooke,1997,Ad.Pharmacol,40,1-49，其全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考。此夕卜，反義DNA可4昔助于DNA-RNA相互作用來(lái)導(dǎo)向RNA,從而激活RNA酶H(RNAseH),其消化二聚體(duplex)中的輩巴RNA。該反義寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)RNAseH活化區(qū)，其能夠激活耙RNA的RNAseH切割。反義DNA可進(jìn)4亍化學(xué)合成或通過(guò)4吏用單鏈DNA表達(dá)載體或其等l介物而表達(dá)。長(zhǎng)雙鏈RNA(dsRNA;通?！?00nt)可用來(lái)沉默多種生物和細(xì)胞類型(例如，蠕蟲(chóng)、果蠅和植物)中靶基因的表達(dá)。一旦引入，該長(zhǎng)dsRNA即進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞途徑，其通常稱為RNA千4尤(RNAi)36途徑。首先，通過(guò)類似于RNaseIII稱為Dicer的酶^1奪該dsRNA加工成20-25個(gè)核普酸(nt)的小干護(hù)GRNA(siRNA)(起始步驟)。然后，該siRNA組裝成含內(nèi)切核并唐核酸酶的稱為RNA"i秀導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的復(fù)合體，在該過(guò)程中解鏈。隨后，該siRNA鏈將RISC引導(dǎo)至互補(bǔ)性RNA分子，其中其切割并石皮壞同源RNA(效應(yīng)步驟)。同源RNA的切割發(fā)生于該siRNA鏈所結(jié)合區(qū)域的中間附近。在哺乳動(dòng)物細(xì)月包中，長(zhǎng)dsRNA(>30nt)的引入啟動(dòng)了強(qiáng)有歲文的拍二病毒反應(yīng)，如通過(guò)非特異性抑制蛋白合成和RNA降解所舉例it明的。然而，通過(guò)siRNA的導(dǎo)入或表達(dá)可繞開(kāi)(bypass)哺乳動(dòng)物的抗病毒反應(yīng)。將dsRNA注射或轉(zhuǎn)染入細(xì)月包和有才幾體內(nèi)，已經(jīng)成為遞送siRNA的主要方法。盡管沉默效應(yīng)持續(xù)若干天，且似乎能傳遞至子代細(xì)胞，但其最終會(huì)減小。然而，最近，多個(gè)研究小組已開(kāi)發(fā)了表達(dá)載體，以在瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)siRNA(參見(jiàn)，例如BrummelkampTR，BernardsR,和AgamiR.(2002).AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.5W置e296:550-553;LeeNS,DohjimaT,BauerQLiH,LiM扁J,EhsaniA,SalvaterraP,andRossiJ.(2002).ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.胸,腸&c/2wo/.20:500-505;MiyagishiM，和TairaK.(2002).U6畫(huà)promoter畫(huà)drivensiRNAswithfoururidine3'overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.7Vafwre5z'otec/mo/.20:497-500;PaddisonPJ,CaudyAA,BernsteinE,HarmonGJ,andConklinDS.(2002).ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.Ge"es1c&Z)ev.16:948-958;PaulCP，GoodPD,WinerI,和EngelkeDR.(2002).EffectiveexpressionofsmallinterferingRNAinhumancells.7V"^^e所她c/mo/.20:505-508;SuiG，SoohooC，AffarE陽(yáng)B，GayF，ShiY,ForresterWC，和ShiY.(2002).ADNAvector-basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.iVoc.7Va/7.Jca^/.5"c/.99(6):5515-5520;YuJ-Y,DeRuiterSL，和TurnerDL.(2002).RNAinterferencebyexpressionofshort-interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells,尸roc.7Via//.爿cad.Sc/.t75！^99(9):6047-6052，其全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考)。一些載體已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于表達(dá)小發(fā)夾RNA(shRNA)，其在體內(nèi)加工成能夠執(zhí)行基因特異性沉默的類似siRNA的分子。所述載體包含位于聚合酶III(polIII)啟動(dòng)子(例如U6或HI啟動(dòng)子)與4-5胸香轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的shRNA序列。該轉(zhuǎn)錄體終止于終止位點(diǎn)的2'位(polIII轉(zhuǎn)錄體天然缺乏多聚A尾)，隨后折疊成具有3，UU-突出部分的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。shRNA的末端在體內(nèi)進(jìn)行加工，將該shRNA轉(zhuǎn)化成約21nt的類似siRNA的分子，其隨后啟動(dòng)RNAi。后一個(gè)發(fā)現(xiàn)與最近對(duì)秀麗小桿線蟲(chóng)(C.e/egara)、果蠅(Z>op/n7a)、植物和4,蟲(chóng)(Trypanosome)進(jìn)4亍的實(shí)-驗(yàn)相關(guān)，其中RNAi已利用4斤疊成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子而i秀導(dǎo)。siRNA載體和表達(dá)系鄉(xiāng)克的應(yīng)用已經(jīng)為人所知,可從Ambion，Inc.(Austin,TX)、Lentigen,Inc.(Baltimore,MD)、Panomics(Fremont,CA)、和Sigma國(guó)Aldrich(ST.Louis,MO)購(gòu)得。在本發(fā)明的另一方面，與革巴RNA分子相互作用并下調(diào)MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因活性的酶性核酸分子或反義分子由插入DNA或RNA載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)。所述重組載體優(yōu)選為DNA質(zhì)4立或病毒載體。酶性4亥酸分子或反義表達(dá)的病毒載體可基于但不限于慢病毒、巨細(xì)胞病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或a病毒來(lái)構(gòu)建。優(yōu)選地，遞送能夠表達(dá)該酶性核酸分子或反義分子的重組載體并使其持續(xù)存在于靶細(xì)胞中?？商娲兀刹捎眠m于酶性核酸分子或反義分子表達(dá)的病毒載體。如有必要，這些載38體可重復(fù)給予。一旦表達(dá)，該酶性核酸分子或反義分子則結(jié)合于耙RNA并下調(diào)其功能或表達(dá)。酶性核酸分子或反義表達(dá)載體的遞送可以為全身性的，如通過(guò)靜月永內(nèi)或月幾肉內(nèi)給予，通過(guò)鄉(xiāng)會(huì)予至,人患者或個(gè)體中外植的耙細(xì)胞，然后重新引入患者或個(gè)體，或通過(guò)任何其他能夠引入所需革巴細(xì)月包內(nèi)的方式。反義DNA可通過(guò)釆用單鏈DNA細(xì)月包內(nèi)表達(dá)載體而表達(dá)。通過(guò)"載體"表示任〗可用來(lái)遞送所需核酸的基于核酸的纟支術(shù)，例^口細(xì)菌質(zhì)并立、病毒沖亥酉交、HAC、BAC等。本發(fā)明的核酸分子可單獨(dú)地、與其他藥物組合或結(jié)合地用來(lái)治療上文討i侖的疾患或病癥。例如，在適于治療的條件下，可單獨(dú)地或與一種或多種藥物組合而對(duì)個(gè)體進(jìn)行治療，或者對(duì)其他恰當(dāng)細(xì)胞進(jìn)4亍治療，這對(duì)本領(lǐng)域中的4支術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。采用特別i殳計(jì)而用于誘導(dǎo)RNA干擾的載體構(gòu)建體相對(duì)于基于寡核苷酸的技術(shù)具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)。最明顯的優(yōu)勢(shì)是穩(wěn)定性和借助可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的i秀導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。載體內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)確^呆shRNA轉(zhuǎn)錄體3皮持續(xù)表達(dá)，而始終〗呆持細(xì)胞水平。因此，該效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間不l象利用注射RNA那樣短暫，后者通常持續(xù)不超過(guò)幾天。且通過(guò)利用表達(dá)構(gòu)建體而非寡核苷酸注射，能夠開(kāi)展基因敲除(geneknockdown)的多代研究，因?yàn)樵撦d體可變成細(xì)胞系內(nèi)的永久固有成分。通過(guò)"三^t連形成寡核苷酸，，或"三纟連寡核苷酸"表示一種可以用序列特異性方式結(jié)合雙鏈DNA而形成三鏈螺旋的寡核苦酸。已證實(shí)這種三鏈螺:旋結(jié)構(gòu)的形成可承卩制草巴基因的4爭(zhēng)錄(Duval-Valentin等,1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,504;Fox，2000,Curr.Med.Chem.7,17-37;Praseuth等，2000，Biochim.Biophys.Acta,1489,181-206)。通過(guò)"雙鏈RNA"或"dsRNA"表示一種與能夠激活細(xì)胞酶的預(yù)定基因序列相匹配的雙鏈RNA,其中該細(xì)胞酶降解相應(yīng)的基因信使RNA轉(zhuǎn)錄體。這些dsRNA稱為短干4尤RNA(siRNA),可用來(lái)抑制基因表達(dá)(見(jiàn)例如Elbashir等，2001,Nature,411,494-498和Bass，2001，Nature,411，428-429)。如本文中4吏用的，術(shù)i吾"雙鏈RNA"或"dsRNA"指能夠RNA干擾"RNAi"的雙鏈RNA分子，包括短干擾RNA"siRNA"，見(jiàn)例如Bass,2001，Nature,411,428-429;Elbashir等，2001,Nature,411,494-498;和Kreutzer等，PCT國(guó)際^>開(kāi)第WO00/44895號(hào)；Zernicka-Goetz等，PCT國(guó)際^>開(kāi)第WO01/36646號(hào)；Fire,PCT國(guó)際^>開(kāi)第WO99/32619號(hào)；Plaetinck等，PCT國(guó)際^>開(kāi)第WO00/01846號(hào)；Mello和Fire,PCT國(guó)際/>開(kāi)第WO01/29058號(hào)；Deschamps-Depaillette,PCT國(guó)際^>開(kāi)第WO99/07409號(hào)；以及Li等，PCT國(guó)際公開(kāi)第WO00/44914號(hào)。本發(fā)明的可下調(diào)MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因表達(dá)的酶性核酸分子、反義核酸或其他核酸分子代表一種治療多種月旁胱疾患和病癥包括M"旦不限于DU、DHIC和^f壬〗可其他病癥的治療途徑，所述病癥對(duì)MG53和MG53受體基因功能的調(diào)節(jié)發(fā)生反應(yīng)。抑制性RNA分子和4支術(shù)的應(yīng)用在本領(lǐng)i或中已為人所知，且在美國(guó)專利第7，022，828號(hào)中進(jìn)行詳細(xì)描述，為了所有的目的，其全部教導(dǎo)均結(jié)合于此供參考。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子長(zhǎng)度可以為約10-100個(gè)核香g臾。例如，本發(fā)明的酶性核酸分子優(yōu)選長(zhǎng)度為約15-50個(gè)核香酸，較優(yōu)選長(zhǎng)度為約25-40個(gè)核苷酸(見(jiàn)例如Jarvis等，1996,J.Biol.Chem.,271,29107-29112)。本發(fā)明的示例性反義分子優(yōu)選長(zhǎng)度為約15-75個(gè)核香酸，較優(yōu)選長(zhǎng)度為約20-35個(gè)核苷酸(見(jiàn)例如Woolf等，1992，PNAS.,89，7305-7309;Milner等，1997，Nature40Biotechnology,15，537-541)。本發(fā)明的示例性三鏈形成寡核苷酸分子優(yōu)選長(zhǎng)度為約10-40個(gè)核苷酸，較優(yōu)選長(zhǎng)度為約12-25個(gè)核苷酸(見(jiàn)例如Maher等，1990,Biochemistry,29,8820-8826;Strobel和Dervan，1990,Science,249,73-75)。本領(lǐng)域中的4支術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到所化本文所預(yù)期反應(yīng)的足夠長(zhǎng)度和恰當(dāng)構(gòu)象。，本發(fā)明核酸分子的長(zhǎng)度不局限于所述的一般性限制。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)(例如下調(diào))MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因表達(dá)的核酸分子包含12-100個(gè)與MG53基因、MG53結(jié)合蛋白基因和/或MG53受體基因的RNA分子互補(bǔ)的堿基。本發(fā)明提供一種用于生成一類基于核酸的基因調(diào)節(jié)劑的方法，該試劑表現(xiàn)出對(duì)所需靶標(biāo)的RNA具有較高程度的特異性。例如，該酶性核酸分子優(yōu)選耙向編碼MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因的靶RNA的一個(gè)高度保守序列區(qū)，因此可提供通過(guò)本發(fā)明的一種或幾種核酸分子而治療疾患或病癥的特未療法。這些核酸分子可才艮據(jù)需要而外源性遞送至特異組織或細(xì)胞耙標(biāo)?？商娲?，該核酸分子(例如核并唐酶和反義分子)可由遞送至特定細(xì)月包的DNA和/或RNA載體表達(dá)。如本文中〗吏用的，"細(xì)月包"以其通常的生物學(xué)意義而應(yīng)用，而不是指整個(gè)多細(xì)月包生物體。細(xì)月包例如可位于體內(nèi)、體外或離體，例如存在于細(xì)l包培養(yǎng)物中，或存在于多細(xì)月包生物體中，該生物體包才舌例如鳥(niǎo)、植物和哺乳動(dòng)物如人類、牛、綿羊、猿、猴、豬、狗和貓。細(xì)月包可以為原核(例如纟田菌纟田月包)或真核(例如哺乳動(dòng)物或才直物細(xì)胞)的。通過(guò)"MG53"、"MG53結(jié)合蛋白"和"MG53受體"蛋白表示包含全長(zhǎng)MG53、MG53結(jié)合蛋白或MG53受體蛋白、其結(jié)構(gòu)域、融合蛋白、嵌合體或片^a的肽或蛋白。本發(fā)明的基于核酸的抑制劑可直接加入或可與包裝于脂質(zhì)體內(nèi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合、或以其他方式遞送至靶細(xì)胞或組織。無(wú)論是否結(jié)合于生物聚合體內(nèi)，該核酸或核酸復(fù)合體都可通過(guò)注射或灌注泵局部主會(huì)予體外、離體或體內(nèi)的相關(guān)組織中。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的特點(diǎn)是具有一個(gè)或多個(gè)非核苷酸部分、并具有切割RNA或DNA分子的酶促活性的酶性核酸分子。在另一種實(shí)施方式中，所述核酸分子如反義分子或核4唐酶可與其他已知療法聯(lián)用以治療上文"i侖及的病癥或疾患。例如，所述分子可與一種或多種已知治療劑4關(guān)合應(yīng)用。反義分子可以為修飾或未修飾的RNA、DNA或混合的聚合寡核苷酸，且主要通過(guò)特異性結(jié)合于引起肽合成抑制(Wu-Pong,November1994,BioPharm,20-33)的匹配序列而發(fā)4軍作用。反義寡核苷酸通過(guò)WatsonCrick;咸基配對(duì)而結(jié)合輩aRNA并通過(guò)阻止所結(jié)合序列的核糖體翻譯而阻斷基因表達(dá)(通過(guò)空間封閉或通過(guò)激活RNaseH酶)。反義分子還可以通過(guò)干4尤RNA加工或乂人月包核至月包質(zhì)的運(yùn)l俞而？文變蛋白合成(Mukhopadhyay&Roth，1996，Crit.Rev.inOncogenesis7,151-190)。此夕卜，單鏈DNA與RNA的結(jié)合可引起異源二聚體的核酸酶降解(上文的Wu-Pong;Crooke)。至今，^又骨架》務(wù)飾的DNA化學(xué)組成(其作為RNaseH的底物)是磷石克酰、二石克代磷酸酯和三氟化硼。最近有才艮道稱含2，-arabino和2-氟-arabino的寡聚物也可以;敫活RNaseH活性。已經(jīng)描述了多種反義分子，其利用化學(xué)修飾核苷酸的新構(gòu)象、二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或RNaseH的底物結(jié)構(gòu):威(Woolf等，PCT國(guó)際公開(kāi)第WO98/13526號(hào)；Thompson等，PCT國(guó)際/>開(kāi)第WO99/54459號(hào)；Hartmann等，于1998年9月21日提交的U.S.Ser.No.60/101,174)，所有這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考。目前已知幾種酶性RNA。此外，幾種體外選擇(進(jìn)化)策略(Orgel，1979,Proc.R.Soc.London,B205,435)已經(jīng)用來(lái)進(jìn)化能夠催化磷酸二酯鍵切割和連接的新核酸催化劑(Joyce,1989,Gene,82,83-87;Beaudry等，1992,Science257，635-641;Joyce,1992,ScientificAmerican267，90-97;Breaker等，1994,TIBTECH12,268;Bartel等,1993，Science261:1411-1418;Szostak，1993,TIBS17,89-93;Kumar等，1995,FASEBJ.，9,1183;Breaker,1996,Curr.Op.Biotech.,7，442;Santoro等，1997,Proc.Natl.Acad.Sci"94,4262;Tang等，1997，RNA3,914;Nakacane&Eckstein,1994,見(jiàn)上文；Long&Uhlenbeck，1994:見(jiàn)上文；Ishizaka等，1995，見(jiàn)上文；Vaish等，1997，Biochemistry36,6495;所有這些均結(jié)合于此供參考)。每一種均可催化一系列反應(yīng)，包括在生理?xiàng)l件下反式水解磷酸二酯4建(且因此可切割其他RNA分子)。酶性核酸分子的酶性性質(zhì)可4吏實(shí)現(xiàn)治療性療法所必需的酶性核酸分子濃度較低。這反映了酶性核酸分子發(fā)揮酶促作用的能力。因此，單個(gè)酶性核酸分子能夠切割耙RNA的4艮多分子。