專利名稱：用于確定細(xì)胞色素p450 1a2、2a6和2d6、pxr以及udp-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1a基因的基因 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的設(shè)備和方法涉及用于確定細(xì)胞色素P450 1A2、2A6和2D6、PXR和UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A基因的基因型的單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(htSNP)和基因芯片，更具體而言，涉及用于確定人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2(＝PXR)和UGT1A基因的單倍型的htSNP的選擇方法、確定所述基因的基因型的方法和用于所述方法的基因芯片。

背景技術(shù)：
出于遺傳多樣性的原因，個(gè)體對(duì)藥物的毒性和效果會(huì)有不同反應(yīng)。因此，在藥物的初始開發(fā)階段考慮重要藥用蛋白相對(duì)于遺傳多樣性的效果是必要的，因?yàn)檫@可以降低藥物開發(fā)的可能性失敗。單倍型是決定個(gè)體之間的遺傳多樣性的因素之一。單倍型指的是在單個(gè)研究種群中每個(gè)基因序列的多態(tài)性的組合。單倍型比個(gè)體多態(tài)性提供了更準(zhǔn)確和更可靠的關(guān)于遺傳多樣性的信息。
人類細(xì)胞色素P450是血紅蛋白的一部分，血紅蛋白協(xié)助氧化外來(lái)化學(xué)物質(zhì)如藥物、致癌物質(zhì)和毒素以及內(nèi)部物質(zhì)如膽固醇、脂肪酸和維生素(Nelson等，Phamacogenetics 61-42，1996)。在肝、腎、小腸和肺中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450的各種亞科。
人類細(xì)胞色素P450 1A2(下文稱CYP1A2)基因以及CYP1A1和CYP1B1都是CYP1基因群中包含的藥物代謝酶。CYP1A2主要在肝臟中產(chǎn)生，并占細(xì)胞色素酶總量的15％。CYP1A2參與重要醫(yī)用藥物如咖啡因、氯氮平(clozapine)、丙咪嗪(imiparamine)和普萘洛爾(propranolol)的代謝。另外，CYP1A2催化內(nèi)部合成物質(zhì)(如17β-雌二醇、尿卟啉原III)，以及致癌物質(zhì)的生物活化(如多環(huán)芳烴的環(huán)氧化和芳香胺/雜環(huán)胺的N-羥基化)(Brosen K.，Clinical Pharmacokinetic，1995，29(suppl1)20-25；Josephy PD.，Environ.Mol.Mutagen，2001，3812-18)。人類細(xì)胞色素P4502A6(下文稱CYP2A6)基因位于19號(hào)染色體上，而具有非常相似的基因序列的偽基因CYP2A7處于CYP2A6基因之上。CYP2A6酶是一種將尼古丁轉(zhuǎn)化為可替寧(cotinine)的主要酶，且CYP2A6酶參與大約80％的尼古丁代謝。CYP2A6酶將抗癌藥物替加氟(tegafur)轉(zhuǎn)化為體內(nèi)活性藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。所述酶主要由肝臟產(chǎn)生，并且在諸如肺、大腸、乳腺、腎和子宮等器官中少量表達(dá)(Drus Metab Dispos.，29(2)91-5，2001；AdvDrug Deliv Rev.，18；54(10)1245-56，2002)。
人類細(xì)胞色素P4502D6(下文稱CYP2D6)基因位于22號(hào)染色體上，而偽基因CYP2D7和CYP2D8處于CYP2D6基因的一端。已知由所述基因編碼的酶負(fù)責(zé)100種以上的重要臨床藥物(包括精神活性藥物、心血管藥物、嗎啡藥物等)的代謝。
由所述CYP2D6基因編碼的酶主要由肝臟產(chǎn)生。盡管所述酶占細(xì)胞色素P450酶總量的大約2％，它們卻是參與30％的藥物代謝的主要酶類。
所述酶在個(gè)體中的活性各異，并根據(jù)其活性級(jí)別被劃分為PM(弱代謝劑)、IM(中等代謝劑)、EM(強(qiáng)代謝劑)和UM(超快代謝劑)。所述基因的遺傳多態(tài)性部分地造成了所述酶的不同活性。眾所周知，CYP1A2基因展現(xiàn)了遺傳多態(tài)性。到目前為止，在所述CYP1A2基因的啟動(dòng)子、外顯子和內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了24種以上的變異體。到2007年6月為止，已有36種單倍型(遺傳變異體的組合)(http://www.cypalleles.ki.se/cyp1a2.htm)、50種CYP2A6的基因型(http://www.cyDalleles.ki.se.cyp2a6.htm)以及大約80種CYP2D6基因的遺傳多態(tài)性(www.immi.ki.se.cypalleles/cyp2d6.htm)，它們?cè)谖锓N之間有極大的差異。由于各種類型的基因變異體和單倍型已經(jīng)被報(bào)道過(guò)，因此有必要通過(guò)最小的單核苷酸多態(tài)性(SNP)確定準(zhǔn)確的單倍型從而增強(qiáng)時(shí)間和成本有效性。
在各種藥物被人體吸收并排出以前，代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)將一直進(jìn)行。細(xì)胞色素P450(CYP)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)。對(duì)參與藥物代謝的CYP酶的研究一直在積極地進(jìn)行。目前，15種CYP酶，尤其是CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4、CYP2B6、MDR1和CYP2C19，已被報(bào)道具有遺傳多態(tài)性。所述遺傳多態(tài)性是影響所述酶的藥物底物的臨床效果、治療效果和副作用的主要因素。一些遺傳變異體造成酶的沉積而根本不能代謝藥物。其它遺傳變異體使酶活性部分地降低。例如，諸如CYP2D6和CYP2C9等酶根據(jù)所述遺傳變異體的不同而在表型上不同，且基因型和表型之間具有相對(duì)較高的相似性。同時(shí)，很難根據(jù)功能性遺傳變異體的存在與否來(lái)預(yù)測(cè)CYP3A4、CYP2B6和MDR1基因的表型。
就人類而言，代謝50％的所有服用藥物的CYP3A4在個(gè)體之間顯示出極大的活性差異。已知CYP2B6在個(gè)體之間表現(xiàn)出最大270倍的差異。盡管個(gè)體差異如此之大，個(gè)體之間的活性差異仍很難直接從基因型來(lái)預(yù)測(cè)，因?yàn)榛蛐秃捅硇椭g具有低相關(guān)性的藥物代謝酶或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白表達(dá)根據(jù)外部因素的不同而出現(xiàn)極大的不同。對(duì)于這些基因而言，蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)，而非遺傳變異體的存在與否，可能是更重要的導(dǎo)致代謝活性的個(gè)體差異的因素。當(dāng)所述酶的表達(dá)被誘導(dǎo)后，這些酶自已大量生成來(lái)提高活性。表達(dá)誘導(dǎo)的機(jī)理通過(guò)將包含藥物受體的外部材料與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述藥物受體的典型實(shí)例是已知在NR1I2基因中表達(dá)的孕烷X受體(PXR)。
據(jù)報(bào)道，PXR的表達(dá)量根據(jù)個(gè)體的不同而不同。有趣的是，所述受體的表達(dá)量與藥物代謝酶如CYP3A4和CYP2B6的表達(dá)量具有高度相關(guān)性(Current Drug Metabolism，2005，6369-383)。于是，個(gè)體之間的所述藥物代謝酶的表達(dá)量差異取決于所述PXR基因的表達(dá)量差異或活性差異，而不是取決于變異體蛋白。
在這點(diǎn)上，對(duì)個(gè)體PXR基因的遺傳多態(tài)性或所述PXR基因的表達(dá)差異的研究近來(lái)引起了關(guān)注。有報(bào)道稱，盡管氨基酸序列并未改變，一些遺傳變異體仍導(dǎo)致個(gè)體對(duì)藥物反應(yīng)的差異，如因紅霉素呼吸測(cè)試或體內(nèi)利福平(rifampin)引起的CYP3A4活性提升。這些PXR變異體由于所述目標(biāo)基因的表達(dá)變化而導(dǎo)致活性變化。因此，所述PXR變異體可能導(dǎo)致藥物或者生物分子在體內(nèi)的活性差異，并極大地影響藥物(PXR基因的耦合劑)引起的藥物相互作用的個(gè)體差異。
UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)是催化葡萄糖醛酸與體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)相結(jié)合的酶。所述UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生諸如苯酚、乙醇、胺和脂肪酸化合物等具有毒性的物質(zhì)的葡萄糖醛酸耦合劑，并把這些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為親水材料以從人體經(jīng)膽汁或尿排出(Parkinson A，Toxicol Pathol.，2448-57，1996)。
據(jù)報(bào)道，所述UGT主要存在于間質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核膜內(nèi)，且在其它組織諸如腎和皮膚中也有表達(dá)。所述UGT酶可以根據(jù)一級(jí)氨基酸序列的相似性大致劃分為UGT1和UGT2亞科。人類UGT1A族有9種異構(gòu)體(UGT1A1和UGT1A3～UGT1A10)。其中，五種異構(gòu)體(UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6和UGT1A9)由肝臟表達(dá)。所述UGT1A基因家族的遺傳多態(tài)性因人而異。已知相對(duì)于UGT1A1、UGT1A3～UGT1A10基因存在數(shù)種遺傳多態(tài)性(http://galien.pha.ulaval.ca/alleles/alleles.html)。所述UGT1A基因的多態(tài)性在種族之間有極大的差異。已證實(shí)酶的活性因多態(tài)性的不同而不同，而多態(tài)性是決定對(duì)于藥物治療的敏感性的重要因素。UGT1A1*6和UGT1A1*28與吉爾伯特綜合征有關(guān)(Monaghan G，Lancet，347578-581，1996)。另外，已報(bào)道了與各種疾病相關(guān)的各種功能性變異體。
由于已報(bào)道了各種類型的遺傳變異體和單倍型，所以搜索方法應(yīng)當(dāng)是有效的。所述單倍型可以由Arlequin、SNPalyze或其它類似軟件進(jìn)行分析。分析所有單核苷酸多態(tài)性(SNP)來(lái)搜索每種單倍型的遺傳變異體會(huì)在成本和時(shí)間上不夠有效。
為了提高效率，可以提供單倍型標(biāo)簽SNP(htSNP)選擇方法。所述htSNP選擇方法是一種選擇最小標(biāo)簽組來(lái)準(zhǔn)確標(biāo)記每種單倍型的方法。如果確定了所選SNP，則可以預(yù)測(cè)所有單倍型。
對(duì)于許多基因而言，遺傳多態(tài)性的分布因種族的不同而不同。因此，有必要檢查先天遺傳變異體和單倍型是否頻繁出現(xiàn)在高麗人中，而如果是的話，它們有多頻繁，以及如何根據(jù)單倍型選擇htSNP。然而，對(duì)高麗人的基因中的遺傳變異體、與之對(duì)應(yīng)的單倍型和根據(jù)每種單倍型的htSNP選擇的研究并不多。
近來(lái)，已報(bào)道了一種通過(guò)對(duì)主要發(fā)現(xiàn)于白種人中的CYP2D6遺傳變異體進(jìn)行SNaPshot分析來(lái)確定11種SNP的方法(Sistonen J等，ClinChem.2005Jul；51(7)1291-1295)，和Roche或Jurilab公司的CYP2D6診斷芯片。然而，它們集中在發(fā)現(xiàn)于白種人中的CYP2D6遺傳變異體上。對(duì)診斷包括高麗人在內(nèi)的亞洲人的CYP2D6遺傳變異體的研究還不足。
因此，本發(fā)明人研究開發(fā)了一種短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確確定主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2(＝PXR)和UGT1A基因的變異體的方法。本發(fā)明提供了對(duì)主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2(＝PXR)和UGT1A遺傳變異體的htSNP選擇方法，以便證明所選htSNP的可用性。


發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于確定發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2(＝PXR)和UGT1A基因的單倍型的htSNP選擇方法。
另外，本發(fā)明的另一方面提供了使用所述htSNP確定人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR112(＝PXR)和UGT1A基因的基因型的方法。
另外，本發(fā)明的另一方面還提供了使用包含基因芯片的試劑盒來(lái)確定人類CYP2D6基因的基因型的方法。
總發(fā)明構(gòu)思的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的說(shuō)明中部分闡明，并將部分地根據(jù)所述說(shuō)明而顯而易見(jiàn)，或可通過(guò)實(shí)踐所述總發(fā)明構(gòu)思而得到理解。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供選自人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因中的基因的htSNP的選擇方法而實(shí)現(xiàn)，所述方法包括從人類收集生物樣本；從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；用引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，該反應(yīng)使用操作中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增選自人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因中的基因或其片段；由操作(c)中所得PCR產(chǎn)物的基因序列確定變異體的存在；由在操作(d)中已確定具有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列確定單倍型；和用SNPtagger軟件對(duì)操作(d)中分析的所述單倍型進(jìn)行測(cè)序并選擇SNP。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供確定人類CYP2A2基因的基因型的方法而實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從對(duì)象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取基因組DNA；(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的基因組DNA作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP1A2基因的至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體選自-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2847T>C、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-1708T>C、-739T>G、-163C>A、1514G>A、2159G>A、2321G>C、3613T>C、5347C>T和5521A>G。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供檢測(cè)CYP1A2啟動(dòng)子基因中的變異體的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從對(duì)象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取基因組DNA；(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所得基因組DNA作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因的啟動(dòng)子區(qū)域；(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP1A2遺傳變異體的存在，所述CYP1A2遺傳變異體包括-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2847T>C、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-1708T>C、-739T>G和-163C>A。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供確定人類CYP2A6基因的基因型的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從對(duì)象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所得核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2A6基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP2A6遺傳變異體的存在，所述CYP2A6遺傳變異體選自-48T>G、13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T、6600G>T和6091C>T。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供確定人類CYP2D6基因的基因型的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所得的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2D6基因或其片段；和(d)確定CYP2D6基因中至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供確定PXR基因的基因型的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所得核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類PXR基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中研究PXR基因的遺傳變異體的存在，所述遺傳變異體選自-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供確定UGT1A基因的功能性變異體的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)單獨(dú)地?cái)U(kuò)增人類UGT1A基因；和(d)對(duì)操作(c)中擴(kuò)增的所述基因測(cè)序并確定所述UGT1A基因中功能性變異體的存在，所述功能性變異體選自UGT1A1基因中的-39(TA)6>(TA)7、211G>A，233C>T和686C>A；UGT1A3基因中的31T>C、133C>T和140T>C；UGT1A4基因中的31C>T、142T>G和292C>T；UGT1A6基因中的19T>G、541A>G和552A>C；UGT1A7基因中的387T>G、391C>A、392G<A、622T>C和701T>C；和UGT1A9基因中的-118T9>T10、726T>G和766G>A。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供確定UGT1A基因的與對(duì)依立替康(irinotecan)的敏感性相關(guān)的多態(tài)性的方法而實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類UGT1A基因；和(d)對(duì)操作(c)中擴(kuò)增的所述人類UGT1A基因測(cè)序并確定所述UGT1A基因中變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的211G>A、233C>T和686C>A；UGT1A6基因中的19T>G、541A>G和552A>C；和UGT1A9基因中的-118T9>T10、726T>G和766G>A。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供用基因芯片確定人類CYP2D6基因的基因型的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括(a)提取待研究的基因并進(jìn)行多重PCR以獲得包含待鑒定的SNP的邊界(circumference)的PCR產(chǎn)物；(b)用識(shí)別等位基因的特異性堿基的ASPE(等位基因特異性引物延伸)引物進(jìn)行ASPE反應(yīng)；(c)將所述反應(yīng)產(chǎn)物與基因芯片混合；和(d)分析所述基因芯片。
本發(fā)明的上述和/或其它方面和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)提供用于確定CYP2D6基因的基因型的SNaPshot基因分型試劑盒和用于確定SNP的具有Zip編碼(Zip Code)寡核苷酸芯片的基因芯片來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明中所述生物樣本包括對(duì)象的血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)，且優(yōu)選的是血液。
本發(fā)明中所述核酸可以包括DNA或RNA，優(yōu)選的是DNA，更優(yōu)選的是基因組DNA。
本發(fā)明中所述變異體將說(shuō)明如下。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“aN>M”或“NaM”(a是正數(shù)，N和M分別是A、C、T或G)是指在基因序列中第“a”位的堿基N被堿基M所替代。術(shù)語(yǔ)“ainsN”或“adelN”(a是正數(shù)，N是A、C、T或G)是在基因序列中第“a”位處插入或刪除一個(gè)堿基N。
