專利名稱：：用于在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸的制作方法用于在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核普酸的核酸發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及癌癥治療領(lǐng)域。發(fā)明背景治療癌癥的方法逐年極大改善。改良的it斷方法與更好的外科技術(shù)相結(jié)合使得外科醫(yī)生能夠通過(guò)去除最低限量的正常組織而更安全地去除腫瘤?；颊叩幕謴?fù)時(shí)間縮短，并且因整容創(chuàng)傷所導(dǎo)致的心理影響降低。然而，盡管外科手術(shù)對(duì)于治療患有局限性腫瘤或者僅具有最低程度擴(kuò)散至例如局部淋巴結(jié)的患者是有用的，但對(duì)于患有轉(zhuǎn)移性疾病或者全身性癌癥如白血病或淋巴瘤的患者的效用有限。在美國(guó)，每年約有15，300人(男女比例為2:1)被診斷患有原發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌在北美和歐洲相對(duì)罕見(jiàn)。據(jù)估計(jì)在美國(guó)發(fā)病率為每100,000人3例。然而，其在全球范圍仍構(gòu)成一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題。在流行區(qū)域，如非洲和亞洲，其發(fā)病率為每100,000人30例至超過(guò)每100,000人100例(AmericanCancerSociety,CancerFactsandFigures,1994，Atlanta,Ga.:AmericanCancerSocietyInc.)。在美國(guó)，雖然原發(fā)性肝癌在癌癥的發(fā)病率排位中為低排位，但是被嚴(yán)格關(guān)注，因?yàn)槠漕A(yù)后差，病例死亡率為0.8(每年罹患原發(fā)性肝癌的15，300名美國(guó)患者當(dāng)中有約13，800名死亡)。在過(guò)去數(shù)十年里，對(duì)癌癥分子機(jī)制的理解有了飛快地a。挑戰(zhàn)是將對(duì)癌癥分子基礎(chǔ)的理解轉(zhuǎn)變成對(duì)癌癥治療的改進(jìn)?，F(xiàn)在普遍公認(rèn)的觀點(diǎn)是，腫瘤在人體中的發(fā)展是一個(gè)多步驟過(guò)程。這些步驟對(duì)應(yīng)于特異的基因改變，這種改變驅(qū)動(dòng)了正常人細(xì)胞向高度惡性的衍生物的進(jìn)行性轉(zhuǎn)化，該衍生物的特征為細(xì)胞增殖增加，細(xì)胞死亡減少、基因組不穩(wěn)定和持續(xù)性血管發(fā)生(HanahanD.，WeinbergR.A.2000;Cell100:57-70)。這些新的認(rèn)識(shí)提示了新的治療方法，即特異性地靶向在腫瘤細(xì)胞中被改變的分子相互作用和生物化學(xué)途徑。藥物遞送系統(tǒng)通常涉及經(jīng)設(shè)計(jì)能使藥物緩慢釋放入大解剖學(xué)區(qū)室，如胃腸道、泌尿生殖道或者血液循環(huán)中的裝置或運(yùn)載體。例如，可設(shè)計(jì)脂質(zhì)體以便將藥物釋放入血液循環(huán)。此類系統(tǒng)存在的問(wèn)題是無(wú)法將它們?cè)O(shè)計(jì)成特異性地向紳瘤細(xì)胞遞送藥物的形式(Schally&Nagy，EuropJEndoctinol1999;141:1)。藥物被無(wú)差別地遞送至正常細(xì)胞和肺瘤細(xì)胞。因此，必須使用大得多的藥物劑量。由于抗癌藥物具有毒性，z使用較大的藥物劑量導(dǎo)致出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床問(wèn)題。經(jīng)常是癌癥患者遭受的這些療法的副作用幾乎同癌癥效果一^f"多。雖然如此，癌癥治療的主要趨勢(shì)仍然是^L用更多的藥物。藥物毒性問(wèn)題可以通過(guò)開發(fā)能夠?qū)⒖拱┧幬飪H僅遞送至癌細(xì)胞而不遞送至正常細(xì)胞的藥物遞送系統(tǒng)而解決。該問(wèn)題的一種解決方法是使用識(shí)別癌細(xì)胞特異抗原并與之相互作用的藥物負(fù)載抗體。存在許多此類抗原，其中一些已經(jīng)用于癌癥治療范例中。例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗原存在于癌細(xì)胞表面，而在大多數(shù)正常細(xì)胞表面不存在(Whitney等，Cancer1995;76:20)。已將抗癌藥物偶聯(lián)至抗轉(zhuǎn)4失蛋白受體抗體，并因此被遞送至腦癌患者(Laske等，Neurosurg1997;41:1039)。使用同位素標(biāo)記抗體的相似策略也已經(jīng)在淋巴瘤患者中應(yīng)用(Vose等，Leukemia&Lymphoma2000;38:91)。這種抗體介導(dǎo)的藥物遞送方法也存在若干嚴(yán)重問(wèn)題。在基因修飾動(dòng)物中的產(chǎn)生抗體在患者中會(huì)造成非希望的反應(yīng)(Muraszko等，CancerRes1983;53:3752)。解決抗癌治療中藥物遞送的一個(gè)較安全的方法是使用癌細(xì)胞上受體的正常配體設(shè)計(jì)藥物運(yùn)載體。配體是獨(dú)特地與特異受體匹配的分子，類似于一把鑰匙獨(dú)特地與一把特定的鎖匹配。該方法的必要條件是受體要存在于僅癌細(xì)胞的表面。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體就是一例，其結(jié)合參與血液中鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)配體。該蛋白質(zhì)配體已經(jīng)被修飾以攜帶抗癌藥物，并且這種配體-受體藥物遞送系統(tǒng)在治療急性白血病中的有效性已經(jīng)得以證明(Faulk等，7MolBiotherapy19卯；2:57)。攜帶藥物的配體還能夠通過(guò)不同類型的化學(xué)鍵(Kratz等，JPharmSci1998;87:338)運(yùn)栽幾種不同類型的抗癌藥物(Berczi等，ArchBiochemBiophy1993;300:356，和Beyer等，JMedChem1998;41:2701)。然而，這種可能性限于參與重金屬如鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)配體。依賴于腫瘤細(xì)胞選擇性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的抗癌治療策略也處于研究當(dāng)中(BinleyK.等，(1999)GeneTherapy6:1721-1727;HeiseC.等，(1997)NatureMedicine3:639-645;和ParrM.J.等，(1997)NatureMedicine3:1145-1149)?？捎脭?shù)個(gè)方法將轉(zhuǎn)基因體內(nèi)遞送進(jìn)入腫瘤，其中有基于腺病毒的載體和基于慢病毒的載體(BenihoudK.等，(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:440-447)。因此，對(duì)于針對(duì)癌癥、特別是肝癌的腫瘤細(xì)胞靶向療法，需要備選系統(tǒng)或者改良系統(tǒng)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的新的核酸。更加具體而言，本發(fā)明涉及上面所定義的核酸，其包含至少一個(gè)待特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)的目的多核苷酸，該目的多核苷酸被置于能驅(qū)動(dòng)其特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)的所謂癌細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)多核苷酸的控制下。根據(jù)本發(fā)明，所述調(diào)節(jié)多核苷酸選自多種選擇的、衍生自編碼人AFP、大鼠AFP、人HIP/PAPI和大鼠PAPI蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域的、多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，置于所述癌細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)序列控制下的所述目的多核苷酸可以編碼對(duì)抗癌有用的任何分子，包括核酸如RNA分子和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括包含用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的所述新核酸的載體，以及已凈皮此類栽體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含作為活性成分的所述新核酸或所述載體的藥物組8合物。附圖簡(jiǎn)述圖1描述栽體pShuttle-rAFPwt-rNIS圖2描述載體pShuttle-hAFPt-rNIS圖3描述載體pShuttle-hHIP/PAP-rNIS圖4描述載體pShuttle誦rHIP/PAP-rNIS圖5圖示NIS在大鼠HIP/PAP調(diào)節(jié)序列控制下在腫瘤性肝細(xì)胞中的功能性表達(dá)。在不同感染復(fù)數(shù)(MOI)下用AdrHIPrNIS感染的HepG2細(xì)胞的體外1231攝取。NI:未感染的；DL324:MOI:10下的空載體;3;MOI:IO和100下的AdCMVrNIS;MOI:25，50，75;及100個(gè)感染性顆粒下的AdrHIPrNIS。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次不同實(shí)驗(yàn)的平均值。-NaC104:沒(méi)有用高氯酸鈉抑制。+NaC104:用高氯酸鈉抑制后。圖6圖示在細(xì)胞與白介素6和/或地塞米松孵育后，刺激在大鼠人HIP/PAP調(diào)節(jié)序列控制下的NIS在腫瘤性肝細(xì)胞中的表達(dá)。比較在不同刺激條件下MOI:100下AdrHIPNIS所感染的HepG2細(xì)胞與AdCMVrNIS所感染的細(xì)胞對(duì)1231的攝取。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次不同實(shí)驗(yàn)的平均值。-NaC104:沒(méi)有用高氯酸鈉抑制。+NaC104:用高氯酸鈉抑制后。圖7圖示患有肝臟腫瘤并且施用過(guò)包含與大鼠HIP/PAP調(diào)節(jié)序列有效連接的NIS序列的DNA構(gòu)建體的大鼠的"TcSPECT/CT成像。AdrHIPNIS所感染的DEN大鼠的"TcSPECT/CT成像。肝臟中的強(qiáng)反差表明NIS在所轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤結(jié)節(jié)中高水平表達(dá)。圖8圖示NIS在不同的AFP衍生調(diào)節(jié)序列控制下的功能性表達(dá)。以不同感染復(fù)數(shù)用AdhAFPt-rNIS和AdrAFPwt-rNIS所感染的HepG2細(xì)胞的體外'23l攝取。-NaC104:沒(méi)有用高氯酸鈉抑制。+NaC104:用高氯酸鈉抑制后。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次不同實(shí)驗(yàn)的平均值。發(fā)明詳述本發(fā)明提供驅(qū)動(dòng)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)的新的調(diào)節(jié)性多核苷酸。因此，本發(fā)明提供用于更有效治療的新治療工具，該新治療工具特異性地靶向癌細(xì)胞以主要或者甚至僅僅地在靼位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)期望的生物學(xué)效果。同時(shí)，新近設(shè)計(jì)的該癌細(xì)胞靶向性治療工具可以導(dǎo)致對(duì)身體中的非癌性細(xì)胞或器官的副作用降低或者甚至沒(méi)有。令人驚訝地，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，衍生自人和大鼠AFP以及人和大鼠HIP/PAPI蛋白質(zhì)的編碼基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域的一族調(diào)節(jié)序列具有指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)的能力。此外，由于本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列具有高轉(zhuǎn)錄活性，因此可以實(shí)現(xiàn)與之有效連接的所述目的多核苷酸的強(qiáng)表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)構(gòu)建了將(i)待于癌細(xì)胞中表達(dá)的目的多核苷酸，即碘化鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)體NIS與(ii)來(lái)源于不同物種的幾種不同的AFP、HIP/PAP調(diào)節(jié)序列相組合的病毒載體。已經(jīng)利用幾種方法在一系列人和鼠的肝臟和非肝臟正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中評(píng)價(jià)過(guò)在用這些載體體外和體內(nèi)感染后NIS蛋白質(zhì)的表達(dá)和亞細(xì)胞定位以及NIS的功能，所述方法為基于純化的膜蛋白提取物的免疫印跡；免疫熒光；免疫組織化學(xué)；放射性碘攝取和排出測(cè)定試驗(yàn)；使用連續(xù)閃爍掃描以及SPECT/CT成像的動(dòng)力學(xué)研究。在Wistar大鼠的化學(xué)誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌(HCC)模型中開展了體內(nèi)研究。在施用致癌物二乙基亞硝胺(DEN)2個(gè)月之后，建立侵襲性極強(qiáng)的多結(jié)節(jié)性HCC。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)，對(duì)于全部所研究的栽體而言，所誘導(dǎo)的NIS表ii^式在體內(nèi)嚴(yán)格限制于肝臟胂瘤。NIS在所轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的質(zhì)膜上強(qiáng)表達(dá)，并且使得放射性碘攝取的水平與使用重組腺病毒(AdCMV-NIS)所觀察到的方文射性不典才聶取水平相當(dāng)，或者甚至更高，在所述AdCMV-NIS中NIS處于遍在的強(qiáng)巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制下。在感染的原代肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的非肝細(xì)胞系中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NIS表達(dá)。對(duì)于所研究的三種施用途徑(門靜脈、肝動(dòng)脈、瘤內(nèi))，體內(nèi)NIS轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。肝動(dòng)脈途徑比門靜脈途徑更有效，因?yàn)楦文[瘤的血管形成大部分通過(guò)肝動(dòng)脈分支發(fā)生。瘤內(nèi)和肝動(dòng)脈途徑導(dǎo)致有利于腫瘤區(qū)域的明顯NIS表達(dá)差異。大約30%注射的放射性碘集中于肝臟腫瘤中，其硪生物半衰期為2.5天。注射18mCi的^I破壞了所照射的轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤結(jié)節(jié)，而未注射的結(jié)節(jié)繼續(xù)生長(zhǎng)。此外，本發(fā)明人還使用本文所描述的HIP/PAPI調(diào)節(jié)序列將目的蛋白質(zhì)、特別是NIS蛋白質(zhì)靶向衍生自各種癌性器官、包括人癌性結(jié)腸和人癌性胰臟的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。在這些轉(zhuǎn)染的癌性細(xì)胞系中，誘導(dǎo)了NIS在質(zhì)膜上的強(qiáng)表達(dá)，并且因此這些細(xì)胞顯示出高水平的碘4聶取?？傊?，本發(fā)明證實(shí)，作為本申請(qǐng)發(fā)明目的的、包含人或大鼠AFP衍生調(diào)節(jié)序列或包含人或大鼠HIP/PAPI衍生調(diào)節(jié)序列的新NIS重組構(gòu)建體，能夠事實(shí)上誘導(dǎo)功能性NIS在腫瘤性肝細(xì)胞、腫瘤性結(jié)腸細(xì)胞和腫瘤性胰腺細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶向表達(dá)，并且這種表達(dá)和攝取活性是強(qiáng)的，即與遍在CMV啟動(dòng)子所誘導(dǎo)的可比或者甚至更強(qiáng)。叔坊做虔本發(fā)明提供特異性地在癌細(xì)胞中發(fā)揮功能的新的調(diào)節(jié)性多核苷酸，以下為對(duì)其的一般描述和詳細(xì)描述。這些新調(diào)節(jié)性多核苷酸在此用于特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)各種目的多核苷酸。如本文所預(yù)期的那樣，目的多核苷酸尤其可以編碼具有抗腫瘤效果的核酸或蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸，所述核酸包含(a)驅(qū)動(dòng)所述目的多核苷酸在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)性多核苷酸，其選自下列的調(diào)節(jié)性多核苷酸(i)調(diào)節(jié)性多核苷酸，從5，端至3，端包含-與選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第一核酸；和畫與核酸SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸；ii-所述第一和第二核酸彼此直接連接，或-所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸[具有1至3000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度彼此間接連接。(ii)與SEQIDNO:4中起始于第2200位核苷酸并終止于第2432位核苷酸的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；(iii)與SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；和(iv)調(diào)節(jié)性多核苷酸，從5，端至3，端包含畫與選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少90。/。核苷酸同一性的第一核酸；和-與SEQIDNO:8的核酸具有至少90。/。核普酸同一性的第二核酸；畫所述第一和第二核酸彼此直接連接，或-所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸[具有1至2000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度]彼此間接連接，和(b)所述目的多核苷酸。如本文所預(yù)期的那樣，所定義的與參考多核苷酸具有至少90%核苷酸同一性的多核苷酸，將與所述參考多核苷酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的核苷酸同一性。如本文所使用，"序列同一性百分?jǐn)?shù)，，通過(guò)在比較窗口中比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來(lái)確定，其中與參考序列(其不包含插入或者缺失)相比，多核苷酸或氨基酸序列在比較窗口中的片段可以包含插入或缺失(例如缺口或懸突)，以<吏于兩個(gè)序列最佳比對(duì)。