此外，酶性核酸分子是一種高度特異性抑制劑，該抑制特異性不僅依賴于與耙RNA結(jié)合的;咸基配對(duì)才幾制，還依賴于輩巴RNA切割才幾制?？蛇x4奪切割^f立點(diǎn)附近的單個(gè)確晉配或堿基^^換，以大大減弱酶性核酸分子的催化活性。具有內(nèi)切核酸酶的酶活性的核酸分子能夠以核苷酸石咸基序列特異性方式重復(fù)切割其他單個(gè)RNA分子?？蒦f吏這種酶性核酸分子耙向幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄體，并實(shí)現(xiàn)體外高效切割(Zaug等，324,Nature4291986;Uhlenbeck,1987Nature328,596;Kim等，84Proc.Natl.Acad.Sci.USA8788，1987;Dreyfus,1988,EinsteinQuart.J.Bio.Med.，6,92;Haseloff和Gerlach,334Nature585，1988;Cech,260JAMA3030,1988;以及Jefferies等，17NucleicAcidsResearch1371,1989;Santoro等，1997,見(jiàn)上文)。由于其序列特異性，反式切割的酶性核酸分子可用作人類疾病的治療劑(Usman&McSwiggen，1995Ann.Rep.Med.Chem.30,285-294;Christoffersen和Marr，1995J.Med.Chem.38，2023-2037)。酶性核酸分子經(jīng)i殳計(jì)可切割位于細(xì)力包RNA背景內(nèi)部的特異性RNA靶標(biāo)。這種切割使得RNA無(wú)功能，并消除由該RNA的蛋白表達(dá)。以該方式，可選才奪性抑制與疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白合成(Warashina等，1999,ChemistryandBiology,6，237-250)。本發(fā)明的酶性核酸分子可通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)進(jìn)4亍調(diào)節(jié)("同種異型酶")，可用來(lái)調(diào)節(jié)MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因表達(dá)。這些異構(gòu)酶性核酸或同種異型酶(見(jiàn)例如George等，美國(guó)專利第5,834,186和5,741,679號(hào)；Shih等，美國(guó)專利第5,589,332號(hào)；Nathan等，美國(guó)專利第5,871,914號(hào)；Nathan和Ellington,PCT國(guó)際7>開(kāi)第WO00/24931號(hào)；Breaker等，PCT國(guó)際一^開(kāi)第WO00/26226和98/27104號(hào)；以及Sullenger等，PCT國(guó)際/>開(kāi)第WO99/29842號(hào))經(jīng)設(shè)計(jì)可對(duì)信號(hào)劑發(fā)生反應(yīng)，其隨后調(diào)節(jié)該酶性核酸分子的活性并調(diào)節(jié)MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體基因的44表達(dá)。響應(yīng)與預(yù)定信號(hào)劑的相互作用，異構(gòu)酶性核酸分子的活性被激活或抑制，使得特定靶標(biāo)的表達(dá)選擇性地被下調(diào)。該耙標(biāo)可包括MG53、MG53結(jié)合蛋白、和/或MG53受體基因。寡核苦酸(例如，反義分子，GeneBlocs)利用本領(lǐng)域中已知的策略合成，長(zhǎng)口在Caruthers等，1992，MethodsinEnzymology211,319;Thompson等，PCT國(guó)際/>開(kāi)第WO99/54459號(hào)；Wincott等，1995，NucleicAcidsRes.23,26772684;Wincottetal.,1997,MethodsMol.Bio.，74,59，Bre腿netal,1998,BiotechnolBioeng.,61，3345,以及Brennan,美國(guó)專利第6,001,311號(hào)中所描述的。所有這些參考文獻(xiàn)均結(jié)合于此供參考。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，小規(guī)才莫合成在394AppliedBiosystems,Inc.的合成儀(synthesizer)上進(jìn)行。可替代地，本發(fā)明的核酸分子可單獨(dú)合成，并于合成后連4妄在一起，例如通過(guò)連4姿作用(Moore等，1992，Science256，9923;Draper等，PCT國(guó)際7>開(kāi)第WO93/23569號(hào)；Shabarova等，1991,NucleicAcidsResearch19,4247;Bellon等，1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951;Bellon等，1997,BioconjugateChem.8,204)。本發(fā)明的核酸分子可以通過(guò)用抗核酸酶基團(tuán)如2，-氨基、2，-C-烯丙基、2，-氟基、2，-0-曱基、2，-H廣泛修飾，而增加穩(wěn)定性(綜述參見(jiàn)Usman和Cedergren,1992,TIBS17，34;Usman等，1994,NucleicAcidsSymp.Ser.31，163)。盡管用磷硫酰、硫代磷酸酯和/或5，-甲基磷酸酯鍵化學(xué)修飾寡核苦酸的核苷酸之間的4建合可改善穩(wěn)定性，^旦這些^f奮飾過(guò)多則可能引起某種毒性。因此，當(dāng)設(shè)計(jì)核酸分子時(shí)，應(yīng)將這些核苷酸之間的鍵合的量降到最低。這些鍵濃度的下降可降低毒性，引起這些分子的效力增加且特異性提高。45本發(fā)明還提供具有可保持或增強(qiáng)活性的化學(xué)修飾的核酸分子。與未^奮飾核酸相比，這種核酸通常還對(duì)核酸酶具有4交高的抗性。優(yōu)選核酸分子對(duì)核酸酶具有抗性，以作為有效的細(xì)胞內(nèi)治療劑而發(fā)揮作用。RNA和DNA4匕學(xué)合成的改善(Wincott等，1995NucleicAcidsRes.23,2677;Caruthers等，1992，MethodsinEnzymology211，3-19)(結(jié)合于此供參考)已經(jīng)擴(kuò)大了通過(guò)引入核苦酸l奮飾而修飾核酸分子的能力，以增加其核酸酶穩(wěn)定性，如上文所述。采用本發(fā)明的基于核酸的分子可通過(guò)提供組合療法的可能性而形成對(duì)疾病惡化的較好療法(例如，針對(duì)不同基因的多種反義或酶性核酸、與已知小子的組合的間歇療法)。利用核酸分子治療個(gè)體還可包括不同類型核酸分子的組合。在一種實(shí)施方式中，提供了具有可保持或增強(qiáng)酶活性的化學(xué)修飾的核酸催化劑。與未<奮飾核酸相比，這種核酸通常還對(duì)核酸酶具有4交高的纟元性。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的特點(diǎn)在于修飾的酶性核酸分子，其具有石粦酸骨架^奮飾，包4舌一個(gè)或多個(gè)碌i/R/粦酸酯、二辟L/R/粦酸酯、曱基磷酸酯、嗎啉代、氨基曱酸酰胺化物(amidatecarbamate)、羧曱基、乙酰胺化物(acetamidate)、聚酰胺、磺酸鹽(酯)、磺酰胺、氨基磺酸鹽(西旨)、formacetal、thioformacetal和/或曱石圭》克基、耳又等。關(guān)于寡核苷酸骨架^奮飾的綜述，參見(jiàn)Hunziker和Leumann，1995，NucleicAcidAnalogues:SynthesisandProperties,inModernSyntheticMethods,VCH，331-417,以及Mesmaeker等，1994,NovelBackboneReplacementsforOligonucleotides,inCarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,ACS，24-39。這些參考文獻(xiàn)均結(jié)合于此供參考。可對(duì)核酸(例如，反義分子和核糖酶)結(jié)構(gòu)4故多種^f奮飾以增強(qiáng)這些分子的效用。例如，這些j'務(wù)飾可增加^f呆存時(shí)間、體外半衰期、生物可利用度、穩(wěn)定性并方便將這些寡核苷酸導(dǎo)入靶位置，包括例如增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性和賦予識(shí)別并結(jié)合耙細(xì)胞的能力。核酸分子的給予。用于遞送核酸分子的方法在Akhtar等，1992,TrendsCellBio.,2,139;以及DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar,1995中力口以描述，二者均結(jié)合于此供參考。Sullivan等，PCTWO94/02595進(jìn)一步描述了用于遞送酶性RNA分子的一般方法。可利用這些步驟遞送幾乎任何核酸分子?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通l支術(shù)人員已知的多種方法將核酸分子給予至細(xì)胞，包括zf旦不限于封裝于脂質(zhì)體中、通過(guò)離子透入法或通過(guò)結(jié)合至其他載體如水凝膠、環(huán)糊精、可生物降解的納米膠嚢以及生物粘附性微球內(nèi)。可替代地，核酸/載體組合通過(guò)直接注射或通過(guò)利用灌注泵而局部遞送。其他遞送途徑包括但不限于口服(片劑或丸劑形式)和/或鞘內(nèi)遞送(Gold,1997，Neuroscience,76,1153-1158)。其他方法包括采用多種運(yùn)輸和載體系統(tǒng)，例如通過(guò)^f吏用偶聯(lián)物(或結(jié)合物，conjugate)和可生物降解的聚合物。關(guān)于藥物遞送策略的詳盡綜述包括CNS遞送，參見(jiàn)Ho等，1999,Curr.Opin.Mol.Ther.,1，336-343和Jain，DrugDeliverySystems:TechnologiesandCommercialOpportunities,DecisionResources,1998以及Groothuis等，1997,J.NeuroVirol"3，387-400。本發(fā)明的分子可用作藥劑。該藥劑預(yù)防、抑制個(gè)體的疾病狀態(tài)出現(xiàn)或者治療(某種程度上減弱癥狀，優(yōu)選全部癥狀)該疾病?？赏ㄟ^(guò)任何通用方式給予本發(fā)明的帶負(fù)電的多核香酸(例如RNA、DNA或蛋白)并導(dǎo)入患者體內(nèi)，可以用或不用穩(wěn)定劑、緩沖夜等，以形成藥物組合物。如果需要采用脂質(zhì)體遞送才幾制，可遵照用于形成脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)步驟。還可配制本發(fā)明的組合物并用作口服給予的片劑、膠嚢或酏劑；直腸給予的栓劑；無(wú)菌溶液；可注射給予的混懸液以及本領(lǐng)域中已知的其他組合物。本發(fā)明還包括所述化合物的藥用制劑。這些制劑包括上述化合物的鹽，例如酸力。成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、乙酸和苯石黃酸。藥物組合物或制劑指形式為適于給予(如全身給予)至細(xì)胞或個(gè)體(優(yōu)選人類)的組合物或制劑。通過(guò)"全身給藥"表示體內(nèi)全身吸收或藥物在血流中累積后分布于全身。恰當(dāng)?shù)男问讲糠忠蕾囉谑褂没蜻M(jìn)入的途徑，例如口月良、經(jīng)皮或通過(guò)注射。這些形式不應(yīng)該阻止所述組合物或制劑到達(dá)耙細(xì)胞(即，預(yù)期該帶負(fù)電聚合物所遞送至的細(xì)月包)。例3。，注射入血力t內(nèi)的藥物iBL合物應(yīng)該為可-容性的。其他因素在本領(lǐng)域中也是已知的，包括考慮如毒性以及阻止組合物或制劑發(fā)揮作用的劑型?？梢鹑砦盏慕o藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、吸入、口服、肺內(nèi)和肌內(nèi)。已證實(shí)藥物進(jìn)入循環(huán)的速率是分子量或大小的函數(shù)。采用包含本發(fā)明化合物的脂質(zhì)體或其他藥物載體可能能夠4吏藥物定位于例如某些組織類型中，如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的組織中?？纱龠M(jìn)藥物與細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面結(jié)合的脂質(zhì)體制劑也非常有用。通過(guò)藥用制劑，表示一種可將本發(fā)明的核酸分子有效分布于最適于其預(yù)期活性的身體部位的組合物或制劑。適于與本發(fā)明的核酸分子一起制備的試劑的非限制性實(shí)例包括PEG偶聯(lián)的核酸、磷脂偶聯(lián)的核酸、含親脂基團(tuán)的核酸、石危代磷酸S旨、P-糖蛋白抑制劑(如PluronicP85),其可促進(jìn)藥物進(jìn)入不同組織例如CNS(Jolliet-Riant和Tillement,1999,Fundam.Clin.Pharmacol"13,16-26);可生物P爭(zhēng)解的聚合物如聚(DL-丙交酯-乙交酯)微球，用于植入后持續(xù)釋放48寸生遞送(Emerich，DF等，1999,CellTransplant,8,47-58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.;以及負(fù)載納米顆粒如那些用聚丁基氰基丙烯酸酯制成的納米顆4立，其可越過(guò)血腦屏障遞送藥物并可改變神經(jīng)吸收才幾制(ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,23,941-949,1999)。遞送策略的其他非限制性實(shí)例包括核酸分子的CNS遞送，包括Boado等，1998，J.Pharm.Sci.,87,1308-1315;Tyler等，1999,FEBSLett.,421，280-284;Pardridge等，1995,PNASUSA.,92,5592-5596;Boado,1995，Adv.DrugDeliveryRev.，15,73-107;Aldrian畫(huà)Herrada等，1998,NucleicAcidsRes.，26，4910-4916;以及Tyler等，1999，PNASUSA.,96,7053-7058中描述的材并+。所有這些參考文獻(xiàn)均結(jié)合于此供參考。本發(fā)明的特點(diǎn)還在于包含表面修飾的脂質(zhì)體的組合物的應(yīng)用，該脂質(zhì)體包含多聚(乙二醇)脂質(zhì)(PEG修飾，或長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體或隱形脂質(zhì)體)。本發(fā)明的核酸分子還可包括不同分子量的共價(jià)連接的PEG分子。這些制劑提供用于增加靶組織內(nèi)藥物累積的方法。這類藥物載體通過(guò)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS或RES)4氐抗調(diào)理作用和清除，/人而實(shí)現(xiàn)4交長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間并促進(jìn)組織暴露于封裝藥物(Lasic等.Chem.Rev.1995,95,2601-2627;Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)?；谄浔苊庠诖鷍射壽交強(qiáng)的MPS組織如肝臟和脾臟堆積的能力，與陽(yáng)離子脂質(zhì)體相比，長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體還可能較大程度地保護(hù)藥物不被核酸酶降解。所有這些參考文獻(xiàn)均結(jié)合于此供參考。本發(fā)明還包括用于儲(chǔ)存或給予而制備的組合物，其包括存在于藥用載體或稀釋劑中的藥物有效量的所需化合物。用于治療的可接受載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域中為人熟知，且在例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中加以描述，其結(jié)合于此供參考。例如，可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染并+和調(diào)t朱劑。這些包括苯曱酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸的酯類。此外，可采用抗氧化劑和懸浮劑。藥物有效劑量或藥物有效量即預(yù)防、抑制個(gè)體的疾病狀態(tài)出現(xiàn)或者治療(某種程度上減弱癥狀，優(yōu)選全部癥狀)該疾病所需的劑量。藥物有效劑量依賴于疾病類型、所采用的組合物、給藥途徑、所治療哺乳生物的類型、要治療的特定哺乳動(dòng)物的身體特4正、同時(shí)用藥情況以及醫(yī)療領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的其他因素。通常，根據(jù)該帶負(fù)電聚合物的效力，給予用量為0.1mg/kg-1000mg/kg體重/天的活性成分。所述制劑可口力良、局部、胃腸外、通過(guò)吸入或噴霧或者直腸給予，所用單位劑量制劑包含常規(guī)無(wú)毒性藥用載體、佐劑和賦形物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)胃腸外包括經(jīng)皮、皮下、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、月幾內(nèi)或鞘內(nèi)注射或灌注4支術(shù)等。此外，4是供一種包括本發(fā)明的核酸分子與藥用載體的藥物制劑。本發(fā)明的一種或多種核酸分子可與一種或多種無(wú)毒性藥用載體和/或3希釋劑和/或佐劑，以及如果需要，其他活性成分相結(jié)合而存在。本發(fā)明的藥物組合物可以為適于口服應(yīng)用的形式，例如片劑、錠劑、糖錠劑、水性或油性混懸液、可分散性粉末或顆粒、乳劑、硬或軟力交嚢或者糖漿劑或酏劑。計(jì)劃口服應(yīng)用的組合物可按照本領(lǐng)域中已知用于制造藥物組合物的任何方法而制備，這些組合物可包含一種或多種如甜味劑、調(diào)p木劑、著色劑或防腐劑，以才是供精致且可口的藥物制劑。片劑包含的活性成分與無(wú)毒性藥用賦形劑(其適于制造片劑)形成混合物。這些賦形劑可為例如惰性稀釋劑如碳酸4丐、碳酸鈉、乳糖、磷酸4丐或磷酸鈉；制粒和崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可未經(jīng)涂布或者其可以利用已知^支術(shù)進(jìn)^f亍涂布。在某些情況50下，這些涂層可通過(guò)已知可延緩崩解和胃腸道內(nèi)吸收的技術(shù)而制備，從而提供較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的持續(xù)作用。例如，可應(yīng)用時(shí)間延緩材料如單^更脂酸甘油酯或二;更脂酸甘油酯?？诜?yīng)用的制劑還可以硬明膠膠嚢的形式而提供，其中活性成分與一種惰性固體稀釋劑如碳酸4丐、磷酸鈣或高嶺土混合，或以軟明膠膠嚢的形式而提供，其中活性成分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄;f覽油混合。水'性混懸液包含與適于制造水性混懸液的賦形劑形成混合物的活性材料。這樣的賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基-曱基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠；分散或潤(rùn)濕劑可以為天然存在的磷脂，例如卵磷脂或脂肪酸與烯基氧化物的縮合產(chǎn)物例如硬脂酸聚氧乙烯，或者長(zhǎng)鏈脂肪醇與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如十七烷乙烯基氧鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或者來(lái)自月旨肪酸和己并唐醇的<扁西旨與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或者來(lái)自脂肪酸和無(wú)水己4唐醇的偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯去山梨灃唐醇單油酸酯(或聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，polyoxyethylenesorbitanmonooleate)。