例如，“-1548C>T”變異體是基因序列中第-1584位的C堿基被T堿基替代。
“2573insC”變異體是在基因序列中第2573位插入(加入)了C堿基?！?125-4133insGTGCCCACT”變異體是在人類CYP2D6基因的第4125～4133位堿基處插入了9個(gè)堿基GTGCCCACT。
“2D6刪除”變異體是將整個(gè)人類CYP2D6基因從染色體中刪除。
另外，“2D6重復(fù)”變異體是在同一染色體中重復(fù)了至少2個(gè)人類CYP2D6基因。
如上所述，本發(fā)明提供了使用最優(yōu)搜索組合來(lái)分析與CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的藥物敏感性相關(guān)的功能性變異體或多態(tài)性的方法，所述最優(yōu)搜索組合基于目前為止還未被檢查的高麗人CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的多態(tài)性。本發(fā)明可以適用于確定包括在遺傳學(xué)特性上與高麗人相似的日本人和中國(guó)人以及高麗人在內(nèi)的亞洲人的CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的基因型。



根據(jù)結(jié)合附圖的對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的下述說(shuō)明，本發(fā)明的上述和/或其它方面將變得顯而易見(jiàn)且更容易理解，在所述附圖中 圖1說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明首次確定的CYP1A2基因的一種變異體在CYP1A2基因的基因序列中的位置； 圖2～6是根據(jù)本發(fā)明選擇的CYP1A2基因的htSNP組合的實(shí)例； 圖7～14說(shuō)明了CYP1A2啟動(dòng)子基因的變異體的結(jié)果，所述變異體是根據(jù)本發(fā)明選擇的所述CYP1A2基因的功能性變異體(這里，X軸表示取決于引物分子數(shù)量的運(yùn)動(dòng)，Y軸表示每個(gè)峰的高度)， 圖7說(shuō)明了CYP1A2啟動(dòng)子的野生型SNP， 圖8說(shuō)明了位于雜合(hetero)變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-3860G>A(CYP1A2*1C)、-2467delT(CYP1A2*1D)和-163C>A(CYP1A2*1F)變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型， 圖9說(shuō)明了位于純合(homo)變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-3860G>A(CYP1A2*1C)、-2467delT(CYP1A2*1D)和-163C>A(CYP1A2*1F)變異體，所述純合變異體在雙鏈DNA中含有兩個(gè)變異體， 圖10說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-163C>A(CYP1A2*1F)和-2808A>C變異體， 圖11說(shuō)明了位于純合變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-163C>A(CYP1A2*1F)變異體，還說(shuō)明了位于雜合變異體中的-2467delT(CYP1A2*1D)、-739T>G(CYP1A2*1E)、-3598G>T、-3113G>A、-2847T>C和-1708T>C變異體， 圖12說(shuō)明了位于純合變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-163C>A(CYP1A2*1F)變異體，還說(shuō)明了位于雜合變異體中的-2467delT(CYP1A2*1D)、-3598G>T和-2847T>C變異體， 圖13說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-163C>A(CYP1A2*1F)、-2467delT(CYP1A2*1D)和-3594T>G變異體， 圖14說(shuō)明了位于純合變異體中的CYP1A2啟動(dòng)子的-163C>A(CYP1A2*1F)變異體，還說(shuō)明了位于雜合變異體中的-3860G>A(CYP1A2*C)、-2467delT(CYP1A2*1D)和-2603insA變異體； 圖15說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明用于選擇htSNP組合的CYP2A6在高麗人中的單倍型的種類和頻率； 圖16～21舉例說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明選擇的CYP2A6基因的htSNP組合， 圖16說(shuō)明了用于通過(guò)在遺傳變異體檢測(cè)目標(biāo)中添加6種功能性變異體和具有所謂功能性的3種遺傳變異體來(lái)確定CYP2A6基因的單倍型的htSNP組合的選擇， 圖17說(shuō)明了用于確定CYP2A6基因的單倍型的htSNP組合的選擇，所述CYP2A6基因包含8種含有氨基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標(biāo)記的變異體和6種頻繁CYP2A6遺傳變異體， 圖18說(shuō)明了用于確定CYP2A6基因的單倍型的另一htSNP組合的選擇，所述CYP2A6基因包含8種含有氨基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標(biāo)記的變異體和6種頻繁CYP2A6遺傳變異體， 圖19說(shuō)明了用于確定CYP2A6基因的單倍型的另一htSNP組合的選擇，所述CYP2A6基因包含8種含有氨基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標(biāo)記的變異體和6種頻繁CYP2A6遺傳變異體， 圖20說(shuō)明了用于確定CYP2A6基因的單倍型的另一htSNP組合的選擇，所述CYP2A6基因包含8種含有氨基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標(biāo)記的變異體和6種頻繁CYP2A6遺傳變異體， 圖21說(shuō)明了用于確定CYP2A6基因的單倍型的另一htSNP組合的選擇，所述CYP2A6基因包含8種含有氨基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標(biāo)記的變異體和6種頻繁CYP2A6遺傳變異體， 圖22～30說(shuō)明了對(duì)所選htSNP組合和CYP2A6功能性遺傳變異體組合的SNaPshot分析的結(jié)果， 圖22說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T>G、2134A>G和6558T>C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型， 圖23說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的567C>7變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型， 圖24說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的6458A>T和6558T>C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型， 圖25說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T>G、13G>A和6558T>C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型， 圖26說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的3391T>C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體，而另一個(gè)被刪除， 圖27說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T>G和2134A>G變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體，而另一個(gè)被刪除， 圖28說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T>G、6558T>C和6600G>T變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體，而另一個(gè)被刪除， 圖29說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的6458A>T變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體，而另一個(gè)被刪除， 圖30說(shuō)明了位于雜合變異體中的CYP2A6基因的6558T>C和6582G>T變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型； 圖31和32說(shuō)明了與圖22～30中所述基因研究一起進(jìn)行的SNaPshot分析，所述SNaPshot分析另外確定了除圖22～30中的所述遺傳變異體之外的CYP2A6基因刪除， 圖31說(shuō)明了存在于同源染色體中的CYP2A6基因， 圖32說(shuō)明了不存在于一個(gè)染色體中且只有一個(gè)基因的CYP2A6基因； 圖33說(shuō)明了部分的CYP2A6基因和CYP2A7基因的共軛連接； 圖34～39說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明選擇的CYP2D6基因的htSNP組合， 圖40和41說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明選擇的CYP2D6基因的htSNP組合之一的SNaPshot分析結(jié)果； 圖42說(shuō)明了使用基因芯片確定CYP2D6基因的基因型的過(guò)程； 圖43說(shuō)明了用于CYP2D6基因的所述基因芯片上的探針； 圖44說(shuō)明了使用長(zhǎng)PCR進(jìn)行的CYP2D6基因擴(kuò)增； 圖45說(shuō)明了ASPE反應(yīng)過(guò)程； 圖46說(shuō)明了顯示根據(jù)示例性實(shí)施方式12對(duì)CYP2D6基因中的變異體的分析結(jié)果的基因芯片； 圖47說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明選擇的PXR基因的htSNP組合； 圖48～50說(shuō)明了搜索根據(jù)本發(fā)明選擇的PXR基因中的功能性變異體的結(jié)果(這里，X軸表示取決于每個(gè)引物的分子數(shù)量的運(yùn)動(dòng)，Y軸表示每個(gè)峰的高度)， 圖48說(shuō)明了PXR基因的-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C功能性變異體，所述變異體均為野生型； 圖49說(shuō)明了位于雜合變異體中的PXR基因的-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C功能性變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個(gè)變異體和一個(gè)野生型； 圖50說(shuō)明了位于純合變異體中的PXR基因的-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C功能性變異體，所述純合變異體在雙鏈DNA中含有兩個(gè)變異體； 圖51～54說(shuō)明了對(duì)50個(gè)高麗人的UGT1A基因的功能性變異體的分析結(jié)果(這里，X軸表示SNP的位置，Y軸表示每個(gè)峰的高度，紅色是T，黑色是C，藍(lán)色是G，綠色是A)； 圖51說(shuō)明了對(duì)UGT1A1(a)和UGT1A3(b)基因的功能性變異體的分析結(jié)果； 圖52說(shuō)明了對(duì)UGT1A4(a)和UGT1A6(b)基因的功能性變異體的分析結(jié)果； 圖53說(shuō)明了對(duì)UGT1A7基因的功能性變異體的分析結(jié)果； 圖54說(shuō)明了對(duì)UGT1A9基因的功能性變異體的分析結(jié)果； 圖55說(shuō)明了對(duì)50個(gè)高麗人的UGT1A1、UGT1A6和UGT1A9基因的與對(duì)依立替康(irinotecan)的敏感性相關(guān)的多態(tài)性的分析結(jié)果； (a)UGT1A1基因的211G>A、233C>T和686C>A；UGT1A6基因的19T>G、541A>G和552A>C；以及UGT1A9基因的726T>G和766G>A，上述均為野生型， (b)UGT1A1基因的野生型211G>A和233C>T，雜合型686C>A；UGT1A6基因的雜合型19T>G和552A>C，野生型541A>G；UGT1A9基因的野生型726T>G和766G>A， (c)UGT1A1基因的野生型211G>A、233C>T和686C>A；UGT1A6基因的雜合型19T>G、541A>G和552A>C；UGT1A9基因的雜合型726T>G和野生型766G>A，和 (d)UGT1A1基因的雜合型211G>A和233C>T，野生型686C>A；UGT1A6基因的雜合型19T>G、541A>G和552A>C；UGT1A9基因的野生型726T>G和766G>A。

具體實(shí)施例方式 下文將參照

本發(fā)明的示例性實(shí)施方式，其中相同的附圖標(biāo)記表示相同要素，并且將盡量避免重復(fù)性說(shuō)明。
本發(fā)明可供通過(guò)對(duì)高麗人CYP1A2基因的變異體分析來(lái)確定發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2基因的基因型、選擇htSNP作為每個(gè)單倍型的最優(yōu)標(biāo)簽組并確認(rèn)其可用性。另外，本發(fā)明可供確定人類CYP1A2基因的新單倍型。
本發(fā)明的選擇人類CYP1A2基因的htSNP的方法如下 (a)從對(duì)象中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因或其片段； (d)從操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定變異體的存在； (e)用SNPtagger軟件對(duì)操作(d)中已確定具有變異體的所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸的方法沒(méi)有限制，是本領(lǐng)域公知的。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來(lái)提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen公司(美國(guó))和Stratagene公司(美國(guó))生產(chǎn)的DNA或RNA提取試劑盒。如果從所述試劑盒提取的是RNA，則通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA待用。
操作(c)中所述人類CYP1A2基因的片段是指包含人類CYP1A2基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)。擴(kuò)增所述人類CYP1A2基因或其片段的所述引物可以基于人類CYP1A2基因或其片段的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)，并且可以選自含參照2～31的引物，但不限于此。
操作(d)中的所述變異體包括SNP、基因刪除和基因重復(fù)，但不限于此。例如，所述變異體可以包括17種變異體，如表5。
所述測(cè)序方法沒(méi)有限制，可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知方法。例如，可以使用自動(dòng)DNA測(cè)序儀或進(jìn)行焦磷酸測(cè)序來(lái)確定基因序列。所述焦磷酸測(cè)序是用于DNA測(cè)序中的已知SNP測(cè)定方法，是檢測(cè)來(lái)自DNA聚合時(shí)釋放的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽(PPi)的光表達(dá)的方法。所述DNA測(cè)序可以使用來(lái)自參照32～61的引物進(jìn)行，但不限于此。可以通過(guò)比較野生型CYP1A2基因的基因序列來(lái)確定操作(d)中變異體的存在?？梢允褂盟鲆吧虲YP1A2基因的基因序列，例如參照1的基因序列(基因庫(kù)(GenBank)登錄號(hào)NT_010194)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的每個(gè)CYP1A2基因型的基因序列(DrugMetab.Pharnmacokinet，2005，20(1)24-33)。
單倍型的頻率和類型可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)程序或市場(chǎng)上銷售的程序來(lái)估計(jì)。例如，可以使用免費(fèi)分發(fā)的Haploview，或商業(yè)化程序SNPAlyze。所述Haploview軟件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。更優(yōu)選的是，可以從http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview下載所述軟件。
本發(fā)明的方法可以另外包括對(duì)操作(a)～(d)的重復(fù)。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內(nèi)的CYP1A2基因的變異相及其單倍型，可以在檢測(cè)完CYP1A2基因型的頻率并從所述群體中選出頻繁CYP1A2基因型之后執(zhí)行操作(e)。
在操作(e)中，用SNPtagger軟件分析CYP1A2基因的單倍型數(shù)據(jù)以選擇htSNP。所述SNPtagger軟件在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如Genehunter、Merlin、Allegro、SNPHAP、htSNP finder(基于PCA)。更優(yōu)選的是，所述軟件可以從http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype或http://slack.ser.man.ac.uk/progs/htsnp.html下載。
可以驗(yàn)證所選htSNP來(lái)改善精度從而確定二倍型。當(dāng)由雙鏈染色體確定人類的基因型后，將所述基因型解碼以確定兩種單倍型組合。如果同時(shí)分析數(shù)個(gè)SNP，則特定單倍型的組合可以和另一個(gè)單倍型的組合相同。如果所述基因型由根據(jù)本發(fā)明所開發(fā)的診斷解碼，則應(yīng)該驗(yàn)證它是否準(zhǔn)確確定了所述基因型?？梢杂肕atlab(邁斯沃克軟件有限公司(TheMathWorks，Inc.)，美國(guó))來(lái)分析是否由基因分析結(jié)果對(duì)所述基因型進(jìn)行了正確的解碼，從而進(jìn)行所述驗(yàn)證。
在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，首先研究了高麗人CYP1A2基因中的變異體來(lái)選擇發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2基因型的htSNP。結(jié)果，在高麗人CYP1A2基因中共發(fā)現(xiàn)17個(gè)SNP(參見(jiàn)表5)。17個(gè)SNP中有一個(gè)(-2603insA)是新型的。
本發(fā)明首次提供的所述單一SNP在雙鏈DNA中包含一個(gè)變異體和一個(gè)野生型(參見(jiàn)圖1)。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，確定了發(fā)現(xiàn)于高麗人中的17個(gè)SNP的單倍型。結(jié)果，本發(fā)明確定了此前從未在高麗人中發(fā)現(xiàn)的CYP1A2基因的的單倍型(參見(jiàn)表6)和基于上述單倍型的基因型。例如，表6中的CYP1A2基因的單倍型2(CYP1A2*1L)是指在所述CYP1A2基因的基因序列中的-3860、-2467和-163位堿基處有SNP的基因型。更具體而言，所述基因型具有-3860G>A、-2467T>delT(-2467delT)和-163C>A的SNP。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用SNPtagger軟件分析已由含CYP1A2基因中的變異體的基因序列確定的單倍型以便選擇htSNP，亦即發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2基因的變異體的17個(gè)單倍型的最小標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明選擇的htSNP組合的實(shí)例如圖2～6中所示。
根據(jù)本發(fā)明選擇的所述htSNP組合可以用于確定人類CYP1A2基因的單倍型。因此，本發(fā)明提供了確定人類CYP1A2基因的單倍型的方法。所述方法包括如下步驟 (a)從對(duì)象中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所得核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因或其片段；和 (d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定所述CYP1A2基因中變異體的存在，所述變異體選自-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2847T>C、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-1708T>C、-739T>G、-163C>A、1514G>A、2159G>A、2321G>C、3613T>C、5347C>T和5521A>G。
操作(b)中的所述提取核酸的方法與上述相同。
如上所述，所述人類CYP1A2基因的片段是指包含所述人類CYP1A2基因的已知SNP的片段。用于操作(c)的所述引物沒(méi)有限制，可以選自參照2～31。