百分?jǐn)?shù)如下計(jì)算(i)確定在兩個(gè)序列中存在相同核酸堿基或者氨基酸殘基的位置的數(shù)量，得到匹配位置數(shù)，(ii)將匹配位置數(shù)除以比較窗口中的總位置數(shù)，和(iii)將結(jié)果乘以100得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。用于比較的最佳序列比對(duì)可以通過(guò)如下方式進(jìn)行Smith和Waterman的局部同源性算法(Add.Apl.Math.2:482(1981))、Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))、12Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988))、這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDr.，Madison,Wis.)、或目檢。在已經(jīng)確定兩個(gè)序列用于比較時(shí)，優(yōu)選采用GAP和BESTFIT確定它們的最佳比對(duì)。有代表性地，使用缺口加4又默認(rèn)值5.00和缺口長(zhǎng)度加權(quán)默認(rèn)值0,30。為了最佳比較，可以使用CLUSTALW(版本1.82)在下列參數(shù)下得到兩個(gè)核酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)(1)CPUMODE=CIustalWmp;(2)ALIGNMENT=全長(zhǎng)》;(3)OUTPUTFORMAT=alnw/個(gè)數(shù)》；(4)OUTPUTORDER=比對(duì)的》;(5)COLORALIGNMENT=無(wú)》;(6)KTUP(字長(zhǎng))=默認(rèn)》;(7)WINDOWLENGTH=默認(rèn)》;(8)SCORETYPE=《百分?jǐn)?shù)》;(9)TOPDIAG=默認(rèn)》;(10)PAIRGAP=默認(rèn)》;(11)PHYLOGENETICTREE/TREETYPE=無(wú)》;(12)MATRIX=默認(rèn)》;(13)GAPOPEN=默認(rèn)》;(14)ENDGAPS=默認(rèn)》;(15)GAPEXTENSION=默認(rèn)》;(16)GAPDISTANCES=默認(rèn)》；(17)TREETYPE=cladogram以及(18)TREEGRAPDISTANCES=隱藏》。本文包括作為調(diào)節(jié)性多核苷酸的下述任何多核苷酸，其與上述參考調(diào)節(jié)性多核苷酸具有至少卯％的核酸同一性并且能夠驅(qū)動(dòng)目的多核苷酸特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞、包括人癌細(xì)胞中表達(dá)。在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中，例如在上面所定義的核酸中，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸(a)有效連接至所述目的多核苷酸。如本文所使用，"有效連接"意味著這樣一種連接，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸與所述目的多核苷酸以目的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄處于所述調(diào)節(jié)性多核苷酸的影響或控制下的方式連接。對(duì)于兩個(gè)DNA序列(例如待轉(zhuǎn)錄的目的多核苷酸和連接至待轉(zhuǎn)錄目的多核苷酸5'端的調(diào)節(jié)性多核苷酸)而言，如果對(duì)調(diào)節(jié)性多核苷酸功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼目的多核苷酸的mRNA轉(zhuǎn)錄，以及如果兩個(gè)DNA序列之間的連接性質(zhì)不(1)引入移碼突變、(2)干擾調(diào)節(jié)性多核苷酸指導(dǎo)蛋白質(zhì)、反義RNA或核酶表達(dá)的能力、或者(3)干擾DNA模板轉(zhuǎn)錄的能力，則這兩個(gè)DNA序列稱作彼此有效連接。因此，當(dāng)調(diào)節(jié)性多核苷酸有效連接至目的多核苷酸序列時(shí)，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸能夠?qū)崿F(xiàn)目的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。在上面所定義的本發(fā)明核酸中，有效連接至目的多核苷酸的調(diào)節(jié)性多核苷酸具有指導(dǎo)所述目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力。上述調(diào)節(jié)性多核苷酸的特異性活性并不排除在正常的非癌細(xì)胞中也可能存在所述目的多核普酸的低水平表達(dá)。然而，本文描述的調(diào)節(jié)性多核苷酸指導(dǎo)所述目的多核苷酸高度優(yōu)先地(包括排他性地)在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。"高度優(yōu)先，，意味著所述目的多核苷酸在癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平與正常的非癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平相比增加至少3倍、優(yōu)選5倍、更優(yōu)選至少10倍、仍更加優(yōu)選至少20倍、50倍或100倍。如本文所使用，癌細(xì)胞指具有致癌細(xì)胞的典型特征的細(xì)胞，所述典型特征例如不受控增殖、永生化、轉(zhuǎn)移潛能、快速的生長(zhǎng)和增殖速度以及某些特異性形態(tài)特征。癌細(xì)胞通常為腫瘤的形式，但是此類細(xì)胞可以在身體內(nèi)單獨(dú)存在或者可以是非致瘤性癌細(xì)胞，例如白血病細(xì)胞。癌細(xì)胞可以與多種癌癥相關(guān)，包括但不限于白血病、淋巴瘤、肝癌、腦癌、腦脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和胰腺癌。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，癌細(xì)胞為來(lái)自肝臟的癌細(xì)胞，包括癌性肝細(xì)胞。在所有情況下，在如上面所定義的本發(fā)明的核酸中，有效連接至調(diào)節(jié)性多核苷酸的目的多核苷酸相對(duì)于所述調(diào)節(jié)性多核苷酸而言為"異源的"。這意味著所述目的多核苷酸不包括編碼人或大鼠AFP的多核苷酸，也不包括編碼人或大鼠HIP/PAPI蛋白質(zhì)的多核苷酸。包含于如上面所定義的用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中的調(diào)節(jié)性多核苷酸的優(yōu)選實(shí)施方案在下文描述。衍生自人啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)，用于在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中特異性表達(dá)目的多核苷酸的、衍生自編碼人AFP蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域的、最短功能性調(diào)節(jié)多核苷酸是這樣的調(diào)節(jié)性多核苷酸，其從5，端至3，端的組成是畫與選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少卯％核普酸同一性的第一核酸；和-與核酸SEQIDNO:3具有至少卯％核苷酸同一性的第二核酸，所述第一核酸的3'端核苷酸共價(jià)連接至所述第二核酸的5，端核苷酸。編碼人AFP蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)為本領(lǐng)域所知。來(lái)自人AFP基因啟動(dòng)子的最小功能性序列已由Watanabe等公開(1987，J.Biol.,Chem.，Vol.282(10):4812-4818)。根據(jù)Watanabe等(1987)，對(duì)于增強(qiáng)子活性而言重要的序列位于AFP基因上游3.3和3.7千堿基對(duì)之間的400個(gè)堿基對(duì)區(qū)域。Watanabe等(1987)使用攜帶AFP5'側(cè)翼序列的CAT構(gòu)建體進(jìn)行研究，表明使用缺乏位于AFP基因上游3.7千g對(duì)的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件的較短AFP啟動(dòng)子片段時(shí)，不發(fā)生CAT編碼序列的轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，使用僅包含AFP基因上游2.9千g對(duì)的AFP啟動(dòng)子片段時(shí)，不能檢測(cè)到CAT表達(dá)。十分令人驚訝地，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含不超過(guò)1000個(gè)核苷酸的、如上所述的人AFP啟動(dòng)子片段可以成功地指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。此外，本文證實(shí)，從5，端至3，端包含與SEQIDNO:l(或SEQIDNO:2)具有至少90%核苷酸同一性的所述第一核酸和與SEQIDNO:3具有至少90。/。核普酸同一性的所述第二核酸、并且其中所述第一和第二核酸被間隔核酸分開的調(diào)節(jié)序列也具有指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力。在本文中據(jù)信，分別為有義方向和反義方向的核酸SEQIDNO:l和SEQIDNO:2賦予在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)的特異性，而核酸SEQIDNO:3被認(rèn)為AJ陚予啟動(dòng)子功能的最小序列。15因此，本發(fā)明的目的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸包括這樣的多核苷酸，其從5'端至3，端包含-與選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第一核酸；和-與核酸SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接連接，或-所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸[具有1至3000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度彼此間接連接。其中所述第一和第二核酸彼此直接連接的此類調(diào)節(jié)性多核苷酸的一個(gè)實(shí)施方案在本文中以調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:9舉例說(shuō)明，該調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:9從5'端至3，端包含核酸SEQIDNO:2，核酸SEQIDNO:2直接連接至核酸SEQIDNO:3。其中所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸彼此間接連接的此類調(diào)節(jié)序列的另一個(gè)實(shí)施方案在本文中以調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:10舉例說(shuō)明，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:10從5，端至3，端包含核酸SEQIDNO:1,該第一核酸通過(guò)其3端連接至具有2835個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的間隔核酸上，并且所述間隔核苷酸通過(guò)其3，端連接至所述第二核酸SEQIDNO:3。如果調(diào)節(jié)序列中存在間隔核酸，則間隔核酸通常具有1至3000個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度，每一核苷酸優(yōu)選地選自腺苷(也稱作"A")、胸苷(也稱作"T，，)、鳥苷(也稱作"G，，)、胞苷(也稱作"C，，)并在某些情況下選自尿苷(也稱作"U")。在某些實(shí)施方案中，間隔核酸具有多達(dá)2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2卯0、2950個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，間隔核酸由來(lái)自人AFP啟動(dòng)子的連續(xù)核苷酸組成，例如來(lái)自人AFP啟動(dòng)子的至少2個(gè)至至少2500個(gè)連續(xù)核苷酸，如在本文調(diào)節(jié)序列SEQIDNO:10中那樣。因此，本文包括調(diào)節(jié)性多核苷酸，其組成為-與選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第一核酸；-具有1至3000個(gè)核普酸長(zhǎng)度的間隔核酸，和-與核酸SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸。的確，衍生自人AFP啟動(dòng)子的本發(fā)明調(diào)節(jié)序列還可以包含畫連接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文也可以稱作5，側(cè)翼序列；和/或-連接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文也可以稱作3，側(cè)翼核酸。所述5，附加核酸和所述3，附加核酸具有1至1500個(gè)核苷酸、優(yōu)選1至1500個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由被核酸酶、包括內(nèi)切核酸酶識(shí)別的限制酶切位點(diǎn)序列組成，例如用于在適宜核酸構(gòu)建體如克隆載體或表達(dá)載體中克隆。在某些實(shí)施方案中；所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300或1400個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:10包含604個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的5，附加多核苷酸。本發(fā)明包括與核酸SEQIDNO:9具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苦酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:9自身。本發(fā)明包括與核酸SEQIDNO:10具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:10自身。17衍^-入啟動(dòng)f時(shí)^伊#/裙茅^#說(shuō)'逸^滋才隸本發(fā)明已經(jīng)證明，用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的、衍生自編碼人HIP/PAPI蛋白質(zhì)的基因之啟動(dòng)子區(qū)域的、更短功能性調(diào)節(jié)多核苷酸，可以由SEQIDNO:4中起始于第2200位核苷酸并終止于笫2432位核苷酸的調(diào)節(jié)性多核苷酸，也即本文中的調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:11組成。HIP/PAP蛋白質(zhì)是在肝細(xì)胞癌(HCC)中過(guò)表達(dá)的C型凝集素。該蛋白質(zhì)具有多效生物學(xué)活性，但是對(duì)于HIP/PAP在肝臟中的功能知之甚少。如PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/112824中所公開，HIP/PAPI被證實(shí)對(duì)原代培養(yǎng)物中的肝細(xì)胞具有體外促有絲分裂和抗凋亡效果。在肝臟衰竭和肝臟再生過(guò)程中，HIP/PAP還是肝細(xì)胞的體內(nèi)促有絲分裂和抗凋亡分子。PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/11824還公開了包含有效連接至(i)兔WAP基因啟動(dòng)子或(ii)小鼠白蛋白基因18啟動(dòng)子的HIP/PAPI編碼序列的DNA構(gòu)建體。在現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有對(duì)編碼人HIP/PAPI蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行功能研究?，F(xiàn)今根據(jù)本發(fā)明已證明，在人基因組中位于HIP/PAPI蛋白質(zhì)編碼序列上游的序列SEQIDNO:4是能夠指導(dǎo)與其有效連接的目的多核苷酸特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。此外還證明，通過(guò)剪切核酸SEQIDNO:4而得到的多種核酸片段也具有指導(dǎo)與其有效連接的目的多核苷酸特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力，所有這些核酸片段均包含核酸SEQIDNO:11。此外，本文還證明，核酸SEQIDNO:11自身具有指導(dǎo)與其有效連接的目的多核苷酸特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力。因此，本發(fā)明功能性目的調(diào)節(jié)多核苷酸包括含有核酸SEQIDNO:11的那些多核苷酸。那些目的調(diào)節(jié)性多核苷酸包括在本文實(shí)施例中公開的HIP/PAPI啟動(dòng)子的多種功能性片段，包括核酸SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。因此，在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸可以選自-與包含SEQIDNO:11的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與包含SEQIDNO:12的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與包含SEQIDNO:13的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與包含SEQIDNO:14的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；和-與包含SEQIDNO:4的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸。此外，在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸還可以選自-與由SEQIDNO:11組成的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與由SEQIDNO:12組成的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與由SEQIDNO:13組成的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與由SEQIDNO:14組成的核酸具有至少90。/。核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸;和-與由SEQIDNO:4組成的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸。通常，在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸具有核酸SEQIDNO:4中的至少2"個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含核酸SEQIDNO:11。