該水性混懸液可含有一種或多種防腐劑長(zhǎng)口乙基、或正丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；一種或多種著色劑；一種或多種調(diào)p木劑；以及一種或多種甜p木劑如蔗糖或糖精。油性混懸液可通過(guò)將活性成分懸浮于植物油例如花生油、橄欖油、麻油或初卩子油或懸浮于石戶物油》口'液體石蠟中而制備。該油'j"生〉'昆懸液可含有增稠劑例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。可加入甜味劑和調(diào)味劑以提供美p木的口服制劑。這些組合物可通過(guò)加入抗氧化劑如抗壞血酸而保存。適于通過(guò)加入水而制備水性混懸液的可分散粉末和顆粒^是供與分散劑或濕潤(rùn)劑、懸浮劑以及一種或多種防腐劑形成混合物的活性成分。恰當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶?rùn)劑或懸浮劑可由上文已提到的那些而舉例說(shuō)明。還可存在其他賦形劑，例如甜P未劑、調(diào)味劑和著色劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以為水包油乳液的形式。油相可以為才直物油或礦物油或這些油的混合物。'除當(dāng)?shù)娜榛瘎┛蔀樘烊淮嬖诘哪z，例如阿拉伯膠或西黃蓍膠，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂以及來(lái)自脂肪酸和無(wú)水己糖醇的酯或偏酯，例如單油酸去山梨泮唐醇(或山梨并唐醇酐單油酸酯，sorbitanmonooleate),以及所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯單油酸去山梨糖醇。該乳液還可含有甜p未劑和調(diào)p未劑。糖漿劑和酏劑可利用甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖而制備。這些制劑還可包含緩和劑、防腐劑以及調(diào)味和著色劑。所述藥物組合物可以為無(wú)菌可注射的水性或油狀混懸液形式。該混懸液可按照已知技藝?yán)媚切┥衔囊烟岬降那‘?dāng)?shù)姆稚⒒驖駶?rùn)劑以及懸浮劑而制備。該無(wú)菌可注射制劑還可為無(wú)毒胃腸外用稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中的溶液?？蓱?yīng)用的可接受々某介和溶劑有7K、林格液和等滲氯化鈉溶液。此外，常^見(jiàn)采用無(wú)菌不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，任何溫和的不4軍發(fā)油均可采用，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制備注射劑。本發(fā)明的核酸分子還可以栓劑的形式給藥，例如用于直腸給藥或者借助導(dǎo)管直接引入膀胱本身。這些組合物可通過(guò)將藥物與恰當(dāng)?shù)姆谴碳ば再x形劑混合而制備，該賦形劑在常溫下是固體，但在直腸溫度下則為液體，因此將在直腸中溶化而釋放藥物。這樣的材料包括可可脂和聚乙二醇。本發(fā)明的核酸分子可在無(wú)菌介質(zhì)中胃腸外給予。該藥物才艮據(jù)所采用的媒介和濃度，可懸浮或溶解于媒介中。有利地，佐劑如局部麻醉劑、防腐劑和纟爰沖劑也可溶解于該々某介中?？膳c載體材料結(jié)合而生成單劑型的活性成分的量隨著所治療的宿主和特定給予模式而有所不同。單位劑型通常包含約lmg至約1000mg的活性成分。應(yīng)該理解，對(duì)于任何特定患者或個(gè)體的特定劑量水平依賴于多種因素，包括所采用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄速率、藥物組合以及待治療特定疾病的嚴(yán)重程度。只于于非人類動(dòng)物的給藥，還可爿夸該ia合物加入動(dòng)物祠^l"或^:用7K中。因?yàn)榕渲苿?dòng)物飼沖+和々大用水組合物可以^艮方〗更，因此動(dòng)物可與其飲食一起攝入治療適當(dāng)量的該組合物。而且可以很方便地將該組合物作為預(yù)混合物4是供，以加入飼料或飲用水中。治療效果。采用多種化合物治療一種指征可增加有益效應(yīng)同時(shí)降低副作用?？商?戈地，本發(fā)明的核酸分子中某些可在細(xì)月包內(nèi)/人真核生物啟動(dòng)子表達(dá)(例如Izant和Weintraub,1985，Science,229，345;McGarry和Lindquist,1986,Proc.Natl.Acad.Sci"USA83,399;Scanlon等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88，105915;Kashani-Sabet等，1992,AntisenseRes.Dev.,2,315;Dropulic等，1992，J.Virol"66,1432化Weerasinghe等，1991，J.Virol"65,55314;Ojwang等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89，108026;Chen等，1992,NucleicAcidsRes"5320，45819;Sarver等，1990Science,247,12221225;Thompson等，1995，NucleicAcidsRes.，23,2259;Good等，1997,GeneTherapy,4，45;所有這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考)。本領(lǐng)域中的普通4支術(shù)人員可i人識(shí)到，4壬4可核酸均可在真才亥細(xì)月包內(nèi)由'除當(dāng)?shù)腄NA/RNA載體表達(dá)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)在于一種表達(dá)載體，其包含的一種核酸序列編碼本發(fā)明的核酸分子中的至少一種。該編碼本發(fā)明核酸分子的核酸序列以可實(shí)現(xiàn)該核酸分子的表達(dá)的方式可才喿作地進(jìn)4亍連接。該核酸分子序列的轉(zhuǎn)錄受用于真核生物RNA聚合酶I(polI)、RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。來(lái)自polII或poim啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄體在所有細(xì)胞內(nèi)均以高水平表達(dá)；在特定細(xì)胞類型中的特定poin啟動(dòng)子的水平依賴于在附近存在的基因調(diào)節(jié)序列(增強(qiáng)子、沉默子等)的性質(zhì)。還可采用原核RNA聚合酶啟動(dòng)子，只要該原核生物RNA聚合酶在恰當(dāng)細(xì)月包內(nèi)表達(dá)(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,6743-7;Gao和H腿g1993,NucleicAcidsRes.,21，2867-72;Lieber等，1993，MethodsEnzymol.,217,47-66;Zhou等，1990,Mol.Cell.Biol"10,4529-37)。所有這些參考文獻(xiàn)均結(jié)合于此供參考。幾個(gè)研究者已經(jīng)證實(shí)，核酸分子(如從這些啟動(dòng)子表達(dá)的核糖酶)可在哺乳動(dòng)物細(xì)月包內(nèi)發(fā)4軍作用(例如Kashani-Sabet等.，1992，AntisenseRes.Dev.,2,3-15;Ojwang等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89，10802-6;Chen等，1992，NucleicAcidsRes"20,4581-9;Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90,6340-4;L'Hui出er等，1992，EMBOJ.,11,4411-8;Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,90,8000-4;Thompson等，1995,NucleicAcidsRes.，23，2259;Sullenger&Cech，1993,Science,262，1566)另一方面，本發(fā)明的特點(diǎn)在于一種表達(dá)載體，其包含的核酸序列編碼本發(fā)明核酸分子中的至少一種，其中編碼方式可實(shí)現(xiàn)該核酸分子的表達(dá)。在一種實(shí)施方式中，該表達(dá)載體包括a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)編碼至少一種所述核酸分子的核酸序列；其中所述序列可#:作性連4妄于所述起始區(qū)和所述終止區(qū)，其連4妾方式可實(shí)現(xiàn)所述核酸分子的表達(dá)和/或遞送。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種試劑盒，其包括適合的容器、以藥用形式置于其中的本發(fā)明的治療劑及其4吏用i兌明書(shū)。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種分離的核酸分子包括一種核酸分子，其是MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體核苷酸序列的互補(bǔ)物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"指核酸分子的核芬酸單^f立之間的Watson-Crick或Hoogsteen石威基配對(duì)，術(shù)^吾"結(jié)合"意指兩個(gè)多肽或化合物或者相關(guān)多肽或化合物之間的物理性或化學(xué)性相互作用或者其組合。結(jié)合包括離子、非離子、范德華、疏水性相互作用等。物理性相互作用可為直4妄或間*接的。如在本文中4吏用的，將"片,殳"定義為至少6個(gè)(鄰4妄)核酸或至少4個(gè)(鄰接)氨基酸的序列，該長(zhǎng)度足以實(shí)現(xiàn)核酸的特異性雜交或氨基酸表位的特異性識(shí)別，且多數(shù)為某個(gè)短于全長(zhǎng)序列的部分。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括可用來(lái)攜帶異源核酸或表達(dá)由一種異源核酸所編碼的肽或蛋白的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可包含在該細(xì)胞天然(非重組)形式內(nèi)不存在的基因、該細(xì)胞天然形式中存在但通過(guò)人工方法55進(jìn)行修飾或重新導(dǎo)入該細(xì)胞內(nèi)的基因，或者已經(jīng)過(guò)人工4務(wù)飾但未將該核酸從細(xì)胞去除的細(xì)胞內(nèi)源性核酸。宿主細(xì)胞可為真核或原核生物細(xì)胞。細(xì)菌培養(yǎng)必需的一般生長(zhǎng)條件可在例如BERGEY'SMANUALOFSYSTEMATICBACTERIOLOGY,Vol.1,N.R.Krieg，ed.,Williams和Wilkins,Baltimore/London(1984)的正文中查到。"宿主細(xì)胞"還可為一種細(xì)胞，其中內(nèi)源性基因或啟動(dòng)子或二者經(jīng)過(guò)修飾以生成本發(fā)明復(fù)合體的一種或多種多肽組分。"衍生物"是從天然化合物直接、通過(guò)修飾或通過(guò)部分取代而形成的組合物。酸序列或氨基酸序列。本發(fā)明的核酸或蛋白的衍生物或類似物包括但不限于這樣一些分子，其包含與本發(fā)明的核酸或蛋白基本同源的區(qū)域，在多種實(shí)施方式中，其與大小相等的核酸或氨基酸序列，或者當(dāng)與所比對(duì)序列相比較時(shí)(其中，通過(guò)本領(lǐng)域中已知的計(jì)算機(jī)同源性程序進(jìn)行比^f)具有至少約30。/。、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的一致性，或者其編碼核酸能夠在嚴(yán)謹(jǐn)性、中度嚴(yán)謹(jǐn)性或低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與編碼本發(fā)明蛋白的序列的互補(bǔ)物雜交，見(jiàn)例如Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sorts,NewYork,N.Y.,1993。核酸書(shū)f生物和^f奮飾物包4舌那些通過(guò)基因置換、位點(diǎn)特異性突變、缺失、插入、重組、修復(fù)、穿梭(shuffle)、內(nèi)切核酸酶消化、PCR、亞克隆以及相關(guān)4支術(shù)而得到的核酸。"同系物"可為天然存在的、或者通過(guò)人工合成一種或多種具有相關(guān)序列的核酸而得到、或通過(guò)一種或多種核酸的l'務(wù)飾而生成相關(guān)核酸。當(dāng)核酸天然或人工來(lái)自共有3且先序列(例如直系同源或旁系同源)時(shí)，則其為同源的。如果未對(duì)兩個(gè)核酸之間的同源性加以清楚描述，則同源性可通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)序列之間的核酸比較而推斷。如果該序列表現(xiàn)出某種程度的序列相似性，例如在一級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)水平大于30%，則可推斷其共有一個(gè)共同的祖先。對(duì)于本發(fā)明的目的，如果核酸序列足夠類似而可在^f氐嚴(yán)謹(jǐn)性條件下重組和/或雜交，則基因?yàn)橥吹?。如在本文中使用的?雜交"指分子僅與特定核苷S吏序列在低、中度或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下結(jié)合、二聚化(雙聯(lián))或雜交，包括當(dāng)該序列存在于復(fù)雜的混合物(例如，整個(gè)細(xì)胞)DNA或RNA中時(shí)。此外，普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，"保守性突變"還包括核酸的替換、缺失或添加，其改變、添加或缺失在一個(gè)編碼序列中的單個(gè)氨基酸或少數(shù)氨基酸，其中，該核酸改變引起類似氨基酸的化學(xué)替換?？捎米鞅舜吮Ｊ匦蕴鎿Q的氨基酸包括下列堿性的精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性的門(mén)冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天門(mén)冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);親水的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);疏水的苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含碌^的蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外，因保守性變異而不同的序列通常是同源的。對(duì)實(shí)施本發(fā)明非常有用的分子生物學(xué)沖支術(shù)，包括i秀變作用、PCR、克隆等的描述包括Berger和Kimmel,GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES,METHODSINENZYMOLOGY,volume152,AcademicPress,Inc.,SanDiego，Calif.(Berger);Sambrook等，MOLECULARCLONING—ALABORATORYMANUAL(2ndEd.)，Vol.1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989，以及CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,RM.Ausubel等，eds.,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.;Berger,Sambrook,與Ausubel,以及Mullis等,美國(guó)專利第4,683,202號(hào)(1987);PCRPROTOCOLSAGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS(Innis等.eds),AcademicPress,Inc.,SanDiego，Calif.(1990)(Innis);Arnheim&Levinson(Oct.1，1990)C&EN36-47^Lueng等。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸利用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。關(guān)于既用于原核細(xì)胞又用于真核細(xì)胞的恰當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)，參見(jiàn)例如Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989的第16和17章。多核苷酸可以為DNA分子、cDNA分子、基因組DNA分子或RNA分子。多核普酸如DNA或RNA可包含的一個(gè)序列中T(胸腺嘧啶)還可以為U(尿嘧咬)。如果多核苷酸某個(gè)位置的核苷酸能夠與在一個(gè)反向平行DNA或RNA鏈中相同位置處的一個(gè)核苷酸形成Watson-Crick配對(duì)，則該多核苦酸與該DNA或RNA分子在該位置彼此互補(bǔ)。如果每一個(gè)分子內(nèi)足夠數(shù)量的對(duì)應(yīng)位置由可彼此雜交以實(shí)玉見(jiàn)予貞期加工的核苷酸所占才居，則該多沖亥苷酸與該DNA或RNA分子基本上4皮此互補(bǔ)。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可利用常規(guī)j支術(shù)而實(shí)施，如本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的。通過(guò)"轉(zhuǎn)化"表示引入新DNA(即該細(xì)胞的外源DNA)后在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的永久或瞬時(shí)基因改變。在另一種實(shí)施方式中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠引導(dǎo)該核酸優(yōu)先在特定細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，應(yīng)用組織特異性調(diào)節(jié)元件來(lái)表達(dá)該核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件在本領(lǐng)域中已經(jīng)為人所知。恰當(dāng)?shù)慕M織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝特異性；Pinkert等，1987.GenesDev.1:268-277)、'淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame和Eaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275)、特別是T細(xì)月包受體啟動(dòng)子(Winoto和Baltimore,1989.EMBOJ.8:729-733)和免疫J求蛋白(Banerji等，1983.Cell33:729-740;Queen和Baltimore,1983.Cell33:741-748)的啟動(dòng)子、4申纟至元凈爭(zhēng)異寸生啟動(dòng)子(侈寸^口，4申經(jīng)樣丈絲啟動(dòng)子；Byrne和Ruddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473一5477、胰腺特異性啟動(dòng)子(Edlund等，1985.Science230:912-916)和乳&泉特異性啟動(dòng)子(例如乳清啟動(dòng)子；U.S.Pat.No.4,873,316和歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第264,166號(hào))。