操作(d)中研究的所述SNP可以選自圖4～6中的htSNP。所述SNP的存在可以由如下變異體研究圖4中的-3860G>A、-3598G>T、-3113G>A、-2808A>C、-2603msA、-2467delT、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G；圖5中的-3860G>A、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-739T>G、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G；以及圖6中的-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G，或-3860G>A、-3598G>T、2321G>C、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G。
操作(d)中檢測(cè)的所述SNP基于發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2基因中的變異體，且該SNP對(duì)確定高麗人的CYP1A2基因的單倍型和基因型極具特異性。
操作(d)中的所述PCR產(chǎn)物的基因序列中的CYP1A2基因的SNP可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多態(tài)性分析方法確定。優(yōu)選的是，所述SNP可以由SNaPshot分析(參見(jiàn)[Peter M.Vallone等，Int J Legal Med，2004，118147-157])、電泳分析或它們的組合來(lái)確定，更優(yōu)選的是用SNaPshot分析來(lái)確定。
所述SNaPshot分析是指通過(guò)用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點(diǎn)附近的已退火基因序列(除SNP區(qū)域以外)和ddNTP。本發(fā)明中使用的所述SNaPshot是用已知方法基于操作(c)中研究的所述CYP1A2基因的SNP設(shè)計(jì)和制造的。所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點(diǎn)的堿基作為3’端，包含與SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列，并在5’端添加了T堿基即可。更具體而言，引物可以選自參照64～74。優(yōu)選的是，所述與SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列的長(zhǎng)度大約為20bp。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則所述SNaPshot引物5’端的T堿基的長(zhǎng)度被設(shè)計(jì)為可變。例如，在所述5’端添加5個(gè)T堿基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。然后，將所述SNaPshot引物與和每個(gè)SNP互補(bǔ)的ddNTP結(jié)合。所述組合物因SNP的不同而大小不同。因此，可以同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP。
為確定用所述SNaPshot分析所得的基因分型結(jié)果是否正確，執(zhí)行了另一種確定所述基因型的方法。另一種方法沒(méi)有限制，優(yōu)選包括自動(dòng)DNA測(cè)序或焦磷酸測(cè)序。
發(fā)現(xiàn)于高麗人中的所述CYP1A2基因中的17種變異體的11個(gè)SNP位于啟動(dòng)子區(qū)域。所述11個(gè)SNP包含由本發(fā)明首次確定的-2603insA變異體。因此，本發(fā)明提供了確定人類CYP1A2啟動(dòng)子基因中變異體的方法。所述方法包括下列步驟 (a)從對(duì)象中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取基因組DNA； (c)使用引物進(jìn)行PCR，所述反應(yīng)使用在操作(b)中所得的基因組DNA作為模板擴(kuò)增人類CYP1A2基因的啟動(dòng)子區(qū)域；和 (d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定所述CYP1A2基因中變異體的存在，所述變異體包括-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2847T>C、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-1708T>C、-739T>G和-163C>A。
操作(b)中的所述提取基因組DNA的方法與上述相同。
操作(c)中擴(kuò)增人類CYP1A2基因的啟動(dòng)子區(qū)域的所述引物是可變的，只要所述引物能擴(kuò)增來(lái)自參照1的從-3860G>A到-163C>A的SNP，更優(yōu)選的是來(lái)自參照62和63的SNP即可。
操作(d)中所述PCR產(chǎn)物的基因序列中的CYP1A2基因的所述SNP可以用本領(lǐng)域內(nèi)公知的多態(tài)性分析方法確定。優(yōu)選的是，所述SNP可以用SNaPshot分析確定。本發(fā)明所用SNaPshot分析可以使用基于CYP1A2基因的所述11個(gè)SNP而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行。本發(fā)明所用的SNaPshot引物是可變的，只要其被設(shè)計(jì)為包含與除所述SNP以外的序列相鄰的基因序列即可。更優(yōu)選的是，具有選自參照64～74的基因序列的引物。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，基于所述影響CYP1A2酶活性的啟動(dòng)子區(qū)域中的11個(gè)SNP，由SNaPshot分析檢測(cè)所述CYP1A2啟動(dòng)子基因的變異體。結(jié)果，證實(shí)本發(fā)明的所述方法可以準(zhǔn)確地高速檢測(cè)所述CYP1A2啟動(dòng)子基因中的變異體(參見(jiàn)圖7～14)。
2.CYP2A6 本發(fā)明可供通過(guò)對(duì)高麗人CYP2A6基因的變異體分析來(lái)確定主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6基因的基因型、選擇htSNP作為每個(gè)單倍型的最優(yōu)標(biāo)簽組并確認(rèn)其可用性。
根據(jù)本發(fā)明選擇人類CYP2A6基因的htSNP的方法如下 (a)從對(duì)象中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2A6基因或其片段； (d)確定在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中變異體的存在； (e)由在操作(d)中已確定具有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列確定單倍型；和 (f)用SNPtagger軟件(http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotyDe/)對(duì)操作(e)中確定的所述單倍型進(jìn)行測(cè)序以選擇htSNP。
所述從操作(a)中收集的樣本中提取核酸的方法沒(méi)有限制，是本領(lǐng)域內(nèi)的已知方法。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來(lái)提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen公司(美國(guó))和Stratagene公司(美國(guó))生產(chǎn)的DNA或RNA提取試劑盒。如果提取的是RNA，則通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA待用。
操作(c)中所述人類CYP2A6基因的片段是指包含人類CYP2A6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)。擴(kuò)增所述人類CYP2A6基因或其片段的所述引物可以基于人類CYP2A6基因或其片段的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)，并且可以選自參照76～89的引物，但不限于此。
操作(d)中的所述變異體包括SNP、基因刪除和基因重復(fù)，但不限于此。例如，所述變異體可以包括30種變異體，如表15。
操作(d)中確定變異體的存在的方法可以包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的變異體檢測(cè)方法。優(yōu)選的是，用序列分析或電泳分析來(lái)比較本領(lǐng)域內(nèi)已知的野生型CYP2A6基因的基因序列(例如參照75的基因序列(基因庫(kù)登錄號(hào)NC_000019))或本領(lǐng)域內(nèi)已知的CYP2A6基因型的各基因序列。另外，還可用RFLP分析來(lái)比較所述野生型CYP2A6基因的限制性酶的切割相。所述CYP2A6基因的刪除或重復(fù)可以通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析來(lái)確定。所述測(cè)序可以通過(guò)自動(dòng)DNA測(cè)序儀或焦磷酸測(cè)序進(jìn)行。
操作(e)中確定含有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列中的所述單倍型可以通過(guò)諸如SNPAlyze、Haplotyper、Arlequin等程序來(lái)確定。
本發(fā)明的方法可以另外包括對(duì)操作(a)～(d)的重復(fù)。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內(nèi)的CYP2A6基因的變異相，可以在檢測(cè)完CYP2A6基因型的頻率并從所述群體中選出頻繁CYP2A6基因型之后執(zhí)行操作(f)。
在操作(f)中，用SNPtagger軟件分析操作(e)中確定的所述單倍型的基因序列以選擇htSNP。用于選擇htSNP的所述軟件包括HapBlock、LDSelect、Haploview、htSNP、TagIT和tagSNPs以及SNPtagger。所述SNPtagger軟件在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，且優(yōu)選的是可以從http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype下載?？梢则?yàn)證所選htSNP來(lái)改善精度從而確定二倍型?？梢杂肕atlab(邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))來(lái)驗(yàn)證所述htSNP。
在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，首先研究了發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6基因中的變異體來(lái)選擇高麗人的CYP2A6基因型的htSNP。結(jié)果，在高麗人CYP2A6基因中共發(fā)現(xiàn)30個(gè)SNP(參見(jiàn)表15)。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用DYNACOM公司生產(chǎn)的SNPAlyze確定了所選的30個(gè)SNP中的14個(gè)SNP的單倍型，從而確定了具有1％以上的頻率的總共19個(gè)單倍型。所述14個(gè)SNP包括8個(gè)導(dǎo)致氨基酸替換且含有功能性遺傳變異體的變異體，和6個(gè)頻繁變異體。用來(lái)確定所述單倍型的程序不限于所述SNPAlyze。作為另外一種選擇，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種軟件，例如，Haplotyper(http://www.people.fas.harvard.edu/～junliu/Haplo/docMain.htm)、Arlequin(htt://lgb.unife.ch/arlequin)和Istech公司生產(chǎn)的SNP Analyzer(http://www.istech21.com/)。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用SNPtagger軟件分析了包括19個(gè)單倍型和1個(gè)基因刪除在內(nèi)的20個(gè)單倍型的基因序列和頻率以選擇htSNP，亦即能方便地鑒定主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6基因的基因型的最小標(biāo)記。htSNP的實(shí)例如圖16～21所示。
可以使用本發(fā)明所選的htSNP組合來(lái)確定所述人類CYP2A6基因的基因型。因此，本發(fā)明提供了確定所述人類CYP2A6基因的基因型的方法。所述方法包括如下步驟 (a)從對(duì)象中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2A6基因或其片段； (d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定所述CYP2A6基因中變異體的存在，所述變異體選自-48T>G、13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T、6600G>T和6091C>T。
操作(b)中的所述提取核酸的方法與上述相同。
如上所述，所述人類CYP2A6基因的片段是指包含人類CYP2A6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)?？梢杂糜诓僮?c)的引物可以包括參照90、91、120和130的引物，但不限于此。
操作(d)中的所述變異體可以選自圖16～21中的htSNP。例如，在操作(d)中，所述變異體可以由圖16中的-48T>G；22C>T；567C>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6582G>T；6600G>T；選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種；和13G>A；51G>A；1620T>C；以及1836G>T來(lái)確定。所述變異體也可以由圖17中的-48T>G；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種來(lái)確定。
如圖18所示，所述變異體可以由22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；3391T>C；6354T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種來(lái)確定。
如圖19所示，所述變異體可以由-48T>G；13G>A；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種來(lái)確定。
如圖20所示，所述變異體可以由-48T>G；13G>A；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；3391T>C；6458A>T；6558T>C；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種來(lái)確定。
另外，如圖21所示，所述變異體可以由-48T>G；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種來(lái)確定。優(yōu)選的是，所述變異體如圖16所示來(lái)確定。
在圖16中的變異體中，證實(shí)具有功能性或具有很高的潛在功能性的變異體包含了替換氨基酸或?qū)е禄騽h除的變異體。因此，要檢測(cè)圖16中的變異體中的功能性CYP2A6變異體，可以研究圖16中的變異體中的所述氨基酸替換變異體或基因刪除變異體?；騽h除幾乎無(wú)法由SNP檢測(cè)。當(dāng)搜索所述變異體以標(biāo)記基因刪除時(shí)，發(fā)現(xiàn)了6091C>T變異體。所述6091C>T變異體是特異性地發(fā)現(xiàn)于操作(c)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中刪除了CYP2A6基因的染色體中的SNP，而且所述6091C>T變異體可以用作基因刪除標(biāo)記變異體。用于確定功能性的所選變異體組合包括10個(gè)變異體，即-48T>G；13G>A；567C>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6582G>T；6600G>T；和6091C>T。所述CYP2A6基因中的5971G>A和5983T>G變異體可以替代所述6091C>T變異體來(lái)標(biāo)記基因刪除。
操作(d)中研究的所述變異體基于主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6基因中的變異體。因此，它對(duì)確定高麗人的CYP2A6基因的單倍型和基因型極具特異性。
操作(d)中的所述PCR產(chǎn)物的基因序列中的CYP2A6基因的變異體可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多態(tài)性分析方法研究?？梢杂肧NaPshot分析(參見(jiàn)[Peter M.Vallone等，Int J Legal Med，2004，118147-157])、電泳分析或它們的組合，更具體而言，可以使用SNaPshot分析來(lái)研究所述變異體。
所述SNaPshot分析是指通過(guò)用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點(diǎn)附近的已退火序列(除SNP區(qū)域以外)和ddNTP。本發(fā)明中使用的所述SNaPshot是用基于操作(d)中研究的所述CYP2A6基因的SNP的已知方法設(shè)計(jì)和制造的。所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點(diǎn)的堿基作為3’端，包含與所述SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列，并在5’端添加了T堿基即可。更優(yōu)選的是，引物可以選自參照97～102。優(yōu)選的是，所述與SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列的長(zhǎng)度大約為20bp。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則所述SNaPshot引物的5’端的T堿基的長(zhǎng)度被設(shè)計(jì)為可變。例如，在所述5’端添加5個(gè)T堿基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。然后，將所述SNaPshot引物與和每個(gè)SNP互補(bǔ)的ddNTP結(jié)合。所述組合物因所述SNP的不同而大小不同。因此，可以同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP。
然后，擴(kuò)增以用于SNaPshot分析的所述PCR產(chǎn)物的基因序列可以用本領(lǐng)域內(nèi)的已知測(cè)序方法進(jìn)行分析，優(yōu)選的是使用自動(dòng)DNA測(cè)序進(jìn)行分析。
例如，具有選自參照92～101的基因序列的引物可以在操作(c)中用于研究圖16中的htSNP組合。優(yōu)選的是，可以使用來(lái)自參照92～101的所有引物，但不限于此。
然后，擴(kuò)增以用于SNaPshot分析的所述PCR產(chǎn)物的基因序列可以用本領(lǐng)域內(nèi)的已知測(cè)序方法進(jìn)行分析，優(yōu)選的是使用自動(dòng)DNA測(cè)序進(jìn)行分析。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)所選htSNP組合的可用性進(jìn)行了確認(rèn)。通過(guò)從圖16的htSNP組合中選擇10種功能性或潛在功能性CYP2A6變異體來(lái)分析操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列，從而進(jìn)行SNaPshot分析。結(jié)果，證實(shí)本發(fā)明的方法能高速地同時(shí)確定發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6基因型(參見(jiàn)圖22～32)。
可以用本發(fā)明所述方法確定的所述CYP2A6基因的基因型包括-48T>G、13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T、6600G>T和6091C>T。與之相對(duì)應(yīng)的每個(gè)基因型和變異體如圖22～32中所示。例如，圖22說(shuō)明了含有-48T>G、6558T>C和2134A>G變異體和7個(gè)野生型的基因型。圖23說(shuō)明了含有567C>T和9個(gè)野生型的基因型。所述CYP2A6*4基因型包含2A6刪除變異體。當(dāng)從人類染色體中刪除CYP2A6基因后，根本不會(huì)生成酶。如果CYP2A6基因被刪除，則所述基因的形狀為部分CYP2A6基因和部分CYP2A7基因相結(jié)合的形狀。所述刪除特異性變異體可以通過(guò)研究上述結(jié)合基因來(lái)確定。
3.CYP2D6 本發(fā)明可供通過(guò)對(duì)高麗人CYP2D6基因的變異體分析來(lái)確定主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6基因的基因型、選擇htSNP作為每個(gè)單倍型的最優(yōu)標(biāo)簽組并確認(rèn)其可用性。
根據(jù)本發(fā)明選擇人類CYP2D6基因的htSNP的方法如下 (a)從人類中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2D6基因或其片段； (d)由在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列確定變異體的存在； (e)由在操作(d)中已確定具有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列確定單倍型；和 (f)用SNPtagger軟件對(duì)操作(e)中所確定的單倍型進(jìn)行測(cè)序以選擇htSNP。