例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQID19NO:12包含SEQIDNO:4中的573個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含SEQIDNO:11。仍為例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:13包含SEQIDNO:4中的1332個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含SEQIDNO:11。仍為例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:14包含SEQIDNO:4中的2056個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含SEQIDNO:11。此類調(diào)節(jié)性多核苷酸可以包含SEQIDNO:4中的多達(dá)2426個(gè)連續(xù)核苷酸。因此此類調(diào)節(jié)性多核苷酸可以包含SEQIDNO:4中的至少233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、2卯、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、3卯、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、410、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、2013卯、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、14卯、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、15卯、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、19卯、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、22卯、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410或2420個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含核酸SEQIDNO:11。還包括與上面所定義的調(diào)節(jié)性多核苷酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸。的確，衍生自人HIP/PAPI啟動(dòng)子的本發(fā)明調(diào)節(jié)序列還可以包含-連接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文中也可以稱作5，側(cè)翼序列；和/或-連接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文中也可以稱作3，側(cè)翼核酸。所述5，附加核酸和所述3，附加核酸具有1至2500個(gè)核苷酸、優(yōu)選1至1500個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由核酸酶、包括內(nèi)切核酸酶識(shí)別的限制酶切位點(diǎn)序列組成，例如用于在適宜核酸構(gòu)建體，例如克隆載體或表達(dá)載體中克隆的目的。在某些實(shí)施方案中，所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、卯0、950、1000、1100、1200、1300或1400個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:4包含調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:11上游的長(zhǎng)度超出2200個(gè)核苷酸的5，附加多核苷酸。衍生自大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明已經(jīng)證明，衍生自大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸能夠指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)。值得注意的是，本文證明核酸SEQIDNO:5能夠指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)。本領(lǐng)域已知，在胰腺炎的急性期，大鼠HIP/PAPI基因表達(dá)增加超過(guò)200倍(1991,Iovanna等，JBiolChem，Vol.266:24664-24669)。大鼠HIP/PAPI基因啟動(dòng)子區(qū)域本身是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。在本領(lǐng)域中，通過(guò)使用經(jīng)帶有融合至CAT基因的大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的不同缺失片段的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的胰腺細(xì)胞，已經(jīng)證明，當(dāng)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞與IL-6和地塞米松的混合物孵育時(shí)，所測(cè)試的幾種啟動(dòng)子片段能夠誘導(dǎo)CAT報(bào)告基因表達(dá)(1995，Dusetti等，JBiolChem，Vol.270(38):22417-22421)。由于大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子對(duì)IL-6和地塞米松混合物的誘導(dǎo)敏感，故Dusetti等(1995)提出大鼠HIP/PAPI基因應(yīng)該歸為2類的急性期蛋白，其表達(dá)通過(guò)IL-6與糖皮質(zhì)激素的聯(lián)合作用而增加。因此，根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)以證明，在大鼠基因組中位于大鼠HIP/PAPI蛋白質(zhì)編碼序列上游的序列SEQIDNO:5為能夠指導(dǎo)與其有效連接的目的多核苷酸特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。不希望被任何特定理論所束縛，據(jù)認(rèn)為，以前證明于特定誘導(dǎo)條件下在胰腺細(xì)胞中具有功能的大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的任何一個(gè)核酸片段也能夠用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸。因此，在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的本發(fā)明核酸中，所述調(diào)節(jié)性多核苷酸也可以選自包含衍生自大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的最短功能性核酸片段，或者包含與其具有強(qiáng)核苷酸同一性的核酸片段的調(diào)節(jié)性多核苷酸。因此，本發(fā)明另一個(gè)目的是如上面一般定義的用于特異性地在哺乳動(dòng)22物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸，在該核酸中所包含的調(diào)節(jié)性多核苷酸由與SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸(所述核酸是以前被證實(shí)于特定誘導(dǎo)條件下在胰腺細(xì)胞中具有功能的衍生自大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的最短核酸片段)具有至少90%核苷酸同一性的核酸組成。因此，這些調(diào)節(jié)性多核苷酸涵蓋如何核酸，所述核酸包含核酸SEQIDNO:5中至少274個(gè)連續(xù)核苷酸并且含有SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核普酸的核酸。例證性地，這些調(diào)節(jié)性多核苷酸包括含有核酸SEQIDNO:5中317個(gè)連續(xù)核苷酸并且含有SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸的核酸。進(jìn)一步例證性地，這些調(diào)節(jié)性多核苷酸包括包含核酸SEQIDNO:5中379個(gè)連續(xù)核苷酸并且含有SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸的核酸。仍然例證性地，這些調(diào)節(jié)性多核苷酸包括包含核酸SEQIDNO:5中444個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸的核酸。在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中，可以包括與包含SEQIDNO:5中至少274、275、276、277、278、279、280、290、291、292、93、294、295、96、297、298、299、00、301、302304305、306、307、308、309、310、311、312、313、314315、31617、318、319、320、21、、、32526、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、歸、870、880、890、卯0、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240或1250個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核香酸的核酸的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸。的確，衍生自人HIP/PAPI啟動(dòng)子的本發(fā)明調(diào)節(jié)序列還可以包含-連接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文中也可以稱作5，側(cè)翼序列；和/或畫連接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文中也可以稱作3，側(cè)翼核酸。所述5，附加核酸和所述3'附加核酸具有1至2500個(gè)核苷酸、優(yōu)選1至1500個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由核酸酶、包括內(nèi)切核酸酶所識(shí)別的限制酶切位點(diǎn)序列組成，例如用于在適宜核酸構(gòu)建體例如克隆載體或表達(dá)載體中克隆的目的。在某些實(shí)施方案中，所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900或950個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度。例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:5包含位于SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的調(diào)節(jié)性多核苷酸上游的、超過(guò)950個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的5，附加多核苷酸。衍生自大鼠啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明已經(jīng)證明，用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的、衍生自大鼠AFP蛋白質(zhì)編碼基因啟動(dòng)子區(qū)域的最短功能性調(diào)節(jié)多核苷酸，是從5，端至3，端具有如下組成的調(diào)節(jié)性多核苷酸-與選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少90。/o核苷酸同一性的第一核酸；和-與SEQIDNO:8的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸，所述第一核酸3'端的核苷酸共價(jià)連接至所述第二核酸5，端的核苷酸上。非常令人驚訝地，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如上所述的包含不超過(guò)1100個(gè)核苷酸的大鼠AFP啟動(dòng)子片段成功地指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。此外，本文證明，下述調(diào)節(jié)序列也具有指導(dǎo)目的多核苷酸特異性地在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力，所述調(diào)節(jié)序列從5，端至3，端包含與SEQIDNO:6(或SEQIDNO:7)具有至少90。/。核苷酸同一性的所述第一核酸和與SEQIDNO:8具有至少90。/。核苷酸同一性的所述第二核酸，并且其中所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸分開。在此相信，分別為有義方向和反義方向的核酸SEQIDNO:6和SEQIDNO:7賦予在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)的特異性，而核酸SEQIDNO:8據(jù)信為賦予啟動(dòng)子功能的最小序列。因此，本發(fā)明的目的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸包括這樣一些多核苷酸，其從5，端至3，端包含畫與選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的第一核酸；和畫與SEQIDNO:8的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接連接，或-所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸[具有1至2000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度l彼此間接連接。其中所述第一和第二核酸通過(guò)小間隔核酸彼此間接連接的此類調(diào)節(jié)序列的一個(gè)實(shí)施方案在本文中以調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:15例證，所述的調(diào)節(jié)性多核普酸SEQIDNO:15從5，端至3，端包含核酸SEQIDNO:257、該所述第一核酸通過(guò)其3'端連接至具有106個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的間隔核酸上、所述間隔核苷酸通過(guò)其3'端連接至所述第二核酸SEQIDNO:8上。其中所述第一和第二核酸通過(guò)長(zhǎng)間隔核酸彼此間接連接的此類調(diào)節(jié)序列的另一個(gè)實(shí)施方案在本文中以調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:16例證，所述的調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:16從5'端至3，端包含核酸SEQIDNO:6、該所述第一核酸通過(guò)其3，端連接至具有1857個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的間隔核酸上、所述間隔核苷酸通過(guò)其3，端連接至所述第二核酸SEQIDNO:8上。如果調(diào)節(jié)序列中存在間隔核酸，間隔核酸通常具有1至2000個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度，每一核苷酸優(yōu)選地選自腺苷(也稱作"A，，)、胸苷(也稱作"T，，)、鳥苷(也稱作"G，，)、胞苷(也稱作"C")并且在某些情況下選自尿苷(也稱作"U")。因此，本文包括由下列核酸組成的調(diào)節(jié)性多核苷酸-與選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的笫一核酸；-具有1至2000個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度的間隔核酸，和-與SEQIDNO:8的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸。在某些實(shí)施方案中，間隔核酸具有不超過(guò)2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、l糊、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、l卯0、1950或2000個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，間隔核酸由來(lái)自大鼠AFP啟動(dòng)子的連續(xù)核苷酸，例如來(lái)自大鼠AFP啟動(dòng)子的至少2個(gè)至至少1800個(gè)連續(xù)核苷酸組成，正如在本文調(diào)節(jié)序列SEQIDNO:16中一樣。的確，衍生自大鼠AFP啟動(dòng)子的本發(fā)明調(diào)節(jié)序列還可以包含國(guó)連接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文中也可以稱作5，側(cè)翼序列；和/或-連接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文中也可以稱作3，側(cè)翼核酸。所述5'附加核酸和所述3'附加核酸具有1至1500個(gè)核苷酸、優(yōu)選1至1500個(gè)核苷酸的核苷酸長(zhǎng)度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由核酸酶、包括內(nèi)切核酸酶識(shí)別的限制酶切位點(diǎn)序列組成，例如用于在適宜核酸構(gòu)建體例如克隆載體或表達(dá)載體中克隆的目的。在某些實(shí)施方案中，所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300或1400個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。例證性地，調(diào)節(jié)性多核普酸SEQIDNO:16包含346個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的5，附加多核苷酸，該5，附加多核苷酸位于SEQIDNO:16中所包含的SEQIDNO:6的上游。仍為例證性地，調(diào)節(jié)性多核苷酸SEQIDNO:16包含76個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的3，附加多核苷酸，該3，附加多核苷酸位于SEQIDNO:16中所包含的SEQIDNO:8的下游。本發(fā)明包括與核酸SEQIDNO:15具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:15本身。本發(fā)明包括與核酸SEQIDNO:16具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:16本身。在用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸中所包含的優(yōu)選目的多核苷酸在用于特異性地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)目的多核苷酸的核酸中，例如如本說(shuō)明書中所定義的核酸中，所述目的多核苷酸可以是任何類型，只要其可以用于癌癥的預(yù)防性或治療性目的即可。換言之，當(dāng)所述目的多核苷酸在所述調(diào)節(jié)性多核苷酸控制下在癌細(xì)胞中特異性地表達(dá)時(shí)，在任何情況下，所述目的多核苷酸均應(yīng)在細(xì)胞水平和27/或組織水平和/或器官水平和/或更加全身性地在整個(gè)哺乳動(dòng)物有機(jī)體水平上誘導(dǎo)抗癌活性。本領(lǐng)域已知的大量具有抗癌活性的多核苷酸均可用作本發(fā)明核酸中的目的多核苷酸。