還包括發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子例如鼠類hox啟動(dòng)子(Kessel和Gmss,1990.Science249:374-379)和曱月臺(tái)蛋白啟動(dòng)子(Campes禾口Tilghman,1989.GenesDev.3:537-546)。在任4可一種實(shí)施方式中，編碼MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體的核酸可以下列形式存在一種或多種凈果DNA;處于恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中并游離保存的一種或多種核酸；？1入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的一種或多種核酸；編碼該復(fù)合體中組分的內(nèi)源性基因的修飾體；與一種或多種調(diào)節(jié)性核酸序列結(jié)合的一種或多種核臥吏；或其iEL合。，該核S臾可以可選地包括連接肽或融合蛋白組分，例如His-TAG、FLAG-TAG、熒光蛋白、GST、TAT、抗體部分、信號(hào)肽等，位于5，端、3'端或ORF內(nèi)的任何位置。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸包括編碼一種MG53受體的可;容性(即纟田月包夕卜)部分的多核苦酸。本文所述實(shí)施方式中的任何一種均可利用本領(lǐng)域中普通4支術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)途徑而實(shí)玉見(jiàn)。59如果宿主是原核生物，例如大腸桿菌(E.coli)，則能夠纟聶入DNA的感受態(tài)細(xì)胞可由在指數(shù)生長(zhǎng)期后收集的細(xì)胞制備而成，隨后用CaCl2法按照本領(lǐng)域中熟知的步驟而處理?？商娲兀刹捎肕gCl2、RbCl、脂質(zhì)體或脂質(zhì)體-蛋白偶耳關(guān)體。轉(zhuǎn)化還可在形成宿主細(xì)胞的原生質(zhì)體后或通過(guò)電穿孔而實(shí)施。這些實(shí)例對(duì)本發(fā)明并非限制性的；存在多種用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的技術(shù)，其為本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知，且應(yīng)認(rèn)為其包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如果該宿主是真才亥生物，則這種利用DNA的壽爭(zhēng)染方法包4舌石粦酸4丐共沉淀，也可應(yīng)用常規(guī)機(jī)械化程序如孩i注射、電穿孔、注入詳皮包裝于脂質(zhì)體中的質(zhì)粒、或病毒載體以及本領(lǐng)域中已知的其他方法。該真核細(xì)力包可以為酵母細(xì)月包(例如釀酒酵母)或者可以為哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人類細(xì)胞。為了長(zhǎng)期高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白，則優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。多肽在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及編碼MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體多肽J元體多肽或其生物活')"生部分的分離的沖亥S臾分子。該復(fù)合體的多肽可利用例如肽合成4義按照標(biāo)準(zhǔn)方法而形成；或通過(guò)在細(xì)胞或細(xì)胞提取物中分別表達(dá)每一種多肽然后分離并純化該多肽而形成。抗體如本文中^f吏用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"指免疫J求蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，其中免疫球蛋白分子即包含特異性結(jié)合(與其發(fā)生免疫反應(yīng))一種抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，包括至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)重(H)鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫(xiě)為VH)和至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)輕(L)鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫(xiě)為VL)。這些抗體包括^旦不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab、Fab，和F(ab，)2片,史以及Fab表達(dá)文庫(kù)。該VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為超變區(qū)(稱為"互補(bǔ)決定區(qū)"("CDR")),通過(guò)較保守的區(qū)域(稱為"框架區(qū)(或骨架區(qū))"(FR))散開(kāi)?？蚣軈^(qū)和CDR的含量已經(jīng)得到精確的確定(參見(jiàn)Kabat,E.A.等.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,以及Chothia,C.等.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917，其均結(jié)合于此供參考)。每一個(gè)VH和VL均由三個(gè)CDR和4個(gè)FR構(gòu)成，從氨基末端至歡基末端以下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通常，/人人類得到的抗體分子涉及類別IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任何一種，其由于分子中存在的重鏈性質(zhì)而彼此不同。某些類別還具有亞類，如IgGpIgG2和其他亞類。而且，在人類，輕鏈可以為K《連或X鏈。本文中對(duì)抗體的提及包括對(duì)所有這些人類抗體種類的類、亞類和型的提及。抗體可以由完整多肽或含感興趣的肽作為免疫劑的片^:而制備。優(yōu)選的抗原多肽片段是MG53、MG53結(jié)合蛋白或MG53受體蛋白中的15-100個(gè)鄰接氨基酸。在一種實(shí)施方式中，該肽位于該多肽的一種非跨膜結(jié)構(gòu)域，例如位于細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中。示例性抗體或抗體片段結(jié)合于一個(gè)表位，該表位易從細(xì)胞外環(huán)境接近且改變蛋白的功能性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括這樣的抗體其識(shí)別且特異于MG53蛋白、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體蛋白、變異體、部分的一個(gè)或多個(gè)表位和/或其組合。在可替換的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可靶向并干擾MG53/MG53受體相互作用以抑制信號(hào)傳導(dǎo)。單克隆抗體的制備在本領(lǐng)域中為人熟知；見(jiàn)例如Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual,第726頁(yè)(ColdSpringHarborPub.1988)?？赏ㄟ^(guò)用包含一種抗原的組合物注射小鼠或兔子、通過(guò)取出血清樣品核實(shí)存在抗體生成、取出脾臟以得到B淋巴細(xì)胞、使淋巴細(xì)月包與骨髓瘤細(xì)胞融合而生成雜交瘤、克隆該雜交瘤、選擇生成抗該抗原的抗體的陽(yáng)性克隆、并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離該抗體，從而獲得單克隆抗體。可利用本領(lǐng)域中熟知的4支術(shù)/人雜交瘤培養(yǎng)物中分離并純化單克隆抗體。在其他實(shí)施方式中，該抗體可通過(guò)重組生成，例如通過(guò)噬菌體展示或通過(guò)組合法而生成。噬菌體展示和組合法可用來(lái)分離那些結(jié)合MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體蛋白或其片^殳的重組抗體，如在例如Ladner等.美國(guó)專利第5,223,409號(hào)；Fuchs等.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huse等.(1989)Science246:1275-1281;Clackson等.(1991)Nature352:624-628;Gram等.(1992)PNAS89:3576-3580中4葛述的。人類單克隆抗體還可利用攜帶人類免疫球蛋白基因而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠而生成。來(lái)自這些用感興趣的抗原免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞可用來(lái)生成雜交瘤，其分泌具有對(duì)人類蛋白表位的特異親和性的人類mAb(見(jiàn)例如Wood等.國(guó)際申請(qǐng)第WO91/00906號(hào);Lonberg,N.等.1994Nature368:856-859;Green,L.L.等.1994NatureGenet.7:13-21;Morrison,S.L.等.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。針對(duì)本發(fā)明復(fù)合體的組分或該復(fù)合體本身的治療上有用的抗體可來(lái)自"人源化，，單克隆抗體。人源化單克隆抗體通過(guò)將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)從小鼠免疫球蛋白的重可變鏈和輕可變鏈轉(zhuǎn)移入人可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)，然后將人類殘基替換入鼠類對(duì)應(yīng)物的沖匡架區(qū)內(nèi)而生成。采用來(lái)自人源化單克隆抗體的抗體組分避免了與鼠類恒定區(qū)免疫原性相關(guān)的潛在問(wèn)題。用于生成人源化單克隆抗體的技術(shù)可在Jones等，Nature321:522,1986和Singer等，J.Immunol.150:2844,1993中查到。該抗體還可來(lái)自從組合免疫球蛋白文庫(kù)分離的人類抗體片,爻；見(jiàn)侈寸^口Barbas等,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2，119，1991。此外，可通過(guò)剪4妄來(lái)自具有'除當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因以及來(lái)自具有恰當(dāng)生物學(xué)特異性的人類抗體分子的基因而得到嵌合抗體；見(jiàn)例如Takeda等，Nature314:544-546,1985。嵌合抗體是其中不同部分來(lái)自不同動(dòng)物種屬的抗體?？躬?dú)特型技術(shù)可用來(lái)生成模擬表位的單克隆抗體。針對(duì)第一單克隆抗體制備的抗獨(dú)特型單克隆抗體將在超變區(qū)內(nèi)具有一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其為由該第一單克隆抗體結(jié)合的表位的"映像"?？商娲兀脕?lái)生成單鏈抗體的技術(shù)可用來(lái)生成單鏈抗體。單鏈抗體通過(guò)借助氨基酸鍵連接Fv區(qū)的重鏈片段和輕鏈片段而形成，得到單鏈多肽。識(shí)別特異性表位(例如細(xì)胞外表位)的抗體片l殳可通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的4支術(shù)而生成。這樣的片革殳包括通過(guò)蛋白水解消化生成的Fab片段和通過(guò)還原二硫^1而產(chǎn)生的Fab片段。當(dāng)用于免疫治療時(shí)，單克隆抗體、其片段或二者可以是未標(biāo)記的或用治療藥劑進(jìn)行標(biāo)記。這些試劑可通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的4支術(shù)直4妄或間4妄地偶聯(lián)于該單克隆抗體，且包括諸如藥物、放射性同位素、凝集素和毒素等試劑。給予單克隆抗體的劑量范圍足夠大，以產(chǎn)生預(yù)期效果，且將隨年齡、病癥、體重、性別、年齡以及4寺治療病癥的程度而不同，且可由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員輕易確定。劑量可為約O.lmg/kg至約2000mg/kg。該單克隆抗體可靜脈內(nèi)、腹月莫內(nèi)、月/L肉內(nèi)和/或皮下給藥。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，該抗原性肽所包含的至少一個(gè)表位是MG53、MG53結(jié)合蛋白和/或MG53受體中位于蛋白表面的區(qū)域，例如親水性區(qū)域。蛋白序列的疏水性分析將表明多肽中哪個(gè)區(qū)》或是特別親水的，因》匕可能編石馬5寸于草巴向#元體生成有用的表面殘基。作為靶向抗體生成的一種方式，示出親水性和疏水性區(qū)域的親水性圖可通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的任何方法而生成，包4舌例如KyteDoolittle或HoppWoods法，利用或者不利用Fourier轉(zhuǎn)化。見(jiàn)例如Hopp和Woods,1981,尸亂淑.JcW.5W.USA78:3824-3828;Kyte和Doolittle1982，《/JV/o/.157:105-142，每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此供參考。本文提供特異于在抗原蛋白、其衍生物、片段、類似物或同系物中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗體。可利用本發(fā)明的蛋白或者其衍生物、片段、類似物、同系物或直系同源作為抗體生成中的免疫原，該抗體免疫特異性結(jié)合這些蛋白組分。人類抗體完全的人類抗體本質(zhì)上是指其中輕《連和重鏈(包括CDR)的整個(gè)序列均來(lái)自于人類基因的抗體分子。本文中這些抗體稱為"人類抗體"或"全人類抗體"。人類單克隆抗體可利用三源雜交瘤技術(shù)；人類B細(xì)月包雜交瘤才支術(shù)(見(jiàn)Kozbor等，1983ImmunolToday4:72)以及EBV雜交瘤技術(shù)來(lái)制備，以生成人類單克隆抗體(見(jiàn)Cole等,1985In:MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)。人類單克隆抗體可用于實(shí)施本發(fā)明，且可利用人類雜交瘤(見(jiàn)Cote等，1983.ProcNatlAcadSciUSA80:2026-2030)或者通過(guò)用艾伯斯坦-巴爾病毒(或EB病毒)體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)月包(見(jiàn)Cole等，1985In:MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss，Inc.,pp.77-96)而生成。64此外，人類抗體還可以利用其他技術(shù)包括噬菌體展示文庫(kù)而生成(Hoogenboom和Winter,M/.萬(wàn)Zo/.227:381(1991);Marks等，/Mo/.歷o/"222:581(1991))。類似地，人類抗體可通過(guò)將人類免疫球蛋白座位引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如小鼠內(nèi)而制備，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)，內(nèi)源性免疫王求蛋白基因已經(jīng)部分或全部滅活。一旦激發(fā)，即可乂見(jiàn)察到人類抗體，其所有方面均與在人類觀察到的極其相似，包括基因重排、組裝和抗體集合(或抗體庫(kù))。該方法在例如美國(guó)專利第5,545,807號(hào)；第5,545,806號(hào)；第5,569,825號(hào)；第5,625,126號(hào)；第5,633,425號(hào)；第5,661,016號(hào)，以及Marks等(Bio/Technology，10:779-783(1992));Lonberg等(Nature,368:856-859(1994));Morrison(Nature,368:812-13(1994));Fishwild等(7V"^/"14:845-51(1996));Neuberger(7V(^we5/o&c/2wo/ogy,14:826(1996》；以及Lonberg和Huszar(/"femiev./wwwwo/.,13:65-93(1995))中有描述。人類抗體還可利用非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而生成，所述非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)改良可響應(yīng)4元原〗敫發(fā)而生成全人類^t體而非動(dòng)物內(nèi)源性抗體。在非人類宿主體內(nèi)編碼重免疫J求蛋白鏈和輕免疫5求蛋白《連的內(nèi)源性基因已經(jīng)喪失功能，且將編碼人類重鏈免疫球蛋白和輕鏈免疫王求蛋白的活性座位插入宿主基因組內(nèi)。例如利用包含必需人類DNA區(qū)段的酵母人工染色體引入這些人類基因。隨后，獲得可提供全部所需《奮飾的動(dòng)物作為后代，這是通過(guò)4吏含有少于全部l奮飾補(bǔ)體(complement)的過(guò)渡性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交育種。這種非人類動(dòng)物的優(yōu)選實(shí)施方式是小鼠，命名為Xenomouse,如在PCT〃>開(kāi)WO96/33735和WO96/34096中4皮露的。Fab片段和單鏈抗體根據(jù)本發(fā)明，可以對(duì)技術(shù)進(jìn)行調(diào)整以生成特異于本發(fā)明抗原蛋白的單鏈抗體(見(jiàn)例如美國(guó)專利第4,946,778號(hào))。此夕卜，可以調(diào)整方法以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(見(jiàn)例如Huse等，5We"ce246:1275-1281(1989)),以實(shí)現(xiàn)單克隆Fab片l殳的快速和有歲文鑒定，該片萃殳具有對(duì)蛋白或者其衍生物、片段、類似物或同系物的預(yù)期特異性。包含對(duì)蛋白抗原的獨(dú)特型的抗體片段可利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)而生成，這些技術(shù)包括但不限于(i)通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab，)2片段；(ii)通過(guò)還原F(ab，)2片段中的二硫4建而生成Fab片段；(iii)通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子生成的Fab片段以及(iv)Fv片段。雙特異性抗體雙特異性抗體是單克隆的，優(yōu)選人類或人源化抗體，其具有對(duì)至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。在本發(fā)明中，結(jié)合特異性之一是針對(duì)本發(fā)明的抗原蛋白的。第二結(jié)合靶標(biāo)是任何其他抗原，且有益地，是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單位。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。