所述從操作(a)中收集的樣本中提取核酸的方法沒(méi)有限制，是本領(lǐng)域內(nèi)的已知方法。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來(lái)提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen公司(美國(guó))和Stratagene公司(美國(guó))生產(chǎn)的DNA或RNA提取試劑盒。如果提取的是RNA，則通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA待用。
操作(c)中所述人類CYP2D6基因的片段是指包含人類CYP2D6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)。擴(kuò)增所述人類CYP2D6基因或其片段的所述引物可以基于人類CYP2D6基因或其片段的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)。例如，所述引物可以包含選自參照106、參照107、參照121～127、參照129～136、參照138、參照139、參照140和參照150的基因序列，但不限于此。
操作(d)中的所述變異體包括SNP、基因刪除和基因重復(fù)，但不限于此。例如，所述變異體可以包括33種變異體，如表34。
操作(d)中確定變異體的存在的方法可以包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的變異體檢測(cè)方法。優(yōu)選的是，可以用基因測(cè)序、電泳分析和RFLP分析來(lái)確定所述變異體。所述基因測(cè)序可以通過(guò)自動(dòng)DNA測(cè)序儀或焦磷酸測(cè)序進(jìn)行。所述焦磷酸測(cè)序是用于DNA測(cè)序中的已知SNP測(cè)定方法，是檢測(cè)來(lái)自DNA聚合時(shí)釋放的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽(PPi)的光表達(dá)的方法。
可以通過(guò)比較野生型CYP2D6基因的基因序列來(lái)確定操作(d)中的變異體的存在。所述野生型CYP2D6基因的基因序列是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。例如，可以使用參照105的基因序列(基因庫(kù)登錄號(hào)AY545216)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的每個(gè)CYP2D6基因型的基因序列(基因庫(kù)登錄號(hào)M33388，http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm)。另外，還可進(jìn)行RFLP分析來(lái)比較所述野生型CYP2D6基因的限制性酶的切割相。所述CYP2D6基因的刪除或重復(fù)可以通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析來(lái)確定。
操作(d)中已確定含有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列中的單倍型可以用全測(cè)序來(lái)確定。
本發(fā)明的方法可以另外包括對(duì)操作(a)～(d)的重復(fù)。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內(nèi)的CYP2D6基因的變異相，可以在檢測(cè)完CYP2D6基因型的頻率并從所述群體中選出頻繁CYP2D6基因型之后執(zhí)行操作(f)。
在操作(f)中，用SNPtagger軟件分析操作(e)中確定的單倍型的基因序列以選擇htSNP。所述SNPtagger軟件在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如Genehunter、Merlin、Allegro、SNPHAP、htSNP finder(基于PCA)，更優(yōu)選的是，所述軟件可以從http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype或http://slack.ser.man.ac.uk/progs/htsnp.html下載。
可以驗(yàn)證所選htSNP來(lái)改善精度從而確定二倍型。當(dāng)由雙鏈染色體確定人類的基因型后，將所述基因型解碼以確定兩種單倍型組合。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則特定單倍型的組合可能和另一個(gè)單倍型的組合相同。如果所述基因型由根據(jù)本發(fā)明所開發(fā)的診斷解碼，則應(yīng)該驗(yàn)證它是否準(zhǔn)確確定了所述基因型?？梢杂肕atlab(邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))分析是否由基因分析結(jié)果對(duì)所述基因型進(jìn)行了正確的解碼，從而進(jìn)行所述驗(yàn)證。
在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，首先研究了發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6基因中的變異體以選擇高麗人CYP2D6基因型的htSNP。結(jié)果，在高麗人CYP2D6基因中發(fā)現(xiàn)了33種變異體和與之相對(duì)應(yīng)的12個(gè)單倍型(基因型)(參見(jiàn)表34和35)。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用SNPtagger軟件對(duì)12個(gè)CYP2D6基因型進(jìn)行測(cè)序以選擇htSNP，亦即可方便地鑒定主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6基因型的最小標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明選擇的htSNP組合的實(shí)例如圖34～39中所示。
根據(jù)本發(fā)明選擇的所述htSNP組合可以用于確定人類CYP2D6基因的基因型。因此，本發(fā)明提供了確定人類CYP2D6基因的基因型的方法。所述方法包括如下步驟 (a)從人類中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2D6基因或其片段； (d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP2D6基因中的至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
操作(b)中的所述提取核酸的方法與上述相同。
如上所述，所述人類CYP2D6基因的片段是指包含人類CYP2D6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)。可以用于操作(c)的引物可以包括選自參照106和107、參照121～127、參照129～136、參照138、139、149和150的基因序列。
操作(d)中的所述變異體可以選自圖34～39中的htSNP。例如，如圖34所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
如圖35所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括-1584C>G；選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；2573insC；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A>C、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
另外，如圖36所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；-1584C>G；選自-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
另外，如圖37所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括-1584C>G；選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；2573insC；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；4125-4133insGTGCCCACT；-1235A>G；1887insTA；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
另外，如圖38所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；1611T>A；選自1661G>C和4180G>C中的一種；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；-1235A>G；1887insTA；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
另外，如圖39所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括-1584C>G；選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；2573insC；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；1887insTA；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
優(yōu)選的是，可以確定圖34中的變異體的存在。操作(d)中確定的所述變異體基于主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6基因中的變異體。因此，它對(duì)確定高麗人的CYP2D6基因的單倍型和基因型極具特異性。
操作(d)中所述PCR產(chǎn)物的基因序列中的CYP2D6基因的變異體可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多態(tài)性分析方法確定。優(yōu)選的是，可以用SNaPshot分析(參見(jiàn)[Peter M.Vallone等，Int J Legal Med，2004，118147-157])、電泳分析或它們的組合來(lái)確定所述變異體。如果所述CYP2D6中的變異體包含SNP，則可以使用SNaPshot分析。
所述SNaPshot分析是指通過(guò)用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點(diǎn)附近的已退火基因序列(除SNP區(qū)域以外)和ddNTP。本發(fā)明中使用的SNaPshot分析是用基于操作(c)中確定的所述CYP2D6基因的SNP的已知方法設(shè)計(jì)和制造的。所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點(diǎn)的堿基作為3’端，包含與所述SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列，并在5’端添加了T堿基即可。優(yōu)選的是，所述與SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列的長(zhǎng)度大約為20bp。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則所述SNaPshot引物5’端的T堿基的長(zhǎng)度被設(shè)計(jì)為可變。例如，在所述5’端添加5個(gè)T堿基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。然后，將所述SNaPshot引物與和每個(gè)SNP互補(bǔ)的ddNTP結(jié)合。所述組合物因所述SNP的不同而大小不同。因此，可以同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP。
例如，具有選自參照141～148以及參照152和153的基因序列的引物可以在操作(c)中用于研究圖34中的htSNP組合。更優(yōu)選的是，可以使用具有選自參照141～148以及參照152和153的基因序列的所有引物。然后，通過(guò)所述SNaPshot分析擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的基因序列可以用已知基因測(cè)序方法進(jìn)行分析。所述基因測(cè)序方法可以在本領(lǐng)域內(nèi)的已知方法中靈活選取，優(yōu)選的是包括自動(dòng)DNA測(cè)序。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)根據(jù)本發(fā)明所選的htSNP組合的可用性進(jìn)行了確認(rèn)。在使用圖34中的htSNP組合進(jìn)行所述SNaPshot分析后，分析了所得PCR產(chǎn)物的基因序列。結(jié)果，證實(shí)本發(fā)明的方法能高速地同時(shí)確定發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6基因型(參見(jiàn)圖40和41)。
可以用本發(fā)明所述方法確定的所述CYP2D6基因的基因型包括CYP2D6*1A、CYP2D6*2A、CYP2D6*5、CYP2D6*2N、CYP2D6*10B、CYP2D6*14B、CYP2D6*18、CYP2D6*21B、CYP2D6*41A、CYP2D6*49、CYP2D6*52和CYP2D6*60。各個(gè)基因型和與之相對(duì)應(yīng)的變異體如表34中所示。參見(jiàn)表34，例如，所述CYP2D6*1A基因型包含一個(gè)野生型，而所述CYP2D6*2A基因型包含野生型CYP2D6基因的基因序列中在SNP 1、SNP 5、SNP 8、SNP 9、SNP 12～SNP 18、SNP 21、SNP 25和SNP 28位點(diǎn)的變異體。所述CYP2D6*5基因型包含2D5刪除變異體。當(dāng)CYP2D6基因從人類染色體中被完全刪除后，不再產(chǎn)生酶。所述CYP2D6*2N基因型包含2D6重復(fù)變異體。即在同一染色體中至少存在2個(gè)CYP2D6基因。
本發(fā)明提供了使用基因芯片確定人類CYP2D6基因的基因型的方法。所述方法包括如下步驟 (a)提取待研究的基因，對(duì)所述基因進(jìn)行多重PCR并得到包含SNP的邊界的PCR產(chǎn)物； (b)用ASPE(等位基因特異性引物延伸)引物進(jìn)行ASPE反應(yīng)以鑒定等位基因的特異性堿基； (c)將所述反應(yīng)產(chǎn)物與基因芯片相混合；和 (d)分析所述基因芯片。
本發(fā)明提供了用于確定SNP的基因型分析芯片(參見(jiàn)圖42)，所述芯片含有基于Zip編碼(Zip Code)寡核苷酸的芯片。
對(duì)每個(gè)SNP生成一對(duì)引物以在操作(b)中進(jìn)行ASPE反應(yīng)。所生成的ASPE引物是在3’端包含SNP位點(diǎn)并與等位基因特異性結(jié)合的基因序列。所述ASPE引物包含Zip編碼，即，朝向5’端具有24bp的寡核苷酸。所生成Zip編碼在每個(gè)等位基因中含有不同的基因序列。
本發(fā)明從文獻(xiàn)中公開的基因序列和用生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)的基因序列中選擇了最優(yōu)Zip編碼序列，所述最優(yōu)Zip編碼序列經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不與其它樣品發(fā)生交叉反應(yīng)。所選序列的Tm為61℃。所生成的Zip編碼不互相干擾。所選基因序列具有ΔG值為-2以上的發(fā)夾形二級(jí)結(jié)構(gòu)。
如果使用所述ASPE引物進(jìn)行ASPE反應(yīng)，則含有對(duì)應(yīng)于所述引物的3’端的等位基因的樣品與所述引物反應(yīng)以發(fā)生等位基因特異性延伸反應(yīng)。如果使用與熒光材料Cyanine 5(Cy5)共價(jià)結(jié)合的dUTP(Cy5-dUTP)來(lái)進(jìn)行所述延伸反應(yīng)，則只有含對(duì)應(yīng)等位基因的樣品會(huì)被Cy5熒光材料標(biāo)記(參見(jiàn)圖45)。所述熒光材料不限于Cy5，可以使用其它材料，諸如Cy3、TAMRA、TexasRed、Cy3.5、Rhodamin6G、SyBR Green等。
在本發(fā)明的分析芯片上提供了與所述Zip編碼互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸探針(cZip Code，互補(bǔ)Zip編碼)。因此，可以識(shí)別用所述Zip編碼引物延伸的樣品中包含的每個(gè)等位基因(參見(jiàn)圖43)。
在所述探針中，在3’端插入了10bp的基因序列作為間隔區(qū)來(lái)誘導(dǎo)與目標(biāo)的雜交。例如，所述間隔區(qū)序列優(yōu)選為5’-CAG GCC AAGT-3’。
本發(fā)明的所述探針優(yōu)選包含參照158～184的基因序列。
在操作(c)和(d)中的將所述反應(yīng)產(chǎn)物與所述基因芯片相混合并分析經(jīng)混合的所述芯片的方法可以包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法。所用的DNA芯片掃描儀可以變化。更優(yōu)選的是，使用Axon公司生產(chǎn)的GenePix 4100B掃描儀。掃描的圖片可以用GenePix Pro 6.0軟件進(jìn)行分析。
如果用本發(fā)明所述基因芯片分析所述CYP2D6基因的變異體，則其結(jié)果與用序列分析所驗(yàn)證的結(jié)果相同。因此，本發(fā)明的基因芯片可以低成本分析各種基因的變異體。
4.PXR 本發(fā)明的方法使用基于高麗人PXR基因中的變異體選擇的htSNP來(lái)確定PXR基因中的功能性變異體。
本發(fā)明所述的選擇人類PXR基因的htSNP的方法包括如下步驟 (a)從人類中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類PXR基因或其片段； (d)對(duì)操作(c)中所得PCR產(chǎn)物測(cè)序以確定變異體的存在； (e)確定操作(d)中已證實(shí)具有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列中的單倍型；和 (f)用SNPtagger軟件對(duì)操作(e)中所確定的單倍型進(jìn)行測(cè)序并選擇htSNP。
所述從操作(a)收集的樣本中提取核酸的方法沒(méi)有限制，是本領(lǐng)域內(nèi)的已知方法。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來(lái)提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen公司(美國(guó))和Stratagene公司(美國(guó))生產(chǎn)的DNA或RNA提取試劑盒。如果提取的是RNA，則通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA待用。
操作(c)中的所述人類PXR基因的片段是指包含人類PXR基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)。擴(kuò)增所述人類PXR基因或其片段的引物可以基于人類PXR基因或其片段的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)，并且所述引物可以選自參照221～240的引物，但不限于此。
操作(d)中所述的變異體包括SNP、基因刪除和基因重復(fù)，但不限于此。例如，所述變異體可以包括22種變異體，如表48。
操作(d)中確定變異體的存在的方法可以包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的變異體檢測(cè)方法。優(yōu)選的是，可以進(jìn)行基因測(cè)序、電泳分析和RFLP分析來(lái)確定所述變異體的存在。所述基因測(cè)序可以通過(guò)自動(dòng)DNA測(cè)序儀或焦磷酸測(cè)序進(jìn)行。
可以通過(guò)比較野生型PXR基因的基因序列來(lái)確定操作(d)中變異體的存在。可以使用所述野生型PXR基因的基因序列，例如參照2200的基因序列(基因庫(kù)登錄號(hào)NT_005612)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的每個(gè)PXR基因型的基因序列。另外，還可用RFLP分析來(lái)比較所述野生型PXR基因的限制性酶的切割相。所述PXR基因的刪除或重復(fù)可以通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析來(lái)確定。
操作(d)中證實(shí)含有變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列中的單倍型的頻率和類型可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)程序或市場(chǎng)上銷售的程序來(lái)分析。例如，可以使用免費(fèi)分發(fā)的Haploview，或商業(yè)化程序SNPAlyze。所述Haploview軟件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，而更優(yōu)選的是，可以從http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview下載所述軟件。
本發(fā)明的方法可以另外包括對(duì)操作(a)～(e)的重復(fù)。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內(nèi)的PXR基因的變異相及其單倍型，可以在檢測(cè)完P(guān)XR基因型的頻率并從所述群體中選出頻繁PXR基因型之后執(zhí)行操作(f)。
在操作(f)中，用SNPtagger軟件對(duì)操作(e)中確定的單倍型測(cè)序來(lái)選擇htSNP。所述SNPtagger軟件在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如Genehunter、Merlin、Allegro、SNPHAP、htSNP finder(基于PCA)，更優(yōu)選的是，所述軟件可以從http://www.well.ox.ac.uk/～xiavi/haplotvpe或http://slack.ser.man.ac.uk/Drogs/htsnp.html下載。