抗癌活性可以定義為破壞癌細(xì)胞和/或抑制其增殖和/或促進(jìn)其分化。癌細(xì)胞是惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其是在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)性基因和途徑上帶有已知或未知的異常的細(xì)胞。此類細(xì)胞具有以不受控的方式生長(zhǎng)的能力，并且可以在天然疾病條件下或?qū)嶒?yàn)條件下引起肺瘤形成。腫瘤定義為同質(zhì)或異質(zhì)的癌細(xì)胞團(tuán)?？拱┗钚园▽?duì)體外生長(zhǎng)的癌細(xì)胞或者人或非人動(dòng)物受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞的破壞和/或抑制其增殖和/或促進(jìn)其分化。對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行破壞和/或抑制其增殖和/或促進(jìn)其分化，可涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的機(jī)制，包括但不限于各種分化、細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡)或者壞死途徑。此外，抗癌活性可包括對(duì)擴(kuò)散的癌細(xì)胞進(jìn)行破壞和/或抑制其增殖和/或促進(jìn)其分化，擴(kuò)散的癌細(xì)胞也稱作轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞，其具有移動(dòng)離開最初腫瘤位點(diǎn)的能力，并且可以在一個(gè)或多個(gè)遠(yuǎn)離起源腫瘤的位點(diǎn)^J^現(xiàn)。此外，抗癌活性可以包括減少、完全消除包含同質(zhì)或異質(zhì)癌細(xì)胞群體的局限性腫瘤或擴(kuò)散性腫瘤，或抑制其生長(zhǎng)。具有抗癌活性的多核苷酸包括這樣的多核苷酸，當(dāng)該多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)其直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這些目的多核苷酸在本文中稱作"自殺多核苷酸"。自殺多核苷酸包括(i)編碼具有細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(ii)編碼在其它物質(zhì)存在時(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(iii)編碼RNAi的多核苷酸，所述RNAi改變或阻斷細(xì)胞生存所必需的蛋白質(zhì)的表達(dá)，或者導(dǎo)致癌基因沉默；(iv)編碼細(xì)胞毒性核糖核酸酶的多核苷酸；(v)編碼抗癌活性所需的核酶的多核苷酸，所述核酶靶向蛋白質(zhì)的表達(dá)；28(Vi)編碼抗癌活性所需的有義或反義核酸的多核苷酸，所述有義或反義核酸改變或阻斷蛋白質(zhì)的表達(dá)。薦Z^拔膚差厲^^W,yj"茅^具有抗癌作用的目的多核苷酸的例證性實(shí)例包括具有抗增殖活性、抗轉(zhuǎn)移活性、抗血管生成活性或促凋亡活性的基因，例如mda-7/IL-24(Sarkar等，(2002)BiotechniquesSuppl:30-39;Fisher等，(2003)CancerBiolTher2:S23畫37)、TNF-a.(Anderson等，CurrOpinPharmacol(2004)4(4):314-320)、IFN畫p(Yoshida等，(2004)CancerSci95(11):858-865)、p53(Haupt等，CellCycle(2004)3(7):912-916)、BAX(Chan等，ClinExpPharmacolPhysiol(2004)31(3):119-128)、PTEN(Sansal等，JClinOncol(2004)22(14):2954-63)、可溶性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(sFGFR)(Gowardhan等，(2004)Prostate61(1):50-59)、RNAi或反義-ras(Liu等，CancerGeneTher(2004)11(11):748-756.)、RNAi或反義VEGF(Qui等，HepatobiliaryPancreatDisInt(2004)3(4):552-557)、反義或RNAimda-9/內(nèi)居蛋白(Sarkar等，PharmacolTher(2004)104(2):101-115)。具有抗癌作用的目的多核苷酸的其它例證性實(shí)例包括增強(qiáng)放療的那些，包括但不限于，p53(Ha叩t等,CellCycle(2004)3(7):912-916)、GADD34(Leibermann等，Leukemia(2002)16(4):527-41)、碘化鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(對(duì)于甲狀腺癌)(Mitrofanova等，ClinCancerRes(2004)10(20):6969-6976)或者Na+/K+ATP酶(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O98/45443)。具有抗癌作用的目的多核苷酸的再其它例證性實(shí)例包括編碼單純皰滲病毒l型胸苷激酶基因(HTK)的那些，其與藥物更昔洛韋(GCV)組合施用。HTK是迄今在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭泻团R床試驗(yàn)中最常用的癌基因治療系統(tǒng)。參見(jiàn)J.Gomez國(guó)Navarro等，"Genetherapyforcancer,"EuropeanJournalofCancer,vol.35，pp.867-885(1999)。HTK的底物特異性區(qū)別于細(xì)胞胸苷激酶的，HTK可以將GCV轉(zhuǎn)化成毒性的鱗酸化形式，從而特異性地殺死表達(dá)HTK的細(xì)胞。自HTK/GCV系統(tǒng)的概念首次描述以來(lái)，已經(jīng)證明其作為腫瘤消除策略在多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥〉昧撕芎玫某晒?。此外，基于該模型的超過(guò)兩打的臨床基因治療試驗(yàn)已經(jīng)于最近7年啟動(dòng)。參見(jiàn)J.A.Roth等，"癌癥基因治療我們已作了什么以及我們將去何方？"("Genetherapyforcancer:whathavewedoneandwherearewegoing")JournaloftheNationalCancerInstitute,vol.89(1),pp.21-39(1997);D.Klatzmann等，"單純皰滲病毒1型胸普激酶"自殺，，基因療法對(duì)復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移性黑素瘤的I/II期劑量遞增研究，，("APhaseI/IIdose-escalationstudyofherpessimplexvimstype1thymidinekinase"suicide"genetherapyforrecurrentmetastaticmelanoma,")HumanGeneTherapy,vol.9，pp.2585-2894(1998);和J.R.Herman等，"前列腺的腺癌的原位基因治療I期臨床試驗(yàn)，，("Insitugenetherapyforadenocarcinomaoftheprostate:AphaseIclinicaltrial,")HumanGeneTherapy,vol.10，pp.1239-1249(1999)。薦竭/A^/成WiA^^《的/核茅^具有抗癌作用的目的多核苷酸的其它例證性實(shí)施方案包括編碼siRNA的那些，所述siRNA可以用于沉默目的基因(包括細(xì)胞存活所需的基因和癌基因)以引起抗癌活性(參見(jiàn)(i)Borkhardt，A"BlockingoncogenesinmalignantcellsbyRNAinterference:NewhopeforahighlyspecificcancertreatmentCancerCell,2002.2(3):p.167-8;(ii)Wilda，M,等,KillingofleukemiccellswithaBCR/ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi).Oncogene,2002.21(37):p.5716-24;(iii)Brummelkamp，T.R"R.Bernards,和R.Agami，Stablesuppressionoft腿ourigenicitybyvirus-mediatedRNAinterference.CancerCell,2002，2(3):p.243-7)。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"RNA干擾"或"RNAi"作廣義定義并且包括所有轉(zhuǎn)錄后機(jī)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制的RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制，例如描述于P.D.ZamoreScience296，1265(2002)中的那些。RNA干擾可以由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)，其可以在真核生物中誘導(dǎo)許多不同的外遺傳基因沉默過(guò)程，包括同源mRNA的降解——在動(dòng)物中稱作RNA千擾(RNAi)和在植物中稱作轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的過(guò)程。RNA干擾(RNAi)由AndrewFire和CraigMello于1998年在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中首次發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)證明，雙鏈RNA通過(guò)稱作RNA千擾的過(guò)程抑制具有互補(bǔ)序列的基因的表達(dá)(參見(jiàn)HammondetaI.Nat.Rev.Genet.2:110-119(2001))。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)應(yīng)于待下調(diào)基因的區(qū)域的dsRNA復(fù)合體可以通過(guò)rAAV介導(dǎo)的RNAi表達(dá)盒而轉(zhuǎn)移在細(xì)胞中表達(dá)。為了本發(fā)明的目的，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"小干擾RNA"(或"siRNA")意思是指短的干擾RNA，其為長(zhǎng)度小于30個(gè)M對(duì)(即60個(gè)核苷酸或堿基)并且優(yōu)選21-25個(gè)堿基對(duì)(即42-50個(gè)堿基或核苷酸)的雙鏈RNA復(fù)合體。更普遍地，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)RNAi的雙鏈RNA稱作"干擾RNA"。因此，"小干擾RNA"或"siRNA，，是能夠降低與其具有同源性的基因表達(dá)的雙鏈RNA復(fù)合體。同源性覆蓋的基因區(qū)域或者其它核苷酸序列稱作"RNAi靶區(qū)域"、"靶區(qū)域"、"RNAi乾序列"或者"靼序列"。在一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA可以是包含有義區(qū)、環(huán)區(qū)和反義區(qū)的"發(fā)夾"或"莖-環(huán)RNA分子"，其中反義區(qū)與有義區(qū)互補(bǔ)并因此能夠形成誘導(dǎo)RNAi的dsRNA復(fù)合體。在其它實(shí)施方案中，siRNA包含兩個(gè)不同的RNA分子，它們非共價(jià)結(jié)合以形成dsRNA復(fù)合體?？梢酝ㄟ^(guò)表達(dá)自目的多核苷酸的RNAi打靶而被沉默的癌基因包括選自ABLI、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES的癌基因。為了本發(fā)明的目的，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"RNAi表達(dá)盒"意思是指編碼一個(gè)或一個(gè)以上RNA分子的核酸組合物，其中所述RNA分子能夠形成雙鏈RNA復(fù)合體并因此能夠誘導(dǎo)RNA干擾。在本發(fā)明上下文中，所述RNAi表達(dá)盒是rAAV載體或rAAV基因組的一部分。因此，本發(fā)明提供用于在mRNA水平體內(nèi)降低或者下調(diào)哺乳動(dòng)物受試者癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的方法。該方法包括向哺乳動(dòng)物受試者(的細(xì)胞)體31內(nèi)施用重組腺伴隨病毒載體，所述載體包含RNA干擾("RNAi")表達(dá)盒，其RNA表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)形成能誘導(dǎo)"RNA介導(dǎo)的干擾，，或者"RNA干擾"("RNAi")(—種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制)的雙鏈RNA復(fù)合體而直接或間接導(dǎo)致相應(yīng)RNAi粑基因表達(dá)降低。該dsRNA復(fù)合體包含在細(xì)胞的生理?xiàng)l件下能雜交至待下調(diào)基因(即RNAi耙基因)的mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少部分核苷酸序列上的核苷酸序列。特別地，RNAi表達(dá)盒的RNA表達(dá)產(chǎn)物將降低RNAi靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞濃度，由此導(dǎo)致哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)RNAi乾基因所編碼的蛋白質(zhì)的濃度降低?；虮磉_(dá)的下調(diào)是特異性的，這是因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)待通過(guò)rAAV-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移而體內(nèi)轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物受試者細(xì)胞內(nèi)的RNAi表達(dá)盒的RNA編碼區(qū)的序列特性時(shí)，選擇了來(lái)自RNAi靶基因的一部分的核苷酸序列；備選地，也就是說(shuō)，抑制是序列特異性的，這是因?yàn)閷?duì)應(yīng)于雙鏈RNA復(fù)合體雙鏈區(qū)的核苷酸序列是RNA千擾所耙向的。本發(fā)明還提供編碼RNA分子的RNAi表達(dá)盒，其中所述的RNA分子在有效連接至本文所公開的衍生自人或大鼠AFP、人和大鼠HIP/PAPI的調(diào)節(jié)性多核苷酸時(shí)能夠在癌細(xì)胞中形成雙鏈RNA復(fù)合體并因此能夠誘導(dǎo)RNA干擾。此類RNAi表達(dá)盒可以由單一DNA分子組成作為rAAV基因組的一部分，當(dāng)引入細(xì)胞內(nèi)后其產(chǎn)生能夠分子內(nèi)形成dsRNA復(fù)合體的單一RNA分子。然而，可以同時(shí)或者相繼地向細(xì)胞內(nèi)引入一種以上的rAAV基因組或RNAi表達(dá)盒或RNA編碼區(qū)，以產(chǎn)生兩種或兩種以上能夠分子間形成dsRNA復(fù)合體的RNA分子。典型地，能夠分子內(nèi)或者分子間形成dsRNA復(fù)合體的兩個(gè)RNA結(jié)構(gòu)部分是待下調(diào)或者降低表達(dá)的基因或核酸序列的至少部分有義序列和至少部分反義序列。RNAi表達(dá)盒的設(shè)計(jì)并不限制本發(fā)明的范圍?？梢圆捎貌煌牟呗栽O(shè)計(jì)RNAi表達(dá)盒，并且基于不同設(shè)計(jì)的RNAi表達(dá)盒將能夠體內(nèi)誘導(dǎo)RNA千擾。(雖然RNAi表達(dá)盒的設(shè)計(jì)不限制本發(fā)明的范圍，但是在本發(fā)明詳述中和下面包括一些RNAi表達(dá)盒設(shè)計(jì)。)所有RNAi表達(dá)盒共有的一個(gè)特性是它們包含RNA編碼區(qū)，所述RNA編碼區(qū)編碼的RNA分子能夠單獨(dú)或者與另一RNA分子聯(lián)合通過(guò)形成分子內(nèi)或者分子間雙鏈RNA復(fù)合體而誘導(dǎo)RNA干擾?？梢圆捎貌煌脑O(shè)計(jì)原理來(lái)實(shí)現(xiàn)同樣的目標(biāo)，并且這些設(shè)計(jì)原理也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。例如，RNAi表達(dá)盒可以編碼一個(gè)或一個(gè)以上RNA分子。在自RNAi表達(dá)盒表達(dá)RNA之后或者過(guò)程中，可以通過(guò)單一自身互補(bǔ)的RNA分子或者通過(guò)兩個(gè)互補(bǔ)的RNA分子形成雙鏈RNA復(fù)合體。dsRNA復(fù)合體的形成可以起始于細(xì)胞核內(nèi)或者細(xì)胞核外。在一個(gè)方面，本文提供雙鏈RNA復(fù)合體，其包含能夠在生理?xiàng)l件下雜交至mRNA分子的至少一個(gè)部分上的第一RNA部分和第二RNA部分，其中第二RNA部分的至少一個(gè)部分能夠在生理?xiàng)l件下雜交至第一部分。優(yōu)選地，第一和第二部分是同一RNA分子的部分并且能夠在生理?xiàng)l件下，如細(xì)胞內(nèi)所存在的那些條件下雜交，并且當(dāng)?shù)谝缓偷诙糠蛛s交時(shí)形成雙鏈RNA復(fù)合體。在另一方面，本文提供用于形成雙鏈RNA復(fù)合體的線性RNA分子，其包含(優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi))能夠雜交至mRNA分子的至少一個(gè)部分上的第一部分和第二部分，其中第二部分的至少一個(gè)部分能夠雜交至第一部分上以形成發(fā)夾dsRNA復(fù)合體。再一個(gè)方面，本發(fā)明方法包括具有部分或全部雙鏈特征的RNA的體內(nèi)AAV介導(dǎo)表達(dá)。包含與RNAi乾基因的一部分相同的核苷i^列的dsRNA復(fù)合體優(yōu)選用于抑制。還發(fā)現(xiàn)相對(duì)于RNAi靶序列而言具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列也可有效實(shí)現(xiàn)抑制。因此，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的比對(duì)算法并通過(guò)計(jì)算核苷酸序列間差異百分?jǐn)?shù)而優(yōu)化序列同一性。備選地，dsRNA復(fù)合體的雙鏈區(qū)可以功能性地定義為能夠與部分靶基因轉(zhuǎn)錄物雜交的核苷酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi表達(dá)盒包含至少一個(gè)RNA編碼區(qū)。優(yōu)選地，RNA編碼區(qū)是能充當(dāng)模板用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)期望RNA分子的DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNAi表達(dá)盒包含兩個(gè)或兩個(gè)以上RNA33編碼區(qū)。RNAi表達(dá)盒還可以包含本文所公開的衍生自人或大鼠AFP或人或大鼠HIP/PAPI的調(diào)節(jié)性多核苷酸，以致使RNAi產(chǎn)物特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明采用包含核酶的RNA分子產(chǎn)生dsRNA復(fù)合體，由此克服了與產(chǎn)生dsRNA相關(guān)的某些已知困難。例如，可以使用核酶的功能性以去除多腺苷酸化信號(hào)，由此阻止RNA分子自細(xì)胞核的釋放或者使釋放最小化。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明基于RNA分子的一部分能夠編碼增強(qiáng)dsRNA特異性活性的RNA或蛋白質(zhì)的能力。