常》見(jiàn)而言，雙特異性抗體的重組生成是基于兩個(gè)免疫球蛋白重-輕/輕-重配對(duì)的共表達(dá)，其中這兩個(gè)重鏈具有不同的特異性(Milstein和Cuello,A^r/w",305:537-539(1983))。由于免疫J求蛋白重鏈和輕鏈的隨4幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中4又一種分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。1993年5月13日7>布的WO93/08829以及Traunecker等，五MS(9人10:3655-3659(1991)中4皮露了類似步驟。具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)可融合于免疫J求蛋白恒定區(qū)序列。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)例i口Suresh等，/"五"2^wo/ogy，121:210(1986);以及Brennan等，229:81(1985)。此外，可以從大腸桿菌中直接回收Fab，片段，并進(jìn)行化學(xué)連接以形成雙特異性抗體。Shalaby等，/五xp.Me乂175:217-225(1992)描述了全人源化雙特異性抗體F(ab，)2分子的生成。每個(gè)Fab，片斷體。由此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合至過(guò)表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人類T細(xì)胞，并能夠引發(fā)人類細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)人類乳腺瘤輩巴標(biāo)的細(xì)力包;;容解酶活性。用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接形成和分離雙特異性抗體片斷的多種4支術(shù)也已經(jīng)得到描述。例如，已經(jīng)應(yīng)用亮氨酸拍3連生成雙特異性4元體。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。Hollinger等，尸rac.iVW/.Sc/.USA90:6444-6448(1993)描述的"雙體(diabody)"技術(shù)已經(jīng)提供了一種制備雙特異性抗體片段的可替代機(jī)制。還報(bào)道了另一種通過(guò)應(yīng)用單鏈Fv(sFv)二聚體而制備雙特異性抗體片,殳的策略。見(jiàn)Gruber等，《//mmw"o/.152:5368(1994)。還考慮了二1"介以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J./iwmmo/.147:60(1991)。雙特異性抗體還可用來(lái)將細(xì)月包毒性劑引入表達(dá)特定抗原的細(xì)月包中。這些抗體具有一個(gè)抗原結(jié)合臂以及一個(gè)結(jié)合一種細(xì)胞毒性劑或一種》文射性核素螯合劑如EOTUBE、DPTA、DOTA和ETTA的^,。異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體構(gòu)成。有人提出這些抗體例如使免疫系統(tǒng)細(xì)胞草巴向于不需要的細(xì)月包(美國(guó)專利第4,676,980號(hào))，并用于治療HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;EP03089)。可i人為這些抗體可利用合成蛋白化學(xué)中已知的方法進(jìn)4亍體外制備，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可利用二石危4建交換反應(yīng)或通過(guò)形成石克醚4建而構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的恰當(dāng)試劑的實(shí)例包括石克醇亞胺(iminothiolate)和4-統(tǒng)u基-l-亞胺基丁基甲基醚(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和那些在例如美國(guó)專利第4，676，980號(hào)中4皮露的。免疫偶耳關(guān)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其包含一種偶聯(lián)于化學(xué)劑或者放射性同位素(即放射性偶聯(lián)物)的抗體。該抗體與細(xì)胞毒性劑的偶聯(lián)物利用多種生物雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二石克^R0丙酸酯(SPDP)、亞胺基好u雜環(huán)戊烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能書(shū)亍生物(如二亞胺代己二酸二曱酯鹽酸鹽)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(如戊二醛)、二疊氮4匕合物(如二(對(duì)位-疊氮苯甲酰)己二胺)、二重氮書(shū)f生物(如二(對(duì)位-重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(如曱苯-2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝'基苯)而形成。例如，可如Vitetta等，Sc&"ce，238:1098(1987)中所描述的來(lái)制備蓖麻毒蛋白的免疫毒素。碳14標(biāo)記的1-異硫氰基千基_3-曱基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于佳j文射性核芬酸與該抗體偶聯(lián)的示例性螯合劑。見(jiàn)WO94/11026。免疫脂質(zhì)體本文披露的抗體還可配制為免疫脂質(zhì)體。包含該抗體的脂質(zhì)體通過(guò)本領(lǐng)i或中已知的方法制備，如Epstein等，AAa"爿c"dScz'.USA，82:3688(1985);Hwang等，尸rac.SC.USA,77:4030(1980);以及美國(guó)專利第4,485,045號(hào)和第4,544,545號(hào)中描述的。美國(guó)專利第5,013,556號(hào)中披露了循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可通過(guò)反相蒸發(fā)法利用一種脂質(zhì)組合物而生成，該組合物包括磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG源磷脂酰乙醇胺68(PEG-PE)。脂質(zhì)體通過(guò)具有確定孔徑的濾器壓出，以得到所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab，片段可借助于二硫鍵交換反應(yīng)偶聯(lián)于脂質(zhì)體，如Martin等，乂C/ze附.257:286-288(1982)中描述的。治療有效量的本發(fā)明抗體通常指達(dá)到治療目標(biāo)所需的量。如上文指出的，抗體與其輩巴抗原之間的結(jié)合性相互作用，在某些情況下，可能干擾靶標(biāo)發(fā)揮作用，而在其他情況下，則可能促進(jìn)生理反應(yīng)。此外，所需給予的量將依賴于抗體與其特異抗原的結(jié)合親和性，且還將依賴于所給予的抗體從所給予的另一個(gè)自由體積個(gè)體清除的速率。本發(fā)明的抗體或抗體片段的治療有效劑量的常用范圍，通過(guò)非限制性實(shí)例，可為約0.1mg/kg體重至約500mg/kg體重。-常用給予頻率可為例如乂人每天兩次至每周一次不等。特異性結(jié)合本發(fā)明一種蛋白的抗體以及通過(guò)本文4皮露的篩選分析而鑒定的其他分子，均可以藥物組合物的形式給予而用于治療多種病癥。在例如Remington:TheScienceAndPracticeOfPharmacy第19X反(AlfonsoR.Gennaro等，編輯)MackPub.Co.，Easton,Pa.:1995;DrugAbsorptionEnhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,AndTrends,HarwoodAcademicPublishers,Langhorne，Pa"1994;andPeptideAndProteinDrugDelivery(AdvancesInParenteralSciences,Vol.4),1991,M.Dekker,NewYork中提供了制備這些組合物時(shí)涉及的原理和需考慮事項(xiàng)以及選擇組分時(shí)的指導(dǎo)原則。這些活性成分還可包裹于微膠嚢內(nèi)，例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合分別例如羥化曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚甲基丙烯酸曱酯微膠嚢，處于膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠嚢)或粗乳狀膠中。用于體內(nèi)給藥的制劑必須無(wú)菌。這一點(diǎn)可通過(guò)用無(wú)菌濾力莫過(guò)濾而容易實(shí)現(xiàn)?？芍苽渚忈屩苿?。緩釋制劑的恰當(dāng)實(shí)例包括含該抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成形品形式，例如膜或微膠嚢。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)、或聚乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專利第3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞4木構(gòu)成的可注射孩"求)和聚-D-(-)-3-羥丁酸。盡管聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠使分子釋放達(dá)到100天以上，但某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間則較短。ELISA測(cè)定用于檢測(cè)被分析蛋白的試劑是能夠結(jié)合于被分析蛋白的抗體，優(yōu)選具有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗體。抗體可以為多克隆、或較優(yōu)選為單克隆?？刹捎猛暾贵w或其片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab)2)。提到探針或抗體時(shí)，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記的"旨在包括通過(guò)將一種可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(即物理性連4妻)于該纟罙4十或抗體而直4妄標(biāo)記該揮:4十或抗體，以及通過(guò)與另一種直才妄標(biāo)記的試劑的反應(yīng)性而間4妻標(biāo)記該4笨4十或抗體。間4妄標(biāo)記的實(shí)例包括用一種熒光標(biāo)記的第二抗體4企測(cè)第一抗體，以及用生物素末端標(biāo)記一個(gè)DNA探針，使得其可利用焚光標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素進(jìn)行檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)樣品"旨在包括從個(gè)體分離的組織、細(xì)月包和生物流體以及個(gè)體體內(nèi)存在的組織、細(xì)月包和流體。因此，血液以及血液的部分或組分，包4舌血清、血漿或'淋巴，包4舌在術(shù)"i吾"生物學(xué)才羊品"的用法內(nèi)。即，本發(fā)明的才企測(cè)方法可用來(lái)在體外和體內(nèi)檢測(cè)生物學(xué)才羊品內(nèi)的浮皮分析mRNA、蛋白或基因組DNA。例如，雜交)和原位雜交。用于檢測(cè)被分析蛋白的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、蛋白印跡、免疫沉淀以及免疫焚光。用于才全測(cè)尋皮用于實(shí)施免疫測(cè)定法的步驟在例如"ELISA:TheoryandPractice:MethodsinMolecularBiology",Vol.42，J.R.Crowther(Ed.)HumanPress,Totowa,N丄，1995;"Immunoassay",E.Diamandis和T.Christopoulus,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif"1996;以及"PracticeandThoryofEnzymeImmunoassays",P.Tijssen，ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,1985中進(jìn)4亍描述。it匕夕卜，用于才全觀'^皮分析蛋白的體內(nèi)4支術(shù)包括將抗#:分析蛋白的標(biāo)記抗體導(dǎo)入個(gè)體體內(nèi)。，B。，該4元體可用》文射'I"生才示i己物進(jìn)^f亍才示i己，該才示i己物在個(gè)體體內(nèi)的存在和位置可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的腔內(nèi)或經(jīng)皮顯4象4支術(shù)單獨(dú)地或與效應(yīng)細(xì)力包一起進(jìn)^f于^r測(cè)。用于給予本發(fā)明治療劑的制劑包括無(wú)菌的水或非水溶液、混懸液和乳液。非水溶劑的實(shí)例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油以及可注射有才幾酯如油酸乙酯。含水載體包括水、含醇/含水溶液、乳液或混懸液，包4舌鹽水和纟爰沖介質(zhì)。媒介物包括氯4匕鈉溶液、葡萄糖林格氏液、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏靜脈內(nèi)媒介物(包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑)、電解質(zhì)補(bǔ)充劑等?？杉尤敕栏瘎┖推渌砑觿?，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。本發(fā)明的化合物、核酸分子、多肽和抗體(本文中也稱為"活性化合物")以及其衍生物、片段、類似物和同系物，可摻入適于給藥的藥物組合物內(nèi)。這些組合物通常包括所述核酸分子、蛋白或#元體以及藥用載體。如本文中使用的，"藥用載體"旨在包括適于給藥的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等中的4壬4可一種禾口全部。'除當(dāng)載體在最近一版的Remington'sPharmaceuticalSciences(該4頁(yè)i或中的才示準(zhǔn)參考文本)中進(jìn)4亍4苗述，其結(jié)合于此供參考。這些載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于水、鹽水、林才各氏液、葡萄4唐溶液和5%的人血清白蛋白。還可采71用脂質(zhì)體和非水性媒介物如不揮發(fā)油。這些介質(zhì)和試劑用作藥物活性物質(zhì)在本領(lǐng)域中已經(jīng)為人熟知。除了任何不與活性化合物相容的常^L介質(zhì)或試劑之外，其在組合物中的應(yīng)用也在考慮之內(nèi)。還可將4卜充性活性4匕合物摻入該組合物內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物配制為與其預(yù)期的給藥途徑相容。給藥途徑的實(shí)例包括胃腸外，例如,爭(zhēng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口(例如，吸入)、經(jīng)皮(即，局部)、經(jīng)粘膜、腹膜內(nèi)和直腸給藥。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可包括下列組分無(wú)菌稀釋劑如用于注射的水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如苯曱醇或?qū)αu基苯曱酸曱酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞石克酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA);纟爰沖液如乙酸、檸檬酸或磷酸；以及用于張力調(diào)節(jié)的試劑如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或^5咸如鹽酸或氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)節(jié)。胃腸外制劑可封裝于安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多次劑量瓶中。適于注射用的藥物組合物包括無(wú)菌含水溶液(如果溶于水)或分散液以及用于臨時(shí)配制無(wú)菌注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)給予，恰當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽水、抑菌水、Crem叩horTM(BASF，Parsippany,N丄)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須無(wú)菌，且應(yīng)該在某種程度上為易于注射的液體。其在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定，且必須能4氏抗纟效生物如細(xì)菌和真菌的污染作用而保存。載體可以為溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及其恰當(dāng)混合物。恰當(dāng)流動(dòng)性可通過(guò)使用例如涂層如凝集素、通過(guò)保持分散液情況下必需的顆粒大小以及通過(guò)利用表面活性劑而維持。防止微生物作用可通過(guò)多種抗細(xì)菌和抗真菌試劑例如對(duì)羥苯曱酸酯、三氯叔丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在多種情況下，組合物中將優(yōu)選包括等滲劑例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延緩吸收可通過(guò)在組合物中包括可延緩吸收的試劑例如單石更脂S臾鋁和明力交而實(shí)J見(jiàn)。無(wú)菌可注射溶液可通過(guò)將活性化合物(例如本發(fā)明的治療復(fù)合體)以必需量在恰當(dāng)溶劑中與上文提到的成分中的一種或其組合(如需要)混合而制備，隨后進(jìn)行過(guò)濾除菌。通常，分散液通過(guò)將活性化合物摻入包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)的無(wú)菌々某介物和上文列出的其他必需成分中而制備。對(duì)用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末，制備方法則是真空干燥和冷凍干燥，其可從其前述無(wú)菌過(guò)濾溶液生成活性成分以及任何其他所需成分的粉末。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食入載體。其可封裝于明膠膠嚢中或壓縮成片劑。為了口服治療劑給藥的目的，可將活性化合物與J3武形劑混合并以片劑、4t劑或力交嚢的形式應(yīng)用?？诹組合物還可利用液態(tài)載體(作為漱口劑使用)制備，其中該液態(tài)載體中的化合物經(jīng)口給藥并漱口然后吐出或咽下。藥用結(jié)合劑和/或佐劑材料也可作為該《且合物的一部分而包含在內(nèi)。片劑、丸劑、月交嚢、4t劑等可包含下列成分中任何一種或性質(zhì)類似的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍力交或明力交；賦形劑如淀4分或乳糖、崩解劑如海藻酸、淀并分(Primogel)或玉米淀4分；潤(rùn)滑劑如石更脂酸4美或Sterotes(商標(biāo))；助流劑如力交態(tài)二氧化石圭；甜p木劑如蔗4唐或糖精；或調(diào)p木劑如薄荷、冬青油或才禹子"i周p木劑(orangeflavoring)。