可以驗(yàn)證所選htSNP來(lái)改善精度從而確定二倍型。當(dāng)由雙鏈染色體確定人類的基因型后，將所述基因型解碼以確定兩種單倍型組合。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則特定單倍型的組合可能和另一個(gè)單倍型的組合相同。如果所述基因型由根據(jù)本發(fā)明所開發(fā)的診斷解碼，則應(yīng)該驗(yàn)證它是否準(zhǔn)確確定了所述基因型?？梢杂肕atlab(邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))來(lái)分析是否由基因分析結(jié)果對(duì)所述基因型進(jìn)行了正確的解碼，從而進(jìn)行所述驗(yàn)證。
在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，首先研究了高麗人PXR基因中的變異體以選擇htSNP，高麗人PXR基因的功能性變異體。結(jié)果，在高麗人的PXR基因中共發(fā)現(xiàn)了22個(gè)SNP(參見(jiàn)表48)。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用DYNACOM公司生產(chǎn)的SNPAlyze軟件確定了22個(gè)所選SNP中的6個(gè)功能性變異體的單倍型，從而確定了總共14個(gè)單倍型(參見(jiàn)表49)。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用SNPtagger軟件對(duì)所述14個(gè)單倍型進(jìn)行測(cè)序以選擇htSNP，亦即可方便地確定發(fā)現(xiàn)于高麗人中的PXR基因的功能性變異體的最小標(biāo)記(參見(jiàn)圖47)。
可以使用根據(jù)本發(fā)明選擇的htSNP組合來(lái)確定人類PXR基因的功能性變異體。因此，本發(fā)明提供了確定人類PXR基因的功能性變異體的方法。所述方法包括如下步驟 (a)從人類中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類PXR基因或其片段；和 (d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定PXR基因中功能性變異體的存在，所述變異體選自-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C。
操作(b)中的所述從收集的樣本中提取核酸的方法與上述相同。
所述人類PXR基因的片段是指包含人類PXR基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)?？梢杂糜诓僮?c)的引物可以選自參照242～247的引物，但不限于此。
操作(d)中研究的所述SNP基于發(fā)現(xiàn)于高麗人中的PXR基因的功能性變異體，它對(duì)確定高麗人PXR基因的功能性變異體和所述功能性變異體的單倍型極具特異性。
可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多態(tài)性分析方法來(lái)確定操作(d)中所述PCR產(chǎn)物的基因序列中的PXR基因的變異體的存在。優(yōu)選的是，可以用SNaPshot分析(參見(jiàn)[Peter M.Vallone等，Int J Legal Med，2004，118147-157])、電泳分析或它們的組合，更優(yōu)選的是用SNaPshot分析來(lái)確定所述變異體的存在。
所述SNaPshot分析是指通過(guò)用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點(diǎn)附近的已退火基因序列(除SNP區(qū)域以外)和ddNTP。本發(fā)明中使用的SNaPshot分析是用基于操作(d)中研究的所述PXR基因的SNP的已知方法設(shè)計(jì)和制造的。所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點(diǎn)的堿基作為3’端，包含與所述SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列，并在5’端添加了T堿基即可。更優(yōu)選的是，引物可以選自參照242～2457的引物。優(yōu)選的是，所述與SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列的長(zhǎng)度大約為20bp。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則所述SNaPshot引物5’端的T堿基的長(zhǎng)度被設(shè)計(jì)為可變。例如，在所述5’端添加5個(gè)T堿基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。然后，將所述SNaPshot引物與和每個(gè)SNP互補(bǔ)的ddNTP結(jié)合。所述組合物因所述SNP的不同而大小不同。因此，可以同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP。
為了確定使用所述SNaPshot分析的基因分型結(jié)果是否正確，采用了另一種基因分型方法。另一種基因分型方法沒(méi)有限制，優(yōu)選包括自動(dòng)DNA測(cè)序或焦磷酸測(cè)序。
在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，對(duì)本發(fā)明所選的htSNP組合的可用性進(jìn)行了確認(rèn)。使用圖47中的htSNP組合進(jìn)行所述SNaPshot分析，并分析了所得PCR產(chǎn)物的基因序列。結(jié)果，證實(shí)本發(fā)明的方法能高速地同時(shí)確定發(fā)現(xiàn)于高麗人中的PXR基因功能性變異體(參見(jiàn)圖48～50)。
可以用本發(fā)明的方法確定的所述PXR基因的功能性變異體包括-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C。
5.UGT1A 根據(jù)本發(fā)明確定人類UGT1A基因的功能性變異體的方法包括如下步驟 (a)從人類中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)使用操作(b)中所提取的核酸個(gè)別地?cái)U(kuò)增人類UGT1A基因；和 (d)對(duì)操作(c)中擴(kuò)增的所述基因進(jìn)行測(cè)序并確定UGT1A基因的功能性變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的-39(TA)6>(TA)7、211G>A，233C>T和686C>A；UGT1A3基因中的31T>C、133C>T和140T>C；UGT1A4基因中的31C>T、142T>G和292C>T；UGT1A6基因中的19T>G、541A>G和552A>C；UGT1A7基因中的387T>G、391C>A、392G<A、622T>C和701T>C；和UGT1A9基因中的-118T9>T10、726T>G和766G>A。
本發(fā)明的確定UGT1A基因的與對(duì)依立替康的敏感性相關(guān)的多態(tài)性的方法包括如下步驟 (a)從人類中收集生物樣本； (b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)使用操作(b)中所提取的核酸個(gè)別地?cái)U(kuò)增人類UGT1A基因；和 (d)對(duì)操作(c)中擴(kuò)增的所述基因進(jìn)行測(cè)序并確定UGT1A遺傳變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的211G>A、233C>T和686C>A；UGT1A6基因中的19T>G、541A>G和552A>C；和UGT1A9基因中的-118T9>T10、726T>G和766G>A。
本發(fā)明的方法采用了基于主要發(fā)現(xiàn)于高麗人的UGT1A基因的多態(tài)性而選擇的最優(yōu)多態(tài)性標(biāo)簽組，并確定了UGT1A基因中的功能性變異體或藥物敏感性。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的方法對(duì)分析高麗人的UGT1A基因而言在時(shí)間和成本上具有有效性。
在本發(fā)明的操作(a)中，所述生物樣本采自人類，優(yōu)選的是包括高麗人、中國(guó)人和日本人在內(nèi)的亞洲人，而更優(yōu)選的是高麗人。所述生物樣本可以包括血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞或毛發(fā)，更優(yōu)選的是血液。
在本發(fā)明的操作(b)中，所述核酸提取自操作(a)中收集的生物樣本。所述核酸可以包括DNA或RNA，優(yōu)選的是DNA，更優(yōu)選的是基因組DNA。從所收集的樣本中提取核酸的工藝沒(méi)有限制，可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)進(jìn)行。作為另外一種選擇，可以使用DNA或RNA提取試劑盒，例如由Quiagen公司(美國(guó))和Stratagene公司(美國(guó))生產(chǎn)的試劑盒。
在本發(fā)明的操作(c)中，使用操作(b)中提取的核酸作為模板并用引物擴(kuò)增了所述UGT1A基因。如果操作(b)中提取的核酸是RNA，則將該RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化為cDNA以用作模板。所述引物由已知方法基于人類UGT1A基因或其片段的基因序列設(shè)計(jì)和制造。
在本發(fā)明的操作(c)中，優(yōu)選的是擴(kuò)增UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9基因來(lái)確定UGT1A基因中的功能性變異體。優(yōu)選的是，擴(kuò)增UGT1A1、UGT1A6和UGT1A9基因來(lái)確定UGT1A基因的決定了對(duì)依立替康的敏感性的多態(tài)性。
在本發(fā)明的操作(d)中，使用操作(c)中所擴(kuò)增的UGT1A基因來(lái)分析所述功能性變異體或與UGT1A基因的藥物敏感性相關(guān)的多態(tài)性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的多態(tài)性分析方法來(lái)分析所述功能性變異體或多態(tài)性。例如，可以進(jìn)行SNaPshot分析、電泳分析、焦磷酸測(cè)序或上述方法的組合。
具體而言，如果待分析的UGT1A基因的變異體包含SNP，則優(yōu)選的是SNaPshot分析。在SNaPshot分析中，使用可以使與SNP位點(diǎn)相鄰的區(qū)域退火的引物和ddNTP來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)。SNaPshot分析中使用的所述引物由基于UGT1A基因的SNP的已知方法設(shè)計(jì)和制造。例如，設(shè)計(jì)和制造引物使得緊鄰SNP位點(diǎn)的堿基是3’端，包含與所述SNP位點(diǎn)相鄰的已退火基因序列，且在5’端添加了T堿基。優(yōu)選的是，所述已退火的基因序列的長(zhǎng)度大約為20bp。如果同時(shí)確定數(shù)個(gè)SNP，則所述SNaPshot引物5’端的T堿基的長(zhǎng)度被設(shè)計(jì)為不同，從而改變所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。
含參照2905～314的基因序列的引物可以用來(lái)進(jìn)行確定UGT1A基因的功能性變異體的SNaPshot分析。含參照315～322的基因序列的引物可以用來(lái)進(jìn)行確定UGT1A基因的與對(duì)依立替康的敏感性相關(guān)的多態(tài)性。
由所述SNaPshot分析擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的基因序列可以用已知測(cè)序方法分析。優(yōu)選的是，所述PCR產(chǎn)物的基因序列可以用自動(dòng)測(cè)序方法來(lái)分析，但不限于此。
如果待分析的UGT1A基因變異體不是SNP(例如，UGT1A1基因中的-39(TA)6>(TA)7)，則可以進(jìn)行已知的焦磷酸測(cè)序來(lái)代替所述SNaPshot分析。所述焦磷酸測(cè)序評(píng)價(jià)在DNA聚合時(shí)釋放的PPi(無(wú)機(jī)焦磷酸鹽)的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，可以使用含參照292～294的基因序列的引物來(lái)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序以確定UGT1A1基因的-39(TA)6>(TA)7。
下文將對(duì)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。下述示例性實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于下述示例性實(shí)施方式。
<CYP1A2> 示例性實(shí)施方式1確定高麗人CYP1A2基因的基因型 <1-1>CYP1A2基因的擴(kuò)增 從48個(gè)健康對(duì)象采集血液后，使用Qiagen公司生產(chǎn)的基因組DNA分離試劑盒將DNA從血液中分離。所述CYP1A2基因包含7個(gè)外顯子(exon)，且大約為11kb長(zhǎng)。將所述CYP1A2基因分為15個(gè)片段進(jìn)行PCR。在每個(gè)PCR中使用的引物如表1所示。在本說(shuō)明書中的基因序列中所寫的A、T、G和C是指腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶。
[表1]用于擴(kuò)增CYP1A2基因及其基因序列的引物

所述引物的位置和所述PCR產(chǎn)物的大小如表2所示。核苷酸的位置根據(jù)細(xì)胞色素P450(CYP)等位基因命名委員會(huì)(http://www.cypalleles.ki.se/cyp1a2.htm)的命名方法書寫。
[表2]引物位置和PCR產(chǎn)物大小
PCR片段對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件如表3所示。
[表3]PCR反應(yīng)條件 <1-2>PCR產(chǎn)物測(cè)序 用自動(dòng)DNA測(cè)序儀對(duì)由示例性實(shí)施方式<1-1>得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。所用引物如表4中所示。
[表4]測(cè)序用引物

用自動(dòng)DNA測(cè)序儀分析了根據(jù)示例性實(shí)施方式<1-1>擴(kuò)增的CYP1A2基因的完整基因序列。在將其與野生型CYP1A2基因(參照1)的基因序列比較后，共發(fā)現(xiàn)了17個(gè)SNP。其結(jié)果如表5中所示。經(jīng)確認(rèn)SNP-2603insA為新型SNP。
[表5]發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2基因變異體 然后，本發(fā)明人使用包含所述SNP中發(fā)現(xiàn)的遺傳變異體的對(duì)象的DNA作為模板，用含有參照38和39的引物進(jìn)行了PCR并用與上述方法相同的方法分析了所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列。其目標(biāo)是確定所述新型SNP是否位于所述CYP1A2基因的一條單鏈中，在同一單鏈中是否存在其它變異體，所述新型SNP是否是由位于該染色體其它部位的相似基因?qū)е碌摹?br> 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這一SNP位于啟動(dòng)子的-2603insA處。所述雙鏈DNA的一條鏈為變異體而另一條鏈為野生型(圖1)。
示例性實(shí)施方式2確定CYP1A2變異體的單倍型 在本發(fā)明的示例性實(shí)施方式中發(fā)現(xiàn)的17種CYP1A2基因變異體根據(jù)其組合可能影響CYP1A2酶的活性。已有報(bào)道對(duì)應(yīng)于某些單倍型的酶活性的變異體。因此，本發(fā)明人用DYNACOM公司的SNPA1yze軟件分析了由示例性實(shí)施方式1中所確定的變異體引起的單倍型。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了在其它種族中未曾發(fā)現(xiàn)過(guò)的新型高麗人單倍型，如表6所示。
[表6]
示例性實(shí)施方式3htSNP的選擇和驗(yàn)證 有報(bào)道稱所述幾個(gè)單倍型，即CYP1A2基因的SNP的組合，可能影響CYP1A2酶的活性?？梢杂米钚?biāo)記檢查所生成的單倍型的具體信息。所述最小標(biāo)記稱為htSNP，是準(zhǔn)確標(biāo)記單倍型所必需的，且包含數(shù)種組合。用SNPtagger軟件(http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype)選擇了所述htSNP組合，亦即最優(yōu)標(biāo)簽組。所選的htSNP組合的實(shí)例如圖2～6中所示。所選htSNP組合是最優(yōu)標(biāo)簽組之一，其中“1”是指野生型，“2”是變異體而‘V’是指所選htSNP。htSNP組合的選擇可以與圖2～6中的htSNP組合不同。
用Matlab軟件(7.1版，邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))分析發(fā)現(xiàn)的所述組合來(lái)確定二倍型和基因型而兩者不相互重合。分析結(jié)果用于確定所述組合。
根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，可以確定二倍型和基因型，兩者不相互重合。這指的是，本發(fā)明所選的htSNP組合不相同，且確定基因型的所述分析是絕對(duì)正確的。
示例性實(shí)施方式4在CYP1A2啟動(dòng)子中快速搜索遺傳變異體 在示例性實(shí)施方式1中確定的發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP1A2基因中的17個(gè)SNP中，進(jìn)行SNaPshot分析來(lái)高速搜索影響CYP1A2酶活性的11個(gè)啟動(dòng)子SNP。使用對(duì)象的DNA作為模板進(jìn)行PCR，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SNaPshot分析。所述CYP1A2基因的啟動(dòng)子大約為4，000堿基，而用于PCR的引物如表7所示。
[表7]引物名稱和基因序列
所述PCR產(chǎn)物的反應(yīng)條件如表8所示。
[表8]PCR反應(yīng)條件 不與擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物反應(yīng)的剩余引物和dNTP可能影響所述SNaPshot分析。為了除去剩余引物和dNTP，將5μL PCR產(chǎn)物與2μLExoSAP-IT(USB生產(chǎn))混合以在37℃反應(yīng)30分鐘，然后于80℃再反應(yīng)15分鐘以使剩余的酶失活。使用產(chǎn)物與表9中的引物進(jìn)行PCR來(lái)制成多重SNaPshot反應(yīng)物。所述多重SNaPshot反應(yīng)物和PCR反應(yīng)條件如表10和表11中所示。
[表9]引物名稱及其基因序列 [表10]多重SNaPshot反應(yīng)物
[表11] 反應(yīng)進(jìn)行完全后，將2μL SAP(USB)與5μL SNaPshot產(chǎn)物混合，在80℃反應(yīng)15分鐘，從而除去[F]ddNTP。然后將0.5μL反應(yīng)物、9.25μLHi-Di甲酰胺(ABI)和0.25μL GeneScan-LIZ規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)物(ABI)于95℃混合5分鐘以使其變性。然后，用3130XL基因分析儀(3130XL GeneticAnalyzer，ABI)分析所述混合物。所得分析結(jié)果如圖7～14中所示。
如圖中所示，根據(jù)所述CYP1A2基因的變異體的不同而顯示不同的峰的顏色和位置，從而易于辨認(rèn)野生型、具有雜合等位基因的變異體(雜合)和具有純合等位基因的變異體(純合)。本發(fā)明所述分析方法節(jié)省成本和時(shí)間，且能方便地分析所述CYP1A2基因變異體。
<CYP2A6> 示例性實(shí)施方式5確定高麗人2A6基因的基因型 <5-1>2A6基因的擴(kuò)增 從50個(gè)健康對(duì)象采集血液后，使用Qiagen公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒將DNA從血液中分離。所述CYP2A6基因包含9個(gè)外顯子，且大約為6.9kb長(zhǎng)。將所述CYP2A6基因分為7個(gè)片段進(jìn)行PCR。PCR所用引物如表12所示。在本說(shuō)明書中的基因序列中所寫的A、T、G和C是指腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶。
[表12]用于擴(kuò)增CYP2A6基因的引物及其基因序列
*從文獻(xiàn)[Drug Metab.Pharmacokin，17(5)SNP18(482)-SNP23(487)(2002)]中引用的引物 所述引物的位置和所述PCR產(chǎn)物的大小如表13所示。核苷酸的位置根據(jù)細(xì)胞色素P450(CYP)等位基因命名委員會(huì)(http://www.cypalleles.ki.se/cyp1a2.htm)的命名方法書寫。
[表13]引物位置和PCR產(chǎn)物大小
PCR片段對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件如表14所示。
[表14]PCR反應(yīng)條件 <5-2>PCR產(chǎn)物測(cè)序 用自動(dòng)DNA測(cè)序儀和含有參照76～89的引物對(duì)由示例性實(shí)施方式<5-1>得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
在將其與野生型CYP2A6基因的基因序列(參照75)比較后，共發(fā)現(xiàn)27個(gè)SNP。27個(gè)SNP中有2個(gè)為新型SNP。通過(guò)基因刪除的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNP?？偣?0個(gè)SNP如表5中所示。
[表15]發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6基因變異體 在表15中，“+”標(biāo)記了發(fā)現(xiàn)于因CYP2A6基因刪除所致而結(jié)合了部分CYP2A6基因和CYP2A7基因的基因中的變異體(參見(jiàn)圖33，CYP2A6基因的外顯子1～8被除去，而所述CYP2A6基因的外顯子9部分替換了CYP2A7基因的外顯子9端)。在假設(shè)所述CYP2A6基因以整體存在的前提下，根據(jù)基因序列對(duì)所述SNP編號(hào)(由于CYP2A6基因被刪除，所以所述SNP并非是針對(duì)CYP2A6基因的)。