在本發(fā)明的另一方面，RNA編碼區(qū)的表達(dá)導(dǎo)致靶基因的下調(diào)。優(yōu)選地，靶基因包含與RNA編碼區(qū)具有至少約90%同一性、更優(yōu)選至少約95%同一性并且甚至更優(yōu)選至少約99%同一性的序列。RNAi乾基因不限制本發(fā)明的范圍，并且可以是細(xì)胞存活所需的任何基因，包括癌細(xì)胞存活所需的任何基因。因此，RNAi把基因的選擇對(duì)于本發(fā)明而言是非限制性的本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何設(shè)計(jì)RNAi表達(dá)盒以下調(diào)任何目的RNAi靶基因的基因表達(dá)。依賴于具體的RNAi靶基因和所遞送的rAAV病毒體的劑量，該方法可以造成RNAi靶基因功能的部分喪失或者完全喪失。竊碼細(xì)應(yīng)##^^#核凝雜的《的多核夯^為了本發(fā)明的目的，有效連接至衍生自人或大鼠AFP或者人或大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性區(qū)域的目的多核苷酸可以是編碼細(xì)胞毒性核糖核酸酶的多核苷酸。多種細(xì)胞毒性核糖核酸酶為本領(lǐng)域已知，包括人RNA酶1的變體，例如相對(duì)于天然人RNA酶1氨基酸序列而言具有一個(gè)或一個(gè)以上選自N88CL86E、N88R、G89D、R91DR4C、L86E、N88R、G89D、R91D、V118CL86E、N88C、R91DR4C、L86E、N88C、R91D、V118CR4C、醒C、V118CK7A、L86E、N88C、R91DK7A、L86E、N88R、G89D、R91DR4C、K7A、L86E、N88C、R91D、V118CR4C、K7A、L86E、N88R、G89D、R91D、V118C的氨基酸替代的那些變體。本發(fā)明目的多核苷酸所編碼的細(xì)胞毒性核糖核酸酶還包括相對(duì)于天然人RNA酶1氨基酸序列而言具有一個(gè)或一個(gè)以上選自下列的氨基酸替代的那些-7賴氨酸(K)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)-85精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)-86亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)-87蘇氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)-88天冬酰胺(N)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)-89甘氨酸(G)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)-90絲氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)-91精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)-92酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)-93脯氨酸(P)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)-94天冬酰胺(N)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。本發(fā)明目的多核苷酸所編碼的細(xì)胞毒性核糖核酸酶還包括相對(duì)于天然人RNA酶1M酸序列而言具有一個(gè)或一個(gè)以上選自下列的氨基酸替代的那些-1賴氨酸(K)、半胱氨酸(C)-2谷氨酸(E)、半胱氨酸(C)-3絲氨酸(S)、半胱氨酸(C)畫4精氨酸(R)、半胱氨酸(C)-5丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)-6賴氨酸(K)、半胱氨酸(C)誦116纈氨酸(V)、半胱氨酸(C)-117脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)-118纈氨酸(V)、半胱氨酸(C)-119組氨酸(H)、半胱氨酸(C)-120苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、和-121天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)多種細(xì)胞毒性核糖核酸酶，包括上述那些，描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S2005261232中，其在此并入作為參考。薦碼凝雄^耳核酶以及它們的構(gòu)建和用途為本領(lǐng)域已知。參見(jiàn)例如Norris等，2000,"Designandtestingofribozymesforcancergenetherapy,"Adv.ExpMed.Biol,465:293-301。還可參見(jiàn)Cech,美國(guó)專利號(hào)5,093,246;Cech，美國(guó)專利號(hào)5,116,742;Haselhoff等，1988,Nature334:585-591。一般地，采用已知的金屬硫蛋白mRNA分子的核苷酸序列與已知的核酶特性，可以設(shè)計(jì)和產(chǎn)生在本發(fā)明中有用的多種不同的核酶或編碼核酶的載體?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明目的多核苷酸編碼的核酶包括干擾金屬硫蛋白基因表達(dá)的那些，例如公開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S2003105(M3中的那些，該美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S2003105043在此整個(gè)地并入作為參考。此類核酶在所乾向的癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，核酶4吏所靶向的癌細(xì)胞對(duì)輻射、活性氧類別和化療劑更敏感。因此，此類核酶在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中的特異表達(dá)可以單獨(dú)使用或者與常規(guī)it射療法或化學(xué)療法組合使用。耙向n種人金屬硫蛋白基因中的一種或多種的mRNA的核酶可以用于治療多種人類36癌癥，包括前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。此類核酶破壞金屬硫蛋白編碼mRNA,而非僅僅是與它們雜交。核酶4象酶一樣起作用，并且每一分子可以被"重復(fù)利用，，以降解多個(gè)mRNA分子。另外的優(yōu)勢(shì)是，為破壞耙RNA，核酶不需要與耙mRNA具有完全互補(bǔ)性。雜交僅僅需要滿足使核酶催化位點(diǎn)能斷裂靶mRNA即可。因此，可以設(shè)計(jì)單一核酶以破壞編碼不同金屬硫蛋白的幾種相關(guān)mRNA,這比設(shè)計(jì)常規(guī)反義分子以有效針對(duì)不同mRNA更容易。本文還包括編碼特異性斷裂基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)mRNA的核酶的那些目的多核苷酸，例如描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003195164中的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003195164在此完整地并入作為參考。薦碼^"乂成'^:乂^"虔W原付^凝茅^本發(fā)明目的多核苷酸還可以編碼干擾特異靶基因表達(dá)而誘導(dǎo)抗癌活性的有義或反義多核苷酸。此類目的多核苷酸包括編碼美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?005261249或2005113328中所公開的反義多核苷酸的那些，該兩個(gè)美國(guó)專利申請(qǐng)?jiān)诖巳牟⑷胱鳛閰⒖?。此類目的多核苷酸還包括編碼與核仁素mRNA互補(bǔ)的并公開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00526860中的反義多核苷酸的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00526860在此全文并入作為參考。此類目的多核苷酸還包括編碼與BRCA-1mRNA互補(bǔ)的并>^開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00526857中的反義多核苷酸的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)柤?526857在此全文并入作為參考。此類目的多核苷酸還包括編碼與WT-1mRNA互補(bǔ)的并公開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00443950的反義多核苷酸的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)柤?443在此全文并入作為參考。此類目的多核苷酸還包括編碼與驅(qū)動(dòng)蛋白mRNA互補(bǔ)的并公開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0049156的反義多核苷酸的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0049156在此全文并入作為參考。此類目的多核苷酸還包括編碼與睪酮阻抑信使-2(TRPM-2)mRNA互補(bǔ)的并公開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003158130的反義多核苷酸的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003158130在此全文并入作為參考。此類目的多核苷酸還包括編碼由ADNF-III寡核苷酸組成的并公開于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00336521的反義多核苷酸的那些，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00336521在此全文并入作為參考。本發(fā)明目的多核苷酸的最優(yōu)選實(shí)施方案在最優(yōu)選實(shí)施方案中，有效連接至衍生自人AFP啟動(dòng)子、大鼠AFP啟動(dòng)子、人HIP/PAPI啟動(dòng)子或大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列上的目的多核苷酸，由編碼催化碘細(xì)胞攝取的大鼠碘化鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Symporter)(NIS)蛋白質(zhì)的多核苷酸組成。本領(lǐng)域已經(jīng)表明，在it^達(dá)NIS基因的大鼠細(xì)胞中，達(dá)到了高水平的放射性碘的細(xì)胞纟聶取。當(dāng)將表達(dá)NIS的重組載體直接注射入荷有肝癌的大鼠的癌結(jié)節(jié)內(nèi)時(shí)，測(cè)定到腫瘤生長(zhǎng)的抑制(2004，F(xiàn)aivre等，CancerResearch,Vol.64:8045-8051)。然而，F(xiàn)aivre等(2004)所設(shè)計(jì)的重組載體不能夠使NIS蛋白質(zhì)特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)，因此其不能夠用于治療。相反，當(dāng)使用包含編碼NIS的多核苷酸作為目的多核苷酸的本發(fā)明核酸時(shí)，NIS蛋白質(zhì)可以特異性地在所靶向的癌細(xì)胞中表達(dá)。此外，當(dāng)使用包含有效連接至一種本說(shuō)明書所述調(diào)節(jié)性多核苷酸上的目的NIS-編碼多核苷酸的核酸時(shí)，高水平的放射性碘細(xì)胞攝取本身足以特異性殺死腫瘤細(xì)胞并且抑制肺瘤生長(zhǎng)，而無(wú)需同時(shí)表達(dá)一種或多種如下基因，所述基因編碼可以在細(xì)胞水平上保留細(xì)胞毒性放射性核素的蛋白質(zhì)，例如，編碼甲狀腺過(guò)氧化物酶的基因(TPO)或者編碼甲狀腺球蛋白的基因(TG)。在目的多核苷酸的某些實(shí)施方案中，所述目的多核苷酸編碼Faivre等(2004，F(xiàn)aivre等，CancerResearch,Vol.64:8045-8051)所公開的NIS38蛋白質(zhì)。在目的多核苷酸的某些實(shí)施方案中，所述目的多核苷酸編碼PCT申請(qǐng)?zhí)朩O97/28175中所公開的NIS蛋白質(zhì)。如本文所-使用，"表達(dá)盒"由核酸組成，所述核酸包含至少下列兩種多核苷酸，分別為(i)由衍生自人或大鼠AFP啟動(dòng)子或者人或大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的本文所定義調(diào)節(jié)性多核苷酸組成的第一多核苷酸，和(ii)由直接或間接誘導(dǎo)抗癌活性的本文所定義目的多核苷酸組成的第二多核苷酸。因此，基于上面所給出的表達(dá)盒的一般定義，本發(fā)明的"核酸"也可以是表達(dá)盒的一種特殊實(shí)施方案。本發(fā)明的表達(dá)盒還可以包含有效連接至目的多核苷酸的多腺苷酸化信號(hào)。多腺苷酸化序列有效連接至待轉(zhuǎn)錄的多核苷酸時(shí)，其允許轉(zhuǎn)錄終止。它優(yōu)選地位于目的多核苷酸的3'(下游)。適宜的多腺苷酸化信號(hào)包括P生長(zhǎng)激素(bGHpA)、SV40和(5-珠蛋白的多腺苷酸化信號(hào)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選表達(dá)盒從5，端至3，端包含(i)如本文所定義的一種調(diào)節(jié)性多核苷酸和(ii)編碼NIS蛋白質(zhì)的一種目的多核苷酸。本發(fā)明最優(yōu)選的表達(dá)盒從5'端至3'端包含(i)衍生自人HIP/PAPI啟動(dòng)子的如本文所描述的一種調(diào)節(jié)性多核苷酸和(ii)編碼NIS蛋白質(zhì)的一種目的多核苷酸。表達(dá)盒此外還可以包含標(biāo)記基因。表達(dá)盒可以包含在載體中。重逸戎糸本發(fā)明提供載體和用于栽體介導(dǎo)的抗癌因子(所述抗癌因子在癌癥治療中有效)遞送和表達(dá)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及重組病毒載體和非病毒載體的用途，其用于向受試者遞送用于特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核普酸的核酸，以治療癌癥。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是在其中插入了用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苦酸的核酸的重組載體。為了本發(fā)明的目的，"載體"、"轉(zhuǎn)移載體"、"基因轉(zhuǎn)移載體"或"核酸組合物轉(zhuǎn)移載體"意思是指能夠轉(zhuǎn)移和/或運(yùn)輸核酸組合物至宿主細(xì)胞、I宿主細(xì)胞和/或至宿主細(xì)胞內(nèi)的特定位置和/或區(qū)室的任何元件，例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒粒等。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆載體和表達(dá)載體，以及病毒載體和非病毒載體以及可能的棵DNA或復(fù)合DNA。然而，該術(shù)語(yǔ)不包括生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)移載體的細(xì)胞，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系。提供了用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的、基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)和非病毒表達(dá)系統(tǒng)。非病毒載體和系統(tǒng)包括通常帶有包含本發(fā)明核酸的表達(dá)盒的質(zhì)粒和游離型載體，AA工染色體(參見(jiàn)例如，Harrington等，1997，NatGenet15:345)。例如，可以用于在哺乳動(dòng)物(例如人)細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明核酸的非病毒載體包括pcDNA3.1/His、pEBVHisA、B、C(Invitrogen，SanDiegoCalif.)、MPSV栽體、Invitrogen1997產(chǎn)品目錄(其在此全文并入作為參考)(InvitrogenInc,SanDiegoCalif.)中描述的其它載體和本領(lǐng)域已知的用于其它蛋白質(zhì)的眾多其它載體。有用的病毒載體包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒的栽體、基于SV40、乳頭瘤病毒、HBP埃巴病毒、痘苗病毒載體和Semliki森林病毒(SFV)的載體。SFV和痘苗病毒載體一般性地討論于Ausubel等(同前)16章中。雖然病毒載體有時(shí)以棵形式引入或者以病毒蛋白質(zhì)之外的蛋白質(zhì)包被，但是通常地這些載體由兩個(gè)組分構(gòu)成，即修飾的病毒基因組和包繞它的衣殼結(jié)構(gòu)(一般描述參見(jiàn)Smith,1995，Annu.Rev.Microbiol.49:807)。然而，可以以多種方式改變載體中的病毒核酸，例如在設(shè)計(jì)用于基因治療時(shí)。這些改變的目的是使病毒喪失在靶細(xì)胞中生長(zhǎng)的能力而同時(shí)保留其在可用的包裝細(xì)胞或者輔助細(xì)胞中以載體形式生長(zhǎng)的能力，以及在病毒基因組中提供插入外源DNA序列的空間和并入編碼目的基因和使目的基因適當(dāng)表達(dá)的新序列。因此，載體核酸一般包含兩個(gè)組分，即在輔助細(xì)胞系中復(fù)制和包裝所必需的順式作用病毒序列和用于外源基因的轉(zhuǎn)錄單位。其它的病毒功能可以以反式表達(dá)于特定包裝或者輔助細(xì)胞系中。腺病毒載體(例如用于人基因治療)描述于例如Rosenfeld等，1992，Cell68:143;PCT出版物WO94/12650;94/12649;和94/12629中。在以腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，本發(fā)明的核酸可以克隆入由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物中。在病毒基因組的非必需El或E3區(qū)域中的插入將導(dǎo)致產(chǎn)生能夠在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)治療性多核普酸序列的活病毒(LoganandShenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:3655)。帶有治療性多核苷^列作為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體描述于例如Miller等，1990，Mol.Cell.Biol.10:4239;Kolberg，1992,J.NIHRes.4:43;和Cornetta等，1991，Hum.GeneTher.2:215中。靡病毒戎沐在本發(fā)明中優(yōu)選使用腺病毒栽體作為基因運(yùn)載體。腺病毒是DNA病毒，其基因組DNA約36kbp大小。腺病毒不傷害人，但是腺病毒基因組的El基因在嚙齒動(dòng)物中具有轉(zhuǎn)化潛能。因此，該區(qū)域必須去除以增強(qiáng)治療的安全性。為了構(gòu)建作為基因遞送載體的重組腺病毒，E1A和E1B區(qū)域被目的基因替換，這使得其成為稱作第一代腺病毒栽體的復(fù)制缺陷型腺病毒。當(dāng)插入基因長(zhǎng)于3.5kbp時(shí)，可附加去除E3區(qū)域。沒(méi)有E1區(qū)域的重組腺病毒可以在組成型表達(dá)E1A和E1B蛋白質(zhì)的293細(xì)胞中繁殖。為了構(gòu)建能夠特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)上面所定義的目的多核苷酸的重組腺病毒，可以從腺病毒基因組DNA中去除E1區(qū)域并且替代地插入包括本發(fā)明核酸的表達(dá)盒。