對(duì)于口月良主合予，藥物組合物可采取例如片劑或月交嚢的形式，其通過(guò)常規(guī)方法與藥用賦形劑一起制備，藥用賦形劑例如有結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(硬脂酸4美、滑石或硅石)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如十二烷基石危酸鈉)。片劑可利用本領(lǐng)域中熟知的方法涂布。用于口服給藥的液態(tài)制劑可采取溶液、糖漿或混懸液的形式，或者其可為干燥品，用于在使用前與水或其他恰當(dāng)媒介混合。這些液態(tài)制劑可通過(guò)常^見(jiàn)方法利用藥用添加劑如懸浮劑(例如，山梨糖醇漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如，凝集素或阿^立伯月交)；非水々某介物(例如，杏仁油、酯油、乙醇或分餾的植物油)；以及防腐劑(例如，曱基或丙基-對(duì)羥苯酸鹽或山梨酸)而制備。該制劑還可包含恰當(dāng)?shù)木彌_鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。用于口服給藥的制劑可恰當(dāng)制備，以實(shí)現(xiàn)活性化合物的控釋。對(duì)于含服給藥，該組合物可采用以常規(guī)方式制備的片劑或錠劑。對(duì)推進(jìn)劑從加壓箱或霧化器以氣溶膠噴霧的形式遞送，恰當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑例如有二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他恰當(dāng)氣體。如果采用加壓氣溶膠，劑量單位可通過(guò)提供計(jì)量遞送的閥門(mén)而確定?？芍苽溆糜谖肫骰虼等肫髦械睦缑髟陆坏脑陆粐昂退幫玻浒摶衔锱c恰當(dāng)粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。該化合物可配制用于通過(guò)注射例如通過(guò)推注注射或連續(xù)灌注而進(jìn)行胃腸外給藥。注射制劑可以以單位劑型的形式存在，例如存在于安瓿或多次劑量容器中，且含有額外的防腐劑。該組合物可采取諸如油狀或含水媒介物中混懸液、溶液或乳液的形式，且可包含調(diào)制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？商娲兀钚猿煞挚蔀榉勰┬问?，用于在使用前與恰當(dāng)々某介物例如無(wú)菌無(wú)熱物質(zhì)的水混合。該4b合物還可配制在直腸《且合物如栓劑或^f呆留灌腸劑中，例如包含常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯。除了之前描述的配方，該化合物還可配制為4諸存制劑(depotpreparation)。這種長(zhǎng)時(shí)間作用的制劑可通過(guò)植入(例如，皮下或肌內(nèi))或通過(guò)月幾內(nèi)注射給藥。因此，或疏水材料(例如合適油類中的乳液)或離子交換樹(shù)脂，或作為微溶性衍生物例如作為微溶鹽而配制。對(duì)于吸入給藥，該化合物可以以氣溶膠噴霧形式遞送，該氣溶膠噴霧來(lái)自高壓容器或分配器(含有恰當(dāng)推進(jìn)劑例如氣體，如二氧化碳)或霧化器。全身給藥還可為經(jīng)粘膜或經(jīng)皮的方法。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，則在配方中采用適于待穿透屏障的滲透劑。這些滲透劑在本領(lǐng)域中通常已經(jīng)為人所知，例如對(duì)于經(jīng)粘膜給藥，包括去垢劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥可通過(guò)采用經(jīng)鼻噴霧或^全劑而實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)皮給藥，活性化合物可配制入軟膏、藥膏、凝月交或乳膏中，如本領(lǐng)域中通常所殺口的。在一種實(shí)施方式中，將活性化合物與保護(hù)該化合物不會(huì)乂人身體迅速清除的載體(如控釋制劑，包括植入物和微嚢遞送系統(tǒng))制備在一起。可采用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。用于制備這些制劑的方法，對(duì)于本領(lǐng)域中技術(shù)人員將很明顯。這些材料還可從AlzaCorporation和NovaPharmacruticals,Inc.購(gòu)得。月旨質(zhì)體混懸液(包括通過(guò)具有針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體而靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥用載體。這些可按照本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方法制備，例如，如美國(guó)專利第4,522,811號(hào)中所描述的。特別有益的是，以單位劑量配制口服或胃腸外組合物以方便給藥以及劑量的均一性。如本文中使用的，單位劑型指物理上分離的單位，適合用作用于待治療個(gè)體的單位劑量；每一個(gè)單位均包含預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算其可與所需藥用載體一起產(chǎn)生預(yù)期治療效果。本發(fā)明單位劑型的夫見(jiàn)格由該活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和希望達(dá)到75的特定療效以及本領(lǐng)域中固有的關(guān)于配制用于個(gè)體治療的該活,l"生化合物的限制來(lái)規(guī)定并直接依賴于這些因素。本發(fā)明的核酸分子可插入載體中，并用作基因治療載體。基因治療載體可通過(guò)例如靜脈內(nèi)注射、局部給予(見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,328,470號(hào))或通過(guò)立體定向注射(見(jiàn)例如，Chen等，1994.尸rac.A^/.爿cad5W.USA91:3054-3057)。該基因治療載體的藥物制劑可包括存在于適當(dāng)稀釋劑中的基因治療載體，或者可包括一種緩釋基質(zhì)，其中植入了基因遞送媒介物?？商娲?，如果該完全基因遞送載體可/人重組細(xì)力包完整地生成，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，則該藥物制劑可包4舌一種或多種生成基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。該藥物組合物可與給藥說(shuō)明書(shū)一起包含于容器、包裝或分配器中。治療有效劑量指足以？1起癥狀改善或延緩的治療劑的量。這些化合物的毒性和治療效果可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步,驟在細(xì)月包培養(yǎng)物或?qū)?驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)確定，例如，用于確定LD50(致死總體的50%的劑量)和ED50(有效治療總體的50%的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，其可表示為L(zhǎng)D50/ED50。優(yōu)選表現(xiàn)出較大治療指數(shù)的化合物。盡管可采用表現(xiàn)出毒性副作用的化合物，還是應(yīng)該仔細(xì)設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)，其使這些化合物輩巴向至受感染的組織部位，以將對(duì)未受染細(xì)胞的可能損害降到最低，從而降低副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物實(shí)-驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)可用于配制一系列人類應(yīng)用的劑量。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選處于包含ED50但毒性很低或無(wú)毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)采用的劑型和所利用的給藥途徑，劑量可在該范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于任何用于本發(fā)明方法中的化合物，該治療有效劑量最初可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定進(jìn)4亍評(píng)估?？稍趧?dòng)物才莫型中形成一個(gè)劑量，以獲得一個(gè)循環(huán)血漿濃度范圍，該范圍包括在細(xì)胞培養(yǎng)中所確定的IC50(即，可實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的受試化合物的濃度)。這些信76息可用來(lái)更準(zhǔn)確的確定人類有用劑量。例如，血漿中的水平可利用高歲文-液相色i普法測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明，還4皮露了利用本文所述方法、選才奪策略、材料或組分中任何一個(gè)的試劑盒或系統(tǒng)。才艮據(jù)本發(fā)明的示例性試劑盒將可選地還包括用于實(shí)施方法或測(cè)定的說(shuō)明書(shū)、包裝材料、一個(gè)或多個(gè)容器，其包含測(cè)定、裝置或系統(tǒng)組分等。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)和優(yōu)選實(shí)施方式的實(shí)施例，本發(fā)明的其他目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)將為本領(lǐng)域的普通4支術(shù)人員所理解，且明顯包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例MG53(—種肌肉特異性TRIM家族蛋白)的發(fā)現(xiàn)。MG53利用之前建立的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法而分離，該方法可鑒定與月幾形成、橫紋肌細(xì)胞中的Ca^信號(hào)傳導(dǎo)和膜完整性的保持有關(guān)的新蛋白。簡(jiǎn)而言之，該途徑利用含有約6500個(gè)克隆的單克隆抗體文庫(kù)，該文庫(kù)產(chǎn)生自用富含三聯(lián)體的膜丄來(lái)自兔骨骼肌丄免疫的小鼠。感興趣抗體根據(jù)在免疫熒光顯微鏡下觀察到的橫紋肌切片的z線染色才莫式而選擇。通過(guò)抗體親和柱純化耙蛋白，并得到了所純化蛋白的部分氨基酸序列。根據(jù)該部分氨基酸序列，從骨骼肌cDNA文庫(kù)分離出編碼該靶基因的完整cDNA。然后利用同源基因篩選在其他可興奮組織中搜索所鑒定基因的不同異構(gòu)體。最后，生成轉(zhuǎn)基因或敲除小鼠才莫型，以研究感興趣基因的體內(nèi)生理功能。篩查該免疫-蛋白質(zhì)組學(xué)文庫(kù)中的肌肉特異性蛋白可鑒定4黃紋肌組織中由分子量53kd的mAb5259特異性識(shí)別的抗原(圖3B)。該蛋白，"MG53",利用mAb5259免疫親和柱從兔骨骼肌部分純化，77并進(jìn)行氨基酸測(cè)序。骨骼肌cDNA文庫(kù)篩選和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定了所預(yù)測(cè)的MG53氨基酸序列以及人類/6p〃.2座^f立上相應(yīng)的wg53基因。mg53mRNA的RNA印跡(Northern印跡)i正實(shí)了骨骼肌和心肌的特異性表達(dá)(圖3C)。結(jié)構(gòu)域同源性分析表明，MG53含有原型的Jj)rototypical丄三聯(lián)基元，該三聯(lián)基元包4舌一個(gè)環(huán)、B-盒和巻曲螺旋(RBCC)部分以及羧基末端的SPRY結(jié)構(gòu)域(圖1、2和3A)。該SPRY結(jié)構(gòu)i或是一種首先在可興奮細(xì)月包月幾漿網(wǎng)的雷i若定(ryanodine)受體Ca"釋放通道中觀察到的保守序列。在迄今已經(jīng)在不同哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)鑒定的約60個(gè)TRIM家族成員中，有15個(gè)成員在RBCC結(jié)構(gòu)域之后攜帶類似的SPRY結(jié)構(gòu)域，且MG53表二見(jiàn)出帶有這些TRIM亞家^:蛋白的^f呆守的一級(jí)結(jié)構(gòu)。MG53介導(dǎo)肌細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸。盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)中不存在3爭(zhēng)膜區(qū)段或脂質(zhì)修飾基元，但在骨骼肌中，MG53似乎主要限于膜結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)分析揭示了MG53在月幾纖維月莫和細(xì)月包內(nèi)嚢泡中的特異性標(biāo)記(圖3D)。MG53在C2C12肌源細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)引起顯著的形態(tài)改變。用MG53和GFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出質(zhì)膜擴(kuò)展，且具有在^f又表達(dá)GFP的細(xì)胞中不存在的filapodia樣結(jié)構(gòu)(圖4A-D)。利用GFP-MG53融合構(gòu)建體，發(fā)現(xiàn)MG53定位于C2C12肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)嚢泡和質(zhì)膜(圖4B)?；罴?xì)胞熒光成像揭示了在過(guò)表達(dá)GFP-MG53的C2C12細(xì)月包內(nèi)的動(dòng)態(tài)細(xì)月包內(nèi)運(yùn)llT和融合。該GFP-MG53介導(dǎo)的在細(xì)胞表膜的嚢泡融合導(dǎo)致GFP-MG53嚢泡出芽而脫離細(xì)胞膜(圖4D)。這一點(diǎn)可利用全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微鏡通過(guò)在質(zhì)膜處的嚢泡融合成像而證實(shí)，表明MG53共表達(dá)大大促進(jìn)了嚢泡融合(數(shù)據(jù)未顯示)?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)源性MG53是一種肌肉特異性TRIM家族蛋白，其介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)嚢泡至肌纖維膜的運(yùn)輸。MG53是一種包含TRIM和SPRY基元的肌肉特異性蛋白。在前面的研究中，我們已經(jīng)建立了一個(gè)單克隆抗體(mAb)文庫(kù)，其針對(duì)與骨骼肌中三聯(lián)連接相關(guān)的蛋白。篩查該免疫-蛋白質(zhì)組學(xué)文庫(kù)中的肌肉特異性蛋白，鑒定出一種分子大小為53千道爾頓(kDa)且可由mAb5259識(shí)別的抗原(稱MG53)。利用結(jié)合有mAb5259的免疫親和柱從兔骨骼肌中部分純化MG53,并進(jìn)行氨基酸測(cè)序。根據(jù)所得到的部分氨基酸序列，從兔和小鼠月幾細(xì)胞文庫(kù)中分離編碼MG53的cDNA?；蚪M文庫(kù)搜索鑒定出人類16pll.2座位上相應(yīng)的MG53基因。圖1中示出了在幾個(gè)物種中預(yù)測(cè)的MG53氨基酸序列。結(jié)構(gòu)域同源性分析表明，MG53在羧基末端除了SPRY結(jié)構(gòu)域外還包含RBCC的原型TRIM標(biāo)簽序列，因此屬于TRIM/RBCC家族(圖1)。在迄今已經(jīng)在哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)鑒定的約60個(gè)TRIM家族成員中，有15個(gè)成員在RBCC結(jié)構(gòu)域之后攜帶類似的SPRY結(jié)構(gòu)域，且MG53表現(xiàn)出帶有這些TRIM亞家族蛋白的保守的一級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)。然而，驚人且意外的是，我們的研究表明MG53是圖2蛋白中唯一的表現(xiàn)出膜修復(fù)功能的TRIM家族蛋白。蛋白印記分析證實(shí)了MG53在小鼠組織中的肌肉特異性表達(dá)(圖3B)。盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)中不存在跨膜區(qū)段或脂質(zhì)修飾基元，但MG53似乎主要限于骨骼肌中的膜結(jié)構(gòu)。用mAb5259進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，揭示了MG53在骨骼肌纖維橫切片的肌纖維膜和TT膜中的特異性標(biāo)記(圖3C)。而且，沖黃切片表明MG53在月幾纖維膜附近的局部濃度，且具有比肌纖維膜的整體膜蛋白通常所觀察的更寬的染色模式。因此，MG53是一種肌肉特異性TRIM家族蛋白，表現(xiàn)出獨(dú)特對(duì)TRIM家族蛋白的亞細(xì)胞分布才莫式。MG53過(guò)表達(dá)在可興奮和非可興奮細(xì)胞中均產(chǎn)生filapodia樣結(jié)抱。為了闡明MG53的細(xì)胞生物學(xué)功能，在C2C12肌源細(xì)胞以及中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)小鼠MG53cDNA。成肌細(xì)胞階段的C2C12細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源性MG53蛋白，然而分化的C2C12肌管則表達(dá)MG53。CHO細(xì)胞是不含內(nèi)源性MG53蛋白的非可興奮性上皮細(xì)胞。如圖4A(左圖)所示，將MG53cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入C2C12成月幾細(xì)月包或CHO細(xì)月包內(nèi)，則引起可由mAb5259識(shí)別的53kDa重組蛋白的表達(dá)。該重組蛋白的分子量等同于在兔和小鼠肌肉內(nèi)存在的內(nèi)源性MG53,乂人而i正實(shí)了所分離cDNA克隆的身份為MG53。用兩個(gè)包含編碼EGFP或MG53的cDNA的質(zhì)粒以10:1的比例共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供了一種利用熒光顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的便捷方法。通過(guò)共聚焦顯微鏡成像，我們觀察到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MG53的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化(圖4B)。特別地，細(xì)胞表膜的擴(kuò)展在瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MG53的CHO細(xì)胞或C2C12成肌細(xì)胞中均形成了不同的filapodia樣結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步研究MG53"i秀導(dǎo)的細(xì)力包形態(tài)變^f匕，生成了MG53的兩個(gè)GFP融合構(gòu)建體GFP-MG53和MG53-GFP，分別將GFP連接于MG53的氨基末端和羧基末端。盡管兩個(gè)融合蛋白均可在CHO細(xì)胞和C2C12成肌細(xì)胞中表達(dá)(圖4C,右圖)，^f旦GFP-MG53和MG53-GFP的亞細(xì)胞分布和功能作用卻顯著且令人意外的不同。利用共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)GFP-MG53融合蛋白在CHO和C2C12細(xì)胞中均既定位于細(xì)胞內(nèi)嚢泡又定位于細(xì)胞表膜(圖4C，左圖)。