為了使用所述SNP確定被刪除的單倍型，在CYP2A6和CYP2A7基因的相同基因序列內(nèi)的5’位點(diǎn)設(shè)計(jì)了正向引物，而在外顯子9中設(shè)計(jì)了逆向引物，所述外顯子9對(duì)CYP2A6基因具有特異性但不擴(kuò)增CYP2A7基因。因此，整個(gè)CYP2A6基因或因所述CYP2A6基因被刪除而與所述CYP2A7基因相結(jié)合的基因可被擴(kuò)增，而所述CYP2A7基因不被擴(kuò)增。
從擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中選擇對(duì)于CYP2A6和CYP2A7基因具有特異性的堿基。在所述CYP2A6基因的翻譯起始密碼子ATG的基礎(chǔ)上，所述CYP2A6基因的6091C/T堿基的邊界(參照75)與CYP2A7基因的6521T的邊界(參照104)相似。不僅是6091，CYP2A6基因序列中的5971G和5983T都與所述CYP2A7基因不同。
“*”是指被國(guó)際CYP命名委員會(huì)認(rèn)可為等位基因的變異體。例如，*11是指含與野生型相比第224位氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼岬淖儺愺w的單倍型。所述國(guó)際命名方法參見(jiàn)http://www.cypalleles.ki.se/cyp2a6.htm。在表中，“#”指新型變異體。
示例性實(shí)施方式6確定CYP2A6基因的基因型的單倍型 示例性實(shí)施方式5中的27個(gè)CYP2A6遺傳變異體和3個(gè)CYP2A6刪除標(biāo)記的變異體取決于其組合方式而可能影響CYP2A6酶的活性。因此，本發(fā)明人用DYNACOM公司的SNPAlyze軟件分析了示例性實(shí)施方式5中所確定的變異體的單倍型。通常，選擇具有5％或10％以上的頻率的變異體來(lái)預(yù)測(cè)單倍型的分布，因?yàn)榈皖l率變異體很難保證統(tǒng)計(jì)顯著性。然而，導(dǎo)致氨基酸替換的變異體即使頻率較低仍具有顯著功能性。因此，在本發(fā)明中，使用了6個(gè)高頻變異體-48T>G、22C>T、51G>A、1620T>C、1836G>T和6354T>C以及8個(gè)導(dǎo)致氨基酸替換的變異體13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T和6600G>T來(lái)確定所述單倍型。在分析中添加了可以標(biāo)記基因刪除的變異體5971G>A、5983T>G和6091C>T。共使用了17個(gè)變異體來(lái)確定所述單倍型。因此，高麗人中的20個(gè)單倍型的分布如圖15中所示。
示例性實(shí)施方式7htSNP的選擇和驗(yàn)證 有報(bào)道稱，數(shù)個(gè)單倍型，即CYP2A6基因的SNP組合，可能影響CYP2A6酶的活性?？梢杂米钚?biāo)記檢查所生成的單倍型的具體信息。所述最小標(biāo)記稱為htSNP，是準(zhǔn)確標(biāo)記單倍型所必需的，且包含幾種組合。用SNPtagger軟件(http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype)分析了根據(jù)示例性實(shí)施方式6選擇的20個(gè)單倍型的基因序列以選擇所述htSNP組合，亦即最優(yōu)標(biāo)簽組。
結(jié)果，選中的htSNP組合如圖16～21中所示。所選htSNP組合是最優(yōu)標(biāo)簽組，其中“1”是指野生型，“2”是變異體而“V”是指所選htSNP。
如果通過(guò)所述htSNP分析確定了所述變異體的基因型，則其單倍型可以根據(jù)分析結(jié)果預(yù)測(cè)。然而，不同單倍型的組合可能具有相同的基因型。用Matlab軟件(7.1版，邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))分析發(fā)現(xiàn)的所述組合來(lái)確定二倍型和基因型，兩者不相互重合。
根據(jù)所得結(jié)果，根據(jù)本實(shí)施方式選擇的htSNP可以確定相互不重合的單倍型。這意味著，根據(jù)本發(fā)明選擇的htSNP組合互不相同，且確定基因型的所述分析是絕對(duì)正確的。
示例性實(shí)施方式8在CYP2A6基因中快速搜索功能性變異體 在示例性實(shí)施方式5中確定的發(fā)現(xiàn)于高麗人中的27種CYP2P6基因的變異體和3種標(biāo)記CYP2A6基因刪除的變異體中，改變功能性的所述CYP2A6基因的基因型可以用于確定基因。進(jìn)行SNaPshot分析來(lái)高速搜索10種功能性變異體，所述SNaPshot分析是CYP2A6基因的高速基因分型技術(shù)之一。所述10種功能性變異體包括9種改變氨基酸或確認(rèn)具有功能性的變異體-48T>G、13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T和6600G>T，和標(biāo)記基因刪除的變異體6091C>T。在圖16的htSNP組合當(dāng)中，選中的htSNP包括10種具有功能性的變異體。所述變異體的位置如表17所示。
[表17]由本發(fā)明的htSNP組合選出的變異體的位置 具體而言，使用對(duì)象的DNA作為模板進(jìn)行PCR，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SNaPshot分析。用于PCR的引物如表18所示。
擴(kuò)增CYP2A6_long的引物擴(kuò)增了CYP2A6基因的整個(gè)長(zhǎng)度。因此，它們不能用于CYP2A6基因刪除。為了確定標(biāo)記基因刪除的6091C>T，應(yīng)該使用一對(duì)引物CYP2A6delF和CYP2A6delR來(lái)擴(kuò)增CYP2A6*4產(chǎn)物。
[表18]引物名稱和基因序列
所述PCR產(chǎn)物的反應(yīng)條件如表19所示。
[表19]PCR反應(yīng)條件 不與擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物反應(yīng)的剩余引物和dNTP可能影響所述SNaPshot分析。為了除去剩余引物和dNTP，將5μL PCR產(chǎn)物與2μLExoSAP-IT(USB生產(chǎn))混合，于37℃反應(yīng)30分鐘，然后于80℃再反應(yīng)15分鐘以使剩余的酶失活。使用所述經(jīng)酶處理的產(chǎn)物與表20中的引物進(jìn)行PCR來(lái)制成多重SNaPshot反應(yīng)物。所述多重SNaPshot反應(yīng)物和PCR反應(yīng)條件如表21和表22中所示。
[表20]引物名稱及其基因序列 [表21]多重SNaPshot反應(yīng)物
(“+”1/2終點(diǎn)緩沖液的組成200mM Tris-HCl，5mM MgCl2，pH 9；Nucleic Acids Research，30(15)74，2002) [表22] 反應(yīng)完成后，將1μL SAP(USB)與10μL SNaPshot產(chǎn)物混合，于37℃反應(yīng)60分鐘，然后于65℃反應(yīng)15分鐘，從而除去剩余ddNTP。然后將0.5μL反應(yīng)物、9.3μL Hi-Di甲酰胺(ABI)和0.2μL GeneScan-LIZ規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)物(ABI)于95℃混合5分鐘以使其變性。然后，用3130XL基因分析儀(ABI)分析所述混合物。所得分析結(jié)果如圖22～30中所示。所述基因型的分析如表23所示。
[表23]
如圖22～30中所示，在每個(gè)SNP中峰的顏色和大小相同。峰的顏色和大小隨所述CYP2A6基因的功能性變異體的不同而不同，從而易于辨認(rèn)野生型、具有雜合等位基因的變異體(雜合)和具有純合等位基因的變異體(純合)。在圖22～30的圖中，X軸是指因引物長(zhǎng)度差異造成的引物在自動(dòng)DNA測(cè)序儀中的移動(dòng)距離，而Y軸是指各堿基中包含的具有特定波長(zhǎng)的熒光材料所發(fā)出的熒光的強(qiáng)度。
圖31和圖32說(shuō)明了與圖22～30中的基因研究一同進(jìn)行的SNaPshot分析，從而研究除圖22～30中的遺傳變異體以外的CYP2A6基因刪除。圖31說(shuō)明了通常存在于同源染色體中的CYP2A6基因，而圖32說(shuō)明了不存在于一個(gè)染色體中且只有一個(gè)基因的CYP2A6。
用根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的SNaPshot分析分析了50個(gè)樣本及其全長(zhǎng)序列。根據(jù)所述分析，基因分型結(jié)果100％相同。也即是說(shuō)，本發(fā)明所述方法具有高再現(xiàn)性并且準(zhǔn)確。
因此，可以用本發(fā)明所述分析方法方便地確定CYP2A6基因的功能性變異體且節(jié)省時(shí)間和成本。
所述方法確定了10個(gè)主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2A6單倍型且同時(shí)用所述組合快速確定了所述CYP2A6基因型。由于包括了發(fā)現(xiàn)于高麗人中的遺傳變異體，因此所述分析方法在確定基因型方面是非常準(zhǔn)確的。另外，所述方法可以分析具有與高麗人非常相似的遺傳學(xué)特性的日本人的幾乎所有基因型。另外還認(rèn)為所述方法可以用于確定90％以上的中國(guó)人的CYP2A6基因型。
<CYP2D6> 示例性實(shí)施方式9確定高麗人的CYP2D6基因的基因型 <9-1>基因組DNA的分離 使用基因組DNA分離試劑盒(Giagen)從采自174個(gè)高麗人的血液樣本中分離基因組DNA。
<9-2>CYP2D6基因的擴(kuò)增和全長(zhǎng)測(cè)序 從示例性實(shí)施方式<9-1>中分離的共174個(gè)基因組DNA樣品中隨機(jī)選取51個(gè)樣品用作模板。使用一對(duì)引物進(jìn)行PCR以擴(kuò)增人類CYP2D6基因的9個(gè)外顯子和1.8kb啟動(dòng)子。
[表24]用于基因擴(kuò)增的引物 所述PCR在94℃進(jìn)行1分鐘，在98℃進(jìn)行10秒，在64℃進(jìn)行30秒，并在72℃進(jìn)行7分鐘，如此運(yùn)行30周期，并最終在72℃進(jìn)行10分鐘。結(jié)果，產(chǎn)生了6，569bp的PCR產(chǎn)物(參見(jiàn)表25)。
[表25]引物位置和PCR產(chǎn)物大小
使用擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為模板，用表26中的共13個(gè)引物分析擴(kuò)增的CYP2D6基因的基因序列。
[表26]用于全長(zhǎng)測(cè)序的引物 <9-3>針對(duì)各基因型的分別分析 對(duì)于剩余的123個(gè)示例性實(shí)施方式<9-1>中所分離的基因組DNA樣品，分別分析了主要發(fā)現(xiàn)于亞洲人中的變異體*2A、*5、*2N、*10B、*14B、*18、*21B、*41A、*49、*52和*60的基因型。
a)CYP2D6*5的分析 為了確定所述CYP2D6*5基因型，使用表27中的引物進(jìn)行PCR。所述PCR在94℃進(jìn)行1分鐘，在98℃進(jìn)行10秒，在64℃進(jìn)行30秒，并在72℃進(jìn)行5分鐘，如此運(yùn)行30周期，然后在72℃進(jìn)行10分鐘。結(jié)果，對(duì)于野生型，擴(kuò)增了包含9個(gè)外顯子的5.1kb PCR產(chǎn)物。對(duì)于CYP2D6*5變異體，擴(kuò)增了3.5kb PCR產(chǎn)物。
[表27]引物的基因序列和位置及PCR產(chǎn)物的大小
b)CYP2D6*2N的分析 為了確定所述CYP2D6*2N基因型，使用表28中的引物進(jìn)行PCR。所述PCR在94℃進(jìn)行1分鐘，在98℃進(jìn)行10秒，在64℃進(jìn)行30秒，并在72℃進(jìn)行8分鐘，如此運(yùn)行30周期，然后在72℃進(jìn)行10分鐘。結(jié)果，對(duì)于CYP2D6*2N變異體，產(chǎn)生了7.8kb PCR產(chǎn)物。
[表28]引物的基因序列和位置及PCR產(chǎn)物的大小
c)CYP2D6*2和*41的分析 除-1584C>G變異體之外，CYP2D6*2基因型和CYP2D6*41基因型包含相同的變異體(-1235A>G；-740C>T；-678G>A；在內(nèi)含子1中基因轉(zhuǎn)換為CYP2D7；1661G>C；2850C>T；4180G>C)。使用表29中的引物用AS-PCR方法(Johanson，Mo1ecular Pharmacology，46452-459，1994)分析了在內(nèi)含子1中基因轉(zhuǎn)換為CYP2D7的所述變異體的基因序列。
如果內(nèi)含子1中發(fā)生轉(zhuǎn)換為CYP2D7基因的基因轉(zhuǎn)換，則用含參照129的引物9和含參照125的引物10B進(jìn)行PCR以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。如果所述CYP2D6*2基因型和CYP2D6*41基因型是正常的，則只有在用含參照129的引物9和含參照130的引物10的組合進(jìn)行PCR時(shí)才會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，可以通過(guò)用所述引物9和所述引物10B的組合進(jìn)行PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在來(lái)確定內(nèi)含子1中轉(zhuǎn)換為CYP2D7基因的所述基因轉(zhuǎn)換。
所述PCR在94℃進(jìn)行5分鐘，在94℃進(jìn)行30秒，在64℃進(jìn)行30秒，并在72℃進(jìn)行30秒，如此運(yùn)行35周期，然后在72℃進(jìn)行10分鐘。用表29中的測(cè)序引物對(duì)-1584C>G變異體進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。確定了-1584G是CYP2D6*2基因型而-1584C是CYP2D6*41基因型。
[表29]引物的基因序列
d)CYP2D6*10B、*14、*18和*49基因型的分析 用PCR-RFLP方法(Johanson，Molecular Pharmacology，46452-459，1994；Wang，Drug Metabolism and Dispososition，27385-388，1998；及Geadigk，Pharmacogenetics，9669-682，1999)分析了所述CYP2D6*10B、*14、*18和*49基因型。所用引物如表30中所示，實(shí)驗(yàn)條件如表31中所示。
[表30]針對(duì)各基因型的引物的基因序列和位置
[表31]針對(duì)各基因型的限制性酶和RFLP相 e)CYP2D6*21、*52和*60基因型的分析 通過(guò)PCR-焦磷酸測(cè)序分析了所述CYP2D6*21、*52和*60基因型。所述分析所用的引物的基因序列如表32所示。
[表32]針對(duì)各基因型的引物的基因序列
基于基因庫(kù)登錄號(hào)M33388中公開的CYP2D6基因的基因序列分析了示例性實(shí)施方式<9-2>和<9-3>中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。每個(gè)等位基因的頻率如表33中所示。
[表33]發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6基因的單倍型
表33中，“Normal”是指正常態(tài)，“Incr”是指增加，“Decr”是指降低，而“None”是沒(méi)有活性。括號(hào)中的標(biāo)注是用于所述分析的標(biāo)記藥物的簡(jiǎn)寫b是丁呋洛爾(bufuralol)；d是異哇胍(debrisoquine)；dx是右美沙芬(dextromethorphan)；s是司巴丁(sparteine)。
當(dāng)從主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的12種基因型中選擇基因后，基于細(xì)胞色素P450(CYP)等位基因命名委員會(huì)(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm)的各基因型的變異體如表34中所示。在表34中，“1”是指野生型而“2”指變異體。
[表34]

示例性實(shí)施方式10htSNP的選擇和驗(yàn)證 要確定示例性實(shí)施方式9中發(fā)現(xiàn)于高麗人中的12個(gè)CYP2D6基因型，分析表34中的所有33個(gè)變異體在成本和時(shí)間上不夠有效。因此，選擇了標(biāo)記遺傳變異體的htSNP來(lái)有效地確定所述基因型，所述htSNP具有單倍型的詳細(xì)信息。所述htSNP必需準(zhǔn)確標(biāo)記每個(gè)單倍型，并包含各種組合。用SNPtagger軟件(http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype/)選擇所述htSNP組合亦即最優(yōu)標(biāo)簽組。所選htSNP組合的實(shí)例如圖34～39中所示。所選htSNP組合是最優(yōu)標(biāo)簽組，其中“1”是指野生型而“2”是變異體，“V”標(biāo)記了選中的htSNP。
用Matlab軟件(7.1版，邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))分析所選組合來(lái)確定相互不重合的二倍型和基因型。然后，確定htSNP組合。
根據(jù)所述驗(yàn)證結(jié)果，可以確定二倍型和基因型而不用使兩者相互重合。換言之，根據(jù)本發(fā)明選擇的htSNP組合互不相同，且確定基因型的所述分析是絕對(duì)正確的。
示例性實(shí)施方式11SNaPshot分析 使用示例性實(shí)施方式10中所選的htSNP組合來(lái)進(jìn)行SNaPshot分析，SNaPshot分析是CYP2D6基因的高速基因分型技術(shù)之一。圖34中的htSNP組合被選擇用于分析。htSNP中包含的變異體的位置如表35所示。對(duì)于htSNP1～htSNP3，如果分析了各種變異體的一個(gè)SNP，則基因型即可確定。而對(duì)于htSNP9，有9個(gè)堿基被插入并重復(fù)。因此，當(dāng)分析了第4125～4133位堿基之一并將其與野生型基因的基因序列比較之后即可確定基因型。
[表35]本發(fā)明的htSNP組合所選的變異體的位置 用與示例性實(shí)施方式<9-2>中相同的方法擴(kuò)增所述CYP2D6基因以產(chǎn)生約6.7kb產(chǎn)物。為確定CYP2D6*5，使用含參照154的引物CYP2D6_3(5’ACCTCTCTGGGCCCTCAGGGA-3’)和含參照123的引物3’2D6*5擴(kuò)增CYP-REP-Del。所述PCR在94℃進(jìn)行1分鐘，在98℃進(jìn)行10秒，在64℃進(jìn)行30秒，并在72℃進(jìn)行3分鐘，如此運(yùn)行30周期，并最終在72℃進(jìn)行10分鐘。結(jié)果，產(chǎn)生了6，569bp的PCR產(chǎn)物。
不與擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物反應(yīng)的剩余引物和dNTP可能影響所述SNaPshot分析。為了除去剩余引物和dNTP，將5μL PCR產(chǎn)物與2μLExoSAP-IT(USB生產(chǎn))混合，在37℃反應(yīng)30分鐘，然后在80℃再反應(yīng)15分鐘以使剩余的酶失活。將經(jīng)酶處理的產(chǎn)物和3μL模板(2μL 6.7kb的CYP2D6基因和1μL 3.6kb的CYP-REP-DEL的混合物)、1μLSNaPshot多重預(yù)反應(yīng)混合物(ABI)、4μL 1/2終點(diǎn)緩沖液(200mM Tris-HCl，5mMMgCl2，pH 9)和合并(Pooled)SNaPshot引物混合以制成共10μL反應(yīng)物。然后，對(duì)所述反應(yīng)物的PCR在96℃進(jìn)行10秒，在50℃進(jìn)行5秒，在60℃進(jìn)行30秒，如此運(yùn)行40周期。所用合并SNaPshot引物的處理濃度如表36所示。
[表36]合并SNaPshot引物的基因序列和處理濃度 反應(yīng)完成后，將10μL反應(yīng)物與1μL SAP(USB公司)混合，在37℃反應(yīng)1小時(shí)，然后在65℃反應(yīng)15分鐘。然后將0.5μL反應(yīng)物、0.2μLLIZ120(ABI)和9.3μL Hi-Di甲酰胺(ABI)混合并置于96孔板。在95℃反應(yīng)2分鐘后，用3130基因分析儀(ABI)分析所述樣品。所得分析結(jié)果如圖40中所示。
如圖40所示，每個(gè)SNP的峰的顏色和大小都是相同的?？梢郧宄罔b定野生型和變異體。
為了用SNaPshot分析來(lái)分析CYP2D6基因重復(fù)，用相同方法擴(kuò)增CYP-REP-Dup以產(chǎn)生3.3kb PCR產(chǎn)物，但此處使用含參照155的Dup-F_2(5’-CCTCACCACAGGACTGGCCACC-3’)和含參照156的Dup-R(5’-CACGTGCAGGGCACCTAGAT-3’)。為從所述PCR產(chǎn)物中除去剩余引物，將5μL PCR產(chǎn)物和2μL ExoSAP-IT(USB)混合，在37℃反應(yīng)30分鐘。然后，所述PCR產(chǎn)物在80℃反應(yīng)15分鐘，使所剩ExoSAP-IT失活。將經(jīng)酶處理的PCR產(chǎn)物與3μL模板、1μL SNaPshot多重預(yù)反應(yīng)混合物、4μL 1/2終點(diǎn)緩沖液和SNaPshot引物(含參照157，CYP2D6-5R，5′-CTCGTCACTGGTCAGGGGTC-3′)混合，制成10μL的反應(yīng)物，以在相同條件下進(jìn)行SNaPshot反應(yīng)。用3100基因分析儀分析所述反應(yīng)物。分析結(jié)果如圖41所示。
如圖中所示，SNP的峰的顏色和大小是相同的?？梢郧宄罔b定野生型和變異體。
通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了包括野生型和遺傳變異體的50個(gè)樣本。結(jié)果100％相同。換言之，本發(fā)明所述的方法具有高再現(xiàn)性并且準(zhǔn)確。
所述方法確定了12個(gè)主要發(fā)現(xiàn)于高麗人中的CYP2D6單倍型且同時(shí)用所述組合快速確定了CYP2D6基因型。由于包括了發(fā)現(xiàn)于高麗人中的遺傳變異體，因此所述方法在確定基因型方面是非常準(zhǔn)確的。所述方法可以用于確定具有與高麗人非常相似的遺傳學(xué)特性的日本人的基因型。根據(jù)上述結(jié)果可以認(rèn)為所述方法可以用于確定90％以上的中國(guó)人的CYP2D6基因型。