靡伴魔病#我#41在一個(gè)實(shí)施方案中，重組載體為含有如本說(shuō)明書中所定義的用于特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸的AAV載體。為了本發(fā)明的目的，"AAV栽體"、"基于AAV的栽體"、"基于腺伴隨病毒的載體"、"腺伴隨病毒載體"、"rAAV載體"或者"重組腺伴隨病毒載體"意思是指衍生自腺伴隨病毒血清型(包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8等)或者其衣殼蛋白質(zhì)序列與AAV2或AAV5衣殼蛋白質(zhì)序列基本上同源的任何其它病毒或血清型的載體。該術(shù)語(yǔ)還包括組合了一種以上AAV血清型的特征的雜合載體。AAV載體中可以有一個(gè)或一個(gè)以上的AAV野生型基因全部或者部分缺失，優(yōu)選rep和/或cap基因缺失，但是保留功能性側(cè)翼ITR序列。功能性ITR序列是拯救、復(fù)制和包裝AAV病毒體所必需的。因此，AAV載體在本文中定義為至少包括病毒復(fù)制和包裝所需的那些順式序列(例如功能性ITR)。ITR無(wú)需是野生型核普酸序列，可以改變此序列，例如通過(guò)核苷酸的插入、缺失或替代而改變，只要序列提供功能性拯救、復(fù)制和包裝即可。為了本發(fā)明的目的，"AAV栽體構(gòu)建體"或"rAAV載體構(gòu)建體"意思是指在生產(chǎn)rAAV病毒體(rAAV載體)中使用的核酸組合物。更加具體而言，rAAV載體構(gòu)建體產(chǎn)生待包裝入rAAV殼體中的rAAV基因組。AAV載體構(gòu)建體可以使用已知技術(shù)構(gòu)建，以提供如下在轉(zhuǎn)錄方向上有效連接的組份(a)衍生自人或大鼠AFP啟動(dòng)子或者人或大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸，(b)目的多核苷酸(例如編碼細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)、包括NIS蛋白質(zhì)或毒性核糖核酸酶的序列，編碼核酶，反義多核苷酸等的序列)，和(c)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。所得到的包含這些有效連接的組分的構(gòu)建體以功能性AAVITR序列為邊界(5'和3')。例如，AAV載體構(gòu)建體可以是雙鏈DNA質(zhì)粒。為了本發(fā)明的目的，"重組病毒"、"重組病務(wù)本"、"重組載體"或"重組病毒載體"意思是指已經(jīng)通過(guò)例如向病毒顆粒中添加或者插入異源核酸組合物而,皮遺傳改變的病毒。為了本發(fā)明的目的，"AAV病毒體"意思是指完整的病毒顆粒，例如野生型(wt)AAV病毒顆粒(包含與AAV衣殼蛋白外殼結(jié)合的線性單鏈AAV核酸基因組)。在此方面，4壬何互補(bǔ)意義的單鏈AAV核酸分子，如"有義，，或者"反義"鏈，均可以包裝入任何一個(gè)AAV病毒體中，并且兩條鏈同樣地是感染性的。。為了本發(fā)明的目的，"重組AAV病毒體"或"rAAV病毒體"在本文定義為由包裹目的異源DNA分子的AAV蛋白質(zhì)殼構(gòu)成的感染性復(fù)制缺陷型病毒，所述的異源DNA分子的一側(cè)或兩側(cè)為AAVITR。rAAV病毒體可以在其中引入了AAV載體構(gòu)建體、AAV輔助功能(helperfunctions)和附助功能(accessoryfunctions)的適宜宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。以該方式，宿主細(xì)胞4皮賦予了編碼如下AAV多肽的能力，所述AAV多肽是將AAV載體(包含目的重組核普酸序列)包裝入重組病毒體顆粒以便以后進(jìn)行基因遞送所需的AAV多肽。除非上下文明確另有指明，術(shù)語(yǔ)"rAAV病毒體"及其同義詞和術(shù)語(yǔ)"rAAV載體"及其同義詞可互換使用。為了本發(fā)明的目的，"假型，，(r)AAV指其中衣殼蛋白質(zhì)的血清型與該小基因的ITR的血清型異源的重組AAV。例如，假型rAAV可以由攜帶AAV5ITR的小基因和AAV2、AAV1、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8或者另一適宜AAV血清型的殼體構(gòu)成，其中小基因包裝在異源殼體中。備選地，假型rAAV可以由AAV5殼體構(gòu)成，在其中包裝入包含來(lái)自至少一種其它血清型的ITR的小基因。特別指出的由AAV5構(gòu)成的rAAV描述于2000年4月28日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/:200，409和2001年4月23日提出的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/USO1/13000中，該兩篇專利申請(qǐng)?jiān)诖瞬⑷胱鳛閰⒖?。處說(shuō)'逸的,逸我伴本發(fā)明的最優(yōu)選載體為腺病毒載體，所述腺病毒載體包含插入其DNA物質(zhì)中的用于特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的至少一個(gè)本文所定義的核酸或者至少一個(gè)本文所定義的表達(dá)盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體可以才艮據(jù)Tong-Chuan等43(1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.95:2590-2514)描述的技術(shù)制備，相同的4支術(shù)也描述于美國(guó)專利號(hào)US5,922,576中，該專利號(hào)US5,922,576在此全文并入作為參考。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體可以z使用本文所定義的核酸或表達(dá)盒作為DNA插入物并根據(jù)Faivre等(2004，CancerResearch，Vol.64:8045-8051)公開的一般技術(shù)制備。，涼i細(xì)慮包含用于特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的本發(fā)明核酸的上述任何一種重組載體均可以用于體內(nèi)施用給需要其的哺乳動(dòng)物，特別是人。在一些情況下，這些栽體還可以用于體外轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞，以便例如在臨床使用前通過(guò)體外測(cè)定確保所確定的目的多核苷酸的抗癌效力。因此，本發(fā)明另一個(gè)目的重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)染，包括使用上面所定義的重組載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。為了本發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)染"用于指核酸組合物被細(xì)胞攝取。當(dāng)外源核酸組合物已經(jīng)跨過(guò)了細(xì)胞膜，則細(xì)胞已經(jīng)被"轉(zhuǎn)染"。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域普遍公知的。參見(jiàn)例如Sambrook等，(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davis等，(1986)BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier。此類技術(shù)可以用于向適宜宿主細(xì)胞中引入一種或一種以上核酸組合物，例如質(zhì)粒載體和其它核酸分子。該術(shù)語(yǔ)指遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定和瞬時(shí)4聶取兩者。為了本發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)導(dǎo)"是經(jīng)病毒載體的"轉(zhuǎn)染"的特殊形式。為了本發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)導(dǎo)，，意味著通過(guò)病毒或病毒載體如重組AAV病毒體，體內(nèi)、體外或者離體地將核酸組合物遞送至、進(jìn)入或達(dá)到受體細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)導(dǎo)是轉(zhuǎn)染的特殊形式，即術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)染包括術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，一般而言，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞為在細(xì)胞內(nèi)攜帶有上面所定義的重組載體并表達(dá)目的多核苷酸的癌細(xì)胞，其中目的多核苷酸在其中的表達(dá)處于衍生自人或大鼠AFP啟動(dòng)子或者人或大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸的控制下。藥物組合物和治療性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明另一個(gè)目的是藥物組合物，所述藥物組合物至少包含選自下列的活性成分(i)用于特異性地在癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的本文所定義核酸，(ii)包含所述本發(fā)明核酸的表達(dá)盒，和(iii)插入有所述核酸或所M達(dá)盒的重組載體。本發(fā)明還涉及抗癌治療性方法，包括將如上面一般定義的藥物組合物施用給需要其的哺乳動(dòng)物體、特別是人體的步驟。因此，本發(fā)明另一個(gè)目的是藥物組合物，所述藥物組合物包含(i)選自下列的活性成分-如本文所定義的核酸或表達(dá)盒；和-如本文所定義的重組載體；和(ii)任選地，一種或一種以上可藥用賦形劑。本發(fā)明還涉及如本文所述的核酸或表達(dá)盒在制造藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及如本文所定義的重組載體用于制造藥物組合物的用途。遞送核酸分子的方法描述于Akhtar等，1992，TrendsCellBio.，2,139;以及DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar，1995中，該兩篇文獻(xiàn)在此并入作為參考。Sullivan等(PCTWO94/02595)進(jìn)一步描述了遞送酶性RNA分子的一般方法。這些方法可以用于遞送實(shí)際上任何核酸分子。核酸分子可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的多種方法施用于細(xì)胞，包括但不限于，包封在脂質(zhì)體中、離子電滲或者并入其它運(yùn)載體中，例如水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解納米嚢和生物粘附性微球體。備選地，核酸/運(yùn)載體的組合可以通過(guò)直接注射或者通過(guò)使用輸液泵局部遞送。其它遞送途徑包括但不限于口服(片劑或丸劑形式)和/或鞘內(nèi)遞送(Gold,1997,Neuroscience，76，1153-1158)。另外的方法包括使用各種運(yùn)輸和運(yùn)載系統(tǒng)，例如使用綴合物和生物可降解聚合物。有關(guān)藥物遞送策略，包括CNS遞送，的全面綜述參見(jiàn)Ho等，1999，Curr.Opin.Mol，Ther.，1，336-343和Jain,DrugDeliverySystems:TechnologiesandCommercialOpportunities，DecisionResources,1998和Groothuis等，1997，JNeuroVirol.，3，387-400。關(guān)于核酸遞送和施用的更詳細(xì)的描述提供于Sullivan等，同上，Draper等,PCTW093/23569,Bdgdman等，PCTWO99/05094,和Klimuk等，PCTWO99/04819中，所有這些文獻(xiàn)在此并入作為參考。本發(fā)明的核酸、表達(dá)盒和重組載體可以用作藥劑。本發(fā)明的核酸、表達(dá)盒和重組載體可通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)方法施用并引入患者體內(nèi)，并可以與或可以不與穩(wěn)定劑、緩沖液等一起形成藥物組合物。當(dāng)希望〗吏用脂質(zhì)體遞送機(jī)制時(shí)，可按照用于脂質(zhì)體形成的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。本發(fā)明的組合物還可以被配制成可用于注射施用的無(wú)菌溶液；混懸液；以及本領(lǐng)域已知的其它組合物，并使用。本發(fā)明還包括所述活性物質(zhì)的可藥用制劑。藥物組合物或制劑指具有適宜向細(xì)胞或患者、優(yōu)選人施用，例如全身施用的形式的組合物或制劑。適宜形式部分地取決于用途或進(jìn)入途徑。例如，注射入血流的藥物組合物應(yīng)該是可溶的。其它因素為本領(lǐng)域已知并且包括種種因素，例如毒性和會(huì)阻止組合物或制劑發(fā)揮效果的形式。"全身施用，，意思是指藥物的體內(nèi)全身性吸收或者累積在血流中隨后分布于整個(gè)身體。導(dǎo)致全身吸收的施用途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、自內(nèi)、吸入、口服、肺內(nèi)和肌內(nèi)。這些施用途徑中的每一種都可以將帶負(fù)電荷的期望聚合物如核酸暴露于可接近的患病組織。已經(jīng)證明藥物進(jìn)入循環(huán)的速率是分子量或者大小的函數(shù)。使用包含本發(fā)明化合物的脂質(zhì)體或者其它藥物運(yùn)栽體可以潛在地將藥物局限于如某些組織類型中，例如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的組織。脂質(zhì)體制劑也是有用的，它可以利于藥物與細(xì)胞表面，包括癌細(xì)胞表面結(jié)合。可藥用制劑意思是指允許本發(fā)明核酸分子或重組載體有效分布于最46適宜發(fā)揮其期望活性的身體部位的組合物或制劑。適宜用本發(fā)明核酸分子配制的藥劑的非限定性實(shí)例包括PEG綴合的核酸、磷脂綴合的核酸、包含親脂部分、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制劑(例如PluronicP85)的核酸，其可以增強(qiáng)藥物i^A各種組織，例如CNS(Jolliet-RiantandTillement，1999，F(xiàn)undam.Clin.Pharmacol.,13，16-26);生物可降解聚合物，例如用于植入后持續(xù)釋放遞送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球體(Emerich，DF等，1999，CellTransplant,8，47-58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.;和荷載的納米孩史粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯構(gòu)成的那些，它們可以遞送藥物跨過(guò)血腦屏障并且可以改變神經(jīng)元攝取機(jī)制(ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,23，941-949,1999)。遞送策略,包括本發(fā)明核酸分子的CNS遞送，的其它非限定性實(shí)例包括Boado等，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315;Tyler等，1999,FEBSLett.，421,280-284;Pardridge等，1995，PNASUSA.，92，5592-5596;Boado，1995，Adv.DrugDeliveryRev.，15，73-107;Aldrian-Herradaetal"1998，NucleicAcidsRes.，26，4910-4916;以及Tyler等，1999，PNASUSA.，96，7053-7058中描述的材料，所有這些參考文獻(xiàn)在此整合作為參考。本發(fā)明還涉及使用組合物，所述組合物包含含有聚(乙二醇)脂質(zhì)的表面修飾的脂質(zhì)體(PEG-修飾的或長(zhǎng)循環(huán)性脂質(zhì)體或者隱形脂質(zhì)體)。本發(fā)明核酸分子還可以包含共價(jià)連接的各種分子量的PEG分子。這些制劑提供了增加藥物在靶組織中積累的方法。這類藥物運(yùn)載體抵抗單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS或RES)的調(diào)理作用和清除，由此4吏血液循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)并且增加了組織與所包封藥物的接觸(Lasic等，Chem.Rev.1995，9S,2601-2627;Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。已經(jīng)表明，此類脂質(zhì)體選擇性地在腫瘤中積累，推測(cè)是通過(guò)外滲及捕^新形成血管的靶組織中來(lái)實(shí)現(xiàn)的(Lasic等，Science1995，267，1275-1276;Oku等，1995，Biochim.Biophys,Acta,1238,86-90)。長(zhǎng)循環(huán)性脂質(zhì)體增強(qiáng)了DNA和RNA的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，特別是與已知在MPS組織中積累的常規(guī)陽(yáng)離子脂質(zhì)體相比時(shí)(Liu等，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870;Choi等，國(guó)際PCT公布號(hào)WO96/10391;Ansell等，國(guó)際PCT公布號(hào)WO96/103卯；Holland等，國(guó)際PCT公布號(hào)WO96/10392;所有這些文獻(xiàn)在此整合作為參考)。長(zhǎng)循環(huán)性脂質(zhì)體還可以比陽(yáng)離子脂質(zhì)體更大程度地保護(hù)藥物不被核酸酶降解，這是基于長(zhǎng)循環(huán)性脂質(zhì)體具有能夠避免在代謝強(qiáng)的MPS組織如肝臟和腎臟中累積的能力。所有這些參考文獻(xiàn)在此整合作為參考。本發(fā)明還包括制備用于儲(chǔ)存或施用的組合物，其包括在可藥用栽體或者稀釋劑中的藥物有效量的期望化合物。用于治療性用途的可接受的栽體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域是眾所周知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)，其在此整合作為參考。例如，可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、著色劑和矯味劑。這包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯曱酸酯。此外，可使用抗氧化劑和助懸劑。藥物有效量是預(yù)防、抑制相應(yīng)患者的癌癥狀況發(fā)生或者治療相應(yīng)患者的癌癥狀況所需的劑量。藥物有效量取決于癌癥類型、癌癥發(fā)展?fàn)顟B(tài)、所使用的組合物、施用途徑、被治療的哺乳動(dòng)物類型、考慮施用的特定哺乳動(dòng)物的身體特征、并行施用的藥物以及醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到的其它因素。通常，依賴于負(fù)電荷聚合物的效力，施用0.1pg/kg至10mg/kg體重/天活性成分量的核酸、表達(dá)盒或重組載體。本發(fā)明的核酸分子和重組載體及其制劑可以以包含常規(guī)無(wú)毒性可藥用載體、助劑和賦形劑的單位劑量形式經(jīng)腸胃外施用。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)腸胃外包括經(jīng)皮、皮下、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌內(nèi)或鞘內(nèi)注射或輸注技術(shù)等等。