該結(jié)果與骨骼月幾纖維中的MG53免疫染色定4立一致(圖3C),表明MG53參與肌細(xì)胞中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)。意外的是，MG53-GFP融合蛋白在CHO和C2C12細(xì)胞中的分布才莫式主要為胞漿分布(圖4C,右圖)，這與GFP-MG53的膜附著性分布形成了鮮明對(duì)比。此夕卜，由MG53或GFP-MG53過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的強(qiáng)烈的filapodia樣膜擴(kuò)展在用MG53-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中完全不存在。由于與GFP融合對(duì)MG53的羧基末端的屏蔽改變了MG53的亞細(xì)胞分布，可能MG53的羧基末端的SPRY基元在將MG53錨定于不同膜區(qū)室時(shí)發(fā)揮了作用，且對(duì)于MG53功能來(lái)i兌是必要的(見(jiàn)圖13和14)?；罴?xì)胞熒光成像鑒定了在過(guò)表達(dá)GFP-MG53的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)嚢泡動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)，以及活躍的外吐融合和細(xì)胞表膜處的嚢泡出芽。密切》見(jiàn)察發(fā)現(xiàn)嚢泡融合事件發(fā)生在表膜(圖4D,左圖)。可清楚辨別含GFP-MG53嚢泡的出芽，且在轉(zhuǎn)染細(xì)胞附近觀察到了所釋放的細(xì)胞外嚢泡(圖4D，右圖)。綜上，細(xì)月包成^象研究表明MG53既可定4立于細(xì)月包內(nèi)嚢泡，又可耙向細(xì)胞表膜，而且其是膜融合和嚢泡出芽的關(guān)4建介導(dǎo)劑。MG53介導(dǎo)細(xì)胞損傷后骨骼肌纖維中的急性膜修復(fù)。嚢泡與質(zhì)膜的融合對(duì)于膜修復(fù)是必需的，之前的研究表明了對(duì)于dysferlin在保持骨骼肌膜完整性方面的作用。我們的結(jié)果表明，MG53能夠驅(qū)動(dòng)囊泡至質(zhì)膜的運(yùn)輸，可能介導(dǎo)在膜破壞后的修復(fù)過(guò)程。由于微電極物理穿透質(zhì)膜引起的急性細(xì)胞損傷，將GFP-MG53快速募集至損傷部位(圖12A)。如果發(fā)生了引起細(xì)胞石皮裂的4交嚴(yán)重?fù)p傷，則該修復(fù)部位4皮GFP-MG53密集標(biāo)記(圖12B)。此夕卜，在成熟的C2C12肌管中也觀察到了該急性膜修復(fù)(參見(jiàn)圖片(movie)2和3)。該數(shù)據(jù)表明，MG53介導(dǎo)的嚢泡運(yùn)輸在細(xì)胞膜急性修復(fù)中發(fā)揮積極作用。為了進(jìn)一步明確MG53在月幾膜^f奮復(fù)中的生理功能，生成了無(wú)MG53的小鼠模型(圖9-11)。在無(wú)應(yīng)激條件下，該wgW-小鼠存活達(dá)到11月齡。體內(nèi)應(yīng)激測(cè)試表明wg537-肌肉的膜修復(fù)功能存在81嚴(yán)重缺陷。如圖IOC所示，下Jt皮跑運(yùn)動(dòng)所i秀導(dǎo)的月莫損傷揭示wg53-A小鼠的比目魚(yú)肌收縮功能存在嚴(yán)重缺陷。即便沒(méi)有高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，與野生型(wO對(duì)照(未示出)相比，mg53-A比目魚(yú)月幾在離體疲勞刺激后的收縮功能恢復(fù)方面仍表現(xiàn)出一定的困難。在8-10月齡，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)損傷后的這些差異顯著增大。顯然，mg53-A肌肉存在較嚴(yán)重的損傷，其中與wf肌肉相比，觀察到收縮功能較弱且波動(dòng)(圖IOD)。將埃文斯藍(lán)染料注射入小鼠腹膜內(nèi)腔，可直接監(jiān)測(cè)下坡運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肌肉損傷后肌纖維膜的完整性。如圖IOE所示，從mg53-A小鼠分離的肌纖維的埃文斯藍(lán)染色顯著強(qiáng)于所述w肌肉，表明程度深的運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉損傷。這一點(diǎn)可以通過(guò)H/E染色證實(shí)，染色表明wgWV-肌肉中萎縮增力口，且老齡wgW-A小鼠比幼齡mg537-小鼠相比萎縮增加(圖IOA)。對(duì)從肌束提取的埃文斯藍(lán)總吸光度進(jìn)行定量測(cè)定，對(duì)下坡跑后mgW-Z-小鼠肌肉損傷增加提供了直接支持(圖10F)。與膜^f務(wù)復(fù)中MG53的作用一致，通過(guò)對(duì)分離過(guò)程中受損的單個(gè)趾短屈肌(FDB)肌纖維進(jìn)行免疫染色，可在損傷部位觀察到MG53濃度升高(圖IIA)。這些膜片將經(jīng)常與dysferlin染色共定位。通過(guò)測(cè)定在激光i秀導(dǎo)膜損傷后FM-143熒光染^+進(jìn)入單個(gè)FDB力幾纖維的量，我們直接評(píng)估了MG53介導(dǎo)的膜修復(fù)功能。wf肌纖維具有內(nèi)在膜修復(fù)功能，并且可充分抵御激光誘導(dǎo)的肌纖維膜損傷，因?yàn)槠浔憩F(xiàn)為可有效排除FM-143熒光染料(圖IIB)。激光誘導(dǎo)損傷后，可7見(jiàn)察到FM-143熒光染泮牛明顯進(jìn)入wg53-AFDB肌纖維(圖11C)。肌纖維膜的激光損傷后，F(xiàn)DB肌纖維內(nèi)FM-143的時(shí)間依賴性蓄積對(duì)mg53-A肌肉的膜修復(fù)功能缺陷提供了直接支持(圖IID)。MG53表達(dá)對(duì)于保持正常心肌膜完整性是必要的。附gW7-小鼠的缺陷并不限于骨骼肌纖維。在注射埃文斯藍(lán)染料的過(guò)程中，約50%82的mg53V-小鼠在注射16小時(shí)內(nèi)死亡，相比而言，所注射的野生型動(dòng)物死亡比例為0。尸體剖4企發(fā)現(xiàn)，甚至在沒(méi)有運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的情況下，11^53-/-心臟表現(xiàn)出強(qiáng)烈的心肌纖維埃文斯藍(lán)染色(圖9)。我們還發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)將大大增加11^53-/-心臟中的埃文斯藍(lán)染色程度。肌肉發(fā)育過(guò)程中MG53在肌管形成方面的作用。膜》務(wù)復(fù)^f又是需要細(xì)胞內(nèi)嚢泡動(dòng)態(tài)運(yùn)輸以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)重組的細(xì)胞過(guò)程之一。骨骼肌中一個(gè)這種過(guò)程發(fā)生在肌形成的過(guò)程中。在成肌細(xì)胞分化成肌管的過(guò)禾呈中，單核成月幾細(xì)月包必須融合在一起形成多核月幾管。為了直接檢測(cè)MG53介導(dǎo)的膜融合對(duì)骨駱肌形成的作用，采用一種特異性RNA干擾探針來(lái)抑制內(nèi)源性MG53在正分化的C2C12肌管中的表達(dá)。相比于轉(zhuǎn)染有針對(duì)錯(cuò)配形式的MG53靶序列的非特異性shRNA的細(xì)胞，識(shí)別小鼠MG53cDNA核普^f列632-652的小發(fā)夾(sh)RNA探針抑制了轉(zhuǎn)染有shRNA-MG53的細(xì)胞中80%以上的MG53表達(dá)(圖5A)。MG53的急性抑制引起C2C12肌管分化的明顯減少(圖5B)。在血清奴J我誘導(dǎo)的分化后第5天和第10天，以shRNA-MG53探針轉(zhuǎn)染的C2C12成肌細(xì)胞所形成的肌管顯著較少(圖5C)。這些結(jié)果表明MG53的正常表達(dá)對(duì)于C2C12成月/L細(xì)月包分化成H幾管是必需的。因?yàn)樾「C蛋白-3受發(fā)育過(guò)程調(diào)節(jié)(圖6A)，且可與MG53相互作用(圖6B)，因此我們檢測(cè)了MG53所誘導(dǎo)的C2C12中的filapodia樣結(jié)構(gòu)是否受小窩蛋白-3過(guò)表達(dá)的影響。如圖6D所示，小窩蛋白-3和MG53在兩種C2C12成月幾細(xì)月包中同時(shí)出現(xiàn)的過(guò)表達(dá)引起對(duì)與GFP-MG53過(guò)表達(dá)相關(guān)filapodia樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)的顯著抑制。平均而言，用小窩蛋白-3和GFP-MG53(比例為10:1)轉(zhuǎn)染的C2C12成月幾細(xì)月包分別4吏filapodia樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)下降82±6%(圖6E和F)。這些結(jié)果表明，小窩蛋白-3代表了MG53介導(dǎo)的膜融合事件的分子調(diào)節(jié)劑之一。為了進(jìn)一步研究小窩蛋白-3在MG53亞細(xì)胞分布和filapodia樣結(jié)構(gòu)形成方面的作用，構(gòu)建一個(gè)小窩蛋白-3shRNA質(zhì)粒(表1),其包含獨(dú)立的紅色焚光蛋白表達(dá)框，用來(lái)為shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提供標(biāo)志物。圖7A中示出的蛋白印跡分析表明，shRNA-小窩蛋白-3探針能夠高效抑制瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有小窩蛋白-3cDNA的CHO細(xì)胞中的小窩蛋白-3表達(dá)，而不影響小窩蛋白-1的表達(dá)。表1.用于構(gòu)建用于MG53和小窩蛋白-3的shRNA的寡聚物<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>的shRNAIDNO.24)TTCAAGAGACTCCTTGCAGTGAATGTCCTTTTTTACCGGTG-3'反義(SEQIDNO.25)5'-AATTCACCGGTAAAAAAGGACATTCACTGCAAGGAGTCTCTTGAACTCCTTGCAGTGAATGTCCG-3'盡管用非特異性shRNA轉(zhuǎn)染的C2C12成肌細(xì)胞表現(xiàn)出正常的分化模式，如圖7B左圖中大量紅色熒光標(biāo)記的肌管所示，但小窩蛋白-3的急性抑制可顯著抑制C2C12成肌細(xì)胞分化為肌管(圖7B，右圖)。平均而言，加入分化介質(zhì)后6天，由紅色熒光標(biāo)記的shRNA-小窩蛋白-3轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞中少于10%可分化為成熟的肌管(圖7C)。該結(jié)果與其他研究者的前期研究結(jié)果一致，證實(shí)了小窩蛋白-3的表達(dá)對(duì)于C2C12肌管分化是必要的。共聚焦顯樣M竟成4象表明，將shRNA-小窩蛋白-3轉(zhuǎn)染入C2C12成月幾細(xì)力包看來(lái)未影響這些細(xì)力包中所表達(dá)GFP-MG53的亞細(xì)力包分布(圖7D)。特別的，用shRNA-小窩蛋白-3或非特異性shRNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，GFP-MG53的獨(dú)特嚢泡分布才莫式和filapodia樣結(jié)構(gòu)均不受影響。該結(jié)果與C2C12細(xì)胞的成肌細(xì)胞階段缺乏小窩蛋白-3表達(dá)相一致。由于肌管分化中小窩蛋白-3的必要特性，測(cè)定了曱基-P-環(huán)糊精(M-PCD)對(duì)過(guò)表達(dá)GFP-MG53的C2C12成肌細(xì)胞的作用，以進(jìn)一步分析MG53-小窩蛋白相互作用對(duì)膜循環(huán)的功能性作用。M-pCD可從細(xì)胞膜提取膽固醇，已經(jīng)廣泛用作破壞細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷結(jié)構(gòu)的試劑。如圖8A中所示，過(guò)表達(dá)GFP-MG53的成肌細(xì)胞表現(xiàn)為嚢泡在細(xì)胞內(nèi)以及肌纖維膜處的自發(fā)性融合。這些自發(fā)性融合事件比較緩慢，以分鐘為數(shù)量級(jí)而發(fā)生。用M-PCD處理后，外吐事件大大增加，引起膜融合加速以及膜嚢泡大量出芽(圖8B)。這些初始改85變被迅速誘導(dǎo)，延長(zhǎng)的與M-pCD的培育，則引起GFP-MG53在成肌細(xì)胞內(nèi)的增溶(圖8C)。小窩蛋白介導(dǎo)的膜嚢泡的內(nèi)化可能在抑制MG53過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的大量外吐事件中發(fā)揮調(diào)節(jié)性作用。而且，MG53與小窩蛋白的相互作用對(duì)于^f呆持MG53的亞細(xì)力包定位是必需的。這個(gè)結(jié)i侖得到其4也利用突變形式小窩蛋白(SEQIDN0.8)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。TRIM和SPRY基元在MG53功能中的作用。對(duì)MG53結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)/功能評(píng)價(jià)(圖13)揭示了GFP與MG53融合在MG53的細(xì)胞內(nèi)分布方面的顯著極性。特別的，GFP與MG53羧基末端的融合改變了MG53分配至嚢泡區(qū)室以及靶向于力幾纖維膜的能力。為了進(jìn)一步4企測(cè)TRIM和SPRY結(jié)構(gòu)i或在促進(jìn)MG53力莫融合功能方面的作用，生成了一系列偶聯(lián)于GFP的缺失突變體(圖13A)。為了分析MG53的這些突變構(gòu)建體的亞細(xì)力包定位，在瞬時(shí)表達(dá)后對(duì)C2C12成肌細(xì)胞進(jìn)行共聚焦顯微鏡成像。如圖13B(右圖)所示，GFP-TRIM或TRIM-GFP^皮主要定位于細(xì)月包內(nèi)嚢泡，月幾纖維膜上則無(wú)明顯沖示"i己。該結(jié)果表明，SPRY結(jié)構(gòu)i或(GFP-TRIM或TRIM-GFP中不存在)對(duì)于MG53輩巴向于月幾纖維月莫是必需的。MG53-GFP主要表現(xiàn)為胞漿分布(圖13B，左圖)這一事實(shí)，進(jìn)一步支持SPRY在4吏MG53草巴向于細(xì)胞表膜方面的作用。有趣的是，盡管GFP-SPRY或SPRY-GFP均表現(xiàn)主要為胞漿分布模式，但它們被很明顯地從細(xì)胞內(nèi)嚢泡排除(圖13B,中圖)。所述胞漿分布模式以及GFP-SPRY和SPRY-GFP在細(xì)胞內(nèi)嚢泡的定位的排除，這可能反映了TRIM的作用。推測(cè)起來(lái)，TRIM基元可能介導(dǎo)MG53附著于細(xì)胞內(nèi)嚢泡(圖13B,右圖)。SPRY結(jié)構(gòu)域不足以獨(dú)自靶向于肌纖維，因此TRIM結(jié)構(gòu)域必須與SPRY結(jié)構(gòu)域一前一后存在，用于MG53恰當(dāng)運(yùn)輸至肌纖維膜。此外，我們的免疫共沉淀數(shù)據(jù)表明小窩蛋白-3與MG53的TRIM基元相互作用(圖13C)。因此，有可能MG53與小窩蛋白-3之間的功能性相互作用成為某些造成在C2C12成月幾細(xì)月包中GFP-SPRY和SPRY-GFP分散才莫式的細(xì)月包因素的基礎(chǔ)?？傮w而言，MG53在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的受調(diào)節(jié)分布，可能來(lái)自TRIM與SPRY結(jié)構(gòu)i或之間的十辦調(diào)作用。為了十合當(dāng)?shù)腗G53亞細(xì)力包定4立而只于TRIM和SPRY的必需性，還具有明顯的功能顯著性，因?yàn)檫@些缺失突變體中沒(méi)有一個(gè)表現(xiàn)出從過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)MG53所，見(jiàn)察到的filapodia結(jié)構(gòu)或強(qiáng)烈的嚢泡出芽事件。MG53可在非月幾細(xì)月包類型中充分發(fā)4軍作用。對(duì)MG53在肌源C2C12細(xì)胞中和分離的骨骼肌纖維中的功能進(jìn)行分析，表明MG53在橫紋肌中嚢泡運(yùn)輸和膜修復(fù)的必要作用。考慮到膜修復(fù)對(duì)于保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是一個(gè)必要因素，因此有可能在其他非肌細(xì)胞類型中的類似修復(fù)機(jī)制也采用類似的分子機(jī)制以促進(jìn)該過(guò)程。為了沖全測(cè)該可能性，之前用C2C12肌源細(xì)胞開(kāi)展的部分實(shí)驗(yàn)在非肌中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞上重復(fù)進(jìn)行。在這些細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了與C2C12細(xì)胞中所)現(xiàn)察到的才及為類似的表型。首先，GFP-MG53可產(chǎn)生質(zhì)膜的filapodia樣突出，且定位于細(xì)胞內(nèi)嚢泡，并定位于質(zhì)膜(圖6和14)。其次，MG53缺失蛋白與在C2C12細(xì)胞中觀察到的行為方式相同。最后，小窩蛋白-3也可控制表達(dá)^CHO細(xì)胞中的MG53的活性(圖14)。因此，這些研究表明，MG53通過(guò)保守的分子機(jī)制而發(fā)揮作用，該分子才幾制存在于除月幾肉之外的其4也細(xì)月包類型中。重組MG53和TAT-MG53的純化。為了將MG53供應(yīng)至耙細(xì)月包，以促進(jìn)更快的細(xì)胞再生，將源于HIV中TAT基因的細(xì)胞穿透肽序列偶聯(lián)于全長(zhǎng)MG53(TAT-MG53)以及幾個(gè)MG53缺失突變體(圖15A)。這些融合蛋白可在大腸桿菌(Eco/O細(xì)菌中表達(dá)，并利用親和層析有效地純化(圖15B和15C)。我們之前已經(jīng)證實(shí)，將這些融合蛋白應(yīng)用于細(xì)胞單層可引起重組蛋白有效易位入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。生成這些融合蛋白應(yīng)使得我們能夠增加靶細(xì)胞內(nèi)MG53的量，因此我們可以實(shí)現(xiàn)MG53對(duì)皮組織的治療效應(yīng)。重組MG53的表達(dá)可在真核或原核細(xì)胞內(nèi)實(shí)施。圖18示出了重組MG53在真核或原核系統(tǒng)中均可表達(dá)。簡(jiǎn)單而言，重組MG53在Sf9細(xì)月包中作為既含TAT肽部分又含6-組氨酸標(biāo)簽(6-HIStag)的融合蛋白而表達(dá)。該組氨酸標(biāo)簽可用來(lái)利用本領(lǐng)域中熟知的過(guò)濾層析l支術(shù)而分離并純化重組蛋白。圖(A)示出了重組人類MG53蛋白(箭頭)的考馬斯藍(lán)染色凝膠，該餾分是利用Ni-NTA柱從Sf9細(xì)胞分離而來(lái)。Input-細(xì)月包提耳又物，F(xiàn)T:流出液，MH^志物，E—先脫次數(shù)。(B)從Sf9細(xì)胞分離的重組人類TAT-MG53(箭頭)的考馬斯藍(lán)染色凝膠。(C)中的考馬斯藍(lán)染色凝膠提供了被表達(dá)的并從大腸桿菌(E.coli)中分離的小鼠TAT-MG53(箭頭)。重組人類TAT-MG53可穿透不同來(lái)源的細(xì)月包。為了使MG53發(fā)揮作用，其必須存在于細(xì)胞內(nèi)。為了證實(shí)重組MG53可以以治療上有意義的量跨細(xì)胞膜而易位，將HL-1心肌細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞與約4或8fig/mL的重組人類TAT-MG53于37。C一起培育15分鐘(圖17)。將細(xì)胞在緩沖鹽溶液中洗滌三次，然后裂解進(jìn)行蛋白印跡分析。蛋白印跡表明對(duì)照細(xì)胞(對(duì)照)不含有內(nèi)源性MG53，然而那些與TAT-MG53—起培育的細(xì)月包則包含充足的細(xì)月包內(nèi)TAT-MG53。我們注意到，由于該蛋白添加了TAT細(xì)胞穿透肽，因此從骨骼肌提取物(肌肉)可見(jiàn)TAT-MG53略大于MG53。