示例性實(shí)施方式12用基因芯片確定基因型 <12-1>Zip編碼芯片的制作 1)探針的制作 將所述探針設(shè)計(jì)為具有與用于ASPE PCR反應(yīng)的Zip編碼互補(bǔ)的基因序列。在3’端插入10bp核苷酸序列(5’-CAG GCC AAGT-3’)作為間隔區(qū)以誘導(dǎo)與目標(biāo)的雜交。
在所述間隔區(qū)的5’端加入24bpZip編碼寡核苷酸。所述探針的基因序列(cZip Code)如表37所示。在這里，表37中的黑體字母是10bp間隔區(qū)序列(圖43)。
[表37] 2)探針的點(diǎn)樣和固定 使用涂布有胺的Corning產(chǎn)GAPSII載玻片來(lái)制造芯片。使用OmniGrid100點(diǎn)樣器用SMP4XP針在所述載玻片上點(diǎn)樣。點(diǎn)樣條件是22℃和54％的濕度。分別在27個(gè)探針上進(jìn)行雙點(diǎn)樣。點(diǎn)樣過(guò)程完畢后，向所述載玻片照射7,500μL/cm2的紫外光以固定所述探針。
3)用于Zip編碼測(cè)試的基因芯片 使用CYP2D6基因的9個(gè)基因型標(biāo)簽(SNP，在表37中以黑體字母標(biāo)記)驗(yàn)證了11個(gè)基因型CYP2D6*1、*2、*5、*10B、*14A、*14B、*18、*21、*41、*49和*2N。
[表38] <12-2>目標(biāo)的制作 1)長(zhǎng)PCR 將2μL CYP2D6基因組DNA樣品、1X LA緩沖液、2.5mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2pmol/μL表16中的引物、2.5單位的LA標(biāo)簽DNA聚合酶(TAKARAcat.No.PR002A)和去離子水混合制成50μL。然后使所述混合物在94℃進(jìn)行1次變性1分鐘，然后在98℃反應(yīng)10秒，在64℃反應(yīng)30秒，在72℃反應(yīng)6分鐘，并重復(fù)30個(gè)周期，然后再反應(yīng)1分鐘以便擴(kuò)增(圖44)。(從CYP2D6基因產(chǎn)生了3種對(duì)應(yīng)*5、*2N等位基因和其它等位基因的第一PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件同上。) [表39]長(zhǎng)PCR引物的基因序列
2)多重PCR 將0.5μL生成的所述長(zhǎng)PCR產(chǎn)物、1X AmpliTaq緩沖液、0.2mMdNTP、0.5pmol/μL的各引物和0.5單位的AmpliTaq Gold(AppliedBiosystemscat.No.N8080242)和去離子水混合制成10μL。使所述混合物在94℃進(jìn)行1次變性5分鐘，然后在94℃反應(yīng)45秒，在57℃45秒，在72℃反應(yīng)1分鐘并重復(fù)30個(gè)周期，然后在72℃再反應(yīng)1分鐘以便擴(kuò)增。第二PCR包括多重PCR。所述PCR產(chǎn)物擴(kuò)增為4組，如表40所示。引物的基因序列如表41所示。
[表40]多重PCR組
[表41]多重PCR引物(基因組PCR引物)的基因序列
3)ASPE(等位基因特異性引物延伸)反應(yīng) 將6μL生成的所述多重PCR產(chǎn)物、1X AmpliTaq緩沖液、10μM Cy5dUTP(GeneChem)、125nM的各ASPE引物、1單位AmpliTaq Gold(Applied Biosystemscat.No.N8080242)、lX Band Doctor(Solgent)和去離子水混合制成20μL。使所述混合物在94℃進(jìn)行1次變性5分鐘，然后在94℃反應(yīng)30秒，在60℃反應(yīng)1分鐘，在72℃反應(yīng)1分鐘，并重復(fù)30個(gè)周期來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增(參見(jiàn)圖45)。所述ASPE反應(yīng)組和ASPE引物的基因序列如表42和表43所示。
[表42]ASPE反應(yīng)組
[表43]ASPE引物的基因序列

4)PCR純化 將ASPE反應(yīng)生成的1～4組PCR產(chǎn)物合并，并用Qiagene純化試劑盒(Qiagenca.no.28106)根據(jù)制造商手冊(cè)進(jìn)行純化。最終流出體積為50μL。
使用快速真空濃縮機(jī)(4080C型，由BioTron制造)將純化后的PCR產(chǎn)物干燥為1～2μL。
5)芯片的預(yù)雜交 在42℃加熱預(yù)雜交緩沖液(25％甲酰胺、5X SSC、0.1％ SDS和10mg/mL BSA)。然后，將芯片浸入所述緩沖液中，并在42℃溫育30分鐘以上。然后將所述芯片用蒸餾水清洗3次，放入錐管中，并用離心分離機(jī)在800rpm下干燥5分鐘。
然后，在42℃預(yù)熱預(yù)雜交緩沖液(25％甲酰胺、5X SSC、0.1％ SDS、0.5mg/mL poly A、25μg/mL Cot-1DNA、10％葡聚糖硫酸酯)。將干燥后的樣品溶解在所述預(yù)雜交緩沖液中。將溶解樣品放入0.5mL PCR管中，在95℃加熱5分鐘。在雜交室內(nèi)放入一片3M紙，然后在其上滴加20μL3X SSC。將所述經(jīng)加熱的樣品加載到所述經(jīng)預(yù)雜交的芯片上，然后將所述芯片組裝到雜交室內(nèi)并在42℃雜交過(guò)夜。
然后用預(yù)熱到50℃的2X SSC的0.1％ SDS溶液將所述芯片清洗1次，歷時(shí)10分鐘，其后于室溫清洗4次每次1分鐘。將清洗過(guò)的芯片立即放入椎管中并用離心分離機(jī)在800rpm干燥5分鐘。
6)分析 用Axon制造的輸出波長(zhǎng)為約650nm的GenePix 4100B掃描儀掃描制備好的所述芯片。用GenePix Pro 6.0軟件分析掃描圖象的熒光信號(hào)強(qiáng)度。所述分析結(jié)果如圖46和表44中所示。
[表44]
結(jié)果，用所述基因芯片分析的CYP2D6基因的變異體和由測(cè)序分析的變異體相同。
<PXR> 示例性實(shí)施方式13確定高麗人PXR基因的基因型 <13-1>PXR基因的擴(kuò)增 從54個(gè)健康對(duì)象采集血液后，使用Qiagen公司制造的基因組DNA分離試劑盒從血液中分離出DNA。用ABI 3130XL基因分析儀分析了PXR基因的完整基因序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了到目前為止報(bào)道過(guò)的18種功能性變異體中的6種。所述PXR基因包含9個(gè)外顯子，且大約為38kb長(zhǎng)。以含功能性變異體的外顯子為中心，將所述PXR基因分為10個(gè)片段，以對(duì)所述片段進(jìn)行PCR。PCR所用引物如表45所示。在本說(shuō)明書中的基因序列中所寫的A、T、G和C是指腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶。
[表45]擴(kuò)增PXR基因的引物及其基因序列

所述引物的位置和PCR產(chǎn)物的大小如表46中所示。核苷酸的位置根據(jù)文獻(xiàn)[HUMAN MUTATION 111.3(1998)]的命名方法書寫。
[表46]引物的位置和PCR產(chǎn)物的大小
各PCR片段對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件如表47中所示。
[表47]PCR反應(yīng)條件 <13-2>PCR產(chǎn)物測(cè)序 用自動(dòng)DNA測(cè)序儀和含參照131～150的引物分析了示例性實(shí)施方式<13-1>產(chǎn)生的每個(gè)PCR產(chǎn)物的基因序列。
與野生型PXR基因(參照130)的基因序列比較后，共發(fā)現(xiàn)了22個(gè)SNP。其中，有6個(gè)SNP包含于目前為止已報(bào)道過(guò)的18種功能性變異體內(nèi)。表48中顯示了22個(gè)SNP，報(bào)道過(guò)的功能性變異體用#標(biāo)記。
[表48]發(fā)現(xiàn)于高麗人中的PXR基因變異體 如表48中所示，所述PXR基因的7種變異體發(fā)現(xiàn)于啟動(dòng)子中，而其余變異體發(fā)現(xiàn)于3’UTR和內(nèi)含子中。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)引起氨基酸替換的變異體。
示例性實(shí)施方式14確定PXR功能性變異體的單倍型 在示例性實(shí)施方式13中研究了PXR基因的6種功能性變異體的功能性，所述功能性變異體因其組合方式可能影響PXR基因的功能性。
因此，本發(fā)明人用DYNACOM公司的SNPAlyze軟件分析了示例性實(shí)施方式13中所發(fā)現(xiàn)的變異體的單倍型。結(jié)果，確認(rèn)了至少14種具有1％以上頻率的單倍型，如表49所示。
[表49]
□各SNP的變異體 示例性實(shí)施方式15htSNP的選擇和驗(yàn)證 有報(bào)道稱幾個(gè)單倍型，即所述PXR基因的SNP的組合，可能影響PXR基因的活性?？梢杂米钚?biāo)記檢查所生成單倍型的具體信息。所述最小標(biāo)記稱為htSNP，是準(zhǔn)確標(biāo)記單倍型所必需的，且包含數(shù)種組合。用SNPtagger軟件(http://www.well.ox.ac.uk/～xiayi/haplotype)對(duì)示例性實(shí)施方式14中選出的14個(gè)單倍型進(jìn)行測(cè)序以選擇所述htSNP組合，亦即最優(yōu)標(biāo)簽組。
結(jié)果，選中的htSNP組合如圖47中所示。所選htSNP組合是最優(yōu)標(biāo)簽組之一，其中“1”是指野生型，“2”是變異體而“V”是指所選htSNP。htSNP組合的選擇可以與圖47中的htSNP組合不同。
用Matlab軟件(7.1版，邁斯沃克軟件有限公司，美國(guó))分析發(fā)現(xiàn)的所述組合來(lái)確定相互不重合的二倍型和基因型。分析結(jié)果用于確定所述組合。
根據(jù)所述驗(yàn)證結(jié)果，二倍型和基因型不用相互重合就可得以確定。換言之，根據(jù)本發(fā)明選擇的htSNP組合互不相同，且確定基因型的所述分析是絕對(duì)正確的。
示例性實(shí)施方式16在PXR基因中快速搜索功能性變異體 在示例性實(shí)施方式13中發(fā)現(xiàn)的高麗人PXR基因的6種功能性變異體中，進(jìn)行SNaPshot分析來(lái)高速搜索影響所述PXR基因功能性的功能性變異體。使用對(duì)象的DNA作為模板進(jìn)行PCR，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SNaPshot分析。所述PCR所用的引物如表50所示。
[表50]
所述PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件如表51所示。
[表51]PCR反應(yīng)條件 等量混合所述4個(gè)經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。不與混合PCR產(chǎn)物反應(yīng)的剩余引物和dNTP可能影響SNaPshot分析。為了除去剩余引物和dNTP，將5μL PCR產(chǎn)物與2μL ExoSAP-IT(USB制造)混合，在37℃反應(yīng)30分鐘，然后在80℃再反應(yīng)15分鐘以使剩余的酶失活。使用所述經(jīng)酶處理的產(chǎn)物與表52中的引物進(jìn)行PCR來(lái)制成多重SNaPshot反應(yīng)物。所述多重SNaPshot反應(yīng)物和PCR反應(yīng)條件如表53和表54中所示。
[表52]引物及其基因序列 [表53]多重SNaPshot反應(yīng)物
[表54] 反應(yīng)完成后，將10μL SNaPshot產(chǎn)物和1μL SAP(USB)混合，在37℃反應(yīng)1小時(shí)，然后在65℃反應(yīng)15分鐘，從而除去[F]ddNTP。然后，將0.5μL反應(yīng)物、9.3μL Hi-Di甲酰胺(ABI)和0.2μL GeneScan-LIZ規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)物(ABI)在95℃混合5分鐘以使其變性。然后，用3130XL基因分析儀(ABI)分析所述混合物。分析結(jié)果如圖48～50所示。
如圖48～50所示，峰的顏色和位置隨所述PXR基因的功能性變異體的不同而不同，從而能方便地識(shí)別野生型、含雜合等位基因的變異體(雜合)和含純合等位基因的變異體(純合)。因此，本發(fā)明所述分析方法可以用于分析PXR基因中的功能性變異體，且節(jié)省成本和時(shí)間。
<UGT1A> 示例性實(shí)施方式17高麗人UGT1A基因中的遺傳變異體的選擇 步驟1)基因組DNA的分離 從50個(gè)高麗人采集血液后，使用基因組DNA分離試劑盒(Qiagen)從血液樣本中分離出DNA。
步驟2)UGT1A基因的擴(kuò)增和全長(zhǎng)測(cè)序 將步驟1中分離出的50個(gè)基因組DNA樣本用作模板。使用表55中的一對(duì)引物進(jìn)行PCR來(lái)擴(kuò)增所述UGT1A基因。擴(kuò)增的UGT1A基因的基因名稱和位置、所用引物名稱、引物的基因序列、引物的大小和PCR反應(yīng)條件如表55所示。
[表55]

步驟3)UGT1A基因的變異體的分析 用已知的3130X基因分析儀(Applied Biosystems)分析了步驟2中擴(kuò)增的所述UGT1A基因的全長(zhǎng)序列。將分析結(jié)果與野生型UGT1A基因(基因庫(kù)登錄號(hào)NT_005120)的基因序列進(jìn)行比較。結(jié)果如表56和表57中所示。
[表56]
[表57]

步驟17-1)UGT1A基因中功能性變異體的選擇 基于步驟3中發(fā)現(xiàn)于50個(gè)高麗人中的UGT1A基因的多態(tài)性來(lái)選擇據(jù)報(bào)道與提高或降低酶活性有關(guān)的變異體。所選變異體如表58所示。盡管UGT1A9基因中的G766A變異體在步驟3中沒(méi)有確定，但據(jù)報(bào)道該變異體為日本人中的功能性變異體。因此，表58中包括了G766A變異體?！敖囟痰鞍住笔侵钙浞g因突變體而暫停的蛋白。
[表58]
步驟17-2)UGT1A基因的與藥物敏感性相關(guān)的多態(tài)性的選擇 基于步驟3中發(fā)現(xiàn)于50個(gè)高麗人中的UGT1A基因的多態(tài)性選擇了已知參與抗結(jié)腸癌藥物依立替康的代謝的UGT1A1、UGT1A6和UGT1A9基因的多態(tài)性，如表59所示。盡管在步驟3中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)UGT1A9基因中的G766A變異體，但據(jù)報(bào)道該變異體是日本人的功能性變異體，因而將其添加到了表59中。
[表59]

示例性實(shí)施方式18對(duì)UGT1A基因中功能性變異體和與藥物敏感性相關(guān)的多態(tài)性的分析 18-1)UGT1A基因的功能性變異體的分析 對(duì)采自對(duì)象的血液進(jìn)行研究以分析其功能性變異體，所述對(duì)象含有UGT1A基因的野生型、含雜合等位基因的變異體和含純合等位基因的變異體。
用與示例性實(shí)施方式17中步驟1和步驟2相同的方法擴(kuò)增了UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9基因的基因序列。將5μL各UGT1A基因的PCR產(chǎn)物和2μL ExoSAP-IT(USB制造)混合并在37℃反應(yīng)30分鐘以除去剩余引物。然后，所產(chǎn)生的反應(yīng)物在80℃再反應(yīng)15分鐘以使剩余ExoSAP-IT失活。然后將2μL所述反應(yīng)物和1μL SNaPshot多重預(yù)反應(yīng)混合物(ABI)、4μL半終點(diǎn)緩沖液(組成200mM Tris HCl，5mM MgCl2，pH 9)和表60中的各SNaPshot引物混合以制備SNaPshot反應(yīng)溶液。此處，所述反應(yīng)物的總量為10μL。
[表60]

對(duì)每種反應(yīng)溶液在下述條件下進(jìn)行PCR 40個(gè)周期(在96℃反應(yīng)10秒，在50℃反應(yīng)5秒并在60℃反應(yīng)30秒)。反應(yīng)過(guò)后，將10μL反應(yīng)溶液與1μL SAP(蝦堿性磷酸酶)(USB)混合并在37℃反應(yīng)1小時(shí)然后在65℃反應(yīng)15分鐘。將0.5μL反應(yīng)溶液與0.2μL LIZ120(ABI)以及9.3μLHi-Di甲酰胺混合并置于96孔板。反應(yīng)樣品在95℃反應(yīng)2分鐘，然后由3130X基因分析儀(Applied Biosystems)分析。分析結(jié)果如圖51～54所示。
如圖51～54所示，峰的顏色和位置隨各UGT1A基因的功能性變異體的不同而不同，從而能方便地鑒定野生型、含雜合等位基因的變異體(雜合)和含純合等位基因的變異體(純合)。證實(shí)了峰的大小和類型與表55中由示例性實(shí)施方式17中測(cè)序所得的結(jié)果100％相同。因此，本發(fā)明所述分析方法可以用于分析UGT1A基因中的功能性變異體，且節(jié)省成本和時(shí)間。
由于UGT1A1基因的-39insTA基因型與SNP不對(duì)應(yīng)，因此無(wú)法對(duì)該基因型進(jìn)行SNaPshot分析。所述-39insTA基因型的變異體由PCR-焦磷酸測(cè)序確定。用于所述分析的引物的基因序列如表61中所示。引物UGT1A1*28F在5’端連接了生物素(biotin)(參見(jiàn)參照202)。用于焦磷酸測(cè)序的引物參見(jiàn)文獻(xiàn)[ClinChem.，Jul；49(7)1182-1185，2003]。
更具體而言，將以含參照202和203的引物生成的PCR產(chǎn)物用作模板。使參照204測(cè)序用引物反應(yīng)，從而用焦磷酸測(cè)序儀確定變異體的存在。
將所生成的PCR產(chǎn)物與37μL pH 7.6的結(jié)合緩沖液(組成10mMTris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA和0.1％ Tween20)和3μL高效鏈霉親和素瓊脂糖(Streptavidin SepharoseTM High Performance，AmershamBioscience)混合。然后，將所述混合物置于96孔板，在室溫和14，000rpm反應(yīng)5分鐘。將0.3μL含參照204的引物(100pmol)與100μLpH 7.6的1X退火緩沖液(組成20mM三羥甲基氨基甲烷乙酸鹽和2mMMgAc2)混合并置于96孔板。用真空Prep Tool處理所述反應(yīng)樣品，在90℃加熱3分鐘然后冷卻到室溫。將Pyro Gold試劑盒(Biotage)提供的酶混合物、底物混合物、dATP、dCTP、dGTP和dTTP加入冷卻的板中以通過(guò)焦磷酸測(cè)序儀確定變異體。
[表61]
18-2)UGT1A基因中功能性變異體的分析 分析了UGT1A基因的與對(duì)依立替康的敏感性相關(guān)的多態(tài)性，除了使用表62中的引物代替表60中的引物以外，所用方法與18-1)中所述的SNaPshot分析相同。分析結(jié)果如圖55所示。在表62中的引物的5’端加入了長(zhǎng)度不同的T重復(fù)基因序列以改變所述引物的長(zhǎng)度。
[表62]
結(jié)果，很容易地同時(shí)鑒定出UGT1A基因的與對(duì)依立替康的敏感性相關(guān)的數(shù)個(gè)SNP。證實(shí)了峰的大小和類型與示例性實(shí)施例17中通過(guò)測(cè)序得到的表55中的結(jié)果100％相同。
工業(yè)實(shí)用性 如上所述，本發(fā)明的CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的功能性變異體或與藥物敏感性相關(guān)的多態(tài)性的分析方法可以用于確定CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的功能性變異體或UGT1A基因的與藥物敏感性相關(guān)的多態(tài)性，所述方法使用基于之前尚未確定的高麗人CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的多態(tài)性的最優(yōu)搜索組合。本發(fā)明可以應(yīng)用于確定諸如與高麗人有相似遺傳學(xué)特性的日本人和中國(guó)人以及高麗人等亞洲人的CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的基因型。
盡管本文已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的一些示例性實(shí)施方式進(jìn)行了展示和說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，可以在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的情況下對(duì)所述示例性實(shí)施方式進(jìn)行變化，本發(fā)明的范圍已在所附權(quán)利要求和等同物中進(jìn)行了限定。
權(quán)利要求
1.選擇人類CYP1A2基因的單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法包括
(a)從對(duì)象中收集生物樣本；
(b)從操作(a)所收集的所述樣本里提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因或其片段；
(d)對(duì)操作(c)中所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并確定變異體的存在；和
(e)根據(jù)操作(d)中已確定具有變異體的所述PCR產(chǎn)物的基因序列預(yù)測(cè)單倍型并用SNPtagger軟件對(duì)所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物選自含參照2～31的引物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，操作(d)中的所述變異體選自單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因刪除和基因重復(fù)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，操作(d)中的所述測(cè)序包括通過(guò)自動(dòng)測(cè)序或焦磷酸測(cè)序進(jìn)行測(cè)序。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述操作(d)通過(guò)對(duì)比所述PCR產(chǎn)物的基因序列和野生型CYP1A2基因的基因序列來(lái)進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括重復(fù)所述操作(a)～(d)。
8.確定人類CYP1A2基因的單倍型的方法，所述方法包括