在本發(fā)明的藥物組合物中，可以存在多種本發(fā)明的核酸分子或重組栽體以及一種或一種以上無(wú)毒性可藥用栽體和/或稀釋劑和/或助劑以及如期望的話其它活性成分。水性混懸劑包含與適宜制造水性混懸劑的賦形劑混合的活性物質(zhì)。此類賦形劑是助懸劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或濕潤(rùn)劑可以是天然磷脂，例如卵磷脂、或環(huán)氧烷烴與脂肪酸的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯硬脂酸酯、或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物如heptadecaethyleneoxycetanoe、或環(huán)氧乙烷與f汴生自脂肪酸的部分脂和己糖醇的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯、或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸的部分脂和己糖醇酐的縮合產(chǎn)物如聚乙烯失水山梨醇單油酸酯。水性混懸劑還可包含一種或一種以上防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯、一種或一種以上著色劑、一種或一種以上調(diào)p木劑和一種或一種以上甜味劑，例如蔗糖或糖精。本發(fā)明的核酸分子和重組載體可以在無(wú)菌介質(zhì)中經(jīng)腸胃外施用。依賴于所使用的賦形劑和濃度，藥物會(huì)懸浮或溶解于賦形劑中。有利地，助劑如局部麻醉藥、防腐劑和緩沖劑可以溶解于賦形劑中。應(yīng)當(dāng)理解，用于任何具體患者的具體劑量水平取決于多種因素，包括所采用的具體化合物的活性、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑和排泄率、藥物聯(lián)合以及所治療的特定癌癥的嚴(yán)重程度。本發(fā)明的核酸分子和重組載體還可以與其它治療性化合物聯(lián)合施用于患者以增加總體抗癌治療效果。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療包括實(shí)體瘤和白血病在內(nèi)的任何類型的癌癥，包括胺前體攝取與脫羧細(xì)胞瘤、迷芽瘤、鰓原瘤、惡性類癌綜合征、類癌性心臟病、癌(例如Walker癌、基底細(xì)胞癌、基底鱗狀細(xì)胞癌、Brown-Pearce癌、導(dǎo)管癌、Ehrlich腫瘤、原位癌、Krebs2、梅克爾細(xì)胞癌、粘液癌、非小細(xì)胞肺癌、coatcell癌、乳頭狀癌、硬癌、細(xì)支氣管肺泡癌、支氣管癌、鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)、組織細(xì)胞功能紊亂、白血病(例3口B細(xì)胞白血病、'混合細(xì)胞白血病、nullcell白血病、T細(xì)胞白血病、慢性T細(xì)胞白血病、HTLV-II-相關(guān)白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、肥大細(xì)胞白血病和髓性白血病)、惡性組織細(xì)胞病、霍奇金病、免疫增生性非霍奇金小淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生、黑素瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、間皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纖維瘤、腺)^巴瘤、癌肉瘤、軟骨瘤、顱咽管瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、間葉瘤、中腎瘤、肌肉瘤、成釉細(xì)胞瘤、牙骨質(zhì)瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、腺癌、癌、腺瘤、膽管瘤、膽脂瘤、圓柱瘤、嚢腺癌、嚢腺瘤、粒層細(xì)胞瘤、兩性胚細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞性肝癌、汗腺瘤、胰島細(xì)胞瘤、萊迪希細(xì)胞瘤、乳頭瘤、塞爾托利細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌細(xì)胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫統(tǒng)肌肉瘤、室管膜瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、神經(jīng)M瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、非嗜鉻性副神經(jīng)節(jié)瘤、血管角質(zhì)瘤、血管淋巴樣增生伴嗜酸粒細(xì)胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果體瘤、癌肉瘤、軟骨肉瘤、葉狀嚢性肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性淋巴肉瘤、月旨肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤(例如尤因肉瘤、實(shí)驗(yàn)性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大細(xì)胞肉瘤)、贅生物(例如骨贅生物、乳腺贅生物、消化系統(tǒng)贅生物、結(jié)腸直腸贅生物、肝臟贅生物、胰臟贅生物、垂體贅生物、睪丸贅生物、眼眶贅生物、頭頸贅生物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)贅生物、聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)贅生物、骨盆贅生物、呼吸道贅生物和泌尿生殖系統(tǒng)贅生物)、神經(jīng)纖維瘤病和宮頸上皮結(jié)構(gòu)不良，并且可用于治療其中的細(xì)胞已永生化或者轉(zhuǎn)化了的其它疾病。本發(fā)明可與其它治療方式，例如化學(xué)療法、冷療法、熱療法、放射療法等等聯(lián)合使用。通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡迷本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:包含f;f生自人HIP/PAPI和大鼠PAPI啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸的制備人和大鼠HIP/PAPI(肝癌-腸-胰腺/胰腺炎相關(guān)蛋白質(zhì)I)啟動(dòng)子突變體如下產(chǎn)生。包含人HIP/PAPI基因全長(zhǎng)調(diào)節(jié)序列的2.44kb片段(包含外顯子l)通過(guò)EcoRI-BamHI消化從pCL6載體釋放。不同缺失突變體用Klenow聚合酶平端化、激酶處理并連接入pLuciferase292載體(pL292，Promega)的Sfl/I位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pL292-EcoRI-HIP/PAPI、pL292-Xmnl-HIP/PAPI、pL292-Pstl-HIP/PAPI、pL292-StuI-HIP/PAPI和pL292-Bsu36I畫HIP/PAPI。這些螢光素酶才艮告基因構(gòu)建體分別包含人HIP/PAPI啟動(dòng)子區(qū)域的2092至+348、1714至+348、987至+348、238至+348和+106至+348位核苷酸(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)編號(hào)為+l)。然后開展螢光素酶測(cè)定，以確定帶有最高轉(zhuǎn)錄活性的缺失突變體。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)分別4吏用質(zhì)粒p-1253/+10PAPI-CAT(p畫1253Z+10PAPI-CAT載體先前由Dusetti等，1995,JBiolChem,Vol.270(38):22417-22421公開)和pL292-Xmnl-HIP/PAPI作為模板擴(kuò)增大鼠HIP/PAPI啟動(dòng)子的1.253Kb片段和所選擇的人HIP/PAPI啟動(dòng)子的2Kb片段。擴(kuò)增在IX聚合il^反應(yīng)緩沖液中開展，IX聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液包含0.2mMdNTP、每種引物各0.2pmol和2.5單位Expand高保真Taq聚合酶(Roche),終體積50pL。PCR反應(yīng)如下進(jìn)行94°C，60s;55。C,30s;72°C，120s;35個(gè)循環(huán)。使用下列寡核苷酸-帶有Kpnl限制酶切位點(diǎn)的有義引物5-CGGGGTACCACTGCAGCCTTGAACTCCTGG-3，[SEQIDNO:17'，-帶有Sail限制酶切位點(diǎn)的反義引物5畫ACGGTCGACTGTCTGCGACTTGAGGAGGCA-3'[SEQIDNO:18；-帶有Sail限制酶切位點(diǎn)的有義引物5'-CCGCGTCGAGCTGCAGATTTTCCAGTTAGTC-3'[SEQIDNO:19，-帶有Mlul限制酶切位點(diǎn)的反義引物5，-TCGACGCGTGTGAGGACAGAGATGGCTGTG-3"[SEQIDNO:20]。pSVSport-rNIS和pShuttle分別由N.Carrasco教授(AlbertEinsteinCollegeofMedicine,Bronx,NewYork)和thevectorcoreoftheUniversityHospitalofNantes惠贈(zèng)。使用Sall-EcoRV(NewEnglandBiolabs)平末端消化從pSVSport-rNIS中切下大鼠NIScDNA、在瓊脂糖凝膠上純化并連接入(14DNA連接酶，Roche)經(jīng)SalI-BglII平端化的pShuttle，得到pShuttle-rNIS。人和大鼠HIP/PAPIPCR產(chǎn)物插入到pShuttle-rNIS中。pShuttle-rNIS和hHIPPCR產(chǎn)物經(jīng)Kpnl(每IO照DNA加10單位酶)于37。C消化2小時(shí)、在無(wú)水乙醇和3M醋酸鈉中于-20。C沉淀過(guò)夜、并經(jīng)SalI于37。C消化2小時(shí)。在瓊脂糖凝膠(QiaExII，Qiagen)上遷移和純化之后，使用T4DNA連接酶于16。C將DNA連接過(guò)夜，產(chǎn)生pShuttlehHIP國(guó)rNIS。使用同樣的實(shí)驗(yàn)程序產(chǎn)生pShuttlerHIP-rNIS，在用Sall-Mlul消化pShuttle-rNIS和rHIPPCR產(chǎn)物之后純化和連接。實(shí)施例2:包含衍生自人AFP啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)性多核苷酸的核酸的制備pShuttlerAFPwt-和hAFPt-rNIS使用常規(guī)限制酶構(gòu)建。為了產(chǎn)生pShuttlerAFPwt-rNIS(圖1)，帶有大鼠a-甲胎蛋白(rAFP)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的EcoRI-Sall3.2Kb片段從pBluescript-rAFPwt中釋放、插入至EcoRI-Sall消化的pSVSport-rNIS中，然后插入至KpnI-NotI消化的pShuttle中。為了產(chǎn)生pShuttlehAFPt-rNIS(圖2)，帶有人a-甲胎蛋白(hAFP)增強(qiáng)子元件的Kpnl-Xhol0.8Kb片段從pGL3-hAFPt中釋放并插入至Kpnl-Sall消化的pShuttle-rNIS中。實(shí)施例3:重組病毒載體的構(gòu)建pShuttlehHIP-(圖3)、rHIP-rAFPwt-(圖l)和hAFPt-rNIS(圖2)被完全測(cè)序。通過(guò)同源重組在大腸桿菌(E.Coli)中使用pAdEasy系統(tǒng)產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒以及腺病毒的生產(chǎn)由Nantes的VectorDevelopmentLab按照He等(P.N.A.S,1998;95.2509-14)說(shuō)明的方法開展。所有重組腺病毒均從單噬菌斑中分離、在293細(xì)胞中擴(kuò)大培養(yǎng)并且通過(guò)雙氯化銫離心純化。純化的病毒以等分試樣儲(chǔ)存于-80。C。通過(guò)噬菌斑試驗(yàn)確定病毒滴度。實(shí)施例4:本發(fā)明核酸的體外和體內(nèi)抗癌活性A.材料和方法A/.權(quán)賴縱HepG2細(xì)胞以5xl()6細(xì)胞接種于10cmPetri皿。次日，使用磷酸釣DNA共沉淀方法以每一才艮告質(zhì)粒10照和1pg編碼P-半乳糖苷酶基因的pCH110載體共轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。P-半乳糖苷酶共轉(zhuǎn)染用作內(nèi)部對(duì)照以便將轉(zhuǎn)染效率標(biāo)化。對(duì)照質(zhì)粒包括在內(nèi)，即pCMV-螢光素酶和pGL3-GFP。轉(zhuǎn)染12h之后，IL-6(100單位/mL)和地塞米松(100nM)單獨(dú)或者組合地加入到培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染48h之后，以磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌細(xì)胞兩次并且在水上刮下細(xì)胞。在包含蛋白酶抑制劑的等滲緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.5，137mMNaCl,1%NonidetP-40)中制備用于螢光素酶活性測(cè)定的細(xì)胞提取物。50jaL上清液與螢光素孵育，并且^f吏用發(fā)光計(jì)測(cè)定螢光素酶活性。啟動(dòng)子活性表示為通過(guò)P-半乳糖苷酶活性標(biāo)化的螢光素酶活性。53細(xì)應(yīng)系人肝細(xì)胞性肝癌HepG2、人結(jié)腸腺癌HT29和乳腺癌T47D細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)加有10。A胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基glutamax(DMEM)/F12KHam's(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的50/50混合物中。人乳腺癌細(xì)胞MCF7和大鼠肝細(xì)胞性肝癌BCXL3維持在補(bǔ)加有10%FCS的DMEM中。AML12(a小鼠肝12)細(xì)胞系維持于補(bǔ)加有5|iig/mL胰島素、5]Lig/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、40ng/mL地塞米松和10%FCS的F12KHam培養(yǎng)基中。人原代成年肝細(xì)胞來(lái)自肝轉(zhuǎn)移行部分肝切除術(shù)后得到的肝小片，使用膠原酶H(RocheMolecularBiochemicals)灌注(500g/mL，HEPES緩沖液pH7.4中2.4mg/mLCaCl2)分離，在分離前4吏用插入到所切除塊的切面上的血管中的導(dǎo)管以HEPES/乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液pH7.4充分洗滌肝組織。灌注的流速為15至18mL/min。通過(guò)溫和離心洗滌細(xì)胞兩次(100g，2min)，并且使用Percoll分級(jí)分離(30%等滲Percoll溶液)將肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)組織分離?；罴?xì)胞通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法確定并生長(zhǎng)于添加有10%FCS的完全William培養(yǎng)基(lmg/mL牛血清白蛋白、25nmol/L地塞米松和5照/mL牛胰島素)中。齡4凝妙拋微感染前一天，3xl()5細(xì)胞接種于24-孔皿。細(xì)胞與肝臟腫瘤特異性NIS重組病毒載體或?qū)φ蛰d體(即空載體Ad-DL324和AdCMV-NIS)以不同感染復(fù)數(shù)(每個(gè)細(xì)胞10、50、100和200個(gè)感染性顆粒)孵育24h。對(duì)于HIP-NIS腺病毒感染的細(xì)胞，在感染后48小時(shí)，將IL-6(100單位/mL)和地塞米松(100nM)單獨(dú)或組合加入培養(yǎng)基中。然后，如先前所述(Faivre等，2004)開展碘攝取和排出研究。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞用B-Hank平衡鹽溶液(B-HBSS,LifeTechnologies,Inc)洗滌兩次，然后每孔在包含l|nCi(37kBq)1231和0.5|UMNal(Fluka，Sigma-Aldrich)的放射性B-HBSS中于37。C孵育60分鐘。在確定的時(shí)間，細(xì)胞用冷B-HBSS洗滌一次，然后在1mL冷無(wú)水乙醇中孵育20分鐘。在碘外排研究中，細(xì)胞孵育在與攝取實(shí)驗(yàn)相同的放射性培養(yǎng)基中60分鐘。然后去除訪文射性培養(yǎng)基。細(xì)胞以B-HBSS洗滌一次，并且加入0.5ml無(wú)硤化物的B-HBSS。在指定的時(shí)間，去除B-HBSS,并將細(xì)胞孵育于冷的無(wú)水乙醇中。細(xì)胞內(nèi)的放射性活性使用孔Y計(jì)數(shù)器定量。細(xì)胞數(shù)量確定為三個(gè)孔的平均細(xì)胞含量。對(duì)于NIS抑制研究，NaCK)4以30^M的濃度加入。A4動(dòng)參雄性Wistar大鼠(CharlesRiver,法國(guó))依照歐盟動(dòng)物福利規(guī)定處理。通過(guò)每日攝取飲用水中的二乙基亞硝胺(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO)(IOOmg/L)8周，在重150-180g的6周齡雄性Wistar大鼠中誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌。通過(guò)々欠用水，大鼠曾接受過(guò)甲狀腺素(T4)補(bǔ)充物(50iag/L)以降低不想要的甲狀腺?gòu)窋z取。A5.沐力差^脊移大鼠用1mL/kg氯胺酮/賽拉嗪的70:30混合物(Imalgene1000，Merial，Rompun，BayerAG)麻醉，然后開腹。評(píng)估了三種施用途徑的基因轉(zhuǎn)移效率肝門內(nèi)、經(jīng)肝動(dòng)脈的選擇性注射和向腫瘤內(nèi)的直接注射。表達(dá)NIS的腺病毒載體經(jīng)肝門內(nèi)或肝動(dòng)脈內(nèi)施用于不同批的大鼠(健康的和經(jīng)DEN處理過(guò)的大鼠(帶有直徑小于10mm的腫瘤結(jié)節(jié)))中。使用30號(hào)注射針頭將rNIS載體直接注射入DEN處理過(guò)的大鼠的5至10mm直徑腫瘤結(jié)節(jié)中。評(píng)估了不同量的病毒，從每只大鼠5xl(^至10"個(gè)感染性顆粒。A6.體力橫凝承其發(fā)a6./."f面A7糸厲;^4'謬Na123I(ScheringAG,Berlin,德國(guó))腹膜內(nèi)注射(每只大鼠6至12MBq)。使用分別用于mI或1311成像的低能或高能高分辨率平行準(zhǔn)直儀對(duì)兩只至四只大鼠同時(shí)成像。使用DSXy照相機(jī)(GE)得到256x256閃爍圖像。所施用的等份示蹤物作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)也進(jìn)行成像。連續(xù)使用同一程序以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。使用4mm孔的針孔型準(zhǔn)直儀并增加采集次數(shù)和數(shù)字化(numerization)，得到更高分辨率的圖像。在此圖像采集后，每一大鼠內(nèi)注射50mg高氯酸鈉(活躍硪運(yùn)輸?shù)挠欣种苿?，并以1分鐘的間隔采集圖像60分鐘。