通過(guò)TAT-MG53融合蛋白的細(xì)月包內(nèi)加工，可生成多個(gè)條帶。因此，在MG53多肽療法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種重組多肽，其包含一個(gè)TAT多肽部分和一個(gè)MG53多肽部分，其中所述TAT和MG53多肽部分存在于單條相鄰4妄的多肽鏈內(nèi)。MG53在人類細(xì)胞系中的異源表達(dá)引起響應(yīng)急性損傷的膜寸奮復(fù)。圖16表明，重組MG53可在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并保留其修復(fù)細(xì)胞膜損傷的能力，而并不表達(dá)額外的蛋白。特別的，將MG53作為與紅色熒光蛋白(RFP)的融合蛋白而克隆入表達(dá)載體內(nèi)。在人胚腎細(xì)胞系(HEK293成纖維細(xì)胞系)中表達(dá)該融合蛋白，并比較該細(xì)胞與僅表達(dá)FRP的細(xì)胞的修復(fù)膜損傷的能力。圖(a)證實(shí)，穩(wěn)定表達(dá)RFP(紅色熒光蛋白)對(duì)照蛋白的細(xì)胞系表現(xiàn)為胞漿表達(dá)才莫式。然而，在4又表達(dá)RFP的HEK293細(xì)月包中(圖16A)，孩i電^L損傷未引起RFP易位至損傷部位(箭頭)。RFP熒光的部分褪色則是由于胞外緩沖液(*)的過(guò)量進(jìn)入。與之對(duì)比的是，穩(wěn)定表達(dá)RFP-MG53(c)的HEK293細(xì)月包顯示定位至細(xì)月包內(nèi)嚢泡。表達(dá)RFP-MG53(d)的HEK293細(xì)月包的4效電才及損傷引起MG53在90秒以內(nèi)大量易位至損傷部位(箭頭)。該結(jié)果表明重組MG53可以用于修復(fù)任何細(xì)胞環(huán)境中的細(xì)胞和/或組織損傷。盡管當(dāng)在異源系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，重組MG53能夠修復(fù)對(duì)細(xì)胞膜的損傷，但本發(fā)明并不限于此。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋了共表達(dá)MG53和小窩蛋白-3以促進(jìn)膜^f復(fù)乂人而治療或預(yù)防組織損傷的方法。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種包含TATA-MG53多肽和TAT-小窩蛋白-3多肽的治療纟且合凈勿。MG53與膜和膜^奮復(fù)的關(guān):f關(guān)依賴于與磷脂酰絲氨酸的相互作甩。脂質(zhì)譜(圖19)表明，純化的重組MG53可與磷脂酰絲氨酸(PS)特異性相互作用，而PS是優(yōu)先出現(xiàn)在質(zhì)膜內(nèi)層以及細(xì)胞內(nèi)嚢泡胞質(zhì)面的脂質(zhì)(圖19A)。如果該相互作用使MG53連接至細(xì)胞內(nèi)膜，則可通過(guò)膜聯(lián)蛋白-V(—種已知與PS相互作用的蛋白)的遷移來(lái)89監(jiān)測(cè)膜破壞后的嚢泡累積。利用膜聯(lián)蛋白-V-GFP,我們觀察到膜聯(lián)蛋白-V-GFP在C2C12成肌細(xì)胞損傷部位的迅速標(biāo)記(圖19B)。膜聯(lián)蛋白-V-GFP的累積可通過(guò)RFP-MG53的共表達(dá)而加速，與MG53介導(dǎo)急性膜修復(fù)過(guò)程的作用一致?；罴?xì)胞成像證實(shí)了RFP-MG53和膜耳關(guān)蛋白-V-GFP朝向損傷部位的有序移動(dòng)。示例斗生方'法M053的,定和義嫠前面描述了(21)用于兔骨駱肌微粒體蛋白的mAb文庫(kù)的制備和篩選。mAb5259(IgG亞類)的制備以及免疫親和性純化如前所述而進(jìn)行(21)。純化的MG53進(jìn)行氨基酸測(cè)序分析，已確定的全部序列均在兔MG53cDNA中編碼(凄t據(jù)未示出)。在凄t據(jù)庫(kù)中的同源性4叟索發(fā)現(xiàn)，小鼠和人類MG53利用部分兔氨基酸序列。從小鼠基因組DNA中擴(kuò)增小鼠MG53基因的一個(gè)外顯子區(qū)域，并利用32P標(biāo)記的外顯子片段篩選兔和小鼠骨骼肌文庫(kù)以得到全長(zhǎng)cDNA。名瘦紐織化夢(mèng)^^危瘦染悉為v^f如前所述利用mAb5259進(jìn)4亍免疫化學(xué)分析(21)。利用結(jié)合有15nm金顆粒的二抗的免疫電4竟術(shù)^口前戶斤述而進(jìn)4亍(17)。勿乂敏培#用于全部研究的C2C12鼠類成肌細(xì)胞系從美國(guó)典型菌種保藏中心(弗吉尼亞，馬納薩斯)購(gòu)得。細(xì)胞在37°C的濕潤(rùn)環(huán)境中用5%C02中培養(yǎng)，C2C12采用DMEM培養(yǎng)基，CHO細(xì)胞采用HamF12培養(yǎng)基，用10%的胎牛血清、100單位/ml的青霉素和100|ig/ml的鏈霉素補(bǔ)充。為了誘導(dǎo)肌管分化，將C2C12成月幾細(xì)胞培養(yǎng)至匯合階段(confluence),將培養(yǎng)基更換成含2%馬血清、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100(ag/ml)的DMEM。為了進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將C2C12成肌細(xì)胞或CHO細(xì)胞以70%匯合涂布于玻璃底平皿中。24小時(shí)后，利用GeneJammer試劑(Stratagene)用上述質(zhì)4立轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)或個(gè)別實(shí)驗(yàn)指定的時(shí)間，通過(guò)活細(xì)胞共聚焦成像使細(xì)胞可視化。在某些實(shí)驗(yàn)中，可使C2C12成肌細(xì)胞在觀察前的指定時(shí)間內(nèi)分化成肌管。全長(zhǎng)小鼠MG53cDNA和相關(guān)截短突變體利用補(bǔ)充的表1中描述的引物通過(guò)PCR而生成。為了構(gòu)建pCMS-MG53，用恰當(dāng)限制性酶消化后，將PCR擴(kuò)增的cDNA在NheI/XbaI位點(diǎn)插入pCMS-EGFP載體內(nèi)(Invitrogen)。為了構(gòu)建GFP-MG53、GFP-TRIM、GFP國(guó)SPRY、MG53-GFP、TRIM-GFP和SPRY-GFP,將PCR產(chǎn)物在XhoI/Xbal位點(diǎn)插入pEGFP-Cl中，或在XhoI/KpnI位點(diǎn)插入pEGFP-Nl中。活細(xì)y^威謬為了監(jiān)測(cè)GFP-MG53的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，在玻璃底平皿(BioptechsInc.)中培養(yǎng)CHO或C2C12細(xì)月包，并用上述質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。利用BioRad2100Radiance激光掃描共聚焦顯樣史鏡通過(guò)63X1.3NA油浸物鏡以3.18s/幀的速度采集熒光圖像(512x512)。iA^4z'為、^f用于MG53的shRNA抑制的耙序列處于小鼠MG53cDNA的622-642位置處(GAGCTGTCAAGCCTGAACTCT)。對(duì)于小窩蛋白-3，把序列處于363-380位置處(GACATTCACTGCAAGGAGATA)。合成了互補(bǔ)的正義和反義寡核苦酸。為了構(gòu)建MG53shRNA和對(duì)照質(zhì)粒，將退火的寡核香酸在Acc651/Hind111限制性酶位點(diǎn)插入psiRNA-hHlGFPzeoG2(InvivoGene)內(nèi)。為了小窩蛋白-3shRNA和對(duì)照質(zhì)粒，將退火的寡核苷酸在EcoRI/BamHI限制性酶<立點(diǎn)插入pRNAiDsRed載體(BDBiosciences)內(nèi)。每一種載體均具有獨(dú)立的熒光蛋白表達(dá)框(綠或紅)，以作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染的標(biāo)志物。所有質(zhì)并立均利用側(cè)翼引物(flankingprimers)通過(guò)直4妄測(cè)序而證實(shí)，并通過(guò)蛋白印跡分析才企測(cè)MG53和小窩蛋白-3蛋白的表達(dá)下調(diào)。蛋^伊遂^k危瘦共沉淀利用標(biāo)準(zhǔn)^支術(shù)進(jìn)行免疫印跡。簡(jiǎn)單而言，收集C2C12或CHO細(xì)胞，并于存在蛋白酶抑制劑(Sigma)混合物(cocktail)的情況下用冰預(yù)冷的改良RIPA纟爰沖液(150mMNaCl，5mMEDTA,1%NP40，20mMTris-HCl，pH7.5)裂解。在4-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離20昭總蛋白。采用標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行MG53和小窩蛋白-3的免疫共沉淀研究。簡(jiǎn)單而言，將骨骼肌組織或C2C12肌管在0.5ml改良RIPA》爰沖液中裂解。全細(xì)月包裂解物(500jug)與5ng多克隆抗MG53(多克隆抗體)或抗小窩蛋白-3抗體(mAb)—起過(guò)夜孵育。作為陰性對(duì)照，將500(ag全細(xì)胞裂解物與5昭正常兔和小鼠IgG—起孵育，并如上進(jìn)行處理。通過(guò)培育2小時(shí)將免疫復(fù)合物收集在蛋白G瓊脂糖珠子上并用RIPA緩沖液洗滌4次。應(yīng)該理解，本文描述的詳細(xì)實(shí)例和實(shí)施方式僅為了說(shuō)明的目的而通過(guò)實(shí)例給出，絕不能認(rèn)為會(huì)限制本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)這些例子能夠想到很多種改良或變化，這些改良或變化包含在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)并且認(rèn)為其包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。例如，成分的相對(duì)量可加以變化以〗吏預(yù)期結(jié)果達(dá)到最伊乙，可加入其他成分，和/或用類似的成分替所述成分中的一種或多種。其他與本發(fā)明的系統(tǒng)、方法和工藝相關(guān)的有利特;f正和功能性，/人所附4又利要求中將變得很明顯。9權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，包含一種核酸序列，所述核酸序列與SEQIDNO.2、4或6中至少一種具有至少30％的序列同源性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸序列進(jìn)一步包含與SEQIDNO.2、4或6中至少一種的至少一部分鄰4妻的多核普酸成分，其中所述多核苦酸位于所述核酸的5'端或3，端。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸序列進(jìn)一步包含剪接變體、點(diǎn)突變、取代、插入、缺失、或單核苷酸多態(tài)斗生中的至少一種。4.一種載體，包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，以及與SEQIDNO.2、4或6中的至少一種具有至少30%同源性的核酸分子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，進(jìn)一步包含可操作性連接于所述核酸分子的啟動(dòng)子。6.—種分離的細(xì)胞，包含權(quán)利要求5所述的載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。9.一種組合物，包含斥又利要求1所述的核酸分子和一種載體。10.—種試劑盒，包括在一個(gè)或多個(gè)容器中的權(quán)利要求9所述的組合物。11.才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸序列編碼一種包含SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種氨基酸序列的多肽。12.—種分離的多肽，包含與SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種具有至少30%序列同源性的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的多肽，進(jìn)一步包括藥用載體、賦形劑和佐劑中的至少一種。14.一種用于治療或預(yù)防細(xì)胞損傷的方法，包括給予一種包含治療或預(yù)防有效量的多肽的組合物，以及藥用載體、賦形劑或佐劑中的至少一種，所述多肽與SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種具有至少30%的同源性。15.—種篩選用于治療或預(yù)防細(xì)胞損傷的化合物的方法，包括下列步驟提供一種細(xì)胞，其表達(dá)一種核酸，所述核酸編碼一種多肽，所述多肽具有與SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種具有至少30%同源性的氨基酸序列；提供受試化合物的文庫(kù)；用所述受試4b合物處理所述細(xì)胞；i秀導(dǎo)對(duì)所述細(xì)力包的膜的損傷；測(cè)定所述細(xì)胞修復(fù)膜損傷的能力；以及比較所述經(jīng)處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞的4》復(fù)能力。16.—種治療或預(yù)防力幾細(xì)力包損傷的方法，包括J合予治療或預(yù)防有凌文量的與SEQIDNO.1、3、5或7具有至少30%同源性的至少一種多肽。17.—種美容纟且合物，包含與SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種具有至少30%同源性的多肽以及一種美容用載體。18.—種治療遭受燒傷的患者的方法，包括給予需要治療的個(gè)人有歲丈量的與SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種具有至少30%同源性的多肽，以及藥用載體、I武形劑或佐劑。19.一種組合物，包含一種核酸分子，所述核酸分子形成抑制性小RNA，并通過(guò)RNA干護(hù)L來(lái)下調(diào)SEQIDNO.2、4或6中至少一種的核酸的表達(dá)，其中所述核酸分子的長(zhǎng)度為約IO至約100個(gè)核普酸；其中所述抑制性核酸分子包含一種核苷酸序列，它與從MG53基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA具有足夠的互補(bǔ)性，以使所述抑制性核酸分子通過(guò)RNA干擾直接或間接引起所述RNA的裂解。20.—種診斷或監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)細(xì)胞修復(fù)障礙的方法，包括4企測(cè)所述患者體內(nèi)的基因多態(tài)性、基因的表達(dá)水平或這二者，以診斷或監(jiān)測(cè)所述患者體內(nèi)的障礙，其中所述基因包含SEQIDNO.2、4或6中至少一種的核苷酸序列。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述表達(dá)水平通過(guò)測(cè)定由所述基因表達(dá)的RNA水平而才企測(cè)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括在檢測(cè)由所述基因表達(dá)的RNA水平之前從所述患者體內(nèi)分離RNA。23.才艮據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多態(tài)性或表達(dá)水平通過(guò)PCR或通過(guò)寡核苦酸雜交而檢測(cè)。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述表達(dá)通過(guò)測(cè)定所述基因的蛋白7JC平而4企測(cè)。25.—種能夠免疫特異性結(jié)合至一種多肽的抗體，所述多肽具有SEQIDNO.1、3、5或7中至少一種的氨基酸序列。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體、抗體片段、人源化抗體。27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述化合物是MG53多肽的激動(dòng)劑。28.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述化合物是小窩蛋白-3的激動(dòng)劑。29.才艮據(jù)4又利要求15所述的方法，其中所述化合物是MG53多肽磷脂相互作用的拮抗劑。30.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述化合物是小窩蛋白-3多肽的^吉抗劑。31.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述化合物是小窩蛋白-3/MG53相互4乍用的4吉4元?jiǎng)?2.—種MG53激動(dòng)劑或拮抗劑，包括選自由肽、肽類似物、4艮肽和擬肽構(gòu)成的《且中的至少一個(gè)成員，其中所述MG535敫動(dòng)劑或拮抗劑具有約10至約200個(gè)氨基酸殘基，且其中所述MG53激動(dòng)劑或拮抗劑與SEQIDNO.1或SEQIDNO.8的一部分具有至少30%的同源性。33.—種融合蛋白，包含一個(gè)具有SEQIDNO.1、3、5、7、8中至少一種或其片^殳的序列的多肽部分，并包含至少一個(gè)定位于氨基末端、羧基末端或這兩端的其他多肽，其中這些多肽部分位于單條鄰接的多肽鏈內(nèi)。34.4艮據(jù)4又利要求33所述的融合蛋白，其中所述至少一個(gè)其他多肽部分包括熒光蛋白。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的融合蛋白，其中所述至少一個(gè)其他多肽部分包招「TAT多肽或其部分。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的融合蛋白，其中所述至少一個(gè)其他多肽部分包括TAT多肽或其部分以及HIS標(biāo)簽。37.—種治療性組合物，包含具有SEQIDNO.1或其部分的多肽和至少一種具有SEQIDNO.8或其部分的第二多肽的組合，以及藥用l武形劑或載體。38.才艮據(jù)權(quán)利要求37所述的治療性組合物，其中所述多肽中的至少一種是融合蛋白，其在氨基末端、羧基末端或兩端包含至少一個(gè)其他多肽部分，其中所述多肽部分位于單條鄰接的多肽鏈內(nèi)。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的治療性組合物，其中所述融合蛋白的所述至少一個(gè)其4也多肽部分是TAT多肽或其部分。40.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中進(jìn)一步包括同時(shí)給予另一種包含SEQIDNO.8或其部分的多肽。41.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞損傷是由于心血管病所致。42.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞損傷是由于運(yùn)動(dòng)或劇烈體力活動(dòng)所致。43.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞損傷是由于手術(shù)操作或裝置所致。44.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的多肽，進(jìn)一步包含美容用載體。45.—種用于緩解由于手術(shù)操作或裝置所致的組織損傷的手術(shù)佐劑，包含4又利要求12所述的多肽。全文摘要本文披露了編碼新型多肽的核酸序列。本文還披露了由這些核酸序列編碼的多肽和免疫特異性結(jié)合該多肽的抗體，以及上述多肽、多核苷酸或抗體的衍生物、變異體、突變體或片段。本發(fā)明進(jìn)一步披露了治療、診斷和研究方法，用于診斷、治療和預(yù)防涉及這些新型人類核酸和蛋白中任何一種的疾病。文檔編號(hào)C12N5/00GK101511181SQ200780033666公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日發(fā)明者蔡傳喜,諾厄·魏斯勒德,麻建杰申請(qǐng)人:新澤西醫(yī)科和牙科大學(xué)