(a)從對(duì)象中收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取基因組DNA；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述基因組DNA作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因或其片段；和
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP1A2基因中至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體選自-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2847T>C、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-1708T>C、-739T>G、-163C>A、1514G>A、2159G>A、2321G>C、3613T>C、5347C>T和5521A>G。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物選自含參照2～31、62和63的引物。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定SNP(單核苷酸多態(tài)性)-3860G>A、-3598G>T、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G的存在。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定單核苷酸多態(tài)性-3860G>A、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-739T>G、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G的存在。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定單核苷酸多態(tài)性-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G的存在。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定單核苷酸多態(tài)性-3860G>A、-3598G>T、2321G>C、-3113G>A、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-163C>A、1514G>A、2159G>A、5347C>T和5521A>G的存在。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，操作(d)中對(duì)所述變異體的存在的確定包括用SNaPshot分析確定所述變異體的存在。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述SNaPshot分析用選自含參照64～74的引物中的引物進(jìn)行。
16.檢測(cè)CYP1A2啟動(dòng)子基因中的變異體的方法，所述方法包括
(a)從對(duì)象中收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取基因組DNA；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述基因組DNA作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP1A2基因的啟動(dòng)子區(qū)域；和
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP1A2基因中單核苷酸多態(tài)性的存在，所述單核苷酸多態(tài)性包括-3860G>A、-3598G>T、-3594T>G、-3113G>A、-2847T>C、-2808A>C、-2603insA、-2467delT、-1708T>C、-739T>G和-163C>A。
17.如權(quán)利要求8或16所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，操作(b)中的所述引物包含參照62和63。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，在操作(d)中對(duì)所述變異體的存在的確定包括用SNaPshot分析確定所述變異體的存在。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述SNaPshot分析用選自含參照64～74的引物中的引物進(jìn)行。
21.選擇人類CYP2A6基因中的單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法包括
(a)從對(duì)象中收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2A6基因或其片段；
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定變異體的存在；
(e)由在操作(d)中已確定具有所述變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列確定單倍型；和
(f)用SNPtagger軟件對(duì)操作(e)中所確定的所述單倍型進(jìn)行測(cè)序并選擇單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物選自含參照76～89的引物。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，操作(d)中的所述變異體選自單核苷酸多態(tài)性、基因刪除和基因重復(fù)。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，操作(d)中對(duì)所述變異體的存在的確定包括對(duì)比所述PCR產(chǎn)物的基因序列和野生型CYP2A6基因的基因序列。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，所述方法還包括重復(fù)操作(a)～(d)。
27.確定人類CYP2A6基因的基因型的方法，所述方法包括
(a)從對(duì)象中收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2A6基因或其片段；和
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定CYP2A6基因中的變異體的存在，所述變異體包括-48T>G；13G>A；567C>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6582G>T；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
28.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物選自含參照90、91、102和103的引物。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括-48T>G；13G>A；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6582G>T；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括-48T>G；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；3391T>C；6354T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括-48T>G；13G>A；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括-48T>G；13G>A；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
35.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括-48T>G；22C>T；51G>A；567C>T；1620T>C；1836G>T；2134A>G；3391T>C；6458A>T；6558T>C；6600G>T；和選自6091C>T、5971G>A和5983T>G中的一種。
36.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，操作(d)中對(duì)所述變異體的存在的確定包括用SNaPshot分析確定所述變異體的存在。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述SNaPshot分析用選自含參照92～101的引物中的引物進(jìn)行。
38.選擇人類CYP2D6基因的單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法包括
(a)從人類收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2D6基因或其片段；
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定變異體的存在；
(e)由在操作(d)中已確定具有所述變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列確定單倍型；和
(f)用SNPtagger軟件對(duì)操作(e)中所確定的所述單倍型進(jìn)行測(cè)序并選擇單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物包含選自參照106、107、121～127、129～136、138、139、149和150的基因序列。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，操作(d)中的所述變異體選自單核苷酸多態(tài)性、基因刪除和基因重復(fù)。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，操作(d)中對(duì)所述變異體的存在的確定包括用測(cè)序、電泳分析和RFLP分析中的一種來(lái)確定所述變異體的存在。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，所述方法還包括重復(fù)操作(a)～(d)。
44.確定人類CYP2D6基因的基因型的方法，所述方法包括
(a)從人類收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類CYP2D6基因或其片段；和
(d)確定CYP2A6基因中至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物包含選自參照106、107、121～127、129～136、138、139、149和150中的基因序列。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
48.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1584C>G；-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1611T>A；1758G>A；2573insC；-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A>C、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1584C>G；-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；1611T>A；1758G>A；1887insTA；2573insC；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
50.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1584C>G；-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1611T>A；1758G>A；2573insC；-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；4125-4133insGTGCCCACT；-1235A>G；1887insTA；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
51.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；選自1611T>A；1661G>C和4180G>C中的一種；1758G>A；1887insTA；2573insC；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；-1235A>G；1887insTA；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
52.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1584C>G；-1426C>T、100C>T和1039C>T中的一種；選自1611T>A；1758G>A；2573insC；-740C>T、-678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G和2850C>T中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A>G、3877G>A、4388C>T和4401C>T中的一種；1887insTA；2988G>A；4125-4133insGTGCCCACT；2D6刪除；和2D6重復(fù)。
53.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，操作(d)中對(duì)所述變異體的存在的確定包括用SNaPshot分析確定所述變異體的存在。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述SNaPshot分析用引物進(jìn)行，所述引物具有緊接單核苷酸多態(tài)性的堿基作為3’端，具有在與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)相鄰處退火的基因序列，并具有添加到5’端的T堿基。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述引物包含選自參照141～148、152和153中的基因序列。
56.用基因芯片確定人類CYP2D6基因的方法，所述方法包括
(a)提取待研究的基因并進(jìn)行多重PCR以獲得具有待鑒定的單核苷酸多態(tài)性邊界的PCR產(chǎn)物；
(b)對(duì)ASPE(等位基因特異性引物延伸)引物進(jìn)行ASPE反應(yīng)以鑒定每個(gè)等位基因的特異性堿基；
(c)將反應(yīng)物與所述基因芯片相混合；和
(d)分析所述芯片。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述基因芯片包含具有參照158～184的基因序列的探針。
58.CYP2D6基因分型試劑盒，所述試劑盒具有用于單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的Zip編碼寡核苷酸芯片。
59.選擇人類PXR基因中功能性變異體的單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法包括
(a)從人類收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類PXR基因或其片段；
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定變異體的存在；
(e)由在操作(d)中已確定具有所述變異體的PCR產(chǎn)物的基因序列確定單倍型；和
(f)用SNPtagger軟件對(duì)操作(e)中所確定的所述單倍型進(jìn)行測(cè)序并選擇單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物選自含參照221～240的引物。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，操作(d)中的所述變異體選自單核苷酸多態(tài)性、基因刪除和基因重復(fù)。
63.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述操作(d)通過(guò)對(duì)比所述PCR產(chǎn)物的基因序列和野生型PXR基因的基因序列來(lái)進(jìn)行。
64.如權(quán)利要求59所述的方法，所述方法還包括重復(fù)所述操作(a)～(d)。
65.確定PXR基因中的功能性變異體的方法，所述方法包括
(a)從人類收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)用引物進(jìn)行PCR，該反應(yīng)使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來(lái)擴(kuò)增人類PXR基因或其片段；和
(d)在操作(c)中所得的PCR產(chǎn)物的基因序列中確定PXR基因中功能性變異體的存在，所述變異體選自-25385C>T、-24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C和11193T>C。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，其中，操作(c)中所述的引物選自含參照221、222、225、226、235和239～241的引物。
68.如權(quán)利要求65所述的方法，其中，操作(d)中對(duì)所述功能性變異體的存在的確定包括用SNaPshot分析確定所述功能性變異體的存在。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述SNaPshot分析用選自含參照242～247的引物中的引物進(jìn)行。
70.確定UGT1A基因中的功能性變異體的方法，所述方法包括
(a)從人類收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)使用操作(b)中所提取的所述核酸擴(kuò)增人類UGT1A基因；和
(d)對(duì)在操作(c)中擴(kuò)增的所述人類UGT1A基因進(jìn)行測(cè)序并確定UGT1A基因中功能性變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的-39(TA)6>(TA)7、211G>A，233C>T和686C>A；UGT1A3基因中的31T>C、133C>T和140T>C；UGT1A4基因中的31C>T、142T>G和292C>T；UGT1A6基因中的19T>G、541A>G和552A>C；UGT1A7基因中的387T>G、391C>A、392G<A、622T>C和701T>C；和UGT1A9基因中的-118T9>T10、726T>G和766G>A。
71.確定UGT1A基因的與對(duì)依立替康的敏感性相關(guān)的多態(tài)性的方法，所述方法包括
(a)從人類收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；
(c)使用操作(b)中所提取的所述核酸擴(kuò)增人類UGT1A基因；和
(d)對(duì)在操作(c)中擴(kuò)增的所述人類UGT1A基因進(jìn)行測(cè)序并確定UGT1A基因中變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的211G>A、233C>T和686C>A；UGT1A6基因中的19T>G、541A>G和552A>C；和UGT1A9基因中的-118T9>T10、726T>G和766G>A。
72.如權(quán)利要求70或71所述的方法，其中，操作(a)中的所述人類包括高麗人。
73.如權(quán)利要求70或71所述的方法，其中，操作(a)中的所述生物樣本選自血液、皮膚細(xì)胞、粘液細(xì)胞和毛發(fā)。
74.如權(quán)利要求70或71所述的方法，其中，所述核酸包括DNA或RNA。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述核酸包括基因組DNA。
76.如權(quán)利要求70所述的方法，其中，操作(c)中的所述UGT1A基因選自UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9基因。
77.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，操作(c)中的所述UGT1A基因選自UGT1A1、UGT1A6和UGT1A9基因。
78.如權(quán)利要求70或71所述的方法，其中，操作(d)中的所述測(cè)序通過(guò)SNaPshot、電泳、焦磷酸測(cè)序或上述方法的組合進(jìn)行。
79.如權(quán)利要求70所述的方法，其中，操作(d)中的所述測(cè)序通過(guò)使用含參照295～314的引物的SNaPshot分析或者使用含參照292～294的引物的焦磷酸測(cè)序進(jìn)行。
80.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，操作(d)中的所述測(cè)序通過(guò)使用含參照315～322的引物的SNaPshot分析進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于確定細(xì)胞色素P450 1A2(CYP1A2)、2A6(CYP2A6)和2D6(CYP2D6)、PXR和UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A(UGT1A)基因的基因型的單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(htSNP)和使用所述htSNP的基因芯片，更具體而言，涉及用于確定人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGT1A基因的單倍型的htSNP的選擇方法、使用所述htSNP確定所述基因的基因型的方法和用于所述方法的基因芯片。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101522911SQ200780033677
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月11日
發(fā)明者申載國(guó), 張仁珍, 李相燮, 鄭惠恩, 車仁浚, 金佑永, 芮晟洙, 金垠泳, 車恩暎, 孫知弘, 崔銀貞, 金江美, 鄭玄朱 申請(qǐng)人:Inje大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)