卓^f尤射V"^^辟^i^和C7Y57^CT/CTJ成^。["，c高锝酸鹽靜脈內(nèi)注射(每一大鼠37MBq)。注射后15分鐘，將大鼠垂直放置，肝臟位于采集窗前。使用4mm厚x120mm直徑的CsI(Na)連續(xù)晶體和位置敏感性光電倍增管開展SPECT采集，產(chǎn)生2mm的固有空間分辨率和10cm的視野。CT系統(tǒng)包含與透鏡偶聯(lián)至冷卻的CCD上的閃爍板(scintillatingsheet)，產(chǎn)生250jim空間分辨率。SPECT/CT(BiospaceMesures，Paris)開展實(shí)時(shí)成像同時(shí)SPECT和CT數(shù)據(jù)采集使得能夠?qū)PECT圖像、CT圖像進(jìn)行斷層顯像重構(gòu)、并且在采集過(guò)程中能夠?qū)蓚€(gè)圖像進(jìn)行配準(zhǔn)(registration)。在40分鐘過(guò)程中采集SPECT和CT圖像。重構(gòu)的圖寸象4吏用Amira3.1.1分析工具(MercuryComputerSystems,Inc)分析。窗鎵定量我們使用感興趣區(qū)域(ROI)方法和適當(dāng)背景校正以計(jì)算特異性活性。在給定器官內(nèi)絕對(duì)的有效120-分鐘攝取按如下計(jì)算用該器官內(nèi)經(jīng)背景校正后的計(jì)數(shù)除以準(zhǔn)直系統(tǒng)的計(jì)數(shù)效率和0時(shí)間的施用活性。123I和131I的物理衰變分別為13.2h和8.05d。生物學(xué)纟聶取計(jì)算為有效纟聶取除以對(duì)應(yīng)于腹膜內(nèi)注射與成4象之間的時(shí)間間隔的同位素物理衰變。在自120分鐘后的圖56像中測(cè)量標(biāo)化的校正后的計(jì)數(shù)率和特定ROI的活性，并且使用單指數(shù)擬合計(jì)算器官半衰期。A".mi伊遽為、浙。在病毒感染后一天制備細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物。刮下細(xì)胞并在包含50mmol/LTrispH8.0、150mmo!/LNaCl、1%NonidetP-40、100ng/mL苯甲基磺酰氟、l照/mL抑酶肽和l照/mL亮抑酶肽的裂解緩沖液中勻漿然后，裂解物在4。C于12，000g離心IO分鐘，在96。C加熱10分鐘溶解于2XLaemmli緩沖液中。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)Bradford方法測(cè)定。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-9。/。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。Western印跡分析如下開展將膜與稀釋在含有0.1%Tween-20和5%脫脂干奶粉的Tris緩沖鹽水中的抗rNIS肽多克隆抗體pAb-10(l:2000)室溫孵育1小時(shí)，然后與辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG(1:1000)室溫孵育1小時(shí)。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光Western印跡檢測(cè)系統(tǒng)(SuperSignal,Pierce)開展檢測(cè)。對(duì)于去糖基化測(cè)定，蛋白質(zhì)在變性緩沖液(0.5。/。SDS和1。/。15-巰基乙醇)中于37。C變性30分鐘。變性的蛋白質(zhì)與肽基:iV-糖苷酶F(PNGaseF;NewEnglandBiolabs，Inc.,Beverly,MA)以500U/照蛋白質(zhì)的濃度于37°C孵育過(guò)夜。A6乂逸織夢(mèng)、^建炎^、i微放射《i多福爾馬林固定的組織切片包埋在石蠟中，H&E染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。對(duì)于免疫熒光，水凍切片(4卞m)在4。/。多聚甲醛中固定15分鐘并與以1:200稀釋的初級(jí)抗NIS多克隆抗體孵育1小時(shí)。通過(guò)UV-熒光顯微鏡觀察熒光。1311標(biāo)記的肝切片用Micro-Imager(視野為24x32mm2，分辨率為25pM，BiospaceMesures)分析。A6.5.薪凝承將器官樣品稱重，在孔Y計(jì)數(shù)器中測(cè)定放射性活性并且結(jié)果表示為每克組織所注射劑量的百分?jǐn)?shù)(。/。ID/g)。針對(duì)所用的體積和y發(fā)射體扣除自身吸收。A7.^##。使用方差分析和5%風(fēng)險(xiǎn)值的PLSDFischer檢驗(yàn)開展統(tǒng)計(jì)學(xué)比較(StatView5.0軟件SAS系統(tǒng))。B.結(jié)果在本實(shí)施例中開展的實(shí)驗(yàn)的目的是，使得可以以相對(duì)低的全身照射劑量通過(guò)內(nèi)部放射療法破壞肝臟肺瘤，以避免副作用，例如骨髓清除。因此該目的旨在確定這樣的病毒或非病毒重組載體，其在轉(zhuǎn)移后能夠通過(guò)在腫臟腫瘤細(xì)胞內(nèi)積累。如圖5中所示，大鼠HIP/PAP調(diào)節(jié)序列成功地誘導(dǎo)NIS在人腫瘤性肝細(xì)胞中表達(dá)。此外，使用轉(zhuǎn)染有腺病毒載體AdrHIPrNIS的H印G2細(xì)胞開展的抗NIS免疫熒光測(cè)定表明，NIS表達(dá)于所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)膜水平上。如圖6中所示，人HIP/PAP調(diào)節(jié)序列也成功地誘導(dǎo)NIS在人腫瘤性肝細(xì)胞中表達(dá)。此外，如圖7中所示，大鼠HIP/PAP調(diào)節(jié)序列誘導(dǎo)特異地在肝臟腫瘤結(jié)節(jié)中的強(qiáng)的NIS體內(nèi)表達(dá)。此外，如圖8中所示，自人和大鼠AFP衍生的調(diào)節(jié)序列兩者均誘導(dǎo)NIS在人腫瘤性肝細(xì)胞中表達(dá)。此外，當(dāng)用包含有效連接至人AFP衍生的調(diào)節(jié)序列的GFPDNA序列的病毒載體轉(zhuǎn)染人細(xì)胞時(shí)，證明GFP專門地并且強(qiáng)烈地表達(dá)于人肝臟癌癥細(xì)胞中。此外，使用轉(zhuǎn)染有腺病毒載體AdAFPrNIS的HepG2細(xì)胞開展的抗NIS免疫熒光測(cè)定表明NIS表達(dá)于所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)膜上。成功的NIS靶向表達(dá)使得人們能夠強(qiáng)烈照射實(shí)體腫瘤而同時(shí)使全身照射劑量最小化。過(guò)去必須克服的主要障礙是可利用的、能夠調(diào)節(jié)潛在治療性基因表達(dá)的腫瘤特異性啟動(dòng)子數(shù)量少并且轉(zhuǎn)錄活性弱。因此，通過(guò)這些先前啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的NIS蛋白質(zhì)表達(dá)，對(duì)于攝取細(xì)胞裂解性濃度的放射性同位素是不夠的。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)通過(guò)選擇肝臟腫瘤特異性基因AFP和HIP/PAPI的截短調(diào)節(jié)序列構(gòu)建NIS重組栽體，解決了該問(wèn)題。根據(jù)該實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，已經(jīng)表明在體內(nèi)這些載體在荷有HCC的動(dòng)物模型的肝臟腫瘤內(nèi)表現(xiàn)出足夠高的NIS轉(zhuǎn)錄活性，如通過(guò)1311治療后肺瘤生長(zhǎng)的明顯抑制所證明的。因此，本文已經(jīng)實(shí)驗(yàn)性開展了-構(gòu)建與報(bào)告基因融合的a曱胎蛋白(AFP)基因的截短調(diào)節(jié)序列或肝癌腸胰腺/胰腺炎相關(guān)蛋白質(zhì)1(HIP/PAPI)基因的截短調(diào)節(jié)序列，并從這些構(gòu)建體中選擇出具有最高轉(zhuǎn)錄活性的構(gòu)建體；-構(gòu)建了帶有所選擇的調(diào)節(jié)序列AFP和HIP/PAPI的大鼠NIS重組腺病毒和慢病毒，并通過(guò)測(cè)序檢查之；-在體外證明，感染AFP-NIS和HIP/PAPI-NIS后，NIS蛋白質(zhì)的表達(dá)強(qiáng)烈并正確地靶向轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞的質(zhì)膜，而在原代正常肝細(xì)胞中其不表達(dá)；-在體外證明，感染AFP-NIS和HIP/PAPI-NIS的細(xì)胞中碘的攝取水平強(qiáng)(與通過(guò)CMV-NIS誘導(dǎo)的硪攝取水平相當(dāng))；-通過(guò)荷有HCC的動(dòng)物中的系列放射性同位素成像，在體內(nèi)證明，放射性硪被肝臟腫瘤結(jié)節(jié)強(qiáng)烈攝取并且不被周圍的非腫瘤組織攝取，這表明NIS在實(shí)體肺瘤肝細(xì)胞中的強(qiáng)功能性表達(dá)源于調(diào)節(jié)序列AFP和HIP/PAPI;-在體內(nèi)證明，在AFP-NIS或HIP/PAPI-NIS轉(zhuǎn)導(dǎo)后，響應(yīng)于1311放射治療，荷有HCC的動(dòng)物中腫瘤消退顯著。59才艮據(jù)本文已經(jīng)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，器官內(nèi)的局部條件非常不同于移植腫瘤內(nèi)的局部條件，特別是因?yàn)槊芗难苄纬?、纖維化-炎性(fibro-inflarnmatory)瘤周反應(yīng)以及肝臟癌癥中所存在的基礎(chǔ)疾病(肝硬化和慢性肝炎)。因此，將在移植肺瘤中觀察到的急劇碘外排外推至患者是不恰當(dāng)?shù)摹１景l(fā)明人已經(jīng)證明，肝臟腫瘤中放射性碘的長(zhǎng)期保留(這是放射治療效力的必要條件)源于攝取、外排和再攝取的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其中通過(guò)AFP-NIS或HIP/PAP-NIS載體誘導(dǎo)的肺瘤性肝細(xì)胞質(zhì)膜上的高NIS蛋白質(zhì)濃度和高的肝臟血流(允許血漿中放射性碘向肝臟的快速再循環(huán))利于再攝取。60序列列表<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>權(quán)利要求1.用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的核酸，所述核酸包含(a)驅(qū)動(dòng)所述目的多核苷酸在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)性多核苷酸，其選自下列調(diào)節(jié)性多核苷酸(i)調(diào)節(jié)性多核苷酸，從5’端至3’端包含-與選自SEQIDNO1和SEQIDNO2的核酸具有至少90％核苷酸同一性的第一核酸；和-與核酸SEQIDNO3具有至少90％核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接連接，或-所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸[具有1至3000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度]彼此間接連接；(ii)與SEQIDNO4中起始于第2200位核苷酸并終止于第2432位核苷酸的核酸具有至少90％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；(iii)與SEQIDNO5中起始于第979位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸具有至少90％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；和(iv)調(diào)節(jié)性多核苷酸，從5’端至3’端包含-與選自SEQIDNO6和SEQIDNO7的核酸具有至少90％核苷酸同一性的第一核酸；和-與SEQIDNO8的核酸具有至少90％核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接連接，或-所述第一和第二核酸通過(guò)間隔核酸[具有1至2000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度]彼此間接連接；和(b)所述目的多核苷酸。2.根據(jù)權(quán)利要求l的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸從5，端至3，端包含國(guó)與選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少卯％核普酸同一性的第一核酸；-具有1至3000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的間隔核酸，和-與核酸SEQIDNO:3具有至少90%核普酸同一性的第二核酸。3.根據(jù)權(quán)利要求l的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸與選自SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的核酸具有至少90%核苷酸同一性。4.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸包含核酸SEQIDNO:4中的至少233個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含核酸SEQIDNO:11。5.根據(jù)權(quán)利要求l的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸選自-與包含SEQIDNO:11的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與包含SEQIDNO:12的核酸具有至少90。/。核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與包含SEQIDNO:13的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；-與包含SEQIDNO:14的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸；和-與包含SEQIDNO:4的核酸具有至少90%核苷酸同一性的調(diào)節(jié)性多核苷酸。6.根據(jù)權(quán)利要求l的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸與包含SEQIDNO:5中的至少274個(gè)連續(xù)核苷酸并且包含SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并終止于第1253位核苷酸的核酸的核酸具有至少90%核苷酸同一性。7.根據(jù)權(quán)利要求6的核酸，包含SEQIDNO:5中的275至1250個(gè)連續(xù)核普酸。8.根據(jù)權(quán)利要求l的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸從5，端至3，端包含-與選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的第一核酸；-具有1至2000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的間隔核酸，和-與SEQIDNO:8的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸。9.根據(jù)權(quán)利要求l的核酸，其中所述調(diào)節(jié)性多核苷酸與選自SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的核酸具有至少卯。/。核苷酸同一性。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)的核酸，其中所述目的多核苦酸編碼蛋白質(zhì)。11.根據(jù)權(quán)利要求10的核酸，其中所述目的多核苷酸編碼治療上用于抗癌癥的蛋白質(zhì)。12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)的核酸，其中所述目的多核苷酸編碼碘化鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)蛋白質(zhì)。13.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)的核酸，其中所述目的多核苷酸編碼目的RNA。14.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸，其中所述目的多核苷酸編碼核酶。15.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸，其中所述目的多核苷酸編碼與特定mRNA分子雜交的反義RNA。16.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸,其中所述目的多核苷酸編碼與特定DNA分子雜交的有義RNA。17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任何一項(xiàng)的核酸，其插入至表達(dá)栽體中。18.在其中插入了權(quán)利要求1至16中任何一項(xiàng)的核酸的重組載體。19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組載體，其能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。20.根據(jù)權(quán)利要求18的重組載體，其能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。21.根據(jù)權(quán)利要求18的重組載體，其由重組病毒栽體組成。22.根據(jù)權(quán)利要求21的重組載體，其由重組腺病毒組成。23.根據(jù)權(quán)利要求21的重組載體，其由重組慢病毒組成。24.重組宿主細(xì)胞，其已經(jīng)被根據(jù)權(quán)利要求18至23中任何一項(xiàng)的重組載體轉(zhuǎn)染。25.根據(jù)權(quán)利要求24的重組宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌細(xì)胞。26.根據(jù)權(quán)利要求24的重組宿主細(xì)胞，其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。27.藥物組合物，包含(i)活性成分，選自-根據(jù)權(quán)利要求1至16中任何一項(xiàng)的核酸；和-根據(jù)權(quán)利要求18至23中任何一項(xiàng)的重組載體；和(ii)一種或一種以上的可藥用賦形劑。28.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任何一項(xiàng)的核酸用于制造藥物組合物的用途。29.根據(jù)權(quán)利要求18至23中任何一項(xiàng)的重組載體用于制造藥物組合物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及衍生自(i)大鼠和人AFP啟動(dòng)子序列和(ii)大鼠和人HIP/PAPI啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)性多核苷酸，該調(diào)節(jié)性多核苷酸可以用于特異性地在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物癌性肝細(xì)胞中表達(dá)目的核酸。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101516908SQ200780033837公開日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年9月12日優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日發(fā)明者C·布雷紹,J·克萊克,J·費(fèi)爾,J·赫維申請(qǐng)人:國(guó)立健康與醫(yī)學(xué)研究所